CN101850116A - 利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法，以绿色荧光蛋白为报告基因、分别构建表达狂犬病病毒糖蛋白和猪瘟E2蛋白基因的表达盒，并克隆至转座子穿梭载体，在转座酶的介导作用下，分别与提纯的犬2型腺病毒和疱疹病毒I型全基因组发生重组，再利用转染试剂(脂质体等)将重组产物分别转染MDCK和Vero细胞，即可获得4株以绿色荧光蛋白为报告基因的重组病毒，即：表达糖蛋白的重组犬2型腺病毒、表达E2蛋白的重组犬2型腺病毒、表达糖蛋白的重组疱疹病毒I型和表达E2蛋白的重组疱疹病毒I型。免疫试验证明，表达E2基因的犬2型腺病毒和疱疹病毒I型活载体重组疫苗均可在猪体内诱导抗猪瘟病毒感染的免疫反应，表达糖蛋白基因的犬2型腺病毒和疱疹病毒I型活载体重组疫苗均可在犬体内诱导抗狂犬病病毒感染的免疫反应。
Description
技术领域：
本发明涉及一种构建犬2型腺病毒和疱疹病毒I型活载体重组疫苗的新方法，尤其是公开一种利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法，属于疫苗制备技术领域。
背景技术：
目前，用于遗传性疾病基因治疗和重组活载体疫苗构建的载体系统有十余种，其中DNA病毒载体在疫苗研究中最为常用，主要有腺病毒、疱疹病毒、痘病毒和杆状病毒等。
重组DNA病毒的构建策略过去主要基于同源重组原理，包括：①细胞内同源重组，即在两段基因组DNA分子之间进行重组。一旦发生同源重组，即可得到预期的重组病毒，无需纯化，但是，重组效率较低。②位点特异性同源重组，即发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶只能催化特异性位点间的重组，不能催化其它任何两条同源或非同源序列之间的重组。③细菌内同源重组，即在大肠杆菌内通过同源重组的方法构建重组病毒质粒载体，经酶切线性化后再转染病毒包装细胞系，从而得到重组病毒。与哺乳动物细胞比较，在大肠杆菌内进行挑克隆、鉴定等操作更加便利，但是，由于在大肠杆菌中病毒序列的遗传选择压力较小，发生突变导致病毒活力下降的可能性高于细胞内重组。④酶切连接，即在病毒质粒中通过连接反应插入一个表达盒，而不是进行同源重组。其优点是：质粒的构建和扩增快速，转染效率高。不足之处在于：在大肠杆菌中病毒序列的遗传选择压力较小，发生突变导致病毒活力下降的可能性要高于真核细胞内重组；单一酶切位点比较稀少，且稀有内切酶的价格昂贵。
目前，已报道的狂犬病-犬2型腺病毒活载体重组疫苗(扈荣良等，prevention ofrabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2encodingthe rabies virus glycoprotein.Microbes and Infection，2006；8(4)：1090-1097)采用的是细菌内同源重组和酶切连接方式获得重组病毒；狂犬病-疱疹病毒I型活载体重组疫苗(扈荣良等，a recombinant pseudorabies virus expressing rabies virusglycoprotein：safety and immunogenicity in dogs.Vaccine.2008；26(10)：1314-21)采用的是细胞内同源重组技术。以上重组病毒的构建方法与本发明涉及的转座机制相比，存在重组效率低或易发生突变的缺点。
转座子(Transposon)又称跳跃因子，是不必借助于同源片段，在转座酶(Transposase)的介导下便可在质粒之间或质粒与基因组之间转移位置的DNA片段。因为具有随机重组的特性，转座子已广泛应用于新基因的发现和功能研究，以及培育转基因动物等。
发明内容：
本发明公开一种利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法，具有高效、廉价和稳定的优点。
本发明的采用以下技术解决方案：
将平行表达报告基因(如：绿色荧光蛋白基因)和保护性抗原基因(如：狂犬病病毒糖蛋白基因、猪瘟E2基因)的表达盒通过常规的分子克隆手段插入带有转座子序列的穿梭载体(如：pMOD-2<MCS>)，该插入位点的两侧为转座子序列；然后，利用限制性内切酶将带有基因表达盒的转座子从穿梭载体游离，并经琼脂糖凝胶电泳纯化；再利用转座酶反应体系处理(37℃，2小时)纯化的转座子和载体病毒的全基因组，反应结束后加入终止液，并经70℃灭活10分钟；最后，利用脂质体等真核细胞转染试剂将反应物转染载体病毒的包装细胞，获得表达外源基因的重组病毒；经蚀斑克隆或有限稀释法纯化后，即可作为重组疫苗免疫动物。
本发明利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法，其特征在于：在转座酶的作用下，使携带外源基因表达盒的转座子与载体病毒的全基因组发生重组，然后将重组产物转染病毒的包装细胞，获得表达外源基因的重组病毒，经常纯化后制成重组疫苗。
所述的方法，其特征在于：利用转座子和转座酶介导的DNA重组机制，构建犬2型腺病毒和疱疹病毒I型活载体重组疫苗。
所述的方法，其特征在于：利用绿色荧光蛋白报告基因和狂犬病病毒糖蛋白保护性抗原基因、猪瘟病毒E2保护性抗原基因，在转座子和转座酶的介导作用下，将平行表达报告基因和保护性抗原基因的表达盒插入载体病毒的全基因组，并在细胞中获得表达。
所述的方法，其特征在于：利用犬2型腺病毒和疱疹病毒I型DNA病毒，在转座子和转座酶的介导作用下，对其基因组进行改造，并获得表达外源基因的重组病毒。
所述的方法，其特征在于：利用犬2型腺病毒和疱疹病毒的包装细胞MDCK和Vero，将转座子与载体病毒全基因组的重组产物转染细胞，包装出重组病毒。
本发明的具体构建犬2型腺病毒和疱疹病毒I型活载体重组疫苗的方法，包括以下步骤：
1.基因表达盒的构建
利用商品化的真核表达质粒载体pIRESneo，通过常规的分子克隆技术构建平行表达报告基因(如：绿色荧光蛋白基因)和保护性抗原基因(如：狂犬病病毒糖蛋白基因、猪瘟E2基因)的表达盒。
2.重组转座子的构建
通过常规的酶切、连接和转化技术，将表达盒克隆至带有转座子序列的商品化穿梭载体pMOD-2<MCS>，插入位点为两段转座子序列之间的多克隆酶切位点(图1)。
3.转座酶介导的转座反应
根据转座子穿梭载体的使用说明书，将重组转座子经酶切游离(图1)和琼脂糖凝胶电泳纯化后，与载体病毒全基因组等量加入转座酶反应体系，37℃反应2小时，反应结束后加入终止液，70℃10分钟灭活转座酶活性。
4.重组病毒的包装
将转座子与载体病毒全基因组的反应物，在转染试剂(脂质体等)的介导下，转染载体病毒的包装细胞，包装重组病毒。
5.重组病毒的纯化与鉴定
利用蚀斑克隆或有限稀释法对重组病毒进行亚克隆3～5次，获得纯化的重组病毒。利用针对外源基因的免疫学方法(抗原或抗体检测)或Southern杂交对重组病毒进行鉴定。
附图说明
图1为
Biotechnologies公司的转座子质粒载体；
图2为CLONTECH公司的真核表达质粒载体。
具体实施方案：
下面结合实施例，对本发明做进一步描述。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。
实施例1：狂犬病-重组犬2型腺病毒的制备方法
1.绿色荧光蛋白和狂犬病糖蛋白基因表达盒的构建
利用商品化的真核表达质粒载体pIRESneo(图2)的多克隆酶切位点EcoRV和BamHI插入狂犬病病毒糖蛋白基因(序列参照GenBank：M31046)，利用Sma I和XbaI位点插入绿色荧光蛋白报告基因(序列参照通用质粒pEGPF-C1)，构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白基因的表达盒。
2.重组转座子的构建
通过Nru I和Bst1107 I位点将基因表达盒完整切下，利用T4连接酶插入穿梭载体pMOD-2<MCS>中两转座子序列之间的Sma I位点(图1)，转化大肠杆菌DH5α，获得携带表达盒的重组转座子。
3.转座酶介导的转座反应
根据商品化转座子穿梭载体的使用说明书，将重组转座子经Pvu II酶切游离(图1)和琼脂糖凝胶纯化后，与犬2型腺病毒全基因组等量加入转座酶反应体系中，37℃反应2小时，反应结束后加入1μl终止液，70℃10分钟灭活转座酶活性。
转座酶反应体系(10μl)：1μl反应缓冲液，0.2μg腺病毒基因组DNA，0.2μg重组转座子DNA，5U转座酶，灭菌四馏水补至10μl。
4.重组病毒的包装
将转座子与犬2型腺病毒全基因组的重组产物，在脂质体2000(Invitrogen产品)的介导下，转染MDCK细胞，直到出现典型葡萄串状细胞病变。
5.重组病毒的纯化与鉴定
利用有限稀释法(稀释至每个细胞孔中含1个病变灶)对重组病毒进行亚克隆3～5次，通过荧光显微镜下观察荧光和细胞病变的一致性，判定重组病毒的纯化程度。
将纯化的重组病毒肌肉注射5条狂犬病抗体阴性成年犬(雌雄随机)，免疫前及免疫后14天时分别采集犬静脉血，分离血清。利用狂犬病荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测血清狂犬病中和抗体滴度，以中和抗体有无为标准，判定重组病毒是否表达狂犬病病毒糖蛋白(表1)。
表1重组犬腺病毒免疫试验
以上结果表明，重组病毒在犬体内表达了糖蛋白，并能诱导抗狂犬病病毒感染的免疫反应。
实施例2：狂犬病-重组疱疹病毒I型的制备方法
1.绿色荧光蛋白和狂犬病糖蛋白基因表达盒的构建
利用商品化的真核表达质粒载体pIRESneo(图2)的多克隆酶切位点EcoRV和BamHI插入狂犬病病毒糖蛋白基因(序列参照GenBank：M31046)，利用Sma I和Xba I位点插入绿色荧光蛋白报告基因(序列参照通用质粒pEGPF-C1)，构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白基因的表达盒。
2.重组转座子的构建
通过Nru I和Bst1107 I位点将基因表达盒完整切下，利用T4连接酶插入穿梭载体pMOD-2<MCS>中两转座子序列之间的Sma I位点(图1)，转化大肠杆菌DH5α，获得携带表达盒的重组转座子。
3.转座酶介导的转座反应
根据商品化转座子穿梭载体的使用说明书，将重组转座子经PvuII酶切游离(图1)和琼脂糖凝胶纯化后，与疱疹病毒I型全基因组等量加入转座酶反应体系中，37℃反应2小时，反应结束后加入1μl终止液，70℃10分钟灭活转座酶活性。
转座酶反应体系(10μl)：1μl反应缓冲液，0.2μg疱疹病毒基因组DNA，0.2μg重组转座子DNA，5U转座酶，灭菌四馏水补至10μl。
4.重组病毒的包装
将转座子与疱疹病毒I型全基因组的重组产物，在脂质体2000(Invitrogen产品)的介导下，转染Vero细胞，直到出现典型病变(细胞变圆脱落)。
5.重组病毒的纯化与鉴定
利用有限稀释法(稀释至每个细胞孔中含1个病变灶)对重组病毒进行亚克隆3～5次，通过荧光显微镜下观察荧光和细胞病变的一致性，判定重组病毒的纯化程度。
将纯化的重组病毒肌肉注射5条狂犬病抗体阴性成年犬(雌雄随机)，免疫前及免疫后14天时分别采集犬静脉血，分离血清。利用狂犬病荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测血清狂犬病中和抗体滴度，以中和抗体有无为标准，判定重组病毒是否表达狂犬病病毒糖蛋白(表2)。
表2重组疱疹病毒免疫试验
以上结果表明，重组病毒在犬体内表达了糖蛋白，并能诱导抗狂犬病病毒感染的免疫反应。
实施例3：猪瘟-重组犬2型腺病毒的制备方法
1.绿色荧光蛋白和猪瘟病毒E2蛋白基因表达盒的构建
利用商品化的真核表达质粒载体pIRESneo(图2)的多克隆酶切位点EcoRV和BamHI插入猪瘟病毒E2蛋白基因(序列参照GenBank：AF091507)，利用SmaI和XbaI位点插入绿色荧光蛋白报告基因(序列参照通用质粒pEGPF-C1)，构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白基因的表达盒。
2.重组转座子的构建
通过Nru I和Bst1107 I位点将基因表达盒完整切下，利用T4连接酶插入穿梭载体pMOD-2<MCS>中两转座子序列之间的Sma I位点(图1)，转化大肠杆菌DH5α，获得携带表达盒的重组转座子。
3.转座酶介导的转座反应
根据商品化转座子穿梭载体的使用说明书，将重组转座子经Pvu II酶切游离(图1)和琼脂糖凝胶纯化后，与犬2型腺病毒全基因组等量加入转座酶反应体系中，37℃反应2小时，反应结束后加入1μl终止液，70℃10分钟灭活转座酶活性。
转座酶反应体系(10μl)：1μl反应缓冲液，0.2μg腺病毒基因组DNA，0.2μg重组转座子DNA，5U转座酶，灭菌四馏水补至10μl。
4.重组病毒的包装
将转座子与犬2型腺病毒全基因组的重组产物，在脂质体2000(Invitrogen产品)的介导下，转染MDCK细胞，直到出现典型葡萄串状细胞病变。
5.重组病毒的纯化与鉴定
利用有限稀释法(稀释至每个细胞孔中含1个病变灶)对重组病毒进行亚克隆3～5次，通过荧光显微镜下观察荧光和细胞病变的一致性，判定重组病毒的纯化程度。
将纯化的重组病毒肌肉注射5头猪瘟抗体阴性的试验猪(雌雄随机)，免疫前及免疫后14天时分别采集犬静脉血，分离血清。利用细胞中和试验和直接免疫荧光法检测血清猪瘟病毒中和抗体滴度(以血清稀释度1∶2X表示)，以中和抗体有无为标准，判定重组病毒是否表达E2蛋白(表3)。
表3重组犬2型病毒免疫试验
以上结果表明，重组病毒在猪体内表达了E2蛋白，并能诱导抗猪瘟病毒感染的免疫反应。
实施例4：猪瘟-重组疱疹病毒I型的制备方法
1.绿色荧光蛋白和猪瘟病毒E2蛋白基因表达盒的构建
利用商品化的真核表达质粒载体pIRESneo(图2)的多克隆酶切位点EcoRV和BamHI插入猪瘟病毒E2蛋白基因(序列参照GenBank：AF091507)，利用Sma I和Xba I位点插入绿色荧光蛋白报告基因(序列参照通用质粒pEGPF-C1)，构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白基因的表达盒。
2.重组转座子的构建
通过Nru I和Bst1107 I位点将基因表达盒完整切下，利用T4连接酶插入穿梭载体pMOD-2<MCS>中两转座子序列之间的Sma I位点(图1)，转化大肠杆菌DH5α，获得携带表达盒的重组转座子。
3.转座酶介导的转座反应
根据商品化转座子穿梭载体的使用说明书，将重组转座子经Pvu II酶切游离(图1)和琼脂糖凝胶纯化后，与疱疹病毒I型全基因组等量加入转座酶反应体系中，37℃反应2小时，反应结束后加入1μl终止液，70℃10分钟灭活转座酶活性。
转座酶反应体系(10μl)：1μl反应缓冲液，0.2μg疱疹病毒基因组DNA，0.2μg重组转座子DNA，5U转座酶，灭菌四馏水补至10μl。
4.重组病毒的包装
将转座子与疱疹病毒I型全基因组的重组产物，在脂质体2000(Invitrogen产品)的介导下，转染Vero细胞，直到出现典型病变(细胞变圆脱落)。
5.重组病毒的纯化与鉴定
利用有限稀释法(稀释至每个细胞孔中含1个病变灶)对重组病毒进行亚克隆3～5次，通过荧光显微镜下观察荧光和细胞病变的一致性，判定重组病毒的纯化程度。
将纯化的重组病毒肌肉注射5头猪瘟抗体阴性的试验猪(雌雄随机)，免疫前及免疫后14天时分别采集犬静脉血，分离血清。利用细胞中和试验和直接免疫荧光法检测血清中的猪瘟病毒中和抗体滴度(以血清稀释度1∶2X表示)，以中和抗体有无为标准，判定重组病毒是否表达E2蛋白(表4)。
表4重组疱疹病毒I型免疫试验
以上结果表明，重组病毒在猪体内表达了E2蛋白，并能诱导抗猪瘟病毒感染的免疫反应。
Claims (6)
1.一种利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法，其特征为：在转座酶的作用下，使携带外源基因表达盒的转座子与载体病毒的全基因组发生重组，然后将重组产物转染病毒的包装细胞，获得表达外源基因的重组病毒，经常纯化后制成重组疫苗。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：利用转座子和转座酶介导的DNA重组机制，构建犬2型腺病毒和疱疹病毒I型活载体重组疫苗。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于：利用绿色荧光蛋白报告基因和狂犬病病毒糖蛋白保护性抗原基因、猪瘟病毒E2保护性抗原基因，在转座子和转座酶的介导作用下，将平行表达报告基因和保护性抗原基因的表达盒插入载体病毒的全基因组，并在细胞中获得表达。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于：利用犬2型腺病毒和疱疹病毒I型DNA病毒，在转座子和转座酶的介导作用下，对其基因组进行改造，并获得表达外源基因的重组病毒。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于：利用犬2型腺病毒和疱疹病毒的包装细胞MDCK和Vero，将转座子与载体病毒全基因组的重组产物转染细胞，包装出重组病毒。
6.权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
1)基因表达盒的构建
利用真核表达质粒载体pIRESneo，通过分子克隆技术构建平行表达报告基因(如：绿色荧光蛋白基因)和保护性抗原基因(如：狂犬病病毒糖蛋白基因、猪瘟E2基因)的表达盒；
2)重组转座子的构建
通过常规的酶切、连接和转化技术，将表达盒克隆至带有转座子序列的商品化穿梭载体pMOD-2<MCS>，插入位点为两段转座子序列之间的多克隆酶切位点；
3)转座酶介导的转座反应
根据转座子穿梭载体的使用说明书，将重组转座子经酶切游离和琼脂糖凝胶电泳纯化后，与载体病毒全基因组等量加入转座酶反应体系，37℃反应2小时，反应结束后加入终止液，70℃10分钟灭活转座酶活性；
4)重组病毒的包装
将转座子与载体病毒全基因组的反应物，在转染试剂的介导下，转染载体病毒的包装细胞，包装重组病毒；
5)重组病毒的纯化与鉴定
利用蚀斑克隆或有限稀释法对重组病毒进行亚克隆3～5次，获得纯化的重组病毒；利用针对外源基因的免疫学方法或Southern杂交对重组病毒进行鉴定。
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| PB01 | Publication | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Application publication date: 20101006 Assignee: JILIN HEYUAN BIOENGINEERING LIMITED COMPANY Assignor: Military Veterinarian Inst. of Military Medical Sciences Academy, PLA Contract record no.: 2014220000004 Denomination of invention: Method for constructing virus live vector recombinant vaccine by utilizing transposon Granted publication date: 20120704 License type: Exclusive License Record date: 20140116 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120704 Termination date: 20140618 |
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