CN102676580B - 高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种植物表达载体及高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生的制备方法。所述植物表达载体pCAMBIA1301-Gg1-LTB，是将植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gG1基因、经修饰的大肠杆菌LTB基因、NOS终止子，分别插入到载体pCAMBIA1301中而得到。本发明进一步提供了pCAMBIA1301-Gg1-LTB在制备高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生中的应用。通过本发明方法提高了gG1和LTB基因在花生中的表达量；运用LTB基因，其基因产物具有粘膜免疫佐剂作用，机体服用后能提高单纯疱疹病毒gG1蛋白的免疫原性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生的制备方法。
背景技术
转基因植物作为一种可行的表达系统，具有产物可修饰、安全、廉价、营养、易推广、可进行大规模生产等优点，是今后疫苗发展的方向。目前，已有多种病原微生物亚单位疫苗抗原在转基因植物中表达成功，而且在动物实验中获得了满意的结果。研究较多的受体植物是烟草和马铃薯。研究较多的亚单位疫苗抗原是乙型肝炎病毒表面抗原和人类免疫缺陷病毒包膜蛋白。在转基因植物疫苗研究中发现的主要问题是机体口服后易产生免疫耐受性。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)能与哺乳动物细胞表面神经节苷酯GM 1结合,具有粘膜佐剂活性。将LTB与单纯疱疹病毒gG1基因都作为目的基因一起转移到花生中表达，以发挥LTB的黏膜佐剂作用，减少了机体口服耐受性，提高了单纯疱疹病毒gG1转基因花生的免疫原性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：植物表达量低和机体口服后易产生免疫耐受性。
本发明根据花生密码子的偏好性，修饰gG1和LTB基因序列，但不改变gG1和LTB氨基酸序列，在此基础上构建植物表达载体pCAMBIA1301-Gg1-LTB，使gG1和LTB在花生中高表达。
本发明公开了一种植物表达载体pCAMBIA1301-Gg1-LTB，是将植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gG1基因、经修饰的大肠杆菌LTB基因、NOS终止子，分别通过EcoR I/BamH I,BamH I/Sph I，Sph I/Pst I,Pst I/HindIII酶切位点插入到载体pCAMBIA1301中而得到；其中所述经修饰的单纯疱疹病毒gG1基因序列如SEQ ID No.12所示，所述经修饰的大肠杆菌LTB基因序列如SEQID No.1所示。
本发明还公开了上述植物表达载体pCAMBIA1301-Gg1-LTB在制备高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生中的应用。
一种高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生的制备方法，是用上述植物表达载体pCAMBIA1301-Gg1-LTB转化农杆菌，然后筛选获得阳性农杆菌用于转基因花生转化。
本发明提高了gG1和LTB基因在花生中的表达量；运用LTB基因，其基因产物具有粘膜免疫佐剂作用，机体服用后能提高单纯疱疹病毒gG1蛋白的免疫原性。
附图说明
图1.植物表达载体pCAMBIA1301-gG1的构建
LB：左边界；RB：右边界；Hyg：潮霉素抗性基因；Pro：启动子；Ter：终止子；gus：β—半乳糖醛酸酶。
图2.植物表达载体pCAMBIA1301-gG1-LTB的构建
LB：左边界；RB：右边界；Hyg：潮霉素抗性基因；Pro：启动子；Ter：终止子；gus：β—半乳糖醛酸酶。
图3.ELISA检测小鼠肠道洗液中的IgA
图4.ELISA检测小鼠血清中的IgG
具体实施方式
1．修饰gG1和LTB基因序列
按花生密码子偏好性修饰gG1和LTB基因序列，但不改变氨基酸的序列。
修饰后的gG1基因序列如SEQ ID No.12所示；gG1氨基酸序列没有改变，如SEQID No.13所示。
修饰后的LTB基因序列如SEQ ID No.1所示。LTB氨基酸序列没有改变，如SEQID No.2所示。
2．植物表达载体的构建
（1）植物表达载体pCAMBIA1301-gG1的构建
植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gG1基因、NOS终止子，以这些基因片段为模板，运用Oligo软件设计引物，见表1。按下列反应条件进行PCR扩增：98℃5min；98℃10S，60℃15S，72℃60S，30个循环；72℃延伸10min。回收的扩增产物与提取载体pCAMBIA1301（购自上海希匹吉生物技术有限公司）DNA连接，得到植物表达载体pCAMBIA1301-gG1，见图1。
表1植物表达载体pCAMBIA1301-gG1所用引物序列
（2）植物表达载体pCAMBIA1301-gG1-LTB的构建
植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gG1基因、经修饰的大肠杆菌LTB基因、NOS终止子，以这些基因片段为模板，运用Oligo软件设计引物，见表2。按下列反应条件进行PCR扩增：98℃5min；98℃10S，60℃15S，72℃60S，30个循环；72℃延伸10min。回收的扩增产物与提取载体pCAMBIA1301（购自上海希匹吉生物技术有限公司）DNA连接，得到植物表达载体pCAMBIA1301-gG1-LTB，见图2。
表2植物表达载体pCAMBIA1301-gG1-LTB所用引物序列
（3）两种植物表达载体的鉴定
将上述两种植物表达载体分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组质粒pCAMBIA1301-gG1和pCAMBIA1301-gG1-LTB进行酶切鉴定。
3.农杆菌工程菌株的构建
利用CaCl2法对农杆菌EHA105菌株（链霉素抗性Str.r／甲哌力复霉素抗性Rif.r）制备感受态细胞，采用直接转化法，将表达载体pCAMBIA1301-gG1和pCAMBIA1301-gG1-LTB转化农杆菌。在有Kan 50μg/ml、Rif 25μg/ml、Str25μg/ml的固体LB培养基平板上筛选重组子；挑选单菌落，28℃，200r/min振荡培养，提取农杆菌载体，PCR鉴定阳性农杆菌菌，筛选获得的阳性农杆菌用于转基因植物转化。
4、植物基因转化
利用潮霉素作为选择压。抗性愈伤组织筛选及植株诱导再生将共培养过的花生组织叶盘转移到含有25mg/L潮霉素、300mg/L羧基青霉素和200mg/L头孢霉素的M1选择培养基（M1：l／2MS＋B5生长物质＋BA 0.5mg/L＋NAA 1.0mg/L＋Glu200mg/ml＋酪蛋白水解物（CH）500mg/L＋蔗糖40g/L＋琼脂7.5g/L，pH5.8）上，转接4次后，选择生长较紧密、淡绿色、颗粒状紧密的抗性愈伤组织，接种在M2分化培养基（M2：l／2MS＋B5生长物质＋KT 0.5mg/L＋NAA 1.0mg/L＋Glu200mg/L＋酪蛋白水解物（CH）500mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂7.5g/L，pH5.8，不加潮霉素选择压）上，诱导出不定芽。将诱导再生的不定芽接种到附加有25mg/L潮霉素的M3培养基（M3：l／2MS＋B5生长物质＋BA 0.2mg/L＋KT 0.3mg/L＋NAA 0.1mg/L＋GA31.0mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂7.5g/L，pH5.8）上进行壮苗培养。当转化植株生长至2cm左右时，转接到含有25mg/L潮霉素的M4培养基（M4：l／2MS＋KT 0.2mg/L＋IBA 1.0mg/L＋活性炭（AC）2g/L＋蔗糖15g/L＋琼脂7.5g/L，pH5.7）上诱导生根。将根系生长良好的转化植株转入砂盆培养。
4、利用PCR鉴定转基因植株
采用改良的植物总DNA的快速少量抽提（CTAB）法【闫苗苗，魏光成，潘效红，马怀雷，李伟振。一种适用于动物与植物总DNA提取的方法——改良CTAB法。安徽农业科学。2008,36(20):8488】提取转化植株的总DNA，以此为模板进行PCR，热循环为94℃变性5min；94℃变性30s；72℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环后，72℃延伸10min；琼脂糖凝胶电泳分析、将PCR产物作琼脂糖电泳后，进行Southern印迹转移、杂交。
5、小鼠口服gG1转基因花生种子后的免疫反应
18只雌性BALB/c小鼠(鼠HSV血清抗体阴性)等分为3组：实验组的6只鼠每次口服0.5g转基因花生种子，每周5次，共服用30天；阴性对照组的6只鼠同样服用非转基因花生种子；阳性对照的6只鼠同样服用HSV培养上清液（107PFU/ml）浸泡24h的非转基因花生种子（500g/500ml）。用ELISA检测小鼠肠道洗液中的IgA和血清中的IgG水平，结果见图3和图4。服用pCAMBIA1301-Gg1-LTB转化花生组，肠道洗液中的IgA和血清中的IgG水平显著高于pCAMBIA1301-Gg1转化花生组（p＜0.05）。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生的制备方法
<130>
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列
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atggctccac aaagcattac cgagctttgc agcgagtaca ggaacaccca aatttacacc 60
attaacgata agattcttag ctacaccgag agcatggctg gaaagaggga gatggttatt 120
attaccttca agagcggagc taccttccaa gttgaggttc caggaagcca acacattgat 180
agccaaaaga aggctattga gaggatgaag gataccctta ggattaccta ccttaccgag 240
accaagattg ataagctttg cgtttggaac aacaagaccc caaacagcat tgctgctatt 300
agcatggaga ac 312
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> 花生
<400> 2
Met Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr
1 5 10 15
Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met
20 25 30
Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr
35 40 45
Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys
50 55 60
Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu
65 70 75 80
Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser
85 90 95
Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn
100
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<212> DNA
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ccggaattcc atggagtcaa agattcaaat ag 32
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gatagcccaa ccgctattag ccttaccacc ccagatcaca ccccaccaat gccaagcatt 180
ggacttgagg aggaggagga ggaggaggag gttgctggag atggagagca ccttaaggga 240
ggagatggaa ccagggatac ccttccacaa agcccaggac cagctgttcc acttgctgga 300
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<213> 人工序列
<400> 13
Leu Val Leu Val Gly Val Ser Gly Val Pro Thr Asn Val Ser Ser Thr
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Thr Gln Pro Gln Leu Gln Thr Thr Gly Arg Pro Ser His Glu Ala Pro
20 25 30
Asn Met Thr Gln Thr Gly Thr Thr Asp Ser Pro Thr Ala Ile Ser Leu
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Thr Thr Pro Asp His Thr Pro Pro Met Pro Ser Ile Gly Leu Glu Glu
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Pro Leu Ala Gly Asp Asp Glu Lys Asp Lys Pro Asn Arg Pro Val Val
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Pro Pro Pro Gly Pro Asn Asn Ser Pro Ala Arg Pro Glu Thr
115 120 125
Claims (3)
1.一种植物表达载体pCAMBIA1301-Gg1-LTB，是将植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gG1基因、经修饰的大肠杆菌LTB基因、NOS终止子，分别通过EcoR I/BamH I, BamH I/Sph I，Sph I/Pst I, Pst I/ Hind III酶切位点插入到载体pCAMBIA1301中而得到；其中所述经修饰的单纯疱疹病毒gG1基因序列如SEQ ID No.12所示，所述经修饰的大肠杆菌LTB基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述植物表达载体pCAMBIA1301-Gg1-LTB在制备高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生中的应用。
3.一种高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生的制备方法，是用权利要求1所述植物表达载体pCAMBIA1301-Gg1-LTB转化农杆菌，然后筛选获得阳性农杆菌用于转基因花生转化。
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