CN1513987A - 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的重组伪狂犬病病毒及应用 - Google Patents

Abstract

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒及其应用，现行的伪狂犬病疫苗Bartha－K61株是一株gE基因缺失疫苗。本发明是提供一种用以表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒(Herpesviridae－Alphaherpesviridae－Varicellovirus－pseudorabies virus)保藏号CCTCC－V200307，它以Bartha－K61株为亲本株，利用重组DNA技术和同源重组构建了一株伪狂犬病病毒突变株。该毒株可作为基因工程标记疫苗用于伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征的免疫预防。此外，可用其它病原的抗原基因置换其LacZ基因，构建以该毒株为基础的多价基因工程活载体疫苗。

Description

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的重组伪狂犬病毒及应用

技术领域：本发明是一种应用在动物体上的疱疹病毒载体及其应用，特别是以呈弱毒疫苗株为材料，分离并克隆复制非必需的毒力基因，以其为基础构建的通用伪狂犬病病毒转移载体。

背景技术  伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV或Aujeszky’s diseasevirus，ADV)是引起多种动物共患的伪狂犬病的病原。PRV在分类学上属于：

病毒界(Vira)----疱疹病毒科(Herpesviridae)----甲疱疹病毒亚科(Alphaherpesviridae)----水痘病毒属(Varicellovirus)----伪狂犬病病毒(pseudorabies virus)

猪是PRV的自然宿主，但其它多种动物也可被感染。感染猪呈现的临床症状常因年龄、免疫力、病毒的毒力以及感染的剂量不同而不一致。通常首次感染的猪群发病最为严重，架子猪最为易感，表现的临床症状多为神经紊乱，断奶前仔猪死亡率高达100％，随着年龄增长，死亡率逐渐降低，成年猪则以发热、食欲下降、流鼻涕、咳嗽、呼吸困难和增重减慢为主，但症状比较轻微，死亡率通常低于5％。在公猪和妊娠母猪可以看到繁殖障碍，如睾丸鞘膜炎、流产、死胎和木乃伊胎等。防制伪狂犬病主要靠疫苗接种，目前已有商品化灭活疫苗和弱毒疫苗，弱毒疫苗容易制备，成本较低。

PRV Bartha-K61株是二十世纪六十年代匈牙利Bartha等人将PRV野毒株用鸡胚成纤维细胞反复传代而获得的一个人工致弱疫苗株(Res Vet Sci，1975，19(1)：17-22)，其毒力大大减弱，免疫原性很好，在国内外应用数十年，证明是安全有效的，在防制伪狂犬病中发挥了重要作用。该毒株最大特点是呈现gE-表型，亦即其gE基因编码功能丧失，据此可以进行疫苗接种动物与野毒感染动物的鉴别诊断，使得扑灭计划的实施成为可能，然而它也有不足之处，通过传代致弱的疫苗株是非克隆变异株的混合物，容易回复突变，此外它具有一定的神经毒力，可引起潜伏感染(J Virol Methods，1994，50(1-3)：269-280)，因此对Bartha-K61株的改造十分必要。

目前有好几种猪源病毒被用作疫苗载体，如猪腺病毒(J Gen Virol，1995，(12)：3153-3157；J Gen Virol，1995，76(7)：1583-1589；Vaccine，1996，14(11)：1083-1087；J Gen Virol，1999，80(3)：563-570)、猪痘病毒(Adv Vet Med，1999，41：463-480)、痘苗病毒(Can J Vet Res，1996，60(4)：315-317)、伪狂犬病病毒(Gene，1986，50：215-224；J Virol，1991，5 (5)：2761-2765)，等等。

一些学者在这方面进行了开拓性研究。Keeler等最早构建了表达gIII-β-半乳糖苷融合蛋白的重组伪狂犬病病毒(Gene，1986，50：215-224)。继之，Thomsen等用伪狂犬病病毒作为活病毒载体，表达出了显著水平的人组织纤溶酶原激活剂(tPA)(Gene，1987，57：261-265)。此后，Whealey等用伪狂犬病病毒作为载体表达了PRV gIII-HIV-1囊膜蛋白的融合蛋白(J Virol，1988，62：4185-4195)，开创了研制伪狂犬病病毒活载体疫苗的先河。Van Zijl等构建了表达猪瘟病毒E1基因的重组伪狂犬病病毒，并取得了令人鼓舞的免疫保护效果(J Virol，1991，65(5)：2761-2765)。为了降低病毒载体的传播能力，Peeters等进一步缺失了伪狂犬病病毒侵入相关基因gD，构建了表达猪瘟病毒E2基因(即以前的E1基因)的gD^-/gE^-重组伪狂犬病病毒，它是一株自限性、非传播性突变株，只能通过细胞-细胞间的直接传递方式局部扩散，但子代病毒没有感染性，该重组病毒也能对猪瘟和伪狂犬病提供双重免疫保护(J Gen Virol，1997，78：3311-3315)。

国内专利查新结果表明，有两个专利涉及伪狂犬病病毒基因缺失突变株，一个涉及gp50(gD)基因的缺失和猪瘟病毒E1基因的插入(中华人民共和国专利局，专利申请号93108005.3)，一个涉及蛋白激酶(即PK)基因和或28K基因缺失(中华人民共和国专利局，专利申请号90106840.3)，均未涉及TK和gE缺失。目前尚无表达PRRSV蛋白基因的重组伪狂犬病病毒疫苗株方面的专利。

发明内容：本发明的目的是提供一种以PRV Bartha-K61株(呈gE/gI阴性表型)为亲本株，采用分子克隆和重组DNA技术构建了通用伪狂犬病病毒转移载体(插入载体)，在此基础上，利用同源重组培育了一株表达PRRSV GP5基因的重组伪狂犬病病毒。该重组病毒TK基因被缺失，故在神经组织复制能力和毒力得以减弱，可以作为预防伪狂犬病的双基因缺失标记疫苗，同时该病毒表达PRRSV保护性抗原GP5，因此可以作为抗猪繁殖与呼吸综合征和伪狂犬病的双价基因工程活载体疫苗。此外该病毒基因组内插入了LacZ基因，它不仅可以作为一个筛选标记，还可以被其它外源基因替换以构建预防多种疫病的多价基因工程疫苗。

本发明是由以下的方法实现的：

本发明以呈gE^-表型的弱毒疫苗Bartha-K61株为材料，分离并克隆了PRV复制非必需的毒力基因TK基因，以其为基础构建了通用伪狂犬病病毒转移载体。

一种表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒(Herpesviridae-Alphaherpesviridae---Varicellovirus---pseudorabies virus)保藏号CCTCC-V200307。保藏在武汉：中国典型培养物保藏中心，保藏日期2003年5月26日。

上述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，所述的病毒衍生于伪狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株。

上述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，所述的病毒与伪狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株均为弱毒株，二者共有特征是gE/gI基因缺失，不产生功能性gE/gI蛋白。

上述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，该病毒是利用重组DNA技术构建的伪狂犬病病毒突变株，其不同于伪狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株的新特征有TK基因的缺失、猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的插入以及大肠杆菌半乳糖苷酶基因的插入。

上述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，所述的病毒不产生功能性胸苷激酶，但表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原和大肠杆菌半乳糖苷酶。

上述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，所述的病毒不产生功能性胸苷激酶，但表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原和大肠杆菌半乳糖苷酶。

一种上述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒在生产预防猪繁殖与呼吸综合征和伪狂犬病的标记疫苗上的应用。

本发明的优点是：

1.本发明以呈gE^-表型的弱毒疫苗Bartha-K61株为材料，分离并克隆了PRV复制非必需的毒力基因TK基因，以其为基础构建了通用伪狂犬病病毒转移载体。我们在此转移载体中引入了完整的表达元件(强启动子和polyA信号)，这十分有利于表达实用的异源基因(如病原体抗原基因或生物活性因子基因)，多克隆位点的引入更提高了该转移载体的通用性和实用性。

2.构建伪狂犬病病毒突变株大体有以下几种方法。一是构建引入突变的转移载体，与病毒基因组共转染通过同源重组构建变异株，这是经典的重组病毒构建方法，但效率较低；二是构建伪狂犬病病毒基因文库，然后将突变引入某一克隆片段，通过该克隆与其它互补克隆共转染而将突变引入到伪狂犬病病毒基因组中；三是将噬菌体P1的LoxP位点引入伪狂犬病病毒基因组中，然后通过Lox/Cre介导的点特异性重组而将突变引入伪狂犬病病毒基因组中，这种方法重组效率为5～20％；四是运用双链断裂修复和单链退火机制将外源基因通过同源重组引入到病毒基因组中，重组率高，筛选容易，但由于PRV基因组中缺少单一位点无法应用此策略。本专利采用转移载体与PRV基因组共转染法获得重组伪狂犬病病毒。避免或者减轻了以上的问题。

3.现行的伪狂犬病疫苗Bartha-K61株是一株gE基因缺失疫苗。本发明以Bartha-K61株为亲本株，利用重组DNA技术和同源重组构建了一株伪狂犬病病毒突变株。该毒株TK基因已被人工失活，对动物神经毒力大大降低，其gE基因缺失可作为该毒株的一个生物学标记，该表型使之与野毒株相鉴别，该毒株能表达猪繁殖与呼吸综合征病毒保护性抗原GP5和大肠杆菌LacZ，LacZ可以作为另一筛选标记。该毒株可作为基因工程标记疫苗用于伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征的免疫预防。此外，可用其它病原的抗原基因置换其LacZ基因，构建以该毒株为基础的多价基因工程活载体疫苗。

构建基于伪狂犬病病毒弱毒株的病毒活载体疫苗，既保留了伪狂犬病弱毒疫苗的优良特性，又赋予其对其它病原的免疫保护能力。病毒活载体疫苗的最大特点是这种病毒活载体疫苗集亚单位疫苗的安全性和弱毒疫苗的抗原增殖能力于一身，能诱使机体产生针对载体持续表达的抗原的保护性细胞免疫和体液免疫，因此具有广阔的开发前景。

4.胸苷激酶(TK)基因是PRV复制非必需基因，也是其主要毒力基因之一，TK基因赋予病毒在神经元中的感染和复制能力，而TK缺失变异株在神经细胞等非分裂细胞中的复制能力则相当低，使得潜伏于神经组织的病毒难以激活。由于分化的神经组织中内源性TK的正常含量低，删除TK基因使病毒不再产生胸苷激酶，可大大降低疫苗病毒的毒力，提高其安全性，故TK基因成为构建基因缺失疫苗的首选靶基因。而gE基因是与神经嗜性有关的毒力基因，也是复制非必需基因，因此近年来国际上伪狂犬病疫苗研究的发展趋势是开发以TK^-/gE^-PRV突变株为基础的疫苗株。已经证实Bartha-K61株是一个gE基因缺失疫苗株，如果再缺失其TK基因将进一步降低其毒力，有利于该疫苗株的推广应用。采用酶解缺失的方法删去TK基因部分片段，这样获得的TK缺失PRV突变株不仅安全性更有保障，而且便于重组病毒的筛选(用TK阴性细胞系加以5′-溴脱氧尿苷或其类似物进行筛选)，同时在TK基因缺失位置可以插入外源基因构建其它病原的病毒活载体疫苗株。

5.本发明使用的病毒活载体疫苗的最大特点是它能激发机体对载体呈送的抗原产生保护性细胞免疫和体液免疫，但使用重组病毒疫苗面临的首要问题是亲本病毒的致病可能性。因此在遗传操作过程中，在确保外源基因获得最佳表达又不影响病毒繁殖的前提下，尽量降低载体病毒的致病性是非常必要的。开发成功的病毒载体的要素包括：支持病毒增殖的细胞培养系统、病毒基因组中存在适当的非必需区可供插入外源基因而不影响病毒的复制、编码病原的免疫原基因、强大的转录调控元件以保证外源基因的最适表达、将外源基因导入非必需位点的操作程序以及鉴别重组病毒和野毒的便利方法。本发明实现了这些要素。

6.疱疹病毒作为载体构建多价基因工程疫苗历史并不短，但伪狂犬病病毒载体的开发应用则起步较晚，主要是由于该病毒基因组庞大、分子生物学研究相对滞后之故。伪狂犬病病毒是作为一种疱疹病毒，拥有庞大的基因组(基因组长达145kb)和许多病毒复制非必需区可供插入外源基因，这构成开发伪狂犬病病毒活载体疫苗的分子病毒学基础。此外PRV宿主感染谱广泛，却不容易感染人类，因而可以用于开发表达其它动物病原基因的基因工程疫苗。

7.猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是1991年前发现的新猪病，引起猪繁殖障碍和呼吸道疾病，现已遍及全球，给养猪业造成很大损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是其病原(Vet Q，1991，13：121-130)，其基因组包括8个开放阅读框架(ORF)，其中ORF5编码糖基化的囊膜蛋白GP5(Virology，1995，206：155-163)，是病毒主要结构蛋白和保护性抗原。据报道，识别PRRSVGP5的单抗可中和病毒的感染性(J Gen Virol，1997，78(8)：1867-1873；J GenVirol，1998，79：989-999)，研究结果还表明GP5至少存在两种类型的抗原表位，一种是线性的，一种是构象依赖性的(J Gen Virol，1997，78(8)：1867-1873)。本发明在通用伪狂犬病病毒转移载体基础上，插入PRRSV GP5基因，通过体外转染筛选构建了以Bartha-K61为亲本株的表达PRRSV GP5基因、呈TK^-/gE^-表型重组伪狂犬病病毒。该重组病毒可作为预防猪繁殖障碍的二价基因工程疫苗候选株，为改造和利用Bartha-K61株、培育表达外源基因的TK^-/gE^-重组PRV突变株、开发二价甚至多价基因工程疫苗提供了物质基础和技术平台，对我国基因工程疫苗产品的系列化、规范化发展具有促进作用。

附图说明：

图1为伪狂犬病病毒基因组酶切图谱。BglII将伪狂犬病病毒基因组切成A-F共6个片段，BamHI将切成1-15共18个片段，KpnI将其切成A-M共16个片段。本发明涉及的转移载体插入位点及同源臂位于BamHI-11片段或KpnI-J片段中。

图2为通用PRV转移载体结构图。ColE1为复制子，Amp⁺为氨苄青霉素抗性基因，P_CMV为人巨细胞病毒立即早期启动子，MCS为多克隆位点，包括HindIII、EcoRI、PstI、EcoRV、NotI、XhoI、NsiI和XbaI，BGH polyA为牛生长激素转录终止信号，PRVR/PRVL为来自伪狂犬病病毒基因组的同源臂序列，TKR/TKL为TK基因两侧序列，中间缺失277bp。

图3为转移质粒构建流程。pCR-GP5为含有PRRSV GP5基因的重组质粒，pSTK为含有PRV基因组BamHI-11片段的重组pBluescript II SK+质粒，其中1.4kb的BamHI/KpnI片段与KpnI-J片段中的BamHI/KpnI片段同源，pBS-LacZ含有SV-40启动子控制下的LacZ基因表达盒。

图4为应用Western blotting检测PRRSV GP5基因在重组PRV病毒中的表达。PK15细胞单层分别接种rPRV-GP5和Bartha-K61株后，提取病毒粒子，进行SDS-PAGE分析，然后转印至硝酸纤维膜上，用PRRS特异性抗血清检测。1.蛋白质分子量标准，2.PRV Bartha-K61株感染PK-15细胞，3.rPRV-GP5感染PK-15细胞，4.PK-15细胞。

具体实施方式：

实施例：

伪狂犬病病毒基因组及其物理图谱见附图1。伪狂犬病病毒转移载体构建策略见附图2。分子克隆按已报道的方法操作(Molecular Cloning.A LaboratoryManual，2^nd edition，Cold Spring Press，Cold Spring Harbor，1991)。伪狂犬病病毒Bartha-K61株用PK15细胞按已报道的方法(Aujeszky’s disease(CurrentTopics in Veterinary Medicine and Animal Science)，USA，1982，72：1768-1772)增殖。

提取Bartha-K61株基因组DNA，用KpnI充分消化，回收其KpnI-J片段(约5.9 kb)，将其克隆于pUC119的KpnI位点，获得pBTK5.9，经用引物P_STK/P_RTK进行PCR扩增证实其中的KpnI-PstI或KpnI-BamHI片段含有完整的TK基因。P_STK：5′-CCC AAG CTT GCT GGG CGT CTT GAA G-3′，P_RTK：5′-ATG CTG CAG GGC ACG GCAAAC TTT-3′，根据已发表的PRV NIA-3株(J Gen Virol，1991，72：1435-1439)TK基因序列设计。将此KpnI-PstI片段(2.6kb左右)亚克隆于pUC119的KpnI/PstI位点，获得重组质粒pBTK2.6，用ABI PRISM 377 DNA Sequencer测定插入片段的序列，测序结果显示，Bartha-K61株KpnI-J片段的KpnI-PstI片段为2 576bp，其中含有完整的UL24和UL23(即TK基因)编码序列以及UL25和UL22的部分编码序列，它们的相对位置和方向与其它甲疱疹病毒相近(J Gen Virol，1989，70：3003-3013)。

用EcoRI消化pBTK2.6后，用Klenow酶大片段补平并自连，得到pBTKΔE，再分别用NotI和HindIII消化缺失384bp(其中含有PstI和NotI位点)，以Klenow酶大片段补平后自连，得到pBTKΔEΔH/N。这样，质粒pBTK2.6上的EcoRI及PstI、NotI和HindIII位点相继消失。

用引物P_SUni/P_RUni(P_SUni：5′-TTT TGC CGA TTT CGG CCT ATT GGTT-3′，P_RUni：5′-GGA TAA CCG TAT TAC CGC CAC TGG TT-3′)扩增真核表达质粒pCR3-Uni(PCR条件为95℃5min；94℃1min，53.1℃，72℃1min，35个循环；72℃7min)，获得1kb左右的片段(其中含有CMV极早期启动子、多克隆位点和BGH polyA信号)。用Klenow酶大片段补平，得到Uni-CMB。用AccI消化pBTKΔEΔH/N以缺失277bp(该片段的缺失导致XhoI位点的消失)，回收大片段，用Klenow大片段酶补平，再用碱性磷酸酶脱磷酸，与Uni-CMB相连接，得到TK基因缺失的通用转移载体pBdTK-Uni(附图3、4)。其多克隆位点中独特的插入位点有：HindIII、EcoRI、PstI、EcoRV、NotI、XhoI、NsiI和XbaI。该转移载体含有氨苄青霉素抗性基因，用它转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，转化菌可在含有氨苄青霉素的LB培养基增殖，转化菌可以置于含30％甘油的LB培养基中，放于-70℃冰箱保存。

用EcoRI/PstI从pCR-ORF5切下GP5基因(生物技术，1999，9(2)：1-3)，GP5基因核苷酸序列及其氨基酸序列见附图4，将其插入到上述通用转移载体的EcoRI/PstI位点，获得pBdTK-GP5，在其中KpnI位点插入来源于pSTK的1.7kb KpnI片段(其中含有TK基因的下游部分序列，pSTK为含有PRV基因组BamHI-11片段的重组pBluescript II SK+质粒，其中1.4kb的BamHI/KpnI片段与KpnI-J片段中的BamHI/KpnI片段同源)(周复春，华中农业大学博士学位论文，1998，p48)，获得转移质粒pBdTK2-GP5。用SalI将LacZ表达盒从pBS-LacZ(刘长军，东北农业大学硕士论文，2000，p43)切下补平，插入到Tth111I酶切并补平的pBdTK2-GP5中，得到pBdTK2-GP5-LacZ。经酶切和PCR鉴定后制备重组质粒，采用Wizard^PureFection Plasmid DNAPurification System(Promega公司产品)按厂家提供的操作手册制备和纯化转移质粒，测定纯度和浓度后冻存，供转染之用。

用0.25％胰酶-EDTA消化液消化PK15细胞，用含100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素(双抗)和10％胎牛血清的DMEM完全培养基分种于35mm细胞培养皿中，置于5％CO₂培养箱中培养18～24h，长至50～80％细胞单层。用Lipfect AMINE PLUS^TM Reagent(GIBCO公司)按产品说明书用2μg纯化转移质粒pBdTK-GP5-LacZ和1μg Bartha-K61基因组DNA共转染PK-15细胞，同时设无质粒转染细胞对照，感作5小时，加培养液继续培养72～96h，收获转染产物。将转染产物反复冻融三次后，接种于LM单层细胞培养物(TK阴性小鼠成纤维细胞系，引自中国典型培养物保藏中心，武汉)，吸附1h。加入维持液(含双抗和5％胎牛血清的DMEM培养液)，另加终浓度为100μg/ml的5-溴脱氧尿苷(BrdU，GIBCO产品)，置于37℃ 5％CO₂培养箱中培养72h后收获，反复冻融三次。如此反复筛选3次，每次取样提取总DNA，用引物P5S/P5R和PSTK/PRTK进行PCR鉴定。P_S5：5′-GAA TTC GAA TTC ATG TTG GGG AAATGC TTG ACC-3′，P_R5：5′-GGA TCC GGA TCC GGC AAA AGC CAT CTAGGG-3′，根据CH-1a株序列(AY032626)设计。

按已叙述的方法(动物病毒学，第二版，北京：科学出版社，1997，p239-242)将疑似重组病毒进行3轮蚀斑纯化，每次用上述PCR方法鉴定。获得的重组病毒命名为rPRV-GP5，冻存于-70℃冰箱，或冻干后保存于-20℃。

用PK15细胞测定重组PRV蚀斑形成能力和病毒滴度，与PRV Bartha-K61株相比，重组病毒rPRV-GP5在PK-15细胞中增殖滴度和蚀斑大小无明显差异。

将PRV Bartha-K61株和重组PRV分别接种于LM细胞(小鼠成纤维细胞系，TK阴性，购自中国典型培养物菌种收藏中心(武汉))单层，同时设未接种细胞对照。37℃下吸附1h，用Hank’s液洗3次，加入含1μCi[³H]dThd(脱氧胸苷，Sigma公司产品)DMEM维持液，置37℃培养12h，刮取细胞，用PBS缓冲液洗涤3次，用Wizard^Genomic DNA Purification Kit(Promega公司产品)提取细胞基因组DNA，点于DE-81膜上，烘干后放于闪烁瓶中进行放射性测定，结果显示，该重组PRV明显缺乏胸苷激酶活性(附图6)，表明该重组病毒的TK基因确已失活。此前已经证实，Bartha-K61为gE^-表型(J Virol，1984，58：970-979)，从而表明本研究构建的重组PRV为gE^-/TK^-变异株，是一株候选的双基因缺失标记疫苗。

将rPRV-GP5和Bartha-K61株分别接种于PK-15单层细胞中，待出现细胞病变后，用PBS缓冲液洗涤三次后，收集感染细胞，制备细胞涂片，以未接种的PK-15细胞作为阴性对照，用PRRSV特异性抗血清和羊抗猪荧光抗体按照郭宝清等报道的方法(中国兽医科技，1996，26(3)：3-5)进行间接免疫荧光试验，可见特异性免疫荧光。

用PK-15细胞大量培养rPRV-GP5，反复冻融3次，再用超声波处理，经高速离心除去细胞碎片，再用10000×g超速离心2h制备病毒粒子，然后进行SDS-PAGE分析。分离胶为8％，积层胶为5％，200V电压下电泳45min。再用Bio-Rad半干型转移电泳仪将凝胶转印至硝酸纤维素膜上。将转印的硝酸纤维素膜置于含10％马血清的磷酸盐缓冲液(PBS)中，4℃下封闭24h后，用PBS洗三次。继续加入100倍稀释的PRRSV阳性血清混匀后置于37℃温箱中作用1h，用含0.05％吐温的PBS洗涤三次，再用洗膜缓冲液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris.Cl，pH7.5)漂洗二次，倾去洗液，加入30ml洗膜缓冲液，加入以1∶30000稀释的碱性磷酸梅酶标记的兔抗猪IgG(二抗)，于室温下平缓摇动，作用1h。用洗膜缓冲液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris.Cl，pH7.5)漂洗3次。再加显色缓冲液(100mol/L NaCl，5mmol/L MgCl₂，100mmol/L Tris.Cl，pH9.5)缓冲液和99μl底物NBT与BCIP(华舜公司产品)混合液[66μl NBT溶液(取0.5g NBT溶于10ml 70％二甲基甲酰胺中)和33μl BCIP(取0.5g BCIP溶于10ml100％二甲基甲酰胺中)混匀]，避光显色数秒后，用PBS终止显色反应。结果表明，GP5基因在重组病毒rPRV-GP5中获得表达(附图7)。

该毒株已经在申请日前保藏，保藏号CCTCC-V200307，该毒株可作为基因工程标记疫苗用于伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征的免疫预防。此外，可用其它病原的抗原基因置换其LacZ基因，构建以该毒株为基础的多价基因工程活载体疫苗。

                        通用PRV转移载体全序列

agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacagg

tttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaa 100

cgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatg

ttgtgtggaattgtgagcggataacaattt 200

ACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTACGCGCGCGTTGACATTGATTAT

TGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG 1700

GGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGA

CCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTC 1800

AATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTAC

GGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAA 1900

GTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCA

GTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTT 2000

GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGT

GGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCC 2100

AAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTC

GTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATG 2200

GGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTA

CTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACT 2300

AAATGCTA GAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCC

CCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCC 2500

ACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCT

GGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGG 2600

gagctcgaattaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacc 3300

Caacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcg

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Ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcc

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Cgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacgg

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cctggccttttgctggccttttgctcaca 6000

tgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgct

cgccgcagccgaacgaccgagcgcagcga 6100

gtcagtgagcgaggaagcggaag 6123

    PRRSV GP5基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列

  1 ATGTTGGGGA AATGCTTGAC CACGGGCTGT TGCTCGCGAT TGCTTTCTTT GTGGTGTATC

    M  L  G   K  C  L  T   T  G  C   C  S  R   L  L  S  L   W  C  I

 61 GTGCCGTTCT GTTTTGCTGT GCTCGTCAAC GCCAACAGCA ACAGCAGCTC TCATTTTCAG

    V  P  F   C  F  A  V   L  V  N   A  N  S   N  S  S  S   H  F  Q

121 TTGATTTATA ACTTGACGCT ATGTGAGCTG AATGGCACAG ATTGGCTGGC TAACAAATTT

    L  I  Y   N  L  T  L   C  E  L   N  G  T   D  W  L  A   N  K  F

181 GACTGGGCAG TGGAGACTTT TGTCATCTTT CCCGTGTTGA CTCACATTGT TTCCTATGGG

    D  W  A   V  E  T  F   V  I  F   P  V  L   T  H  I  V   S  Y  G

241 GCACTCACCA CCAGCCATTT CCTTGACACA GTTGGTCTGG TCACTGTGTC CACCGCCGGG

    A  L  T   T  S  H  F   L  D  T   V  G  L   V  T  V  S   T  A  G

301 TTTTATCACG GGCGGTATGT CTTGAGTAGC ATCTACGCGG TCTGTGCTCT GGCTGCGTTG

    F  Y  H   G  R  Y  V   L  S  S   I  Y  A   V  C  A  L   A  A  L

361 ATTTGCTTCG TCATTAGGCT TGCGAAGAAC TGCATGTCCT GGCGCTACTC TTGTACCAGA

    I  C  F   V  I  R  L   A  K  N   C  M  S   W  R  Y  S   C  T  R

421 TATACCAACT TCCTTCTGGA CACTAAGGGC AGACTCTATC GTTGGCGGTC GCCCGTTATT

    Y  T  N   F  L  L  D   T  K  G   R  L  Y   R  W  R  S   P  V  I

481 GTAGAGAAAG GGGGTAAGGT TGAGGTCGAG GGTCACCTGA TCGACCTCAA AAGAGTTGTG

    V  E  K   G  G  K  V   E  V  E   G  H  L   I  D  L  K   R  V  V

541 CTTGATGGTT CCGTGGCAAC CCCTTTAACC AGAGTTTCAG CGGAACAATG GGGTCGTCTC

    L  D  G   S  V  A  T   P  L  T   R  V  S   A  E  Q  W   G  R  L

        601 TAG

        ATC

       试验项目                   TK活性(c.p.m)

     未感染LM细胞                   5013

     PRV Bartha-K61株感染LM细胞     4961

     rPRV-GP5感染LM细胞             48237

                         c.p.m.＝curie per mmol

重组伪狂犬病病毒胸苷激酶活性测定结果。将PRV Bartha-K61株和重组PRV分别接种于LM细胞单层，同时设未接种细胞对照。37℃下吸附1h，用Hank’s液洗3次，加入含1μCi[³H]dThd(脱氧胸苷，Sigma公司产品)DMEM维持液，置37℃培养12h，刮取细胞，用PBS缓冲液洗涤3次，用Wizard^Genomic DNA Purification Kit(Promega公司产品)提取细胞基因组DNA，点于DE-81膜上，烘干后放于闪烁瓶中进行放射性测定。c.p.m.＝curie per mmol。

Claims (7)

1.一种表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒(Herpesviridae-Alphaherpesviridae---Varicellovirus---pseudorabies virus)，保藏号CCTCC-V200307。

2.根据权利要求1所述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，其特征是：所述的病毒衍生于伪狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株。

3.根据权利要求1所述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，其特征是：所述的病毒与伪狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株均为弱毒株，二者共有特征是gE/gI基因缺失，不产生功能性gE/gI蛋白。

4.根据权利要求1或2或3所述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，其特征是：该病毒是利用重组DNA技术构建的伪狂犬病病毒突变株，其不同于伪狂犬病病毒Bartha-K61疫苗株的新特征有TK基因的缺失、猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的插入以及大肠杆菌半乳糖苷酶基因的插入。

5.根据权利要求1或2或3所述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，其特征是：所述的病毒不产生功能性胸苷激酶，但表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原和大肠杆菌半乳糖苷酶。

6.根据权利要求4所述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒，其特征是：所述的病毒不产生功能性胸苷激酶，但表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原和大肠杆菌半乳糖苷酶。

7.一种上述的权利要求所述的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒在生产预防猪繁殖与呼吸综合征和伪狂犬病的标记疫苗上的应用。

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