CN118185885A - 一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法 - Google Patents
一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118185885A CN118185885A CN202410361207.5A CN202410361207A CN118185885A CN 118185885 A CN118185885 A CN 118185885A CN 202410361207 A CN202410361207 A CN 202410361207A CN 118185885 A CN118185885 A CN 118185885A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- avian
- recombinant
- type
- influenza virus
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 41
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 10
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 54
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 8
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 claims description 7
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 4
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 3
- 241001135572 Human adenovirus E4 Species 0.000 claims description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 abstract 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法,H3N8禽流感病毒HA蛋白,其序列如SEQ ID NO.1所示;重组血清4型禽腺病毒,其中使用H3N8禽流感病毒HA基因替换血清4型禽腺病毒Fiber‑2基因,替换的是血清4型禽腺病毒Fiber‑2基因的253位核苷酸到1440位核苷酸。本发明利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入H3N8禽流感病毒HA基因,成功获得了表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒,此重组病毒可作为免疫防控H3N8以及血清4型腺病毒的二联疫苗候选株。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法,属于基因工程技术领域。
背景技术
低致病性禽流感病毒H3N8感染主要导致家禽产蛋下降和呼吸道疾病,且可跨宿主传播。本发明以血清4型禽腺病毒为载体,将H3N8禽流感病毒的HA基因替换血清4型禽腺病毒的Fiber-2基因,成功构建了表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒,为联合防控血清4型禽腺病毒和H3N8禽流感病毒提供了二联候选疫苗毒株。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷,提供一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法。
为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒,其特征是:
H3N8禽流感病毒HA蛋白,其序列如SEQ ID NO.1所示;
重组血清4型禽腺病毒,其中使用H3N8禽流感病毒HA基因替换血清4型禽腺病毒Fiber-2基因,替换的是血清4型禽腺病毒Fiber-2基因的253位核苷酸到1440位核苷酸。
一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒的制备方法,该制备方法包括以下步骤:
(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对血清4型禽腺病毒Fiber-2基因的sgRNA,其序列如表1所示;
(2)通过PCR和同源重组的方法构建携带H3N8禽流感病毒HA基因和RFP表达盒的供体质粒,其中RFP表达盒两端都带有LoxP位点,PCR使用的引物序列如表2所示;
表2构建供体质粒所用的PCR引物
(3)6孔板接种LMH细胞培养过夜,共转染sgRNA和供体质粒各3μg,转染6h后去除转染上清并加培养液;转染12h后感染表达EGFP的重组4型腺病毒(FA4-EGFP),感染2h后换成细胞维持液;
(4)感染FA4-EGFP后观察RFP红色荧光,利用空斑试验和有限稀释的方法进行红色荧光重组病毒的纯化,获得带有RFP表达盒的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒;
(5)纯化后的红色荧光重组病毒接种转染Cre重组酶的LMH细胞,4d后取感染的细胞上清再次接种转染Cre重组酶的LMH细胞,重复该过程直至红色荧光病毒完全消失;使用PCR、I FA和Western Blot的方法对去除RFP表达盒的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒进行鉴定。
表达EGFP的重组病毒FA4-EGFP,其特点是能够表达绿色荧光EGFP,区别于重组病毒的红色荧光蛋白RFP,便于快速纯化重组病毒,重组病毒FA4-EGFP的详细构建方法见专利CN112877303A。
本发明方法先进科学,通过本发明,本发明的目的是基于CRISPR-Cas9技术构建表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒,本发明的关键技术是利用CRISPR-Cas9技术在血清4型禽腺病毒中插入H3N8禽流感病毒HA基因以及带有LoxP位点的RFP表达盒,利用RFP蛋白进行病毒的纯化,纯化完成后使用Cre重组酶敲除RFP表达盒,最后获得可以稳定表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒。
本发明所述的是一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒,利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入H3N8禽流感病毒HA基因,成功获得了表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒,此重组病毒可作为免疫防控H3N8以及血清4型腺病毒的二联疫苗候选株。
附图说明
图1为表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组病毒的构建策略示意图;
图2为初代重组病毒FAdV4-HA(H3)-RFP的荧光图;
a:母本病毒FA4-EGFP;b:重组病毒FAdV4-HA(H3)-RFP;c:阴性对照。
图3为PCR鉴定重组病毒FAdV4-HA(H3)的纯度;
M:DNA marker;1:野生型FAdV-4;2:母本病毒FAdV-EGFP;3:未纯化的重组病毒;4:纯化后的重组病毒FAdV4-HA(H3)。
图4为重组病毒FAdV4-HA(H3)中HA蛋白的表达鉴定;
a:利用针对FAdV-4的单抗鉴定重组病毒;b:流感单抗3A11鉴定重组病毒中HA蛋白的表达;c:阴性LMH细胞对照;d:Western b lot鉴定重组病毒中HA蛋白的表达。
图5为重组病毒FAdV4-HA(H3)的生长曲线测定。
图6为重组病毒FAdV4-HA(H3)在LMH细胞中的稳定性测试;
M:Protein marker;1~10:1~10代FAdV4-HA(H3)感染后的细胞裂解样品;11:阴性LMH细胞对照。
具体实施方式
实施例:
1.血清4型禽腺病毒基因组的制备:根据天根公司的基因组提取试剂盒说明书进行提取,取血清4型禽腺病毒培养上清200μL置于1.5mL指形管内,加入200μL Proteinase K溶液,充分混匀后加入200μL缓冲液GB,混匀后置于70℃水浴作用10min,瞬时离心后加入200μL无水乙醇,充分振荡混匀15sec。将混匀后的溶液加入吸附柱CB3中(吸附柱放在收集管中),12000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD,12000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW,12000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中,重复加入600μL漂洗液PW,12000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。12000rpm离心2min,倒掉废液,将吸附柱CB3置于室温放置数分钟以晾干吸附材料中的漂洗液。将吸附柱CB3转入1.5mL指形管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液TE,室温放置2min,12000rpm离心2min,收集到离心管中的溶液即为病毒的基因组。
2.sgRNA表达载体的构建:根据FAdV-4的Fiber-2基因序列利用sgRNA在线设计网站(http://cr i spor.tefor.net/)进行sgRNA的设计。将设计好的sgRNA克隆到lentiCRISPR v2质粒,通过测序进行sgRNA表达载体的验证。具体的sgRNA序列见表1,由南京擎科生物科技有限公司合成。
表1针对Fiber-2基因的sgRNA序列
3.供体质粒的构建:由南京擎科生物科技有限公司合成带有LoxP系统的pUC-57载体,利用同源重组的方法在上述载体中插入RFP表达盒,构建的pUC-57-LoxP-RFP载体由本实验室保存。以pUC-57-LoxP-RFP载体为模板扩增带有LoxP系统的RFP表达盒;以pMD19-T载体为模板将pMD19-T载体线性化;以血清4型禽腺病毒基因组为模板扩增左端同源臂HR1和右端同源臂HR2;以pDP2002-HA质粒为模板扩增H3N8禽流感病毒的HA基因。琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收,通过同源重组的方法按照HR1-Fiber-2-RFP-HR2的顺序组装在pMD19-T上,最终获得的供体质粒送南京擎科生物科技有限公司测序并由实验室保存。构建供体质粒所用的引物序列见表2。
表2构建供体质粒所用的PCR引物
4.红色荧光重组病毒的拯救:6孔板中接种LMH细胞,培养过夜。待细胞密度生长至80%左右进行转染转染,在200μL的Opt i-MEM培养基中加入3μgsgRNA、3μg供体质粒以及6μL的转染试剂Mi rus,室温孵育45min后进行转染,转染6h后换成细胞生长液。转染12h后,弃去细胞生长液,感染0.1MOI的FA4-EGFP病毒,感染2h后换成细胞维持液。感染72h后,取病毒培养上清并进行盲传,每天观察LMH细胞时候出现红色荧光簇。红色荧光簇的出现表明成功构建了重组病毒。
5.红色荧光重组病毒的纯化及鉴定:将拯救的具有红色荧光重组病毒利用空斑试验和有限稀释法进行纯化,通过PCR鉴定病毒是否已纯化,结果如图3。结果表明成功获得纯的重组病毒FAdV4-HA(H3)-RFP。PCR所用的引物见表3。
表3PCR鉴定重组病毒的引物
6.RFP表达盒的敲除:用0.1MOI的红色荧光重组病毒感染转染Cre重组酶的LMH细胞,感染2h后换成细胞维持液,每天观察红色荧光病毒的数量,4d后取感染的细胞上清再次接种转染Cre重组酶的LMH细胞,重复该过程直至红色荧光病毒完全消失。通过PCR、I FA和Western Blot的方法对去除RFP表达盒的重组病毒进行鉴定。
7.重组病毒中HA蛋白的表达鉴定:用0.01MOI纯化后不带RFP表达盒的重组病毒接种LMH细胞,3天后将LMH细胞进行固定,利用针对H3N8禽流感病毒HA蛋白的单抗和针对FAdV-4的单抗进行I FA鉴定。结果如图4,同一视野中可同时检测到HA蛋白和FAdV-4,表明HA成功插入FAdV-4中,并获得良好表达。
8.删除RFP表达盒的重组病毒的生长曲线测定:在6孔板中铺LMH细胞,次日分别用0.1MOI的野生型FAdV-4和重组病毒接种LMH细胞,2h后换成1%维持液,感染后24h、48h、72h、96h和120h收取细胞上清。之后利用TCID50测定病毒各个时间点的病毒滴度,绘制病毒的生长曲线。结果显示,重组病毒的复制能力与野生型FAdV-4的生长速度和滴度接近(如图5)。
9.删除RFP表达盒的重组病毒的稳定性测试:将重组病毒FAdV4-HA(H3)进行连续传代10代,每隔5代进行提基因组和测序鉴定,并在第10代进行I FA鉴定。结果如图6所示,重组病毒FAdV4-HA(H3)在LMH细胞中进行稳定复制,并且在第10代病毒仍然能够用针对HA蛋白的单抗通过I FA检测到HA蛋白,表明连续传代后的重组病毒可以稳定表达HA蛋白。
SEQ ID NO.1
H3N8禽流感病毒HA基因序列:
ATGAAGACCATTATTGCATTGAACTACATTCTCTGCCTGGCATTTGGCCAGAATCTTCCAGGGAAAGACAGCAGTACAGCAACACTCTGTCTGGGACATCATTCAGTGCCGAATGGAACAATAGTTAAAACAATCACTGACGATCAGATTGAGGTGACCAATGCTACTGAGTTGGTTCAAAATTCCTCAACAGGAAAAATATGCAACAATCCTCACAAGGTTCTTGATGGAAGAGACTGCACATTAATAGATGCCATGCTTGGAGACCCTCATTGCGATGTTTTTCAAGATGAAAAGTGGGATCTCTTTGTAGAGCGAAGCAGTGCTTTCAGCAATTGTTATCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTCGATCCCTAATTGCTTCCTCAGGCACACTGGACTTCATTACTGAAAGTTTCACCTGGGCAGGAGTGAGCCAGAATGGAGGAAGCAGTGCCTGCAAAAGAGGACCTGCCAACGGTTTCTTCAGCAGATTGAACTGGTTGACTAAGTCAGGAAGCTTATATCCACTATTGAACGTGACTATGCCTAACAATTACAATTTTGACAAGCTATACATCTGGGGTGTTCACCACCCGAGTACAAACCAAGAACAGACTAACCTATATGTTCAAGCCTTAGGAGGAGTCACAGTCTCCACCAGGAGAAGCCAACAAACCATAGTCCCAAACaTTGGATCTAGaCCTTGGGtGAGAGGTCAATCTGGTAGAATAAGCATATATTGGACAATAGTCAAACCTGGTGACGTACTAGTAATCAATAGTAATGGAAATCTGATTGCGCCTCGGGGATTTTTCAAGATCCGGACCGGAAGAAGCTCAATAATGAGGTCAGATGCACCTATAGAAACTTGCATTTCAGAATGCATTACCCCAAATGGAAGCaTTCCCAATGACAaGCCTTTTCaAAATGtAAACAAAATCaCATACGGGGCATGTCCCAAaTACGTGAAGCAAAATACCCTAAAGTTGGCTACAGGAATGAGGAATGTGCCTGAGAAGCAAACCAGAGGTCTATTCGGTGCAATAGCAGGATTCATAGAGAATGGGTGGGAAGGAATGATAGATGGTTGGTATGGCTTCAGGCACCAAAATTCTGAAGGCACAGGACAAGCAGCAGATCTTAAAAGCACTCAAGCGGCCATTGATCAAATCAATGGGAAATTGAACAGAGTGATTGAAAAGACGAATGAAAAATTCCATCAAATCGAAAAGGAATTCTCCGAAGTTGAAGGGAGAATTCAAGATCTTGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAGTGGATCTATGGTCTTATAATGCAGAGCTTCTTGTTGCTCTGGAGAACCAGCATACAATTGACCTGACAGACTCTGAGATGAACAAGTTATTTGAAAAGACCAGAAGGCAGCTAAGAGAGAATGCTGAAGACATGGGCAATGGTTGCTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCTTGCATCGAATCAATTAGGAACGGGACTTATGACCATGACATATACCGAGATGAGGCACTGAACAATCGGTTTCAGATCAGAGGTGTTGAACTAAAATCTGGATACAAAGACTGGATTCTGTGGATTTCCTTTGCCATATCATGCCTTTTGCTTTGTGTTGTATTGTTGGGGTTCATTATGTGGGCTTGCCAGAAAGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGA
Claims (3)
1.一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒,其特征是:
H3N8禽流感病毒HA蛋白,其序列如SEQ ID NO.1所示;
重组血清4型禽腺病毒,其中使用H3N8禽流感病毒HA基因替换血清4型禽腺病毒Fiber-2基因,替换的是血清4型禽腺病毒Fiber-2基因的253位核苷酸到1440位核苷酸。
2.如权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒的制备方法,其特征是:该制备方法包括以下步骤:
(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对血清4型禽腺病毒Fiber-2基因的sgRNA,其序列如表1所示;
表1针对Fiber-2基因的sgRNA序列
(2)通过PCR和同源重组的方法构建携带H3N8禽流感病毒HA基因和RFP表达盒的供体质粒,其中RFP表达盒两端都带有LoxP位点,PCR使用的引物序列如表2所示;
表2构建供体质粒所用的PCR引物
(3)6孔板接种LMH细胞培养过夜,共转染sgRNA和供体质粒各3μg,转染6h后去除转染上清并加培养液;转染12h后感染表达EGFP的重组4型腺病毒(FA4-EGFP),感染2h后换成细胞维持液;
(4)感染FA4-EGFP后观察RFP红色荧光,利用空斑试验和有限稀释的方法进行红色荧光重组病毒的纯化,获得带有RFP表达盒的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒;
(5)纯化后的红色荧光重组病毒接种转染Cre重组酶的LMH细胞,4d后取感染的细胞上清再次接种转染Cre重组酶的LMH细胞,重复该过程直至红色荧光病毒完全消失;使用PCR、IFA和Western Blot的方法对去除RFP表达盒的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒进行鉴定。
3.如权利要求2中所述的制备方法,其特征是:表达EGFP的重组病毒FA4-EGFP,其特点是能够表达绿色荧光EGFP,区别于重组病毒的红色荧光蛋白RFP,便于快速纯化重组病毒。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410361207.5A CN118185885A (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410361207.5A CN118185885A (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118185885A true CN118185885A (zh) | 2024-06-14 |
Family
ID=91394229
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410361207.5A Pending CN118185885A (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN118185885A (zh) |
-
2024
- 2024-03-27 CN CN202410361207.5A patent/CN118185885A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107502608B (zh) | 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用 | |
CN107190022B (zh) | 一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法 | |
CN113061586B (zh) | 表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法 | |
CN116463297A (zh) | 一种表达鸡传染性贫血病病毒vp1蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法 | |
CN112080521B (zh) | 一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法 | |
CN110079541A (zh) | 一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用 | |
CN117511888A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达鸡传染性贫血病病毒T1P6毒株VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法 | |
CN111040998B (zh) | 一种稳定表达狂犬病毒糖蛋白细胞株的构建及其应用 | |
CN107267532B (zh) | PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用 | |
CN118185885A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法 | |
CN106811484B (zh) | 一种牛pdhb基因腺病毒干扰载体构建及其鉴定方法 | |
CN113736799B (zh) | 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用 | |
CN116970575A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术表达H7N9禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其的制备方法 | |
CN118048323A (zh) | 一种表达h10n3禽流感病毒禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法 | |
CN114657213A (zh) | 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用 | |
CN113584080A (zh) | 一种Nluc标记的重组猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建及其应用 | |
CN113061585A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备方法 | |
CN114214338A (zh) | 猪源piv5全长感染性克隆及其制备方法和应用 | |
CN108754616B (zh) | 伪狂犬病病毒基因组Fosmid文库、构建方法及其在构建突变体中的应用 | |
CN116286685A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法 | |
CN115786282A (zh) | 表达鸭3型腺病毒Fiber-2蛋白的重组血清4型禽腺病毒的构建 | |
CN118240780A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达禽传染性法氏囊病毒新型变异株VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法 | |
CN111394315A (zh) | 表达猪CD163和CD169分子的悬浮Marc145细胞系 | |
CN116426489A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达新型鹅星状病毒ORF2蛋白C端的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法 | |
CN116855459A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达新城疫病毒La Sota毒株HN蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |