CN116710478A - 冠状病毒感染性细胞及其制备方法 - Google Patents

冠状病毒感染性细胞及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116710478A
CN116710478A CN202180068564.7A CN202180068564A CN116710478A CN 116710478 A CN116710478 A CN 116710478A CN 202180068564 A CN202180068564 A CN 202180068564A CN 116710478 A CN116710478 A CN 116710478A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coronavirus
cells
level
leu
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180068564.7A
Other languages
English (en)
Inventor
清水淳
丹贺直美
山田美铃
宫崎和雄
盐田达雄
中山英美
佐佐木正大
纐缬律子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mckenne Technology Co ltd
Osaka University NUC
Original Assignee
Mckenne Technology Co ltd
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mckenne Technology Co ltd, Osaka University NUC filed Critical Mckenne Technology Co ltd
Publication of CN116710478A publication Critical patent/CN116710478A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/17—Metallocarboxypeptidases (3.4.17)
    • C12Y304/17023—Angiotensin-converting enzyme 2 (3.4.17.23)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供能够稳定地感染冠状病毒的人细胞作为进行SARS‑CoV‑2等冠状病毒的感染研究的人细胞，并且提供利用该细胞的、确认样品中存在冠状病毒的方法、制造冠状病毒的方法和评价被测样品的抗冠状病毒活性或被测样品中是否存在具有抗冠状病毒中和作用的物质的方法。具体地，本发明涉及制备冠状病毒感染性人永生化髓样细胞的方法等，包括将ACE2和TMPRSS2导入人永生化髓样细胞中的步骤。

Description

冠状病毒感染性细胞及其制备方法
技术领域
本发明涉及用于评价冠状病毒的感染的细胞，其制备方法及使用该细胞的冠状病毒的感染的评价方法等。
背景技术
目前，正在对在全世界范围内肆虐的Covid19感染综合征进行治疗药物、疫苗的开发。在这样的开发中，需要使作为Covid19感染综合征的致病病毒的SARS-CoV-2持续增殖，因此，需要使SARS-CoV-2感染宿主细胞。
现在，报告了SARS-CoV-2在以来自非洲绿猴肾脏的Vero E6细胞为代表的来自肠道、胆管、肝脏的各种细胞中感染、增殖(非专利文献1、2、3)。然而，尚未报导SARS-CoV-2在作为细胞因子产生源的人血液系统的免疫细胞中的感染模型。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：PNAS，2020Mar，117(13)7001-7003
非专利文献2：Cell STEM CELL，2020July 27，125-136
非专利文献3：Science，2020，369，50-54
发明内容
发明要解决的问题
本发明是鉴于上述现有技术中存在的课题而作出的，目的在于提供作为进行SARS-CoV-2等冠状病毒的感染研究的人细胞，能够稳定地被冠状病毒感染的人细胞。
本发明的目的还在于提供确认样品中存在冠状病毒的方法、以及冠状病毒的制造方法或评价被测样品的抗冠状病毒活性或被测样品中是否存在具有抗冠状病毒中和作用的物质的方法。
解决问题的方法
本发明的发明人对适合感染SARS-CoV-2的细胞进行了研究，结果通过在来源于iPS细胞等的可增殖的永生化人单核细胞中导入ACE2和TMPRSS2，成功地制备了可有效感染并增殖冠状病毒的细胞。此外，用冠状病毒感染所制备的细胞导致炎性细胞因子的产生。进而，本发明的发明人发现，通过使得到的细胞分化，伴随冠状病毒的感染的病毒增殖、细胞因子释放量增加。因此发现，通过利用这些细胞，能够以病毒水平的增加和/或炎性细胞因子的产生量为指标来确认病毒的存在。
具体而言，本发明涉及以下的发明。
(1)一种冠状病毒感染性人永生化髓样细胞的制备方法，其包括将ACE2和TMPRSS2导入人永生化髓样细胞中的步骤。
(2)根据(1)所述的制备方法，其中，上述人永生化髓样细胞为表达M-CSF和/或GM-CSF的细胞。
(3)根据(1)所述的制备方法，其包括将M-CSF和/或GM-CSF导入上述永生化髓样细胞中的步骤；以及将ACE2和TMPRSS2导入所得导的表达M-CSF和/或GM-CSF的永生化髓样细胞中的步骤。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的制备方法，其特征在于，通过慢病毒导入上述ACE2和上述TMPRSS2。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的制备方法，其中，上述人永生化髓样细胞为人永生化单核细胞。
(6)一种表达ACE2及TMPRSS2的树突状细胞的制备方法，其包括使通过(5)的方法得到的人永生化单核细胞分化为树突状细胞的步骤。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的制备方法，其中，上述冠状病毒为SARS-CoV-2。
(8)一种表达ACE2和TMPRSS2的人永生化髓样细胞。
(9)根据(8)所述的人永生化髓样细胞，其还表达M-CSF和/或GM-CSF。
(10)根据(8)或(9)所述的细胞，其中，上述人永生化髓样细胞为人永生化单核细胞。
(11)根据(8)或(9)所述的细胞，其中，上述人永生化髓样细胞为人树突状细胞。
(12)一种判断样品中冠状病毒的存在的方法，上述方法包括将样品添加到(9)至(11)中任一项所述的人永生化髓样细胞的培养液中的步骤；以及检测上述细胞的培养上清液中的冠状病毒或测定冠状病毒的水平的步骤。
(13)根据(12)所述的方法，其中，上述培养上清液中的上述冠状病毒的检测或上述冠状病毒的水平的测定在添加上述样品的第1-7天进行。
(14)根据(12)或(13)所述的方法，其中，上述冠状病毒的检测或上述冠状病毒的水平的测定通过上述冠状病毒的RNA的检测或上述冠状病毒的RNA水平的测定来进行。
(15)根据(14)所述的方法，其中，通过定量PCR进行上述冠状病毒RNA的检测或冠状病毒RNA水平的测定。
(16)根据(12)或(13)所述的方法，其中，上述冠状病毒的检测或冠状病毒的水平的测定通过上述培养上清液中的炎性细胞因子的检测或炎性细胞因子水平的测定来进行。
(17)根据(16)所述的方法，其中上述炎性细胞因子是IL-6。
(18)一种冠状病毒的制造方法，其包括向(9)至(11)中任一项所述的人永生化髓样细胞的培养液中添加冠状病毒而感染该细胞的步骤；以及回收上述细胞的上述培养液中的冠状病毒的步骤。
(19)根据(18)所述的方法，其中，上述培养液中的上述冠状病毒的回收在添加上述冠状病毒的第1至7天进行。
(20)一种被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法，其包括在上述被测样品的存在下向(9)至(11)中任一项所述的人永生化髓样细胞的培养液中添加冠状病毒的步骤；以及测定上述细胞的培养上清液中的上述冠状病毒的水平的步骤，其中，在上述被测样品的存在下添加了上述冠状病毒的上述培养上清液中的上述冠状病毒的水平，低于在上述被测样品不存在的情况下添加了上述冠状病毒的上述培养上清液中的冠状病毒的水平时，评价该被测样品具有抗冠状病毒活性作用。
(21)一种鉴定被测样品中是否含有具有冠状病毒中和作用的物质的方法，其包括在上述被测样品的存在下，在(9)至(11)中任一项所述的人永生化髓样细胞的培养液中混合冠状病毒的步骤；以及测定上述细胞的培养上清液中的上述冠状病毒的水平的步骤，其中，在上述被测样品的存在下添加了上述冠状病毒的上述培养上清液中的上述冠状病毒的水平，低于在上述被测样品不存在下添加了上述冠状病毒的上述培养上清液中的冠状病毒的水平的情况下，评价为该被测样品含有具有冠状病毒中和作用的物质。
(22)根据(21)所述的方法，其中，上述被测样品为血液样品。
(23)根据(21)或(22)所述的方法，其中，上述具有冠状病毒中和作用的物质为冠状病毒中和抗体。
(24)一种评价冠状病毒疫苗的中和抗体诱导能力的方法，其包括将来自接种了该疫苗的哺乳动物的血液样品作为被测样品实施(22)或(23)所述的方法的步骤。
(25)根据(20)至(24)中任一项所述的方法，其中，上述培养上清液中的上述冠状病毒的水平的测定在从添加上述被测样品或上述样品起第1至7天进行。
(26)根据(20)至(25)中任一项所述的方法，其中，上述冠状病毒的检测或冠状病毒的水平的测定通过上述冠状病毒的RNA的检测或冠状病毒的RNA水平的测定来进行。
(27)根据(26)所述的方法，其中，上述冠状病毒的RNA水平的测定通过定量PCR进行。
(28)根据(20)至(25)中任一项所述的方法，其中，上述冠状病毒的水平的测定通过所述培养上清液中的炎性细胞因子水平的测定来进行。
(29)根据(28)所述的方法，其中，上述炎性细胞因子是IL-6。
发明的效果
通过使用本发明的细胞，能够稳定地供给冠状病毒感染性人细胞。由此能使用人免疫系统的细胞进行冠状病毒感染研究。另外，可以稳定地提供具有冠状病毒感染性的细胞。通过使用本发明的冠状病毒感染性人永生化髓样细胞，可以使SARS-CoV-2等冠状病毒感染人免疫系统细胞，可以在更接近人机体内的条件下评价冠状病毒的感染。另外，通过使用本发明的冠状病毒感染性细胞，可进行在体外的病毒感染实验。由此，可用于阐明冠状病毒感染人免疫系统细胞的机制、以及引起与免疫细胞相关的恶化、细胞因子风暴的机制。此外，本发明提供的冠状病毒感染性细胞可用于治疗药物和疫苗的开发。
附图说明
图1A为制备得到的人永生化髓样细胞(K-ML2)和由IL-4诱导制备的树突状细胞中作为特征性细胞表面标志物，用流式细胞仪测定CD14、CD54、CD209的变化得到的测定值。
图1B为制得的人永生化髓样细胞(K-ML2)的吉姆萨染色图。
图2为通过定量PCR法确认制备得到的人永生化髓样细胞(K-ML2)中各种基因(ACE2、TMPRSS2、ADAM17)的表达量得到的转录产物的电泳照片。
图3为使用含有TMPRSS2基因和药物抗性基因的载体进行了基因导入的K-ML2(导入TMPRSS2；下图)、及该未导入基因的K-ML2(未处理；上图)在药剂存在下培养后的细胞的照片。
图4为表示在K-ML2和导入了TMPRSS2基因的K-ML2(K-ML2/TMPRSS2)中，用定量PCR测定TMPRSS2的RNA量的结果的图表。左图表示每1个样品的拷贝数，右图表示该拷贝数除以用K-ML2测定的拷贝数得到的数值(倍数变化)。图表的横轴表示细胞名，图表的纵轴表示TMPRSS2的RNA的拷贝数(左图)及倍数变化(右图)。
图5表示在导入了ACE2和TMPRSS2基因的人永生化髓样细胞(K-ML2/TMPRSS2/ACE2)中，用定量PCR测定ACE2的RNA量得到的结果的图表。左图表示每1个样品的拷贝数，右图表示该拷贝数除以用K-ML2测定的拷贝数得到的数值(倍数变化)。图表的横轴表示细胞名，图表的纵轴表示ACE2的RNA的拷贝数(左图)及倍数变化(右图)。
图6A表示使表达ACE2及TMPRSS2的K-ML2(K-ML2/TMPRSS2/ACE2)及来自K株的表达M-CSF及GM-CSF的人永生化髓样细胞(K-ML2)浓度依赖性地感染SARS-CoV-2病毒后第3天的病毒量的图表。作为阳性对照，使用表达TMPRSS2的Vero细胞(Vero/TMPRSS2)，作为阴性对照(None)，在不含细胞的培养基中接种病毒。横轴表示病毒添加时(0天)的SARS-CoV-2的病毒浓度(copy/μL)，纵轴表示在培养第3天通过定量PCR测定的培养上清液中的SARS-CoV-2的病毒浓度(copy/μL)。
图6B是将图6A中感染SARS-CoV-2病毒(1×103copy/μL)时的病毒增殖能力进行分析的结果。将图6A的阴性对照(None)的值设为1，表示为图6A的表达ACE2和TMPRSS2的K-ML2(K-ML2/TMPRSS2/ACE2)和来自K株的表达M-CSF和GM-CSF的人永生化髓样细胞(K-ML2)的培养上清液中的病毒浓度的比例。横轴表示样品名，纵轴表示各细胞的培养上清液中的病毒浓度除以添加到不含细胞的培养基中的样品中的病毒量而得到的值(倍数表示(相对于无TD))。
图7为表示使M-CSF及GM-CSF表达人永生化髓样细胞(Mylc；K-ML2)、通过使Mylc分化而得到的树突状细胞(Mylc-DC)、表达ACE2和TMPRSS2的Mylc(cMylc)以及通过使cMylc分化而得到的树突状细胞(cMylc-DC)感染SARS-CoV-2后第3天的培养上清液中的病毒量的图表。作为阳性对照使用表达TMPRSS2的Vero细胞(Vero/TMPRSS2)，作为阴性对照(None)使用不含细胞的培养基。横轴表示添加病毒时(第0天)的SARS-CoV-2病毒浓度(copy/μL)，纵轴表示培养72小时后通过定量PCR测定的SARS-CoV-2病毒浓度(copy/μL)。
图8为在表达Mylc、Mylc-DC、ACE2及TMPRSS2的表达M-CSF及GM-CSF的人永生化髓样细胞(cMylc)、及通过使该细胞分化而得到的树突状细胞(cMylc-DC)中添加SARS-CoV-2，将这些细胞培养72小时，通过ELISA测定由此得到的培养上清液中的IL-6的产生量的图表。图表的纵轴表示ELISA的测定值，图表的横轴表示培养了72小时的上清液的稀释率。例如，在cMylc-DC中，白色点连成的线图中，将预先用Vero细胞培养的含有SARS-CoV-2病毒的上清液稀释100倍(x100)，添加到cMylc-DC中后，培养72小时，然后直接用ELISA测定上清液的组(横轴100)在纵轴显示1.10左右，将上清液在测定前稀释10倍的组(横轴10)在纵轴显示0.20左右。
发明的具体实施方式
<术语的定义>
本说明书中，“髓样细胞”也称为骨髓细胞，定义为表达CD11b分子或CD33分子的细胞，其来源没有特别限定，例如有源自多能性干细胞的髓样细胞、或从生物体(例如外周血)采集的髓样细胞。具体而言，作为髓样细胞，可以举出白细胞的粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞，或尚未分化为这些细胞的未分化的细胞(可以举出髓样前体细胞)等。
在本说明书中，“冠状病毒”定义为属于冠状病毒科的单链RNA病毒，引起发热、干咳等呼吸道感染症。具体而言，可举出SARS-CoV、SARS-CoV-2、中东呼吸系统综合征相关病毒(MARS-CoV)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等，优选为SARS-CoV-2。另外，冠状病毒不限于感染人，也包含感染家畜、宠物、野生动物等的种类。作为感染人以外的冠状病毒，具体而言，还可举出猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)等。例如，作为SARS-CoV-2，可以使用日本神奈川县卫生研究所分离的[SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-020(GenBank基因数据序列库：LC528232)]。
本说明书中，“冠状病毒感染性”是指受到冠状病毒感染的能力。因此，冠状病毒感染性细胞是指受到冠状病毒感染的细胞。
在本说明书中，所谓“水平”是指数值化的有关存在量的指标，例如包含浓度、量或可用作其替代的指标。此外，水平可以是绝对数值(即，测量的存在量)或相对于根据需要设定的对照的相对数值。
<冠状病毒感染性人永生化髓样细胞的制备方法>
在一个实施方式中，本发明涉及冠状病毒感染性人永生化髓样细胞的制备方法，其包括将ACE2和TMPRSS2导入人永生化髓样细胞中的步骤。用于上述方法的人永生化髓样细胞可以是永生化单核细胞或通过将M-CSF和GM-CSF导入永生化单核细胞制备的细胞。
单核细胞的制备可以通过从外周血采集的方法、从多能性干细胞诱导分化的方法、使成纤维细胞等其他体细胞以未分化状态开始诱导分化的方法、或者通过直接重编程直接诱导分化的方法来进行。
从外周血采集单核细胞时，作为人的外周血中的表达CD14分子的细胞，可以通过公知的分离，制备方法得到单核细胞。例如，可以将人外周血用等体积的生理盐水、磷酸缓冲生理盐水或汉克斯(HANKS)缓冲溶液等轻轻稀释，在离心管中的Ficoll(注册商标)(GEHealthcare公司)上静置分层，在15-30℃下以500-1000×g离心分离20分钟，将带黄色的血浆与透明的Ficoll之间的白色带状层作为由淋巴细胞、单核细胞构成的外周血单核细胞(PBMC)组分回收。回收的外周血单核细胞组分可以根据需要进一步清洗后使用。通过从回收的PBMC组分进一步回收表达CD14分子的细胞，可以得到单核细胞。例如，使结合有抗CD14抗体的固相与PBMC接触，使单核细胞与该固相结合，清洗并除去未结合的细胞，由此可以分离回收单核细胞。例如，已知使用磁珠作为这样的固相的方法等(Dynabeads(注册商标)CD14(Thermo Fisher Scientific Inc.)等)。另外，也可以不从外周血中分离PBMC而通过使外周血直接与结合有抗CD14抗体的固相接触而得到单核细胞。
在从多能细胞分化得到单核细胞的情况下，从多能细胞诱导单核细胞的方法是公知的。本说明书中，“多能性干细胞”是指具有多能性及自我复制能力的细胞。本说明书中，“多能性”与多分化潜能同义，是指通过分化而可分化为多个系统的细胞的细胞的状态。本说明书中的“多能性干细胞”包含干细胞、胚胎干(ES)细胞、源自通过核移植而获得的克隆胚胎的胚胎干细胞(“ntES细胞”)、生殖干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、及诱导多能性干(iPS)细胞、及造血干细胞。关于某细胞是否为多能性干细胞，例如在受试细胞在体外培养体系中形成胚状体(embryoid body)的情况下，或者在分化诱导条件下培养(分化处理)后分化为所期望的细胞的情况下，可以判定该细胞为多能性干细胞。
诱导多能性干细胞分化为单核细胞例如通过使巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白细胞介素-3(IL-3)(参见Fernadndo O.Martinez等，Experimental Hematology(2008)；36：1167-1175)，IFN-γ或PMA(参见Annabelle Grolleau等，J Immunol 1999；162：3491-3497)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见WO2012/043651，日本特开2017-131136和日本特开2018-171005)与多能性干细胞接触来进行。分化诱导的单核细胞可以根据需要通过前述方法仅回收表达CD14的细胞进行纯化。
单核细胞的永生化可以通过在由上述得到的单核细胞中导入选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因及LYL1基因中的至少1种基因和cMYC基因，从而在维持单核细胞的功能的同时附加增殖能力来进行。优选使用选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因和BCL2基因中的至少1个基因与cMYC基因的组合，或者BMI1基因与cMYC基因的组合。这些基因向单核细胞的导入可以参考WO2012/043651及日本特开2017-131136号的记载来进行。基因的导入可以通过以下记载的基因的导入方法来进行。
永生化单核细胞可以通过进一步导入M-CSF和GM-CSF来维持其增殖能力。因此，本发明的方法可包括进一步将M-CSF和GM-CSF导入永生化髓样细胞或永生化单核细胞中。或者，可以使用表达M-CSF和GM-CSF的细胞作为永生化髓样细胞或永生化单核细胞。向永生化髓样细胞或永生化单核细胞导入这些基因可以参考日本特开2018-171005的记载来进行。
对于上述得到的人永生化单核细胞，按照以下基因的导入方法中记载的方法，通过导入ACE2及TMRPSS2的基因，可以制备冠状病毒感染性人永生化髓样细胞。更具体地，这些基因可以通过慢病毒载体导入。
ACE2是血管紧张素转化酶II的简称，是作为心血管稳态的重要调节因子的肾素-血管紧张素激素系统的必需的反调节性羧肽酶。人ACE2蛋白通常具有表2或序列编号10记载的氨基酸序列。
TMPRSS2是II型跨膜丝氨酸蛋白酶的缩写，并且是锚定于质膜的丝氨酸蛋白酶，其参与与前列腺的正常生理功能相关的蛋白水解级联。人TMPRSS2蛋白通常具有表2或序列编号8记载的氨基酸序列。
此外，只要导入的细胞获得对冠状病毒的感染性或感染性提高，则导入细胞的ACE2和TMPRSS2的同种型和变体、1-5个或1-3个氨基酸被取代、插入、缺失或添加的突变体或者导入的ACE2和TMPRSS2可以是与上述ACE2和TMPRSS2具有80％或其以上、85％或其以上、90％或其以上、95％或其以上、98％或其以上或99％或其以上的同一性的突变体。
例如，由于ACE2被ADAM17切断而与冠状病毒的结合被抑制，因此可以使用在被ADAM17切断的部位具有突变的ACE2。作为这样的突变的例子，可以举出表2的序列编号10中记载的氨基酸序列中的第706位的蛋氨酸被取代为脯氨酸的突变。另外，由于有氨基酸序列中的第26、27位的赖氨酸及苏氨酸的突变使SARS-CoV-2对ACE2的结合增强的报告(doi：https：//doi.org/10.1101/2020.04.07.024752)，所以ACE2可以是序列编号10的26位的赖氨酸被精氨酸取代和/或27位的苏氨酸被脯氨酸取代。另外，为了提高ACE2与SARS-CoV-2的结合能力，可以使用将ACE2的第584位的亮氨酸取代为丙氨酸的突变体(Am J PhysiolLung Cell Mol Physiol.2009Jul；297(1):L84-96.)。
<基因的导入方法>
可以使用公知的方法进行，只要可带来所期望的效果，则其方法没有特别限制。作为基因的导入方法，可以举出例如使用病毒、质粒、人工染色体等载体，或者通过脂质体转染、脂质体、显微注射、电穿孔等方法，向细胞内导入所期望的基因的方法。作为病毒载体，可列举逆转录病毒载体、慢病毒载体(以上为Cell，126，pp.663-676，2006；Cell，131，pp.861-872，2007；Science，318，pp.1917-1920，2007)、腺病毒载体(Science，322，945-949，2008)、腺相关病毒载体、仙台病毒载体(WO2010/008054)等。人工染色体载体例如包括人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC，PAC)等。作为质粒，可以使用用于哺乳动物细胞的质粒(Science，322：949-953，2008)。可以使用转座子非病毒地将目标核酸整合到宿主细胞的基因组中，例如可以使用PiggyBac载体等。
载体中可以含有启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子、多聚腺苷酸化位点等控制序列，以使期望的基因能够表达，进而，根据需要可以含有药物抗性基因(例如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因等)、选择标记序列(例如，胸苷激酶基因、白喉毒素基因等)、报告基因序列(例如，绿色荧光蛋白等荧光蛋白传递子、β-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等)等。
另外，载体也可以具有在哺乳动物细胞中功能性的复制起点、和编码与该复制起点结合而控制复制的蛋白质的基因，以使其即使不整合到染色体中也可被复制而存在于附加体中。作为在哺乳动物细胞中功能性的复制起点和与该复制起点结合而控制复制的蛋白质的例子，在EBV中可列举出复制起点oriP和EBNA-1基因，在SV40中可列举出复制起点ori和SV40 large Tantigen基因等(WO2009/115295，WO2009/157201和WO2009/149233)。另外，为了同时导入多个所希望的基因，可以使用多顺反子表达的表达载体。为了以多顺反子表达，编码基因的序列之间可以通过内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)或口蹄病病毒(FMDV)2A编码区连接(Science，322：949-953，2008和WO2009/0920422009/152529)。
导入了目标基因的细胞，在载体具有耐药性基因的情况下，可以在与整合到细胞内的耐药性基因对应的药剂的存在下培养导入基因的细胞，以存活的细胞的形式得到。另外，载体具有报告基因时，可以进行与整合到细胞内的报告基因所对应的发光或荧光测定，以产生发光或荧光的细胞的形式得到。这样的发光或荧光测定可以使用商业试剂盒进行。另外，例如，也可以将通过以从细胞中提取的DNA为模板进行定量PCR，从而将确认了细胞中的目标基因的mRNA的表达的细胞作为导入了目标基因的细胞。定量PCR可以使用商业试剂盒进行。或者，也可以通过ELISA等检测细胞产生的目标蛋白质，将确认了目标基因的蛋白质表达的细胞作为导入了目标基因的细胞。
<冠状病毒感染性人永生化髓样细胞>
本发明的一个实施方式涉及表达ACE2和TMPRSS2的人永生化髓样细胞。该人永生化髓样细胞可以是表达ACE2和TMPRSS2的人永生化单核细胞或人树突状细胞。另外，这样的人永生化髓样细胞优选可以导入或表达M-CSF和/或GM-CSF。
<冠状病毒感染性人树突状细胞>
通过对如上所述获得的导入有ACE2和TMPRSS2的永生化单核细胞进行分化诱导，能够使其分化为树突状细胞。因此，本文的冠状病毒感染性人永生化髓样细胞包括这样的表达ACE2和TMPRSS2的树突细胞。本发明的方法还可以包括将人永生化单核细胞分化成树突细胞的步骤。从单核细胞向树突状细胞的分化诱导可以参照已经有的报导(FrancoiseChapuis等，EurJ Immunol.(1997)27(2)：431-41.；Marc Dauer等，J Immunol(2003)170(8)：4069-4076.；Figdor CG等，Nat Med.(2004)10(5)：475-80；Helmut Jonuleit等，EurJImmunol.(1997)27(12)：3135-42)。例如，可以通过在10-500ng/ml的IL-4存在下培养单核细胞来诱导分化为树突细胞。
上述冠状病毒感染性人永生化髓样细胞、冠状病毒感染性人永生化单核细胞和冠状病毒感染性人树突状细胞可用于冠状病毒感染。另外，这些细胞可以与其他成分一起制成冠状病毒感染用组合物。
<判断冠状病毒的存在的方法>
本发明的一个方面涉及判断样品中冠状病毒的存在的方法。具体地，该方法包括将样品添加到受冠状病毒感染的人永生化髓样细胞的培养物中的步骤、以及检测该单核细胞或该树突细胞的培养上清液中的冠状病毒或测量冠状病毒的水平的步骤。
作为本发明的判定中使用的培养基，可以列举例如IMDM、RPMI1640、α-MEM、MEM、DMEM等。另外，作为添加物，可以含有人或牛血浆蛋白质组分、胎牛血清或人血清、葡萄糖、D-甘露醇等糖类、氨基酸、腺嘌呤等核酸碱基、磷酸氢钠、A-生育酚、亚油酸、胆固醇、亚硒酸钠、人全转铁蛋白、人胰岛素、乙醇胺、2-巯基乙醇、G-CSF、GM-CSF、碳酸氢钠、甲基纤维素等。另外，根据需要，还可以添加庆大霉素、氨苄青霉素、青霉素、链霉素等抗生素；无机盐类；缓冲剂如HEPES、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂等。作为具体例，使用永生化单核细胞进行评价时，可以使用在α-MEM中含有10-20％胎牛血清或2-5％HPL(Human plateletlysate，人血小板来源补充剂(Advanta Cell公司)的培养液来进行。另外，使用树突状细胞进行评价时，可以使用IL-4作为添加物，例如可以使用含50-200ng/mL IL-4的培养基。
培养条件可以是约37℃，可以是约5％CO2。
作为“样品”，可以使用来自人或动物的体液(血液、鼻涕、痰、尿等)、或组织(口咽、鼻咽等)、培养细胞、细胞培养液(细胞培养上清液)、饮用水或食品、环境中的清洗液或擦拭液等，例如为血液样品。它们可以适当浓缩或稀释，或者实施提取或精制等前处理。本说明书中，“血液样品”包含全血、血浆、血清、全血或血细胞的溶血液等血液的分级物或处理物以及它们的稀释液或浓缩液，优选可以是血清或其稀释液。在样品为液体时，可以将以任意稀释倍数稀释的稀释液用于评价。
可以将上述冠状病毒感染性人永生化髓样细胞(包含冠状病毒感染性人永生化单核细胞或冠状病毒感染性人树突状细胞，下同)接种于上述培养基中进行培养，根据需要以规定的次数及间隔进行细胞的传代或培养基更换后，添加样品。添加样品后，根据需要以规定的次数和间隔进行培养基更换，同时进一步培养细胞。样品添加后的培养期间可以为1种，也可以为2种以上的期间。例如，培养时间可以是1-7天、2-6天、2-5天、2-4天或3天。
传代或培养基更换的次数，例如可以为1次，也可以为2次、3次、4次或5次以上。另外，作为传代或培养基更换的间隔，例如可以是2-3天1次，也可以是4-5天1次，还可以是1周1次。
培养结束后的培养上清液中的冠状病毒的检测或冠状病毒的水平的测定可以通过冠状病毒RNA的检测或冠状病毒RNA水平的测定、噬菌斑测定、TCID50等病毒效价测定等来进行。培养结束后，为了迅速定量地检测或测定，大多使用以RNA为指标的测定法。冠状病毒的RNA的检测或RNA水平的测定只要是能够检测RNA或测定RNA量的方法则没有特别限制，通常通过利用与冠状病毒RNA特异性结合的物质的方法来进行。在一实例中，“与冠状病毒RNA特异性结合的物质”可为核酸分子，优选为具有与冠状病毒RNA互补的序列的核酸分子。具有与冠状病毒RNA互补的序列的核酸分子可通过杂交与冠状病毒RNA特异性结合。本说明书中的“核酸”包含DNA、RNA、或人工创制的核酸(包含PNA或Locked Nucleic Acid(2'，4'-BNA)等交联型核酸)或它们的组合。与冠状病毒RNA特异性结合的核酸分子可以在至少一部分包含人工设计的序列(例如，用于标记或标签化的序列等)。
“探针”通常具有与冠状病毒RNA序列互补的序列，并且是用于测量与冠状病毒RNA序列的结合的核酸分子。探针通常是能够与冠状病毒RNA特异性结合的例如10-30mer、10-20mer等的核酸分子。作为测定冠状病毒RNA与探针的结合水平的方法，可列举Southern杂交、Northern杂交、点阵杂交、荧光原位杂交(FISH)、微阵列、ASO法等，具体而言，可以使用利用Gene ChipTM miRNA Array Strip(Thermo Fisher Scientific公司)或Agilent miRNA微阵列(Agilent Technologies公司)的方法。
冠状病毒RNA的检测或冠状病毒RNA水平的测定可通过检测与特异性结合冠状病毒RNA的物质结合的冠状病毒RNA的结合或测定结合水平来进行。“结合水平”可以是结合量、结合数或结合比例、或者表示它们的数值(例如，测定的荧光强度等测定值本身)。此时，作为与冠状病毒RNA特异性结合的物质，可以使用标记物质，或者也可以标记冠状病毒RNA来使用。另外，通常同时测定标准样品，基于该标准样品制作标准曲线或校准曲线，将由测定样品的测定值算出的值，或以标准样品水平为指标进行标准化的数值确定为结合水平。
标记方法的实例可以列举例如放射性同位素(RI)标记、荧光标记和酶标记。
例如，冠状病毒RNA水平可以通过以下(a)至(c)测量：
(a)使至少1个与冠状病毒RNA的碱基序列或其一部分结合的核酸分子(探针)与上述培养上清液接触；
(b)测定与上述探针结合的上述培养上清液中的冠状病毒RNA的结合水平；以及
(c)由测得的结合水平确定培养上清液中冠状病毒的存在。
或者，冠状病毒RNA可以通过以下(a)至(c)检测：
(a)使至少1个与冠状病毒RNA的碱基序列或其一部分结合的核酸分子(探针)与上述培养上清液接触；
(b)检测与上述探针结合的上述培养上清液中的冠状病毒RNA的结合；以及
(c)当检测到结合时，判定上述培养上清液中存在冠状病毒。
或者，冠状病毒RNA的检测或冠状病毒RNA水平的测定可利用基于PCR的方法，例如可通过使用与冠状病毒RNA特异性结合的核酸(引物)进行qPCR、ARMS(突变阻滞扩增系统)、RT-PCR(逆转录酶-PCR)或Nested PCR来测定。或者，也可以利用invader(注册商标)法。“引物”通常为用于核酸扩增的10-30mer(优选17-25mer、15-20mer等)的核酸分子，其至少一部分(优选7mer以上、8mer以上、9mer以上、10mer以上)具有与冠状病毒RNA的末端序列互补的序列。作为引物，例如可以使用具有序列编号11-14中记载的碱基序列或由序列编号11-14中记载的碱基序列构成的核酸分子。
因此，冠状病毒RNA水平可以通过以下步骤测量：
(a)以上述培养上清液为模板，使用可与冠状病毒RNA特异性结合的核酸分子(引物)，使上述培养上清液中的冠状病毒RNA的全部或一部分扩增；
(b)测定扩增的核酸分子的水平；以及
(c)从扩增的核酸分子的水平确定上述培养上清液中冠状病毒的存在。
冠状病毒RNA，也可以通过以下步骤检测：
(a)以上述培养上清液为模板，使用可与冠状病毒RNA特异性结合的核酸分子(引物)，使上述培养上清液中的冠状病毒RNA的全部或一部分扩增；
(b)检测扩增的核酸分子；以及
(c)当检测到扩增的核酸分子时，确定在上述培养上清液中存在冠状病毒。
培养上清液中的冠状病毒RNA的全部或一部分的扩增可以通过以该培养上清液为模板进行PCR反应等来实施。扩增的核酸的水平可以通过斑点印迹杂交法、表面等离子体共振法(SPR法)、PCR-RFLP法(限制性片段长度多态性聚合酶链反应)、原位RT-PCR法、PCR-SSO(多聚酶链式反应-序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法(序列特异引物引导的PCR法)、AMPFLP(扩增片断长度多态性)法、MVR-PCR法(序列多态性分析PCR法)、PCR-SSCP(多聚酶链式反应-单链构象多态性)法来测定。
本说明书中，与RNA“特异性结合”是指该物质以比对具有其他碱基序列的核酸的亲和性实质上高的亲和性与具有冠状病毒RNA序列的核酸结合。在此，“实质上高的亲和性”是指可将具有冠状病毒RNA序列的核酸与具有其他碱基序列的核酸区别检测的程度的亲和性。其他碱基序列优选以可与冠状病毒RNA序列区别的程度不同，可以是具有50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下的同一性的碱基序列。例如，实质上高的亲和性是指，与冠状病毒RNA的结合量可以是与其他碱基序列的结合量的3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上。
根据检测的冠状病毒RNA或测定的冠状病毒RNA水平判断样品中是否存在冠状病毒。具体而言，在上述培养上清液中检测到冠状病毒RNA时，可以判断样品中存在冠状病毒。另外，当该培养上清液中的冠状病毒的RNA水平的测定量与阴性对照相比增加时，可以判断样品中存在冠状病毒。需要说明的是，作为阴性对照，可以使用进行本评价时使用的培养基等。
或者，培养结束后的培养上清液中的冠状病毒的检测或冠状病毒的水平的测定可以通过冠状病毒蛋白的检测或冠状病毒蛋白水平的测定来进行。对冠状病毒蛋白质的检测或蛋白质水平的测定没有特别限制，只要是能够检测蛋白质或测定蛋白质量的方法即可，通常通过利用与冠状病毒蛋白质特异性结合的物质的方法来进行。在一个实例中，“特异性结合冠状病毒蛋白的物质”可以列举抗体或其抗原结合片段、适体、配体/受体或其结合片段、或它们与另一物质的融合物。
本说明书中，“抗原结合片段”是指包含抗体的一部分(部分片段)的蛋白质或肽，是指保持抗体对抗原的作用(免疫反应性、结合性)的蛋白质或肽。作为抗原结合片段，例如可以举出F(ab')2、Fab'、Fab、Fab3、单链Fv(以下称为“scFv”)、(串联)双特异性单链Fv(sc(Fv)2)、单链三抗体、纳米抗体、二抗体VHH、五抗体VHH、微型抗体、(双链)双抗体、串联双抗体、双特异性三抗体、双特异性双抗体、双亲和重靶向分子(DART)、三聚抗体(或三抗体)、四抗体(或[sc(Fv)2]2)或(scFv-SA)4)二硫键连接的Fv(以下称为“dsFv”)、紧凑型IgG、重链抗体或它们的聚合物(Nature Biotechnology，29(1)：5-6(2011)；Maneesh Jain et al.，TRENDS in Biotechnology，25(7)(2007)：307-316；以及Christoph stein等，Antibodies(1)：88-123(2012)。本说明书中，抗体和免疫反应性片段可以是单特异性、双特异性(bi-specific)、三特异性(tris-specific)和多特异性(multi-specific)中的任一种。
通常，通过检测与特异性结合冠状病毒蛋白的物质结合的冠状病毒蛋白的结合或测定结合水平来进行冠状病毒蛋白的检测或冠状病毒蛋白水平的测定。所谓测定的“结合水平”，可以是这些物质的结合量、结合数、或结合比例、或者表示它们的数值(例如，测定的荧光强度等的测定值本身)。此时，作为与冠状病毒蛋白特异性结合的物质，可以使用标记的物质，或者也可以将冠状病毒蛋白标记后使用。另外，通常同时测定标准样品，基于该标准样品制作标准曲线或校准曲线，将算出的值或以标准样品水平为指标进行标准化的数值确定为结合水平。
因此，例如，本发明的方法可以包括：
(a)使至少1种与冠状病毒蛋白结合的物质与上述培养上清液接触；
(b)检测结合到与上述冠状病毒蛋白结合的物质上的上述培养上清液中的冠状病毒蛋白的结合，或测定结合水平；以及
(c)根据检测到的结合或测定到的结合水平判断培养上清液中冠状病毒的存在。
本说明书中，使用抗体或其抗原结合片段检测或测定蛋白质时，结合的测定可以基于公知的检测和/或测定方法。例如，可以通过酶联免疫测定法(EIA法)、简易EIA法、酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、放射免疫测定法(RIA法用)、荧光免疫测定法(FIA法)等标记免疫测定法；蛋白质印迹法等免疫印迹法；胶体金凝集法等免疫色谱法；离子交换层析法，亲和层析法等层析法；比浊法(TIA法)；散射测浊法(NIA法)；比色法；胶乳凝集法(LIA法)；粒子计数法(CIA法)；化学发光测定法(CLIA法，CLEIA法)；沉降反应法；表面等离子体共振法(SPR法)；共振镜检测器法(RMD法)；比较干涉法等来测定结合。
具体而言，可以使上述培养上清液与固定在固相上的本发明的抗体或其抗原结合片段接触，清洗后，添加能够与待检测或测定对象蛋白质结合的标记抗体，然后通过清洗除去非结合抗体，通过检测该抗体的标记或测定标记量(例如，标记的强度)来检测待检测或测定对象蛋白质或确定其水平。另外，通过免疫层析进行时，使上述培养上清液与未固定的可与第一待检测或测定对象蛋白质结合的标记抗体接触后，使该混合物与在特定部位固定有可与第二待检测或测定对象蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段的载体接触，测定该部位的上述标记抗体的检测或标记量(例如，标记的强度)来检测待测蛋白质或确定待测蛋白质的水平。标记方法可包括例如放射性同位素(RI)标记、荧光标记和酶标记。
本说明书中，蛋白质“特异性结合”是指该物质以比对具有其他氨基酸序列的蛋白质的亲和性实质上高的亲和性与具有冠状病毒蛋白质序列的核酸进行结合。在此，“实质上高的亲和性”是指可将冠状病毒蛋白质与具有其他氨基酸序列的蛋白质区分检测的程度的亲和性。其它氨基酸序列优选与冠状病毒蛋白序列可区分地程度不同，并且可以是具有50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下同一性的氨基酸序列。例如，实质上高的亲和性可以是与冠状病毒蛋白的结合量为与其他氨基酸序列的结合量的3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上。
根据检测的冠状病毒蛋白或测定的冠状病毒蛋白水平判断样品中是否存在冠状病毒。具体而言，在上述培养上清液中检测到冠状病毒蛋白时，可以判断样品中存在冠状病毒。另外，该培养上清液中的冠状病毒的蛋白质水平的测定量与阴性对照相比增加时，可以判断样品中存在冠状病毒。需要说明的是，作为阴性对照，可以使用进行本评价时使用的培养基等。
或者，培养结束后的培养上清液中的冠状病毒的检测或冠状病毒的水平的测定可以通过炎性细胞因子的检测或炎性细胞因子水平的测定来进行。通常，由免疫细胞通过病毒感染产生的炎性细胞因子引起身体器官的炎症，导致病毒感染加重。在病毒感染细胞中，通过评价这样的炎性细胞因子的产生量，可期待与重症化的病情阐明、治疗方法的阐明相关。作为炎性细胞因子，例如可举出IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-1β等。
炎性细胞因子的检测或炎性细胞因子水平的测定只要是能够检测蛋白质或测定蛋白质量的方法，则没有特别限制，通常通过利用与炎性细胞因子特异性结合的物质的方法来进行。在一例中，作为“与炎性细胞因子特异性地结合的物质”，可举出抗体或其抗原结合片段、适体、配体/受体或其结合片段、或者它们与其他物质的融合物。
典型地，炎性细胞因子的检测或炎性细胞因子水平的测定通过检测与炎性细胞因子特异性结合的物质上结合的炎性细胞因子的结合或测定结合水平来进行。所谓测定的“结合水平”，可以是这些物质的结合量、结合数或结合比例、或者表示它们的数值(例如，测定的荧光强度等的测定值本身)。这种情况下，作为与炎性细胞因子特异性结合的物质，可以使用标记的物质，或者也可以将炎性细胞因子标记后使用。另外，通常同时测定标准样品，基于该标准样品制作标准曲线或校准曲线，将算出的值或以标准样品水平为指标进行标准化的数值确定为结合水平。
因此，例如，本发明的方法可以包括：
(a)使至少1种与炎性细胞因子结合的物质与上述培养上清液接触；
(b)检测结合了与上述炎性细胞因子结合的物质的上述培养上清液中的炎性细胞因子的结合，或测定结合水平；以及
(c)根据检测到的结合或测量到的结合水平判断培养上清液中冠状病毒的存在。
根据检测到的炎性细胞因子或测定到的炎性细胞因子水平判断样品中是否存在冠状病毒。具体而言，在上述培养上清液中检测到炎性细胞因子时，可以判断样品中存在冠状病毒。另外，该培养上清液中的炎性细胞因子水平的测定量与阴性对照相比高时，可以判定样品中存在冠状病毒。需要说明的是，作为阴性对照，可以使用进行本评价时使用的培养基等。
<冠状病毒的制造方法>
本发明的一个方式涉及冠状病毒的制造方法。具体而言，该制造方法包括向冠状病毒感染性人永生化髓样细胞(包括永生化人单核细胞及人树突状细胞)的培养液中添加冠状病毒而感染细胞的步骤；以及回收细胞的培养液中的冠状病毒的步骤。
将永生化人髓样细胞接种于培养基，根据需要以规定的次数及间隔进行细胞的传代或培养基更换后，向培养细胞中添加冠状病毒。感染细胞的冠状病毒例如可以直接使用已经被冠状病毒感染的细胞培养液的培养上清液，也可以根据需要用培养基等稀释液稀释后使用。添加样品后，根据需要以规定的次数和间隔进行培养基更换，同时进一步培养细胞。添加冠状病毒后的培养期可以是1-7天、2-6天、2-5天、2-4天或3天。其他永生化人髓样细胞的培养条件可以依据上述<判断冠状病毒的存在的方法>项中记载的条件。
可以将培养结束后的培养液(例如培养上清液)直接作为含冠状病毒的液体。或者，也可以通过将培养结束后的培养液(例如培养上清液)适当浓缩或纯化而制成含冠状病毒的液体。
<被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法>
本发明涉及被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法。本评价方法包括在被测样品存在下将冠状病毒添加到冠状病毒感染性人永生化髓样细胞(包括永生化人单核细胞或人树突状细胞)的培养液中的步骤；以及测量细胞的培养上清液中的冠状病毒水平的步骤。
本说明书中，“抗冠状病毒活性”是指对冠状病毒感染症带来治疗效果、症状缓解效果和/或预防效果的活性，代表性的是中和活性和增殖抑制活性(例如，RNA链合成抑制活性、RNA聚合酶抑制活性等)。
将永生化人髓样细胞接种于培养基，根据需要以规定的次数及间隔进行细胞的传代或培养基更换后，向培养细胞中添加冠状病毒。感染细胞的冠状病毒例如可以直接使用已经被冠状病毒感染的细胞培养液的培养上清液，也可以根据需要用培养基等稀释液稀释后使用。添加样品后，根据需要以规定的次数和间隔进行培养基更换，同时进一步培养细胞。添加冠状病毒后的培养期可以是1-7天、2-6天、2-5天、2-4天或3天。其他永生化人髓样细胞的培养条件可以依据上述<判断冠状病毒的存在的方法>项中记载的条件。
可以在添加冠状病毒之前、同时或之后将被测样品添加到细胞培养液中。例如，为了确认中和活性或预防效果，优选在添加冠状病毒之前或添加冠状病毒的同时添加被测样品。例如，被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法可以是如下方法，其包括：向冠状病毒感染性人永生化髓样细胞的培养液中添加被测样品的步骤；向上述细胞培养液中添加冠状病毒的步骤；以及测定上述细胞的培养上清液中的上述冠状病毒的水平的步骤，其中，在上述被测样品的存在下添加了上述冠状病毒的上述培养上清液中的上述冠状病毒的水平，低于向不存在上述被测样品的情况下添加了上述冠状病毒的上述培养上清液中的冠状病毒的水平的情况下，将该被测样品评价为具有抗冠状病毒活性。
或者，本发明的被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法也可以是用于评价被测样品对已经感染的细胞的效果的方法，具体而言，该方法包括：在冠状病毒感染性人永生化髓样细胞的培养液中添加冠状病毒的步骤；在上述细胞培养液中添加被测样品的步骤；以及测定上述细胞的培养上清液中的上述冠状病毒的水平的步骤，其中，在上述被测样品的存在下添加了上述冠状病毒的上述培养上清液中的上述冠状病毒的水平低于在上述被测样品的不存在下添加了上述冠状病毒的上述培养上清液中的冠状病毒的水平的情况下，评价该被测样品具有抗冠状病毒活性。
被测样品的形式可以是但不限于例如抗体、受体或其片段、中分子、肽、小分子、适体或核酸药物。被测样品也可以将稀释成任意的稀释倍数系列的样品用于评价。另外，被测样品不需要由单一物质构成，可以是来自人或动物的体液(血液、鼻涕、痰、尿等)、或组织(口咽、鼻咽等)、培养细胞、细胞培养液(细胞培养上清液)、饮用水或食品、环境中的清洗液或擦拭液、血液样品等生物体成分、混合物、组合物、植物提取物等。例如，通过将从有冠状病毒感染病史的对象或接种了冠状病毒疫苗或其候选的对象得到的血液样品作为被测样品，可以判断该对象的血液中的成分(代表性的是抗体)是否具有抗冠状病毒活性。或者，被测样品除了溶剂或培养基成分等的溶解液或稀释液以外，也可以是仅由单一成分构成的被测药物。
作为添加冠状病毒和被测样品后的细胞培养期间，可以设定任意的时间。例如，培养时间可以是1-7天、2-6天、2-5天、2-4天或3天。其他永生化人髓样细胞的培养条件可以依据上述<判断冠状病毒的存在的方法>项中记载的条件。经过上述培养期间后的培养上清液中的冠状病毒水平的测定可以按照上述<判断冠状病毒的存在的方法>进行。
通过比较培养上清液中测量的冠状病毒水平与对照的冠状病毒水平来判断被测样品是否具有抗冠状病毒活性。作为对照，可以使用在不存在被测样品的情况下与冠状病毒一起培养的细胞的培养上清液。具体而言，含被测样品的培养上清液中的冠状病毒水平低于不含被测样品的培养上清液中的冠状病毒水平时，可判断该被测样品具有抗冠状病毒活性。
<被测样品中的抗冠状病毒物质的鉴定方法>
本发明涉及鉴定被测样品中是否含有具有抗冠状病毒活性的物质(抗冠状病毒物质)的方法。本发明的鉴定方法包括在被测样品的存在下在冠状病毒感染性人永生化髓样细胞(包括永生化人单核细胞或人树突状细胞)的培养液中混合冠状病毒的步骤；以及测定上述细胞的培养上清液中的上述冠状病毒的水平的步骤，其中，如果在上述被测样品的存在下添加了上述冠状病毒的上述培养上清液中的上述冠状病毒的水平，低于在被测样品不存在的情况下添加有上述冠状病毒的上述培养上清液中的冠状病毒的水平，则将被测样品鉴定为含有具有抗冠状病毒活性的物质。
在本发明的方法中，所谓“被测样品”，是要判断是否含有抗冠状病毒物质的样品，只要是能够适用本发明的方法的样品，则可以使用任何样品，但优选该样品本身不具有细胞毒性，例如，除了上述血液样品以外，还可以使用食品、饮料或植物提取物等。例如，它可以是抗体、接种疫苗后的血液或血清或提取物。被测物质可以稀释成任意的稀释倍数系列后用于评价。
例如，通过本发明的鉴定方法鉴定的抗冠状病毒物质可以按照上述形式，例如可以为具有冠状病毒中和活性的物质，优选为冠状病毒中和抗体。
被测样品中的抗冠状病毒物质的鉴定方法中的具体的各步骤可以根据上述<被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法>来实施。
通过将培养上清液中测得的冠状病毒水平与对照的冠状病毒水平进行比较来鉴定被测样品中是否含有抗冠状病毒物质。作为对照，可以使用在不存在被测样品的情况下与冠状病毒一起培养的细胞培养上清液。具体而言，含被测样品的培养上清液中的冠状病毒水平低于不含被测样品的培养上清液中的冠状病毒水平时，可鉴定为该被测样品含有抗冠状病毒物质。
<冠状病毒疫苗的评价方法>
本发明的被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法以及被测样品中的抗冠状病毒物质的鉴定方法可以用于判断通过疫苗给药在生物体内是否生成中和抗体(或通过疫苗给药产生的抗体是否具有中和活性)。具体而言，采集接种了疫苗的哺乳动物(小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猪、牛、马、猴、人等)的血液，将由该血液制备的血液样品作为被测样品，实施本发明的被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法，或本发明的被测样品中的抗冠状病毒物质的鉴定方法，判断该被测样品具有抗冠状病毒活性，或者在鉴定为包含抗冠状病毒物质的情况下，可以判断为通过该疫苗给药在生物体内生成中和抗体(或通过疫苗给药产生的抗体具有中和活性)。因此，本发明涉及评价冠状病毒疫苗的中和抗体诱导能力的方法，该方法包括将接种了该疫苗的哺乳动物来源的血液样品作为被测样品，实施本发明的被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法、或本发明的被测样品中的冠状病毒中和物质的鉴定方法的步骤。
本发明的冠状病毒疫苗的评价方法还可包括接种疫苗的步骤，例如可以为如下评价方法，其包括：对被测哺乳动物接种疫苗候选物质的步骤；从该被测哺乳动物采集血液的步骤；作为采集的血液或由该血液制备的血液样品被测样品，实施本发明的被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法、或者本发明的被测样品中的冠状病毒中和物质的鉴定方法的步骤。
<试剂盒>
本发明涉及包含冠状病毒感染性人永生化髓样细胞的用于判断冠状病毒存在的试剂盒、冠状病毒的制造用试剂盒、被测样品的抗冠状病毒活性评价用试剂盒、被测样品中的抗冠状病毒物质的鉴定用试剂盒、或冠状病毒疫苗的评价用试剂盒。该试剂盒除了包含冠状病毒感染性人永生化髓样细胞以外，还可以包含包装、说明书，另外，还可以包含选自培养用培养基、培养添加物、能够与冠状病毒RNA或蛋白质结合的物质、以及任意的标准物质等中的1种以上。另外，作为培养用培养基，可以使用<判断冠状病毒的存在的方法>项中记载的培养基。
以下，基于实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。需要说明的是，本申请全文中引用的全部文献通过参照而直接援引至本申请中。
(实施例1)源自人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞的制作源自人诱导多能性干(iPS)细胞的永生化单核细胞参考已往报导(WO2012/043651，日本特开2017-131136和日本特开2018-171005)而制作。详细而言，将未分化的iPS细胞(K株((WO2012/043651，日本特开2017-131136和日本特开2018-171005))接种到事先将层粘连蛋白511(iMatrix-511-E8，Nippi公司，Cat#：892-012)涂作基底膜的直径10cm的培养皿(AGC TechnoGlass公司，Cat#：1012-100)或6孔板(CorningInc.，Cat#：3516)上，在α-MEM培养基(富士胶片和光纯药公司，Cat#：137-17215)，使用添加了20％胎牛血清(以下记为FBS)(CytivaInc.，Cat#：SH30088.03)的培养液(以下，记为α-MEM培养基(含有20％FBS)开始分化诱导。之后，每3天1次用α-MEM培养基(含有20％FBS)更换培养基的同时继续培养。从分化诱导开始起14-21天后，将TrypLETMSelect(含有1mM乙二胺四乙酸(EDTA))(GIBCOInc.，Cat#：A12859-01)及0.5mMEDTA/PBS(NacalaiTesque公司，Cat#：13567-84)等量混合，通过在37℃下处理60分钟，使用制备的溶液(最终浓度0.75mMEDTA)剥离并收集细胞，并通过吹打操作制备细胞悬浮液。接着，将从1个直径10cm的培养皿或6孔板的1孔回收的细胞悬浮液，悬浮在向10mL的D-MEM培养基(富士胶片和光纯药公司，Cat#：044-29765)添加了10％胎牛血清(以下记作FBS)(CytivaInc.，Cat#：SH30088.03)的培养液中，接种于直径10cm的2个或1个培养皿，在37℃、5％CO2培养箱内静置。16小时后，回收未附着于直径10cm的培养皿的悬浮细胞，使其通过100μm的细胞过滤器(CorningInc.，Cat#：352360)，由此，得到除去了凝集细胞块的细胞悬浮液。
将上述得到的细胞悬浮液在加有α-MEM培养基(含有20％FBS)，100ng/mL M-CSF(Peprotech Inc.，Cat#：AF-300-25)和100ng/m L GM-CSF(Peprotech Inc.，Cat#：300-03)的培养液中混合，接种在T25烧瓶(公司CellSeed，HydroCell，Cat#：CSF025或ThermoFisher Scientific Inc.，Cat#：169900)中，进行培养。然后，经过3-9天左右后，出现悬浮性或弱粘附性的细胞，观察到细胞数逐渐增加。
使用作为Human immunodeficiency virus 1型(HIV-I)增殖力等缺陷株的、蛋白质表达用启动子为EF1a的第3代慢病毒载体(SignaGen Inc.)，向得到的悬浮细胞或弱粘附性的细胞中导入c-MYC和BMI1，制作来源于人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞。将该永生化单核细胞系在37℃、5％CO2培养箱中在24孔板中在含有20％FBS、50-100ng/mL M-CSF和50-100ng/mL GM-CSF的α-MEM培养基中培养，并在培养开始3-5周后作为增殖细胞获得。另外，源自人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞可以通过市售的细胞保存液、例如无血清细胞保存液Bambanker(GCLTEC Inc.，Cat#：CS-02-001)在液氮下保存。
(实施例2)表达M-CSF和GM-CSF的来自人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞的制作
表达M-CSF和GM-CSF的来自人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞参考已有报告(日本特开2018-171005)来制作。详细而言，使用作为Human immunodeficiency virus 1型(HIV-I)增殖力等缺陷株的、蛋白质表达用启动子为EF1a的第3代慢病毒载体(SignaGenInc.)，向实施例1中得到的来自人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞中同时导入人M-CSF基因和人GM-CSF基因的表达载体。从基因导入3天后开始，在37℃、5％CO2培养箱内，在均不含人M-CSF和GM-CSF的α-MEM(含有20％FBS)培养基中进行培养，从培养开始3-5周后，作为增殖性细胞获得，使用市售的细胞保存液，在液氮下保存。
(实施例3)由表达M-CSF和GM-CSF的源自人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞诱导制作树突状细胞
由表达M-CSF和GM-CSF的源自人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞制备树突状细胞参考已有报告(日本特开2018-171005)来进行。详细而言，将实施例2中制作的表达M-CSF和GM-CSF的源自人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞直接或将保存的细胞解冻后，悬浮在α-MEM培养基(富士胶片和光纯药公司，Cat#：137-17215)中含有10％胎牛血清(以下记为FBS)(Cytiva Inc.，Cat#：SH30088.03)的培养液(以下，记为α-MEM培养基(含有10％FBS)和100ng/mL的IL-4(Peprotech Inc.，Cat#：200-04)中，在T25烧瓶中，在37℃、5％CO2培养箱内培养3天，诱导制成树突状细胞。
为了确认所制备的细胞为单核细胞样细胞、或者所诱导的细胞为树突状细胞，进行了表面标志物的测定、以及利用吉姆萨染色等的形态观察等。表面标志物测定使用CD14抗体、CD54抗体、CD209抗体(均为Biolegend Inc.，Cat#：367103,Cat#：353107,Cat#：330107)，使用BD Bioscience Inc.的流式细胞仪Accuri进行。另外，关于吉姆萨染色，使用市售的吉姆萨染色液(Merck Inc.，Cat#：HX69072204)，按照制造商提供的方案，进行吉姆萨染色或迈格吉染色(May–Giemsa stain)(Nacalai Tesque公司，梅利格兰德液，Cat#：37126-14)，用高倍显微镜(Orimpus公司，IX70，400-1000倍)进行测定。测定结果示于图1。在表达M-CSF和GM-CSF的源自人诱导多能性干细胞的永生化单核细胞中，确认了CD14和CD54的表达。另外，在诱导制作成树突状细胞的情况下，可以确认到作为对一般的树突状细胞的诱导变化的指标的CD14的表达衰减、CD54和CD209的表达增强(图1A)。另外，由形态观察的结果确认为单核细胞样细胞(图1B)和树突状细胞。
以后，将由K株制作的表达M-CSF和GM-CSF的人永生化单核细胞作为“K-ML2”。
(实施例4)人永生化髓样细胞中的基因表达确认
以往，关于冠状病毒对人的感染机制，进行了大量研究。SARS-CoV-2等冠状病毒感染人时，重要的是引起病毒外膜与细胞膜的融合，已知结构中的尖峰蛋白质(S蛋白质)与人的细胞的细胞膜的ACE2受体结合后，被作为蛋白质分解酶的TMPRSS2切断，S蛋白质被活化，由此病毒外膜与细胞膜的融合成为可能(Markus Hoffmann等，Cell，2020April；181,271-280)。
因此，为了使SARS-CoV-2更有效地感染K-ML2，对于与SARS-CoV-2结合的ACE2、以及对于SARS-CoV-2向细胞内的侵入重要的TMPRSS2和ADAM17，进行了人永生化髓样细胞中的基因表达的分析。
使用表1所示的引物组(Eurofins Inc.)，将实施例2中制备的K-ML2中的各基因表达利用PCR溶液(宝生物公司，One Step TB Green Prime ScriptTM RT-PCR Kit II，Cat#：RR086A)和实时PCR仪器(Step One Plus，Applide Biosystems Inc.)进行检测。PCR反应是在50℃下2分钟和95℃下2分钟后，以95℃变性20秒、54-56℃配对30秒、72℃延伸30秒的3步骤条件下进行40个循环。
[表1]
其结果，如图2所示，确认到ADAM17的表达，另一方面，对于ACE2，虽然确认到表达，但其表达量极小，另外，对于TMPRSS2，几乎检测不到表达。因此认为，为了提高SARS-CoV-2对K-ML2的感染效率，需要使TMPRSS2和ACE2稳定地表达。
(实施例5)通过慢病毒载体导入TMPRSS2基因
为了在K-ML2中稳定地表达TMPRSS2，使用作为Human immunodeficiency virus 1型(HIV-I)增殖力等缺陷株的、在EF1a启动子的下游具有TMPRSS2基因(表2：序列编号No.8)且在CMV启动子下游具有药物抗性基因的第3代慢病毒载体(SignaGen)。在24孔板中以1×106细胞/孔接种悬浮于α-MEM培养基(含有20％FBS)中的K-ML2细胞，通过添加2×106TU(滴度单位)量的病毒载体液来导入该载体。使载体导入细胞悬浮于α-MEM培养基，以最终细胞数为1×106细胞/孔的方式接种于24孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。在培养4天后为了筛选导入了基因的细胞，添加嘌呤霉素(Sigma-Aldrich公司，嘌呤霉素，Cat#：P883Cat#：P8833)，进一步培养7天。然后，得到因耐药性而存活的细胞作为TMPRSS2的表达细胞(K-ML2/TMPRSS2)。
[表2]
药剂筛选的结果如图3所示。未进行基因导入的对照组由于没有药剂耐性，因此确认到添加药剂后细胞迅速死亡。导入了TMPRSS2基因的组由于细胞增殖，具有耐药性，因此期待到导入了包含TMPRSS2基因的慢病毒载体序列。
另外，在利用药剂进行筛选后，在mRNA水平上确认了导入了TMPRSS2基因的细胞中的TMPRSS2的表达。mRNA量通过使用了上述表1的TMPRSS2的引物组和已知浓度的模板的绝对定量法，利用PCR溶液(宝生物公司，One Step TB Green Prime ScriptTM RT-PCR KitII，Cat#：RR086A)和实时PCR仪器(Step One Plus，Applide Biosystems)检测。PCR反应是在50℃下2分钟和95℃下2分钟后，以95℃变性20秒、54℃配对30秒、72℃延伸30秒的3步骤条件进行40个循环。结果如图4所示。与K-ML2相比，在K-ML2中导入了TMPRSS2的细胞(K-ML2/TMPRSS2)中，TMPRSS2的表达增加，可以确认TMPRSS2被导入。
(实施例6)慢病毒载体的ACE2基因的导入
使用作为Human immunodeficiency virus 1型(HIV-I是增殖力等缺陷株的、在EF1a启动子的下游具有ACE2(序列编号10)，在CMV启动子的下游具有与上述TMPRSS2基因导入时具有不同的耐药性基因的第3代慢病毒载体(Signa Gen公司)，对实施例5中制作的在K-ML2中导入了TMPRSS2基因的细胞(K-ML2/TMPRSS2)导入ACE2基因。在24孔板中，以1×106细胞/孔接种悬浮于α-MEM培养基(含有20％FBS)中的K-ML2/TMPRSS2细胞，添加2×106TU量的病毒载体液，导入该载体。使载体导入细胞悬浮于α-MEM培养基，以最终细胞数为1×106细胞/孔的方式在α-MEM培养基(含有20％FBS)中接种到24孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。在培养4天后为了筛选导入了基因的细胞，使用新霉素(G418，Enzo Life Sciences公司，Cat#：ALX-380-013-G001)存在下进行筛选。其结果，导入了ACE2基因的组的细胞增殖，具有耐药性，因此期待到导入了包含ACE2基因的慢病毒载体序列。
测定mRNA和蛋白质来确认通过上述操作制作的细胞中的ACE2表达。mRNA量通过使用了上述表1的ACE2的引物组和已知的浓度模板的绝对定量法，利用PCR溶液(宝生物公司，One Step TB Green Prime ScriptTM RT-PCR Kit II，Cat#：A25742)和实时PCR仪器(StepOne Plus，Applide Biosystems)检测。PCR反应是在50℃下2分钟和95℃下2分钟后，以95℃变性20秒、54-56℃配对30秒、72℃延伸30秒的3步骤条件进行40个循环。结果如图5所示。与K-ML2相比，在实施例5中制备的K-ML2/TMPRSS2中通过上述操作导入了ACE2的细胞(K-ML2/TMPRSS2/ACE2)中，可以确认到ACE2的表达增加。因此，结合实施例5中的结果，可以确认通过本操作制作的细胞(K-ML2/TMPRSS2/ACE2)在K-ML2中导入了TMPRSS2和ACE2。
以下，也将导入了ACE2和TMPRSS2的K-ML2细胞(K-ML2/TMPRSS2/ACE2)记载为来源于K株的“cMylc”。
(实施例7)对cMylc的冠状病毒感染性的测定
一般而言，感染病毒的检测包括(1)利用电子显微镜直接观察，(2)利用以病毒蛋白质为靶标的抗原抗体反应的方法，(3)针对病毒基因序列的扩增法，及(4)病毒感染细胞(死细胞)的检测。在广泛称为SARS-CoV-2感染性细胞的Vero细胞中，已知SARS-CoV-2感染效率可通过释放到培养基中的增殖病毒来源的基因序列特异性定量PCR来测量。因此，通过定量PCR测量病毒量。
将实施例6中制作的源自K株的cMylc在α-MEM培养基(含有20％FBS)中，在37℃、5％CO2培养箱内培养，3天进行一次培养基更换，由此维持来制备。将该源自K株的cMylc以细胞数为2.0×104个/孔的方式接种到96孔板中。
SARS-CoV-2使用了在日本神奈川县卫生研究所将感染者检体接种于培养细胞(Vero细胞)中并使其增殖得到的病毒(SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-020)。用α-MEM培养基(含有20％FBS)调制感染Vero细胞培养液中释放的培养上清液，使病毒的终浓度为1.0×101、1.0×102、1.0×103copy/μL，添加到各孔中，然后在37℃，5％CO2培养箱内培养。进而，使用定量PCR测定培养第3天的培养上清液中的病毒数。作为阳性对照，使用表达TMPRSS2的Vero细胞(Vero/TMPRSS2)(PLoS One.2019；14(4):e0215822，从日本国立研究开发法人医药基础·健康·营养研究所JCRB细胞库(细胞编号：JCRB1818)购入)，作为阴性对照，使用α-MEM培养基(含有20％FBS)。
具体而言，从以最终浓度计为1.0×101、1.0×102、1.0×103copy/μL的病毒感染的各细胞的培养上清液提取SARS-CoV-2病毒RNA后，供于实时PCR。病毒RNA用QIAamp ViralRNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取，实时PCR基于公知的方法，使用基于SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-020的序列(Ascension#LC528232.1)的引物组(表3，Sigma Aldrich公司)，使用PCR溶液(One StepTB Green Prime ScriptTM RT-PCR Kit II，TaKaRa公司)和实时PCR仪器(Quant Studio3，Applide Biosystems公司)进行检测。PCR反应基于上述Sigma Aldrich引物序列，在42℃下5分钟，95℃下10秒后，以95℃下5秒变性和60℃下34秒延伸的2步骤进行40个循环。从标准曲线计算病毒量。
[表3]
如图6A所示，在Vero细胞中通过1.0×102copy/μL以上的感染，在cMylc细胞中通过1.0×103copy/μL以上的感染，在培养第3天确认到SARS-CoV-2的增殖。将添加1.0×103copy/μL的病毒3天后的病毒量相对于未添加细胞的组中的病毒量的比例((各实验组的培养上清液中的病毒量)/(未添加细胞的病毒量))用K-ML2和cMylc进行比较的结果示于图6B。在K-ML2中导入ACE2和TMPRSS2(K-ML2/TMPRSS2/ACE2)显示出促进SARS-CoV-2的增殖。由以上确认，在cMylc中，可以达成人细胞中的优异的SARS-CoV-2的增殖。
(实施例8)由永生化单核细胞制备树突状细胞
将实施例3中制作的K-ML2(为了容易理解与cMylc的感染比较，源自K株的Mylc，以下简称为[Mylc])和实施例5中制作的cMylc在α-MEM培养基(含有20％FBS)中，在37℃、5％CO2培养箱内培养，3天进行一次培养基更换，由此维持并制备。在将Mylc及cMylc一旦冷冻保存后使用的情况下，在37℃下隔水加热后，进行2次用α-MEM培养基(含有20％FBS)悬浮、离心(300×g)而回收的操作后，进行上述的培养及培养基更换。将制备得到的cMylc用100ng/mL的IL-4(Peprotech公司，Cat#：200-04)的存在下培养3天，使其分化为树突状细胞，得到来源于Mylc或cMylc的树突状细胞。以后，将使Mylc分化而得到的树突状细胞称为“Mylc-DC”，将使cMylc分化而得到的树突状细胞称为“cMylc-DC”。
(实施例9)对cMylc-DC的冠状病毒感染性的测定
SARS-CoV-2使用了在日本神奈川县卫生研究所将感染者检体接种于培养细胞(Vero细胞)中并增殖得到的病毒(SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-020)。使用释放到感染的Vero细胞培养物中的培养上清液作为病毒。作为评价培养基，使用含有10％FBS的α-MEM(Gibco公司，Cat#：C1187500BT)。
将实施例8中得到的Mylc-DC和cMylc-DC置于含有IL-4的α-MEM培养基(含有20％FBS和100ng/mL的IL-4)的T25烧瓶中，将实施例3中得到的Mylc和实施例5中得到的cMylc置于不含有IL-4的α-MEM培养基(含有20％FBS)的T25烧瓶中，在37℃、5％CO2培养箱内培养3天。然后将所有细胞以1×104个细胞/孔接种在96孔板中。作为对照组，使用表达TMPRSS2的Vero细胞(Vero/TMPRSS2)(从日本国立研究开发法人医药基础·健康·营养研究所JCRB细胞库(细胞编号：JCRB1818)购入)。
将制备的SARS-CoV-2添加到96孔板中的Mylc、cMylc、Mylc-DC或cMylc-DC中，使其感染，在37℃、5％CO2条件下，在评价培养基(含10％FBS的α-MEM)中培养。72小时后回收培养上清液，基于定量PCR法测定上清液中所含的子代病毒的感染量。具体而言，从感染了1.08×103，1.08×104，1.08×105TU的病毒的各细胞的培养上清液提取SARS病毒RNA后，供于实时PCR。需要说明的是，引物组、PCR溶液、实时PCR仪器和实时PCR条件与实施例7中相同。
SARS-CoV-2致敏引起的病毒释放量示于图7。与阴性对照(none)相比，Mylc和Mylc-DC的病毒释放量没有差异，与此相对，与阴性对照(none)相比，cMylc和cMylc-DC的病毒释放量显著增多。特别是cMylc-DC的病毒释放量比cMylc多，因此表明在SARS-CoV-2的增殖中，优选使用更加分化的细胞。
(实施例10)通过冠状病毒感染检测细胞因子表达
永生化单核细胞或树突细胞分泌IL-6作为炎性细胞因子。因此，确认所制作的细胞是否因冠状感染而表达细胞因子。
将冷冻保存的Mylc细胞或cMylc细胞在37℃下隔水加热后，进行两次用α-MEM培养基(含有20％FBS)悬浮、离心(300×g)回收的操作后，在10mlα-MEM(Gibco BRL)中的添加了FBS(CytivaInc.，Cat#：SH30088.03)10％的培养液或添加了2或5％HPL(Humanplateletlysate，来自人血小板的补充剂(AdvantaCell公司，Cat#：HPCHXCGL50)的培养液中接种于T25烧瓶后，培养3天。
将实施例8中得到的Mylc-DC和cMylc-DC置于含有IL-4(100ng/ml)的α-MEM培养基(含有20％FBS)的T25烧瓶中，将Mylc和cMylc置于不含IL-4的α-MEM培养基(含有20％FBS)的T25烧瓶，在37℃、5％CO2培养箱内培养3天。然后将cMylc或cMylc-DC以2×104个细胞/孔接种在96孔板中。
将与实施例9同样地得到的、在感染Vero细胞培养液中释放的培养上清液用α-MEM培养基(含有10％FBS)稀释100倍(×100)或稀释1000倍(×1000)，将所得到的含SARS-CoV-2病毒的液体添加到96孔板中的Mylc、Mylc-DC、cMylc或cMylc-DC中，使其感染，在37℃、5％CO2条件下，在评价培养基(α-MEM培养基(含有10％FBS))中培养，将得到的培养上清液用于评价。72小时后收集培养上清液并储存在-80℃下直至测量。将培养上清液中含有的IL-6用BioLegend公司制TELISA MAXTM Deluxe Set HUMAN IL-6试剂盒，Cat#：使用430504，按照制造商的方案进行测定。阴性对照使用添加了培养基的对照。
SARS-CoV-2病毒致敏产生的IL-6的量如图8所示。由cMylc分泌的IL-6依赖于致敏的病毒量而增加，与Mylc相比显著提高。另外，cMylc-DC的IL-6量比cMylc更多，因此表明在进一步分化的细胞中，伴随SARS-CoV-2病毒的IL-6产生更多。
因此表明，通过本实施例中记载的方法制作的cMylc及将其分化而得到的细胞(cMylc-DC等)能够被SARS-CoV-2病毒感染及增殖。cMylc及其分化的细胞允许在人细胞上进行检测实验，其等效于通过常规非人细胞(例如Vero细胞)进行的SARS-CoV-2病毒感染实验。
本申请以2020年10月7日在日本申请的特愿2020-170141为基础，在此提及的内容全部包含在本说明书中。
6
<110>
<120>
<130> PG02936A
<150> JP 2020-170141
<151> 2020-10-07
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 1
ctccttctca gccttgttgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 2
tccagtactg tagatggtgc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 3
ctctacggac caaacttcat c 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 4
ccactattcc ttggctagag taa 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 5
gtcgtggtgg tggatggtaa aa 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 6
gccccatctg tgttgattct ga 22
<210> 7
<211> 1479
<212> DNA
<213>
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1479)
<400> 7
atg gct ttg aac tca ggg tca cca cca gct att gga cct tac tat gaa 48
Met Ala Leu Asn Ser Gly Ser Pro Pro Ala Ile Gly Pro Tyr Tyr Glu
1 5 10 15
aac cat gga tac caa ccg gaa aac ccc tat ccc gca cag ccc act gtg 96
Asn His Gly Tyr Gln Pro Glu Asn Pro Tyr Pro Ala Gln Pro Thr Val
20 25 30
gtc ccc act gtc tac gag gtg cat ccg gct cag tac tac ccg tcc ccc 144
Val Pro Thr Val Tyr Glu Val His Pro Ala Gln Tyr Tyr Pro Ser Pro
35 40 45
gtg ccc cag tac gcc ccg agg gtc ctg acg cag gct tcc aac ccc gtc 192
Val Pro Gln Tyr Ala Pro Arg Val Leu Thr Gln Ala Ser Asn Pro Val
50 55 60
gtc tgc acg cag ccc aaa tcc cca tcc ggg aca gtg tgc acc tca aag 240
Val Cys Thr Gln Pro Lys Ser Pro Ser Gly Thr Val Cys Thr Ser Lys
65 70 75 80
act aag aaa gca ctg tgc atc acc ttg acc ctg ggg acc ttc ctc gtg 288
Thr Lys Lys Ala Leu Cys Ile Thr Leu Thr Leu Gly Thr Phe Leu Val
85 90 95
gga gct gcg ctg gcc gct ggc cta ctc tgg aag ttc atg ggc agc aag 336
Gly Ala Ala Leu Ala Ala Gly Leu Leu Trp Lys Phe Met Gly Ser Lys
100 105 110
tgc tcc aac tct ggg ata gag tgc gac tcc tca ggt acc tgc atc aac 384
Cys Ser Asn Ser Gly Ile Glu Cys Asp Ser Ser Gly Thr Cys Ile Asn
115 120 125
ccc tct aac tgg tgt gat ggc gtg tca cac tgc ccc ggc ggg gag gac 432
Pro Ser Asn Trp Cys Asp Gly Val Ser His Cys Pro Gly Gly Glu Asp
130 135 140
gag aat cgg tgt gtt cgc ctc tac gga cca aac ttc atc ctt cag gtg 480
Glu Asn Arg Cys Val Arg Leu Tyr Gly Pro Asn Phe Ile Leu Gln Val
145 150 155 160
tac tca tct cag agg aag tcc tgg cac cct gtg tgc caa gac gac tgg 528
Tyr Ser Ser Gln Arg Lys Ser Trp His Pro Val Cys Gln Asp Asp Trp
165 170 175
aac gag aac tac ggg cgg gcg gcc tgc agg gac atg ggc tat aag aat 576
Asn Glu Asn Tyr Gly Arg Ala Ala Cys Arg Asp Met Gly Tyr Lys Asn
180 185 190
aat ttt tac tct agc caa gga ata gtg gat gac agc gga tcc acc agc 624
Asn Phe Tyr Ser Ser Gln Gly Ile Val Asp Asp Ser Gly Ser Thr Ser
195 200 205
ttt atg aaa ctg aac aca agt gcc ggc aat gtc gat atc tat aaa aaa 672
Phe Met Lys Leu Asn Thr Ser Ala Gly Asn Val Asp Ile Tyr Lys Lys
210 215 220
ctg tac cac agt gat gcc tgt tct tca aaa gca gtg gtt tct tta cgc 720
Leu Tyr His Ser Asp Ala Cys Ser Ser Lys Ala Val Val Ser Leu Arg
225 230 235 240
tgt ata gcc tgc ggg gtc aac ttg aac tca agc cgc cag agc agg att 768
Cys Ile Ala Cys Gly Val Asn Leu Asn Ser Ser Arg Gln Ser Arg Ile
245 250 255
gtg ggc ggc gag agc gcg ctc ccg ggg gcc tgg ccc tgg cag gtc agc 816
Val Gly Gly Glu Ser Ala Leu Pro Gly Ala Trp Pro Trp Gln Val Ser
260 265 270
ctg cac gtc cag aac gtc cac gtg tgc gga ggc tcc atc atc acc ccc 864
Leu His Val Gln Asn Val His Val Cys Gly Gly Ser Ile Ile Thr Pro
275 280 285
gag tgg atc gtg aca gcc gcc cac tgc gtg gaa aaa cct ctt aac aat 912
Glu Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Lys Pro Leu Asn Asn
290 295 300
cca tgg cat tgg acg gca ttt gcg ggg att ttg aga caa tct ttc atg 960
Pro Trp His Trp Thr Ala Phe Ala Gly Ile Leu Arg Gln Ser Phe Met
305 310 315 320
ttc tat gga gcc gga tac caa gta gaa aaa gtg att tct cat cca aat 1008
Phe Tyr Gly Ala Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Ile Ser His Pro Asn
325 330 335
tat gac tcc aag acc aag aac aat gac att gcg ctg atg aag ctg cag 1056
Tyr Asp Ser Lys Thr Lys Asn Asn Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Gln
340 345 350
aag cct ctg act ttc aac gac cta gtg aaa cca gtg tgt ctg ccc aac 1104
Lys Pro Leu Thr Phe Asn Asp Leu Val Lys Pro Val Cys Leu Pro Asn
355 360 365
cca ggc atg atg ctg cag cca gaa cag ctc tgc tgg att tcc ggg tgg 1152
Pro Gly Met Met Leu Gln Pro Glu Gln Leu Cys Trp Ile Ser Gly Trp
370 375 380
ggg gcc acc gag gag aaa ggg aag acc tca gaa gtg ctg aac gct gcc 1200
Gly Ala Thr Glu Glu Lys Gly Lys Thr Ser Glu Val Leu Asn Ala Ala
385 390 395 400
aag gtg ctt ctc att gag aca cag aga tgc aac agc aga tat gtc tat 1248
Lys Val Leu Leu Ile Glu Thr Gln Arg Cys Asn Ser Arg Tyr Val Tyr
405 410 415
gac aac ctg atc aca cca gcc atg atc tgt gcc ggc ttc ctg cag ggg 1296
Asp Asn Leu Ile Thr Pro Ala Met Ile Cys Ala Gly Phe Leu Gln Gly
420 425 430
aac gtc gat tct tgc cag ggt gac agt gga ggg cct ctg gtc act tcg 1344
Asn Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Thr Ser
435 440 445
aag aac aat atc tgg tgg ctg ata ggg gat aca agc tgg ggt tct ggc 1392
Lys Asn Asn Ile Trp Trp Leu Ile Gly Asp Thr Ser Trp Gly Ser Gly
450 455 460
tgt gcc aaa gct tac aga cca gga gtg tac ggg aat gtg atg gta ttc 1440
Cys Ala Lys Ala Tyr Arg Pro Gly Val Tyr Gly Asn Val Met Val Phe
465 470 475 480
acg gac tgg att tat cga caa atg agg gca gac ggc taa 1479
Thr Asp Trp Ile Tyr Arg Gln Met Arg Ala Asp Gly
485 490
<210> 8
<211> 492
<212> PRT
<213>
<400> 8
Met Ala Leu Asn Ser Gly Ser Pro Pro Ala Ile Gly Pro Tyr Tyr Glu
1 5 10 15
Asn His Gly Tyr Gln Pro Glu Asn Pro Tyr Pro Ala Gln Pro Thr Val
20 25 30
Val Pro Thr Val Tyr Glu Val His Pro Ala Gln Tyr Tyr Pro Ser Pro
35 40 45
Val Pro Gln Tyr Ala Pro Arg Val Leu Thr Gln Ala Ser Asn Pro Val
50 55 60
Val Cys Thr Gln Pro Lys Ser Pro Ser Gly Thr Val Cys Thr Ser Lys
65 70 75 80
Thr Lys Lys Ala Leu Cys Ile Thr Leu Thr Leu Gly Thr Phe Leu Val
85 90 95
Gly Ala Ala Leu Ala Ala Gly Leu Leu Trp Lys Phe Met Gly Ser Lys
100 105 110
Cys Ser Asn Ser Gly Ile Glu Cys Asp Ser Ser Gly Thr Cys Ile Asn
115 120 125
Pro Ser Asn Trp Cys Asp Gly Val Ser His Cys Pro Gly Gly Glu Asp
130 135 140
Glu Asn Arg Cys Val Arg Leu Tyr Gly Pro Asn Phe Ile Leu Gln Val
145 150 155 160
Tyr Ser Ser Gln Arg Lys Ser Trp His Pro Val Cys Gln Asp Asp Trp
165 170 175
Asn Glu Asn Tyr Gly Arg Ala Ala Cys Arg Asp Met Gly Tyr Lys Asn
180 185 190
Asn Phe Tyr Ser Ser Gln Gly Ile Val Asp Asp Ser Gly Ser Thr Ser
195 200 205
Phe Met Lys Leu Asn Thr Ser Ala Gly Asn Val Asp Ile Tyr Lys Lys
210 215 220
Leu Tyr His Ser Asp Ala Cys Ser Ser Lys Ala Val Val Ser Leu Arg
225 230 235 240
Cys Ile Ala Cys Gly Val Asn Leu Asn Ser Ser Arg Gln Ser Arg Ile
245 250 255
Val Gly Gly Glu Ser Ala Leu Pro Gly Ala Trp Pro Trp Gln Val Ser
260 265 270
Leu His Val Gln Asn Val His Val Cys Gly Gly Ser Ile Ile Thr Pro
275 280 285
Glu Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Lys Pro Leu Asn Asn
290 295 300
Pro Trp His Trp Thr Ala Phe Ala Gly Ile Leu Arg Gln Ser Phe Met
305 310 315 320
Phe Tyr Gly Ala Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Ile Ser His Pro Asn
325 330 335
Tyr Asp Ser Lys Thr Lys Asn Asn Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Gln
340 345 350
Lys Pro Leu Thr Phe Asn Asp Leu Val Lys Pro Val Cys Leu Pro Asn
355 360 365
Pro Gly Met Met Leu Gln Pro Glu Gln Leu Cys Trp Ile Ser Gly Trp
370 375 380
Gly Ala Thr Glu Glu Lys Gly Lys Thr Ser Glu Val Leu Asn Ala Ala
385 390 395 400
Lys Val Leu Leu Ile Glu Thr Gln Arg Cys Asn Ser Arg Tyr Val Tyr
405 410 415
Asp Asn Leu Ile Thr Pro Ala Met Ile Cys Ala Gly Phe Leu Gln Gly
420 425 430
Asn Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Thr Ser
435 440 445
Lys Asn Asn Ile Trp Trp Leu Ile Gly Asp Thr Ser Trp Gly Ser Gly
450 455 460
Cys Ala Lys Ala Tyr Arg Pro Gly Val Tyr Gly Asn Val Met Val Phe
465 470 475 480
Thr Asp Trp Ile Tyr Arg Gln Met Arg Ala Asp Gly
485 490
<210> 9
<211> 2418
<212> DNA
<213>
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2418)
<400> 9
atg tca agc tct tcc tgg ctc ctt ctc agc ctt gtt gct gta act gct 48
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
gct cag tcc acc att gag gaa cag gcc aag aca ttt ttg gac aag ttt 96
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
aac cac gaa gcc gaa gac ctg ttc tat caa agt tca ctt gct tct tgg 144
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
aat tat aac acc aat att act gaa gag aat gtc caa aac atg aat aat 192
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
gct ggg gac aaa tgg tct gcc ttt tta aag gaa cag tcc aca ctt gcc 240
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
caa atg tat cca cta caa gaa att cag aat ctc aca gtc aag ctt cag 288
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
ctg cag gct ctt cag caa aat ggg tct tca gtg ctc tca gaa gac aag 336
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
agc aaa cgg ttg aac aca att cta aat aca atg agc acc atc tac agt 384
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
act gga aaa gtt tgt aac cca gat aat cca caa gaa tgc tta tta ctt 432
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
gaa cca ggt ttg aat gaa ata atg gca aac agt tta gac tac aat gag 480
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
agg ctc tgg gct tgg gaa agc tgg aga tct gag gtc ggc aag cag ctg 528
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
agg cca tta tat gaa gag tat gtg gtc ttg aaa aat gag atg gca aga 576
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
gca aat cat tat gag gac tat ggg gat tat tgg aga gga gac tat gaa 624
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
gta aat ggg gta gat ggc tat gac tac agc cgc ggc cag ttg att gaa 672
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
gat gtg gaa cat acc ttt gaa gag att aaa cca tta tat gaa cat ctt 720
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
cat gcc tat gtg agg gca aag ttg atg aat gcc tat cct tcc tat atc 768
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
agt cca att gga tgc ctc cct gct cat ttg ctt ggt gat atg tgg ggt 816
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
aga ttt tgg aca aat ctg tac tct ttg aca gtt ccc ttt gga cag aaa 864
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
cca aac ata gat gtt act gat gca atg gtg gac cag gcc tgg gat gca 912
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
cag aga ata ttc aag gag gcc gag aag ttc ttt gta tct gtt ggt ctt 960
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
cct aat atg act caa gga ttc tgg gaa aat tcc atg cta acg gac cca 1008
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
gga aat gtt cag aaa gca gtc tgc cat ccc aca gct tgg gac ctg ggg 1056
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
aag ggc gac ttc agg atc ctt atg tgc aca aag gtg aca atg gac gac 1104
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
ttc ctg aca gct cat cat gag atg ggg cat atc cag tat gat atg gca 1152
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
tat gct gca caa cct ttt ctg cta aga aat gga gct aat gaa gga ttc 1200
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
cat gaa gct gtt ggg gaa atc atg tca ctt tct gca gcc aca cct aag 1248
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
cat tta aaa tcc att ggt ctt ctg tca ccc gat ttt caa gaa gac aat 1296
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
gaa aca gaa ata aac ttc ctg ctc aaa caa gca ctc acg att gtt ggg 1344
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
act ctg cca ttt act tac atg tta gag aag tgg agg tgg atg gtc ttt 1392
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
aaa ggg gaa att ccc aaa gac cag tgg atg aaa aag tgg tgg gag atg 1440
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
aag cga gag ata gtt ggg gtg gtg gaa cct gtg ccc cat gat gaa aca 1488
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
tac tgt gac ccc gca tct ctg ttc cat gtt tct aat gat tac tca ttc 1536
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
att cga tat tac aca agg acc ctt tac caa ttc cag ttt caa gaa gca 1584
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
ctt tgt caa gca gct aaa cat gaa ggc cct ctg cac aaa tgt gac atc 1632
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
tca aac tct aca gaa gct gga cag aaa ctg ttc aat atg ctg agg ctt 1680
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
gga aaa tca gaa ccc tgg acc cta gca ttg gaa aat gtt gta gga gca 1728
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
aag aac atg aat gta agg cca ctg ctc aac tac ttt gag ccc tta ttt 1776
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
acc tgg ctg aaa gac cag aac aag aat tct ttt gtg gga tgg agt acc 1824
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
gac tgg agt cca tat gca gac caa agc atc aaa gtg agg ata agc cta 1872
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
aaa tca gct ctt gga gat aaa gca tat gaa tgg aac gac aat gaa atg 1920
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
tac ctg ttc cga tca tct gtt gca tat gct atg agg cag tac ttt tta 1968
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
aaa gta aaa aat cag atg att ctt ttt ggg gag gag gat gtg cga gtg 2016
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
gct aat ttg aaa cca aga atc tcc ttt aat ttc ttt gtc act gca cct 2064
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
aaa aat gtg tct gat atc att cct aga act gaa gtt gaa aag gcc atc 2112
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
agg atg tcc cgg agc cgt atc aat gat gct ttc cgt ctg aat gac aac 2160
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
agc cta gag ttt ctg ggg ata cag cca aca ctt gga cct cct aac cag 2208
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
ccc cct gtt tcc ata tgg ctg att gtt ttt gga gtt gtg atg gga gtg 2256
Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val
740 745 750
ata gtg gtt ggc att gtc atc ctg atc ttc act ggg atc aga gat cgg 2304
Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg
755 760 765
aag aag aaa aat aaa gca aga agt gga gaa aat cct tat gcc tcc atc 2352
Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile
770 775 780
gat att agc aaa gga gaa aat aat cca gga ttc caa aac act gat gat 2400
Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp
785 790 795 800
gtt cag acc tcc ttt tag 2418
Val Gln Thr Ser Phe
805
<210> 10
<211> 805
<212> PRT
<213>
<400> 10
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val
740 745 750
Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg
755 760 765
Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile
770 775 780
Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp
785 790 795 800
Val Gln Thr Ser Phe
805
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 11
gcctcttctc gttcctcatc ac 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 12
agcagcatca ccgccattg 19
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 13
agcctcttct cgttcctcat cac 23
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 14
ccgccattgc cagccattc 19

Claims (29)

1.一种冠状病毒感染性人永生化髓样细胞的制备方法，其包括将ACE2和TMPRSS2导入人永生化髓样细胞中的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述人永生化髓样细胞是表达M-CSF和/或GM-CSF的细胞。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其包括向所述永生化髓样细胞中导入M-CSF和/或GM-CSF的步骤；以及
向得到的表达M-CSF和/或GM-CSF的永生化髓样细胞中导入ACE2和TMPRSS2的步骤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述ACE2和所述TMPRSS2通过慢病毒导入。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其中，所述人永生化髓样细胞为人永生化单核细胞。
6.一种表达ACE2和TMPRSS2的树突状细胞的制备方法，其包括使通过权利要求5的方法得到的人永生化单核细胞分化为树突状细胞的步骤。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法，其中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。
8.一种人永生化髓样细胞，其表达ACE2和TMPRSS2。
9.根据权利要求8所述的人永生化髓样细胞，其还表达M-CSF和/或GM-CSF。
10.根据权利要求8或9所述的细胞，其中，所述人永生化髓样细胞为人永生化单核细胞。
11.根据权利要求8或9所述的细胞，其中，所述人永生化髓样细胞为人树突状细胞。
12.一种判断样品中存在冠状病毒的方法，其包括向权利要求9至11中任一项所述的人永生化髓样细胞的培养液中添加样品的步骤；以及
检测所述细胞的培养上清液中的冠状病毒或测定冠状病毒的水平的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述培养上清液中的所述冠状病毒的检测或所述冠状病毒的水平的测定在从添加所述样品起第1至7天进行。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述冠状病毒的检测或冠状病毒的水平的测定通过所述冠状病毒的RNA的检测或冠状病毒的RNA水平的测定来进行。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，通过定量PCR进行所述冠状病毒的RNA的检测或冠状病毒的RNA水平的测定。
16.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述冠状病毒的检测或冠状病毒的水平的测定通过所述培养上清液中的炎性细胞因子的检测或炎性细胞因子水平的测定来进行。
17.根据权利要求16的方法，其中所述炎性细胞因子是IL-6。
18.一种冠状病毒的制造方法，其包括在权利要求9至11中任一项所述的人永生化髓样细胞的培养液中添加冠状病毒而使其感染该细胞的步骤；以及
回收所述细胞的所述培养液中的冠状病毒的步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述培养液中的所述冠状病毒的回收在从添加所述冠状病毒起第1至7天进行。
20.一种被测样品的抗冠状病毒活性的评价方法，其包括：
在所述被测样品的存在下，向权利要求9至11中任一项所述的人永生化髓样细胞的培养液中添加冠状病毒的步骤；以及
测定所述细胞的培养上清液中的所述冠状病毒的水平的步骤，
其中，如果在所述被测样品的存在下添加有所述冠状病毒的培养上清液中的冠状病毒水平，低于在所述被测样品的不存在下添加有冠状病毒的培养上清液中的冠状病毒水平，则该被测样品被评价为具有抗冠状病毒活性。
21.一种鉴定被测样品中是否含有具有冠状病毒中和作用的物质的方法，其包括：
在所述被测样品的存在下，向权利要求9至11中任一项所述的人永生化髓样细胞的培养液中混合冠状病毒的步骤；以及
测定所述细胞的培养上清液中的所述冠状病毒的水平的步骤，
其中，如果在所述被测样品的存在下添加有所述冠状病毒的所述培养上清液中的所述冠状病毒的水平，低于在所述被测样品的不存在下添加有所述冠状病毒的所述培养上清液中的冠状病毒的水平，则该被测样品被鉴定为含有具有冠状病毒中和作用的物质。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述被测样品为血液样品。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述具有冠状病毒中和作用的物质为冠状病毒中和抗体。
24.一种评价冠状病毒疫苗的中和抗体诱导能力的方法，其包括：
将来自接种了该疫苗的哺乳动物的血液样品作为被测样品实施权利要求22或权利要求23所述的方法的步骤。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中，所述培养上清液中的所述冠状病毒的水平的测定在从添加所述被测样品或所述样品起第1至7天进行。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中，所述冠状病毒的检测或冠状病毒的水平的测定通过所述冠状病毒的RNA的检测或冠状病毒的RNA水平的测定来进行。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述冠状病毒的RNA水平的测定通过定量PCR来进行。
28.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中，所述冠状病毒的水平的测定通过所述培养上清液中的炎性细胞因子水平的测定来进行。
29.根据权利要求28的方法，其中，所述炎性细胞因子是IL-6。
CN202180068564.7A 2020-10-07 2021-10-06 冠状病毒感染性细胞及其制备方法 Pending CN116710478A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-170141 2020-10-07
JP2020170141 2020-10-07
PCT/JP2021/037069 WO2022075384A1 (ja) 2020-10-07 2021-10-06 コロナウイルス感染性細胞及びその調製方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116710478A true CN116710478A (zh) 2023-09-05

Family

ID=81126497

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180068564.7A Pending CN116710478A (zh) 2020-10-07 2021-10-06 冠状病毒感染性细胞及其制备方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230374452A1 (zh)
EP (1) EP4227407A1 (zh)
JP (1) JPWO2022075384A1 (zh)
CN (1) CN116710478A (zh)
WO (1) WO2022075384A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115261336B (zh) * 2022-06-06 2024-03-29 干细胞转化研究中心有限公司 人源胚外滋养层细胞模型在病毒高效制备、检测和药物筛选中的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2268796A1 (en) 2008-03-17 2011-01-05 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Vectors and methods for generating vector-free induced pluripotent stem (ips) cells using site-specific recombination
ES2587395T3 (es) 2008-06-04 2016-10-24 Cellular Dynamics International, Inc. Procedimientos para la producción de células IPS usando un enfoque no vírico
WO2009157201A1 (en) 2008-06-26 2009-12-30 Osaka University Method and kit for preparing ips cells
EP2322611B1 (en) 2008-07-16 2016-06-01 IP Pharma Co., Ltd. Method for production of reprogrammed cell using chromosomally unintegrated virus vector
US10034900B2 (en) 2010-09-30 2018-07-31 National University Corporation Kumamoto University Method of producing myeloid blood cells
JP6903866B2 (ja) 2016-01-27 2021-07-14 国立大学法人 熊本大学 血液由来単球の増殖誘導方法
JP6884967B2 (ja) 2017-03-31 2021-06-09 国立大学法人 熊本大学 ヒトミエロイド系血液細胞及び該細胞の作製方法
CN112601815A (zh) * 2018-08-27 2021-04-02 迈凯恩技术有限公司 使用永生化单核细胞和诱导细胞的抗感染药物、疫苗等的评价方法
TWI689897B (zh) 2019-04-02 2020-04-01 中原大學 可攜式智慧型噪音抑制及音訊播放裝置

Also Published As

Publication number Publication date
EP4227407A1 (en) 2023-08-16
US20230374452A1 (en) 2023-11-23
JPWO2022075384A1 (zh) 2022-04-14
WO2022075384A1 (ja) 2022-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Adombi et al. Monkey CV1 cell line expressing the sheep–goat SLAM protein: a highly sensitive cell line for the isolation of peste des petits ruminants virus from pathological specimens
JP5190654B2 (ja) 分子マーカーを用いた間葉系幹細胞の識別方法及びその利用
JP2012527887A (ja) 人工多能性幹細胞のクローンの選択方法
JP7376013B2 (ja) 不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬，ワクチンなどの評価方法
KR102015205B1 (ko) 리프로그래밍 전구체 조성물 및 그의 사용 방법
Wang et al. Human airway lineages derived from pluripotent stem cells reveal the epithelial responses to SARS-CoV-2 infection
AU2018279728B2 (en) Methods and compositions for identifying epitopes
CN114230658A (zh) 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途
CN103703130A (zh) 筛选诱导的多能干细胞的方法
JP7382628B2 (ja) アフリカ豚コレラウイルスの製造方法及び検出方法
CN116710478A (zh) 冠状病毒感染性细胞及其制备方法
WO2007021004A1 (ja) ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカーＭｓｘ１／２
JP6490010B2 (ja) ゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去方法および該方法に用いられる合成ペプチド
WO2020125423A1 (zh) 重组单纯疱疹病毒、试剂盒及其用途
CN110129272B (zh) 稳定表达map3k8蛋白的pk-15细胞株及其构建和应用
US20230122115A1 (en) Markers specific for pluripotent stem cells, and methods of using the same
CN114672460B (zh) 一种靶向cd44的异质型cic细胞模型的制备方法及应用
Naaman et al. Measles virus persistent infection of human induced pluripotent stem cells
CN110592031B (zh) 一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用
KR20230087589A (ko) 분비체-함유 조성물의 분석을 위한 방법 및 어세이
WO2022046706A2 (en) Assay for sars-cov-2 infection of vulnerable human cells
KR102154380B1 (ko) 고-적정 e형 간염 바이러스 스톡을 세대화시키는 방법과 e형 간염 바이러스의 적정 측정법
CN113699240B (zh) Nrk在肺癌治疗和预后诊断中的医药用途
CN116064618B (zh) 一种echs1基因突变体、蛋白多肽、试剂盒及其应用
CN113249331B (zh) 负载Tax抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20230905

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication