CN103619484B - 用于密度梯度分离的方法和插入件 - Google Patents

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Abstract

描述了一种适合用于密度梯度分离的离心管的插入件。插入件包括元件，所述元件尺寸确定成配合在管内以用于将管分成顶部分和底部分。可选地插入件具有支撑件，所述支撑件从元件延伸或悬挂以用于将元件定位在管内。至少两个开口位于元件上，使得当插入件定位在离心管中时，第一开口相对于第二开口更靠近管的底端。也描述了一种使用离心管的插入件从样本分离靶细胞群的方法。

Description

用于密度梯度分离的方法和插入件
相关申请
本申请要求于2011年5月5日提交的共同未决的美国临时申请No.61/482,886的优先权，上述申请的内容通过引用完整地被合并于本文中。
技术领域
本申请涉及一种用于分离细胞群的设备和方法，并且更具体地涉及用于离心管的插入件和使用密度梯度分离来分离细胞群的方法。
背景技术
在许多应用中，期望富集或替代地耗尽生物样本中的细胞群。血液学、免疫学和肿瘤学的领域依赖于外周血和来自相关组织（例如骨髓、脾、胸腺和胎肝）的细胞悬液的样本。特定细胞类型从这些不均匀样本的分离对于这些领域中的研究以及某些恶性肿瘤和免疫/造血障碍的诊断和治疗是关键。
诸如T细胞和抗原递呈细胞的免疫细胞的纯化群是免疫功能的研究所必需的并且在免疫疗法中使用。细胞、分子和生化过程的研究需要孤立地分析某些细胞类型。许多技术已用于分离T细胞亚群、B细胞、嗜碱粒细胞、NK细胞和树突细胞。
造血干细胞的分离也已成为很感兴趣的领域并且纯干细胞群将促进造血的研究。从外周血、脐带血和/或骨髓移植造血细胞越来越多地与高剂量化学疗法和/或放射疗法组合使用以便治疗包括恶性、非恶性和遗传性疾病的各种疾病。这样的移植物中的很少细胞能够长期造血重建，并且因此强烈需要开发用于纯化造血干细胞的技术。
此外，严重并发症和甚至移植程序的成功在很大程度上取决于用于去除对移植受体构成风险的移植物中的细胞的程序的有效性。这样的细胞包括同种移植物中为移植物抗宿主疾病（GVHD）负责的T淋巴细胞，和可能导致恶性生长的复发的自体移植物中的肿瘤细胞。通过去除非必要细胞并且因此减小待输注的冷冻保存液（cyropreservant）的体积而紧实移植物也是重要的。
在某些情况下，期望去除或耗尽来自生物样本，例如骨髓移植物中的肿瘤细胞。支气管、乳腺导管以及胃肠道和泌尿生殖道的上皮癌代表如今看到的实体性肿瘤的主要类型。微转移肿瘤细胞迁移被认为是患有上皮癌的患者的重要预后因素。检测这样的转移性细胞的能力受到组织或流体采样的有效性和肿瘤检测方法的灵敏性限制。富集血液样本中的循环上皮肿瘤细胞的技术增加检测转移性疾病的能力并且便于这样的罕见细胞的研究和能够进行疾病扩散的生物变化的确定。
造血细胞和免疫细胞在物理特性，例如密度的基础上并且在对杀死连续分裂细胞的某些药理学试剂的易感性的基础上进行分离。细胞表面抗原的单克隆抗体的出现大大增加了区分和分离不同细胞类型的可能性。使用单克隆抗体使细胞群从血液和相关细胞悬液分离有两种基本方法。它们的区别在于用（一种或多种）抗体区分/标记的是期望细胞还是非期望细胞。
在阳性选择技术中，期望细胞用抗体进行标记并且从剩余未标记/非需要细胞去除。在阴性选择中，非需要细胞被标记并且被去除。抗体/补体治疗和免疫毒素的使用是阴性选择技术，但是荧光激活细胞分选（FACS）和多数分批免疫吸附技术可以适合于阳性和阴性两种选择。在免疫吸附技术中，细胞用单克隆抗体进行选择并且优选地结合到可以从细胞的剩余物去除的表面，例如珠柱、瓶、磁性颗粒。免疫吸附在临床上和研究中赢得赞同，原因是它们用单克隆抗体保持靶细胞的高特异性，但是不同于FACS，它们可以按比例扩大以直接处理临床采集中的大量细胞并且它们避免使用细胞毒性试剂，例如免疫毒素和补体的危险。然而它们需要使用“设备”或细胞分离表面，例如珠柱、淘瓶或磁体。
不管特定方法如何，用于从血液分离特定细胞（例如造血干细胞、免疫细胞和循环上皮肿瘤细胞）的当前技术大体上包括去除红血细胞（RBC）的初始步骤。密度分离通常用于从外周血液去除RBC。Ficoll-PaqueTM（Ficoll）（Amersham Pharmacia Biotech AB，乌普萨拉，瑞典）是用于该应用的使用最广泛的密度分离介质（DSM）。其它DSM包括LymphoprepTM（Axis-Shield，挪威），和RosetteSepTM DM-L（STEMCELL Technologies，加拿大）。在Ficoll密度分离中，将全血层叠在Ficoll上并且然后离心。RBC和粒细胞沉淀到细胞团块并且单核细胞保持在Ficoll-血浆界面处。该技术的成功依赖于单核细胞、粒细胞和RBC之间的密度的差异，由此单核细胞在Ficoll中漂浮而RBC和粒细胞则不然。
如果有血液与Ficoll的混合，则Ficoll的密度将被影响，因此在离心之前需要将血液小心地层叠到Ficoll层上。在离心之后，如果血浆和Ficoll之间的界面在管的操作期间被扰动，则可能难以在不也收集一些红细胞和粒细胞的情况下回收单核细胞。
特定细胞可以例如使用RosetteSepTM连接到红血细胞，以便形成免疫花环，从而使得在密度梯度分离期间靶细胞与红血细胞形成团块。许多不同的特定淋巴细胞和粒细胞群可以通过密度梯度分离与RosetteSepTM的组合进行分离。另外，如果全血储存超过24小时，则粒细胞改变密度并且将不会与红细胞形成团块。使用RosetteSepTM将RBC连接到粒细胞可以改善这些样本中的单核细胞的密度分离。
如果层叠和细胞回收的过程更可靠则将是有益的。已进行了一些研发管的工作以使用离心管中的各种类型的插入件简化Ficoll过程。UniSep管（NovaMEd，以色列）具有由塑料支撑件保持就位的网状圆盘的插入件。具有该插入件的管难以装载Ficoll，原因是它们需要离心步骤，并且网会被细胞堵塞。CPTTM管（BD，新泽西州）具有在Ficoll状密度分离介质上的凝胶屏障。管昂贵并且凝胶会被细胞堵塞，尤其在有红细胞的任何免疫花环的情况下。美国专利No.5,840,502描述一种具有圆锥形硅树脂插入件的管，所述插入件压配合到离心管中。这些管大体上需要离心以用密度分离介质填充管。
AccuspinTM（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）和LeucosepTM（Greiner Bio-One，门罗，北卡罗莱那州）管具有将管分成顶部和底部部段的熔块。需要离心步骤以用密度介质填充熔块之下的体积并且在密度分离期间该熔块可以脱离。熔块可以变为涂覆有红血细胞（RBC）并且有时堵塞，尤其当分离免疫花环细胞时。
因此，需要一种用于离心管的插入件，其允许管容易地装载Ficoll或其它密度分离介质。此外，将有利的是在插入件之下俘获的空气的小体积在分离中不破坏管的使用。也将有利的是插入件未被小血凝块或红血细胞的聚集体或花环堵塞并且能够倒置管以倒出富集样本，而包含团块的管的下部分中的液体不流出。最后，期望插入件可靠地保持就位，使得它脱离的机会很小。
发明内容
本公开大体上涉及一种用于离心管的插入件，其有用于使用密度分离介质（DSM）的密度梯度分离。在一个实施例中，插入件便于用DSM填充离心管并且将样本层叠在离心管中的DSM的顶部上。在密度梯度分离方案期间，插入件也便于包含DSM的离心管的处理和操作。在一个实施例中，在密度梯度分离之后插入件帮助防止DSM与DSM和样本的剩余体积之间的界面层之间的混合。
在一个实施例中，插入件包括元件，所述元件尺寸确定成配合在离心管内并且将管分成顶部分和底部分。在一个实施例中，插入件具有通过元件的至少两个开口，使得当插入件定位在离心管中时，第一开口相对于第二开口更靠近管的底端。在一个实施例中，插入件包括支撑件，所述支撑件从元件延伸或悬挂以用于将元件定位在管内。在一个实施例中，当插入件向下推动到离心管中时，支撑件接触离心管的底端并且限制插入件的位置。
在一个实施例中，当定位在离心管中时，第一开口允许流体流动到插入件之下的空间中。当离心管填充有液体时，第二开口允许空气从元件之下的空间逸出。可选地，插入件具有超过两个开口。在一个实施例中，开口尺寸确定成提供横越每个开口的表面张力，从而当倒置管时，防止包含在元件之下的流体流动通过开口。
在一个方面中，插入件有用于靶群从样本的回收或分离。在一个实施例中，靶群是靶细胞群并且样本是生物样本。在一个实施例中，本文中所述的插入件有用于使用密度梯度分离从血液样本分离和回收白细胞或单核细胞。
本文中所述的插入件提供许多优点。在一个实施例中，插入件允许样本倒入包含DSM的离心管中而不混合样本和DSM，从而损害密度梯度分离。在一个实施例中，插入件允许离心管容易地填充有DSM。在一个实施例中，在密度梯度分离期间本文中所述的插入件不被例如血细胞或其它样本成分堵塞。在一个实施例中，在密度梯度分离之后，离心管的顶部分中的样本的体积可以被倒出离心管而不倒出包含在离心管的底部分中的液体。在一个实施例中，插入件允许被分离样本被倒出或泻出离心管而不扰动包含在管的底部分中的分离介质和任何团块材料（例如红血细胞）的底部分。本文中所述的插入件也可以容易地和经济地使用注射模制或本领域中已知的其它技术制造为单件并且容易插入离心管中。
在另一方面中，提供一种用于从样本分离靶细胞群的方法，其包括：
a)提供具有如本文中所述的插入件的离心管；
b)用密度分离介质（DSM）填充离心管的一部分，使得DSM覆盖插入件的顶部；
c)将包含靶细胞群的样本的体积加入离心管，以形成DSM和样本之间的界面；
d)旋转离心管以从样本分离靶细胞群。
在一个实施例中，方法包括在旋转离心管之后，从DSM和样本之间的界面之上的样本的体积回收靶细胞群。在一个实施例中，通过倒出元件之上的包含在离心管的顶部分中的样本的体积从离心管回收靶细胞群。在一个实施例中，通过使用体积转移装置（例如移液管）去除元件之上的包含在离心管的顶部分中的样本的体积回收靶细胞群。可选地，方法包括在旋转离心管之前，例如通过免疫花环（如通过引用被合并于此的美国专利No.6,750,326中所述）将致密颗粒连接到样本中的第二细胞群，以改善将靶细胞群从样本的剩余部分分离。在一个实施例中，本文中所述的插入件可以在减速期间在制动器开启的情况下在离心机中使用，而不损害从样本回收靶细胞。
在另一方面中，提供一种离心管，所述离心管包括如本文中所述的用于离心管的插入件。在一个实施例中，插入件与离心管成一体。
在另一方面中，本说明书提供一种套件，所述套件包括如本文中所述的插入件。在一个实施例中，套件也包括一个或多个离心管、DSM的体积或用于执行如本文中所述的任何方法的印刷手册。
本公开的其它特征和优点将从以下详细描述变得明显。然而应当理解详细描述和具体例子尽管指示本公开的优选实施例，但是仅仅作为示例被给出，原因是本领域的技术人员从该详细描述将显而易见本公开的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
为了更好地理解本文中所述的实施例并且更清楚地显示它们可以如何实施例，现在将仅仅通过例子参考附图，附图显示至少一个示例性实施例，并且其中：
图1A显示具有第一开口和第二开口之间的15度倾斜的用于离心管的插入件的一个实施例的透视图。图1B是图1A中所示的插入件的俯视平面图。图1C是沿着线A-A的图1B中所示的插入件的截面图。
图2A显示具有凹顶表面、具有第一开口和第二开口之间的15度倾斜的用于离心管的插入件的一个实施例的透视图。图2B是图2A中所示的插入件的俯视平面图。图2C是沿着线A-A的图2B中所示的插入件的截面图。
图3A显示具有凹顶表面、具有第一开口和第二开口之间的25度倾斜的用于离心管的插入件的一个实施例的透视图。图3B是图3A中所示的插入件的俯视平面图。图3C是沿着线A-A的图3B中所示的插入件的截面图。
图4显示具有中心开口和围绕元件的顶表面的周边的三个开口并且具有中心开口和元件的周边之间的15度倾斜的圆锥形插入件的一个实施例。中心开口在离心期间允许细胞的通过并且围绕周边的开口在用密度介质填充管期间允许空气逸出。
图5显示具有中心开口和围绕元件的顶表面的周边的三个开口并且具有中心开口和元件的周边之间的40度倾斜的圆锥形插入件的一个实施例。中心开口在离心期间允许细胞的通过并且围绕周边的开口在用密度介质填充管期间允许空气逸出。
图6显示定位在离心管内的如本文中所述的插入件的一个实施例的截面图。
图7A显示定位在离心管内的如本文中所述的插入件的一个实施例的截面侧视图，其中管装载有分离介质和层叠在分离介质的顶部上的样本。图7B显示通过密度梯度离心将样本分离成层之后的管。图7C显示倒置的管，其中分离介质在插入件之下保持在管中。
具体实施方式
本文中所述的插入件有用于与离心管组合以使用密度梯度分离来分离样本中的靶群。例如，在一个实施例中，插入件可以定位在离心管中并且用于使用密度分离通过在离心机中旋转管使单核细胞从外周血液的样本中的其它细胞分离。具有比DSM大的密度的细胞和其它成分将沉淀到管的底部，而具有比DSM小的密度的细胞和其它成分将在样本和DSM之间的界面处或之上沉淀。
在一个实施例中，当插入件定位在离心管中时，本文中所述的插入件便于用DSM填充离心管。插入件也有用于层叠离心管中的样本和DSM并且防止样本和DSM之间的界面的破坏。在一个实施例中，插入件也有用于在密度梯度分离方案中回收靶细胞群。
根据本发明的用于离心管的插入件的各种示例性实施例在图1至5中显示。
参考图1，提供用于离心管的插入件10。插入件10具有元件12和支撑件14。支撑件14从元件12延伸以用于将插入件与离心管定位在一起。如图1中所示，支撑件14可以采用圆柱形侧壁的形式。在一些实施例中，支撑件可以采用从元件延伸或悬挂并且用于在离心管中定位或稳定插入件的撑杆或腿的形式。
在一个实施例中，插入件具有通过元件的至少两个开口。参考图1，显示通过元件12的第一开口16和通过元件12的第二开口18。在一个实施例中，当插入件定位在离心管中时，第一开口相对于第二开口更靠近离心管的底部。可选地，如图1中所示，第一开口16和/或第二开口18可以包括支撑件14的切口部分。在一个实施例中，开口的周边包括支撑件14的切口部分和离心管的侧壁的至少一部分。在一个实施例中，第一和/或第二开口为圆形。在一个实施例中，第一和/或第二开口为非圆形并且包括直或弯曲侧或它们的组合。在一个实施例中，第一和第二开口是不同形状。
图2显示用于离心管的插入件200的另一实施例，该插入件具有元件212、支撑件214以及第一和第二开口216和218。元件212具有凹表面，所述凹表面具有从位于元件的周边上的第一开口216到第二开口218的15度的倾斜。图3显示用于离心管的类似插入件300。支撑件314从元件312延伸，并且具有凹表面，所述凹表面具有从位于元件的周边上的第一开口316到第二开口318的25度的倾斜。
图4和5显示用于离心管的插入件的另外的实施例，所述插入件具有用于分离管的顶和底部分的圆锥形元件。参考图4，插入件400具有元件412、支撑件414、第一中心开口416和围绕元件的周边的多个第二开口418。元件412具有圆锥形顶表面，所述圆锥形顶表面具有从元件的底部处的第一开口到周边的大约15度的倾斜。图5显示类似插入件，所述插入件具有元件512、支撑件514、第一中心开口516和围绕元件512的周边的多个第二开口518。元件512具有圆锥形顶表面，所述圆锥形顶表面形成从元件的底部处的第一开口到周边的40度的倾斜。可选地，插入件具有一个、两个、三个、四个、五个或超过五个第二开口。在一个实施例中，第二开口具有不同尺寸。在一个实施例中，第二开口围绕元件的周边均匀地间隔。
在一个实施例中，元件尺寸确定成配合在离心管内以用于将管分成顶部分和底部分。参考图6，插入件显示为定位在空离心管50内并且元件12将离心管顶部分和底部分。如图6中所示，支撑件14接触离心管的圆锥形底部分并且防止插入件进一步下降到离心管中。在一个实施例中，从元件延伸或悬挂的支撑件也便于将插入件放置到离心管中并且在操作管时或在分离步骤（例如离心）期间防止插入件脱离。
在一个实施例中，本文中所述的插入件便于用DSM填充离心管。例如，第一开口允许元件之上的离心管的顶部分中的空间与离心管之下的离心管的底部分中的空间之间的空气或流体连通。在一个实施例中，一个或多个第二开口也允许元件之上的离心管的顶部分中的空间与离心管之下的离心管的底部分中的空间之间的空气或流体连通。在一个实施例中，当管的底端通过第一开口填充有液体时，第二开口允许空气从元件之下的空间逸出。可选地，插入件具有一个、两个、三个、四个、五个或超过五个第二开口。在一个实施例中，第二开口具有不同尺寸。在一个实施例中，第二开口围绕元件的周边均匀地间隔。
在一个实施例中，当插入件定位在离心管中时，第一开口相对于第二开口更靠近管的底端。第一和第二开口的相对布置允许流体穿过第一开口并且填充管的底部分。当流体通过第一开口填充管时，空气排出定位在便于用流体填充或装载管的第一开口之上的第二开口。在一个实施例中，第一开口和第二开口在元件上分离的距离是第一开口的直径的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或大于五倍。在一个实施例中，第一开口和第二开口在元件上分离的距离是第二开口的直径的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或大于五倍。当在本文中使用时，“直径”表示当插入件定位在离心管中时由任一开口的相对侧限定的最大横截面距离。
在一个实施例中，当插入件定位在离心管中时，第一开口位于元件的顶表面的最下部分处。例如参考图6，第一开口16相对于离心管50的底端位于元件12的最下部分处。类似地，将领会，当图2-5中所示的插入件定位在离心管内时，第一开口将相对于离心管的底部位于元件的顶表面的最下部分处。
在另一实施例中，当插入件定位在离心管中时，第二开口位于元件的顶表面的最高部分处。例如参考图6，第二开口18相对于离心管50的底端位于元件12的最高部分处并且最靠近管的敞开端部。在一个实施例中，当管填充有流体时，将第二开口定位在元件的最高部分处帮助防止气泡被俘获在插入件之下。在一个实施例中，第一和/或第二开口位于元件的周边上或附近。在一个实施例中，当插入件定位在离心管中时，第一和/或第二开口邻近离心管的侧壁定位。例如，图4显示具有第一中心开口和位于元件的周边上的多个第二开口的插入件。
在一个实施例中，开口尺寸确定成提供横越开口的表面张力，从而当倒置管时防止包含在插入件之下的液体通过开口流动。例如，在一个实施例中，开口的每一个相对于离心管的横截面积具有小于15%、小于10%、小于5%、在5%到1%之间或小于1%的面积。本领域的技术人员将容易能够确定第一和第二开口的尺寸以允许流体（例如DSM）由横越开口的表面张力保持在插入件之下。在一个实施例中，第一开口相对于第二开口较大。例如，在一个实施例中，第一开口具有从大约1mm到大约5mm的直径。在一个实施例中，第一开口具有大约2mm到大约4mm的直径。在一个实施例中，第二开口具有小于大约2mm的直径。
在一个实施例中，插入件具有从元件延伸或悬挂的支撑件以用于将元件定位在管内。在一个实施例中，支撑件接触离心管的底部并且限制插入件可以向下推动到管中多远。在一个实施例中，当向下朝着离心管的底端推动插入件时，例如当插入件向下插入管中时，或当包含插入件的管被离心时，支撑件抵抗压缩。在一个实施例中，支撑件是从元件的底表面延伸的圆柱形侧壁。在另一实施例中，支撑件可以包括从元件的底表面延伸的一个或多个腿以用于接触离心管的底端。在一个实施例中，离心管具有圆锥形底端并且支撑件接触离心管的圆锥形底部分的至少一部分。
在一个实施例中，当插入件定位在离心管中时，元件的顶表面的至少一部分与垂直于离心管的纵轴线的平面形成5度到75度之间的角。可选地，当插入件定位在离心管中时，元件的顶表面的至少一部分与垂直于离心管的纵轴线的平面形成15度到65度之间、大约15度、大约25度或大约50度的角。
在一个实施例中，当插入件定位在离心管中时，顶部元件的倾斜部分允许第一开口相对于第二开口更靠近离心管的底端。例如，当插入件定位在离心管中时，图1中所示的插入件的元件12与垂直于离心管的纵轴线的平面形成15度的倾斜。图4显示具有圆锥形元件的插入件，当插入件定位在离心管中时，圆锥形元件与垂直于离心管的纵轴线的平面形成15度的倾斜。图5显示具有圆锥形元件的插入件，当插入件定位在离心管中时，圆锥形元件与垂直于离心管的纵轴线的平面形成40度的倾斜。
在一个实施例中，当插入件定位在离心管中时，元件的顶表面的至少一部分具有凹特征。在一个实施例中，凹特征具有圆锥或抛物线或圆锥或抛物线的一部分的形式。可选地，凹特征从元件的周边上的点倾斜到第一开口。在一个实施例中，当插入件定位在离心管中时，第一开口在凹特征的底部处。例如，图2和3显示具有元件的插入件，所述元件具有凹特征，所述凹特征具有从第二开口218、318到与第二开口在直径上相对的第一开口216、316的倾角。图4和5显示具有元件的插入件，所述元件具有呈圆锥的形式的凹特征。当插入件定位在管内时允许第一开口相对于一个或多个第二开口定位在下方的附加元件也包括在本描述的范围内。
在一个实施例中，当插入件定位在管中时，元件尺寸确定成配合在离心管内并且与离心管的侧壁形成干涉配合。在一个实施例中，元件的周边径向延伸超出支撑件并且形成凸缘。在一个实施例中，元件和离心管之间的干涉配合防止液体通过元件和离心管之间。在一个实施例中，当插入件定位在管内时，支撑件尺寸确定成配合在离心管内并且与离心管的侧壁形成干涉配合。在一个实施例中，支撑件和离心管之间的干涉配合防止液体在离心管的顶部分和底部分之间通过支撑件和离心管之间。
在一个实施例中，通过注射模制以形成由单件材料制造的插入件来制造本文中所述的插入件。替代地，元件和支撑件可以单独地制造并且联结以形成插入件。在一个实施例中，插入件的全部或部分由硅树脂、塑料或橡胶或它们的组合制造。在一个实施例中，插入件的全部或部分由高密度聚丙烯、共聚多酯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯或它们的组合制造。可选地，元件的周边或凸缘由适合与离心管形成干涉配合的弹性材料制造。在一个实施例中，插入件优选地由具有比用于分离靶细胞群的DSM的密度大的密度的材料制造。具有不同密度的商用DSM包括FicollTM（GE Healthcare，密度=1.077g/mL）、RosetteSep DM-LTMStemcell Technologies，加拿大，密度=1.081g/mL）、RosetteSep DM-MTM（StemcellTechnologies，加拿大，密度=1.085g/mL）、LymphoprepTM（Axis-Shield，挪威，密度=1.077g/mL）、OptiprepTMAxis-Shield，挪威，密度=1.32g/mL）、HistopaqueTM（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，密度=1.077、1.019、1.083g/mL）。具有比用于分离靶细胞群的典型DSM大的密度的合适塑料包括但不限于Tritan（Eastman，金斯波特，田纳西州，密度=1.18g/cm3）、聚碳酸酯（Lexan，SABIC Innovative Plastics，沙特阿拉伯，密度=1.2g/cm3）、聚四氟乙烯（Teflon，DuPont，特拉华州，美国，密度=2.2g/cm3）和具有比大约1.08g/cm3大或更优选地比1.1g/cm3大的密度的其它合适的塑料。由具有比DSM大的密度的材料制造的插入件将不在DSM中漂浮。当具有插入件的离心管以高速在离心机中旋转时，插入件将受到浮力，所述浮力对抗管和插入件之间的干涉配合的力并且可能导致插入件漂浮。漂浮的插入件将不正确地定位在管中，使它对于密度梯度分离无效。在一个实施例中，插入件的密度大于1.08g/cm3。在一个实施例中，插入件的密度大于1.1g/cm3。在一个实施例中，插入件的全部或部分由聚碳酸酯、共聚多酯、聚四氟乙烯或高密度聚丙烯制造。
尽管具有圆锥形底端的离心管在本领域中通常是优选的，但是其它管（例如平底或圆底管）也可以用于本文中所述的插入件。在本领域中通常使用的离心管的例子包括15mL或50mL圆锥形FalconTM牌管（可从美国新泽西州富兰克林湖的Becton Dickson获得）、0.5mL圆底FalconTM牌管以及0.5、1.5和2.0mL微离心管（Eppendorf AG，汉堡，德国）。离心管和微离心管的其它厂商包括Corning Lifescience（洛威尔，马萨诸塞州）和Greiner Bio-one（弗里肯豪森，德国）。在一个实施例中，本文中所述的插入件尺寸确定成配合15mL或50mL圆锥形底部离心管。在另一实施例中，插入件尺寸确定成配合5mL管或0.5、1.5和2.0mL微离心管。
在本公开的另一方面中，提供一种包括如本文中所述的插入件的离心管。在一个实施例中，插入件与离心管成一体。在一个实施例中，插入件结合到离心管的侧壁。在一个实施例中，插入件由与离心管相同的材料制造。
图7显示在密度梯度分离方案的各阶段定位在离心管中的插入件的一个实施例。参考图7A，图1的插入件显示为定位在离心管50中，具有元件12、支撑件14、第一开口16和第二开口18。管50显示为用DSM60刚好填充到插入件的顶部之上。包含靶群的样本70层叠在DSM60的顶部上。在一个实施例中，样本70被加入管并且完全地或部分地与位于插入件之上的DSM的一部分混合。样本与插入件的顶表面之上的DSM的混合不会显著地影响离心期间靶群的分离或样本和剩余DSM之间的界面的形成。图7B显示密度梯度分离和在DSM60和样本72的剩余体积的界面处的在插入件之上包含靶群的体积74形成之后的管。在一个实施例中，本文中所述的插入件允许插入件之上的体积容易地从离心管去除以回收靶群。参考图7C，倒置管导致先前包含在插入件之上的任何体积倒出管，而DSM60和任何非靶细胞保持在离心管50中。尽管图7C显示管以180度倒置，但是也能够以更小的角、例如大于大约90度、大约90到135度或大约112到157度倒置管，以去除包含在插入件之上的流体的体积。
在另一方面中，提供一种用于从样本分离靶细胞群的方法。在一个实施例中，所述方法包括：
a)提供具有如本文中所述的插入件的离心管；
b)用密度分离介质（DSM）填充离心管的一部分，使得DSM覆盖插入件的顶部；
c)将包含靶细胞群的样本的体积加入离心管，以形成DSM和样本之间的界面；以及
d)旋转离心管以从样本分离靶细胞群。
在一个实施例中，靶群包括适合于使用密度梯度分离进行分离的细胞。例如，在一个实施例中，靶细胞群包括选自哺乳动物细胞、干细胞、ES细胞、肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、造血干细胞和外周血液单核细胞的至少一个细胞类型。在一个实施例中，靶细胞群是白细胞。在一个实施例中，靶细胞群具有小于DSM的密度的平均密度。本领域的技术人员将容易能够选择适合用于本文中所述的方法中的DSM以便分离特定靶细胞群。
在一个实施例中，通过将样本层叠到DSM上以形成DSM和样本之间的界面而将包含靶细胞群的样本的体积加入离心管。例如，可以使用移液管或类似的体积转移装置将样本层叠到离心管中的DSM上。在一个实施例中，将包含靶细胞群的样本的体积加入离心管，使得样本与离心管中插入件之上的DSM混合。例如，样本可以被倒入离心管中。在一个实施例中，样本沿离心管的侧壁向下倒入，以最小化样本和DSM的混合。技术人员将领会，尽管插入件有助于防止样本和插入件之下的的DSM之间的混合，但是样本和插入件之上的DSM的混合将不阻止界面的形成或靶细胞群从样本的分离。在一个实施例中，样本完全地或部分地与插入件之上的DSM混合并且界面形成于完全地或部分地与DSM混合的样本和离心管中的剩余DSM之间。
在一个实施例中，样本是包含一个或多个细胞类型的生物样本。在一个实施例中，样本是液体，例如外周全血、粘液或脑脊液。在一个实施例中，样本是包含一个或多个细胞类型的溶液。例如，在一个实施例中，样本是组织样本或骨髓，其中细胞已被离解并且存在于溶液中。
在一个实施例中，方法包括回收靶细胞群。例如在一个实施例中，在旋转离心管以从样本分离靶细胞群之后，从DSM和样本之间的界面之上的样本的体积回收靶细胞群。
在一个实施例中，通过倒置离心管以去除离心管中的插入件之上的样本的体积回收靶细胞群。在一个实施例中，当倒置管时，DSM和沉淀在插入件之下的任何材料保持在离心管中并且不通过元件中的开口流出。可选地，在一个实施例中，样本是血液样本，并且在去除靶细胞群之前，通过抽吸或倒置管以倒出DSM和血浆层之间的中间相层从界面层之上去除血浆的体积。
在一个方面中，本文中所述的方法可以与本领域中已知的方法结合使用，以增强通过密度梯度分离进行的靶群的分离。例如，在一个实施例中，方法包括在旋转离心管之前例如通过如美国专利No.6,750,326中所述的免疫花环将致密颗粒连接到样本中的第二细胞群。在一个实施例中，颗粒连接的第二细胞群分离到DSM和样本的剩余部分之间的界面之下，而靶细胞群分离到DSM和样本之间的界面。在一个实施例中，致密颗粒选自红血细胞、硅颗粒、金属颗粒、金属氧化物颗粒、聚合物颗粒和玻璃颗粒。在一个实施例中，第二细胞群由特定表面蛋白限定并且致密颗粒通过细胞表面蛋白特异的抗体连接到第二细胞群。
在另一方面中，本描述提供一种套件，所述套件包括如本文中所述的用于离心管的插入件。在一个实施例中，套件也包括离心管、密度分离介质的体积、将特定细胞连接到致密颗粒的抗体成本和/或用于执行如本文中所述的任何方法的印刷手册。
以下非限定性例子是本发明的举例说明：
例子
例子1：密度梯度分离
密度梯度分离是公知的程序，其中基于细胞的密度的差异，将细胞分成一个或多个部分。下面概述用于细胞的单间断密度梯度分离的示例性方案：
1.用密度梯度溶液（例如，Ficoll-Paque，Histopaque）填充离心管达到大约1/3满。
2.轻轻地将细胞悬液（例如，全血或细胞悬液）层叠在密度梯度溶液的顶部上。关键是最小化细胞悬液和密度梯度溶液之间的混合。对于全血，建议用相同体积的缓冲介质（例如磷酸盐缓冲盐水（PBS））稀释血液。
3.以400xg离心15分钟，制动器关闭以限制界面的破坏。
4.使用移液管从Ficoll-血浆界面小心地去除富集细胞。有时优选的是首先去除血浆以在冲洗步骤（5）之前最小化总样本体积。
5.使用离心机用5-10×体积的PBS+2%FBS冲洗富集细胞1-2次。
例子2：在标准管中使用Ficoll-Paque的免疫花环
下面概述使用Ficoll-Hypaque免疫花环来自外周全血的细胞的示例性阴性选择方案：
1.每mL外周全血加入50uL抗体成分。
2.在室温下培养20分钟。
3.用相同体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）+2%胎牛血清（FBS）稀释样本并且轻轻地混合。
4.将稀释样本层叠在Ficoll-Hypaque的顶部上或将Ficoll层叠在稀释样本之下。
5.室温下以1200xg离心20分钟，制动器关闭。
6.从Ficoll-血浆界面去除富集细胞。
7.用5-10×体积的PBS+2%FBS冲洗富集细胞。
可选地，对于单核细胞和其它粘附细胞的富集，1mM EDTA可以被加入全血的样本和所有冲洗/稀释溶液。
例子3：具有插入件的现有技术的密度梯度分离管的使用
（可从Sigma-Aldrich获得）、（可从德国的Greiner Bio-One GmbH获得）、UniSep（可从以色列耶路撒冷的Novamed获得）和ACT Dendreon（以前可从MICRA Scientific公司获得，并且在美国专利No.5,840,502中描述）密度离心管均包含插入件，所述插入件旨在便于样本的装载而不破坏分离介质和样本之间的层。
这些管必须首先基于管尺寸和插入件的位置装载适当体积的DSM。一般而言，管然后离心短时间以将DSM驱动到插入件之下。管然后准备好如例如在例子1中所述的标准密度梯度分离方案中那样使用。使用这些管，通过允许样本快速地加入DSM简化例子1的层叠步骤2，原因是它将仅仅与插入件之上的DSM的体积混合。另外，通过允许界面处的细胞通过倒出管而回收来简化层去除步骤（即，例子1的步骤4）。与标准方法一样，可能优选的是在回收细胞之前首先去除大量血浆。
例子4：使用具有插入件的现有技术的管的免疫花环
美国专利No.5,840,502号所述的ACT Dendreon离心管是标准50mL聚丙烯离心管，具有专门设计用于密度梯度分离的插入件，所述插入件允许用户通过从管倒出包含细胞的样本的一部分去除Ficoll-血浆界面处的细胞。使用Dendreon管进行免疫花环的示例性方案包括以下步骤：
必要时准备管进行密度梯度分离：
1.将DSM的推荐体积加入管。
2.以400g离心5分钟，Ficoll-Paque将填充插入件之下的体积。
3.通过如例子2中所述的免疫花环准备血细胞进行阴性选择。
4.每mL外周全血加入50uL抗体成分。
5.在室温下培养20分钟。
6.用相同体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）+2%胎牛血清（FBS）稀释样本并且轻轻地混合。
7.将稀释血液样本倒入或层叠到Ficoll-Paque的顶部上。
8.室温下以1200xg离心20分钟，制动器开启。
9.通过移除界面或倒出管插入件之上的体积从Ficoll-血浆界面去除富集细胞。
10.用5-10×体积的PBS+2%FBS冲洗富集细胞。
富集细胞现在准备好进一步使用。
CPTTM管（BD，新泽西州）具有在Ficoll状密度分离介质上的凝胶屏障。使用CPT管进行细胞分离遵循相同的一般程序，区别在于步骤1和2不是必需的，原因是密度分离介质已经在管中保持在凝胶塞之下。
例子5：使用Ficoll-Paque通过免疫花环富集CD8+T细胞
该例子揭示使用例子1和2中所述的方法使用标准50mL管、Dendreon管和CPT管从外周全血富集CD8+T细胞。RosetteSepTMCD8+T细胞富集混合物（可从STEMCELLTechnologies获得）用于比较不同管中的细胞富集。表1中所示的结果揭示对于在标准50mL管、CPT或Dendreon管中执行的分离在观察到的纯度和回收率上没有明显差异。CPT和Dendreon管初始设计成通过消除两个耗时的步骤（需要将血液层叠在Ficoll上和需要在离心之后移除界面细胞）提供更方便的密度梯度分离。RosetteSepTM免疫花环试剂有用于通过密度梯度分离选择特定细胞群。因此，由这些管提供的密度梯度分离的改进也应用于RosetteSepTM富集。
表1：在标准50mL管、Dendreon50mL管和CPT管（8mL）中的Ficoll-Paque分离之后获得的CD8+细胞纯度和回收率的比较。在具有和不具有添加或免疫花环试剂的两个样本上执行分离。样本A开始于6.8%CD8+细胞；样本B开始于3.0%CD8+细胞。
例子6：成角插入件对密度离心的影响
具有如图1中所示的倾斜顶部元件、不具有独立圆柱形支撑件的插入件由硅树脂塞子制造。当放置在竖直15mL圆锥形底部离心管中时，插入件具有大约5mm的厚度和与水平线成大约15°的角。插入件通过与离心管的侧壁的干涉配合保持就位。插入件在管中定位，使得当加入大约5mL的Ficoll-Paque时，液位覆盖插入件的最高点。在塞子上的最高和最低点切出开口。开口具有半圆的形状，具有大约2mm的直径，半圆的敞开端部背离元件。
使用标准15mL管或具有上述插入件的15mL管在标准密度梯度分离中测试插入件的有效性。在每种情况下，使用5mL的Ficoll和用PBS+2%FBS1:1稀释的3mL的血液。以400xg离心旋转20分钟，制动器关闭。
使用以下三种不同方法来准备样本进行密度分离：
1.将血液小心地层叠到Ficoll上，在离心机中旋转，使用移液管小心地去除含细胞的血沉棕黄层。
2.将血液小心地层叠到Ficoll上，在离心机中旋转，旋转管以混合含细胞的血沉棕黄层并且倒出。在标准管的情况下，不倒出团块。
3.将血液倒入管中，在离心机中旋转，旋转管以混合含细胞的血沉棕黄层并且倒出。
使用以上的方法3，几乎没有细胞在标准管中回收。这不令人惊奇，原因是在离心期间血液与Ficoll混合并且不形成用于细胞沉淀的不同密度的层。在所有其它情况下，有类似数量的细胞被回收，如表2中所示。
基于流式细胞仪中的光散射分析回收细胞的表型。使用细胞样本被倒在Ficoll上的方法2和3，与标准方法的1%相比回收细胞有大约10%的粒细胞污染。这与插入件的存在无关。因此，插入件允许密度梯度分离而不需要小心的样本层叠和血沉棕黄层去除。对于方法2和3观察到的回收样本的更高粒细胞含量可能是由于一些细胞粘着到插入件的表面或俘获在表面上的不平整部分中。表面上的不平整部分存在，原因是使用刀从硅树脂塞子手动地切割插入件。对于平滑插入件，这将未被预期。
表2：在密度梯度分离之后回收的细胞的数量和粒细胞的百分比。
例子7：使用不同插入件配置的密度分离
使用设计成快速原型制作的立体平版印刷方法由树脂制造如图1至4中所示的插入件。所有四个插入件设计成具有与注射模制相容的形状，以配合到标准50mL离心管（例如，Falcon牌管）中，使得插入件的底部将就座在管的圆锥形部段的顶部分上并且允许用密度梯度介质填充插入件之下的体积而不需要离心。插入件的每一个具有在插入件上的最高点处的小开口，使得当液体通过位于插入件下部的大开口流入时，空气可以逸出。每个插入件被设计，使得当管填充有大约20mL的Ficoll时，它将完全浸没。
插入件放置在管中并且填充有大约20mL的Ficoll。图4中所示的圆锥形插入件不容易填充有Ficoll。为了让Ficoll填充插入件之下的体积，必须例如通过保持管并且以圆形运动旋转摆动人的手臂施加一定的附加向下力。如图1中所示的倾斜插入件也需要一定的附加离心力进行填充。图2和3中所示的具有凹顶表面的勺状插入件容易在正常重力下装载Ficoll（即，不需要附加摇动）。所以勺状插入件最容易装载密度梯度材料。
当倒置管时，针对Ficoll的泄漏测试每种类型的插入件。首先简单地以300xg旋转具有插入件的管，使得从所有插入件去除所有气泡。然后每个管从竖直倒置到45°并且然后完全颠倒。在所有情况下，当从竖直倒置到45°时，插入件之上的所有Ficoll倒出，但是插入件之下的Ficoll保持在原位。当完全倒置管时，对于图1至3中所示的插入件，插入件之下的Ficoll缓慢地漏出。所以圆锥形插入件（如图4中）提供插入件之下的Ficoll的最稳定保持。
然后在密度梯度分离中测试每个插入件。将大约20mL的Ficoll加入每个管，使得Ficoll的水平在插入件的顶部之上大约2mm。然后将用PBS1:1稀释的30mL的外周全血加入每个管。快速地加入血液，不考虑轻轻地层叠到Ficoll上。遵循例子1中所述的方法并且使用层叠在20mL的Ficoll上的30mL的相同稀释血液也准备标准管。
然后以400xg使管离心20分钟，制动器关闭。在离心之后，从所有管去除血浆层并且具有插入件的管旋转，使得血沉棕黄层与插入件之上的所有液体混合并且通过将管从竖直倒置到45°倒出液体。通过移液管从标准管小心地去除血沉棕黄层。从每个管回收的细胞的数量在表3中被显示。使用血球计将粒细胞计数为总细胞的子集。结果显示标准管似乎提供比具有插入件的任何管更高的总细胞回收。然而，这可能是由于细胞粘着到插入件。红血细胞似乎粘着到插入件表面并且可能粘着到一些有核细胞。本例子的插入件由不生物相容的树脂制造，而由注射模制塑料制造的插入件很可能表现出较小的细胞粘附。
表3：在密度梯度分离之后回收的细胞的数量和粒细胞的百分比。
例子8：使用注射模制圆锥形插入件的密度分离和RosetteSepTM细胞富集
如图4中所示的插入件由聚丙烯注射模制并且然后插入50mL Falcon离心管中，使得插入件的底部靠置在管的底部处的圆锥形部分上。插入件的顶部处的凸缘用于将插入件保持就位并且提供一定的顺应性，以便在管直径不均匀的情况下进行配合。管中的插入件的高度使得17mL的DSM将管填充到刚刚在插入件的顶部之上的水平。插入件中的中心孔的底部之下的管体积至少为10mL，使得如果DSM之上的整个体积填充有血液（即，大约35mL），则血液可以具有25%的血细胞比容而不完全填充插入件之下的体积。由于在密度梯度分离之前血液典型地与稀释液、例如PSB1:1稀释，因此初始样本血细胞比容可以高达50%，这超过正常范围。
通过将血清移液管的尖端放置在圆锥形部段的底部处的开口上并且分配将DSM引入插入件之下。DSM通过孔并且在插入件之下流动，同时空气通过围绕插入件的上缘的孔排出。一旦所有空气被排出，超过插入件之下的体积的DSM的体积通过插入件的上缘上的孔排出。替代地，将DSM加入插入件之上，替换管帽并且以有力的向下运动摇动管以将DSM驱动到插入件中。
一旦装载DSM，管在加入或不加入RosetteSepTM的情况下准备用于密度梯度分离。当使用RosetteSepTM时，试剂与样本培养，如例子4中所述。密度分离然后如下进行：
1.将稀释血液样本倒入或层叠在Ficoll-Paque的顶部上。
2.在室温下以1200xg离心10或20分钟，制动器开启。
3.通过移除界面或倒出管插入件之上的体积，从Ficoll-血浆界面去除富集细胞。
4.用5-10×体积的PBS+2%FBS冲洗富集细胞。
离心速度的变化的影响在表4中被显示。10分钟的离心足以有效分离。
使离心机制动器开启的影响在表5中被显示。显著地，观察到当使用这些插入件时，制动器可以开启，原因是不同于标准密度分离，在离心步骤结束时是否扰动血浆-DSM界面并不重要。
在密度分离之后，观察到插入件的上表面的一些红色着色。该着色覆盖插入件的表面的0到80%，并且可以通过用一定体积的新鲜缓冲液冲洗插入件容易地去除该着色。通过首先在血球计中计数细胞并且然后在加入溶解细胞外膜、但不溶解核膜的1%乙酸之后计数细胞，由此产生的悬液显示几乎完全是红血细胞。在加入乙酸之后基本上没有细胞可见。因此，不预期保持在插入件上的细胞影响细胞富集。使用抵抗细胞粘附的生物相容材料将进一步改善插入件的性能。
表4：离心时间对使用具有如本文中所述的插入件的管进行RosetteSepTM密度梯度分离的影响。对于10和20分钟离心旋转时间每个样本的期望细胞的纯度和回收率是类似的。
表5：离心机制动器对使用具有如本文中所述的插入件的管进行RosetteSepTM密度梯度分离的影响。使制动器开启或关闭对纯度或回收率不具有明显影响。
例子9：插入件之下的气泡对细胞分离的影响
改变图4中所示的插入件之下的气泡的体积对细胞分离性能的影响在表6中被显示。在密度分离之前用RosetteSepTMCD3富集混合物（cocktail）培养血液样本。最小气泡（大约1mL体积）围绕插入件的圆周伸展但是不完全环绕管。3mL体积气泡一直环绕管。中等尺寸气泡是将预期在插入件之下看到的最大气泡，即使比较小心地加入DSM。数据显示插入件之下的空气体积可以相当大（高达大约8mL）而不影响细胞分离。这很可能是由于在离心开始之后空气较快地逸出并且插入件之下的DSM的密度仅仅微小地变化并且可能仅仅在DSM的上部分中，在分离期间当RBC沉淀时所述部分然后移位回到插入件之上。
表6：插入件之下的气泡对密度梯度分离的影响。初始样本中的CD3+细胞的纯度为16%。
例子10：与商业上可获得的管的比较
使用标准密度梯度分离（如例子3中所述）并且加入RosetteSepTM（如例子8中所述），商业上可获得的管（可从挪威的Axis-Shield获得）和管（可从北卡罗莱那州Monroe的Greiner Bio-One获得）与包含图4中所示的插入件的管比较。管之间的处理的唯一区别在于包含本文中所述的插入件的管仅仅离心10分钟而不是商业上可获得的管的标准20分钟。这样做是为了减小总分离时间。
使用Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）执行密度分离。确定每个管类型的有核细胞回收率并且然后归一化到在对照标准50mL管分离中获得的回收率。表8中的数据显示回收率在所有管中是类似的并且与标准密度分离没有不同。
具有插入件的管 Lymphoprep管 Leucosep管
有核细胞回收率 101±23% 116±48% 98±38%
表8.对于n=6样本的有核细胞回收率。通过将没有插入件的标准50mL管用于每个样本而使数据归一化以控制Ficoll-Paque分离，并且将数据表示为平均值±标准偏差。
对于RosetteSepTM分离，使用流式细胞计对于初始和富集样本确定期望细胞群的纯度，同时从测量的纯度和细胞计数确定对于初始和富集样本的期望细胞的回收率。RosetteSepTM混合物用于NK细胞、B细胞、单核细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD3+T细胞的富集。表9中的数据示出了所有管的纯度和回收率是类似的。包含如本文图4所示的插入件的管展示了与比较管相比相似的回收率和纯度，尽管离心分离时间较短。
纯度 当前管 Lymphoprep管 Leucosep管
NK细胞 73.6 76.5 71.3
B细胞 97.3 99.0 98.7
单核细胞 75.3 77.8 74.7
CD4+T 96.3 97.8 97.4
CD3+ 93.3 94.8 94.0
CD8+T 86.3 91.5 91.1
回收率 当前管 Lymphoprep管 Leucosep管
NK细胞 43 34 22
B细胞 67 54 47
单核细胞 60 56 53
CD4+T 48 53 47
CD3+ 53 57 48
CD8+T 36 21 30
表9：使用与不同离心管类型组合的RosetteSepTM试剂富集的期望细胞类型的纯度和回收率。对于每个细胞类型分离一个样本，每个管类型一式两份。
例子11：循环肿瘤细胞的富集
模型系统用于评估使用RosetteSepTM富集在血液中循环的肿瘤细胞的本发明的有效性。以大约1%或0.1%将乳腺癌细胞株CAMA接种到全血中。样本然后用RosetteSepTMCD45Depletion混合物培养10或20分钟并且然后1）在50mL离心管中小心地层叠在Ficoll-Paque Plus上，以1200xg离心20分钟，制动器关闭，并且小心地去除，或者2）快速地移入包含Ficoll-Paque Plus的具有如图4中所示的插入件的50mL离心管中，以1200xg离心10分钟，制动器开启，并且简单地倒出。通过有核细胞表达EpCAM的开始和富集分数的流式细胞仪分析评价CTC纯度，并且使用纯度和细胞计数确定回收率。表10中所示的结果揭示当比较相同的混合物培养时间时，使用具有本发明的插入件的离心管的CAMA细胞的富集是等效的或更好。使用相同的混合物培养时间，对于使用管+插入件的分离，与单独管相比纯度和回收率大体上更高。此外，与使用较多培养时间（20分钟）的单独管相比，使用较少混合物培养时间（10分钟）的管+插入件可以获得类似结果。
表10：以大约0.1或1%接种到全血中的CAMA细胞的纯度和回收率。所有测试一式两份并且两份的平均值显示在表中。
例子12：插入件密度的影响
由聚丙烯（密度=0.90g/cm3）、TritanTM（密度=1.18g/cm3）、LexanTM（密度=1.2g/cm3）和高密度聚丙烯（密度>1.1g/cm3）制造的如图4中所示的插入件插入50mL圆锥形离心管（Greiner Bio-one，德国）中。管填充有15mL的Ficoll-PaqueTM（GE Healthcare），如例子8中所述。Ficoll-PaqueTM具有1.077g/cm3的密度。然后通过使用血清移液管或通过倒入加入附加体积的大约35mL水完全填充管。为了测试插入件是否对离心管有任何影响和插入件是否在不同旋转速度下不同地工作，管在Beckman Coulter离心机中以在2300到3500rpm的范围内的速度离心（由此产生的角加速度是重力加速度的大约1200到2400倍）。在密度梯度分离的标准条件（即，2300rpm或更小）下，管没有不良事件。然而，当以更高的速度离心时，观察到聚丙烯插入件有时漂浮到离心管的顶部。
表11显示在不同离心机速度下针对聚丙烯插入件观察到的漂浮插入件的频率。如果具有插入件的离心管在离心之前被加热到50℃持续1-3天，则也观察到漂浮插入件。具有插入件的管在-20℃、4℃、RT和50℃下储存1-3天并且然后允许达到室温持续至少一天。表12显示在不同温度下储存之后针对聚丙烯观察到的漂浮插入件的频率。据认为在高速离心期间聚丙烯插入件漂浮，原因是在生成的高压力下，管膨胀并且插入件和管之间的干涉配合消失。在50℃下储存管可以加剧该影响，原因是塑料管稍微松弛，减小与插入件的干涉配合的程度。这可以潜在地通过膨胀围绕插入件的圆周的凸缘的直径进行补救，然而这也可能使插入件插入和/或放置到离心管中更困难。
由Tritan、Lexan和高密度聚丙烯（密度>1.1g/cm3）制造的插入件插入离心管中并且然后在50℃下储存1-3天。如表13中所示，在离心之后没有插入件漂浮，与离心速度无关。由具有比DSM大的密度的材料制造的插入件因此在分离条件的范围下更稳定。
2300rpm 2500rpm 2800rpm 3200rpm 3500rpm
漂浮插入件的频率 0/16 0/16 3/16 8/16 31/64
%漂浮插入件 0% 0% 19% 50% 48%
表11：在不同离心机转速（rpm）下具有聚丙烯插入件的离心管离心之后观察到的漂浮插入件的频率。
-20℃ 4℃ RT 50℃
漂浮插入件的频率 0/100 0/100 0/500 14/100
%漂浮插入件 0% 0% 0% 14%
表12：在不同温度下储存之后具有聚丙烯插入件的离心管的以2300rpm离心之后观察到的漂浮插入件的频率。
表13：在不同离心机转速（rpm）下具有不同高密度插入件的离心管离心之后观察到的漂浮插入件的频率。
尽管已参考当前被认为优选的例子描述了本公开，但是应当理解本公开不限于所公开的例子。相反地，本公开旨在涵盖包括在附带权利要求的精神和范围内的各种修改和等效布置。
所有出版物、专利和专利申请通过引用完整地被合并于本文中，如同特定地和单独地指示每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用完整地被合并。

Claims (43)

1.一种用于密度梯度分离的离心管的插入件，所述插入件包括：
元件，所述元件尺寸确定成配合在管内以用于将管分成顶部分和底部分，
支撑件，所述支撑件从所述元件延伸或悬挂以用于将所述元件定位在管内，其中当朝着所述离心管的底端推动所述支撑件时，所述支撑件限制所述元件和管的底部之间的距离，并且当朝着所述离心管的所述底端向下推动所述插入件时，所述支撑件抵抗压缩，以及
通过所述元件的至少两个开口，使得当所述插入件定位在所述离心管中时，第一开口相对于第二开口更靠近管的所述底端，
其中当所述插入件定位在所述离心管中时，所述第一开口允许所述元件之上的管的顶部分中的空间与所述元件之下的管的底部分中的空间之间的流体连通，以及当管的底部分通过所述第一开口填充有密度分离介质时，所述第二开口允许空气从所述元件之下的空间逸出，以及
其中所述至少两个开口尺寸确定成提供横越开口的表面张力，从而当倒置管时，防止包含在所述元件之下的密度分离介质流动通过开口。
2.根据权利要求1所述的插入件，其中当所述插入件定位在所述离心管中时，所述第一开口位于所述元件的顶表面的最下部分处。
3.根据权利要求1或2所述的插入件，其中当所述插入件定位在所述离心管中时，所述第二开口位于所述元件的顶表面的最高部分处。
4.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述至少两个开口位于所述元件的周边上。
5.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述至少两个开口中的每一个的面积小于所述离心管的横截面积的15％。
6.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述至少两个开口中的每一个的面积小于所述离心管的横截面积的10％。
7.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述至少两个开口中的每一个的面积小于所述离心管的横截面积的5％。
8.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述第一开口比所述第二开口大。
9.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述第一开口具有1mm到5mm的直径，并且所述第二开口具有小于2mm的直径。
10.根据权利要求1或2所述的插入件，其中当所述插入件定位在所述离心管中时，所述支撑件接触管的底端。
11.根据权利要求10所述的插入件，其中所述离心管具有圆锥形底端，并且当所述插入件定位在所述离心管中时，所述支撑件接触所述圆锥形底端。
12.根据权利要求10所述的插入件，其中所述支撑件包括从所述元件的底表面延伸的圆柱形侧壁。
13.根据权利要求10所述的插入件，其中所述支撑件包括从所述元件的底表面延伸的一个或多个腿。
14.根据权利要求1或2所述的插入件，其中当所述插入件定位在所述离心管中时，所述元件的顶表面的至少一部分与垂直于所述离心管的纵轴线的平面形成在5度和75度之间的角。
15.根据权利要求14所述的插入件，其中当所述插入件定位在所述离心管中时，从所述第一开口到所述第二开口的所述元件的顶表面与垂直于所述离心管的纵轴线的平面形成在5度和75度之间的角。
16.根据权利要求14所述的插入件，其中所述角在15度和65度之间。
17.根据权利要求1或2所述的插入件，其中当所述插入件定位在所述离心管中时，所述元件的顶表面的至少一部分具有凹特征。
18.根据权利要求17所述的插入件，其中所述凹特征具有圆锥或抛物线或圆锥或抛物线的一部分的形式。
19.根据权利要求17所述的插入件，其中所述凹特征从所述元件的周边上的点倾斜到第一开口。
20.根据权利要求1或2所述的插入件，其中当所述插入件定位在所述离心管中时，所述元件与所述离心管的侧壁形成干涉配合。
21.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述元件从所述支撑件径向向外延伸以形成凸缘。
22.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述插入件的部分全部由硅树脂、塑料或橡胶或它们的组合制造。
23.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述插入件的密度大于1.08g/cm3。
24.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述插入件的密度大于1.1g/cm3。
25.根据权利要求23所述的插入件，其中所述插入件的部分或者所述插入件的全部由聚碳酸酯、共聚多酯、聚四氟乙烯或高密度聚丙烯制造。
26.根据权利要求1或2所述的插入件，其中所述离心管是50mL离心管或15mL离心管。
27.一种离心管，其包括根据权利要求1至26中任一项所述的插入件。
28.根据权利要求27所述的离心管，其中所述插入件与所述离心管成一体。
29.一种用于从样本分离靶细胞群的方法，其包括：
a)提供具有根据权利要求1至26中任一项所述的插入件的离心管；
b)用密度分离介质(DSM)填充所述离心管的一部分，使得DSM覆盖所述插入件的顶部；
c)将包含所述靶细胞群的样本的体积加入所述离心管，以形成DSM和所述样本之间的界面；
d)旋转所述离心管以从所述样本分离所述靶细胞群；
e)倒置所述离心管以从所述离心管去除包括所述靶细胞群的样本的体积。
30.根据权利要求29所述的方法，其中靶群包括选自哺乳动物细胞、干细胞、ES细胞、肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、造血干细胞和外周血液单核细胞的至少一个细胞类型。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述样本包括外周全血。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述靶细胞群是白细胞。
33.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述靶细胞群具有的平均密度小于所述DSM的密度。
34.根据权利要求33所述的方法，还包括从DSM和所述样本之间的界面之上的样本的体积回收所述靶细胞群。
35.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述插入件之下的DSM保持在所述离心管中。
36.根据权利要求29或30所述的方法，还包括在旋转所述离心管之前，将致密颗粒连接到所述样本中的第二细胞群。
37.根据权利要求36所述的方法，其中颗粒连接的第二细胞群分离到DSM和所述样本之间的界面之下，并且所述靶细胞群分离到DSM和所述样本之间的界面。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述致密颗粒选自红血细胞、硅颗粒、金属颗粒、金属氧化物颗粒、聚合物颗粒和玻璃颗粒。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二细胞群由特定表面蛋白限定，并且所述致密颗粒通过细胞表面蛋白特异的抗体连接到所述第二细胞群。
40.根据权利要求36所述的方法，其中步骤d)包括在离心机中在离心机制动器开启的情况下在减速期间旋转所述离心管。
41.一种套件，其包括根据权利要求1至26中任一项所述的插入件和离心管。
42.根据权利要求41所述的套件，还包括密度分离介质的体积。
43.根据权利要求41或42所述的套件，还包括用于执行根据权利要求29至40中任一项所述的方法的印刷手册。
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