JP4284375B2 - 幹細胞増殖因子様ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する方法および材料 - Google Patents
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Description
(1.1 技術分野)
本発明は、新規ポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコードされる新規タンパク質を、例えば治療方法、診断方法および研究方法におけるこれらポリヌクレオチドおよびタンパク質に関する使用とともに、提供する。
同定されたポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、例えば診断、法医学、遺伝子マッピング、遺伝性障害またはその他の形質の原因である変異の同定における、生物多様性を評価するための多数の用途、ならびにDNA配列およびアミノ酸配列に依存する多くの他の種類のデータおよび生成物を生じるための多数の用途を有する。タンパク質は、例えばリーダー配列クローニングの場合におけるそれらの分泌性質によって、PCRベースの技術の場合におけるそれらの細胞供給源または組織供給源によって、あるいは既知の生物学的活性の他の遺伝子との構造的類似性によって、生物学的活性を有することが知られている。本発明は、これらポリペプチドおよびこれらをコードするポリヌクレオチドに向けられる。特に本発明は、新規の幹細胞増殖因子様ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに向けられる。
著者等は示した。(Thomson et al,(1998)Science,282,1145−1147(参考として本明細書中に援用される))。このことは、臓器不全および変性疾患の処置のために自家移植および器官再生を用いるための門戸を開いた。幹細胞における、多くの受容体と可溶性かつ間質性細胞発現性の因子との正確な相互作用は、幹細胞が分裂し、分化に関係するために必要とされる。因子を提供する組織ニッチおよび微小環境は、非常に大きな重要性を有することが明らかになった。サイトカイン(例えば、IL−3、IL−6、IL−7)および可溶性タンパク質(例えば、flt−3、エリスロポエチンおよび幹細胞因子)はすべて、特定経路を下って分化を達成するために協調して作用することが示された。増殖因子、サイトカインおよび組織局在化の正確な組合せが、異なる分化幹細胞集団を生じ得ると考えられる。
本発明は、新規の幹細胞増殖因子様ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする新規の単離ポリヌクレオチド(組換えDNA分子、クローン化遺伝子またはその縮重変異体(特に、対立遺伝子改変体のような天然に存在する改変体)、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド分子)およびこのようなポリペプチド上に存在する1つまたは複数のエピトープを特異的に認識する抗体、ならびにこのような抗体を産生するハイブリドーマの発見に基づいている。
ベクターおよび配列決定ベクターが挙げられる。本発明に従う宿主細胞は、原核生物でも真核生物細胞でもよく、単細胞生物でも多細胞生物の一部であってもよい。
性を調節する(すなわち増減させる)化合物を同定するための方法も提供する。このような方法は、例えば本明細書中に列挙された障害の症状を改善し得る化合物の同定のために利用され得る。このような方法としては、本発明のポリペプチドと相互作用する(例えば結合する)化合物およびその他の物質を同定するためのアッセイが挙げられ得るが、これらに限定されない。
・本発明はさらに、以下も提供し得る:
・(項目1) 配列番号2、配列番号12、配列番号17または配列番号26あるいはそれらの成熟タンパク質コード部分からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
・(項目2) 生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、項目1に記載のポリヌクレオチドと約99%を超える配列同一性を有する、ポリヌクレオチド。
・(項目3) DNA配列である、項目1に記載のポリヌクレオチド。
・(項目4) 項目1に記載のポリヌクレオチドの相補体を含む、単離されたポリヌクレオチド。
・(項目5) 配列番号3、配列番号13、配列番号18または配列番号27からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
・(項目6) 項目5に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
・(項目7) 表面に付着された項目1に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸アレイ。
図1は、幹細胞増殖因子様ポリペプチド(配列番号3)と、ヒトクローン1トロンボスポンジンmRNA(配列番号23)との間のBLASTPアミノ酸配列アライメントを示す。これは、2つの配列が232アミノ酸残基に亘って60%の類似性、および同じ232アミノ酸残基に亘って46%の同一性を共有することを示す。ここで、A=アラニン、C=システイン、D=アスパラギン酸、E=グルタミン酸、F=フェニルアラニン、G=グリシン、H=ヒスチジン、I=イソロイシン、K=リジン、L=ロイシン、M=メチオニン、N=アスパラギン、P=プロリン、Q=グルタミン、R=アルギニン、S=セリン、T=トレオニン、V=バリン、W=トリプトファン、Y=チロシンである。ギャップはダッシュとして示される。
V1.1プログラム(Nielsen et al,(1997)Int.J.Neur.Syst.8,581)(Center for Biological Sequ
ence Analysis,The Technical University of Denmarkから)を用いて予測された。切断部位は、コンピュータープログラムにより予測されるものとは異なり得ることを当業者は認識する。配列番号6は、このシグナルが配列番号3から除去された場合に生じるペプチドである。配列番号11は、このシグナルが配列番号9から除去された場合に生じるペプチドである。配列番号15は、このシグナルが配列番号13から除去された場合に生じるペプチドである。配列番号21は、このシグナルが配列番号18から除去された場合に生じるペプチドである。
4.1 定義
本明細書中および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、本文中でそれ以外に明記しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
は別のEMFの発現を調整する一連のヌクレオチドを意味する。
w York NY(これらの両方は、その全体が参考として本明細書中に援用される)に詳述されている。
ル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化(これらに限定されない))から生じる種々のポリペプチドを意図する。
に連結された調節エレメントの誘導時に、異種性のポリペプチドまたはタンパク質を発現する。この用語は、遺伝子発現において調節的役割を有する単数または複数の組換え遺伝子エレメント(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)を安定的に組み込んだ宿主細胞も意味する。本明細書中で定義されたような組換え発現系は、発現される内因性DNAセグメントまたは遺伝子に連結された調節エレメントの誘導時に細胞に対して内因性のポリペプチドまたはタンパク質を発現する。細胞は、原核生物または真核生物性であり得る。
);この実施形態の変形では、多くとも25%(75%の配列同一性);そして、この実施形態のさらなる変形では、多くとも20%(80%の配列同一性);そして、この実施形態のさらなる変形では、多くとも10%(90%の配列同一性)、そしてこの実施形態のさらなる縮退では、多くとも5%(95%の配列同一性)だけ、列挙された配列から変化する。本発明の実質的に等価の、例えば変異体のアミノ酸配列は、好ましくは列挙されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する。本発明の実質的に等価のヌクレオチド配列は、より低いパーセントの配列同一性を有し、例えば遺伝暗号の冗長性または変性を考慮する。好ましくはヌクレオチド配列は、少なくとも約65%の同一性、さらに好ましくは少なくとも約75%の同一性、もっとも好ましくは少なくとも約95%の同一性を有する。本発明の目的のために、実質的に等価の生物学的活性および実質的に等価の発現特徴を有する配列は、実質的に等価であると考えられる。等価性を決定するために、成熟配列の短縮(例えば偽停止コドンを作製する変異による)は、無視されるべきである。配列同一性は、例えばJotun Hein法(Hein,J.(1990)Methods Enzymol.183:626−645)を用いて確定され得る。配列間の同一性は、当該技術分野で既知のその他の方法により(例えば、ハイブリダイゼーション条件を変えることによって)決定され得る。
本発明は、新規の幹細胞増殖因子様ポリペプチド、幹細胞増殖因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに癌およびその他の免疫学的障害の診断、処置または予防のためのこれらの組成物の使用の開発に基づいている。
質コード配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、(a)配列番号1〜2、4、8、10、12、14、16〜17、19または26のヌクレオチド配列のいずれかの相補体;(b)配列番号3、5〜7、9、11、13、15、18、20〜21または27のポリペプチドのいずれか1つをコードするポリヌクレオチド;(c)上記の任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド;(d)上記のタンパク質のいずれかの種ホモログをコードするポリヌクレオチド;あるいは(e)配列番号3、5〜7、9、11、13、15、18、20〜21または27のポリペプチドの特異的ドメインまたは短縮を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。目的のドメインは、コードされるポリペプチドの性質に依存し得る;例えば受容体様ポリペプチド中のドメインとしては、リガンド結合、細胞外、膜貫通または細胞質ドメインまたはそれらの組合せが挙げられ;免疫グロブリン様タンパク質中のドメインとしては、可変性免疫グロブリン様ドメインが挙げられ;酵素様ポリペプチド中のドメインとしては、触媒性ドメインおよび基質結合ドメインが挙げられ;そしてリガンドポリペプチド中のドメインとしては、受容体結合ドメインが挙げられる。
Alignment Search Toolを意味するBLASTは、局所配列アライメントに関して検索するために用いられる(Altshul,S.F.J Mol.Evol.36:290−300(1993)およびAltshul,S.F.らJ.Mol.Biol.21:403−410(1990))。
ことにより連続的に改変され、次に欠失または挿入が標的部位に作製され得る。アミノ酸配列欠失は一般に、約1〜30残基、好ましくは約1〜10残基の範囲であり、典型的には連続している。アミノ酸挿入は、1〜100以上の残基の長さの範囲のアミノ末端および/またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一アミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入は、一般に約1〜10アミノ残基、好ましくは1〜5残基の範囲であり得る。末端挿入の例としては、分泌または異なる宿主細胞中での細胞内標的化に必要な異種シグナル配列、ならびに発現タンパク質を精製するために有用なFLAG配列またはポリ−ヒスチジン配列のような配列が挙げられる。
分に当業者のレベル内である。一般に組換え発現ベクターとしては、複製の起点、ならびに宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能マーカー、例えばE.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisiae TRP1遺伝子、ならびに下流構造配列の転写を指向する高発現遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、特に、解糖酵素、例えば3−ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)、a−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、好ましくは細胞周辺腔または細胞外媒質中への翻訳タンパク質の分泌を指向し得るリーダー配列を用いて、適切な段階でアッセンブルされる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴、例えば安定化または発現組換え産物の簡易精製を付与するアミノ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌使用のための有用な発現ベクターは、機能性プロモーターを用いて操作可能読取り段階に、適切な翻訳開始および終結シグナルと一緒に所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより、構築される。ベクターは、ベクターの保持を保証し、望ましい場合には、宿主内での増幅を提供するために、1つまたは複数の表現型選択可能マーカーおよび複製の起点を含む。形質転換のための適切な原核生物宿主としては、E.coli、Bacillus subtilus、Salmonella typhimurium、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属およびStaphylococus属内の種々の種が挙げられるが、その他も選択物として用いられ得る。
本発明の別の局面は、幹細胞増殖因子様ヌクレオチド配列またはそのフラグメント、類似体または誘導体を含む核酸分子とハイブリダイズし得るかまたは相補的である単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸と相補的である(例えば二本鎖cDNA分子のコード鎖と相補的またはmRNA配列と相補的)ヌクレオチド配列を含む。特定の局面において、少なくとも約10、25、50、100、250または500ヌクレオチドとの、または幹細胞増殖因子様コード鎖全体との、あるいはその一部分のみとの配列相補性を含むアンチセンス核酸分子が提供される。幹細胞増殖因子様のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、あるいは幹細胞増殖因子様核酸配列と相補的なアンチセンス核酸が、さらに提供さ
れる。
阻害することにより)ように、被験体に投与されるか、あるいはインサイチュで生成される。ハイブリダイゼーションは、安定二重鎖を形成するために慣用的ヌクレオチド相補性によってか、あるいは例えばDNA二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重螺旋の大きい溝における特異的相互作用によってなされる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例としては、組織部位での直接注射が挙げられる。あるいはアンチセンス核酸分子は、選択細胞を標的化するよう改変され、次に全身投与され得る。例えば全身投与のためには、アンチセンス分子は、それらが、選択細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するよう(例えばアンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することにより)、改変され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されたベクターを用いて、細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なpolIIまたはpolIIIプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が好ましい。
核酸修飾としては、その糖ホスフェート骨格が改変されるかまたは誘導される改変塩基および核酸が挙げられるが、これらに限定されない。これらの改変は、少なくとも一部は、それらが、例えば被験体における治療的用途においてアンチセンス結合核酸として用いられ得るよう、改変核酸の化学的安定性を強化するために実行される。
c.Natl.Acad.Sci.84:648−652;PCT公開番号WO88/09810参照)あるいは血液脳関門(例えばPCT公開番号WO89/10134参照)が挙げられ得る。さらにオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断作用物質(例えばKrol,ら,1988.BioTechniques 6:958−976参照)または挿入剤(例えばZon,1988.Pharm.Res.5:539−549参照)を用いて改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等と結合され得る。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含有するよう遺伝子操作された宿主細胞を提供する。例えばこのような宿主細胞は、公知の形質転換、トランスフェクションまたは感染方法を用いて宿主細胞中に導入される本発明の核酸を含有し得る。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するよう遺伝子操作された宿主細胞を提供する。この場合、このようなポリヌクレオチドは、細胞中でのポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞と異種の調節配列と作動可能に会合する。
細菌培養中で産生される組換えポリペプチドおよびタンパク質は通常は、細胞ペレットから最初に抽出され、その後の1つまたは複数の塩析水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。タンパク質再フォールディング工程は、必要な場合には、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに用いられ得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終精製工程のために用いられ得る。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、任意の便利な方法(凍結解凍循環、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む)により、破壊され得る。
pombe、Kluyveromyces株、Candidaまたは異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株が挙げられる。潜在的に適切な細菌株としては、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimuriumまたは異種タンパク質を発現し得る任意の細菌株が挙げられる。タンパク質が酵母または細菌内で作られる場合、機能的タンパク質を得るために、例えば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により、そこで産生されるタンパク質を改変する必要があり得る。このような共有結合は、公知の化学的方法または酵素的方法を用いて成し遂げられ得る。
使用により促され得、外因性DNAが宿主細胞ゲノム中に組み込まれた細胞の選択を可能にする。ターゲッティング事象の同定はまた、負の選択可能マーカーが外因性DNAに連結されるが、負の選択可能マーカーがターゲッティング配列と隣接するよう、そして宿主細胞ゲノムの配列による正しい相同的組換え事象が負の選択可能マーカーの安定組込みを生じないよう配置されるように、負の選択の特性を示す1つまたは複数のマーカー遺伝子の使用によっても促され得る。この目的のために有用なマーカーとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子または細菌キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ(gpt)遺伝子が挙げられる。
本発明はまた、幹細胞増殖因子様キメラタンパク質または融合タンパク質も提供する。本明細書中で用いる場合、幹細胞増殖因子様「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非幹細胞増殖因子様ポリペプチドに作動可能に連結された幹細胞増殖因子様ポリペプチドを含む。「幹細胞増殖因子様ポリペプチド」とは、幹細胞増殖因子様タンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、一方、「非幹細胞増殖因子様ポリペプチド」とは、幹細胞増殖因子様タンパク質と実質的に相同でないタンパク質(例えば幹細胞増殖因子様タンパク質と異なるタンパク質、および同一または異なる生物体に由来するタンパク質)に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。幹細胞増殖因子様融合タンパク質内では、幹細胞増殖因子様ポリペプチドは幹細胞増殖因子様タンパク質の全部または一部に対応し得る。一実施形態では、幹細胞増殖因子様融合タンパク質は、幹細胞増殖因子様タンパク質の少なくとも1つの生物学的活性部分を含む。別の実施形態では、幹細胞増殖因子様融合タンパク質は、幹細胞増殖因子様タンパク質の少なくとも2つの生物学的活性部分を含む。さらに別の実施形態では、幹細胞増殖因子様融合タンパク質は、幹細胞増殖因子様タンパク質の少なくとも3つの生物学的活性部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動可能に連結される」用語は、幹細胞増殖因子様ポリペプチドおよび非幹細胞増殖因子様ポリペプチドが互いにインフレームで融合されることを示すことが意図される。非幹細胞増殖因子様ポリペプチドは、幹細胞増殖因子様ポリペプチドのN末端またはC末端に融合され得る。
ロブリン融合タンパク質を用いて、幹細胞増殖因子様コグネイトリガンドの生物学的利用能に影響を及ぼし得る。幹細胞増殖因子様リガンド/幹細胞増殖因子様相互作用の抑制は、増殖性および分化性障害の両方の治療に、ならびに細胞生存を調整する(例えば促進するかまたは阻害する)のに、療法的に有用であり得る。さらに、本発明の幹細胞増殖因子様−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体における抗幹細胞増殖因子様抗体を産生するための免疫原として、幹細胞増殖因子様リガンドを精製するための免疫原として、そしてスクリーニングアッセイにおいて幹細胞増殖因子様と幹細胞増殖因子様リガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するための免疫原として用いられ得る。
本発明の単離されたポリペプチドとしては、配列番号3、5〜7、9、11、13、15、18、20〜21または27のいずれか1つとして記述されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号1〜2、4、8、10、12、14、16〜17、19または26のヌクレオチド配列のうちのいずれか1つによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは対応する全長タンパク質または成熟タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドはまた、(a)配列番号1〜2、4、8、10、12、14、16〜17、19または26で記述されるヌクレオチド配列のいずれか1つを有するポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは(b)配列番号3、5〜7、9、11、13、15、18、20〜21または27として記述されるアミノ酸配列のいずれか1つをコードするポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは(c)ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、(a)または(b)のいずれかのポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、好ましくは生物学的または免疫学的活性を有するポリペプチドも包含する。本発明はまた、配列番号3、5〜7、9、11、13、15、18、20〜21または27として記述されるアミノ酸配列のいずれかの生物学的活性改変体または免疫学的活性改変体、あるいは対応する全長タンパク質または成熟タンパク質;ならびに生物学的活性を保有するその「実質的等価物」(例えば、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%または89%、さらに典型的には少なくとも約90%、91%、92%、93%または94%、よりさらに典型的には少なくとも約95%、96%、97%、98%または99%、最も典型的には少なくとも約99%のアミノ酸同一性を有する)も提供する。対立遺伝子改変体によりコードされるポリペプチドは、配列番号3、5〜7、9、11、13、15、18、20〜21または27を含むポリペプチドと比較して、同様の活性、増大した活性または低下した活性を有し得る。
本発明の宿主細胞の培養を増殖させる工程、およびその細胞またはその細胞が増殖された培地からタンパク質を精製する工程を含む。例えば、本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドを含む適切な発現ベクターを含有する宿主細胞が、コードされたポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養される、ポリペプチドを生成する方法を包含する。本ポリペプチドは、培養物から、便宜的には培養培地から、または宿主細胞から調製された溶解物から回収され得、そしてさらに精製され得る。好ましい実施形態は、このような方法により産生されたタンパク質が全長形態または成熟形態のタンパク質であるものを包含する。
ような変更、置換、交換、挿入または欠失のための技術は、当業者に周知である(例えば米国特許第4,518,584号参照)。好ましくは、このような変更、置換、交換、挿入または欠失は、そのタンパク質の所望の活性を保有する。そのタンパク質機能のために重要であるタンパク質領域は、当該分野で公知の種々の方法により決定され得る。その例としては、単一アミノ酸またはアミノ酸列をアラニンで系統的に置換し、その後、その結果生じたアラニン含有改変体を生物学的活性に関して試験することを含む、アラニン走査法が挙げられる。この種の分析は、生物学的活性における置換アミノ酸(単数または複数)の重要性を決定する。タンパク質機能に重要であるタンパク質領域は、eMATRIXプログラムにより決定され得る。
好ましい同一性および/または類似性は、試験される配列間に最大一致を生じるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、コンピュータープログラムで体系化されており、その例としては、GCGプログラムパッケージ(GAP(Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984);Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX、FASTA(Altschul,S.F.ら,J.Molec.Biol.215:403−410(1990))、PSI−BLAST(Altschul,S.F.ら,Nucleic Acids Res.vol.25,pp.3389−3402、この記載内容は、参考として本明細書中に援用される)、eMatrixソフトウエア(Wuら、J.Comp.Biol.,vol.6,pp.219−235(1999)、この記載内容は、参考として本明細書中に援用される)、eMotifソフトウェア(Nevill−Manningら、ISMB−97,vol 4,pp.202−209、この記載内容は、参考として本明細書中に援用される)、GeneAtlasソフトウエア(Molecular Simulations Inc.(MSI),San Diego,CA)(SanchezおよびSali(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.,95,13597−13602;Kitson DHら(2000)「Remote homology detection using structural modeling−an evaluation」Submitted;Fischer and Eisenberg(1996)Protein Sci.5,947−955)およびKyte−Doolittle疎水性予測アルゴリズム(J.Mol Biol,157,pp.105−31(1982)、この記載内容は、参考として本明細書中に援用される))が挙げられるが、これらに限定されない。BLASTプログラムは、National Center for Biotechnology Information(NCBI)およびその他の供給元(BLAST Manual
,Altschul,S.ら、NCB NLM NIH Bethesda,MD 20894;Altschul,S.ら、J.Mol.Biol.215:403−410(1990))から公的に利用可能である。
本発明の遺伝子のポリヌクレオチドにおける変異は、コードされたタンパク質の正常機能の損失を生じ得る。従って本発明は、本発明のポリペプチドの正常活性を回復するための、あるいは本発明のポリペプチドに関与した疾患状態を処置するための、遺伝子療法を提供する。本発明のポリペプチドをコードする機能性遺伝子を適切な細胞へと送達すると、ベクター(特にウイルスベクター(例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター))の使用により、エキソビボ、インサイチュまたはインビボで実行されるか、あるいは物理的DNA移入法(例えばリポソームまたは化学的処理)の使用によりエキソビボで実行される(例えばAnderson,Nature,vol.392に対する補遺,no.6679,pp.25−20(1998)参照)。遺伝子療法技術のさらなる検討のためには、Friedmann,Science,244:1275−1281(1989);Verma,Scientific American:68−84(1990);およびMiller,Nature,357:455−460(1992)を参照されたい。本発明のヌクレオチドのいずれか1つまたは本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の導入はまた、染色体外基質を用いて(一過性発現)かまたは人工染色体を用いて(安定発現)も、成し遂げられ得る。このような細胞に及ぼす所望の作用または細胞中での所望の活性を増殖するかまたは生成するために、細胞はまた、本発明のタンパク質の存在下でエキソビボでも培養され得る。処理された細胞は次に、治療的目的のためにインビボで導入され得る。あるいは、他のヒト疾患状態では、本発明のポリペプチドの発現の防止またはその活性の阻害が、疾患状態を処置するに際して有用であることが、企図される。アンチセンス療法または遺伝子療法は、本発明のポリペプチドの発現を負に調節するために適用され得ることが、企図される。
に挿入され得ることもまた、企図される。所望のタンパク質コード配列に連結された場合、標準的選択法によるマーカーDNAの増幅は、細胞中での所望のタンパク質コード配列の同時増幅を引き起こす。
本発明のポリペプチドの生物学的機能をインビボで決定するための好ましい方法では、本発明により提供される1つ以上の遺伝子が、相同組換えを用いて、動物の生殖系列中で過剰発現されるかまたは不活化される(Capecchi,Science 244:1288−1292(1989))。外因性プロモーターエレメントまたは内因性プロモーターエレメントの調節制御下で遺伝子が過剰発現される動物は、トランスジェニック動物として公知である。内因性遺伝子が相同組換えにより不活化された動物は、「ノックアウ
ト」動物と呼ばれる。ノックアウト動物(好ましくは、ノックアウト非ヒト哺乳動物)は、米国特許第5,557,032号(この記載内容は、参考として本明細書中に援用される)に記載されているように調製され得る。トランスジェニック動物は、生物学的プロセスにおいて(好ましくは疾患状態において)本発明のポリペプチドが果す役割を決定するために、有用である。トランスジェニック動物は、脂質代謝を調整する化合物を同定するためのモデル系として有用である。トランスジェニック動物(好ましくは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物)は、米国特許第5,489,743号およびPCT公開番号WO94/28122(これらの記載内容は、参考として本明細書中に援用される)に記載されたような方法を用いて作製される。
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、本明細書中で同定された1つ以上の用途または生物学的活性(本明細書中に引用されたアッセイに関連したものを包含する)を示すと予測される。本発明のタンパク質に関して記載された用途または活性は、(例えば、遺伝子療法またはDNAの導入に適したベクターにおける)このようなタンパク質またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与もしくは使用によって、提供され得る。特定の状態または病態の基礎を成す機構は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドまたはその調節因子(アクチベーターまたはインヒビター)が、処置を必要とする被験体にとって有益であるか否かを指示する。従って「本発明の治療用組成物」としては、本発明の単離されたポリヌクレオチド(組換えDNA分子、クローン化遺伝子およびその縮重改変体を包含する)または本発明のポリペプチド(全長タンパク質、成熟タンパク質およびその短縮形態またはドメインを包含する)、あるいは標的遺伝子発現/標的タンパク質発現のレベルまたは標的タンパク質活性のレベルのいずれかで、標的遺伝子産物の全体的活性を調整する化合物およびその他の物質が挙げられる。このような調節因子としては、ポリペプチド、アナログ(改変体)(フラグメントおよび融合タンパク質を包含する)、抗体ならびにその他の結合タンパク質;本発明のポリペプチドを直接または間接的に活性化するかもしくは阻害する化合物(例えば、本明細書中に記載されたような薬剤スクリーニングアッセイにより同定される);アンチセンスポリヌクレオチド、および三重螺旋形成に適したポリヌクレオチド;ならびに特に、本発明のポリペプチドの1つ以上のエピトープを特異的に認識する、抗体またはその他の結合パートナーが挙げられる。
本発明により提供されるポリヌクレオチドは、種々の目的のために研究共同体により用いられ得る。本ポリヌクレオチドは、分析用途、特徴付け用途または治療的使用のための組換えタンパク質を発現するため;対応するタンパク質が優先的に(構成的に、あるいは組織分化または発生の特定段階で、または疾患状態においてのいずれかで)発現される組織に関するマーカーとして;ゲル上での分子量マーカーとして;染色体を同定するため、または関連遺伝子位置をマッピングするための、染色体マーカーまたはタグ(標識された場合)として;潜在的遺伝性障害を同定するために患者における内因性DNA配列と比較するために;ハイブリダイズし、それにより新規な関連DNA配列を発見するためのプローブとして;遺伝子フィンガープリンティングのためのPCRプライマーを得るための情報源として;他の新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスにおいて既知の配列を「差し引く」ためのプローブとして;「遺伝子チップ」またはその他の支持体への付着のため(発現パターンの試験を包含する)のオリゴマーを選択し作製するために;DNA免疫技術を用いて抗タンパク質抗体を惹起させるために;そして抗DNA抗体を惹起させるかまたは別の免疫応答を惹起するための抗原として、用いられ得る。このポリヌクレオチドが、(例えばレセプター−リガンド相互作用において)別のタンパク質と結合するかまたは結合する可能性があるタンパク質をコードする場合、このポリヌクレオチドはまた、結合が起こる他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定するために、または結合相互作用のインヒビターを同定するために、相互作用捕捉アッセイ(例えばGyurisら、Cell 75:791−803(1993)に記載されたようなもの)にも用いられ得る。
(例えば標識化試薬)として;対応するポリペプチドが優先的に(構成的に、あるいは組織分化または発生の特定段階で、あるいは疾患状態においてのいずれかで)発現される組織に関するマーカーとして;そしてもちろん、相関的レセプターまたはリガンドを単離するために、同様に用いられ得る。これらの結合相互作用に関与するタンパク質は、結合相互作用のペプチドインヒビターもしくは低分子インヒビターまたはアゴニストについてスクリーニングするためにも、用いられ得る。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、栄養源またはサプリメントとしても用いられ得る。このような用途としては、タンパク質サプリメントまたはアミノ酸サプリメントとしての使用、炭素源としての使用、窒素源としての使用、ならびに炭水化物供給源としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。このような場合、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、特定の生物の食物に添加され得るし、あるいは別個の固体調製物または液体調製物として、例えば粉末、ピル、溶液、懸濁液またはカプセルの形態で投与され得る。微生物の場合、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その微生物が培養される培地中または培地上に添加され得る。
本発明のポリペプチドは、サイトカイン、細胞増殖活性(誘導性または阻害性のいずれか)または細胞分化活性(誘導性または阻害性のいずれか)に関連した活性を示し得るし、あるいはある種の細胞集団における他のサイトカインの産生を誘導し得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような属性を示すポリペプチドをコードし得る。今までに発見された多数のタンパク質因子(すべての公知のサイトカインを包含する)は、1つ以上の因子依存性細胞増殖アッセイにおいて活性を示しており、それゆえ、これらのアッセイは、サイトカイン活性の便利な確認として役立つ。本発明の治療用組成物の活性は、細胞株(
32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF−1、Mo7e、CMK、HUVECおよびCacoを包含するが、これらに限定されない)に関する多数の慣用的因子依存性細胞増殖アッセイのうちのいずれか1つにより立証される。本発明の治療用組成物は、以下において用いられ得る:
T細胞増殖に関するアッセイまたは胸腺細胞増殖に関するアッセイとしては、Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober編,Greene Publishing Associates and Wiley−Interscience刊(Chapter 3,In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1−3.19;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Takaiら、J.Immunol.137:3494−3500,1986;Bertagnolliら、J.Immunol.145:1706−1712,1990;Bertagnolliら、Cellular Immunology
133:327−341,1991;Bertagnolliら、I.Immunol.149:3778−3783,1992;Bowmanら、I.Immunol.152:1756−1761,1994に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
2 and Interleukin 4,Bottomly,K.,Davis,L.S.およびLipsky,P.E.,Current Protocols in Immunology.,J.E.e.a.Coligan編,Vol 1 pp.6.3.1−6.3.12,John Wiley and Sons,Toronto.1991;de Vriesら、J.Exp.Med.173:1205−1211,1991;Moreauら、Nature 336:690−692,1988;Greenbergerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2931−2938,1983;Measurement of mouse and human
interleukin 6-Nordan,R.,Current Protoco
ls in Immunology.J.E.Coligan編,Vol 1 pp.6.6.1−6.6.5,John Wiley and Sons,Toronto.1991;Smithら、Proc.Natl.Aced.Sci.U.S.A.83:1857−1861,1986;Measurement of human Interleukin 11-Bennett,F.,Giannotti,J.,Clark,
S.C.and Turner,K.J.,Current Protocols in
Immunology.J.E.Coligan編,Vol 1 pp.6.15.1
John Wiley and Sons,Toronto.1991;Measurement of mouse and human Interleukin 9-C
iarletta,A.,Giannotti,J.,Clark,S.C.and Turner,K.J.,Current Protocols in Immunology.J.E.Coligan編,Vol 1 pp.6.13.1,John Wiley and Sons,Toronto.1991に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチドは、幹細胞増殖因子活性を示し得、かつ多能性および全能性の幹細胞(始原生殖細胞、胚性幹細胞、造血性幹細胞および/または生殖系列幹細胞を包含する)の増殖、分化および生存に関与し得る。幹細胞へのインビボまたはエキソビボでの本発明のポリペプチドの投与は、損傷組織または疾患組織の再操作、移植、バイオ製剤の製造、およびバイオセンサーの開発のために有用である、全能性または多能性状態に細胞集団を維持し得そして増殖させ得る。大量のヒト細胞を産生する能力は、現在は非ヒト供給源またはドナー、疾患(例えばパーキンソン病、アルツハイマー病およびその他の神経変性疾患)を処置するための細胞移殖;移植のための組織(例えば、骨髄、皮膚、軟骨、腱、骨、筋肉(心筋を包含する)、血管、角膜、神経細胞、胃腸細胞);ならびに移植のための器官(例えば、腎臓、肝臓、膵臓(島細胞を包含する)、心臓および肺);から得られなければならない、ヒトタンパク質の産生のための重要な作業適応性を有する。
る。これは、培養培地への本発明のポリペプチドの直接投与により成し遂げられ得る。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた間質細胞が、培養中の幹細胞集団のためのフィーダー層としてか、またはインビボで、用いられ得る。フィーダー層のための間質性支持細胞としては、胚性骨髄線維芽細胞、骨髄間質細胞、胎児肝臓細胞または培養胚性線維芽細胞が挙げられ得る(米国特許第5,690,926号参照)。
本発明のポリペプチドは、造血の調節に、従って骨髄様細胞障害またはリンパ様細胞障害の処置に、関与し得る。コロニー形成細胞を支持するか、または因子依存性細胞株の支持体を支持する辺縁的生物学的活性でさえ、造血調節における関与(例えば、赤血球前駆細胞の単独でかまたは他のサイトカインと組合せての、成長および増殖の支持における関与)を示し、それにより、例えば種々の貧血の処置における有用性、または放射線照射/化学療法と組合せて用いて赤血球前駆体および/または赤血球の産生を刺激するための有用性;例えば化学療法と組み合わせて、その結果として起こる骨髄抑制を予防または処置するのに有用な骨髄様細胞(例えば、顆粒球および単球/マクロファージ)の成長および増殖(すなわち、伝統的コロニー刺激因子活性)を支持する際の有用性;巨核球の成長および増殖、ならびにその結果生じる血小板の成長および増殖を支持し、それにより種々の血小板障害(例えば血小板減少症)の予防または処置を可能にする有用性;そして一般的に血小板輸液の代わりまたは補完的に用いるための有用性;および/または上記の造血性細胞のいずれかおよびすべてへの成熟を可能にし、従って種々の幹細胞障害(例えば、移殖により通常処置されるもの;再生不良性貧血および発作性夜間血色素尿症が挙げられるが、これらに限定されない)における治療的有用性が見出される、造血性幹細胞の成長および増殖を支持する有用性;ならびに正常細胞としてかまたは遺伝子療法のために遺伝子操作された、放射線照射/化学療法後のインビボまたはエキソビボでの(すなわち、骨髄移植と組み合わせてか、または末梢前駆細胞移殖(同種または異種)を伴う)、幹細胞区画の再集団化における有用性を示す。
種々の造血系列の増殖および分化に関する適切なアッセイが、上記されている。
15:141−151,1995;Kellerら、Molecular and Cellular Biology 13:473−486,1993;McClanahanら、Blood 81:2903−2915,1993に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
p.163−179,Wiley−Liss,Inc.,New York,N.Y.1994;Long term culture initiating cell assay,Sutherland,H.J.,Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshneyら編,Vol pp.139−162,Wiley−Liss,Inc.,New York,N.Y.1994に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチドはまた、骨、軟骨、腱、靭帯および/または神経組織の成長または再生に、ならびに創傷治癒、組織修復および置換に、そして熱傷、切開および潰瘍の治癒にも、関与し得る。
、ならびに中枢神経系疾患(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群)の処置に用いられ得る。本発明により処置され得るさらなる症状としては、機械的障害および外傷性障害(例えば、脊髄障害、頭部外傷および脳血管疾患(例えば発作))が挙げられる。化学療法またはその他の医学療法に起因する末梢神経ニューロパシーもまた、本発明の組成物を用いて処置可能であり得る。
組織形成活性に関するアッセイとしては、国際特許公開WO95/16035(骨、軟骨、腱);国際特許公開WO95/05846(神経、ニューロン);国際特許公開WO91/07491(皮膚、内皮)に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチドはまた、免疫機能刺激活性または免疫抑制活性(アッセイが本明細書中に記載されている活性が挙げられるが、これらに限定されない)も示し得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような活性を示すポリペプチドをコードし得る。タンパク質は、種々の免疫不全および免疫障害(重症複合型免疫不全(SCID)を包含する)の処置において、例えばTリンパ球および/またはBリンパ球の成長および増殖を調節(アップレギュレートまたはダウンレギュレート)する際に、ならびにNK細胞およびその他の細胞集団の細胞溶解活性をもたらす際に、有用であり得る。これらの免疫不全は、遺伝性であり得るし、あるいはウイルス(例えばHIV)感染、細菌感染または真菌感染により引き起こされ得るか、あるいは自己免疫障害に起因し得る。より詳細には、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染またはその他の感染(例えば、HIV感染、肝炎ウイルス感染、ヘルペスウイルス感染、マイコバクテリア感染、リーシュマニア感染、マラリア感染、ならびに種々の真菌感染(例えばカンジダ症))により引き起こされる感染性疾患は、本発
明のタンパク質を用いて処置可能であり得る。もちろんこの点で、本発明のタンパク質は、免疫系への追加免疫が一般に望まれ得る場合(すなわち、癌の処置の場合)にも、有用であり得る。
ットにおける同種異系心移植片およびマウスにおける異種膵臓島細胞移植片が挙げられ、これらはともに、Lenschowら、Science 257:789〜792(1992)に記載されるように、インビボでのCTLA4Igの免疫抑制効果を試験するために使用された。Turkaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:11102−11105(1992)に記載されているように、インビボでのCTLA4Ig融合タンパク質の免疫抑制作用を調べるために用いられている。さらに、GVHDのマウスモデル(Paul編,Fundamental Immunology,Raven Press,New York,1989,pp.846−847参照)は、その疾患の発症に及ぼす本発明の治療用組成物の作用を決定するために用いられ得る。
活性を有するペプチドとともに発現することは、トランスフェクトした腫瘍細胞に対するT細胞媒介性免疫応答を誘導する。必要に応じて、MHCクラスII関連タンパク質の発現を遮断するアンチセンス構築物をコードする遺伝子(例えば、インバリアント鎖)もまた、Bリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするDNAで同時トランスフェクトされて、腫瘍関連抗原の提示を促し得そして腫瘍特異的免疫を誘導し得る。従って、ヒト被験体におけるT細胞媒介性免疫応答の誘導は、その被験体における腫瘍特異的寛容を克服するのに十分であり得る。
胸腺細胞または脾臓細胞の細胞傷害性に関する適切なアッセイとしては、Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober編,Greene Publishing Associates and Wiley−Interscience刊(Chapter 3,In Vitro
assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1−3.19;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Herrmannら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
78:2488−2492,1981;Herrmannら、J.Immunol.128:1968−1974,1982;Handaら、J.Immunol.135:1564−1572,1985;Takaiら、J.Immunol.137:3494−3500,1986;Takaiら、J.Immunol.140:508−512,1988;Bowmanら、J.Virology 61:1992−1998;Bertagnolliら、Cellular Immunology 133:327−341,1991;Brownら、J.Immunol.153:3079−3092,1994に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
in Immunology,J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober編,Greene Publishing Associates and Wiley−Interscience刊(Chapter 3,In Vitro assays for
Mouse Lymphocyte Function 3.1−3.19;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Takaiら、J.Immunol.137:3494−3500,1986;Takaiら、J.Immunol.140:508−512,1988;Bertagnolliら、J.Immunol.149:3778−3783,1992に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
れるタンパク質を同定するアッセイ)としては、Gueryら、J.Immunol.134:536−544,1995;Inabaら、Journal of Experimental Medicine 173:549−559,1991;Macatoniaら、Journal of Immunology 154:5071−5079,1995;Porgadorら、Journal of Experimental Medicine 182:255−260,1995;Nairら、Journal of Virology 67:4062−4069,1993;Huangら、Science 264:961−965,1994;Macatoniaら、Journal of Experimental Medicine 169:1255−1264,1989;Bhardwajら、Journal of Clinical Investigation 94:797−807,1994;およびInabaら、Journal of Experimental Medicine 172:631−640,1990に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチドは、哺乳動物細胞(例えば単球、線維芽細胞、好中球、T細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および/または内皮細胞)に関する走化性またはケモキネシス活性に関与し得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような属性を示すポリペプチドをコードし得る。走化性レセプター活性およびケモキネシスレセプター活性化を用いて、所望の細胞集団を所望の作用部位に動員または引き付け得る。走化性組成物またはケモキネシス組成物(例えば、本発明のタンパク質、抗体、結合パートナーまたは調節因子)は、組織に対する創傷またはその他の外傷の処置において、ならびに限局性感染の処置において、特定の利益を提供する。例えば、腫瘍または感染部位へのリンパ球、単球または好中球の誘引は、その腫瘍または感染因子に対する免疫応答改善を生じ得る。
走化性活性に関するアッセイ(走化性を誘導または防止するタンパク質を同定するアッセイ)は、膜を通る細胞の移動を誘導するタンパク質の能力を測定するアッセイ、ならびにある細胞集団が別の細胞集団へと接着するのを誘導するタンパク質の能力を測定するアッセイからなる。移動および接着に関する適切なアッセイとしては、Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober編,Greene Publishing Associates and Wiley−Interscience刊(Chapter 6.12,Measurement of alpha and beta Chemokines 6.12.1−6.12.28);Taubら、J.Clin.Invest.95:1370−1376,1995;Lindら、APMIS 103:140−146,1995;Mullerら、Eur.J.Immunol.25:1744−1748;Gruberら、J.of Immunol.152:5860−5867,1994;Johnstonら、J.of Immunol.153:1762−1768,1994に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチドはまた、止血または血栓溶解または血栓症にも関与し得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような属性を示すポリペプチドをコードし得る。組成物は、種々の凝血性障害(例えば、血友病のような遺伝性障害)の処置において、あるいは外傷、手術またはその他の原因に起因する創傷の処置において凝血事象およびその他の止血事象を強化するために、有用であり得る。本発明の組成物はまた、血栓の形成を溶解または阻害するために、ならびに血栓形成に起因する症状(例えば、心臓および中枢神経系脈管の梗塞(例えば発作))の処置および予防のためにも、有用であり得る。
止血活性および血栓溶解活性に関するアッセイとしては、Linetら、J.Clin.Pharmacol.26:131−140,1986;Burdickら、Thrombosis Res.45:413−419,1987;Humphreyら、Fibrinolysis 5:71−79(1991);Schaub,Prostaglandins 35:467−474,1988に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチドは、癌細胞の生成、増殖または転移に関与し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在または量の検出は、1つ以上の種類の癌の診断および/または予後判定のために有用であり得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド/ポリペプチドの存在または発現増大は、癌、前癌状態または進行中の悪性疾患の遺伝的危険性を示し得る。逆に、そのポリペプチドの遺伝子の欠損または非存在は、癌状態に関連し得る。癌または癌に対する素因と関連する単一ヌクレオチド多型の同定も、診断または予後判定のために有用であり得る。
、喉頭癌および甲状腺癌を含む)、肺癌(小細胞癌および非小細胞癌を含む)、乳癌(小細胞癌および腺管癌を含む)、胃腸癌(食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌および結腸直腸新形成に関連したポリープを含む)、膵臓癌、肝臓癌、泌尿器癌(膀胱癌および前立腺癌を含む)、女性生殖管の悪性腫瘍(卵巣癌、子宮(子宮内膜を含む)癌および卵胞における固形腫瘍を含む)、腎臓癌(腎細胞癌を含む)、脳癌(内因性脳腫瘍、神経芽細胞腫、星状細胞性脳腫瘍を含む)、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞浸潤、骨癌(骨腫を含む)、皮膚癌(悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮癌、基底細胞癌を含む)、血管外皮細胞腫、およびカポジ肉腫において有効であり得る。
v.Biol.,40:1189−97(1999)およびLiら、Clin.Exp.Metastasis,17:423−9(1999)に記載されたようなヒヨコ漿尿膜の血管新生の誘導または血管内皮細胞遊走の誘導のような、血管新生アッセイが挙げられる。適切な腫瘍細胞株は、例えば、American Type Tissue Culture Collectionカタログから入手可能である。
本発明のポリペプチドはまた、レセプター、レセプター/リガンド、あるいはレセプター/リガンド相互作用のインヒビターまたはアゴニストとしての活性も実証し得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような特徴を示すポリペプチドをコードし得る。このようなレセプターおよびリガンドの例としては、サイトカインレセプターおよびそれらのリガンド、レセプターキナーゼおよびそれらのリガンド、レセプターホスファターゼおよびそれらのリガンド、細胞−細胞相互作用に関与するレセプターおよびそれらのリガンド(細胞接着分子(例えばセレクチン、インテグリンおよびそれらのリガンド)が挙げられるが、これらに限定されない)、ならびに抗原提示、抗原認識ならびに細胞性免疫応答発生および体液性免疫応答発生に関与するレセプター/リガンド対が挙げられるが、これらに限定されない。レセプターおよびリガンドはまた、関連レセプター/リガンド相互作用の潜在的ペプチドインヒビターまたは低分子インヒビターのスクリーニングのためにも、有用である。本発明のタンパク質(レセプターフラグメントおよびリガンドフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない)は、それ自体、レセプター/リガンド相互作用のインヒビターとして有用であり得る。
レセプター−リガンド活性に関する適切なアッセイとしては、Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober編,Greene Publishing Associates and Wiley−Interscience刊(Chapter 7.28,Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28.1−7.28.22),Takaiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6864−6868,1987;Biererら、J.Exp.Med.168:1145−1156,1988;Rosensteinら、J.Exp.Med.169:149−160 1989;Stoltenborgら、J.Immunol.Methods 175:59−68,1994;Stittら、Cell 80:661−670,1995に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
Vol.182(1990) Academic Press,Inc.San Diego)。放射性同位体の例としては、トリチウムおよび炭素14が挙げられるが、これらに限定されない。発色分子の例としては、蛍光分子(例えば、フルオレサミンまたはローダミン)、あるいはその他の発色分子が挙げられるが、これらに限定されない。毒素の例としては、リシンが挙げられるが、これに限定されない。
本発明は、種々の薬剤スクリーニング技術のいずれかにおいて新規なポリペプチドまたはその結合フラグメントを用いることにより、化合物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中で遊離しているか、固体支持体に付着されるか、細胞表面に保有されるか、または細胞内に位置するかのいずれかであり得る。薬剤スクリーニングの一方法は、このポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する組換え核酸で安定的に形質転換された真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、競合的結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞についてスクリーニングされる。このような細胞は、生存形態または固定形態のいずれかで、標準結合アッセイのために用いられ得る。例えば、本発明のポリペプチドまたはフラグメントと試験される作用物質との間の複合体の形成を測定し得るし、あるいはこの新規なポリペプチドと、当該分野で周知である適切な細胞株との間の複合体形成の減少を調べ得る。
Chem Biol,1(1):114−19(1997);Dornerら、Bioorg Med Chem,4(5):709−15(1996)(アルキル化ジペプチ
ド)を参照されたい。
本発明は、ポリペプチド(例えば、リガンドまたはレセプター)の特異的結合を検出するための方法も提供する。当該分野は、本発明のレセプターポリペプチドに対する従来未知であった結合パートナーを同定するために特に有用である、多数のアッセイを提供する。例えば、哺乳動物細胞または細菌細胞を用いる発現クローニング、あるいはツーハイブリッドスクリーニングアッセイを用いて、結合パートナーをコードするポリヌクレオチドを同定し得る。別の例として、本発明の適切な固定化ポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、本発明のポリペプチドを認識しそして結合するポリペプチドを単離し得る。本発明のポリペプチドの生物学的活性を調整する(すなわち増大するかまたは低減する)化合物(特に、低分子)の同定のために用いられる、多数の種々のライブラリーが存在する。本発明のレセプターポリペプチドに対するリガンドもまた、外因性リガンドまたは外因性リガンドカクテルを、本発明のレセプターの発現に関する以外は遺伝子的に同一である2つの細胞集団(一方の細胞集団は本発明のレセプターを発現し、他方は発現しない)に添加することにより、同定され得る。次に、リガンド(単数または複数)の添加に対する2つの細胞集団の応答が比較される。あるいは、発現ライブラリーは、細胞中で本発明のポリペプチドとともに同時発現され得、そして潜在的なリガンド(単数または複数)を同定するためにオートクライン応答に関してアッセイされ得る。さらに別の例として、BIAcoreアッセイ、ゲル重層アッセイ、または当該分野で公知のその他の方法を用いて、結合パートナーポリペプチド(例えば、(1)無機ライブラリーおよび有機化学物質ライブラリー、(2)天然産物ライブラリー、ならびに(3)無作為ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリー)を同定し得る。
白血病および関連障害が、本発明のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの機能を促進するかまたは阻害する治療薬の投与により、処置または予防され得る。このよう
な白血病および関連障害としては、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ性白血病が挙げられるが、これらに限定されない(このような障害の概要に関しては、Fishmanら、1985,Medicine,2d Ed.,J.B.Lippincott Co.,Philadelphiaを参照されたい)。
本発明のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの活性を調整する化合物を用いて介入の効力に関して試験され得る、従って治療的有用性の症状発現の観察時に処置され得る、細胞型を包含する神経系障害としては、神経系損傷、および軸索の離断、ニューロンの縮小または変性、あるいは脱髄のいずれかを引き起こす疾患または障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明により患者(ヒト患者および非ヒト哺乳動物患者を包含する)において処置され得る神経系病変としては、中枢神経系(例えば脊髄、脳)または末梢神経系についての以下の病変が挙げられるが、これらに限定されない:
(i)外傷性病変:物理的損傷により引き起こされるかまたは手術に関連する病変(例えば、神経系の一部分を切断する損傷、または圧迫損傷);
(ii)虚血性病変:この場合、神経系の一部分における酸素の欠如が、ニューロンの損傷または死を引き起こす(脳梗塞または虚血、あるいは脊髄梗塞または虚血が挙げられる);
(iii)感染性病変:この場合、例えば膿瘍による感染の結果としてか、またはヒト免疫不全ウイルス、帯状疱疹ウイルスまたは単純ヘルペスウイルスによる感染に関連して、またはライム病、結核、梅毒による感染に関連して、神経系の一部が破壊または損傷される;
(iv)変性病変:この場合、変性プロセスの結果として神経系が破壊または損傷される(パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病または筋萎縮性側索硬化症に関連した変性が挙げられるが、これらに限定されない);
(v)栄養性疾患または障害に関連した病変:この場合、栄養障害または代謝の障害により、神経系の一部が破壊または損傷される(ビタミンB12欠乏症、葉酸欠乏症、ウェルニッケ病、タバコ−アルコール弱視、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病(脳梁の原発性変性)およびアルコール性小脳変性が挙げられるが、これらに限定されない);
(vi)全身性疾患に関係する神経学的病変(糖尿病に関係する神経学的病変(糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺)、全身性エリテマトーデスに関係する神経学的病変、癌腫または類肉腫に関係する神経学的病変が挙げられるが、これらに限定されない);
(vii)毒性物質(アルコール、鉛または特定の神経毒素が挙げられる)により引き起こされる病変;ならびに
(viii)脱髄病変:この場合、脱髄性疾患(多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害、横断脊髄障害または種々の病因、進行性多病巣性白質脳症、ならびに橋中央ミエリン溶解が挙げられるが、これらに限定されない)により、神経系の一部が破壊または損傷される。
(i)培養中のニューロンの生存時間増大;
(ii)培養中またはインビボでのニューロンの出芽増大;
(iii)培養中またはインビボでのニューロン関連分子(例えば、運動ニューロンに関連したコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ)の産生増大;あるいは
(iv)インビボでのニューロン機能不全の症状低減。
本発明のポリペプチドはまた、以下のさらなる活性または作用のうちの1つ以上も示し
得る:感染因子(細菌、ウイルス、真菌またはその他の寄生生物が挙げられるが、これらに限定されない)の増殖、感染または機能を阻害するか、あるいはそれらを殺害すること;身体的特徴(身長、体重、毛髪の色、眼の色、皮膚、脂肪対赤身比またはその他の組織色素沈着、あるいは臓器または身体部分のサイズもしくは形状(例えば、胸部の増大または縮小、骨形態または形状の変化が挙げられるが、これらに限定されない)に作用(抑制または増強)すること;生体リズムあるいは概日性周期または概日リズムに作用すること;男性被験体または女性被験体の生殖能に作用すること;食物の脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子またはその他の栄養因子または構成成分(単数または複数)の代謝、異化、同化、プロセシング、利用、貯蔵または排泄に作用すること;行動的特徴(食欲、性欲、ストレス、認知(認知障害を包含する)、抑うつ(抑うつ障害を包含する)および暴力的行動が挙げられるが、これらに限定されない)に作用すること;鎮痛作用またはその他の疼痛低減作用を提供すること;造血系列以外の系列における胚性幹細胞の分化および成長を促進すること;ホルモンまたは内分泌活性;酵素の場合には、酵素の欠損を矯正し、欠損関連性疾患を処置すること;過増殖性障害(例えば、乾癬)の処置;免疫グロブリン様活性(例えば、抗原または補体を結合する能力);ならびにこのようなタンパク質あるいはこのようなタンパク質と交差反応性である別の物質もしくは実体に対して免疫応答を引き起こすように、ワクチン組成物中で抗原として作用する能力。
多型の実証は、ヒト被験体におけるそのような多型の同定、ならびに診断および処置のためのこの情報の薬理遺伝学的使用を可能にする。このような多型は、例えば、種々の疾患状態(例えば、炎症または免疫応答を包含する障害)に対する差次的素因または感受性、あるいは薬剤投与に対する差次的応答に関連し得、この遺伝情報を用いて、予防的処置または治療的処置を適切に調整させ得る。例えば、炎症または自己免疫疾患に対する素因に関連した多型の存在は、その多型の存在を同定することにより、ヒトにおけるこの状態
の診断を可能にする。
慢性関節リウマチに対する本発明の組成物の免疫抑制作用は、実験動物モデル系で決定される。その実験モデル系は、ラットにおけるアジュバント誘導性関節炎であり、そのプロトコルは、J.Holoshitzら、1983,Science,219:56により、またはB.Waksmanら、1963,Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.,23:129により記載されている。その疾患の誘導は、完全フロイントアジュバント(CFA)中の死滅結核菌の懸濁液を、一般的に皮内に、1回注射することにより、引き起こされ得る。注射経路は変わり得るが、ラットは、尾の基部にアジュバント混合物を注射され得る。そのポリペプチドは、約1〜5mg/kgの用量で、リン酸緩衝化生理食塩水溶液(PBS)中で投与される。コントロールは、PBSのみの投与からなる。
本発明の組成物(ポリペプチドフラグメント、アナログ、改変体、および抗体またはその他の結合パートナー、あるいは調節因子(アンチセンスポリヌクレオチドを包含する)を包含する)は、種々の治療方法において多数の用途を有する。治療用途の例としては、本明細書中に例示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態は、本発明のペプチドを調節することにより調整され得る疾患または障害に罹患した個体への、本発明の有効量の幹細胞増殖因子様ポリペプチドまたはその
他の組成物の投与である。投与方式は特に重要ではないが、非経口投与が好ましい。例示的投与方式は、静脈内ボーラスを送達することである。本発明の幹細胞増殖因子様ポリペプチドまたはその他の組成物の投与量は、普通は処方医により決定される。投与量は、個別の患者の年齢、体重、状態および応答によって変わることが、予測される。典型的には、1回の投与当たりに投与されるポリペプチドの量は、約0.01μg/患者体重1kg〜100mg/患者体重1kgの範囲であり、好ましい用量は、約0.1μg/患者体重1kg〜10mg/患者体重1kgである。非経口投与のためには、本発明の幹細胞増殖因子様ポリペプチドは、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと組合せた注射可能形態で処方される。このようなビヒクルは当該分野で周知であり、例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ならびに少量のヒト血清アルブミンからなる溶液が、挙げられる。このビヒクルは、このポリペプチドまたはその他の活性成分の等張性および安定性を維持する少量の添加剤を含有し得る。このような溶液の調製は、当業者の範囲内である。
本発明のタンパク質またはその他の組成物(由来する供給源が何であれ、例えば組換え供給源および非組換え供給源が挙げられるがこれらに限らない)(本発明のポリペプチドの抗体またはその他の結合パートナーが挙げられる)は、単独でか、またはそれが種々の障害を処置または改善するための用量で適切なキャリアまたは賦形剤(単数または複数)と混合された薬学的組成物の状態で、必要とする患者に投与され得る。このような組成物は、(タンパク質またはその他の活性成分およびキャリアのほかに)、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および当該分野で周知のその他の物質を、必要に応じて含有し得る。「薬学的に受容可能な」という用語は、活性成分(単数または複数)の生物学的活性の有効性を妨害しない、非毒性物質を意味する。そのキャリアの特性は、投与経路に依存する。本発明の薬学的組成物はまた、サイトカイン、リンホカイン、またはその他の造血因子(例えば、M−CSF、GM−CSF、TNF、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IFN、TNF0、TNF1、TNF2、G−CSF、Meg−CSF、トロンボポエチン、幹細胞因子およびエリスロポエチン)も含有し得る。さらなる組成物中では、本発明のタンパク質は、その疾患または障害の処置に有益なその他の作用物質と組合わされ得る。これらの作用物質としては、種々の増殖因子(例えば、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF−αおよびTGF−β)、インスリン様増殖因子(IGF)ならびに本明細書中に記載されたサイトカイン)が挙げられる。
、第2タンパク質または治療薬が、第1タンパク質と同時に投与され得る(例えば、同時に、または異なる時点であるが但し、作用因子の組合せの治療濃度が処置部位で達成される)。この適用の化合物の処方および投与のための技術は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co.,Easton,PA最新版において見出され得る。治療的有効用量とは、症状の改善(例えば、関連の医学的症状の処置、治癒、予防または改善)を生じるため、あるいはこのような症状の処置、治癒、予防または改善に関する速度の増大を生じるために十分な、化合物の量をさらに指す。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、治療的有効用量とは、成分単独を指す。組合せに対して適用される場合、治療的有効用量は、組み合わせて逐次投与されるかまたは同時投与されるかに関わらず、治療効果を生じる活性成分の併用量を指す。
適切な投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経粘膜投与または腸内投与;非経口送達(筋内注射、皮下注射、髄内注射、ならびに髄腔内注射、直接心室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射が挙げられる)が、挙げられ得る。薬学的組成物中においてかまたは本発明の方法を実行するために用いられる、本発明のタンパク質またはその他の活性成分の投与は、種々の従来の方法(例えば、経口摂取、吸入、局所適用、あるいは皮膚注射、皮下注射、腹腔内注射、非経口注射または静脈内注射)で実行され得る。患者への静脈内投与が好ましい。
したがって、本発明に従って用いるための薬学的組成物は、薬学的に用いられ得る調製物中への活性化合物のプロセシングを促す賦形剤および助剤を含む1つ以上の生理学的に受容可能なキャリアを用いて、慣用的方法で処方され得る。これらの薬学的組成物は、それ自体公知である方法で、例えば慣用的混合、溶解、造粒、糖衣剤製造、研和(levigating:磨砕)、乳化、封入、包括または凍結乾燥法により、製造され得る。適正処方物は、選択される投与経路に拠る。治療的有効量の本発明のタンパク質またはその他の活性成分が経口的に投与される場合、本発明のタンパク質またはその他の活性成分は、錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシルの形態である。錠剤形態で投与される場合、本発明の薬学的組成物は、固体キャリア、例えばゼラチンまたはアジュバントをさらに含有し得る。錠剤、カプセルおよび粉末は、約5〜95%の本発明のタンパク質またはその他の活性成分、好ましくは約25〜90%の本発明のタンパク質またはその他の活性成分を含有する。液体形態で投与される場合、液体キャリア、例えば水、石油、動物または植物起源の油、例えば落花生油、鉱油、ダイズ油またはゴマ油、あるいは合成油が添加され得る。液体形態の薬学的組成物は、生理学的生理食塩溶液、デキストロースまたはその他の糖類溶液、あるいはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールをさらに含有し得る。液体形態で投与される場合、薬学的組成物は、約0.5〜90重量%の本発明のタンパク質またはその他の活性成分、好ましくは約1〜50%の本発明のタンパク質またはその他の活性成分を含有する。
物用量の異なる組合せを特徴付けするために、染料または顔料が錠剤または糖衣丸コーティングに添加され得る。
物を十分に溶解し、全身投与時に、自ら低毒性を生じる。天然では、共溶媒系の割合は、その溶解性および毒性の特徴を破壊することなく、かなり変更され得る。さらに共溶媒構成成分の同一性は変更され得る:例えば他の低毒性非極性界面活性剤がポリソルベート80の代わりに用いられ得る;ポリエチレングリコールの分画サイズは、変更され得る;他の生体適合性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンは、ポリエチレングリコールを置換し得る;そして他の糖類または多糖類がデキストロースに取って代わり得る。あるいは疎水性薬学的化合物のための他の送達系が用いられ得る。リポソームおよびエマルションは、疎水性薬剤のための送達ビヒクルまたはキャリアの公知の例である。ある種の有機溶媒、例えばジメチルスルホキシドも用いられ得るが、通常は、より大きい毒性という犠牲を払う。さらに化合物は、徐放系、例えば治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを用いて送達され得る。種々の型の徐放性物質が確立されており、当業者に周知である。徐放性カプセルは、それらの化学的性質に応じて、2〜3週間から100日間までに亘って化合物を放出し得る。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質またはその他の活性成分安定化のためのさらなる戦略が用いられ得る。
いて個々の患者を処置する。最初に、担当医師は、低用量の本発明のタンパク質またはその他の活性成分を投与して、患者の応答を観察する。最適治療的効果が患者に関して得られるまで、より高い用量の本発明のタンパク質またはその他の活性成分が投与され、その時点で、投与量はさらに増大されない。本発明の方法を実行するために使用される種々の薬学的組成物は、患者体重1kgあたり、約0.01μg〜約100mg(好ましくは、約0.1μg〜約10mg、さらに好ましくは約0.1μg〜約1mg)の本発明のタンパク質またはその他の活性成分を含有すべきである、と意図される。骨、軟骨、腱または靭帯の再生のために有用である本発明の組成物に関しては、処置方法は、局所的に、全身的に、あるいは移植片またはデバイスとして局在的に、組成物を投与することを包含する。投与される場合、本発明に用いるための治療用組成物は、もちろん、発熱物質無含有の生理学的に受容可能な形態である。さらに組成物は望ましくは、骨、軟骨または組織の損傷部位への送達のために、粘着形態で、封入されるかまたは注入され得る。局所投与は、創傷治癒および組織修復に適し得る。上記のような組成物中にも任意に含まれ得る本発明のタンパク質またはその他の活性成分以外の治療的に有用な作用物質は、代替的にまたはさらに、本発明の方法において組成物と同時にまたは逐次的に投与され得る。好ましくは、骨形成および/または軟骨形成のためには、組成物は、タンパク質含有組成物またはその他の活性成分含有組成物を骨および/または軟骨の損傷部位に送達して、骨および軟骨の発達のための構造を提供し得、そして最適には身体中に吸収され得るマトリクスを含み得る。このようなマトリクスは、他の移殖医療用途に現在用いられている物質で構成され得る。
より、前駆細胞の骨形成活性を助ける機会をタンパク質に提供する。さらに別の組成物では、本発明のタンパク質またはその他の活性成分は、骨および/または軟骨欠損、創傷または問題の組織の処置に有益であるその他の作用物質と組合され得る。これらの作用物質としては、種々の増殖因子、例えば上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF−αおよびTGF−β)およびインスリン様増殖因子(IGF)が挙げられる。
本発明に用いるのに適した薬学的組成物としては、活性成分が、その意図された目的を達成するために有効量で含有される組成物が挙げられる。より具体的には、治療的有効量とは、処置されている被験体の発症を防止するために、または既存の症状を軽減するために有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書中に提供された詳細な開示にかんがみて、十分に当業者の能力の範囲内である。本発明の方法に用いられる任意の化合物に関しては、治療的有効用量は、適切なインビトロアッセイから最初に概算され得る。例えば用量は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いられ得る循環濃度範囲を達成するよう、動物モデルにおいて処方され得る。例えば用量は、細胞培養で決定した場合にIC50(すなわち、タンパク質の生物学的活性の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環濃度範囲を達成するよう、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報を用いて、ヒトにおける有用用量を、より正確に決定し得る。
範囲内であって、毒性をほとんどまたはまったく伴わない。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路によって、この範囲内で変化し得る。的確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して、個々の医師により選択され得る(例えばFinglら、1975,「The Pharmacological Basis of Therapeutics」Ch.1 p.1参照)。投薬量および間隔は、所望の作用または最小有効濃度(MEC)を保持するのに十分である活性部分の血漿レベルを提供するよう、個々に調整され得る。MECは各化合物について変わるが、インビトロデータから概算され得る。MECを達成するのに必要な投薬量は、個体の特性および投与経路に拠る。しかしながらHPLCアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定し得る。
組成物は、所望により、活性成分を含有する1つ以上の単位投薬形態を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在し得る。パックは、例えば金属またはプラスチック箔、例えばブリスター包装を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与に関する使用説明書を添付され得る。適合性薬学的キャリア中に処方された本発明の化合物を含む組成物も調製され、適切な容器中に入れられて、指示条件の処置のためにラベルを貼られ得る。
(4.10.1 ヒト抗体)
完全ヒト抗体は、本質的に、CDRを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子に関する。このような抗体は、本明細書中で「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技法;ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozborら、1983 Immunol Today 4:72参照)ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技法(Coleら、1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96参照)により調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は本発明の実施に際して利用され、ヒトハイブリドーマを用いることにより(Coteら、1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026−2030参照)、またはヒトB細胞をエプスタイン・バーウイルスを用いてインビトロで形質転換することにより(Coleら、1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96参照)産生され得る。
され得る(HoogenboomおよびWinter,J.Mol.Bio.,227:381(1991);Marksら、J.Mol.Biol.,222:581(1991))。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されたマウス中にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより、作製され得る。攻撃誘発(challenge)時に、ヒト抗体産生が観察されるが、これは、すべての点(遺伝子再配列、アセンブリーおよび抗体レパートリーを含む)において、ヒトで観察されたものに非常によく似ている。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;第5,545,806号;第5,569,825号;第5,625,126号;第5,633,425号;第5,661,016号に、ならびにMarksら、(Bio/Technology 10,779−783(1992);Lonbergら、(Nature 368 856−859(1994));Morrison(Nature 368,812−13(1994));Fishwildら(Nature Biotechnology 14,845−51(1996));Neuberger(Nature Biotechnology 14,826(1996));ならびに、LonbergおよびHuszar(Intern.Rev.Immunol.13 65−93(1995))に記載されている。
本発明に従って、本発明の抗原タンパク質に特異的な一本鎖抗体の産生のための技法が適合され得る(例えば米国特許第4,946,778号参照)。さらに、タンパク質あるいはその誘導体、フラグメント、アナログまたは相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速且つ有効な同定を可能にするための方法が、Fab発現ライブラリの構築のために適合され得る(例えばHuseら、1989 Science 246:1275−1281参照)。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、当該分野で公知の技法により産生され、その例としては、(i)抗体分子のペプシン消化により産生されるF(ab’)2フラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を低減することにより生成されるFabフラグメント;(iii)パパインおよび還元剤による抗体分子の処理により生成されるFabフラグメント;ならびに(iv)Fvフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の1つは、本発明の抗原性タンパク質に対するものである。第二の結合標的は、任意のその他の抗原であり、有益には、細胞表面タンパク質、あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
で置換される(例えばチロシンまたはトリプトファン)。大型アミノ酸側鎖をより小さいものと取り替えることにより、大型側鎖と同一のまたは類似のサイズの代償性「空洞」が二次抗体分子の界面に作られる(例えばアラニンまたはトレオニン)。これは、他の望ましくない最終産物、例えばホモ二量体を上回るヘテロ二量体の収量を増大するためのメカニズムを提供する。
トリガリング分子、例えばT細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28またはB7)、あるいはIgGに対するFcレセプター(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)と結合する腕と組合せされ得る。二重特異性抗体は、特定抗原を発現する細胞に細胞毒性作用物質を向けるためにも用いられ得る。これらの抗体は抗原結合腕および、細胞毒性作用物質または放射性核種キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTAまたはTETAを結合する腕を保有する。別の当該二重特異性抗体は、本明細書中に記載されたタンパク質抗原を結合し、さらに組織因子(TF)を結合する。
ヘテロ結合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、2つの共有的に連結された抗体からなる。このような抗体は、例えば望ましくない細胞に対して(米国特許第4,676,980号)、そしてHIV感染の処置のために(WO 91/00360;WO 92/200373;EP 03089)、免疫系細胞を標的化することが提唱されている。抗体は、合成タンパク質化学における公知の方法、例えば架橋剤を包含する方法を用いてインビトロで調製され得ることが意図される。例えば免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用い、またはチオエーテル結合を形成することにより、構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−4−メルカプトブチルイミデート(mercaptobutyrimidate)、ならびに例えば米国特許第4,676,980号に開示されたものが挙げられる。
例えば癌の処置に際しての抗体の有効性を強化するよう、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することは望ましくあり得る。例えばシステイン残基がFc領域に導入され、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。このように生成されるホモ二量体抗体は、内在化能力を改善し、かつ/または相補体媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)を増大し得た。Caronら、J.Exp Med.,176:1191−1195(1992)およびShopes,J.Immunol.,148:2918−2922(1992)参照。抗腫瘍活性強化を示すホモ二量体抗体も、Wolffら、Cancer Research,53:2560−2565(1993)に記載されているようなヘテロ二機能性架橋剤を用いて調製され得る。あるいは二元性Fc領域を有し、それにより相補的溶解およびADCC能力強化を示し得る抗体が、操作され得る(Stevensonら、Anti−Cancer Drug
Design,3:219−230(1989)参照)。
本発明は、細胞毒性作用物質、例えば化学療法薬、毒素(例えば細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的活性毒素またはそのフラグメント)または放射性同位元素(すなわち放射性結合体)と結合された抗体を含む免疫結合体にも関する。
種は、放射性結合抗体の産生のために利用可能である。例としては、212Bi、131I、131In、90Yおよび186Reが挙げられる。
この実施形態の一用途において、本発明のヌクレオチド配列は、コンピューター読取り可能媒体上に記録され得る。本明細書中で用いる場合、「コンピューター読取り可能媒体」とは、コンピューターにより直接読み取られ、アクセスされ得る任意の媒体を指す。このような媒体としては、磁気保存媒体、例えばフロッピー(登録商標)ディスク、ハードディスク保存媒体および磁気テープ;光学的保存媒体、例えばCD−ROM;電気的保存媒体、例えばRAMおよびROM;ならびにこれらの部類のハイブリッド、例えば磁気/光学保存媒体が挙げられるが、これらに限定されない。現在公知のコンピューター読取り可能媒体のいずれかを用いて、本発明のヌクレオチド配列をその上に記録したコンピューター読取り可能媒体を含む製品を作り得る方法を、当業者は容易に理解し得る。本明細書中で用いる場合、「記録された」とは、コンピューター読取り可能媒体上に情報を保存するための方法を指す。本発明のヌクレオチド配列情報を含む製品を生成するために、コンピューター読取り可能媒体上に情報を記録するための現在公知の方法のいずれかを、当業者は容易に適合し得る。
もしくは26またはその代表的フラグメント;あるいはコンピューター読取り可能形態で配列番号1〜2、4、8、10、12、14、16〜17、19または26のヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列のいずれかを提供することにより、当業者は、種々の目的のために配列情報に日常的にアクセスし得る。コンピューター読取り可能媒体中に提供される配列情報に当業者がアクセスできるコンピューターソフトウエアが、公的に利用可能である。以下の例は、Sybaseシステム上でBLAST(Altschulら、J.Mol.Biol.215:403−410(1990))およびBLAZE(Brutlagら、Comp.Chem.17:203−207(1993))検索アルゴリズムを実行するソフトウエアを用いて、核酸配列内のオープンリーディングフレーム(ORF)を同定する方法を実証する。このようなORFはタンパク質コードフラグメントであり得、そして商業的に重要なタンパク質、例えば発酵反応に用いられる酵素を生産するのに、ならびに商業的に有用な代謝産物の生産に有用であり得る。
列、ヘアピン構造および誘導可能発現エレメント(タンパク質結合配列)が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、本発明のフラグメントは、広範に記載されたように、三重螺旋形成あるいはアンチセンスDNAまたはRNAにより遺伝子発現を制御するために用いられ得、この両方法は、ポリヌクレオチド配列のDNAまたはRNAとの結合に基づいている。これらの方法に用いるのに適したポリヌクレオチドは、通常は20〜40塩基の長さであり、転写に関与する遺伝子の領域(三重螺旋−Leeら、Nucl.Acids Res.6:3073(1979);Cooneyら、Science 15241:456(1988);およびDervanら、Science 251:1360(1991)参照)と、あるいはmRNAそれ自体(アンチセンス−Olmno,J.Neurochem.56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988))と相補的であるよう設計される。三重螺旋形成はDNAからのRNA転写の停止(shut off)を最適にもたらすが、一方、アンチセンスRNAハイブリダイゼーションはポリペプチドへのmRNA分子の翻訳を遮断する。両技法は、モデル系において有効であることが実証されている。本発明の配列中に含入される情報は、アンチセンスまたは三重螺旋オリゴヌクレオチドの設計のために必要である。
本発明はさらに、適切な標識と必要に応じて結合されるかまたは別の方法で会合された本発明の核酸プローブまたは抗体を用いて、試験試料中の本発明のORFのうちの1つ、またはその相同体の存在または発現を同定するための方法を提供する。
roduction to Radioimmunoassay and Related Techniques,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1986); Bullock,G.R.ら,Techniques in Immunocytochemistry,Academic Press,Orlando,FL Vol.1(1982),Vol.2(1983),Vol.3(1985); Tijssen,P.,Practice and Theory of immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1985)に見出され得る。本発明の試験試料としては、細胞、タンパク質または細胞の膜抽出物、あるいは生物学的流体、例えば痰、血液、血清、血漿または尿が挙げられる。上記の方法に用いられる試験試料は、アッセイフォーマット、検出方法の性質、ならびにアッセイされる試料として用いられる組織、細胞または抽出物によって変わる。タンパク質抽出物または細胞の膜抽出物の調製方法は当該分野で周知であり、利用される系と適合性がある試料を得るよう、容易に適合され得る。
本発明の新規なポリペプチドおよび結合パートナーは、本発明の分子を発現する部位の医学的画像処理に有用である(この場合、例えば本発明のポリペプチドは炎症または感染の部位を画像処理するための、免疫応答に関与する)(例えば米国特許第5,413,778号(Kunkelら)参照)。このような方法は、標識剤またはイメージング剤の化学的結合、被験体への薬学的に受容可能なキャリア中での標識化ポリペプチドの投与、ならびに標的部位でのインビボでの標識化ポリペプチドの画像処理を含む。
本発明の単離タンパク質およびポリヌクレオチドを用いて、本発明はさらに、配列番号1〜2、4、8、10、12、14、16〜17、19または26で記述されるヌクレオチド配列のいずれかに対応するORFによりコードされるポリペプチドに結合するか、あるいは核酸によりコードされるポリペプチドの特定のドメインと結合する作用物質を得、
そして、同定する方法を提供する。詳述すると、上記の方法は、
(a)本発明のORFによりコードされる単離タンパク質または本発明の核酸と、作用物質とを接触させる工程、および
(b)作用物質が上記タンパク質または上記核酸に結合するか否かを決定する工程を含む。
of Synthetic Peptides: Antisense Peptides、「In Synthetic Peptides,A User’s Guide,W.H.Freeman」NY(1992),pp.289−307およびKaspczakら、Biochmistry 28: 9230−8(1989)参照)、あるいは薬学的作用物質等を生成するために、特定のペプチド配列と結合し得るペプチド、薬学的作用物質等を生成するための一般に利用可能な手法を、当業者は容易に適応し得る。
本発明の別の態様は、天然ヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るポリペプチド特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド配列番号1〜2、4、8、10、12、14、16〜17、19または26のいずれかに由来し得る。対応する遺伝子は限定数の組織内でのみ発現されるため、ヌクレオチド配列番号1〜2、4、8、10、12、14、16〜17、19または26のいずれかに由来するハイブリダイゼーションプローブは、試料中のこのような組織の細胞型のRNAの存在の指標として用いられ得る。
られる。このようなベクターは当該分野で公知であり、市販されており、そして適切なRNAポリメラーゼ、例えばT7またはSP6RNAポリメラーゼ、ならびに適切な放射性標識化ヌクレオチドの付加により、インビトロでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ヌクレオチド配列は、それらのそれぞれのゲノム配列をマッピングするためのハイブリダイゼーションプローブを構築するために用いられ得る。本明細書中に提供されたヌクレオチド配列は、周知の遺伝子および/または染色体マッピング技法を用いて、染色体または染色体の特定領域にマッピングされ得る。これらの技法としては、インサイチュハイブリダイゼーション、公知の染色体マーカーに対する連鎖分析、公知の染色体に特異的なライブラリまたはフローソーティングした染色体調製物を用いたハイブリダイゼーションスクリーニング等が挙げられる。染色体展開の蛍光インサイチュハイブリダイゼーションの技法は、特に、Vermaら(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York NYに記載されている。
オリゴヌクレオチド、すなわち小核酸セグメントは、例えば自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて一般的に実行されるように、化学的手段によりオリゴヌクレオチドを直接合成することにより、容易に調製され得る。
二次アミノ基(>NH)をグラフトされたポリスチレン表面である。コバリンクモジュール(CovaLink Modules)は、Nunc Laboratoriesから購入可能である。DNA分子は、ホスホルアミデート結合によりもっぱら5’末端でコバリンクに結合されて、1pmolより多いDNAの固定化を可能にする(Rasmussenら、(1991)Anal Biochem 198(1)138−42)。
6513−29)。これは、単一共有結合のみを用いる固定化が好ましい場合に、有益である。ホスホルアミデート結合は、2nm長スペーサー腕を介してポリスチレン表面に共有的にグラフトされたスペーサー腕の末端に位置するコバリンクNH二次アミノ基にDNAを結合する。ホスホルアミデート結合によりコバリンクNHにオリゴヌクレオチドを連結するために、オリゴヌクレオチド末端は5’末端リン酸基を有さねばならない。ビオチンがコバリンクに共有結合され、次にプローブを結合するためにストレプトアビジンが用いられることはおそらくは可能である。
用される)。
核酸、例えばcDNA、ゲノムDNA、染色体DNA、顕微解剖染色体バンド、コスミドまたはYAC挿入物、ならびにRNA(mRNA(任意の増殖過程を伴わない)を含む)は、任意の適切な供給源から得られ得る。例えばSambrookら、(1989)は、哺乳動物細胞から高分子量DNAを単離するための3つのプロトコルを記載する(p.9.14−9.23)。
)を形成する。Fitzgeraldら(1992)は、急速ゲルろ過法によりサイズ分画され、末端修復を伴わずにlacZマイナスM13クローンベクターに直接結合されるpUC19のCviJI**消化物を用いて、このフラグメント化戦略の無作為性を定量的に評価した。76クローンの配列分析は、CviJIs**がPuGCPy部位のほかに、pyGCPyおよびPuGCPuを制限し、そして新規な配列データが無作為フラグメント化と一致する割合で蓄積されることを示した。
支持体、例えばナイロン膜の上にDNA試料をスポッティングすることにより、アレイが調製され得る。スポッティングは、金属ピンのアレイを用いることにより実施され得(その位置は、マイクロタイタープレート中のウエルのアレイに対応する)、ナイロン膜に約20nlのDNA溶液が移動するまで反復される。オフセットプリンティングにより、ウエルの密度より高いドット密度が達成される。用いられる標識の種類によって、1mm2中に1〜25ドットが収容される。予備選定数の横列および縦列でのスポッティングを回避することにより、別個のサブセット(サブアレイ)が形成され得る。一サブアレイ中の試料は、異なる個体からのDNA(または同一遺伝子)の同一ゲノムセグメントであり得るし、あるいは異なる重複ゲノムクローンであり得る。サブアレイの各々は、同一試料のレプリカスポッティングを表し得る。一例では、選定遺伝子セグメントは、64人の患者から増幅され得る。各患者に関しては、増幅遺伝子セグメントは、1つの96ウエルプレート中に存在し得る(96ウエルはすべて、同一試料を含有する)。64人の患者の各々についてプレートが調製される。96ピンデバイスを用いることにより、すべての試料が8×12cm膜上にスポットされ得る。サブアレイは、各患者から1ずつ、64個の試料を含有し得る。96サブアレイが同一である場合、ドットスパンは1mm2であり、サブアレイ間に1mmの間隙が存在し得る。
が行われることが当業者には予測されよう。したがって本発明の範囲を限定するのは、添付の特許請求の範囲のみである。
(ヒト細胞のcDNAライブラリーからの配列番号1および配列番号16の単離)
標準PCR、ハイブリダイゼーション配列記号分析による配列決定、およびサンガー配列決定技術を用いて、成人脳から調製されたヒトcDNAライブラリー(Clontech)から、配列番号1の新規の核酸を得た。配列番号16の新規の核酸を、標準PCR、ハイブリダイゼーション配列記号分析による配列決定、およびサンガー配列決定技術を用いて、胎児皮膚から調製されたヒトcDNAライブラリー(Invitrogen)から得た。挿入物と側面を接するベクター配列に特異的なプライマーを用いて、PCRで、ライブラリーの挿入物を増幅した。これらの試料をナイロン膜上にスポットして、オリゴヌクレオチドプローブで尋問して、配列記号を得た。クローンを類似または同一配列の群に集めて、ゲル配列決定のために各群から単一代表クローンを選択した。次に増幅挿入物の5’配列を、典型的サンガー配列決定プロトコルで逆M13配列決定プライマーを用いて推定した。PCR産物を精製し、蛍光染料ターミネーターサイクル配列決定に付した。377Applied Biosystems(ABI)シーケンサーを用いて、1回ゲル配列決定を実行した。これらの挿入物を、このライブラリから以前には得られなかった、そして公的データベースで以前に報告されていない新規の配列として同定した。これらの配列を、添付の配列表では配列番号1および配列番号16と呼ぶ。
(配列番号8の集合)
上記の実施例1に記載した方法により種々のcDNAライブラリーから得た、そしていくつかの場合には1つ以上の公的データベースから得た配列から、本発明の新規の核酸(配列番号8)をアセンブルした。最終配列は、シードとしてEST配列を用いてアセンブルした。次に帰納的アルゴリズムを用いて、この集合に属する異なるデータベース(すなわち、EST配列、dbESTバージョン119、gb pri119およびUniGeneバージョン119を含有するHyseqのデータベース)からの付加的配列を取り出すことにより、シードを拡大集団に広げた。集合を拡大する上記のデータベースからの付加的配列がなくなった時点で、アルゴリズムを終結させた。集合中への構成成分配列の含入は、300より大きいBLASTスコアおよび95%より大きい同一性%を有する拡大集合に対するBLASTNヒットに基づいた。
(配列番号12、配列番号17および配列番号26の集合)
上記の実施例1に記載した方法によりcDNAライブラリーから得た、そしていくつかの場合には1つまたは複数の公的データベースから得た配列から、本発明の新規の核酸(配列番号12,17および26)をアセンブルした。最終配列は、シードとしてEST配列を用いてアセンブルした。次に帰納的アルゴリズムを用いて、この集合に属する異なるデータベース(すなわち、EST配列、dbESTバージョン124、gb pri124およびUniGeneバージョン124を含有するHyseqのデータベース)からの付加的配列を取り出すことにより、シードを拡大集団に広げた。集合を拡大する上記のデータベースからの付加的配列がなくなった時点で、アルゴリズムを終結させた。集合中への構成成分配列の含入は、300より大きいBLASTスコアおよび95%より大きい同一性%を有する拡大集合に対するBLASTNヒットに基づいた。
ョン124、gb pri124、UniGeneバージョン124、Genpeptリリース124)。編集過程に用いられ得たその他のコンピュータープログラムは、phredPhrapおよびConsed(ワシントン大学)、ならびにed−ready、ed−extおよびcg−zip−2(Hyseq, Inc.)であった。全長ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号12〜13、配列番号17〜18および配列番号26〜27として配列表に示す。
(配列番号2の集合)
上記の実施例1に記載した方法により、cDNAライブラリーから得た配列番号1から、本発明の新規の核酸(配列番号2)をアセンブルした。トランスポゾン配列決定技術を用いて、配列番号1を含有する種々のクローンを、それらを完全な形でさらに配列決定した。次にその結果生じた重複配列をアセンブルして、配列番号2の全長配列を得た。
(A.可溶性幹細胞増殖因子様ポリヌクレオチド(配列番号2、配列番号8、配列番号12、配列番号17または配列番号26)およびポリペプチド(配列番号3、配列番号9、配列番号13、配列番号18または配列番号27)のクローニングおよび発現)
可溶性幹細胞増殖因子様ポリペプチドを発現するために、全長幹細胞増殖因子様DNAを、Marathon−ready cDNAライブラリ(Clontech)からPCR増幅する。一次PCR産物を、繰り込み(nested)PCRプライマーを用いてさらに増幅し、これは、適切な細胞株中で発現されると、可溶性幹細胞増殖因子様ポリペプチドを生じる。二次PCRの生成物(配列番号2、配列番号8、配列番号12、配列番号17および配列番号26)を、EcoRI部位およびXhoI部位間のpCDNA3.1/Myc−His(+)A中でクローン化する。可溶性幹細胞増殖因子様ポリペプチドをコードするプラスミドおよび対照ベクターを、FuGENE−6トランスフェクション試薬(Roche)を用いてCHO細胞中にトランスフェクトする。培地、細胞溶解物および不溶性細胞破砕屑分画を、SDS−PAGEにより、その後、抗myc抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析する。
幹細胞増殖因子様タンパク質は、昆虫細胞中で以下のように発現される:
幹細胞増殖因子様遺伝子(配列番号2、8、12、17または26)を、PCRにより、pIB/V5−His TOPO TAクローニングベクター(Invitrogen
Corporation)中にクローン化する。ベクター中の幹細胞増殖因子様DNAを、Myc/Hisタグを用いて、またはいかなるタグも用いずに、生成する。昆虫細胞(High Five TM, Invitrogen)を、InsectSelect
TMSystem (Invitrogen)を用いて、タグを含有する幹細胞増殖因子様プラスミドDNAでトランスフェクトする。幹細胞増殖因子様タンパク質の発現を、一過性発現により確定する。発現幹細胞増殖因子様タンパク質を含有する培地をSDS−PAGE上で分離し、ウエスタンブロット分析により幹細胞増殖因子様タンパク質を同定する。幹細胞増殖因子様タンパク質の大規模生産のためには、Ultimate InsectSerum−Free培地(Invitrogen)を含有するフラスコ中で、耐性細胞を展開させる。細胞を27℃で4日間、〜100mphで振盪する。精製用のタンパク質を含有する状態調節培地を、遠心分離により収集する。
成熟幹細胞増殖因子様遺伝子(配列番号2、8、12、17または26)を、Invitrogenからの発現ベクター(PCR T7/NT−TOPO)中でクローン化する。その結果生じたプラスミドを大腸菌BL−21(DE3)pLys株中で発現させる。細胞を、アンピシリン(100 g/ml)を含有するLBブロス中で37℃で増殖させる。次に、IPTG(最終濃度1mM)を用いて幹細胞増殖因子様タンパク質の発現を誘導し、細胞をさらに4時間増殖させて、収穫する。SDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングによる幹細胞増殖因子様産生の分析を、上記と同様に実行する。
Acetate1000mL滅菌フィルターユニット)に通して、粒状物質を除去する。その結果生じた溶液を10倍濃縮して、同時に、10kDaの膜カットオフサイズを有するダイアフィルトレーションカートリッジ(diafiltration cartridge)を用いて、20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5で平衡させる。10倍濃縮およびジアフィルトレーション化培地を、20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5で平衡させたNi−NTAカラム上に載せる。300mMのNaClおよび20mMのイミダゾールを含有する20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5でカラムを洗浄することにより、非保持構成成分を除去する。His−タグ化幹細胞増殖因子様タンパク質を同一緩衝液およびイミダゾールの線状勾配(20〜300mM)で溶離する。溶離タンパク質を、上記と同様に同定する。幹細胞増殖因子様を含有するプールした分画を、10kDaの膜カットオフサイズを有するAmicon stircellを用いて、PBS緩衝液で平衡させる。この過程も、イミダゾールの除去を生じる。次に、機能性試験のために、タンパク質をPBS緩衝液中で約10mg/mLに濃縮する。
(一次ヒト細胞中での配列番号2、配列番号8、配列番号12、配列番号17または配列番号26の発現)
適切なMarathonライブラリーからの二次ネスト化PCRの産物または幹細胞増殖因子様ポリペプチドをコードする任意のその他のポリヌクレオチドを、適切な正および逆PCRプライマーを用いて、適切なクローン部位で、MSCVレトロウイルスベクター(Clontech)中でクローン化する。次にこのレトロウイルスベクターを、FUGENE−6トランスフェクション試薬を用いて、パッケージ細胞株中にトランスフェクトして、その中でクローン化された幹細胞増殖因子様DNAを有する適度に大量のレトロウイルスを産生する。レトロウイルス含有上清をパッケージ化した細胞株から調製し、間質性細胞または幹細胞と混合する。レトロウイルス形質導入時に、これらの形質導入細胞は、幹細胞増殖因子様タンパク質を発現し得、これを次に、以下のように分析し得る:
A.液体培養アッセイ:造血性またはその他の起源からの幹細胞は、市販されている。1×104幹細胞を、96ウエルプレート中でプレートする。5〜200ng/mlの精製幹細胞増殖因子様タンパク質またはその他の適切な増殖因子を適切な濃度で幹細胞に付加する。IL−3およびIL−6を、インキュベーションの5日後に添加する。培養を顕微鏡的に観察し、毎日計数する。フローサイトメトリー染色を実施して、細胞系列分化を確定する。配列番号18に対応する配列を有する精製タンパク質を用いて実行された2回の予備実験では、対照と比較して、有意の変化は観察されなかった。
(配列番号1〜2、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16〜17、配列番号19または配列番号26を用いた発現試験)
種々の組織中の配列番号1〜2、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16〜17、配列番号19または配列番号26の発現を、半定量的ポリメラーゼ連鎖反応ベースの技術を用いて分析する。ヒトcDNAライブラリを、目的の組織(成人膀胱、成人脳、成人心臓、成人腎臓、成人リンパ節、成人肝臓、成人肺、成人卵巣、成人胎盤、成人直腸、成人脾臓、成人精巣、骨髄、胸腺、甲状腺、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肝臓−脾臓、胎児皮膚、胎児脳、胎児白血球およびマクロファージ)からの発現遺伝子の供給源として用いる。遺伝子特異的プライマーを用いて、配列番号1〜2、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16〜17、配列番号19または配列番号26の配列の一部分を試料から増幅する。増幅産物をアガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルターに移して、化学結合させる。次に、フィルターを、クレノウポリメラーゼ無作為プライム法を用いて、配列番号1〜2、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16〜17、配列番号19または配列番号26から生成された放射性標識化(33P−dCTP)二本鎖プローブとハイブリダイズさせる。フィルターを洗浄し(高ストリンジェンシー)、数時間、ホスホル画像処理スクリーンを曝露するために用いる。バンドは、特定ライブラリ中の配列番号1〜2、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16〜17、配列番号19または配列番号26配列を含むcDNAの存在を、したがって対応する細胞型または組織中のmRNA発現を示す。
Claims (1)
- 障害を治療するための薬剤であって、
単離されたポリペプチド
を含み、該単離されたポリペプチドは、
(a)配列番号18または配列番号27から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;あるいは
(b)(a)において規定されるアミノ酸配列における1アミノ酸〜10アミノ酸の置換、欠失、または付加により(a)から誘導され、かつ幹細胞増殖因子活性を有する、ポリペプチド;
である、薬剤。
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