CN101378652A

CN101378652A - 生长性和病虫害抵抗性得到提高的植物及其制作方法

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Publication number: CN101378652A
Application number: CNA2007800049251A
Authority: CN
Inventors: 小川健一; 松本雅好; 白石友纪
Original assignee: Gang Shanxian; Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2006-02-09
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2027-02-08
Also published as: EP1992219B1; US20090300797A1; WO2007091634A1; CA2652482A1; EP1992219A1; MX2008010204A; EP1992219A4; CA2652482C; ES2373408T3; BRPI0718438A2; RS52073B; AU2007213040B2; JP5205563B2; AU2007213040A1; US8097770B2; JPWO2007091634A1; ZA200806977B; CN101378652B

Abstract

本发明提供生长性和病虫害抵抗性同时得到提高的转化植物，以及该转化植物的制作方法。发现导入有编码谷胱甘肽结合性质体型果糖－1，6－双磷酸醛缩酶的DNA的转化植物与野生型植物相比，生长性和病虫害抵抗性同时提高。

Description

生长性和病虫害抵抗性得到提高的植物及其制作方法

技术领域

本发明涉及生长性和病虫害抵抗性同时得到提高的植物及其制作方法。

背景技术

以往，农作物的生产率提高一直是基于经验的品种改良或通过使用农药进行病虫害的驱除等来进行的。然而，通过近年来的分子生物学的快速发展，现在已经能够通过转化植物等分子育种的方法来进行生产率高的农作物的开发。作为用于提高农作物生产率的具体技术，可以列举生长促进(生长性的提高)、赋予病虫害抵抗性、赋予应激抵抗性、赋予矮性、开花时期的调节等，除此之外还遍及多个直接或间接与生产率提高相关的技术范围。

作为直接与生产率提高相关的技术，可以列举植物的生长促进(生长性的提高)。例如，在非专利文献1中，报告有使来源于蓝细菌的果糖-1，6/景天庚酮糖-1，7-双磷酸酶过剩表达的烟草的生长性提高。此外，在非专利文献2中，报告有导入转录因子Dof1的拟南芥在低氮环境下生长性提高。

此外，通过对农作物赋予病虫害抵抗性，与遭受病虫害的农作物相比，可以提高生产率。迄今为止报告有导入特定的基因而制作病虫害抵抗性植物的技术。例如，在专利文献1中，公开有通过在正常的活性型G蛋白α亚单位基因进行转化来制作对稻白叶枯病的耐病性被提高的稻的制作方法。此外，在专利文献2中，公开有在编码防卫素蛋白质的基因进行了转化的稻显示出对稻热病和稻白叶枯病的抵抗性。

然而，赋予病虫害抵抗性有时未必导致生产率的提高。例如，已知在植物体构成性地表达包含病虫害抵抗性的应激抵抗性基因时，有损植物体的生长性(参照非专利文献3～5)，记载有为了确保生长性而必需某种努力。

专利文献1:特开2005—192496(公开日:平成17年(2005年)7月21日)

专利文献2:特开2003—88379(公开日:平成15年(2003年)3月25日)

非专利文献1:Miyagawa Y，Tamoi M，Shigeoka S.Overexpression of a cyanobacterial fructose-1，6-/sedoheptulose-1，7-bisphosphatase in tobacco enhances photosynthesis and growth.Nat Biotechnol.2001 Oct；19(10):965-9.

非专利文献2:Yanagisawa S，Akiyama A，Kisaka H，Uchimiya H，Miwa T.Metabolicengineering with Dofltranscription factor in plants:Improved nitrogen assimilation and growth under low-nitrogen conditions.Proc Natl Acad Sci U S A.2004 May 18；101(20):7833-8.Epub 2004 May 10.

非专利文献3:Berrocal-Lobo M，Molina A，Solano R.(2002)Constitutive expression of ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 in Arabidopsis

resistance to several necrotrophic fungi.Plant J.29:23-32.

非专利文献4:Kasuga M，Liu Q，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.(1999)Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a singlestress-inducible transcription factor.NatBiotechnol.17:287-291.

非专利文献5:Tang X，Xie M，Kim YJ，Zhou J，Klessig DF，Martin GB.(1999)Overexpression of Pto activates defense responses and confers broad resistance.Plant Cell.11:15-29.

发明内容

如上所述，促进植物生长(提高生长性)的技术和对植物赋予病虫害抵抗性的技术作为不同的技术而分别进行研究。因此，为了对植物同时赋予生长性提高和病虫害抵抗性，必须应用2种不同的技术。具体而言，例如为了通过转化而同时赋予生长性提高和病虫害抵抗性，必须导入2种不同的基因，然而在这种情况下，也会预想到与分别单独导入时同样的表达型不同时表达的情形。

另一方面，如果发现通过应用一种技术就能够同时赋予生长性提高和病虫害抵抗性的技术，则可以期待不会产生上述那样的问题，对农作物的生产率提高作出大的贡献。然而，这样的技术在过去并没有报告。

本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供生长性和病虫害抵抗性同时提高的转化植物，以及该转化植物的制作方法。

本发明人等在研究植物生长中的活性酶的控制机理的过程中，在拟南芥的培养细胞和分离叶绿体中鉴定了谷胱甘肽结合性的质体型果糖-1，6-双磷酸醛缩酶。从野生型拟南芥中克隆了编码该蛋白质的基因，在大肠杆菌中使重组蛋白质表达，阐明其机理。此外，在该研究过程中还发现，制作导入有上述谷胱甘肽结合性的质体型果糖-1，6-双磷酸醛缩酶基因的转化拟南芥后，该转化植物体与野生型植物体相比生长性提高。进而，还发现该转化植物体的病虫害抵抗性也同时提高，从而完成了本发明。

即，本发明所述的转化植物，其特征在于，导入有编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1，6-双磷酸醛缩酶的DNA，生长性和病虫害抵抗性提高。

此外，本发明所述的生长性和病虫害抵抗性得到提高的植物的制作方法，其特征在于，包含将编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1，6-双磷酸醛缩酶的DNA导入植物的工序。

在本发明所述的转化植物和本发明所述的生长性和病虫害抵抗性得到提高的植物的制作方法中，优选所述编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1，6-双磷酸醛缩酶的DNA选自下述(a)～(d)。

(a)编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；

(b)编码由如下氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，即在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列；

(c)由序列号2所示的碱基序列构成的DNA；

(d)与由序列号2所示的碱基序列构成的DNA在严格条件下进行杂交的DNA。

根据本发明，通过导入一个基因就能够制作植物的生长性和病虫害抵抗性同时得到提高的植物。因此，本发明发挥能够对提高农作物的生产率、提高生物质量生产率作出大贡献的效果。此外，还发挥能够大幅减少化学肥料、农药的使用的效果。

进而，如果作为原料导入到适当的植物中，则可以期待在植物中进行目前在成本方面依赖于原油的各种工业原料、能量的生产。

本发明的另外的目的、特征以及优点通过如下的描述可充分明了。此外，本发明的益处在参照附图的如下说明中明了。

附图说明

图1是表示在FBA1基因的克隆中使用的引物和限制性内切酶位点的图。

图2是表示导入了FBA1基因的转化植物的FBA1mRNA的RT-PCR结果的电泳图像。

图3是表示FBA1基因的T-DNA插入突变体(049B07)的T-DNA插入位置的图。

图4是接种了炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)孢子的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)叶子的照片(上部)和实施锥虫蓝染色后的叶子的照片(下部)。

图5是表示在接种了炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)孢子的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)叶子中，能够侵入的菌数的图表。

图6是对接种了炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)孢子的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)叶子实施锥虫蓝染色，观察侵入菌丝而得的显微镜照片。

图7是接种了炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)孢子的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)接种后第24天的植物体的照片。

图8是接种了西红柿斑叶细菌(Pseudomonas syringae pv.tomato strain DC3000)孢子的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)接种后第5天的植物体的照片。

图9(a)是表示经水杨酸处理的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)的PR1mRNA的RT-PCR结果的电泳图像。

图9(b)是表示经水杨酸处理的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)的PR1的相对mRNA量的图表。

图10(a)是表示经茉莉酮酸处理的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)的PDF1.2mRNA的RT-PCR结果的电泳图像。

图10(b)是表示经茉莉酮酸处理的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)的PDF1.2的相对mRNA量的图表。

图11是野生型拟南芥(Col-1)和导入了FBA1基因的转化拟南芥(35S-FBA1/Col-0)播种后第42天的植物体的照片。

图12是野生型拟南芥(Col-1)、FBA1基因的T-DNA插入突变体(049B07)、导入了FBA1基因的转化拟南芥(35S-FBA1/Col-0)以及分别导入以FBA1的半胱氨酸残基被取代为丙氨酸残基的方式导入突变的4种FBA1基因的转化拟南芥播种后第30天的植物体的照片。

图13是在野生型拟南芥(Col-1)、FBA1基因的T-DNA插入突变体(049B07)、导入了FBA1基因的转化拟南芥(35S-FBA1/Col-0)以及分别导入以FBA1的半胱氨酸残基被取代为丙氨酸残基的方式导入突变的4种FBA1基因的转化拟南芥中，比较各植物的莲座叶的湿重和总莲座叶数而得到的图表。

图14是使野生型拟南芥(Col-0)和导入了FBA1基因的转化拟南芥(35S-FBA1)在与大气相同的CO₂条件以及高CO₂条件下生长时播种后第25天的植物体的照片。

图15是使野生型拟南芥(Col-0)和导入了FBA1基因的转化拟南芥(35S-FBA1)在与大气相同的CO₂条件以及高CO₂条件下生长时分别比较莲座叶的湿重和莲座叶数而得到的图表。

具体实施方式

首先，简单说明本发明完成的背景。

本发明人等示出，在植物中适当浓度的活性酶不仅作为生物合成的基质而且作为在植物发育中的控制因子是必需的，而且可以通过用适当浓度的活性酶处理种子、植物体、叶、根等来改善植物的生长。进而，还示出活性酶的生长改善效果与细胞内的谷胱甘肽相关。作为这种研究中的一环，本发明人等克隆拟南芥(Arabidopsis thaliana)培养细胞中的谷胱甘肽结合性蛋白质，鉴定了其中推定为质体型果糖-1，6-双磷酸醛缩酶的蛋白质(Ito，H.，Iwabuchi，M.and Ogawa，K.(2003)PlantCell Physiol.44，655-660.)。

然后，由野生型拟南芥克隆编码该蛋白质的cDNA，在大肠杆菌中使重组蛋白质表达，尝试使用精制后的该重组蛋白质阐明其机理。

在此，拟南芥至少有7个被认为是编码果糖-1，6-双磷酸醛缩酶(以下记为“FBA”)的基因，预想其中3个以质体为靶。本发明人等对于这3个FBA，将上述谷胱甘肽结合性的FBA命名为“FBA1”、将其他2个命名为“FBA2”和“FBA3”来进行试验。其结果阐明:1)重组FBA1具有FBA的活性；2)重组FBA1被谷胱甘肽控制；3)FBA1、FBA2和FBA3都被二硫苏糖醇或还原型硫氧还蛋白(Trx)抑制，只有FBA1被谷胱甘肽再活化等。此外，由于从FBA1基因的T-DNA插入突变体分离的叶绿体丧失FBA1活性，因此表示FBA1实际上存在于叶绿体中(Ogawa，K.Matsumoto，M.and Ito，H.，(2005)Vol.1，Photosynthesis:Fundamental Aspects to Global Perspectives，edited byVan der Est A and Bruce D.Lawrence，Allen Press，Inc.，468-469.，松本雅好，小川健一，第23次日本植物细胞分子生物学会大会-讨论会纪要集，2005年8月4日发行)。

本发明人等为了进一步研究，在野生型拟南芥中导入FBA1基因，制作转化植物。于是发现，用该FBA1转化的拟南芥的生长性提高而且病虫害抵抗性提高。

以下，对于本发明所述的转化植物及其制作方法进行详细说明。

本发明提供导入有编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1，6-双磷酸醛缩酶(FBA1)的DNA、生长性和病虫害抵抗性提高的转化植物及其制作方法。

在本发明中，“生长性提高”是指，将导入有编码FBA1的DNA的植物与没有导入的植物相比较时，导入有编码FBA1的DNA的植物生长量多，或者生长速度快，更具体而言，是指自然重量或干重重，种子、果实的产量多或干重重，叶的片数多等。

此外，在本发明中，“病虫害抵抗性提高”是指，将导入有编码FBA1的DNA的植物与没有导入的植物相比较时，导入有编码FBA1的DNA的植物对病原真菌、病原细菌延迟或者减轻其病情进展，以及延迟或减轻害虫的虫害。在此，虫害抵抗性是指，产生害虫忌避物质所带来的忌避效果以及产生引诱天敌的物质或对害虫有毒的物质所导致的害虫的驱除或增殖抑制效果。

本发明中所使用的编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1，6-双磷酸醛缩酶(以下记作“FBA1”)的DNA，只要是具有FBA活性、存在于叶绿体等的质体中、被谷胱甘肽抑制活性的DNA即可，其来源的植物没有特别限制。作为叶绿体的FBA活性一直以来用生物化学的方法测定，已知与拟南芥的FBA1同样地显示pH依赖性，此外，在叶绿体基质内进行光合成时起作用的酶的最佳pH可以容易地预想到是适于进行光合成时的pH8，因此以往暗示在多数植物中存在FBA1。应说明的是，FBA活性是指，可逆地催化将果糖-1，6-双磷酸转换为磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸的反应的活性。

作为本发明中所用的编码FBA1的DNA，可以列举来源于拟南芥的FBA1基因。来源于拟南芥的FBA1由序列号1所示的氨基酸序列构成，编码其的基因(全长cDNA)由序列号3所示的碱基序列构成。在序列号3所示的碱基序列中，第145位～第147位是起始密码子，第1318位～第1320位是终止密码子。即，拟南芥FBA1基因在序列号3所示的碱基序列中具有第145位～第1320位作为可读框(ORF)。序列号2所示的碱基序列是拟南芥FBA1基因的ORF碱基序列。应说明的是，作为与拟南芥FBA1基因的碱基序列具有同源性的基因，可以列举在稻的基因组上发现的基因(dbjIBAB55475.1)。

此外，由在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1或多个氨基酸的氨基酸序列构成，且编码具有FBA1活性的蛋白质的DNA也可以很好地用于本发明。如后述的实施例所示，本发明人等证实导入有如下DNA的拟南芥与导入了编码没有突变的FBA1的DNA的拟南芥同样，生长性提高，即，编码在拟南芥FBA1的氨基酸序列(序列号1)中将第72位的半胱氨酸取代为其他氨基酸(在实施例中为丙氨酸)而得到的突变FBA1的DNA，或者编码将第187位的半胱氨酸取代为其他氨基酸(在实施例中为丙氨酸)而得到的突变FBA1的DNA。

在此，“缺失、取代或添加1或多个氨基酸”是指，可以通过部位特异性的突然变异诱发法等公知的突变肽制作法来缺失、取代或添加程度的个数(优选10个以下，更优选7个以下，进一步优选5个以下)的氨基酸缺失、取代或添加。这种突变蛋白质不限于具有通过公知的突变多肽制作法而人为地导入的突变的蛋白质，还可以是将天然存在的蛋白质分离精制而得到的蛋白质。

蛋白质的氨基酸序列中的几个氨基酸，可以不显著影响该蛋白质的结构或功能而容易地被改变，这在该领域中是众所周知的。进而，不仅是人为改变的蛋白质，而且在天然的蛋白质中也存在不会显著改变该蛋白质的结构或功能的突变体，这也是众所周知的。

优选的突变体，具有保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。优选沉默取代、添加和缺失，特别优选保守性取代。它们不会改变本发明所述的多肽的活性。

被看作代表性的保守性取代的是，脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu及Ile中的一个氨基酸取代成别的氨基酸，羟基残基Ser与Thr的交换，酸性残基Asp与Glu的交换，酰胺残基Asn与Gln之间的取代，碱性残基Lys与Arg的交换，以及芳香族残基Phe、Tyr之间的取代。

此外，在本发明中，只要是能够编码具有FBA1活性的蛋白质，也可以使用与由序列号2所示的碱基序列构成的DNA在严格条件下进行杂交的DNA。在这种DNA中，包括例如编码由在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA。

在本发明中，“严格条件”是指，仅在序列之间存在至少90％的同源性、优选至少95％的同源性、最优选至少97％的同源性时发生杂交。具体而言，例如，可以举出在杂交溶液(含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM的NaCl、15mM的柠檬酸三钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt液、10％硫酸葡聚糖以及20μg/ml的变性剪切鲑鱼精子DNA)中在42℃孵育一晚，然后在约65℃在0.1×SSC中洗涤过滤器的条件。

杂交可以通过在Sambrook等、Molecular Cloning，A LaboratoryManual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)中记载的方法等众所周知的方法来进行。通常，温度越高、盐浓度越低就变得越严格(变得难以杂交)，可以获得同源性更高的DNA。

氨基酸序列、碱基序列的同源性可以采用Karlin和Altschul的算法BLAST(Karlin S，Altschul SF，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:2264-2268(1990)；Karlin S，Altschul SF，Proc.Natl.Acad Sci.USA，90:5873-5877(1993))来确定。开发出被称为基于BLAST的算法的BLASTN或BLASTX的程序(Altschul SF，et at.，J.Mol.Biol.，215:403(1990))。

本发明中所使用的编码FBA1的DNA可以来源于基因组DNA，也可以来源于cDNA，还可以是化学合成的DNA。

作为获得本发明中所使用的编码FBA1的DNA的方法，可以列举通过公知技术将编码FBA1的DNA片段分离后进行克隆的方法。例如，制备与编码拟南芥FBA1的DNA的碱基序列的一部分进行特异性杂交的探针，筛选基因组DNA文库、cDNA文库即可。

或者，作为获得本发明中所使用的编码FBA1的DNA的方法，可以列举采用PCR等扩增手段的方法。例如，在编码拟南芥FBA1的cDNA中，从5’侧和3’侧的序列(或其互补序列)中分别制备引物，使用这些引物以基因组DNA(或cDNA)为模板进行PCR等，将夹于两引物之间的DNA区域扩增，由此可以大量地得到本发明中所使用的编码FBA1的DNA片段。

本发明中所使用的DNA，可以以适当植物的组织或细胞作为供给源来获得。作为植物没有特别限制，例如，可以列举与拟南芥近亲的其他十字花科的植物、稻、烟草、油椰子、白杨等。另外，如上所述，暗示多数植物中存在具有FBA1活性的蛋白质，本领域技术人员可以容易地预想到在拟南芥以外的植物中也存在编码FBA1的DNA。

在本发明中，作为将编码FBA1的DNA导入到植物中的方法，可以优选使用构筑重组表达载体而将其导入到植物中的方法，所述重组表达载体是将在编码FBA1的DNA的上游连结在植物细胞中起作用的启动子、在下游连结在植物细胞中起作用的终止子而得到的。

在后述的实施例中，作为在植物细胞中起作用的启动子，使用构成性表达的花椰菜花叶病毒35S启动子，但并不限于此。作为花椰菜花叶病毒35S启动子以外的构成性启动子，可以列举稻的肌动蛋白启动子、玉米的泛蛋白启动子等，这些启动子也可以很好地用于本发明中。

作为构成性启动子以外的启动子，可以列举rbcS启动子、Cab启动子等绿叶组织特异性的启动子或HSP70启动子等诱导性启动子，但并不限于此。此外，直接插入叶绿体的基因组时的启动子可以列举rbcL启动子等，但只要是在叶绿体内起作用的启动子就不限于此。

作为在植物细胞中起作用的终止子，可以列举来源于一氧化氮合成酶(NOS)基因的终止子、来源于花椰菜花叶病毒的终止子等。

在植物转化中使用的重组表达载体，只要是在植物细胞内能够使插入基因表达的就没有特别限制。特别是，向植物体导入载体的方法是使用农杆菌时，优选使用pBI系等双元载体。作为双元载体，可以列举pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。

在本发明中，成为转化对象的植物，是指植物体整体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵状组织等)或植物培养细胞、或者各种形态的植物细胞(例如悬浮培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈合组织等中的任一种。作为转化中所使用的植物，没有特别限制，适当选择能够表达所用的编码FBA1的DNA的植物即可。

在此，使用编码拟南芥FBA1的DNA时，成为转化对象的植物，优选与拟南芥为近亲的十字花科的植物，但并不限于此。例如，报告有烟草、白杨、柠檬等能够用拟南芥的基因制作出转化植物。(Franke R，McMichael CM，Meyer K，Shirley AM，Cusumano JC，Chapple C(2000)Modified lignin in tobacco and poplar plants over-expressing theArabidopsis gene encoding ferulate 5-hydroxylase.Plant J.22:223-234；Pena L，Martin-Trillo，M，Juarez J，Pina，JA，Navarro L，Martinez-Zapater JM.(2001).Constitutive.expression of ArabidopsisLEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their generation time，Nat.Biotechnol.19，263-267)。因此，认为如果将编码拟南芥FBA1的DNA导入到上述那样的植物中，则可以制作出生长性和病虫害抵抗性得到提高的各种转化植物。

向植物细胞导入重组表达载体时，使用本领域技术人员公知的转化方法(例如农杆菌法、基因枪法、聚乙二醇法、电穿孔法等)。例如，使用农杆菌法时，将构筑的植物用表达载体导入到适当的农杆菌(例如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens))中，根据叶片圆盘法(内宫博文著，植物基因操作手册，1990，27-31pp，Koudansha Scientific，东京)等使此株感染于无菌培养叶片，可以得到转化植物。

此外，使用基因枪法时，可以直接使用植物体、植物器官、植物组织自身，还可以制备切片后使用，还可以制备原生质体后使用。可以用基因导入装置(例如PDS-1000(BIO-RAD公司)等)处理如此制备得到的样品。处理条件根据植物或样品而异，通常在450～2000psi左右的压力、4～12cm左右的距离进行。

导入有目标DNA的细胞或植物组织首先用卡那霉素耐受性、潮霉素耐受性等药物耐受性标记选择，接着通过常规方法再生于植物体中。从转化细胞再生植物体可以根据植物细胞种类、通过本领域技术人员公知的方法进行。

确认是否在植物中导入有目标DNA可以通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等进行。例如，从转化植物制备DNA，对导入的DNA设计特异性的引物，进行PCR。然后，对于扩增产物进行琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，通过溴化乙锭等进行染色，检测目标扩增产物，由此可以确认被转化。

一旦获得在基因组中导入有编码FBA1的DNA的转化植物体，就可以由该植物体通过有性生殖或无性生殖而获得后代。此外，还可以从该植物体、其后代或克隆得到繁殖材料(例如种子、原生质体等)，以它们为基础来批量生产目标植物体。

期待如上得到的转化植物与野生型植物相比生长性和病虫害抵抗性提高。生长性的提高可以通过比较同时播种的野生型植物与植物体的大小、重量等来确认。此外，病虫害抵抗性的提高例如后述的实施例所记载的那样，可以通过与野生型植物比较炭疽病菌(Colltotricumhigginsianum)接种后的病情来确认。

本发明所述的转化植物的生长性，拟南芥的情况，即使是极低照度(太阳光的50分之一左右)也可看到10～15％以上的增加，如果将照度成倍提高，则预计增加30～40％左右以上，在太阳光的20分之3左右的光下，预计增加70～80％左右以上。此外，升高CO₂浓度时，与通常的植物相比，显示2～3倍以上的生长性，在优选的条件下显示10～20倍以上的生长性。如此制作出的植物，即使是只有森林地表等的照度的场所也能够生长，可以使植物能生长的面积增加。此外，在高照度下可以大大改善生长性，因此可以期待在田地等开放地中飞跃性地提高农作物的生产率。另一方面，导入到作为工业及能源原料而受关注的植物中时，可以期待大幅降低生产成本，将这些植物作为石油的替代原料。如果导入到纸浆用的树木、例如白杨中，则期待可以有效地植林和育林，可以抑制新的森林砍伐。导入到干燥地的植物中时，可期待可以提高干燥地的植物生产率，可以有助于促进绿化或抑制沙漠化的进行。

本发明所述的转化植物的病虫害抵抗性不仅具有对真菌、而且延及对细菌和害虫的广泛的生物谱。水杨酸、茉莉酮酸是感染病原菌时制成的对病害抵抗性非常重要的信号物质。本发明所述的转化植物具有以往所没有的如下显著特征:水杨酸引起的病害抵抗性应答和茉莉酮酸引起的病害抵抗性应答都得到增强。此外，已知茉莉酮酸是与虫害抵抗性有关的物质(Ozawa，R.，Arimura，G.，Takabayashi，J.，Shimoda，T.，andNishioka，T.(2000)Involvement of j asmonate-and salicylate-relatedsignaling pathways for the production of specific herbivore-inducedvolatiles in plants:Plant Cell Physiol.41:391—398.，高林纯示编集(2003)蛋白质核酸酶Vol48(13)2003年10月号)。因此，本领域技术人员容易理解本发明所述的转化植物对虫害的抵抗性也提高。

[实施例]

以下，用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限于这些实施例。

(1)使用植物

野生型拟南芥使用Columbia(Col-0)。内生谷胱甘肽的量减少的突变体cad2-1(Howden，R.，Andersen，C.R.，Goldsbrough，P.B.andCobbett，C.S.(1995)A cadmium-sensitive，glutathione-deficient mutantof Arabidopsis thaliana.Plant Physiol.107:1067-1073.)使用由Dr.Christopher S.Cobbett(The University of Melbourne，Parkville，Australia)提供的。

植物播种于如下得到的土壤中，即，在正方形的塑料罐(6.5×6.5×5cm)中从底部开始以2:2:1的比例装入蛭石(旭工业，冈山)、吴羽培养土(吴羽园艺培养土、吴羽化学、东京)、蛭石而得到的三层土壤，在生长温度22℃、长日照(16-h明/8-h暗)或短日照(10-h明/14-h暗)的条件下使其生长。

(2)FBA1基因的克隆、突变FBA1基因的制作及FBA1过剩表达转化植物的制作

从4周龄的拟南芥野生型Columbia(Col-0)中分离出总RNA，使用Prostar first strand RT-PCR试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，U.S.A)进行RT-PCR(模板RNA量5.0μg)，制作cDNA。

如图1所示，使用基于FBA1的cDNA序列(序列号3)设计的下述特异性引物，将全长cDNA作为2个片段通过PCR进行扩增，将各片段TA-克隆到pGEM-T载体(Promega，Madison，WI，USA)。

1F-1:5’-GGATCCTATGGCGTCTGCTAG-3’(序列号4)

1R-1:5’-ATCTGCAACGGTCTCGGGAGA-3’(序列号5)

1F-2:5’-GTGTGGTCCGAGGTGTTCTTCT-3’(序列号6)

1R-2:5’-GAGCTCGAGTAGGTGTAACCCTTG-3’(序列号7)

将2个片段在Bstp I位点融合，构建含有全长cDNA的载体(pGEM-FBA1)。为了制作转化植物，用限制性内切酶BamH I和SacI处理pGEM-FBA1后，将片段导入到pBI121载体中。

此外，还制作用于使将存在于FBA1蛋白质中的4个半胱氨酸残基分别取代为丙氨酸残基的突变型FBA1蛋白质(fba1C72A，fba1C128A，fba1C156A，fba1C187A)表达的构造体。在用于制作上述pGEM-FBA1的2个cDNA片段中含有BamH I-Bstp I片段的构造体中，4个半胱氨酸残基都被编码。于是，首先，用引物pGEM-del-Apa I与引物SP6的组合进行PCR，将pGEM载体失去多克隆位点的片段进行扩增。另一方面，用引物Ald-C72A、Ald-C128A、Ald-C156A或Ald-C187A与引物T7的组合进行PCR，得到导入了部位特异性变异的片段。PCR在如下条件下进行:95℃ 5分钟一次循环，94℃ 30秒、60℃ 1分钟、72℃ 1分钟30次循环。

T7:5’-CCGCTGAGCAATAACTAGC-3’(序列号8)

SP6:5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAT-3’(序列号9)

pGEM-del-Apa I:5’-TCACTATAGGGCGAATTGGTACCGA-3’(序列号10)

Ald-C72A:5’-AATGCAACCGCTGGGAAGAGG-3’(序列号11)

Ald-C128A:5’-TTTGTCGATGCCTTGCGCGATG-3’(序列号12)

Ald-C156A:5’-GTCTTGGGCCCAAGGCTTGG-3’(序列号13)

Ald-C187A:5’-AGTGTTCCCGCCGGTCCTTCA-3’(序列号14)

混合2个PCR产物各0.5μl，热变性后进行慢冷(94℃ 10分钟、37℃ 15分钟、4℃ 35分钟)，加入LA-Taq(TAKARA BIO Inc.，Tokyo，Japan)0.5μl，在72℃处理3分钟。进而，加入引物T7(10μM)和引物SP6(10μM)，进行94℃ 30秒、57℃ 1分钟、72℃ 1分钟10次循环的PCR。用限制性内切酶Aap I和BamH I消化后，在pBluscript SK载体上进行亚克隆。亚克隆后，将BamH I和Bstp I的消化片段与另一方的cDNA片段(Bstp I-Sac I片段)融合，导入到pBI121的表达载体中。

使用农杆菌法(Clough，S.J.and Bent，A.F.(1998)Floral dip:Asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J.16:725-743.)，将由上述制成的各pBI121表达载体导入Col-0和cad2-1，制作转化植物。

具体而言，用作为选拔标记的含有卡那霉素的琼脂培养基(1/2倍浓度的MS培养基)反复选拔，从所有种子在装有卡那霉素的培养基上能够生长的阶段(性状不再分离的后代)开始，通过RT-PCR解析来确认导入基因的表达量，确认转化植物的制作。RT-PCR是如下进行的，即，用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN，Valencia，CA，USA)从3片4周龄转化拟南芥的熟叶中提取总RNA，用Prostar first Strand RT-PCR Kit(Stratagene，La，jolla，CA，USA)进行cDNA的制作，然后在premix EX-taq(TaKaRa，Otsu，Shiga，Japan)7.5μl、FBA1-F引物(1.33μM)2μl、FBA1-R引物(1.33μM)2μl、cDNA模板(0.025μg)2μl、H₂O 1.5μl的反应液中进行26次循环(94℃ 30秒、58℃ 60秒、72℃ 60秒)。作为对照，使用可看到构成性表达的Tubulin基因。Tubulin的RT-PCR是如下进行的，使用Tublin-F和Tublin-R的引物对，反应液与上述相同，进行22次循环(94℃ 30秒、58℃ 60秒、72℃ 60秒)。通过1.2％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物，用Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Hachioji，Japan)进行定量。

FBA1-F:5’-TCTGCTAGCTTGGTTAAGCCTAAC-3’(序列号15)

FBA1-R:5’-GGCATCGCGCAAGCAATCGACAAA-3’(序列号16)

Tubulin-F:5’-GTCCAGTGTCTGTGATATTGCAC-3’(序列号17)

Tubulin-R:5’-GCTTACGAATCCGAGGGTGC-3’(序列号18)

将电泳结果示于图2中。Tubulin是在本生长条件下可看到构成性表达的对照基因。由图2可知，35S-FBA1、35S-fba1C72A、35S-fba1C128A、35S-fba1C156A和35S-fba1C187A与野生型(Col-0)相比，FBA1 mRNA的量增加。同样地，可确认35S-FBA1/cad2-1与cad2-1相比，FBA1 mRNA的量增加。

应说明的是，在本实施例中使用cDNA构建表达载体，但是本领域技术人员容易理解如下内容:即使从基因组DNA克隆含有内含子的FBA1基因，构建表达载体，导入到植物中也可以获得转化植物体。

(3)FBA1基因的T-DNA插入突变体

从GABI-Kat(Germany http://www.gabi-kat.de/db)购入在拟南芥的FBA1基因中插入有T-DNA的突变体(GK Line ID 049B07)的种子(异种状态)。将T-DNA的插入位置示于图3。如图3所示，对T-DNA和FBA1设计下述的特异性引物，通过以基因组DNA为模板的PCR来选拔同种的突变体。

T-1:5’-CTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAA-3’(序列号19)

F-1:5’-GGGGAATAAAATGGTAAAGAGAAGGAGGC-3’(序列号20)

F-2:5’-GCAATAATCAGAGAATCTCACTCT-3’(序列号21)

具体顺序如下。

将上述从GABI-Kat购入的种子播种，切取播种2周后的叶2片，放入1.5ml的eppentube中用乳钵研磨。装入100μl的DNA提取液(200mM Tris/HCl pH7.5，250mM NaCl，2.5mM EDTA pH8.0，0.5％SDS)，充分搅拌。以10080×g离心10分钟后，将80μl上清装入新的1.5ml的eppentube中，加入60μl的异丙醇后进行搅拌。以10080×g离心10分钟后，废弃上清，加入200μl的70％乙醇，充分搅拌。以10080×g离心5分钟后，废弃上清，进行真空干燥(TOMY Micro Vac)15分钟。用20μl的TE溶解，以10080×g离心10分钟后，将上清用于PCR的模板。PCR反应液的组成为25mM MgCl₂ 2μl、10×PCR缓冲液2μl、10mM dNTP 0.5μl、Sigma Taq DNA聚合酶0.15μl、模板DNA溶液1.0μl、1.0μl的引物1、1.0μl的引物2、H₂O 12.35μl，进行25次循环(94℃ 30秒、60℃ 60秒、72℃ 120秒)。引物的组合用F-1与F-2以及F-1与T-1两种来进行。PCR后，采用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，将仅在引物F-1与T-1的组合看到带的个体作为同种的FBA1的T-DNA插入突变体而获得。应说明的是，该FBA1的T-DNA插入突变体以下记作“049B07”。

(4)炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)的接种实验1

作为供试菌使用以十字花科植物为宿主的炭疽病菌:Colltotricumhigginsianum。将菌在PDA斜面培养基上于22℃培养10天后，用接种环刮取孢子，用灭菌水进行悬浮并调整浓度到1×10⁵spore/ml。

对于每一片4周龄的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)叶子，在两处滴加孢子悬浮液10μl。将瓶置于托盘中，为了保持充分的湿度而用透明的塑料制覆盖物盖上盖，在22℃、长日照的条件下孵育6天。

接种后第6天对接种了菌的叶子拍照，为了将通过感染而坏死的细胞染色，根据Koch and Slusarenko的方法(Koch，E.and Slusarenko，A.(1990)Arabidopsis is susceptible to infection by a downy mildew fungus.Plant Cell 2，437-445)进行锥虫蓝染色。即，将接种有菌的叶子沉淀于用乙醇稀释1/2的Lactophenol-trypaneblue溶液(在10ml水中加入10ml乳酸、10ml甘油、10g苯酚、10mg锥虫蓝)，沸腾3分钟。然后，用2.5g/ml的水合氯醛(Wako，Tokyo，Japan)进行洗涤。

结果示于图4中。图4的上部是接种了菌的叶子的照片，下部是接种了菌的叶子锥虫蓝染色后的照片。箭头表示接种部位。由图4可知，Col-0(野生型)的接种部位坏死(通过锥虫蓝染色被染色成深蓝色)，而在FBA1的转化植物(35S-FBA1/Col-0)中几乎没有看到坏死。另一方面，对于在cad2-1中导入了FBA1的35S-FBA1/cad2-1来说，没有导入35S-FBA1的效果，在接种部位看到坏死。

进行上述的锥虫蓝染色后，用光学显微镜计算孢子数和有侵入菌丝的孢子数。结果示于图5中。可知，35S-FBA1/Col-0与其他系统相比侵入菌丝的数量少。

进而，进行上述的锥虫蓝染色后，用光学显微镜(×250)拍摄侵入菌丝。其图像示于图6中。可知，35S-FBA1/Col-0与其他系统相比侵入菌丝短且少。

(5)炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)的接种实验2

用与上述(4)相同的顺序，制备炭疽病菌:Colltotricumhigginsianum的孢子悬浮液(浓度:1×10²spore/ml)。

对4周龄的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)进行喷雾接种。将瓶置于托盘中，为了保持充分的湿度而用透明的塑料制覆盖物盖上盖，在22、长日照条件下孵育24天。

图7表示接种后第24天各系统的植物体的照片。由图7可知，在35S-FBA1/Col-0中，只有开始用喷雾进行感染的叶子出现坏死，但是新的叶子形成而并没有发生进一步的感染。另一方面确认，在其他系统的植物体中，几乎全部叶子出现坏死，感染也扩展到新形成的叶子。

(6)西红柿斑叶细菌(Pseudomonas syringae pv.tomato strain DC3000)的接种实验

作为植物病原细菌，使用已知感染于拟南芥的西红柿斑叶细菌病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato strain DC3000)，研究对于植物病原细菌的抵抗性。从甘油贮存菌(-80℃)划线到KB琼脂培养基(示蛋白胨No.320g；K₂HPO₄ 1.4g；MgSO₄·7H₂O 0.4g；甘油10ml/L)，在28℃培养2天，用细胞刮器(Asahi Techno Glass，Funahashi，Chiba，Japan)刮取菌，用适量的10mMMgCl₂溶液进行悬浮，将浓度调整为10⁸cfu/ml。用该悬浮液对4周龄的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)进行喷雾接种。在22℃、长日照条件下进行孵育。

结果示于图8中。由图8可知，35S-FBA1/Col-0与其他系统相比，坏死的叶子明显少。对于被导入的植物方面(宿主植物)，与导入于Col-0的情况相比，导入于cad2-1的情况的效果弱，因此可以说导入于谷胱甘肽合成能力高的系统的植物的情况，其FBA1的导入效果高。

(7)水杨酸处理

对4周龄的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)喷雾处理1mM的水杨酸，为了保持湿度而用透明的塑料制覆盖物盖上盖。在此，水杨酸是病原菌(特别是细菌)感染于植物时在植物体内合成的用于病害抵抗反应的信号物质，PR-1是通过水杨酸的信号而抑制表达的抗细菌性蛋白质。

喷雾处理后，在第6小时、第12小时、第24小时从各植物体采取3片叶，用液氮固定。精制总RNA，统一18S rRNA的量，制作cDNA，然后制备premix EX-taq(TaKaRa，Shiga，Japan)7.5μl、PR1-F引物(1.33μM)2μl、PR1-R引物(1.33μM)2μl、cDNA模板(0.025μg)2μl、H₂O 1.5μl的反应液，以30次循环(94℃ 30秒、58℃ 60秒、72℃ 60秒)进行RT-PCR。

所用的引物如下所示。

PR1-F:5’-CAGCCCCAAGACTACTTCAATGC-3’(序列号22)

PR1-R:5’-GGTCGTTCAATAAGAATGACAGACG-3’(序列号23)

将PCR产物供于采用1.2％琼脂糖凝胶的电泳，用Bio-Analyzer(Agilent Technologies，Germany)进行定量。结果示于图9(a)和图9(b)中。图9(a)表示电泳的结果，图9(b)表示PR1的相对mRNA量。由图9(a)和图9(b)可知，35S-FBA1/Col-0与其他系统相比，即使经水杨酸处理24小时后，仍然高度维持PR-1基因的表达。对于被导入的植物方面(宿主植物)，与导入于Col-0的情况相比，导入于cad2-1的情况的效果弱，因此可以说导入于谷胱甘肽合成能力高的系统的植物的情况，其FBA1的导入效果高。

(8)茉莉酮酸处理

对4周龄的拟南芥(Col-0，35S-FBA1/Col-0，cad2-1，35S-FBA1/cad2-1，049B07)喷雾处理50μM的水茉莉酮酸，为了保持湿度而用透明的塑料制覆盖物盖上盖。在此，茉莉酮酸作为病原菌(特别是真菌)感染于植物或者遭受昆虫的虫害时在植物体内合成的用于病虫害抵抗反应的信号物质是已知的，PDF1.2是通过茉莉酮酸的信号而抑制表达的抗菌蛋白质。

喷雾处理后，在第6小时、第12小时、第24小时从各植物体上采取3片叶，用液氮固定。精制RNA，统一18S rRNA的量，制作cDNA，然后制备premix EX-taq(TaKaRa，Shiga，Japan)7.5μl、PDF1.2-F引物(1.33μM)2μl、.PDF1.2-R引物(1.33μM)2μl、cDNA模板(0.025μg)2μl、H₂O 1.5μl的反应液，以27次循环(94℃ 30秒、58℃ 60秒、72℃ 60秒)进行RT-PCR。

用于PDF1.2扩增的引物如下所示。

PDF1.2-F:5’-TAAGTTTGCTTCCATCATCACCC-3’(序列号24)

PDF1.2-R:5’-GTGCTGGGAAGACATAGTTGCAT-3’(序列号25)

与上述(5)相同，将PCR产物供于采用1.2％琼脂糖凝胶的电泳，用Bio-Analyzer进行定量。将结果示于图10(a)和图10(b)中。图10(a)表示电泳的结果，图10(b)表示PR1的相对mRNA量。由图10(a)和图10(b)可知，35S-FBA1/Col-0与其他系统相比，经茉莉酮酸处理24小时后的PDF1.2基因表达高。对于被导入的植物方面(宿主植物)，与导入于Col-0的情况相比，导入于cad2-1的情况的效果弱，因此可以说导入于谷胱甘肽合成能力高的系统的植物的情况，其FBA1的导入效果高。

(9)植物体的生长性

9-1转化植物(35S-FBA1/Col-0)与野生型植物(Col-0)的比较

导入了FBA1基因的转化拟南芥(35S-FBA1/Col-0)与野生型(Col-0)相比，可观察到生长性大幅提高。

图11是比较6周龄的Col-0和35S-FBA1/Col-0的照片。明显可知35S-FBA1/Col-0大。

9-2导入有氨基酸取代FBA1的转化植物的生长性

为了明确FBA1的氨基酸序列(序列号1)中的半胱氨酸残基的重要性，按上述(2)中记载的顺序制作表达各半胱氨酸残基取代为丙氨酸的酶的拟南芥(35S-fba1C72A、35S-fba1C128A、35S-fba1C156A、35S-fba1C187A)(例如，C72A表示导入了表达将序列号1的第72位的半胱氨酸取代为丙氨酸而得到的FBA1酶的构造体)。

图12是播种后第30天的各植物体的照片。此外，在图13中示出比较各植物的莲座叶的湿重和总莲座叶数而得到的图表。由图12和图13可知，35S-fba1C72A和35S-fba1C187A与35S-FBA1/Col-0相同，与野生型(Col-0)相比，生长性提高。另一方面，35S-fba1C128A和35S-fba1C156A虽然根据生长照度而效果不同，但是显示与野生型(Col-0)同等程度的生长性。由该结果启示，对FBA1功能发挥重要作用的半胱氨酸可能是位于序列号1的第128位和第156位的半胱氨酸。另一方面，第72位和第187位的半胱氨酸即使取代成其他氨基酸，也使植物的生长性提高。因此证实，即使在FBA1的氨基酸序列中导入编码原来的氨基酸被取代成其他氨基酸的突变FBA1的基因，也能够使植物的生长性提高。

此外，由图13可知，由于生长性的提高伴随着莲座叶的片数增加，因此显示，通过导入FBA1基因，不仅生长量增加，而且生长速度也加快。

9-3 CO₂固定能力提高的确认

为了研究35S-FBA1植物潜在的CO₂固定能力是否提高，将CO₂浓度控制在0.3％，与在大气CO₂浓度生长的情况相比较。结果示于图14和图15中。如图14和图15所示，即使在野生型(Col-0)中也可看到伴随着CO₂浓度升高而生长性提高，但是35S-FBA1植物可看到伴随着CO₂浓度升高而生长性显著提高。由该结果显示，通过导入FBA1基因可以显著提高CO₂的固定能力。

应说明的是，用于实施发明的具体实施方式中进行的具体实施方式或实施例终究是阐明本发明的技术内容的，不应狭义地解释为仅限于这样的具体例，可以在本发明的根本宗旨和所要求保护的范围内进行各种变更后实施。

此外，在本说明书中记载的学术文献和专利文献都是在本说明书中作为参考而援引的。

产业上的可利用性

本发明提供生长性和病虫害抵抗性同时得到提高的植物，期待在农林业中的应用。

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