JP4418242B2 - イネ白葉枯病に対し耐病性が高められたイネおよびその作出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、野生型と比較してイネ白葉枯病に対し耐病性が高められたイネの作出に関し、イネの品種改良の分野に属する。
イネ白葉枯病は、Xanthomonas oryzae pv. oryzaeという細菌によって引起されるイネの最重要病害の一つである。イネ白葉枯病はアジアにおいてイネに最も甚大な被害を与える病害として知られているが、現在ではアジアのみならずアフリカ、北米、南米、オーストラリアなど世界のイネ栽培地域のほとんどで発生が報告されている。
我が国では西南暖地における重要病害であるが、昭和40年をピークとして発生は減少してきている。しかしながら、平成5年には、異常気象により多発生し、全国的に多大な被害を与えた。現在の栽培品種のほとんどが我が国のイネ白葉枯病菌のレースのすべてに感受性を示すことから、今後もイネ白葉枯病に対する警戒の必要性が高いといえる。しかしながら、イネ白葉枯病菌を防除するための有効な農薬がないのが現状である。そこで、品種改良により、イネ白葉枯病に対する高い耐病性を持つイネを作出する必要性がある。
なお、本発明に関連する先行技術文献情報を以下に記す。
Suharsono et al., 2002, Proc.Natl.Acad.Sci., 99:13307-13312
Suharsono et al., 2002, Proc.Natl.Acad.Sci., 99:13307-13312
本発明は、上記のような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、品種改良により、イネ白葉枯病に対する高い耐病性を持つイネを作出することにある。
従来、作物植物新品種の育成は交配育種あるいは突然変異などを基盤に行なわれてきた。しかし、交配や突然変異による方法では、基本的に個体差や偶然に期待せざるを得ないため、品種改良の成功率が必ずしも高くなく、目的の品種を得るために多大な費用と時間を要した。目的の品種を得るための、より確実性の高い方法としては、遺伝子工学的手法による品種改良が有効である。
いもち病に関しては、イネ3量体Gタンパク質αサブユニット遺伝子を欠失した変異体d1が、その野生型に比較して、いもち病抵抗性が弱くなっていることが示されている（非特許文献１；Suharsono et al.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci., 99:13307-13312）。本発明者等は、3量体Gタンパク質αサブユニット遺伝子が、イネ白葉枯病に対する耐病性においても機能する可能性があると考え、恒常的に活性化したGタンパク質αサブユニット遺伝子でイネを形質転換し、その効果を検証した。その結果、形質転換による恒常的に活性化したGタンパク質αサブユニットの発現によって、プロベナゾール誘導性タンパク質の発現が誘導され、これにより野生型イネと比較して顕著にイネ白葉枯病に対する耐病性が高まった。即ち、本発明者等は、Gタンパク質αサブユニットが、糸状菌による病害であるいもち病に対してのみならず、これと感染様式の異なるバクテリア病害の白葉枯病に対しても、耐病性を高める機能を有することを見出し、本発明を完成した。
従って、本発明は、恒常的活性型のGタンパク質αサブユニット遺伝子の導入によりイネ白葉枯病に対し耐病性が高められたイネおよびその作出方法に関し、より詳しくは、下記発明に関する。
（１）恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAで形質転換され、野生型と比較してイネ白葉枯病に対する耐病性が高められたイネ植物体。
（２）恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAが下記（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される、（１）に記載のイネ植物体。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（３）（１）または（２）に記載の植物体の繁殖材料。
（４）恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAでイネを形質転換することを特徴とする、野生型と比較してイネ白葉枯病に対する耐病性が高められたイネ植物体の作出方法。
（５）恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAが下記（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される、（４）に記載の方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（１）恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAで形質転換され、野生型と比較してイネ白葉枯病に対する耐病性が高められたイネ植物体。
（２）恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAが下記（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される、（１）に記載のイネ植物体。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（３）（１）または（２）に記載の植物体の繁殖材料。
（４）恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAでイネを形質転換することを特徴とする、野生型と比較してイネ白葉枯病に対する耐病性が高められたイネ植物体の作出方法。
（５）恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAが下記（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される、（４）に記載の方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
本発明により、恒常的活性型のGタンパク質αサブユニット遺伝子の導入によりイネ白葉枯病に対し耐病性が高められたイネおよびその作出方法が提供された。本発明によれば、イネに対するイネ白葉枯病菌の感染を顕著に軽減することができ、病害によるイネ収穫量の減収を回避させることが可能である。
本発明は、恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAで形質転換され、野生型と比較してイネ白葉枯病に対する耐病性が高められたイネおよびその作出方法を提供する。
本発明のイネの作出に用いる、恒常的活性型Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAとしては、その由来する植物に特に制限はない。好ましくは、イネ科植物由来であり、最も好ましくはイネ由来である。
恒常的活性型Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAは、遺伝子工学的手法によって、天然型のGタンパク質αサブユニットをコードするDNAを改変することにより調製することができる。
恒常的に活性化された3量体Gタンパク質αサブユニットは、GTP結合能を保持しているが、GTP加水分解活性を喪失している（Vervoort er al., FEBS letters, 1997, 404:153-158）。従って、調製されたGタンパク質αサブユニットが、恒常的に活性化しているか否かは、GTP結合能およびGTP加水分解活性を検出することにより判定することが可能である。
イネ由来の恒常的活性型Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAとしては、イネ由来の天然型のGタンパク質αサブユニット（GeneBank D38232）の223位のグルタミンをロイシンに置換した変異体（QL）をコードするDNAを例示することができる。この変異体のアミノ酸配列を配列番号：２に、該変異体をコードするDNAの塩基配列を配列番号：１に示す。
また、本発明においては、恒常的活性型Gタンパク質αサブユニットをコードしうる限り、恒常的活性型Gタンパク質αサブユニットをコードする配列番号：１に記載のDNAと塩基配列が類似しており、該DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを用いることもできる。
このようなDNAには、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAが含まれる。アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer W, Fritz H-J, Methods Enzymol 154: 350〈1987〉）が挙げられる。
また、このようなDNAは、ハイブリダイゼーション技術（Southern EM, J. Mol. Biol., 98: 503〈1975〉）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki RK, et al., Science, 230: 1350〈1985〉; Saiki RK, et al., Science, 239: 487〈1988〉）を利用して調製することもできる。例えば、天然型のGタンパク質αサブユニット遺伝子の塩基配列（GeneBank D38232）もしくはその一部をプローブとして、また天然型Gタンパク質αサブユニット遺伝子（GeneBank D38232）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からGタンパク質αサブユニット遺伝子を単離し、単離した遺伝子を基に、上記した遺伝子改変方法により恒常的活性型タンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。このように、ハイブリダイゼーション技術やPCR技術を利用して単離し得る、恒常的活性型Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAもまた、本発明において利用可能である。
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、6M 尿素、0.4％ SDS、0.5×SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4％ SDS、0.1×SSCの条件下では、より相同性の高いDNAを単離できることが期待される。ここで高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば、96,97,98,99％以上）の配列の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268〈1990〉; Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877〈1993〉）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., 215: 403〈1990〉）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
本発明の恒常的活性型Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAは、ゲノムDNAに由来しても、cDNAに由来してもよく、また化学合成DNAであってもよい。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。
ゲノムDNAは、例えば、イネ品種からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作製し、これを展開して、Gタンパク質αサブユニットをコードするDNA（例えば、GeneBank D38232）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、Gタンパク質αサブユニットをコードするDNA（例えば、GeneBank D38232）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したPCRを行って調製することも可能である。cDNAは、例えば、イネ品種から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAPなどのベクターに挿入してcDNAライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またPCRを行うことにより調製できる。
恒常的活性型Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAを利用して形質転換イネを作製するには、該DNAが挿入されたベクターをイネ細胞に導入し、これにより得られた形質転換イネ細胞を再生させればよい。
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta SK: In Gene Transfer To Plants （Potrykus I and Spangenberg, Eds） pp.66-74〈1995〉）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki S, et al., Plant Physiol., 100: 1503〈1992〉）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P, et al., Biotechnology 9: 957〈1991〉）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を細胞へ導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y, et al., Plant J., 6: 271〈1994〉）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。
ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が一旦得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、プロトプラストなど）を得て、それらを基に目的の植物体を量産することも可能である。
これにより得られたイネ植物体は、野生型植物体と比較して、イネ白葉枯病に対して高い耐病性を有することが期待される。イネ白葉枯病に対して耐病性が高められているか否かは、実施例に記載のように、イネ白葉枯病菌の接種後の発病率により検証することができる。
イネ3量体Gタンパク質αサブユニット遺伝子の一部を欠失した変異体、大黒d1（DK22）は、矮性でかつ短粒を示す。イネ3量体Gタンパク質αサブユニット遺伝子を欠失した変異体d1は、その野生型に比較して、いもち病菌抵抗性が弱くなっていることが示されている（Suharsono et al., 2002, Proc.Natl.Acad.Sci., 99:13307-13312）。本実施例では、このd1及びその親株であるイネ品種日本晴、さらにイネ3量体Gタンパク質αサブユニット遺伝子のプロモーター部分を導入したQL/d1を用いた。
白葉枯病菌はXanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) のレースＩであるT7174を用いた。25℃で2日間培養したXooを用いて5x108 CFU/mlの濃度に調整し、2針接種法及び剪葉接種法によって接種した。その後、経時的に病徴の発現状況を観察した。
＜結果１＞
2針接種法及び剪葉接種法ともにd1では、イネ白葉枯病に対して発病率が高く、病徴も劇症で萎凋あるいは枯死に至った（図1A）。2針接種法において病斑長が葉先までの半分以上に及ぶ割合を判定基準にした場合、感染10日後で、d1では10個体中6個体に達した（図1B）。イネ白葉枯病菌感染後、経時的にプロベナゾール誘導性タンパク質の発現をその抗体を用いて解析した結果、d1では、その野生株と比較して、プロベナゾール誘導性タンパク質の発現に遅れが認められた（図1C）。
2針接種法及び剪葉接種法ともにd1では、イネ白葉枯病に対して発病率が高く、病徴も劇症で萎凋あるいは枯死に至った（図1A）。2針接種法において病斑長が葉先までの半分以上に及ぶ割合を判定基準にした場合、感染10日後で、d1では10個体中6個体に達した（図1B）。イネ白葉枯病菌感染後、経時的にプロベナゾール誘導性タンパク質の発現をその抗体を用いて解析した結果、d1では、その野生株と比較して、プロベナゾール誘導性タンパク質の発現に遅れが認められた（図1C）。
＜結果２＞
プロベナゾールに対する感受性を、活性型Gタンパク質αサブユニットを導入したQL/d1と、d1及びその野生株を用いて解析した。その結果、QL/d1においてプロベナゾール誘導性タンパク質は、その野生株と比較して、大量に誘導されていた（図2のQL/d1）。一方、d1では、その野生株に比較してプロベナゾール誘導性タンパク質の発現が1日の遅れが認められた（図2のd1）。
プロベナゾールに対する感受性を、活性型Gタンパク質αサブユニットを導入したQL/d1と、d1及びその野生株を用いて解析した。その結果、QL/d1においてプロベナゾール誘導性タンパク質は、その野生株と比較して、大量に誘導されていた（図2のQL/d1）。一方、d1では、その野生株に比較してプロベナゾール誘導性タンパク質の発現が1日の遅れが認められた（図2のd1）。
＜結果３＞
d1、野生株、QL/d1を用いて2針接種法でイネ白葉枯病菌を接種し、その発病率を比較した。10個体について3回の反復実験を行った結果、d1については発病率が高く、QL/d1については、発病率が著しく低いことが明らかになった（図3）。
d1、野生株、QL/d1を用いて2針接種法でイネ白葉枯病菌を接種し、その発病率を比較した。10個体について3回の反復実験を行った結果、d1については発病率が高く、QL/d1については、発病率が著しく低いことが明らかになった（図3）。
Claims (2)
- 恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAでイネを形質転換することを特徴とする、野生型と比較してイネ白葉枯病に対するイネの耐病性を高める方法。
- 恒常的に活性化された植物由来の3量体Gタンパク質αサブユニットをコードするDNAが下記（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
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