KR100877730B1 - 단자엽 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 ｐｂｚ１단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단자엽 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 PBZ1 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물 및 상기 식물의 종자에 관한 것이다. 또한 상기 단백질의 식물체 내 발현양상 및 상기 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 확인하고, 식물의 세포사멸의 바이오 마커로써 상기 단백질의 항체를 제공한다. 본 발명에 따르면, 벼와 같은 단자엽 식물에서 상기 유전자를 포함하는 프로모터로 형질 전환시키면 병에 대한 방제효과가 탁월한 식물체를 개발할 수 있다.

PBZ1 단백질, 세포사멸, 리보뉴클레아제 활성, 노화

Description

단자엽 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 ＰＢＺ１ 단백질{PBZ1 protein involved in senescence and cell death of monocot plants}

도 1은 부분적인 돌연변이체 (Spl1 및 Spl2)에서 벼 도열병 감염에 의해 유도된 PEG-분획화한 단백질의 2차원 전기영동 분석결과를 나타낸 것으로,

A: spl1 및 2 돌연변이체의 표현형

B: spl1 및 2 돌연변이체로부터 추출된 단백질의 2차원 전기영동 분석결과

C: B의 직사각형으로 표시한 부분의 단백질을 확대한 이미지

D: 2차원 전기영동의 웨스턴 블럿 분석 결과

E: SDS-PAGE를 이용한 웨스턴 블럿 분석 결과

도 2는 식물의 노화가 진행되는 동안 PBZ1 단백질의 축적을 나타낸 것으로,

A: 잎의 노화를 측정하기 위해 다양한 시점에서 엽록소의 함량을 측정한 결과

B: 다양한 시점에서 채취한 시료로부터 추출된 PBZ1 단백질의 웨스턴 블럿 분석 결과

C: 벼 전체 식물의 자연적인 노화기간 동안 PBZ1 단백질의 축적 및 엽록소 함량

도 3은 호기적 또는 침수 조건에서 성장시킨 모종으로부터 얻은 초엽에서 PBZ1 단백질의 축적 및 면역염색 결과를 나타낸 것으로,

A: 호기적 조건에서 침수 (5일) 조건으로 옮겨서 성장시킨 모종으로부터 얻은 벼 초엽에서 PBZ1 단백질을 유입시킨 결과로 단백질은 공기 중에 노출시켜 0, 1, 2, 3, 4 및 5일이 경과된 후 추출하여 분석한 결과

B, C: 호기적 조건에서 4일간 성장시킨 모종으로부터 얻은 어린 초엽의 단면

D, E, F; 호기적 조건에서 4일간 성장시킨 모종의 노화된 초엽의 단면

도 4는 호기적 또는 침수조건에서 성장시킨 모종으로부터 얻은 뿌리의 통기조직이 형성되는 동안 PBZ1 단백질의 축적 및 면역염색으로 위치를 확인한 결과를 나타낸 것으로,

A: 호기적 조건 (5일) 또는 침수조건 (48시간)에서 성장시킨 모종으로부터 얻은 뿌리의 통기조직 세포에 PBZ1 단백질을 유입한 결과

B: 유입된 PBZ1 단백질의 웨스턴 블럿 분석 결과로 단백질은 침수 0, 3, 6, 12, 24 및 48 시간이 경과한 후 추출하였다.

C: 48시간 침수된 뿌리의 면역염색법으로 위치를 확인한 결과

도 5는 뿌리골무 (A) 및 종자 호분세포 (D)에서 PBZ1 단백질의 면역염색법으로 착색된 세포내 위치를 나타낸 것이다.

도 6은 M. grisea (벼 도열병) 처리 후 PBZ1 프로모터의 형광이미지를 나타낸 것으로, PBZ1 프로모터::sGFP (PBZ1 pro::sGFP)로 형질 전환된 잎을 KJ101(도열병균)로 3일 동안 감염시킨 다음 관찰한 결과이다.

도 7은 세포예정사와 관련된 종자 호분 층에서 PBZ1 단백질의 발현을 나타낸 것으로,

A: 종자 호분 층에서 PBZ1 단백질을 면역염색으로 위치를 확인한 결과.

B: 종자 (B) 및 발아된 지 3일된 종자의 PBZ1 프로모터의 활성.

C: 형질전환 식물체에서 발현된 PBZ1 프로모터::sGFP (PBZ1 pro::sGFP)에서 GFP 형광을 공 초점 (confocal) 현미경을 이용하여 관찰한 결과

도 8은 발아가 진행되는 동안 종자 호분세포에서 TUNEL을 사용하여 DNA 분열을 측정한 결과를 나타낸 것으로,

A: 48시간 동안 발아시킨 다음 종자 호분세포에서 DNA 분열을 측정한 것으로 세포사멸 형광감지 키트 및 쪼개진 DNA 가닥의 3‘ 말단기에 형광 (FITC)-라벨링된 그룹을 첨가하여 DNA 분열을 감지한 결과

B: 발아 동안 종자 호분세포에서 DNA 분열 및 PBZ1 단백질의 Colocalization결과

도 9는 E. coli로부터 분리 정제된 PBZ1 단백질에 의해 배양된 벼 세포에서 세포 사멸의 유도를 나타낸 것으로, 세포사멸의 정도는 A ₅₉₅ 에서 각각 세포의 에반스 블루 스테닝으로 측정하였으며, 24시간 배양 후 배양된 벼 세포에서 죽은 세포수를 측정하였다.

A: 민감성 반응에서 PBZ1 단백질을 처리했을 때 벼 캘러스의 형태.

B 및 C: 조사량의 농도 (1, 2.5, 5, 10 μM) 및 시간 의존적 (6, 12, 18, 24 hr)으로 측정된 세포사멸의 결과

D: 항 PBZ1 항체를 사용하여 세포사멸을 차단시킨 결과

E: PBZ1 단백질을 침투시키고 5일이 경과된 담배 잎 (왼쪽 잎의 1, 10 mM HEPES 완충액 pH 7.0; 2, 아세틸화된 BSA 100 μg/ml; 3, 정제된 PBZ1 단백질 (10 μg/ml); 4, 정제된 PBZ1 단백질 (25 μg/ml); 5, 정제된 PBZ1 단백질 (50 μg/ml); 6, 정제된 PBZ1 단백질 (100 μg/ml).

F: 1, 아세틸화된 BSA 100 μg/ml; 2, 정제된 특이적 PBZ1 항체 (10 μl); 3, 정제된 PBZ1 단백질(100 μg/ml); 4, 정제된 PBZ1 단백질(100 μg/ml) 및 정제된 특이적 PBZ1 항체 (10 μl). 음성대조구로는 항 PBZ1 항체를 사용하였다.

도 10은 애기장대에서 PBZ1-유도된 세포사멸을 나타낸 것으로,

A: 애기장대에서 글루코코르디코이드 호르몬인 덱사메타손 (DEX)으로 유도된 PBZ1 과발현 라인(T2-3 및 T2-4)을 DEX (20 )로 72시간 동안 처리했을 때.

B: 락토페놀-트리판 블루로 착색된 잎

C: 락토페놀-트리판 블루로 착색된 잎의 현미경 관찰사진.

D 및 E: DEX를 처리하고 72 시간 후 전체 RNA 및 단백질을 채취하여 노던 및 웨스턴 블럿 분석을 실시한 결과.

도 11은 정제된 PBZ1 단백질 10 μM에 다양한 처리 후 24시간이 경과했을 때 벼 캘러스 DNA 분열의 아가로스 겔 분석결과를 나타낸 것이다.

도 12는 정제된 PBZ1 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 나타낸 것으로, 벼의 잎에서 추출한 전체 RNA (5 μg)로 아가로스 겔에서 분석하였으며, R. I는 리보뉴클레아제 저해제 (50 unit)를 나타내며 B는 음성대조구로 100°C에서 10분간 끓인 PBZ1 단백질을 나타낸다.

본 발명은 단자엽 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 PBZ1 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조방법, 상기 방법에 의해 형질 전환된 식물 및 상기 식물의 종자에 관한 것이다. 또한 상기 단백질의 식물체내 발현양상 및 상기 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 확인하고, 식물의 세 포사멸의 바이오마커로써 상기 단백질의 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

식물은 생물성 자극이나 스트레스를 인식하자마자 다양한 종류의 생체방어체계를 활성화시킨다. 식물의 생체방어체계로는 이온이상 유출, 활성산소생성, 세포사멸, 세포벽 강화, 방어관련 단백질의 생산, 파이토알렉신 생산, 체계적 신호 전달에 의한 생체 방어 체계의 가동 등을 들 수 있다 (McDowell, 2001, TIBS 25:79-82). 그러나 대부분 이들의 기능에 대한 연구는 아직 미진한 상태이다.

PR-단백질은 식물이 병원균의 침입에 대항해서 유기되는 다양한 식물 유전자들의 발현 단백질을 의미한다. 보고된 문헌에 의하면, Van Loon (Plant Mol. Biol. , 1994, 12, 245-265)에 의해 11종류로 분류되었다가 최근 많은 연구의 결과로 그 종류가 점점 증가되어지고 있다 (Christensen et al, 2002, Mol. Plant Pathol. 3, 135-144). 그 중 직접적으로 생물, 생화학적 항균 활성이 확인된 것으로는 키티나아제 (PR-10), β-1,3-글루카나아제 (PR-2)등이 있고, 형질 전환체 식물을 제작하여 유전자 발현을 유도한 것들로 병의 발생을 억제하는 유전자들로는 PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5등이 알려져 있다 (Broglie et al, 1991, Science, 254, 1194-1197; Zhu et al, Bio/Technology, 1994, 12, 807-812). 그러나 대부분의 PR-단백질에 대한 직접적인 항균활성 기능은 아직 명확하게 밝혀져 있지 않으며, 처음 자작나무 꽃가루 알레르겐으로 알려졌으나 이들은 병원균의 침입 시 수종의 식물에서 유기되는 단백질로 보고되어져 있다.

한편, 벼의 PR-10 단백질 유전자는 처음으로 일본에서 살균제 프로베나졸(probenazole) 처리에 의해 발현되는 프로베나졸 유도성 단백질 (probenozole induced protein; PBZ)로 보고된 (Midoh, N. and Iwata, M. 1996, Plant Cell Physiol. 37, 9-18) 이후, McGee 등 (Mol. Plant Microbe Interact. 2001, 14, 877-886)에 의해 세 개의 PR-10 유전자가 클로닝 되었고, 그 중 2개는 발현되고 (PR-10a, PR-10b) 하나는 유사유전자로 밝혀졌다. PR-10a는 PBZ1 유전자와 99% 동일하고 (854/860bp), PR-10a와 PR-10b 간에는 DNA 염기서열로는 81% 상동성이 있는 것으로 알려져 있다.

도열병균 접종 후 PR-10a 유전자의 발현 (mRNA)은 일찍 유기되나 (12hpi), PR-10b는 늦게 (48hpi) 유기되어지며 자스몬산과 살리실산에 의해 유기되며 이들의 발현은 비체계적이라고 알려져 있다. 최근 PBZ1와 단백질 수준에서 28% 상동성을 가지고 리보뉴클레아제의 보존된 서열을 갖는 PR-10이 다시 클로닝 되었다. 그러나 아직 PR-10 단백질들에 대한 생물/생화학적 작용과 생물적 스트레스 내성 활성, 리보뉴클레아제 활성에 관한 기능연구는 현재까지 명확하게 밝혀져 있지 않은 실정이다.

지금까지 PR-10 단백질 발현이 확인된 식물로는 파아슬리, 완두, 감자, 대두, 아스파라가스, 고추, 사탕수수, 벼 등이 보고되어져 있으며, 리보뉴클레아제 활성을 갖는 인삼 단백질과 상동성이 있어 리보뉴클레아제 활성이 있을 것으로 예상되어진 다.

한편, 식물의 세포 예정사 (programmed cell death)는 병원균에 대한 방어 수단으로써 과민성 반응에만 국한되는 것은 아니다. 지금까지 식물에서의 세포 예정사에 관여하는 대표적인 조직으로는 노화 (잎, 초엽)조직을 들 수 있다. 또한, 뿌리의 통기조직 세포형성, 뿌리골무, 종자 호분세포 등이 포함되어진다.

본 발명에서는 단자엽 식물의 병저항성 관련 단백질 (PR-10)을 연구하던 중, 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 PBZ1 단백질의 기능을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 단자엽 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 PBZ1 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 PBZ1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질의 식물체내 발현양상을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 세포사멸에 관여하는 상기 단백질의 DNA 분열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 세포사멸의 바이오마커로써 상기 단백질의 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 단자엽 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 상기 유전자를 포함하는 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 형질 전환된 식물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 식물의 종자를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 단자엽 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 PBZ1 단백질을 제공 한다.

본 발명에서는 처음으로 일본에서 살균제 프로베나졸(probenazole) 처리에 의해 발현되는 프로베나졸 유도성 단백질 (probenozole induced protein; PBZ)로 보고되어진 병원관련 단백질(PR-10)인 PBZ1 단백질의 기능을 규명하기 위해 서열번호 2로 표시되는 상기 단백질을 분리하였다. 본 발명에 따른 PBZ1 단백질의 범위는 벼로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 상기 단백질을 포함한 프로모터로 형질전환시킬 때 식물의 노화 및 세포사멸이 조절되어 병 방제 효과가 나타나는 것을 의미한다.

상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 본 발명에 있어서, 식물의 노화 및 세포사멸은 벼 식물체의 잎 조직과 세포 예정사 (PCD)에 관여하는 뿌리의 통기조직 세포, 뿌리골무, 종자 호분세포에서 PBZ1 단백질의 기능을 나타내는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 PBZ1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전 자는 PBZ1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

벼 유래의 PR-10 단백질에서 세 개의 PR-10 유전자가 클로닝 되었고, 그 중 2개는 발현되고 (PR-10a, PR-10b) 하나는 유사유전자로 알려져 있으며, PR-10a는 PBZ 유전자와 99% 동일하고 (854/860bp), PR-10a와 PR-10b 간에는 DNA 염기서열로는 81% 상동성이 있는 것으로 알려져 있다.

또한 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 벼 식물체에서 상기 PBZ1 단백질의 발현위치를 제공한다.

식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 PBZ1 단백질의 식물체 내에서 발현을 확인하기 위해, 벼 식물의 잎과 돌연변이체에서 PBZ1 단백질의 발현을 확인한 결과 도 1 및 2에서 알 수 있듯이, 정확히 PBZ1의 발현이 잎의 노화 및 돌연변이체에서 동시에 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 노화 마커로써 가장 많이 사용되는 엽록소 양의 측정으로부터 엽록소 양이 감소함에 따라 PBZ1의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 자발적인 잎의 노화에서도 PBZ1의 축적이 일어나는 현상을 관찰할 수 있었다.

잎의 노화뿐만 아니라 초엽에서 발현양상을 확인할 결과, 초엽의 노화는 최근 annals botany에 보고된 바와 같이 일반적으로 벼의 초엽은 종자 발아단계에서 초엽을 보호하는 기구로, 발아 후 초엽은 클레오프타일(coleoptile) 에서 나오고 그런 다음 급격하게 세포 사멸을 일으키는데, 그것을 보다 더 자세히 보기위해서 초엽을 혐기적 조건에서, 즉 침수된 상태에서 발아시켰을 때 초엽만이 성장하는 것으로부터 PBZ1 단백질이 식물의 노화에 관여한다는 것을 확인할 수 있었다.

또한 초엽을 혐기적 조건에서 3일간 배양시킨 후 다시 호기적 조건에서 배양시켜 샘플을 매일 6일간 채취하여 웨스턴 블럿 분석과 면역학적 위치분석 실험을 실시하여 PBZ1 단백질의 발현양상을 확인한 결과, 노화가 발생되는 조건에서 시간이 지남에 따라서 PBZ1의 발현 양이 증가되는 것을 확인할 수 있었다 (도 3 참조). 또한 세포 예정사가 발생하는 초엽조직은 주로 도관조직과 통기조직 세포에서 발생되는 것으로 보고되어져 있는데, 본 발명에서는 PBZ1의 축적위치가 초엽의 통기조직 세포에서 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 뿌리의 통기조직 세포에서도 축적이 일어나는 현상을 관찰할 수 있었다 (도 4 참조). 일반적으로 뿌리의 통기조직 세포의 형성은 혐기 조건에서 발생되는데, 만약 호기적 조건에서 발아하게 되면 즉 담수 조건이 아닌 상태에서 발아한 뿌리는 통기조직이 형성되지 않는다 (도 4 참조). 비담수 조건에서 발아된 벼 뿌리를 담수조건으로 배양시키면 급격한 통기조직 세포가 발생되는데, 이때 시료를 취하여 웨스턴 블럿과 면역조직염색법을 실시한 결과 명확하게 통기조직 세포 형성과 PBZ1의 발현시기가 일치함을 확인할 수 있었다. 특히 면역조직염색법에서 뿌리피질의 통기조직 세포에서 정확하게 발현되어지는 것을 확인할 수 있었다 (도 4 참조). 또한 뿌리골무 및 종자호분 세포에서도 발현되어지는 것을 확인할 수 있었다 (도 5). 따라서 PBZ1의 발현이 식물 PCD 조직과 동일하게 발현되는 것으로 보아 PBZ1은 세포사멸을 일으키는 단백질임을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에서는 서열번호 3으로 표시되는 상기 유전자를 포함하는 프로모터 및 이 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

프로모터는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기 서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세 포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible 프로모터)가 연결되어 있다. 즉 유도성 프로모터에는 생물체의 발달 과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명에서는 게이트웨이 클로닝 시스템을 사용하여 PBZ 프로모터 GFP 융합 pFANTA 벡터를 제작하였다.

또한, 본 발명에서는 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 형질 전환된 식물체를 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아 그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명에서는 벼 종자에서 캘러스를 유도하여 이 중 배 발생이 가능한 캘러스를 선택한 다음, 아그로박테리움을 이용하여 형질전환 시켰다. 포스피노트리신을 이용하여 형질 전환체만을 선별하고, 그 결과 6 line의 형질 전환체를 개발하여 종자와 발아동안 PBZ1 프로모터 형광 이미지를 관찰하였다. 또한 개발된 형질 전환체의 R2 종자를 확보하기 위해, 포장과 온실에서 각각의 line을 전개하여 PBZ1 프로모터 라인이 도열병 처리 시 반응하는지를 관찰하였다. 그 결과, PBZ1 프로모터가 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6A 참조). 또한 잎 노화에서도 강한 신호를 보이는 것을 관찰할 수 있었다 (도 6B 참조). 이러한 결과는 PBZ1 유전자가 세포사멸을 유도한다는 것을 In vivo 상태에서도 확인시켜 주는 것으로 PBZ1 프로모터 발현이 종자 자체에서는 발아되지 않았으나, 발아 과정에서는 강하게 발현된다는 것을 입증해주는 결과이다. 따라서 본 발명에서는 PBZ1 유전자를 포함하는 프로모터로 형질전환 시킴으로써 식물의 노화 및 세포사멸에 직접적인 영향을 주어 병 방제효과가 탁월한 식물체를 개발할 수 있을 것으로 예상된다.

또한, 본 발명에서는 PBZ1 유전자를 포함하는 프로모터로 형질전환시킨 형질전환체의 PBZ1 단백질이 실제로 세포사멸을 일으키는지 알아보기 위해서, 정제된 PBZ1 단 백질을 담배 잎에 침투시키고 세포사멸을 확인하였다. 그 결과, PBZ1 단백질 100 μg/ml에서 효과적으로 세포사멸이 진행되어지는 것을 확인할 수 있었다 (도 9 참조). 그리고 음성 대조구는 PBZ1 항체를 이용하여 PBZ1 단백질과 함께 침투시켰을 때 세포사멸의 정도가 현저히 감소되는 것으로 보아 PBZ1 단백질에 의해 세포사멸이 발생되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포사멸이 벼 부유 세포에서도 관찰되었는데 마찬가지로 담배에서와 동일한 결과를 얻을 수 있었다 (도 9 참조). PBZ1이 처리된 세포는 뚜렷한 민감성 감응을 보였으며, 또한 에반스 블루 염색에서 정량적으로 분석한 결과 조사량 또는 시간 의존적으로 세포사멸이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명에서 사용된 PBZ1 단백질의 항체는 세포사멸을 확인하는 마이오 마커로써 사용되어질 수 있다.

한편, 본 발명에서는 PBZ1 유전자를 DEX 유도성 벡터에 클로닝하여 형질전환 식물체를 제조하고 세포사멸이 유도되는지를 확인하였다. 애기장대에 형질전환 식물체를 만들어 각각 line에 대하여 20 μM DEX를 처리한 다음 세포사멸 유무를 관찰하였다. 도 3에서와 같이 PBZ1 형질 전환체는 DEX를 처리했을 때 대조구에 비하여 성장하는 것이 느리며, 잎에 DEX 처리를 할 경우 세포가 죽는 것을 확인하는데 사용되는 세포사멸 마커 염색제인 트리판 블루로 염색하여 확인할 수 있었다 (도 9 참조).

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물로부터 얻은 종자를 제공한다. 바람직하게는 상기 종자는 단자엽 식물 유래이며, 더욱 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서는 식물의 세포 예정사를 나타내는 마커로서 PBZ1 단백질의 DNA 분열을 제공한다.

PBZ1 단백질을 처리한 세포에서 DNA 분열을 확인한 결과, PBZ1이 처리된 세포에서 DNA 분열이 발생되어졌으며, TUNEL 분석에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다 (도 11 참조).

또한, 본 발명은 벼 유래의 PBZ1 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 제공한다.

본 발명에서는 PBZ1이 세포사멸을 어떻게 일으키는지 알아보기 위해, PBZ1 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 측정하였다. 그 결과 PBZ1은 도 12에서 보는 바와 같이, 리보뉴클레아제 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. PBZ1 단백질의 리보뉴클레아제 활성 및 세포사멸과의 상호관계는 명확하게 밝혀지지 않았지만, 최근에 리보뉴클레아제도 세포사멸에 관여한다는 것이 알려졌다. 하지만 PBZ1이 리보뉴클레아제 활성을 가진다고 해서 세포사멸을 일으킨다는 정확한 증거는 in vivo에서 보고된 바가 없다.

본 발명의 방법에 의해 식물의 노화 및 세포사멸이 조절되어 병 방제효과를 가지는 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료 작물류가 포함된다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

재료 및 방법

1. 식물재료

온실에서 네 번째 내지 다섯 번째 잎이 성장된 단계의 벼 모종은 도열병을 감염시키기 위해 사용하였다. 돌연변이체 (spl1 및 spl2)는 온실에서 성장시켰으며, 초엽(coleoptile)의 노화를 유도하기 위해, 벼는 유리병 속에서 완전히 침수시켰다. 세포 사멸은 5일 동안 침수시킨 모종을 대기 중에서 1일에서 6일 동안 노출시켜 관찰하였다. 뿌리 통기조직 형성은 기존에 보고된 방법 (Kawai et al. 1998, Planta., 204, 277-287)을 이용하여 수행하였다. 가피가 탈피된 종자는 28°C, 암실에서 발아시키고 발아된 종자의 배아를 본 발명에서 사용하였다.

2. 웨스턴 - 블롯 분석 ( Western blot analyses )

단백질은 Mg/NP-40 완충용액을 이용하여 추출하고 PEG 4000으로 분획을 얻은 다음 기존에 보고된 방법 (Kim et al. Electrophoresis, 2001, 22, 2103-2109)으로 분석을 실시하였다. PEG로 분획화된 시료는 SDS-PAGE로 분석하고 반건조 전기영동 시스템 (Hoefer, San Francisco, CA, USA)을 이용하여 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 블럿된 막은 7% w/v 무지방 건조 우유가 포함된 TTBs (50 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.1% v/v Tween 20 및 150 mM NaCl)에서 2시간 동안 반응을 차단시켰다. 차단 후 막은 TTBs로 1000배 희석된 PBZ1 폴리클로날 안티세럼으로 배양시켰다. 항원-항체 상호작용은 2시간 동안 실시하였다. 막은 20분 동안 TTBs로 3회 세척하고 이차항체 goat anti-rabbit IgG 항체를 TTBs로 5000배 희석시킨 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)와 공유결합시키고 단백질 밴드를 확인하였다. TTBs로 생성된 밴드를 세척한 다음, 면역블럿 신호를 ECL (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, USA)를 이용하여 확인하였다. 본 발명에서는 항체를 이용하여 PBZ1 단백질의 기능을 확인하였으며, 분리된 PBZ1 단백질을 유전자 클로닝하여 염기서열(서열번호 1) 및 아미노산 서열(서열번호 2)을 확인하였다.

3. 조직부분 제조 및 면역조직화학염색법

잎 부분을 4 ℃의 PBS-완충용액 포름알데히드(4% 포름알데히드 w/v)로 고정시킨 다음 기존에 보고된 방법 (Kim et al. Proteomics, 2004, 4, 3569-3578)으로 분석하였다. 조직에 포함된 에탄올은 수송체인 크실렌을 사용하여 Paraplast Plus (Sigma)로 침투시키기 전에 100% tert-부탄올 및 크실렌 속에서 흔들어 제거하고 ,핸드 마이크로톰으로 절단하여 poly-L-lysine이 코팅된 현미경 슬라이드로 옮겼다. 면역조직화학적 염색을 위해, 이 부분을 0.02% 소듐아지드 및 0.05% 트윈-20이 포함된 PBS에 2% BSA가 포함된 차단 완충액에서 1시간 동안 상온에서 배양시켰다. 이 부분을 정제된 0.1% 트윈-20 및 차단완충액 (1:1, v/v)이 포함된 희석된 완충액에서 일차항체와 2시간 동안 배양시켰다. 조직표본은 각각 10분 동안 PBS-T로 3회 헹군 다음 1시간 동안 알칼리 인산화효소와 공유결합된 anti-rabbit IgG 항체 (1:300)와 반응시킨 후 PBS-T로 10분 동안 헹군 다음 시료를 가시화하기 위해 NBT/BCIP 용액에서 20분 동안 배양시켰다.

4. PBZ1 프로모터- GFP 리포터 구축물 및 아그로박테리움 튜머사피엔스 형질전환

본 발명에서는 게이트웨이 클로닝 시스템을 사용하여 pFANTA 벡터를 제작하였다. PBZ1 프로모터(서열번호 3)의 상류 큰 부분은 (1403 bps)은 유전자 특이적인 프라이머 세트로 증폭시켰다. 프라이머 세트 중 정방향 프라이머로 : 5´-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGGTGCATGGTTGCGACCATT-3’(서열번호 4), 역방향 프라이머로 5´-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC AGCTAGTTGCAACTGATCAC-3’(서열번호 5)를 사용하였다. 플라스미드는 성숙된 벼(Oryza sativa cv Nakdong) 종자로부터 triparental mating 및 배발생 calli에 의해 아그로박테리움 튜머사피엔스로 도입시켜 형질 전환시켰다. 대략 200개의 성숙된 벼 종자를 이용하여 형질 전환된 아그로박테리움 형질 전환체는 gentle shaking으로 1분 동안 70% (v/v) 에탄올로 멸균하였다. 에탄올을 제거하고 종자는 시판되는 표백제 (20% (v/v)) 100 ml로 1시간 동안 더 멸균시켰다. 멸균된 종자는 멸균수로 여러 차례 헹군 다음 실험을 진행하였다.

5. 세포 생존력 및 세포사멸 분석

세포사멸은 트리판 블루를 사용하여 조직염색 분석법으로 측정하였다. 시료는 알콜성 락토페놀트리판 블루 혼합물 (에탄올 30 mL, 페놀 10 g, 물 10 mL, 글리세롤 10 mL, 젖산 10 mL, 트리판 블루 10 mg)로 덮고, 끓는 물에 2~3 분간 담근 다음, 실온에서 1시간 동안 방치시켰다. 클로랄하이드레이트 용액 (2.5 g/mL)으로 옮긴 후 탈염을 위해 20분간 끓여주고 시료를 50% (w/v) 글리세롤로 균형을 유지시킨 다음 슬라이드 위에 올려 입체현미경으로 관찰하였다.

담배 잎의 세포 사멸은 침투 후 72 시간이 경과했을 때 관찰하였다. 현탁 배양된 벼 세포는 세포사멸 분석을 위해 25 ℃에서 성장시켰으며 에반스 블루 스테닝으로 분석하였다. 정제된 PBZ1 및 OsPR-10 단백질은 주사기를 사용하여 담배 잎의 배축으로 침투시켰다.

6. In situ 에서 핵 DNA 분열 감지

본 발명에서는 핵 DNA 분열을 감지하기 위해 기존에 보고된 방법 (Caccia, 2001)에 따라 수행하였다. TUNEL 분석에서는 DIG-11-dUTP 및 알칼리성 인산염이 연결된 항디고시제닌 항체를 DNA 3'-OH 그룹을 가시화하기 위해 사용하였다. 샘플은 단백질 분해효소 (proteinase K) 용액 (0.05 M Tris-HCl, pH 7.6 속에 0.5 /mL)과 실온에서 20분 동안 배양시킨 다음, 냉수와 TdT 완충용액 (25 mM Tris-HCl, pH 6.6, 200 mM sodium-cacodylate 및 5 mM CoCl₂)으로 헹구고 라벨링된 혼합물 (TdT 10 units 및 TdT 완충용액 50 에 dig-11dUTP 0.5 nmol)과 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 반응은 300 mM NaCl 및 30 mM 구연산나트륨으로 실온에서 30분 동안 헹구어주면서 중지시켰다. 슬라이드를 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl로 10 분간 세척한 다음, 1% (w/v) 차단제가 포함된 동일 완충용액으로 50분간 세척해 주었다. 면역염색 감지는 DIG DNA 라벨링 및 감지키트 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하여 실시하였다. 양성 및 음성 대조구는 TdT 및 라벨링 혼합물과 배양 전에 실온에서 10분 동안 DNase I (23 units mL1)을 처리한 부분으로부터 채취하였다. 착색된 부분은 일반광학현미경으로 관찰하고 즉시 사진을 촬영하였다. 핵을 착색하기 위해 형광염색제 DAPI를 사용하였다. 샘플은 형광도립현미경 (Leica DM RHC)으로 관찰하였다. 필터는 여기상태의 파장은 334-365 nm, 방출파장은 420 nm로 사용하였다.

7. E. coli . 에서 PBZ1 유전자의 발현

PBZ1 cDNA는 정방향 프라이머 (5’-CGGATCCATGGCTCCGGCCTGCGTC-3’ (서열번호 6)) (밑줄은 BamHI 제한효소 부분) 및 역방향 프라이머 (5’-CATCTTAGGCGTATTCGGCAGGG-3’ (서열번호 7))를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 산물은 pGEM-T 벡터 (Promega)로 서브클론 하였다. BamH1 및 Pst1로 절단된 Open reading frame (ORF) 조각은 pQE30 벡터 (Qiagen, Chatsworth, CA)로 클론하였다. 재조합 6xHis-tagged PBZ1 단백질은 pQE30 발현 벡터로 배열시키고 E. coli 세포에서 성장된 플라스미드 pQE30::PBZ1는 흡광도 A ₆₀₀ 가 0.6이 될 때까지 LB배지에서 30℃로 성장시켰다. IPTG는 1 mM의 최종 농도에서 첨가하고 단백질의 발현을 위해 30℃에서 5~6시간 동안 계속해서 배양시켰다. E. coli 세포에서 과발현시킨 재조합 PBZ1 단백질은 Ni-NTA 정제키트 (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.

8. 리보뉴클레아제 분석 ( RNase assay )

본 발명에서는 정제된 PBZ1 및 OsPR-10 단백질을 리보뉴클레아제 활성 및 디옥시리보뉴클레아제 활성을 측정하였다. 각각의 활성을 측정하기 위해, 실온에서 3시간에서 9시간까지 배양시켰다. 전체 RNA 및 DNA 5μg이 포함된 반응 혼합물은 벼 잎으로부터 제조하였다. 배양 후 단백질은 페놀-클로로포름 처리에 의해 제거하고 RNA 및 DNA는 포름알데히드-변성된 아가로스 겔 또는 0.8% 아가로스 겔로 분리하였다. 아크릴아미드 겔에서 리보뉴클레아제 활성을 측정하기 위해, Yen 및 Green (1991, Plant Physiol 97: 1487-1493)에 의해 기존에 보고된 바 있는 리보뉴클레아제가 포함된 조건에서 겔을 제조하였다.

본 발명의 PBZ1 유전자를 포함하는 프로모터로 식물을 형질 전환시켜 노화 및 세포사멸이 조절되어진 병에 대한 방제효과가 탁월한 식물체를 생산할 수 있다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> PBZ1 protein involved in senescence and cell death of monocot plants <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 833 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 cagctctagc tagctacagg catcagtggt cagtagagtg atcagttgca actagctagc 60 tagttagatt atatcttcag tgatggctcc ggcctgcgtc tccgacgagc acgccgtcgc 120 ggtgtcggcg gagcggctgt ggaaggcgtt catggacgcg tccactttgc ccaaggcctg 180 cgccggcttg gtcgacgaca ttgcggtcga ggggaacggt ggtccgggca ccatctacac 240 catgaagctt aaccctgccg cgggtgtggg aagcacatac aagacccggg tggcggtgtg 300 cgacgccgca agtcatgtcc taaagtcgga tgtgctcgag gcagaaagca aggtggggaa 360 gctcaagtca cactcgacgg agacgaagct tgaggccacc ggcgatggct cctgtgtggc 420 caagctcaag gtggagtacg agctcgagga cggcagctca ctgtcgccgg agaaggagaa 480 ggacatcgtg gatggctact atggcatgct caagatgatc gaggactacc tcgtcgctca 540 ccctgccgaa tacgcctaag atgaagagga atactgcctc tatccagtat atcccaccta 600 gagtgagtga taattaaata atgagagccg cagaaatgtc caaattctcg tggcgtttga 660 gtccgtgaga gtaatttcgt gctttaagtt tgtggttgtg tttatgtgcc tttctatggt 720 cgtattcagt gttaaagtta tcattttgct tcatcaatgg gtgaataaag agaggcaagt 780 ctgaatgtgt tctgctatgg tttggaggtt aatatggaag attgaaaatc aaa 833 <210> 2 <211> 158 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Pro Ala Cys Val Ser Asp Glu His Ala Val Ala Val Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Leu Trp Lys Ala Phe Met Asp Ala Ser Thr Leu Pro Lys Ala 20 25 30 Cys Ala Gly Leu Val Asp Asp Ile Ala Val Glu Gly Asn Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Thr Met Lys Leu Asn Pro Ala Ala Gly Val Gly Ser 50 55 60 Thr Tyr Lys Thr Arg Val Ala Val Cys Asp Ala Ala Ser His Val Leu 65 70 75 80 Lys Ser Asp Val Leu Glu Ala Glu Ser Lys Val Gly Lys Leu Lys Ser 85 90 95 His Ser Thr Glu Thr Lys Leu Glu Ala Thr Gly Asp Gly Ser Cys Val 100 105 110 Ala Lys Leu Lys Val Glu Tyr Glu Leu Glu Asp Gly Ser Ser Leu Ser 115 120 125 Pro Glu Lys Glu Lys Asp Ile Val Asp Gly Tyr Tyr Gly Met Leu Lys 130 135 140 Met Ile Glu Asp Tyr Leu Val Ala His Pro Ala Glu Tyr Ala 145 150 155 <210> 3 <211> 1403 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PBZ1 promoter <400> 3 ggtgcatggt tgcgaccatt ttggcgccta cttctcgcgg aggccggcga ggtgcacgct 60 cgatggcgcc gacgtggggt tcacctacga cggcgacacg aggacatgct cacagaggga 120 cccgcgtcgg attaatttga gccaagggaa aactggtctt taatgattat ttctctctcc 180 tattcctcca aaaataataa aataatctca ccggtgtcca gcagctaatt aacagttttt 240 tgtgatgccc tacagcaaat acacgttctt acgacatccc ctagttaatt acacgttttt 300 cggacgtcct gtagcaaatt ttgccgtata acaattacat tactatcctc atctttccaa 360 accaagggta ggaagtagag aacttctcta aaagtgtttt ggaatgtaag aacatatttt 420 gacacaagtt ttgaatgctg gaatgataag caatttgaaa cggagagatt tatcaaagtt 480 aggacgtacg tgctctggta ctagccgtac gatgacgccc aataattcaa ccgaagaaca 540 accacaccta tcgatccgag gtggcaaggt ggaaattttg cgttaaagct caatttgtcc 600 ctggtgaccg tgacatcaga ttgagtatca ctgagtctac caattgaagg ttgtatatat 660 ccgaggtggc acagtgaaaa ttgatacgct atgaaaccca acaagattga aagaaattca 720 taattgaatt aatacctacc gataaagggt atttgtttag acccatctca gagcatgaca 780 tgtagtcgta cctatcatct aaaagcattt aaattagggt ctgttcgatt tagattatta 840 aacaaattat tatcgttgat tacctaccaa ttgattatgg aaataaatta aatactttaa 900 aattaaactt aataaatagt ttaaaacaag tgatcaaagc agtagaataa agtttgttga 960 gagatttttt gaaacataga acaaataatc agttccaata atccggcgaa taatctgaga 1020 atcagtgttc taactgtaaa caaagaccat gatctcatat atgattattc tcccaaccgt 1080 cctatatatg cccaggtctc aaatgtcagc tcttctagat ggaaccaaag aaaaaaaccc 1140 ttaatttcca caggtcaagc cacatgtgat ccccaatatt cctacttcca gaaccctaga 1200 attccacaca aagttcagca tatgcaacca atggagctga gttcccaact gcaacattta 1260 ttctggatga tgtcttcttc tcctcttgcc accctataaa tagcccatgc tactgctcac 1320 ctttgaagca caagcacaag cacaagcagc tctagctagc tacaggcatc agtggtcagt 1380 agagtgatca gttgcaacta gct 1403 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Gateway <400> 4 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc cggtgcatgg ttgcgaccat t 51 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Gateway <400> 5 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc agctagttgc aactgatcac 50 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cggatccatg gctccggcct gcgtc 25 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 catcttaggc gtattcggca ggg 23

Claims (12)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진, 단자엽 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 PBZ1 유전자 프로모터.
5. 제4항의 PBZ1 유전자 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
6. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
8. 삭제
9. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PBZ1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 PBZ1 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 단자엽 식물의 노화 및 세포사멸을 유도하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 단백질이 식물체의 잎, 뿌리의 통기조직 세포, 뿌리골무, 또는 종자 호분 세포에서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 PBZ1 단백질은 리보뉴클레아제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 삭제

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