BRPI0718438A2 - planta tendo capacidade de crescimento e resistência a doenças aperfeiçoadas e método para a sua produção - Google Patents

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BRPI0718438A2
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Kenichi Ogawa
Masayoshi Matsumoto
Tomonori Shiraishi
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Japan Science & Tech Agency
Okayama Prefecture
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Abstract

PLANTA TENDO CAPACIDADE DE CRESCIMENTO E RESISTêNCIA A DOENçAS APERFEIçOADAS E MéTODO PARA A SUA PRODUçãO. Divulga-se uma planta transgênica aperfeiçoada na capacidade de crescimento e na resistência a doenças. Também se descreve um método para a produção da planta transgênica. Verifica-se que uma planta transgênica tendo DNA que codifica uma frutose-1 ,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glutationa introduzido nela é aperfeiçoada na capacidade de crescimento e na resistência a doenças, comparada a uma do tipo selvagem.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTA TENDO CAPACIDADE DE CRESCIMENTO E RESISTÊNCIA A DOENÇAS APERFEIÇOADAS E MÉTODO PARA A SUA PRODUÇÃO".
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a uma planta tendo capacidade
de crescimento e resistência a doenças aperfeiçoadas para controlar a inci- dência causada por pragas, incluindo insetos e doenças, e a um método pa- ra a produção da dita planta. (Nas partes que se seguem, a capacidade de crescimento será referida como "características de crescimento da planta", e a resistência a doenças será referida como "características de controle de pragas", as quais o tradutor acredita ser uma tradução mais apropriada dos termos).
TÉCNICA ANTECEDENTE
Convencionalmente, a produtividade das colheitas tem sido a- perfeiçoada efetuando-se o aperfeiçoamento da espécie apoiada com a ex- periência, por extermínio dos insetos usando agroquímicos, e por outros mé- todos. Entretanto, com um desenvolvimento rápido na biologia molecular nos anos recentes, um método de reprodução molecular (tal como a produção de uma planta transformada) torna possível desenvolver colheitas tendo alta produtividade. Os exemplos específicos das técnicas para melhorar a produ- tividade das colheitas incluem: a promoção do crescimento (aperfeiçoamento nas características de crescimento da planta); a adição de características (isto é, características de controle de pragas) para o controle da incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças; a adição de resis- tência ao estresse; a adição de uma característica de diminuição, o controle do tempo de floração; e similares. Além dos exemplos precedentes, existem diversos tipos de técnicas que resultam no aperfeiçoamento na produtivida- de, direta ou indiretamente.
As técnicas que resultam diretamente no aperfeiçoamento na produtividade incluem a promoção do crescimento da planta (o aperfeiçoa- mento nas características de crescimento da planta). Por exemplo, o Docu- mento de não-Patente 1 descreve que o tabaco tendo frutose- 1,6/sedoeptulose-1,7-bisfosfatase cianobacteriana aperfeiçoa as suas carac- terísticas de crescimento da planta. O Documento de não-Patente 2 descre- ve que a Arabidopsis thaliana introduzindo o fator de transcrição de Dofl aperfeiçoa as suas características de crescimento da planta sob condições de baixo teor de nitrogênio.
Também, a adição de características de controle de pragas às colheitas aperfeiçoa a produtividade, comparadas às colheitas danificadas por pragas, incluindo os insetos e as doenças. Foram descritas até o mo- mento técnicas para a produção de uma planta tendo as características de controle de pragas por meio da introdução de um gene específico em uma planta. Por exemplo, o Documento de Patente 1 descreve tal método que a transformação é efetuada com um gene codificando uma forma constitutiva- mente ativa da subunidade α da proteína G, de modo a produzir arroz aper- feiçoado na tolerância contra a praga bacteriana da folha. Também, o Do- cumento de Patente 2 descreve que o arroz transformado com um gene co- dificando uma proteína defensina é resistivo contra a ferrugem do arroz e a praga bacteriana das folhas.
Em alguns casos, entretanto, a adição de características de con- trole de pragas não resulta no aperfeiçoamento na produtividade. Por exem- pio, sabe-se que as características de crescimento da planta são diminuídas em uma planta quando um gene relacionado à resistência ao estresse (inclu- indo as características de controle de pragas) for expresso constitutivamente na planta (referir-se aos Documentos que não são Patentes 3 a 5), e descre- ve-se que alguns tipos de esforços são necessários para o propósito de as- segurar as características de crescimento da planta. Documento de Patente 1
Publicação de Pedido de Patente Não Examinada Japonesa, Tokukai, Ns 2005-192496 (publicada em 21 de julho de 2005) Documento de Patente 2 Publicação de Pedido de Patente Não Examinada Japonesa,
Tokukai, Ne 2003-88379 (publicada em 25 de março de 2003) Documento que não-Patente 1 Miyagawa Y, Tamoi Μ, Shigeoka S. Overexpression of a cyano- bacterial fructose-1,6-/sedoheptulose-1,7-bisphosphatase in tobacco enhan- ces photosynthesis and growth. Nat Biotechnol. out. de 2001; 19(10): 965-9. Documento que não-Patente 2 Yanagisawa S, Akiyama A, Kisaka H1 Uchimiya H, Miwa T. Me-
tabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation and growth under low-nitrogen conditions. Proc Natl Aead Sei USA. 18 de maio de 2004; 101(20): 7833-8. Epub 10 de maio de 2004. Documento que não-Patente 3 Berrocal-Lobo M, Molina A, Solano R. (2002) Constitutive ex-
pression of ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 in Arabidopsis confers resis- tance to several neerotrophie fungi. Plant J. 29: 23-32. Documento oue não-Patente 4
Kasuga M, Liu Q1 Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. (1999) Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-indueible transcription factor. Nat Biotechnol. 17: 287-291. Documento que não-Patente 5
Tang X, Xie M1 Kim YJ, Zhou J, Klessig DF1 Martin GB. (1999) Overexpression of Pto activates defense responses and confers broad resis- tance. Plant Cell. 11:15-29. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Conforme descrito acima, as técnicas para promover o cresci- mento da planta (aperfeiçoar as características de crescimento da planta) e as técnicas para adicionar as características de controle de pragas a uma planta foram pesquisadas separadamente até a gora. Por esta razão, é re- querido aplicar dois tipos diferentes de técnicas para o propósito de aperfei- çoar as características de crescimento da planta e adicionar as característi- cas de controle de pragas a uma planta. Especificamente, por exemplo, dois genes diferentes necessitam ser introduzidos em uma planta, para o propósi- to de obter uma planta transformada, na qual as características de cresci- mento da planta são aperfeiçoadas e a incidência causada por pragas, inclu- indo os insetos e as doenças, é controlada. Entretanto, há uma possibilidade que a planta transformada assim obtida não possa expressar os mesmos fenótipos que aquela obtida por introdução de cada um dos genes somente.
Se tal técnica for desenvolvida que uma única técnica possa a- perfeiçoar as características de crescimento da planta e adicionar as carac- terísticas de controle de pragas a uma planta simultaneamente, o problema precedente não ocorrerá. Com isso, espera-se que a técnica contribua gran- demente para o aperfeiçoamento na produtividade das colheitas. Entretanto, tal técnica não tinha sido descrita até agora.
A presente invenção é feita em vista dos problemas precedentes, e tem um objetivo para proporcionar: uma planta transformada, na qual as características de crescimento da planta são aperfeiçoadas e a incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças, é controlada por su- as características; e um método para a produção da planta transformada.
Com a pesquisa de um mecanismo de controle do oxigênio ativo no crescimento da planta, os inventores da presente invenção identificaram as frutose-1,6-bisfosfato aldolases do tipo plastídio que se ligam à glutationa em células cultivadas de Arabidopsis thaliana e cloroplastos isolados de A- rabidopsis thaliana e Spinacia oleracea. Um gene codificando a proteína foi clonado a partir da Arabidopsis thaliana do tipo selvagem, uma proteína re- combinante foi expressa em Escherichia coli a partir do gene clonado, e a proteína foi analisada quanto à sua função. No processo de pesquisa, a Ara- bidopsis thaliana foi transformada com a frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glutationa, e então se verificou que a planta trans- formada tinha características de crescimento da planta aperfeiçoadas com- parada com a planta do tipo selvagem. Ademais, verificou-se que a incidên- cia causada pelas pragas, incluindo os insetos e as doenças, foi também controlada na planta transformada. A presente invenção foi realizada sobre estas descobertas.
Ou seja, uma planta transformada relacionada à presente inven- ção é uma planta transformada onde: um DNA codificando uma frutose-1,6- bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glutationa é introduzido; como uma conseqüência, as características de crescimento da planta são aperfeiçoadas e a incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças, é controlada.
Um método para produzir uma planta de acordo com a presente invenção, em que as características de crescimento da planta são aperfeiço- adas e a incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças, é controlada, inclui a etapa de: introduzir, em uma planta, um DNA codifi- cando uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glu- tationa.
Em uma planta transformada de acordo com a presente inven- ção e em um método para produzir a planta de acordo com a presente in- venção, em que as características de crescimento da planta são aperfeiçoa- das e a incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças, é controlada, é preferível que um DNA codificando uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glutationa seja selecionado a partir do grupo que consiste nos seguintes (a) até (d):
(a) um DNA codificando uma proteína tendo a seqüência de a- minoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1;
(b) um DNA codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos com remoção, substituição, ou adição de um ou diversos ami-
noácidos na seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1;
(c) um DNA tendo a seqüência de bases mostrada em SEQ ID
NO: 2; e
(d) um DNA que hibridiza sob condições severas com um DNA tendo a seqüência de bases mostrada em SEQ ID NO: 2.
A presente invenção torna possível produzir, por introdução de
um único gene em uma planta, uma planta na qual as características de crescimento da planta são aperfeiçoadas e a incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças, é controlada. Portanto, a presente inven- ção pode contribuir largamente para o aperfeiçoamento na produtividade de colheitas e na produtividade de biomassa. Também, a presente invenção pode reduzir significativamente a quantidade de fertilizante químico e agro- químicos a serem usados. Ademais, se a presente invenção for aplicada a uma planta que seja adequada como matérias-primas, espera-se que a planta produzida pe- la presente invenção possa ser usada como uma alternativa a diversos tipos de matérias-primas industriais ou fonte de energia, embora agora nós seja- mos predominantemente dependentes do óleo bruto para as matérias- primas industriais ou a fonte de energia por causa de seu custo.
Os objetivos, as características, e as concentrações da presente invenção serão tornados claros pela descrição abaixo. Além disso, as vanta- gens da presente invenção serão evidentes a partir da explanação a seguir em referência aos desenhos.
A figura 1 é uma vista ilustrando os iniciadores e os sítios de en- zimas de restrição usados para a clonagem de um gene de FBA1.
A figura 2 mostra os eletroforetogramas ilustrando o resultado da eletroforese efetuada para os produtos de RT-PCR de mRNA de FBA1 obti- do de uma planta transformada na qual foi introduzido um gene de FBA1.
A figura 3 é uma vista ilustrando uma posição na qual o T-DNA foi inserido em um mutante com T-DNA inserido (049B07) de um gene de FBA1.
A figura 4 mostra: fotografias das folhas de cinco tipos de Arabi- dopsis thaliana (Col-O, 35S-FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) inoculada com os esporos de Colletotrichum higginsianum (na parte superior); e fotografias das folhas coloridas com azul de tripano (na parte inferior).
A figura 5 é um gráfico ilustrando o número de hifas penetradas nas folhas de cinco tipos de Arabidopsis thaliana (Col-O, 35S-FBA1/Col-O, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) inoculada com os esporos de Colleto- tríchum higginsianum.
A figura 6 mostra os micrografias para observar a penetração das hifas por realização da coloração com azul de tripano sobre as folhas de cinco tipos de Arabidopsis thaliana (Col-O, 35S-FBA1/Col-O, cad2-1, 35S- FBA1/cad2-1, e 049B07) inoculada com os esporos de Colletotrichum hig- ginsianum. A figura 7 mostra uma fotografia de cinco tipos de Arabidopsis thaliana (Col-0, 35S-FBA1/Col-O1 cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) ino- culada com os esporos de Colletotrichum higginsianum, a fotografia tendo sido tirada 24 dias após a inoculação.
A figura 8 mostra uma fotografia de cinco tipos de Arabidopsis
thaliana (Col-0, 35S-FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) ino- culada com os esporos da cepa de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, as fotografias tendo sido tiradas 5 dias após a inoculação.
A figura 9 (a) mostra os eletroforetogramas ilustrando o resulta- do da eletroforese realizada para os produtos de RT-PCR de mRNA de PR1 obtido a partir de cinco tipos de Arabidopsis thaliana (Col-0, 35S-FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) sujeita ao tratamento com salicilato.
A figura 9 (b) é um gráfico ilustrando a quantidade relativa de mRNA de PR1 obtido a partir de cinco tipos de Arabidopsis thaliana (Col-0, 35S-FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) sujeita ao tratamento com salicilato.
A figura 10 (a) mostra os eletroforetogramas ilustrando o resul- tado da eletroforese realizada para os produtos de RT-PCR de mRNA de PDF1.2 obtido a partir de cinco tipos de Arabidopsis thaliana (Col-0, 35S- FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) sujeita ao tratamento com jasmonato.
A figura 10 (b) é um gráfico ilustrando a quantidade relativa de mRNA de PDF1.2 obtido a partir de cinco tipos de Arabidopsis thaliana (Col- 0, 35S-FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) sujeita ao trata- mento com jasmonato.
A figura 11 mostra uma fotografia da Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Col-1) e da Arabidopsis thaliana transformada (35S-FBA1/Col-0) na qual um gene de FBA1 foi introduzido, a fotografia tendo sido tirada 42 dias após a semeadura. A figura 12 mostra uma fotografia de: Arabidopsis thaliana do
tipo selvagem (Col-1); um mutante de inserção de T-DNA de um gene de FBA1 (049B07); Arabidopsis thaliana transformada na qual foi introduzido um gene de FBA1 (35S-FBA1/Col-0); e quatro tipos de Arabidopsis thaliana transformada na qual foram introduzidos, respectivamente, quatro tipos de genes de FBA1, mutados para codificar as FBAIs com diferentes resíduos de cisteína substituídos pelo resíduo de alanina, a fotografia tendo sido tira- da 30 dias após a semeadura.
A figura 13 mostra os gráficos comparando os seguintes tipos de Arabidopsis thaliana no (i) peso novo da parte moída acima de uma planta e no (ii) número total de folhas de roseta de uma planta, entre: Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Col-1); um mutante com T-DNA inserido de um gene de FBA1 (049B07); Arabidopsis thaliana transformada na qual foi intro- duzido um gene FBA1 (35S-FBA1/Col-0); e quatro tipos de Arabidopsis tha- liana transformada na qual foram introduzidos, respectivamente, quatro tipos de genes de FBA1, mutados para codificar as FBAIs com diferentes resí- duos de cisteína substituídos pelo resíduo de alanina. A figura 14 mostra uma fotografia de: Arabidopsis thaliana do
tipo selvagem (Col-1); e Arabidopsis thaliana transformada (35S-FBA1) na qual foi introduzido um gene de FBA1, cada uma das quais foi desenvolvida (a) sob a mesma condição de CO2 que na atmosfera e (b) sob uma condição de alto teor de CO2, a fotografia tendo sido tirada 25 dias após a semeadura. A figura 15 mostra os gráficos comparando, no (i) peso novo da
parte moída acima de uma planta e no (ii) número total de folhas de roseta de uma planta, entre: Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Col-1); um mu- tante com T-DNA inserido de um gene de FBA1 (049B07); e Arabidopsis thaliana transformada (35S-FBA1) na qual foi introduzido um gene de FBA1, cada uma das quais foi desenvolvida (a) sob a mesma condição de CO2 que na atmosfera e (b) sob uma condição de alto teor de CO2. MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO
Primeiramente, o que segue descreve resumidamente os fun- damentos dos processos através dos quais foi efetuada a presente invenção. Os inventores da presente invenção demonstraram (i) que o oxi-
gênio ativo de concentração apropriada era necessário para uma planta não somente como um substrato na biossíntese, como também como um fator de controle no crescimento da planta; e (ii) que o crescimento da planta pode ser aperfeiçoado por tratamento de uma semente, um corpo da planta, uma folha, ou uma raiz com oxigênio ativo de concentração apropriada. Também, os inventores mostraram que um efeito do oxigênio ativo na melhora do crescimento estava associado com a glutationa em uma célula. Através da pesquisa, os inventores examinaram as proteínas que se ligam à glutationa em células cultivadas de Arabidopsis thaliana, com isso identificando uma proteína que foi deduzida ser uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio (lto, H., Iwabuchi, M. e Ogawa1 K. (2003) Plant Cell Physiol. 44, 655-660.).
Após isso, os inventores clonaram um cDNA codificando a prote- ína a partir de Arabidopsis thaliana do tipo selvagem, expressaram uma pro- teína recombinante na Escherichia coii a partir do gene clonado, e purifica- ram a proteína recombinante de modo a analisar a sua função. É predito que a Arabidopsis thaliana tem pelo menos sete genes,
deduzidos codificarem uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase (nas partes que se seguem, referida como "FBA"), e que três genes dos sete genes são alve- jados para um plastídio. Das três FBAs, os inventores denominaram a FBA que se liga à glutationa como "FBA1" e as outras duas FBAs como "FBA2" e "FBA3", respectivamente. Então a FBA1 até a FBA3 foram submetidas a um experimento. Como um resultado, os seguintes fatos foram revelados:
1) uma FBA1 recombinante tem uma atividade de FBA;
2) a FBA1 recombinante é controlada pela glutationa; e
3) todas as FBA1, FBA2, e FBA3 são suprimidas por ditiotreitol ou tiorredoxina (Trx) reduzida, porém somente a FBA1 foi ativada novamen- te pela glutationa.
Além disso, foi indicado que a FBA1 está presente no cloroplasto na verdade porque a atividade da FBA foi perdida no cloroplasto isolado de um mutante com T-DNA inserido de um gene de FBA1 ("Ogawa, K., Matsu- moto, M. e lto, H., (2005) Vol.1, Photosynthesis: Fundamental Aspects to Global Perspectives, editado por Van der Est A e Bruce D. Lawrence, Allen Press, Inc., 468-469", "Matsumoto, M. e Ogawa, K., Resumos do 23s simpó- sio da sociedade japonesa para célula de planta e biológica molecular (Dai 23 kai nihon shokubutsu saibou bunshi seibutsu gakkai taikai simpojiumu youshi shu), publicado em 4 de agosto de 2005").
Para prosseguir adicionalmente com a pesquisa, os inventores introduziram um gene de FBA1 na Arabidopsis thaliana do tipo selvagem, e, com isso, produziram uma planta transformada. Como um resultado, verifi- cou-se que as características de crescimento da planta foram aperfeiçoadas e a incidência causada por pragas, incluindo insetos e doenças, é controlada na Arabidopsis thaliana transformada com FBA1. O que segue descreve em detalhe uma planta transformada de
acordo com a presente invenção e um método da sua produção.
A presente invenção proporciona: uma planta transformada onde um DNA codificando a frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glutationa (FBA1) é introduzida, e como uma conseqüência, as carac- terísticas de crescimento da planta são aperfeiçoadas e a incidência causa- da por pragas, incluindo os insetos e as doenças, é controlada; e o método de produção dela.
Na presente invenção, a expressão "as características de cres- cimento da planta são aperfeiçoadas" significa que uma planta à qual é in- traduzido um DNA codificando a FBA1 tem uma proporção maior de cresci- mento ou tem uma velocidade de crescimento mais rápida, comparada com uma planta à qual não é introduzido o DNA que codifica a FBA1. Mais espe- cificamente, a expressão "as características de crescimento da planta são aperfeiçoadas" significa que a planta à qual é introduzido o DNA codificando a FBA1 tem um peso bruto ou peso seco maior, tem uma semente ou uma fruta em uma quantidade de produção maior ou de um peso seco maior, ou tem um número maior de folhas, comparada com a planta à qual não é intro- duzido o DNA que codifica a FBA1.
Também, na presente invenção, a expressão "a incidência cau- sada por pragas, incluindo os insetos e as doenças, é controlada" significa que a planta à qual é introduzido o DNA codificando a FBA1 tem as caracte- rísticas mais destacadamente a seguir, comparada com a planta à qual não é introduzido o DNA que codifica a FBA1: (i) o progresso de uma doença causada por fungos ou bactérias patogênicas pode ser retardado ou a doen- ça pode ser aliviada; (ii) o progresso de danos verminosos pode ser reduzido. O controle da incidência causada por insetos refere-se neste documento a: (i) um efeito repelente obtido pela produção de uma substância repelente contra o inseto; e (ii) um efeito de exterminação ou um efeito preventivo do crescimento para o inseto, obtido pela produção de uma substância para atrair o seu inimigo natural ou pela produção de uma substância tóxica con- tra o inseto.
A frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à
glutationa (nas partes a seguir, referida como "FBA1"), codificada no DNA a ser usado na presente invenção, somente necessita ter uma atividade de FBA, existir em um plastídio, tal como o cloroplasto, e controlar a sua ativi- dade pela glutationa. Também, o tipo da planta a partir da qual é derivado o DNA não está particularmente limitado. Tem sido sugerido que a FBA1 exis- te em muitos tipos de plantas. Isto é suportado pelos seguintes fatos: (i) sa- be-se que uma atividade de FBA no cloroplasto, convencionalmente medida por utilização de um método bioquímico, exibe dependência pelo pH, assim como a FBA1 da Arabidopsis thaliana exibe; e (ii) facilmente se espera que o pH ótimo para uma enzima funcionando dentro do estroma do cloroplasto, durante a fotossíntese, seja aproximadamente 8, no qual ocorre a fotossín- tese. A atividade de FBA refere-se à atividade para catalisar reversivelmente uma reação na qual um frutose-1,6-bisfosfato é convertido em um fosfato de diidroxiacetona e em um gliceraldeídos-3-fosfato. O DNA que codifica a FBA1 usado na presente invenção pode
ser um gene de FBA1 derivado da Arabidopsis thaliana. A FBA1 derivada da Arabidopsis thaliana tem a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, e um gene (cDNA de tamanho natural) que codifica a FBA1 tem a seqüência de bases mostrada em SEQ ID NO: 3. Da seqüência de bases mostrada em SEQ ID NO: 3, a posição 145 até a posição 147 são um códon de iniciação; e a posição 1318 até a posição 1320 são um códon de inter- rupção. Ou seja, o gene de FBA1 de Arabidopsis thaliana tem um quadro de leitura aberto (ORF) consistindo na região entre a posição 145 e a posição 1320 da seqüência de bases mostrada em SEQ ID NO: 3. A seqüência de bases mostrada em SEQ ID NO: 2 é a seqüência de bases do ORF do gene de FBA1 da Arabidopsis thaliana. Os genes que são homológicos com a se- qüência de bases do gene de FBA1 de Arabidopsis thaliana incluem um ge- ne (dbj|BAB55475.1) presente sobre um genoma do arroz.
Na presente invenção, é preferível usar um DNA codificando uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácidos com remoção, substituição, ou adição de um ou diversos aminoácidos na seqüência de a- minoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, e tenha uma atividade de FBA1. Conforme mostrado no Exemplo descrito posteriormente, os inventores e- xemplificaram que as características de crescimento da planta foram aper- feiçoadas, bem como na Arabidopsis thaliana, na qual foi introduzido um DNA codificando a FBA1 não tendo nenhuma mutação, na Arabidopsis thali- ana, na qual qualquer um dos dois seguintes tipos de DNA foi introduzido: (i) um DNA codificando a FBA1 mutada de modo a substituir a cisteína da posi- ção 72 na seqüência de aminoácidos da FBA1 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1) por um outro aminoácido (alanina, no Exemplo); (ii) um DNA codi- ficando a FBA1, de modo a substituir a cisteína da posição 187 na seqüência de aminoácidos da FBA1 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1) por um outro aminoácido (alanina, no Exemplo).
A expressão "remoção, substituição, ou adição de um ou diver- sos aminoácidos" significa, neste documento, que certo número (preferivel- mente 10 ou menos, mais preferivelmente 7 ou menos, mais preferivelmente 5 ou menos) de aminoácidos é removido, substituído, ou adicionado. O certo número de aminoácidos deve estar dentro da faixa na qual os aminoácidos podem ser removidos, substituídos, ou adicionados, usando um método de produção de peptídeo mutado bastante conhecido, tal como as técnicas de mutagênese sítio-dirigida. Tal proteína mutada não está limitada a uma pro- teína tendo uma mutação artificialmente introduzida por um método de pro- dução de polipeptídeo mutado bastante conhecido, porém pode ser uma pro- teína obtida por isolamento e purificação de uma proteína de ocorrência na- tural.
Sabe-se bem neste campo que alguns aminoácidos podem ser alterados em uma seqüência de aminoácidos de uma proteína, sem serem afetados significativamente na estrutura ou na função da proteína. Também, sabe-se bem que, além do mutante artificial, existe um mutante de ocorrên- cia natural no qual a estrutura ou a função não é significativamente alterada daquela de sua proteína natural por causa de sua mutação.
Um mutante preferível tem substituição, remoção, ou adição conservativa ou não conservativa de um aminoácido. A substituição, a adi- ção, ou a remoção silenciosa é preferível. Especialmente, a substituição conservativa é preferível. Estas não alteram uma atividade do polipeptídeo relacionado à presente invenção.
A substituição conservativa típica inclui: a substituição, um pelo outro, entre os aminoácidos alifáticos Ala, Vai, Leu, e lie; a interalteração dos resíduos de hidroxila Ser e Thr; a interalteração dos resíduos ácidos Asp e Glu; a substituição entre os resíduos de amida Asn e Gln; a interalteração dos resíduos de base Lys e Arg; e a substituição entre os resíduos aromáti- cos Phe e Tyr.
Na presente invenção, um DNA (um primeiro DNA) pode ser u- sado, o qual hibridiza sob condições severas com um DNA (um segundo DNA) tendo a seqüência de bases mostrada em SEQ ID NO: 2, desde que o primeiro DNA codifique uma proteína tendo uma atividade de FBA1. O pri- meiro DNA pode ser, por exemplo, um DNA codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido com remoção, substituição, ou adição de um ou diversos aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1.
As "condições severas" na presente invenção significam que a hibridização ocorre somente quando existir pelo menos 90% de identidade, preferivelmente pelo menos 95% de identidade, ou mais preferivelmente pe- Io menos 97% de identidade entre as seqüências. Especificamente, a condi- ção a seguir é um exemplo das condições severas: (i) um filtro de hibridiza- ção é incubado durante a noite, a 42°C, em solução de hibridização (incluin- do 50% de formamida, 5 χ SSC (NaCI a 150 mM, citrato de trissódio a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), 5 χ solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrana, e 20 μς/ιηΙ de DNA de esperma de salmão cortado, desnaturado); e então (ii) o filtro é lavado em 0,1 χ SSC em aproximadamen- te 65°C.
A hibridização pode ser realizada utilizando um método bastante conhecido, conforme descrito em "Sambrook e col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3â Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001)". Normal- mente, uma temperatura aumentada e uma concentração diminuída de sal aumentam a severidade (isto é, tornam difícil hibridizar), com isso permitindo obter um DNA tendo homologia maior.
A identidade em uma seqüência de aminoácidos ou em uma se- qüência de bases pode ser determinada usando um algoritmo BLAST por Karlin e Altschul (Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 2264- 2268 (1990); Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad Sei. USA, 90: 5873-5877 (1993)). Com base no algoritmo BLAST, os programas chamados BLASTN ou BLASTX foram desenvolvidos (Altschul SF, e col., J. Mol. Biol., 215: 403 (1990)).
O DNA que codifica a FBA1 usado na presente invenção pode ser derivado de um DNA genômico ou um cDNA, ou pode ser um DNA qui- micamente sintetizado.
O DNA que codifica a FBA1 usado na presente invenção pode ser obtido por isolamento e clonagem de fragmentos de DNA que codificam a FBA1, utilizando técnicas conhecidas. Por exemplo, prepara-se uma sonda que especificamente hibridiza com uma parte de um DNA codificando a FBA1 de Arabidopsis thaliana, e uma biblioteca de DNA genômico ou uma biblioteca de cDNA é examinada com a sonda.
Alternativamente, o DNA codificando a FBA1 usado na presente invenção pode ser obtido por meios de amplificação, tais como a PCR. Por exemplo, os iniciadores para a PCR são preparados com base nas extremi- dades de 5' e 3' da seqüência (ou sua seqüência complementar) do cDNA que codifica a FBA1 de Arabidopsis thaliana; e, por utilização dos iniciadores, a PCR ou outro meio é conduzido com um DNA genômico (ou um cDNA) como um molde, de modo a amplificar a região do DNA entre os iniciadores. Neste modo, os fragmentos de DNA codificando a FBA1 usados na presente invenção podem ser obtidos em grande quantidade.
O DNA usado na presente invenção pode ser obtido de um teci-
do ou de uma célula de uma planta apropriada, como uma fonte. O tipo da planta pode ser, porém não está limitado a, por exemplo, outras plantas cru- cíferas que sejam muito relacionadas à Arabidopsis thaliana, tais como o arroz, o tabaco, a palmeira-de-óleo, o choupo, e similares. Conforme descri- to acima, sugere-se que muitos tipos de plantas têm uma proteína tendo uma atividade de FBA1 e, portanto, uma pessoa versada na técnica pode facilmente esperar que as plantas diferentes da Arabidopsis thaliana também tenham um DNA codificando a FBA1.
Na presente invenção, como um método para introduzir um DNA codificando a FBA1 em uma planta, tal método é preferivelmente usado que um vetor de expressão recombinante é construído, de modo a ter um promo- tor funcionando em uma célula de planta conectado à montante de um DNA codificando a FBA1 e um terminador funcionando em uma célula de planta conectado à jusante do DNA1 e é introduzido em uma planta. Na modalidade descrita posteriormente, o promotor funcionando
em uma célula de planta pode ser, porém não está limitado, a um promotor do vírus do mosaico de couve-flor 35S, que é constitutivamente expresso. Um promotor capaz de ser expresso constitutivamente diferente do promotor do vírus do mosaico de couve-flor 35S pode ser um promotor de actina do arroz, um promotor de ubiquitina do milho, ou similar. Estes promotores po- dem ser preferivelmente usados para a presente invenção também.
Um promotor capaz de ser expresso constitutivamente diferente dos promotores antecedentes pode ser, porém não está limitado a: um pro- motor específico do tecido da folha verde, tal como um promotor rbcS e um promotor Cab; e um promotor capaz de indução, tal como o promotor de HSP70. Um promotor a ser inserido diretamente em um genoma de cloro- plasto pode ser, porém não está limitado a um promotor rbcL ou similar, e pode ser qualquer promotor que possa funcionar no cloroplasto.
O terminador funcionando em uma célula de planta pode ser um terminador derivado de um gene da enzima sintética de nopalina, um termi- nador derivado de um vírus do mosaico de couve-flor, ou similar.
Um vetor de expressão recombinante, usado para a transforma-
ção de uma planta, não está particularmente limitado a um tipo específico, na medida em que um gene inserido no vetor de expressão recombinante possa ser expresso em uma célula de planta. É preferível usar vetores biná- rios (tais como do sistema pBI) quando o Agrobacterium for usado para in- traduzir um vetor em uma planta. Os exemplos dos vetores binários podem incluir o pBIG, o pBIN19, o pBI101, o pBI121, o pBI221, e similares.
As plantas a serem transformadas na presente invenção podem ser quaisquer das que seguem: plantas inteiras; órgãos das plantas (tais como uma folha, uma pétala, um caule, uma raiz, uma semente, e similares); tecidos das plantas (tais como a epiderme, a floema, o parênquima, um xi- lema, um feixe fibrovascular, um tecido de barreira, um tecido de estrutura esponjosa, e similar); células de culturas de plantas; e diversas formas de células de plantas (tais como as células de culturas suspensas); protoplas- tos; pedaços de folhas; calos, e similares. O tipo da planta usada para a transformação não está particularmente limitado, e ela pode ser uma planta capaz de expressar o DNA que codifica a FBA1 que é usada.
Quando for usado o DNA codificando a FBA1 de Arabidopsis thaliana, as plantas crucíferas, as quais estão muito relacionadas à Arabi- dopsis thaliana, são preferíveis para as plantas a serem transformadas. En- tretanto, a planta usada na presente invenção não está limitada a estas. É descrito que uma planta transformada pode ser produzida a partir das plan- tas tais como o tabaco, o choupo, e os cítricos, por utilização de um gene de Arabidopsis thaliana (Franke R, McMichaeI CM, Meyer K, Shirley AM, Cu- sumano JC, Chapple C. (2000) Modified Iignin in tobacco and poplar plants over-expressing the Arabidopsis gene encoding ferulate 5-hydroxylase. Plant J. 22: 223-234; Pena L, Martin-Trillo M, Juarez J, Pina JA, Navarro L, Marti- nez-Zapater JM. (2001) Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their generation time. Nat Biotechnol. 19: 263-267). Portanto, é considerado que diversos tipos de plantas transforma- das, nos quais as características de crescimento da planta são aperfeiçoa- das e a incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças, é controlada, podem ser produzidos por introdução do DNA codificando a FBA1 de Arabidopsis thaliana nas plantas precedentes.
Um vetor de expressão recombinante pode ser introduzido em uma célula de planta por um método de transformação conhecido na técnica, por exemplo, um método com Agrobacterium, um método de pistola de par- tículas, um método com polietileno glicol, um método de eletroporação, e similar. Por exemplo, quando o método com Agrobacterium for usado, uma planta transformada pode ser obtida por (i) introdução de um vetor de ex- pressão construído para as plantas em um Agrobacterium adequado (tal como o Agrobactgerium tumefaciens), e (ii) contaminação, com as cepas resultantes, das folhinhas cultivadas sob uma condição asséptica, de acordo com técnicas tais como o método do disco de folha (Uchimiya, H., Manual de manipulação de gene de planta (Shokubutsu idenshi sousa manyuaru), 1990, págs. 27-31, Kodansha Scientific, Tóquio, Japão).
Quando o método de pistola de partículas for usado, é possível usar uma planta, um órgão da planta, ou um tecido da planta diretamente ou na forma de um pedaço ou um protoplasto que é preparado. As amostras assim preparadas podem ser processadas por utilização de um dispositivo de introdução de gene (tal como o PDS-1000 da BIO-RAD). Geralmente, o método de pistola de partículas é conduzido sob a pressão de aproximada- mente 3.102,64 kPa a 13.789,51 kPa (450 psi a 2000 psi), e na distância de aproximadamente 4 cm a 12 cm, e tais condições podem variar dependendo do tipo de uma planta ou uma amostra.
As células ou os tecidos da planta nos quais é introduzido um DNA de interesse são primeiramente selecionados com base em um marca- dor de resistência a fármaco, tal como a resistência à canamicina ou a resis- tência à higromicina, e então são regenerados nas plantas por utilização de métodos comuns. A regeneração das plantas a partir das células transfor- madas pode ser realizada usando métodos conhecidos na técnica, de acor- do com o tipo de células de plantas.
Se o DNA de interesse foi introduzido com êxito ou não em uma planta pode ser determinado, por exemplo, utilizando um método de PCR, um método de hibridização southern, um método de hibridização northern, ou similar. Por exemplo, se a transformação foi realizada com êxito ou não pode ser confirmado de acordo com as seguintes etapas: preparação de uma biblioteca de DNA a partir de uma planta transformada; projeto de inici- adores específicos para o DNA de interesse; condução da PCR com a biblio- teca de DNA e os iniciadores; sujeição dos produtos amplificados à eletrofo- rese em gel de agarose, eletroforese em gel de poliacrilamida, eletroforese capilar ou similar; coloração com brometo de etídio ou similar; e detecção de um produto amplificado de interesse.
Assim que for obtida uma planta transformada, na qual um DNA codificando a FBA1 é introduzido em um genoma, a descendência da planta pode ser obtida por reprodução da planta de modo sexual ou assexual. A- demais, é possível produzir a planta desejada em grande quantidade a partir de materiais para a reprodução (tais como uma semente, um protoplasto, e similar), os materiais sendo obtidos a partir da planta, de sua descendência, ou de seu clone.
A planta transformada assim obtida na maneira precedente é esperada ter características de crescimento da planta e características de controle de pragas mais aperfeiçoadas, comparada com uma planta do tipo selvagem. É possível confirmar se as características de crescimento da plan- ta são aperfeiçoadas ou não por comparação, nos tamanhos, pesos, e simi- lares, entre uma planta transformada e uma planta do tipo selvagem, cada uma das quais é semeada ao mesmo tempo. Também, é possível confirmar se a incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças, pode ser adicionalmente controlada ou não, por comparação entre uma planta transformada e uma planta do tipo selvagem, nos estados de doença, após elas serem inoculadas com, por exemplo, Colletotrichum higginsianum (co- mo no Exemplo descrito posteriormente). As características de crescimento da planta de uma planta trans- formada de acordo com a presente invenção são aperfeiçoadas como a se- guir. Na Arabidopsis thaliana transformada, as características de crescimen- to da planta são aumentadas em 10% a 15% ou mais, mesmo sob intensi- dade de luz extremamente baixa (aproximadamente 1/50 da luz do sol). A- demais, espera-se que as características de crescimento da planta sejam aumentadas em aproximadamente 30% a 40% ou mais, quando a intensida- de da luz for duplicada, e sejam aumentadas em aproximadamente 70% a 80% ou mais, quando a intensidade da luz for aumentada para aproximada- mente 3/20 da luz do sol. Quando a concentração de CO2 for aumentada, a planta transformada exibe duas a três vezes ou mais tantas características de crescimento da planta quanto exibe uma planta normal. Além disso, sob as condições preferíveis, a planta transformada exibe 10 a 20 vezes ou mais tantas características de crescimento da planta quanto exibe uma planta normal na concentração de CO2 aumentada. As plantas assim produzidas podem crescer mesmo em um local tendo intensidade da luz limitada (tal como em um solo da floresta). Isto aumenta uma área onde as plantas po- dem crescer. Ademais, as características de crescimento da planta são lar- gamente aperfeiçoadas sob alta luminosidade. Portanto, espera-se que a produtividade das colheitas seja significativamente melhorada em uma área aberta, tal como um campo cultivado. Além disso, espera-se que a aplicação da presente invenção às plantas que chamam a atenção como material in- dustrial ou material de fonte de energia possa reduzir significativamente um custo de produção das plantas, de modo a fazer com que as plantas se tor- nem uma alternativa para o óleo. Também, espera-se que a aplicação da presente invenção às árvores para a polpação (tais como o choupo) possa obter a arborização e a nutrição efetivas de uma floresta, de modo a conter um possível desflorestamento no futuro. Espera-se que a aplicação da pre- sente invenção às plantas em uma região árida possa aperfeiçoar a produti- vidade das plantas na região árida, de modo a contribuir para a aceleração do esverdecimento ou a prevenção da desertificação.
Em vista do controle da incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças, uma planta transformada de acordo com a presen- te invenção possui um amplo espectro não somente sobre os fungos, como também sobre as pragas, incluindo as bactérias e os insetos. O salicilato e o jasmonato, cada um dos quais é produzido quando uma planta é infectada com as bactérias patogênicas, são substâncias de sinal, importantes para o controle da incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doen- ças. Uma planta transformada de acordo com a presente invenção tem uma característica excelente, tal que ela é aperfeiçoada em ambas as respostas do salicilato e do jasmonato para controlar a incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças. Esta característica não pode ser encon- trada nas plantas convencionais. Também, o jasmonato é conhecido como uma substância relacionada às características para controlar a incidência causada por insetos ("Ozawa, R., Arimura, G., Takabayashi, J., Shimoda, T., e Nishioka, T. (2000) Involvement of jasmonate- and salicylate-related signa- Iing pathways for the production of specific herbivore-induced volatiles in plants, Plant Cell Physiol. 41, 391-398.", "Takabayashi, J. ed. (2003) Protein, nucleic acid and enzyme (Tampakushitsu, kakusan, kouso), vol. 48 (13), ou- tubro de 2003"). Portanto, uma pessoa versada na técnica pode facilmente entender que uma planta transformada de acordo com a presente invenção pode adicionalmente controlar a incidência causada por insetos. Exemplos
A presente invenção será descrita em detalhe nos Exemplos. Deve ser observado que a presente invenção não está limitada aos Exem- plos.
(1) Uma Planta a Ser Usada
Para a Arabidopsis thaliana do tipo selvagem, usou-se a Colum- bia (Col-0). Uma cad2-1 mutante, na qual a quantidade de glutationa endó- gena foi reduzida (Howden, R., Anderson, C.R., Goldsbrough, P.B. e Cobbett, C.S. (1995) A cadmium-sensitive, glutathione-deficient mutant of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 107: 1067-1073.), foi proporcionada pelo Dr. Christo- pher S. Cobbett (Universidade de Melbourne, Parkville, Austrália).
As plantas foram semeadas em um pote plástico quadrado (6,5 χ 6,5 χ 5 cm) enchido com solo de três camadas tendo camadas de vermiculita (Asahi-Kogyo, Okayama, Japão), solo de cultura Kureha (solo de cultivo de jardim Kureha, Kureha Co., Tóquio, Japão), e vermiculita, a partir do fundo. As camadas foram preparadas em uma razão de 2:2:1 (na ordem listada acima). Então, as plantas foram desenvolvidas sob uma condição de dia longo (16 h de luz/8 h de escuridão) a 22°C de uma temperatura de cresci- mento, ou sob uma condição de dia curto (10 h de luz/14 h de escuridão) a 22°C de uma temperatura de crescimento.
(2) Clonagem de um Gene de FBA1, Produção de um Gene de FBA1 Muta- do e Produção de uma Planta Transformada de FBA1 Superexpressa
O RNA total foi isolado da Arabidopsis thaliana do tipo selvagem Columbia (CoI-O) na idade de 4 semanas. Então, a RT-PCR (a quantidade de RNA de molde: 5,0 μg) foi realizada utilizando o kit de RT-PCR de primei- ra fita Prostar (Stratagene, La Jolla, CA, E.U.A.), de modo que um cDNA foi produzido.
Conforme ilustrado na figura 1, os iniciadores específicos a se- guir, os quais foram projetados com base em uma seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 3) da FBA1, foram usados de modo que dois fragmentos de cDNA de tamanho natural foram amplificados por PCR. Então, cada um dos fragmen- tos foi clonado por TA em um vetor pGEM-T (Promega, Madison, Wl, E.U.A.). 1F-1: 5'-GGATCCTATGGCGTCTGCTAG-3' (SEQ ID NO: 4) 1R-1: 5'-ATCTGCAACGGTCTCGGGAGA-3' (SEQ ID NO: 5) 1F-2: 5'-GTGTGGTCCGAGGTGTTCTTCT-3' (SEQ ID NO: 6) 1R-2: 5'-GAGCTCGAGTAGGTGTAACCCTTG-3' (SEQ ID NO: 7) Os dois fragmentos foram fundidos em um sítio Bstpl, de modo
que foi construído um vetor (pGEM-FBA1) incluindo o cDNA de tamanho natural. Para o propósito de produzir uma planta transformada, o pGEM- FBA1 foi processado pelas enzimas de restrição BamHI e Saci, e então os fragmentos foram introduzidos em um vetor pB1121. Ademais, foram produzidas quatro construções para expressar
as proteínas FBA1 mutadas (fba1C72A, fba1C128A, fba1C156A, e fba1C187A, respectivamente). Nas quatro construções, o diferente de quatro resíduos de cisteína em uma proteína FBA1 foi substituído por um resíduo de alanina, respectivamente. Todos os quatro resíduos de cisteína foram codificados em uma construção incluindo um fragmento de BamHI-BstpI dos dois fragmentos de cDNA que foram usados para produzir o pGEM-FBA1.
Em vista disso, a PCR foi primeiramente realizada usando uma combinação de um iniciador pGEM-del-Apal e um iniciador SP6, de modo a amplificar um fragmento no qual foi removido um sítio de clonagem múltipla do vetor pGEM. Então, a PCR foi primeiramente efetuada usando uma combinação de um iniciador T7 e qualquer um dos iniciadores Ald-C72A, Ald-C 128A, Ald- C156A, ou Ald-Cl 87A, de modo a obter um fragmento no qual foi introduzida a mutagênese sítio-dirigida. A PCR precedente foi realizada em um ciclo de 95°C por 5 minutos e em 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por um minuto, e 72°C por um minuto. T7: 5'-CCGCTGAGCAATAACTAGC-3' (SEQ ID NO: 8) SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAT-3' (SEQ ID NO: 9)
pGEM-del-Apal: 5'-TCACTATAGGGCGAATTGGTACCGA-3' (SEQ ID NO: 10) Ald-C72A: 5'-AATGCAACCGCTGGGAAGAGG-3' (SEQ ID NO: 11) Ald-Cl28A: 5'-TTTGTCGATGCCTTGCGCGATG-3' (SEQ ID NO: 12) Ald-Cl56A: 5'-GTCTTGGGCCCAAGGCTTGG-3' (SEQ ID NO: 13) Ald-Cl87A: 5'-AGTGTTCCCGCCGGTCCTTCA-3' (SEQ ID NO: 14)
Então, 0,5 μΙ cada de dois produtos da PCR assim obtidos foi misturado, desnaturado termicamente, e esfriado lentamente (94°C por 10 minutos, 37°C por 15 minutos, e 4°C por 35 minutos). Após 0,5 μΙ de LA-Taq (TAKARA BIO Inc., Tóquio, Japão) ser adicionado nele, o seu tratamento térmico foi realizado a 72°C por 3 minutos. Ademais, o iniciador T7 (10 μΜ) e o iniciador SP6 (10 μΜ) foram adicionados ao mesmo, e a sua PCR foi reali- zada em 10 ciclos de 94°C por 30 segundos, 57°C por um minuto, e 72°C por um minuto. Então, os fragmentos da PCR assim obtidos foram digeridos usando as enzimas de restrição Apal e BamHI, e subclonados em um vetor pBluscript SK. Após o processo de subclonagem, os fragmentos de digestão de BamHI e Bstpl foram fundidos com um outro fragmento de cDNA (o frag- mento Bstpl-Sacl), de modo a serem introduzidos em um vetor de expressão ρΒΙ121.
Os vetores de expressão pBM21 assim preparados de acordo com o procedimento precedente foram introduzidos em Col-O e cad2-1 por utilização do método com Agrobacterium (Clough, S.J. e Bent, A.F. (1998) Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-743.), de modo que foi produzida uma planta transformada.
Especificamente, um processo de seleção foi repetidamente rea- lizado sobre um meio ágar (1/2 da concentração de um meio Murashige- Skoog) contendo canamicina, que era um marcador de seleção. Após ser atingida tal fase que todas as sementes puderam desenvolver-se sobre o meio contendo a canamicina (isto é, uma geração na qual não foram segre- gadas as características), o nível de expressão do gene introduzido foi me- dido usando a análise por RT-PCR, e com isso a produção de uma planta transformada foi confirmada. Antes da RT-PCR ser realizada, o RNA foi ex- traído de três folhas amadurecidas de Arabidopsis thaliana transformada na idade de 4 semanas por utilização do Mini Kit de Planta RNeasy (QIAGEN, Valencia, CA, E.U.A.), e um cDNA foi preparado usando o Kit de RT-PCR de primeira Fita Prostar (Stratagene, La Jolla, CA, E.U.A.). Então, a RT-PCR foi realizada em 26 ciclos (94°C por 30 segundos, 58°C por 60 segundos, e 72°C por 60 segundos), utilizando solução de reação incluindo 7,5 μΙ da pré- mistura EX-taq (TaKaRa, Otsu, Shiga, Japão); 2 μΙ de iniciador FBA1-F (1,33 μΜ); 2 μΙ de molde de cDNA (0,025 μg); e 1.5 μΙ de H2O. Um gene de Tubu- lina, cuja expressão foi confirmada constitutivamente, foi usado como um controle. A RT-PCR para a Tubulina foi realizada em 22 ciclos (94°C por 30 segundos, 58°C por 60 segundos, e 72°C por 60 segundos), usando: um conjunto de iniciadores de Tublina-F e Tublina-R; e a mesma solução de re- ação usada na RT-PCR precedente. O produto da PCR foi confirmado por eletroforese em gel de agarose a 1,2%, e medido quantitativamente usando o Bioanalisador Agilent Technologies 2100 (Agilent Technologies, Hachioji, Japão).
FBA1-F: 5'-TCTGCTAGCTTGGTTAAGCCTAAC-3' (SEQ ID NO: 15) FBA1-R: 5'-GGCATCGCGCAAGCAATCGACAAA-3' (SEQ ID NO: 16) Tubulina-F: 5'-GTCCAGTGTCTGTGATATTGCAC-3' (SEQ ID NO: 17) Tubulina-R: 5'-GCTTACGAATCCGAGGGTGC-3' (SEQ ID NO: 18)
A figura 2 mostra o resultado da eletroforese. A tubulina era um gene de controle cuja expressão pôde ser confirmada constitutivamente sob as condições de crescimento nos presentes Exemplos. Conforme está claro a partir da figura 2, confirmou-se que 35S-FBA1, 35S-fba1C72A, 35S- fba1C128A, 35S-fba1C156A, e 35S-fba1C187A tinham uma quantidade au- mentada de mRNA de FBA1, comparadas com o tipo selvagem (Col-0). Si- milarmente, confirmou-se que 35S-FBA1/cad2-1 tinha uma quantidade au- mentada de mRNA de FBA1, comparada com cad2-1.
No presente Exemplo, um vetor de expressão foi construído u- sando um cDNA. Diferente disto, uma pessoa versada na técnica pode fa- cilmente entender que uma planta transformada pode ser obtida por (i) clo- nagem de um gene de FBA1 incluindo o intron a partir de um DNA genômico, (ii) construção de um vetor de expressão com o gene, e (iii) introdução do vetor de expressão em uma planta. (3) Um Mutante de um Gene de FBA1 com T-DNA Inserido
A partir de GABI-Kat (Alemanha, http://www.gabi-kat.de/db), proporcionaram-se comercialmente sementes (em um estado heterogêneo) de um mutante (ID da Linhagem GK 049B07) no qual o T-DNA foi inserido em um gene de FBA1 de Arabidopsis thaliana. A figura 3 mostra uma posi- ção na qual o T-DNA é inserido. Conforme ilustrado na figura 3, os iniciado- res a seguir, específicos para o T-DNA e o gene de FBA1, foram projetados, e os mutantes homogêneos foram selecionados por PCR usando um DNA genômico como um molde.
T-1: 5'-CTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAA-3' (SEQ ID NO: 19) F-1: 5'-GGGGAATAAAATGGTAAAGAGAAGGAGGC-3' (SEQ ID NO: 20) F-2: 5'-GCAATAATCAGAGAATCTCACTCT-3' (SEQ ID NO: 21) Especificamente, os seguintes procedimentos foram realizados.
As sementes proporcionadas por GABI-Kat foram semeadas, e duas folhas foram cortadas duas semanas após a semeadura. Então, as du- as folhas foram colocadas em um tubo Eppendorf de 1,5 ml e foram tritura- das. 100 μΙ de solução de extração de DNA (incluindo Tris/HCI a 200 mM em pH 7,5, NaCI a 250 mM, EDTA a 2,5 mM em pH 8,8, e 0,5% de SDS) foram adicionados nela e a solução assim preparada foi bastante agitada nisto.
Então, a solução assim preparada foi centrifugada a 10.080xg por 10 minu- tos. Após isto, 80 μΙ do sobrenadante resultante foram transferidos para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml, e 60 μΙ de isopropanol foram adicionados nele e a solução assim preparada foi agitada nele. Então, a solução assim obtida foi centrifugada a 10.080xg por 10 minutos. Após isto, o sobrenadante resultante foi descartado, e 200 μΙ de etanol a 70% foram adicionados nele e a mistura assim obtida foi agitada bem. Subseqüentemente, a mistura foi centrifugada a 10.080xg por 5 minutos, e então o sobrenadante resultante foi descartado e o precipitado foi secado a vácuo (TOMY Micro Vac) por 15 minutos. Então, o precipitado secado foi dissolvido em 20 μΙ de TE, e a solu- ção resultante foi centrifugada a 10.080xg por 10 minutos. O sobrenadante resultante foi usado como um molde para a PCR. A PCR foi realizada com uma solução de reação de PCR que continha: 2 μΙ de MgCI2 a 25 mM; 2 μΙ de IOxtampão de PCR; 0,5 μΙ de dNTP a 10 mM; 0,15 μΙ de Taq DNA poli- merase da Sigma; 1,0 μΙ de solução de molde de DNA; 1,0 μΙ de primerl; 1,0 μΙ de primer2; e 12,35 μΙ de H2O. A PCR foi realizada em 25 ciclos (94°C por segundos, 60°C por 60 segundos, e 72°C por 120 segundos). A PCR foi realizada com duas combinações dos iniciadores: (i) o iniciador F-Ieo inici- ador F-2; e (ii) o iniciador F-1 e o iniciador T-1. Após a PCR, a eletroforese em gel de agarose a 1,2% foi efetuada, de modo que fosse obtido um indivi- dual no qual uma banda foi observada somente para a combinação de (ii) o iniciador F-1 e o iniciador T-1 como um mutante de FBA1 com T-DNA homo- gêneo inserido. Daqui em diante, este mutante de FBA1 com T-DNA inserido é referido como "049B07".
(4) Um Experimento 1 de Inoculacão com Colletotrichum Hiaainsianum O Colletotrichum higginsianum, cuja planta hospedeira era uma
planta crucífera, foi usado como um fungo de amostra. O Colletotrichum hig- ginsianum foi cultivado sobre um meio de PDA com inclinação, a 22°C, por dias, e então os esporos assim obtidos foram coletados utilizando um ciclo de inoculação. Os esporos foram suspensos em água esterilizada, de modo a obter uma suspensão de esporos, que foi então ajustada para 1 χ 105 esporos/ml.
10 μΙ da suspensão de esporos foram colocados sobre dois pon-
tos cada sobre uma folha de cada tipo de Arabidopsis thaliana (Col-0, 35S- FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) na idade de 4 semanas. Os potes nos quais cada planta foi desenvolvida foram colocados sobre bandejas, as quais foram cobertas com uma cobertura plástica transparente, de modo que fosse mantida umidade suficiente nelas. Então, estas plantas foram incubadas a 22°C sob a condição de dia longo, por 6 dias.
As folhas inoculadas com Colletotrichum higginsianum foram fotografadas 6 dias após a inoculação, e coloridas com azul de tripano de modo a colorir as células necrosadas por causa da infecção, de acordo com um método por Koch e Slusarenko (Koch, E. e Slusarenko, A. (1990) Arabi- dopsis is susceptible to infection by a downy mildew fungus. Plant Cell 2, 437-445). Ou seja, a folha inoculada com Colletotrichum higginsianum foi imersa em uma solução de Lactofenol-azul de tripano (incluindo 10 ml de ácido láctico, 10 ml de glicerol, 10 g de fenol, e 10 mg de azul tripano em 10 ml de água) diluída em 1/2 com etanol. A folha foi então fervida por 3 minu- tos. Após isto, a folha foi lavada com 2,5 g/ml de hidrato de cloral (Wako, Tóquio, Japão).
A figura 4 mostra o resultado. As fotografias na parte superior na figura 4 são das folhas inoculadas com Colletotrichum higginsianum, e as fotografias na parte inferior na figura 4 são das folhas inoculadas com Colle- totrichum higginsianum e coloridas com azul de tripano. As setas na figura 4 indicam os pontos inoculados. Conforme está claro a partir da figura 4, os pontos inoculados de Col-O (tipo selvagem) foram necrosados (coloridos de azul escuro pela coloração com azul de tripano). Entretanto, nos pontos ino- culados da planta transformada (35S-FBA1/Col-0), as partes necrosadas foram dificilmente reconhecidas. Por outro lado, nos pontos inoculados de 35S-FBA1/cad2-1, que foi produzida por introdução de FBA1 em cad2-1, a introdução de 35S-FBA1 não foi efetiva e as partes necrosadas foram reco- nhecidas.
Após a coloração com azul de tripano, o número de esporos e o número de esporos tendo hifas que penetram foram contados utilizando um microscópio óptico. A figura 5 mostra o resultado. O resultado claramente mostra que a 35S-FBA1/Col-O tinha um menor número de hifas que pene- tram, comparada com as plantas das outras linhagens.
Ademais, após a coloração com azul de tripano, as fotografias das hifas que penetram foram tiradas utilizando o microscópio óptico (x250). A figura 6 mostra as fotografias desse modo tiradas. As fotografias clara- mente mostram que a 35S-FBA1/Col-O tinha um comprimento mais curto das hifas que penetram e um número menor de hifas que penetram, comparada com as plantas das outras linhagens.
(5) Um Experimento 2 de Inoculação com Colletotrichum Higginsianum
Uma suspensão de esporos (concentração: 1 χ 102 esporos/ml)
de Colletotrichum higginsianum foi preparada no mesmo modo como em (4).
A suspensão de esporos foi pulverizada e inoculada sobre cinco tipos de Arabidopsis thaliana (Col-0, 35S-FBA1/Col-0, cad2-1, 35S- FBA1/cad2-1, e 049B07) na idade de 4 semanas. Os potes nos quais cada planta foi desenvolvida foram colocados sobre bandejas, as quais foram co- bertas com uma cobertura plástica transparente, de modo que fosse mantida umidade suficiente. Então, estas plantas foram incubadas a 22°C sob a con- dição de dia longo, por 24 dias.
A figura 7 mostra a fotografia das plantas de cada linhagem, a fotografia tendo sido tirada 24 dias após a inoculação. A figura 7 claramente mostra o que segue: (i) em 35S-FBA1/Col-O1 embora as folhas infectadas com Colletotrichum higginsianum pela pulverização efetuada em um estágio inicial deste experimento tenham sido necrosadas, formaram-se novas fo- lhas e não ocorreu nenhuma infecção adicional; (ii) por outro lado, nas plan- tas das outras linhagens, quase todas as folhas foram necrosadas, e a infec- ção espalhou-se para as novas folhas que foram formadas.
(6) Um Experimento de Inoculação com a Cepa de Pseudomonas Svrinoae DV. Tomato DC3000
A resistência aos fungos patogênicos de plantas foi investigada usando a cepa de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Sabe-se que a cepa de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 é um fungo patogêni- co de planta que pode infectar a Arabidopsis thaliana. A cepa de Pseudomo- nas syringae pv. tomato DC3000 de um estoque em glicerol (-80°C) foi ino- culada riscando sobre um meio de KB ágar (incluindo 20 g de proteose pep- tona N8 3; 1,4 g of K2HPO4; 0,4 g de MgSO4 TH2O; e 10 ml/L de glicerol), e foi cultivada a 28°C por 2 dias. Então, as células foram coletadas usando um Raspador de Células (Asahi Techno Glass, Funahashi, Chiba, Japão). As células foram suspensas em uma quantidade apropriada de solução de Mg- Cl2 a 10 mM, de modo a obter uma suspensão, a qual foi então ajustada pa- ra 108 cfu/ml. A suspensão foi pulverizada e inoculada sobre cinco tipos de Arabidopsis thaliana (Col-0, 35S-FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) na idade de 4 semanas. Então, estas plantas foram incubadas a 22°C sob a condição de dia longo.
A figura 8 mostra o resultado. Conforme está claro a partir da figura 8, a 35S-FBA1/Col-O teve um número notavelmente menor das folhas que foram necrosadas, comparada com as plantas das outras linhagens. Com relação a uma planta na qual a FBA1 é para ser introduzida (isto é, uma planta hospedeira), o que segue deve ser observado. Quando a FBA1 foi introduzida na cad2-1, a eficácia da introdução foi reduzida, comparada com um caso no qual a FBA1 é introduzida em Col-0. Portanto, é aparente que a eficácia da introdução da FBA1 aumenta quando a FBA1 é introduzida em uma planta da linhagem tendo uma maior capacidade sintética de gluta- tiona.
(7) Tratamento com Salicilato
O salicilato a 1 mM foi pulverizado sobre cinco tipos de Arabi- dopsis thaliana (Col-0, 35S-FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) na idade de 4 semanas, e uma cobertura plástica transparente foi usada para cobrir, de modo que fosse mantida a umidade. O salicilato é uma substância de sinal sintetizada dentro de uma planta, quando a planta é in- fectada com germes (especialmente as bactérias patogênicas), para o pro- pósito de reação para controlar a incidência causada por pragas, incluindo os insetos e as doenças. A PR1 é uma proteína antibacteriana cuja expres- são é controlada por um sinal do salicilato.
Após a pulverização, três folhas foram colhidas de cada planta.
Especificamente, uma folha foi colhida 6 horas após a pulverização, uma outra folha foi colhida 12 horas após a pulverização, e a outra folha foi colhi- da 24 horas após a pulverização. Então, as folhas foram imobilizadas usan- do nitrogênio líquido. O RNA de cada folha foi purificado. Então, um cDNA foi produzido a partir de uma quantidade igual de rRNA de 18S derivado de cada RNA. Com uma solução de reação contendo: 7,5 μΙ de pré-mistura EX- tag (TaKaRa, Shiga, Japão); 2 μΙ de iniciador PR1-F (1,33 μΜ); 2 μΙ de inici- ador PR1-R (1,33 μΜ); 2 μΙ de molde de cDNA (0,025 Mg); e 1,5 μΙ de H2O, a RT-PCR foi realizada em 30 ciclos (94°C por 30 segundos, 58°C por 60 se- gundos, e 72°C por 60 segundos).
Os iniciadores usados são como a seguir: PR1-F: 5'-CAGCCCCAAGACTACTTCAATGC-3' (SEQ ID NO: 22) PR1-R: 5'-GGTCGTTCAATAAGAATGACAGACG-3' (SEQ ID NO: 23)
Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,2%, e medidos quantitativamente usando o Bio-Analisador (Agi- Ient Technologies, Alemanha). A figura 9 (a) e a figura 9 (b) mostram o resul- tado. A figura 9 (a) mostra o resultado da eletroforese, e a figura 9 (b) mostra a quantidade relativa de mRNA de PR1. Conforme está claro a partir da figu- ra 9 (a) e da figura 9 (b), a 35S-FBA1/Col-O manteve um nível de expressão maior de um gene de PR1, mesmo após 24 horas terem se passado desde que foi efetuado o tratamento com salicilato, comparada com as plantas das outras linhagens. Com relação a uma planta na qual a FBA1 é para ser in- troduzida (isto é, uma planta hospedeira), o que segue deve ser observado. Quando a FBA1 foi introduzida na cad2-1, a eficácia da introdução foi redu- zida, comparada com um caso no qual a FBA1 foi introduzida em Col-0. Por- tanto, é aparente que a eficácia da introdução da FBA1 aumenta quando a FBA1 é introduzida em uma planta da linhagem tendo uma maior capacida- de sintética de glutationa. (8) Tratamento com Jasmonato
O jasmonato a 50 μΜ foi pulverizado sobre cinco tipos de Arabi- dopsis thaliana (Col-0, 35S-FBA1/Col-0, cad2-1, 35S-FBA1/cad2-1, e 049B07) na idade de 4 semanas, e uma cobertura plástica transparente foi usada para cobrir, de modo que fosse mantida a umidade. Sabe-se que o jasmonato é uma substância de sinal sintetizada dentro de uma planta, quando a planta é infectada com microorganismos patogênicos (especial- mente os micetos) ou submetida ao dano por alimentação causado por inse- tos, para o propósito de reação de defesa contra a incidência causada por doença ou insetos. A PDF1.2 é uma proteína antifúngica cuja expressão é controlada por um sinal do jasmonato.
Após a pulverização, três folhas foram colhidas de cada planta. Especificamente, uma folha foi colhida 6 horas após a pulverização, uma outra folha foi colhida 12 horas após a pulverização, e a outra folha foi colhi- da 24 horas após a pulverização. Então, as folhas foram imobilizadas usan- do nitrogênio líquido. O RNA de cada folha foi purificado. Então, um cDNA foi produzido a partir de uma quantidade igual de rRNA de 18S derivado de cada RNA. Após isto, a solução de reação contendo: 7,5 μΙ de pré-mistura EX-tag (TaKaRa, Shiga, Japão); 2 μΙ de iniciador PDF1.2-F (1,33 μΜ); 2 μΙ de iniciador PDF1.2-R (1,33 μΜ); 2 μΙ de molde de cDNA (0,025 μg); e 1,5 μΙ de H2O foi preparada, e a RT-PCR foi realizada em 27 ciclos (94°C por 30 segundos, 58°C por 60 segundos, e 72°C por 60 segundos).
Os iniciadores usados para amplificar a PDF1.2 são como se
segue:
PDF1.2-F: 5'-TAAGTTTGCTTCCATCATCACCC-3' (SEQ ID NO: 24) PDF1.2-R: 5'-GTGCTGGGAAGACATAGTTGCAT-3' (SEQ ID NO: 25)
Assim como em (5) acima, os produtos da PCR foram submeti- dos à eletroforese em gel de agarose a 1,2%, e medidos quantitativamente usando o Bio-Analisador. A figura 10 (a) e a figura 10 (b) mostram o resulta- do. A figura 10 (a) mostra o resultado da eletroforese, e a figura 10 (b) mos- tra a quantidade relativa de mRNA de PDF1,2. Conforme está claro a partir da figura 10 (a) e da figura 10 (b), a 35S-FBA1/Col-0 teve um nível de ex- pressão maior de um gene de PDF1.2 24 horas após o processamento com jasmonato, comparada com as plantas das outras linhagens. Com relação a uma planta na qual a FBA1 é para ser introduzida (isto é, uma planta hospe- deira), o que segue deve ser observado. Quando a FBA1 foi introduzida na cad2-1, a eficácia da introdução foi reduzida, comparada com um caso no qual a FBA1 foi introduzida em Col-0. Portanto, é aparente que a eficácia da introdução da FBA1 aumenta quando a FBA1 é introduzida em uma planta da linhagem tendo uma maior capacidade sintética de glutationa. (9) Características de Crescimento da Planta
[9-1] Comparação entre uma planta transformada (35S- FBA1/Col-0) e uma planta do tipo selvagem (CoI-O)
Observou-se que a Arabidopsis thaliana transformada (35S- FBA1/Col-0), na qual foi introduzido um gene de FBA1, tinha características de crescimento da planta significativamente aperfeiçoadas, comparada com a Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Col-0).
A figura 11 mostra uma fotografia comparando entre Col-O e 35S-FBA1/Col-0, cada uma de Col-O e 35S-FBA1/Col-O estando na idade de 6 semanas. Esta claramente mostra que a 35S-FBA1/Col-O é maior do que a Col-0.
[9-2] Características de crescimento da planta de uma planta transformada, na qual é introduzida uma FBA1 de aminoácido substituído
Para clarificar a importância de um resíduo de cisteína contido em uma seqüência de aminoácidos de FBA1 (SEQ ID NO: 1), quatro tipos de Arabidopsis thaliana (35S-fba1 C72A, 35S-fba1 C128A, 35S-fba1 C156A, e 35S-fba1C187A) foram produzidos, de modo que eles expressaram enzimas nas quais diferentes resíduos de cisteína foram substituídos por um resíduo de alanina, de acordo com os procedimentos descritos em (2) acima (por exemplo, "C72A" representa a introdução de uma construção expressando uma enzima FBA1 na qual a cisteína na posição 72 de SEQ ID NO: 1 foi substituída por alanina).
A figura 12 mostra uma fotografia das plantas 30 dias após a semeadura. A figura 13 mostra um gráfico comparando entre as plantas no (i) peso novo da parte moída acima de uma planta e no (ii) número total de folhas de roseta de uma planta, Conforme está claro a partir da figura 12 e da figura 13, a 35S-fba1 C72A e a 35S-fba1 C187A tiveram características de crescimento da planta mais aperfeiçoadas, assim como a 35S-FBA1/Col-O teve, comparadas com um tipo selvagem (Col-0). Por outro lado, a 35S- fba1C128A e a 35S-fba1C156A exibiram características de crescimento da planta similares às características de crescimento da planta do tipo selva- gem (Col-0), embora a eficácia fosse diferente entre as três, dependendo da intensidade da luz durante o crescimento da planta. De acordo com este re- sultado, sugeriu-se tal possibilidade que a cisteína que desempenhava uma função importante para a função da FBA1 fosse a cisteína da posição 128 e a cisteína da posição 156 em SEQ ID NO: 1. Quando a cisteína da posição 72 e a cisteína da posição 187 foram substituídas por um outro aminoácido, respectivamente, as características de crescimento da planta foram aperfei- çoadas. Assim, o seguinte fato foi exemplificado: as características de cres- cimento da planta puderam ser aperfeiçoadas, mesmo em uma planta na qual foi introduzido um gene mutado para codificar a FBA1 com um aminoá- cido original substituído por um outro aminoácido em uma seqüência de a- minoácidos da FBA1.
Ademais, conforme está claro a partir da figura 13, a planta na qual as características de crescimento da planta foram aperfeiçoadas reve- lou um aumento no número total de suas folhas de roseta. Isto indicou que uma velocidade de crescimento da planta pôde ser aumentada por introdu- ção de um gene de FBA1, bem como o grau de crescimento de uma planta.
[9-3] Confirmação do aperfeiçoamento na capacidade de fixação
de CO2
Para examinar se a capacidade de fixação de CO2 potencial de uma planta 35S-FBA1 foi aperfeiçoada ou não, foi feita uma comparação entre (i) as plantas desenvolvidas em concentração de CO2 controlada para 0,3% e (ii) as plantas desenvolvidas em concentração de CO2 atmosférico. A figura 14 e a figura 15 mostram o resultado. Conforme mostrado na figura 14 e na figura 15, no caso de uma planta do tipo selvagem (Col-0), as suas ca- racterísticas de crescimento da planta foram aperfeiçoadas, juntamente com o aumento na concentração de CO2; por outro lado, no caso da planta 35S- FBA1, as suas características de crescimento da planta foram aperfeiçoadas significativamente, juntamente com o aumento na concentração de CO2. Es- te resultado indica que a capacidade de fixação de CO2 de uma planta pode ser aumentada significativamente por introdução de um gene de FBA1.
A invenção sendo assim descrita, será óbvio que o mesmo modo pode ser variado em muitas formas. Tais variações não são para serem con- sideradas como um afastamento do espírito e do escopo da invenção, e to- das as tais modificações, conforme seriam óbvias para alguém versado na técnica, são pretendidas estar incluídas no escopo das reivindicações a se- guir.
Todos os documentos acadêmicos e os documentos de patentes no presente relatório descritivo são como referência ao presente relatório descritivo.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
A presente invenção proporciona uma planta, na qual as carac- terísticas de crescimento da planta são aperfeiçoadas e a incidência causa- da por pragas, incluindo os insetos e as doenças, é controlada. Portanto, a presente invenção é esperada ser aplicável na agricultura e na silvicultura.
LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<1 JQ> AGÊNCIA DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO JAPÃO JURISDIÇÃO DE OKAYAMA
<!20> PLANTA TENDO CAPACIDADE DE CRESCIMENTO E RESISTENCÍA À DOEN- ÇAS APERFEIÇOADAS E MÉTODO PARA A SUA PRODUÇÃO
<130> A181-16
<140> PCT/JP2007/052216
<141> 2007-02-08
<150> JP 2006-032895
<151> 2006-02-09
<160> 25
<170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 391 <212> PRT
<213> ArabidopsisThaliana
<400> 1 „ , _ _ η τ
Met Aia Ser Ala Ser Phe Val Lys Pro Asn THr Leu Ser Ser Pro Trp 10 15
! Ie Gly Gln Arg Ser Rie Ala His Thr Ser Ala Ser Ser Ser Pro Pro 25 30
Pro Arg Val Ser Phe Aia Ile Arg Ala Gly Ala Tyr Ser Asp Glu Leu 40 45
Val Lya Thr Ala Lys Ser Ile Ala Ser Pro Gly Arg Gly Ile Leu Ala 50 55 60
I Ie Asp Glu Ser Asn Ala Thr Cys Gly Lys Arg Leu Ala Ser I Ie Giy 65 70 75 80
Leu Asp Asn Thr Glu Asp Asn Arg Gln Ala Tyr Arg Gtn Leu Leu Leu 85 90 95
Thr Thr Pro Gly Leu Qly Asp Tyr Ile Ser Gly Ser I Ie Leu Phe Glu 100 105 110
Glu Thr Leu Tyr Gln Ser Thr Lys Asp'Gly Lys Thr Phe Val Asp Cys 115 120 125
Leu Arg Asp Ala Asn I Ie Val Pro Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly Leu 130 135 140
Ser Pro Leu Ala Gly Ser Asn Glu Glu Ser Trp Qys Gln Gly Leu Asp 145 150 155 160
Gly Leu Ala Ser Arg Ser Ala Glu Tyr Tyr Lys Gln Gly Ala Arg Phe 165 170 175
Ala Lys Trp Arg Thr Val Val Ser Val Pro Cys Gly Pro Ser Ala Leu 180 185 190
Ala Val Lys Glu Ala Ala Trp Gly Leu Ala Arg Tyr Ala Ala I Ie Ser 195 200 205
Gln Aap Asn Bly Leu Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Ile Leu Leu Asp 210 215 220
Gly Asp His Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Val Ala Glu Lys Val Trp 225 230 235 Ζ40
Ser Glu Val Phe Phe Tyr Leu Ala Gln Asn Asn Val Uet Phe Glu Gly 245 250 255
Ile Leu Leu Lys Pro Ser Het Val Thr Pro Gly Ala Glu His Lys Asn 260 265 270 Lys Aia Ser Pro Glu Thr Val Ale Asp Phe Thr Leu Thr Met Leu Lys 275 280 285
Arg Arg Val Pro Pro Ala Val Pro Gly I Ie Met Phe Leu Ser Giy Gly 290 295 300
Cln Ser Glu Ala Glu Aia Thr Leu Asn Leu Asn Ala Ilet Asn Gln Ser 305 310 315 320
Pro Asn Pro Trp His Val Ser Phe Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Gln Asn 325 330 335
Ser Val Leu Arg Thr Trp Gln Gly Lys Pro Glu Lys Ile Glu Ala Ser 340 345 350
Gln Lys Ala Leu Leu Val Arg Ala Lys Ala Asn Ser Leu AIa Gln Leu 355 360 365
Gly Lys Tyr Ser Ala Glu GIy""θIu'"ÃsrTgTu"Tisp'ÃIa Lys Lys Gly Met 370 375 380
Phe Val Lys Gly Tyr Thr Tyr 385 390
<210> 2 <211> 1176 <212> DIW
<213> Arabidopsis Thaliana <400> 2
atggcgtctg ctagcttcgt taagcctaac accctctctt ctccatggat cggccaacgc 60
tcctttgctc acacctctgc ttcttcttct cctcctcctc gagtctcctt cgcgatccgc 120
gccggtgctt actccgacga gcttgttaaa accgccaaaa gcattgcatc ccctgggaga 180
ggtatcttgg cgatcgatga gtccaatgca acctgtggga agaggottgo ttctatoggc 240
ttggataaca ccgaggacaa ccgtcaggcc tacaggcaac ttctgcttac cactcctggc 300
ctcggcgatt acatctctgg ttccattctc ttcgaggaga ctctttacca gtccaccaag 360
gacggtaaga cctttgtcga ttgcttgcgc gatgccaaca tcgtccctgg catcaaagtt 420
gacaagggct tgtctcccct agccggttcc aacgaagagt cttggtgcca aggcttggat 480
ggattggcct cacgctctgc tgagtactac aagcaaggcg ctcgttttgc caagtggagg 540
acagtggtga gtgttccctg cggtccttca gcactggctg tgaaggaagc tgcgtggggg 600 ctggctcgct atgeagccat ctctcaggat aatggtcttg tccccattgt ggagccagag 680
atccttotgg acggggacca cccaatagag aggactctgg aggtggçaga gaaagtgtgg 720
tcagaggtgt tcttctactt ggcacagaac aacgtcatgt ttgagggcat tctgttgaag 780 ccgagcatgg tcaccccagg cgctgagcac aagaacaagg cctctcccga gaccgttgca 840
gatttcacgc tcaccatgct gaaaaggagg gttcctccgg ctgtcccagg gatcatgttt 900 ctgtcaffgag gacaatcaga ggcagaggcc acactgaacc tgaacgccat gaaccagagc 960
ccaaacccat ggcatgtgtc cttctcatac gcacgtgocc tgcagaactc cgtgctcaga 1020 _
acatggcaag gcaagccgga gaagattgag gcctcgcaga aggcactgtt ggtgagggca 1080
aaggccaact cactggccca gctcggcaaa tactcagccg agggagagaa cgaggatgcc 1140
aagaaaggaa tgtttgtcaa gggttacacc tactga 1176
<210> 3 <211> 1515 <212> DNA
<213> Arabidopsis Thaliana <400> 3
ccaaagtaga cgactactaa tagtagtaaa caaaaccttt ggctttaaca ctctcctcca 60
aatcccagat ctctctctgt ctctgtcccg cggagtcccc gagagattga tcaccatcac 120
ttttgtacct tccttgtact acctatggcg tctgctagct tcgttaagcc taacaccctc 180
tcttctccat ggatcggoca acgotoottt gctcacaoct otgcttcttc ttctoctoot 240
cctogagtct ccttcgcgat ccgcgccggt gcttactccg acgagcttgt taaaaccgcc 300
aaaagcattg catcccctgg gagaggtatc ttggcgatcg atgagtccaa tgcaacctgt 360
gggaagaggc ttgcttctat cggcttggat aacaccgagg acaaccgtca ggcctacagg 420
caacttctgc ttaccactcc tggcctcggc gattacatct ctggttocat tctcttcgag 480
gagactcttt accagtccac caaggacggt aagacctttg tcgattgctt gcgcgatgcc 540
aacatcgtcc ctggcatcaa agttgacaag ggcttgtctc ccctagccgg ttccaacgaa 600
gagtcttggt gccaaggctt ggatggattg gcctcacgct ctgctgagta ctacaagcaa 660
ggcgctcgtt ttgccaagtg gaggacagtg gtgagtgttc cctgcggtcc ttcagcactg 720
gctgtgaagg aagctgcgtg ggggctggct cgctatgcag ccatctctca ggataatggt 780
cttgtcccca ttgtggagcc agagatcctt ctggacgggg accacccaat agagaggact 840
ctggaggtgg cagagaaagt gtggtcagag gtgttcttct acttggcaca gaacaacgtc 900
atgtttgagg gcattctgtt gaagccgagc atggtcaccc caggcgctga gcacaagaac 960
aaggcctctc ccgagaccgt tgcagatttc acgctcacca tgctgaaaag gagggttcct 1020
ccggctgtcc cagggatcat gtttctgtca ggaggacaat cagaggcaga ggccacactg 1080
aacctgaacg ccatgaacca gagcccaaac ccatggcatg tgtccttctc atacgcacgt 1140 gccctgcaga actccgtgct cagaacatgg caaggoaagc cggagaagat tgaggcctcg 1200 cagaaggcac tgttggtgag ggcaaaggcc aactcactgg cccagctcgg caaatactca 1260 gccgagggag agaacgagga tgccaagaaa ggaatgtttg tcaagggtta cacctactga 1320 tttgttaatt toagagatcg taataaggat taaggaccat tgttgtcttt tgtttttttt 1380 tccctttttt gttttgtctc tgagaaagaa agacagtcac gagtcacgat catatcatat 1440 atgtatgtga gcaacgtgaa aacatcetct taaatctata tttcctctca gaaagactga 1500 ttactgtttg actgc 1515
<210> 4 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificiai: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<4Q0> 4
ggatcctatg gcgtctgcta g 21
<210> 5 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 5
atctgeaacg gtctcgggag a 21
<210> 6
<211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 6
gtgtggtccg aggtgttctt ct 22
<210> 7 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüencia Artificial: Seqüencia do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<40ü> 7
gagctcgagt aggtgtaacc cttg 24
<210> β <211> 19 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> β
ccgctgagca ataactagc 19
<210> 9 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente <4Q0> 9
atttaggtga cactatagaa t 21
<210> 10 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 10
tcactatagg gcgaattggt accga 25
<210> 11 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 11
aatgcaaccg ctgggaagag g 21
<210> 12 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 12 '
tttgtcgatg ccttgcgoga tg 22 <210> 13 <211> 20 <212> DMA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 13 on
gtcttgggcc caaggcttgg 20
<210> 14 <211> 21 <212> DMA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 14 01
agtgttcccg ccggtccttc a
<210> 15 <211> 24 <212> DHA
<213> Seqüência Artificial
<220> .. . ..
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado
Artificialmente <400> 15
tctgctagct tggttaagoc taac ^
<210> 16 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<40£» 16
ggcatcgcgc aagcaatcga caaa 24
<210> 17 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<40Q> 17
gtccagtgtc tgtgatattg cac 23
<210> 18 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 18
gcttacgaat ccgagggtgc ζυ
<210> 1θ <211> 23 <212> DMA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<4ÜQ> 19 „
ctKstttscc ccagcaggcg aaa ίύ <210> 20 <211> 29 <212> DKA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<4Q0> 20
ggggaataaa atggtaaaga gaaggaggc 29
<210> 21 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<40Q> 21
gcaataatca gagaatctca ctct 24
<210> 22 <211> 23 <212> DKA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 22
cagccceaag actacttcaa tgc 23
<210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 23
ggtcgttcaa taagaatgac agacg 25
<210> 24 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<4Q0> 24
taagtttgct tccatcatca ccc 23
<210> 25 <211> 23 <212> DWA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência do Iniciador Sintetizado Artificialmente
<400> 25
gtgctgggaa gacatagttg cat 2

Claims (4)

1. Planta transformada na qual: um DNA codificando uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glutationa é introduzido, de modo que um nível de ex- pressão da frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glu- tationa; e como uma conseqüência, as características de crescimento da planta são aperfeiçoadas e a incidência causada por pragas, incluindo inse- tos e doenças, é controlada.
2. Planta transformada de acordo com a reivindicação 1, na qual o DNA codificando a frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glutationa é selecionado a partir do grupo que consiste nos seguintes (a) até (d): (a) um DNA codificando uma proteína tendo a seqüência de a- minoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1; (b) um DNA codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos com remoção, substituição, ou adição de um ou diversos ami- noácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1; (c) um DNA tendo a seqüência de bases mostrada na SEQ ID NO: 2; e (d) um DNA que hibridiza sob condições severas com um DNA tendo a seqüência de bases mostrada na SEQ ID NO: 2.
3. Método para produzir uma planta na qual as características de crescimento da planta são aperfeiçoadas e a incidência causada por pragas, incluindo insetos e doenças, é controlada, o método compreendendo a etapa de: introduzir, em uma planta, um DNA codificando uma frutose-1,6- bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glutationa.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, no qual o DNA codificando a frutose-1,6-bisfosfato aldolase do tipo plastídio que se liga à glutationa é selecionado a partir do grupo que consiste nos seguintes (a) até (d): (a) um DNA codificando uma proteína tendo a seqüência de a- minoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1; (b) um DNA codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos com remoção, substituição, ou adição de um ou diversos ami- noácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1; (c) um DNA tendo a seqüência de bases mostrada na SEQ ID NO: 2; e (d) um DNA que hibridiza sob condições severas com um DNA tendo a seqüência de bases mostrada na SEQ ID NO: 2.
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