KR102047270B1 - CaUBP12를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 유래 신규 CaUBP12(Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성 증진 단백질을 암호화 하는 CaUBP12 유전자를 규명하였으며, CaUBP12 단백질이 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaUBP12 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CaUBP12를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법{Method for improving the resistance to the drought stress using CaUBP12 in plants}

본 발명은 고추 유래 신규 CaUBP12(Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화시킨다.

ABA는 비생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절다고 알려져 있으나, 완전한 ABA 신호전달 경로는 아직 규명되지 않았다. 식물세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려져 있다. 수용체가 ABA를 인식하면 SnRK2(non-fermenting 1-related subfamily 2) 단백질 인산화효소(kinase) 및 PP2Cs(type 2C protein phosphatases) 각각에 의해 하위 단백질이 인산화 및 탈인산화 된다. SnRK2.2, SnRK2.3, 및 SnRK2.6(OST1)와 같은 SnRK2 인산화효소는 ABA 신호전달의 양성 조절자로써 기능하고, 이와 반대로 group A PP2Cs 인산가수분해효소는 ABA의 음성 조절자 기능을 하며, ABA 수용체인 PYR/PYL/RCAR 단백질들은 group A PP2Cs과 상호작용하여 이들의 활성을 억제한다고 보고되어 있다. PYR/PYL/RCAR에 의해 ABA 발현 증가가 인식되면 단백질 인산가수분해효소-인산화효소 상호작용이 억제되고, SnRK2 type 인산화효소 분비가 유도된다. SnRK2 인산화효소는 전사인자 및 SLAC1 음이온 채널을 포함하는 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.

한편, 유비퀴틴화(ubiquitination) 경로를 통한 단백질 분해는 식물체가 비생물적 스트레스에 대한 적응 및 방어 반응을 조절하기 위한 중요한 기작 중 하나이다. 유비퀴틴화는 E1(ubiquitin activating enzyme), E2(ubiquitin-conjugating enzyme) 및 E3(ubiquitin ligase)로 구성되는 3가지 효소의 연속적인 작용에 의해 일어나는 중요한 번역 후 조절과정이다. 유비퀴틴이 E1에 의해 활성화되면, 활성화된 유비퀴틴은 E2로 전달되고 E3 리가아제가 유비퀴틴과 표적 단백질을 결합시킨다. 이러한 과정에서 E3 리가아제가 표적 단백질을 결정하고 이에 결합한다.

유비퀴틴 중합체 또는 융합단백질의 형태로 생성된 유비퀴틴은 생성과 동시에 연결부위의 α-펩티드 결합이 절단되면서 유비퀴틴 단량체로 되는데, 이 과정은 유비퀴틴 다음의 펩티드 결합을 절단하는 효소인 유비퀴틴 특이 분해 효소인 DUB (de-ubiquitinating enzyme)에 의해 촉매 된다. 이와 같은 DUB 효소에는 시스테인 단백질 분해효소의 두 그룹인 UBPs (ubiquitin-specific processing protease, 유비퀴틴 특이 단백질 분해효소)와 UCHs (ubiquitin C-terminal hydrolase, 유비퀴틴 키르복시 말단 가수분해효소)가 포함된다 (Tobias amp; Varshavsky, (1991) J Biol. Chem. 266, 12021; Pickart amp; Rose, (1985) J Biol. Chem. 260, 7903). UCH와 UBP 두 효소 그룹 모두 유비퀴틴의 카르복시 말단의 펩티드 결합을 가수분해한다. UCH는 약 20-30 킬로달톤으로 비교적 크기가 작고 유비퀴틴의 카르목시 말단의 아마이드와 에스테르를 절단하는 한편 UBP는 α-펩티드 또는 ε-이소펩티드 결합으로 연결된 유비퀴틴 결합단백질로부터 유비퀴틴을 해리한다. 유비퀴틴을 이용한 단백질이나 펩티드의 유전공학적 생산기술의 가장 중요한 요소 중의 하나는 UBP와 같은 선택적절단 효소이다. 따라서 UBP의 다양한 유전공학적 이용을 위하여 유비퀴틴 뒤에 연결된 단백질의 크기에 구애받지 않고 활성이 높은 UBP 효소에 대한 연구는 다수 이루어 지고 있으나 UBP를 이용하여 식물의 가뭄 저항성을 증가시키는 연구는 미흡한 실정이다.

대한민국 등록특허 10-1775788 대한민국 등록특허 10-1608175

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자 들은 고추에서 유비퀴틴 특이 단백질 분해효소 유전자인 CaUBP12(Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자를 과발현 시킬 경우, 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시킨다는 것을 확인하여, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 양성적 조절인자(positive regulator) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaUBP12(Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CaUBP12 유전자에 의해 암호화되는 서열번호2의 아미노산 서열로 이루어진 CaUBP12 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CaUBP12 유전자 또는 CaUBP12 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaUBP12 유전자를 식물체에 형질전환하여 과발현시킴으로써 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaUBP12(Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CaUBP12 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaUBP12 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CaUBP12 유전자 또는 CaUBP12 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

(a) CaUBP12(Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaUBP12 단백질을 과발현시키는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성 증진 단백질을 암호화 하는 CaUBP12 유전자를 동정하였으며, CaUBP12 단백질은 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaUBP12 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는, 고추잎에 가뭄, 저온조건, ABA, H₂O₂ 또는 NaCl을 처리한 결과 CaUBP12 유전자의 발현패턴을 나타낸 것이다.
도 1b는, CaUBP12 유전자의 식물 조직별 발현양을 상대적으로 나타낸 것이다.
도 1c는, CaUBP12 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여 CaUBP12 융합단백질의 형광신호를 확인한 결과이다.
도 2a는, CaUBP12-silenced 고추 식물과 대조군의 CaUBP12의 발현량을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 2b는, CaUBP12-silenced 고추 식물과 대조군의 건조 표현형과 생존율을 나타낸 것이다.
도 2c는, CaUBP12-silenced 고추 식물과 대조군 잎의 수분손실률을 나타낸 것이다.
도 2d는, CaUBP12-silenced 고추 식물과 대조군 잎의 온도를 나타낸 것이다.
도 2e는, 도 2d의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2f는, CaUBP12-silenced 고추 식물과 대조군 잎의 기공개도를 나타낸 것이다.
도 2g는, 도 2f의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a는, ABA 처리 조건에서 CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis와 야생형 대조군의 발아율을 비교한 것이다.
도 3b는, ABA 처리 조건에서 CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis와 야생형 대조군의 녹색 자옆의 비율을 나타낸 것이다.
도 3c는, ABA 처리 조건에서 CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis와 야생형 대조군의 뿌리성장을 비교한 것이다.
도 3d는, 도 3c의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3e는, ABA 처리 조건에서 CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis와 야생형 대조군의 발아 이후 ABA 처리시 뿌리성장의 차이를 나타낸 것이다.
도 3f는, 도 3e의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4a는, 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서 CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis와 대조군간 건조표현형을 나타낸 것이다.
도 4b는, 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서 CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis와 대조군간 생존율을 나타낸 것이다.
도 4c는, 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서 CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis와 대조군간 잎의 수분손실률을 나타낸 것이다.
도 4d는, 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서 CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis와 대조군 잎의 기공개도를 나타낸 것이다.
도 4e는, 도 4d의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4f는, 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서 CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis와 대조군간 잎의 온도를 나타낸 것이다.
도 5a는, CaUBP12 유전자가 과발현된 Arabidopsis에서 ABA 농도와 빛 조건에 따른 기공개도의 실험결과를 현미경으로 관찰한 것이다.
도 5b는, 도 5a의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6a는, CaUBP12 효소 기능을 상실한 CaUBP12 ^C191S -OX 식물과 대조군인 CaUBP12-OX의 뿌리성장을 비교한 것이다.
도 6b는, 도 6a의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6c는, CaUBP12 효소 기능을 상실한 CaUBP12 ^C191S -OX 식물과 대조군인 CaUBP12-OX의 건조표현형을 나타낸 것이다.
도 6d는, CaUBP12 효소 기능을 상실한 CaUBP12 ^C191S -OX 식물과 대조군인 CaUBP12-OX의 생존률을 나타낸 것이다.
도 7a은, CaUBP12-silenced 식물과 대조군에서 건조내성 관련 유전자의 발현 정도를 qPCR로 분석한 결과이다.
도 7b는, CaUBP12 과발현 식물 및 대조군에서 건조내성 관련 유전자의 발현 정도를 qPCR로 분석한 결과이다.
도 8a는, CaUBP12-silenced 고추식물과 대조군간 CaUBP12 유전자의 발현 정도를 비교한 것이다.
도 8b는, CaUBP12-OX 고추식물과 대조군간 CaUBP12 유전자의 발현 정도를 비교한 것이다.
도 8c는, CaUBP12 ^C191S -OX 고추식물과 대조군간 CaUBP12 유전자의 발현 정도를 비교한 것이다.

본 발명자들은, ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하는 유비퀴틴 특이 단백질 분해효소인 CaUBP12 유전자를 동정하였고, 상기 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물체에서 건조 스트레스에 대한 저항성 증가를 확인함으로써 본 발명은 완성하였다.

이에, 본 발명은 본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자 단백질을 암호화하는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaUBP12(Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 유전자 및 이에 의해 암호화되는 서열번호2의 아미노산 서열의 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 유전자인 CaUBP12는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaUBP12 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "양성 조절인자(positive regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 증가방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaUBP12가 과발현되는 경우, ABA 민감도 증가, 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가될 수 있다.

본 발명자들은 건조 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, 유비퀴틴 특이 단백질 분해효소인 CaUBP12을 동정하였고, 앱시스산 (ABA)의 민감도가 증가할수록 기공폐쇄를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스산 또는 건조 스트레스와 CaUBP12 유전자간의 연관성을 규명하고자 하였다.

우선, 본 발명의 일실시예에서는, CaUBP12 유전자를 분리하였으며, 35S:CaUBP12-GFP 융합단백질을 이용하여 CaUBP12 단백질이 핵에 위치하고, 꽃에서 가장 많이 발현되는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는, 건조, ABA, H₂O₂ 또는 저온 처리한 고추 식물 잎에서 CaUBP12 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, ABA를 처리한 조건에서 CaUBP12의 발현이 저해된 고추 및 정상대조군 고추 식물의 잎에서 잎 온도, 기공개도, 수분손실률, 및 생존률 등을 측정함으로써 CaUBP12 유전자 침묵에 의한 ABA 감수성 감소 효과를 확인하였고, 실제로 CaUBP12 발현이 저해된 식물에서 대조군에 비해 건조 스트레스 저항성이 감소되는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaUBP12을 과발현하는 형질전환 애기장대 식물체를 제작하여 ABA를 처리한 조건에서 야생형 식물체와 CaUBP12 과발현 식물체의 잎 온도, 증산률, 형태 및 생존률등의 측정을 통해 CaUBP12이 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 양성 조절자로 작용함을 확인하였으며(실시예 5 참조), 실제로 애기장대 식물에서 CaUBP12 유전자 과발현시 건조 저항성 증가를 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaUBP12 효소활성을 상실한 CaUBP12 ^C191S -OX(cysteine to serine) 식물을 이용하여 ABA 처리 조건에서 뿌리생장, 생존률 등을 관찰한 결과, CaUBP12의 deubiquitinating 활성이 가뭄저항성에 있어 핵심적인 기능을 한다는 것을 확인하였다(실시예 7 참조).

본 발명의 다른 양태로서, 서열번호 1의 CaUBP12 유전자 또는 서열번호 2의 CaUBP12 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) CaUBP12(Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaUBP12 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법, 및 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

고추 (Capsicum annuum L., cv. Nockwang), 및 담배 (Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v), 사토(sand), 및 양토(loam soil)를 1:1:1(v/v/v)로 섞고 파종하였다. 이후 고추 식물은 27±1℃ 조건의 생육실에서 16시간 빛/ 8시간 암주기로 백색 형광등(80 μmol photons m^-2·S^-1) 빛 아래 성장시켰다. 담배 식물은 16 시간 빛 / 8 시간 암주기로 25±1℃ 조건의 성장 챔버에서 유지시켰다. 애기 장대(Arabidopsis thaliana, 생태형 Col-0) 식물 종자를 1 % sucrose와 Microagar (Duchefa 생화학)가 포함된 Murashige and Skoog (MS) 소금에서 발아시켰다. 모든 종자는 성장실에 넣기 전에, 4℃에서 2일간 개화결실을 맺게 하였고, 그 플레이트를 성장 챔버에서 16 시간 빛 / 8 시간 암주기로 24℃에서 배양하였다. 애기 장대 모종은 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=9:1:1, v/v/v)에 24℃에서 16 시간 빛 / 8 시간 암주기로 백색 형광등(130 μmol photons m^-2·S^-1) 빛 아래 60% 상대습도로 유지시켰다.

1-2. CaUBP12 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 제조

전장 CaUBP12의 cDNA를 pENTR / D-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합하고, CaUBP12 유전자의 구성적 발현을 위해 LR 반응을 사용하여 pK2GW7 이원매개체( binary vector )를 애기 장대의 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터 제어 하에 삽입 하였다. 35S : CaUBP12 구조를 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciens )균주 GV3101 로 형질 전환시켰다. 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciens ) 매개한 형질전환은 꽃가루 딥 방법(floral dip method) (Clough and Bent, 1998)을 통해 수행되었다. 형질 전환된 계통을 선택하기 위해, 형질 전환된 식물체로부터 수확한 종자를 카나마이신(kanamycin) 50 μg·mL^-1을 함유 한 MS 한천 평판에 뿌렸다.

1-3. 세포 내 위치 분석(Subcellular localization analysis)

정지 코돈이 없는 CaUBP12 코딩 영역을 GFP- 융합 이진 벡터 p326GFP에 삽입 하였다. 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101를 p19 균주 (1 : 1 비율, OD600 = 0.5)와 혼합하고, 5 주된 완전히 팽창 된 담배 식물 잎에 공침시켰다. 침투 2 일 후, 현미경 분석을 전술 한 바와 같이 수행 하였다.

1-4. RNA 추출 및 qRT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)

RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 각기 ABA를 처리하거나 건조 스트레스를 준 고추 및 애기장대 식물의 잎을 수확하였다. 상기 식물체의 잎으로부터 추출한 모든 RNA 샘플에 대하여 RNA가 없는 DNase(RNA-free DNase)로 분해하여 genomic DNA를 제거하고, Transcript First Strand cDNA Synthesis kit(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용해 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 iQ™SYBR Green Supermix 및 하기 표 1과 같은 특이적 프라이머와 함께 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분간, 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초 45싸이클의 프로그램으로 수행되었다. 각 유전자의 상대적인 발현량은 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 애기장대 액틴8 (Arabidopsis actin8; AtACT8) 유전자 및 고추 액틴 1(CaACT1 ) 유전자를 정규화를 위해 사용하였다.

Primer name	Primer sequence (5'-3')
For cloning
CaUBP12	Forward: TTTTCAGTCCGAAGACAG Reverse: ACCAATTAATCCAATGTGCTGGTA
For RT-PCR
CaUBP12	Forward: ACTTCCACATTACCGTATGATTATCTTC Reverse: GATTTCTTGGAAAGAGAATGTGTTTTG
CaACT1	Forward: GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT Reverse: CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT
CaRAB18	Forward: ATGTCGCACTACGAGAACCAATATAG Reverse: ATCATCCTCAGAGCTGCTGGAGC
CaNCED3	Forward: AGATTAGTTCAAGAACGTGAATTGG Reverse: ACTTGATAAGGGACATCATCTTCAG
CaOSR1	Forward: CTCGAGCTATCAGAGCAAAGTC Reverse: TCTAGAGATCCTGTGTATTGACCAT
Actin8	Forward: CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA Reverse: GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT
RAB18	Forward: GGAAGAAGGGAATAACACAAAAGAT Reverse: GCGTTACAAACCCTCATTATTTTTA
NCED3	Forward: ACATGGAAATCGGAGTTACAGATAG Reverse: AGAAACAACAAACAAGAAACAGAGC
RD29B	Forward: GTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTG Reverse: ATTAACCCAATCTCTTTTTCACACA

1-5. ABA, 건조스트레스, NaCl, 저온 및 H₂O₂ 처리 및 형태 분석

고추 식물에서 CaUBP12 유전자의 발현 패턴 변화를 관찰하기 위해, six-leaf stage의 고추 식물에 100 μM ABA, 건조 스트레스, 저온(4℃), 100 μM H₂O₂ 또는 200 mM NaCl을 처리하였다. 처리 후 0, 2, 6, 12, 및 24시간 후에 고추 잎을 회수하고 하기와 같은 분석을 실시하였다.

qRT-PCR 분석을 위해, CaUBP12 유전자가 침묵된 six-leaf stage의 고추 식물 및 CaUBP12 유전자를 과발현하는 4주 된 35S:CaUBP12 애기장대 형질전환 식물에 50 μM ABA를 처리하거나, 건조스트레스를 준 후 정해진 시간에 고추 잎을 회수하였다.

애기장대 식물 묘목의 성장률은 야생형 및 35S:CaUBP12 형질전환 애기장대의 종자 100개를 다양한 농도의 ABA가 처리된 MS 한천 배지 플레이트에 파종하고 7일 후 초록색 자엽이 생성된 묘목의 개수를 세어 측정하였다. 동시에 7일 동안 MS 플레이트 상에 수직으로 자란 각각의 묘목 개수와 묘목 뿌리의 길이를 측정하였다. 식물체는 24℃ 온도, 16시간/8시간의 낮/밤 사이클 조건으로 형광등(130 μmol photons m^-2·s^-1) 빛에서 성장시켰다.

건조 스트레스 저항성은 four-leaf stage의 CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추 식물 또는 2주된 야생형 및 35S:CaUBP12 애기장대 식물에 각각 14일 또는 15일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 준 후 1일 또는 5일 동안 다시 식물체에 물을 주고, 식물체의 생존율을 계산함으로써 분석하였다. 또한 증발하는 물 손실량을 측정함으로써 건조 저항성을 정량적으로 확인하였다. 이를 위해, four-leaf stage의 고추 식물 및 3주 된 애기장대로부터 회수한 잎을 페트리 접시(petri-dish)에 놓고 상기 페트리 접시를 40% 상대 습도의 성장 챔버에 두고 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.

1-6. 표현형 분석 (Phenotypic analyses)

묘목 성장을 시험하기 위해, 다양한 ABA 농도를 가진 MS 한천 배지를 함유하는 플레이트 상에 유전자형 당 36 개의 씨앗을 뿌렸다. 야생형 애기 장대와 CaUBP12 과 발현(CaUBP12-OX) 형질 전환 애기 장대에서 얻은 1 주일 된 묘목을 토양 혼합물을 담고 있는 그릇에 무작위로 심어 물기가 있는 조건에서 2 주 동안 재배했다. 가뭄 스트레스를 주기 위해 급수를 9-10 일 동안 보류하고 다시 물을 준 후 1-2 일 후에 재수화 된 잎을 가진 식물의 생존율을 계산했다. 고추의 경우, 10-11 일 동안 급수를 보류하여 4 엽 단계(four-leaf stage) 식물에 가뭄 스트레스가 가해졌으며 다시 물을 준 날로 부터 1 일 후에 재수화 된 잎을 가진 식물의 생존율이 계산되었다. 가뭄 저항성은 증발 수분 손실을 측정하여 정량적으로 결정되었다. 네 엽 단계(four-leaf stage)고추와 3 주 된 애기 장대 식물에서 잎을 분리하여 페트리 접시에 넣었다. 접시를 성장 챔버에서 40 %의 상대 습도로 유지하고, 지시된 시점에서 생중량의 손실을 측정 하였다. 모든 실험은 생물학적 시료에서 독립적으로 최소 3회 반복되었다.

1-7. 열 영상법(Thermal imaging)

열 화상 분석(thermal imaging analysis)을 위해, 첫 번째와 두 번째 잎이 모두 자라는 4 주된 고추 식물과 3 주 또는 4 주된 애기 장대 식물을 50μM ABA로 처리했다. 열 화상 이미지는 적외선 카메라 (FLIR systems; T420)를 사용하여 얻었으며 잎 온도는 FLIR Tools + ver 5.2 소프트웨어로 측정했다.

1-8. Virus-induced gene silencing (VIGS)

CaUBP12의 기능 상실 분석(loss-of function analysis)을 위해, 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 침묵 (virus-induced gene silencing: VIGS)이 수행되었다. 간략하게 음성대조군으로서 pTRV1 및 pTRV2:CaUBP12 또는 pTRV2:00을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD₆₀₀=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.

1-9. 기공개도(Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도(stomatal aperture)의 생물학적 정량은 이전에 설명한대로 수행되었다(Lim and Lee, 2016). 간단하게는, 3 주된 장미 잎에서 잎 껍질을 채취하고 기공 개방 용액 (SOS; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, 10 μM CaCl2, pH 6.15)에 부유시켰다. 껍질을 애기 장대 식물 및 고추 식물에서 80 %초과 하는 기공 개구를 얻기 위해 3 시간 동안 배양 하였다. 완충액을 다양한 ABA 농도를 함유한 신선한 SOS로 대체하였다. 잎 껍질은 그 후 2 시간 더 배양되었다. 각각의 개별 샘플에서, 100 기공을 Nikon Eclipse 80i 현미경하에 무작위로 관찰 하였다. 각 실험은 3 배로 수행되었다.

실시예 2. CaUBP12 유전자 분리, CaUBP12 단백질의 세포내 위치 및 발현 조직

새로운 건조-유도 고추 전사 인자를 분리하기 위해서, 앱시스산 (ascisic acid; ABA)으로 처리된 고추 잎을 이용하여 RNA-seq 분석을 수행하였고, 건조 스트레스에 의해 유발되는 후보 인자를 분리하여, CaUBP12 유전자를 분리하였다.

또한, 상기 실시예 1-3 기재된 방법에 따라, CaUBP12 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여, CaUBP12 coding region을 형광단백질인 Green Fluorescent protein (GFP)을 결합시켜 35S promoter 하에서 발현되도록 벡터를 구축하였다. 보다 구체적으로 녹색 형광단백질 (GFP) (35S:CaUBP12-GFP)의 융합단백질을 담배 (N. benthamiana) 표피 세포에서 일시적으로 발현시켰다.

그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 담배 (N. benthamiana)의 표피 세포 (epidermal cell)에 있는 35S:CaUBP12-GFP 융합단백질이 핵 내에서 GFP 신호를 만들었으며, 따라서 35S:CaUBP12-GFP 단백질의 발현 분석 결과, CaUBP12-GFP 융합단백질이 핵에 위치하는 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, Fibrillarin-RFP 융합단백질에 대한 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 적색 형광 신호에 대한 청색 형광 신호가 핵에서 검출되었다. 상기 결과는 CaUBP12 단백질이 핵 내에서 위치하며 기능하는 것을 의미하여, CaUBP12 단백질은 핵을 타겟으로 하고, 해당 위치에서 기능을 한다는 것을 확인하였다.

또한, 식물 조직별로 CaUBP12 유전자의 상대적 발현 정도를 분석한 결과, 도 1b와 같이 꽃에서 가장 발현되는 것으로 나타났다.

실시예 3. 건조(drought), ABA, H₂O₂ NaCl 또는 저온 처리에 의한 CaUBP12 유전자의 발현 증가 확인

CaUBP12 유전자가 ABA 신호전달 및 비생물적 스트레스 반응과 관련이 있는지 알아보기 위해, 먼저 건조, ABA, H₂O₂, NaCl 또는 저온 처리한 고추 식물의 잎에서 CaUBP12 유전자의 발현 변화를 측정하였다. Semi-quantitative RT-PCR 분석을 수행한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 건조, ABA, H₂O₂, 저온 처리한 경우는 아무런 처리를 하지 않은 경우와 비교하여 CaUBP12 유전자의 발현이 현저하게 증가 하였다 그러나 NaCl을 처리한 경우에는 유의미한 차이가 없었다.

실시예 4. CaUBP12 유전자가 침묵된 고추 잎에서 가뭄내성 감소 확인

많은 연구들을 통해 ABA 감수성은 식물에서 건조 스트레스 저항성과 관련되어 있음일 알려져 있다. ABA 및 건조 스트레스 신호는 비록 ABA가 건조 반응 경로와 독립적인 경로를 가지고 있지만 공통의 신호전달 경로를 공유한다. 상기 내용들을 바탕으로, CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추 식물의 건조 스트레스에 대한 생리학적 및 분자적 반응을 분석하였다.

CaUBP12가 건조 스트레스 저항성에 관여 하는지를 알아보기 위해 이를 위해, 실시예 1-8과 같이 담배얼룩바이러스(tobacco rattle virus: TRV) 기반 VIGS(virus-induced gene silencing) 시스템을 이용하였다. VIGS의 효율을 확인하기 위해 semi quantitative RT-PCR 분석을 실시했다. CaUBP12의 발현 수준은 대조군 식물(TRV:00)보다 CaUBP12-silenced 고추(TRV:CaUBP12)에서 더 감소하였다(도 2a).

먼저, 건조에 대한 민감성을 알아보기 위해, 4주된 정상 대조군 및 CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추 식물에 15일동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 유발시켰다. 그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, 물이 존재하는 환경 하에서는 상기 두 식물 간의 형태학적 차이가 없었으나, 건조 스트레스를 주었을 때 CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추 식물은 정상 대조군에 비하여 상대적으로 급격히 시들었다. 다시 5일동안 물을 주었을 때 정상 대조군은 81.5% 이상에서 성장이 재개되었으나, CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추는 12.9% 만이 생존하여 성장하였다.

다음으로, 물이 있는 환경하에서 성장시킨 정상 대조군(TRV:00) 및 CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추 식물(TRV:CaUBP12)로부터 잎을 떼어내고 9시간 후까지 생중량을 측정하여 증산 수분 손실률(transpiration water loss)을 확인하였다. 그 결과 도 2c에 나타난 바와 같이 잎의 수분손실률은 정상 대조군에서 더 낮게 측정되었다. 그리고 양 고추 식물에서 1차 및 2차 잎을 떼어내고 60분 후까지 잎 온도를 측정한 결과, 도 2d,e에 나타난 바와 같이, 정상 대조군 잎보다 CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추의 잎에서 잎 온도가 더 낮게 나타났다.

마지막으로, 기공폐쇄는 증발냉각(evaporative cooling)을 감소시키고 결과적으로 잎 온도를 증가시킨다고 알려져 있으므로, CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추는 ABA 처리 후 야생형 고추에 비하여 상대적으로 기공폐쇄가 지연될 것이라고 판단하였다. 이에, 상기 두 고추 식물에 대하여 각각 0, 10, 20 μM ABA를 처리하여 상기 실시예 1-9의 방법에 따라 기공개도를 측정하였다.

그 결과, 도 2f,g에 나타난 바와 같이, CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추(TRV:CaUBP12)가 야생형 고추보다 기공개도가 더 큰 것으로 관찰되었다. 또한, ABA를 처리한 경우 야생형 보다 CaUBP12 유전자 발현이 저해된 고추에서 평균 기공개도가 크게 나타났으며, ABA를 처리하지 않은 경우에는 상기 두 식물간의 기공개도에 큰 차이는 나타나지 않았다.

실시예 5. CaUBP12 과다발현 Arabidopsis 식물의 ABA에 대한 향상된 감도 확인

CaUBP12 유전자의 생리적 역할을 조사하기 위해, 우선, 실시예 1-2에 따라 강력한 항시발현 CaMV 35S 프로모터의 조절하에 CaUBP12 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대를 제조하고, 두 개의 독립된 T3 동형 라인(CaUBP12-OX #2 및 CaUBP12-OX #10)을 얻었고, 이를 표현형 분석에 이용하였다. 반 정량적 RT-PCR 분석 결과 CaUBP12은 CaUBP12-OX 식물에서만 발현되었음을 확인하였다(도 8b).

이에 ABA를 보충하거나 하지 않은 MS 플레이트 상에 CaUBP12-OX 식물 및 야생형 식물의 종자를 각각 파종하고 발아시키면서 발아율을 비교하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우는 CaUBP12-OX 식물의 종자가 야생형 종자에 비하여 발아율이 차이가 없었으나, 1.0μM ABA를 처리한 경우에는 CaUBP12-OX 식물의 종자보다 야생형 종자의 발아율이 높게 나타났다.

한편, 유모기(seedling stage)에서 CaUBP12 과발현(CaUBP12-OX) 식물과 야생형 간의 차이가 두드러졌다.

보다 구체적으로, 0.0μM, 0.5μM 또는 0.75μM의 ABA를 보충한 MS 플레이트 상에 CaUBP12-OX 식물 및 야생형 식물의 종자를 각각 파종하여 5일 동안 성장시킨 결과, ABA를 보충하지 않은 경우에는 CaUBP12 과발현(CaUBP12-OX) 식물과 야생형 간의 차이가 나타나지 않았으나 ABA를 보충한 경우는 도 3b에 나타낸 바와 같이, 녹색자엽(Green cotyledon)을 가진 다수의 묘목이 야생형 보다 CaUBP12 과발현(CaUBP12-OX) 식물에서 더 적었고, 도 3c, 3d에 나타낸 바와 같이, 8일 동안 성장시킨 결과 CaUBP12 과발현(CaUBP12-OX) 식물에서 뿌리 길이가 짧게 나타났다.

또한, CaUBP12-OX 식물의 ABA 민감성이 늦은 발아와 연관 있는지 확인하기 위하여 ABA가 처리되지 않은 조건에서 발아한지 3일 후, ABA가 처리된 배지로 옮겨 5일간 생장시킨 결과, 도 3e,f와 같이 CaUBP12-OX 식물의 뿌리 길이가 야생형 보다 짧게 나타나 ABA에 더 민감한 것으로 나타났다.

상기 결과로부터, 애기장대에서 CaUBP12 유전자 과발현은 발아기와 유모기 동안 ABA 민감도(sensitivity)를 부여한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 6. 애기장대 식물에서 CaUBP12 유전자 과발현에 의한 건조 저항성 증가 확인

ABA에 반응하는 식물에서 CaUBP12의 영향을 더욱 확실히 알아보기 위해, 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 CaMV(Cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터의 조절 하에서 CaUBP12 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환 식물체(이하, CaUBP12 -OX)를 제조하였다. 먼저 CaUBP12 유전자 과발현이 ABA 매개 기공폐쇄에 영향을 미치는지 알아보기 위해, ABA에 대한 잎 온도와 기공개도 변화를 측정하여 분석하였다.

먼저 CaUBP12 -OX 및 애기장대 야생형(WT) 식물의 잎에 50 μM ABA를 처리하고 온도를 측정한 결과, 도 4f에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하고 6시간째에 CaUBP12 -OX 식물의 경우 야생형보다 잎 온도가 현저하게 높게 측정되었다. 반면에 ABA를 처리하지 않은 경우에는 CaUBP12 -OX 및 애기장대 야생형(WT) 식물의 잎 온도의 유의미한 차이는 없었다.

또한, ABA에 의한 기공폐쇄를 관찰하기 위해 4주된 CaUBP12 -OX 및 야생형 식물로부터 잎 껍질을 회수하여 0.0μM, 10 μM 및 20 μM ABA가 포함된 SOS 완충용액에서 배양하였다. 그 결과, 도 4d,e에 나타낸 바와 같이, CaUBP12 - OX 의 경우 야생형 식물의 보다 기공개도가 더 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과는 CaUBP12 유전자의 과발현이 ABA에 반응하여 기공폐쇄를 증가시킨다는 것을 의미한다.

나아가 기공폐쇄는 증산을 통해 탈수되는 잎에서 수분손실의 감소를 유도하므로, 다음으로 4주된 CaUBP12-OX 및 야생형 식물로부터 잎을 떼어내고 6시간 후 생중량을 측정하여 증산 수분 손실률(transpiration water loss)을 확인하였다. 그 결과, 도 4c와 같이 잎의 수분손실률은 CaUBP12 -OX이 야생형보다 더 낮은 것을 확인하였다.

다음으로, 건조 저항성에 대한 CaUBP12 유전자 과발현의 영향을 확인하기 위해 CaUBP12 -OX 및 야생형(WT) 식물을 물이 정상적으로 공급되는 환경에서 4주 동안 임의적으로 토양에서 성장시켰다. 그 결과 도 4a의 왼쪽에 보이는 바와 같이 정상적 환경에서는 CaUBP12 -OX이 야생형 식물과 형태적인 차이를 보이지 않았다. 그러나 14일 동안 물주기를 중단하여 건조 스트레스를 주었을 때는 도 4a의 중간 사진처럼 CaUBP12 -OX 식물이 야생형 식물보다 상대적으로 덜 시들었다. 그리고 다시 물을 주었을 때 도 5A의 오른쪽 사진처럼 CaUBP12 -OX 식물이 야생형보다 더 빠르게 성장이 재개되었으며, 1일 동안 물을 주고 생존율을 측정한 결과 도 4b와 같이, CaUBP12 -OX 및 야생형 식물은 각각 100-96.8% 및 31.7% 생존하여 CaUBP12 유전자가 과발현하는 식물에서 생존율이 현저히 증가한 것을 확인하였다.

상기와 같이, CaUBP12-OX 식물이 야생형 식물보다 ABA에 의한 기공폐쇄에 더 민감하게 반응하므로 이에 근거하여, CaUBP12 유전자가 과발현 되는 경우 기공의 재개방에도 영향을 미치는지 실험하였다. 도 5a,b에 나타난 것처럼 ABA가 처리되지 않은 경우에는 빛과 어둠 조건에서 야생형과 CaUBP12-OX 식물간 유의미한 차이가 발견되지 않았으나, ABA를 처리한 경우에는 어둠 조건에서 빛을 비출 때 CaUBP12-OX 식물에서 기공이 재개방 되는 정도가 야생형보다 작았다.

상기 결과를 통해 CaUBP12-OX 식물은 ABA에 대해 과민성을 가져 수분손실을 막음으로써 가뭄저항성을 높힌다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7. ABA 매개 가뭄저항에서 CaUBP12 단백질의 deubiquitinating 활성의 중요성

ABA매개 가뭄저항에 있어서 CaUBP12는 양성적 조절인자로 작용하므로 CaUBP12의 효소활성이 가뭄저항에 중요한 역할을 하는 것으로 예상된다. 이러한 가설을 입증하기 위해 CaUBP12 효소활성을 상실한 CaUBP12 ^C191S -OX(cysteine to serine) 식물을 제작하였다.

우선, 유전자의 발현정도를 알아보기 위해 semi-quantitiative RT-PCR을 수행한 결과 도 8c와 같이, CaUBP12 발현은 CaUBP12 ^C191S -OX 식물에서만 나타난다.

도 3의 결과와 같이, CaUBP12-OX 식물은 0.5μM 및 0.75μM ABA 조건에서 ABA에 민감한 표현형을 보였으므로, 야생형, CaUBP12-OX 및 CaUBP12 ^C191S -OX 식물에서 1차 뿌리 생장을 측정하였다. 도 6 a,b에 나타난 바와 같이, ABA가 처리되지 않은 조건에서는 상기 3가지 식물들간 유의미한 차이점을 확인할 수 없었다. ABA가 처리된 조건에서 야생형과 CaUBP12 ^C191S -OX을 비교해 보면, 0.5μM ABA 조건에서는 유의미한 차이가 없으나 0.75μM ABA 조건에서는 CaUBP12 ^C191S -OX이 야생형 보다 ABA에 대해 더 민감성을 가지는 것으로 나타났다. CaUBP12-OX와 CaUBP12 ^C191S -OX을 비교해 보면, 0.5μM 0.75μM ABA 조건에서 모두 CaUBP12-OX가 CaUBP12 ^C191S -OX 보다 ABA에 대해 더 민감성을 가지는 것으로 나타났다.

CaUBP12 ^C191S -OX 식물의 건조에 대한 민감성을 알아보기 위해, 야생형, CaUBP12-OX 및 CaUBP12 ^C191S -OX 식물에 14일동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 유발시켰다. 그 결과, 도 6c에 나타난 바와 같이, 물이 존재하는 환경 하에서는 상기 세 식물 간의 형태학적 차이가 없었으나, 건조 스트레스를 주었을 때 CaUBP12 ^C191S -OX 식물은 야생형 보다는 건조 스트레스에 높은 저항성을 보였으나, CaUBP12-OX 식물보다는 낮은 저항성을 보였다. 다시 1일동안 물을 주었을 때 야생형은은 18.7%, CaUBP12-OX는 91~97%, CaUBP12 ^C191S -OX는 23~39%가 생존하였다.

이러한 결과는 CaUBP12 단백질의 deubiquitinaing 활성이 ABA 매개 가뭄저항성에서 핵심적인 기능을 한다는 것을 의미한다.

스트레스 반응성 유전자의 발현은 가뭄 스트레스의 중요한 결과로 알려져 있다. 따라서 고추와 애기장대의 스트레스 반응성 유전자가 CaUBP12의 발현수준에 따라 조절되는지 알아보았다. 상기 실시예 1-4에 기재된 방법에 따라, CaUBP12-OX 식물, CaUBP12-silenced 식물 및 대조군 식물에 탈수 처리 후 특이적 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 진행하였다. 그 결과, 도 7a와 같이, CaRAB18 , CaNCED3 및 CaOSR1 유전자는 CaUBP12-silenced 고추에서 대조군에 비해 덜 유도되었으며, 도 7b와 같이, RAB18 , NCED3 및 RD29B 유전자는 CaUBP12-OX 식물에서 대조군보다 더 많이 유도되었다. 이러한 결과는 CaUBP12 유전자의 발현은 스트레스 반응성 유전자의 양성 조절자로서 작용함을 나타낸다.

상기 결과들을 통해 CaUBP12가 ABA 매개 기공폐쇄 및 건조 반응 마커 유전자의 발현을 유도함으로써 고추 식물뿐만 아니라 애기장대에서 건조 저항성에 대한 양성 조절자로 작용함을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to the drought stress using CaUBP12 in plants <130> MP18-064 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3366 <212> DNA <213> CaUBP12 <400> 1 atgactcttc tcactcctcc tccgattgat ccagaagaca atgaaccaga agacaatgaa 60 atgcttgttc ctagttctga ctttcctacc gagggacctc agcctatgga agttgcacca 120 gcagacgcaa caagtacagt ggatgcacag gcggtggatg atccggcatc agcccggttc 180 acatggactg ttgacaattt ttcaaggttg aacgtgaaga agttgtactc cgatgctttt 240 aatgtaggag gatataaatg gaggattctg atattcccga aagggaataa tgcagaccat 300 ttatcaatgt atctagatgt ggcagatgct gcaacattgc cttatggttg gagtagatat 360 gctcagttta gcttagctgt tatcaatcga attcacaaca agtacacagt aagaaaagat 420 acccagcacc agtttaatgc aagggagagt gattggggtt tcacgtcatt catgcctctt 480 agtgaaatat atgatcctgg aagaggttat cttatggatg atacagtcat aattgaagct 540 gatgttgccg tccgtaaagt cattgattac tggtcccatg actctaaaaa ggagactggt 600 tttgttggcc ttaagaatca gggagccact tgttacatga 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tgcattttta 3180 tccatgggtc gtcccgagta cctggaggaa tcggatattg tgtccaaccg tttccagaaa 3240 agagatgtgt atggtgcttg ggagcagtac cttggattag agcacactga caatgctcca 3300 aaaagatcat atgctgccaa ccagaaccga cacaattttg agaagcctgt tcggatctac 3360 aactag 3366 <210> 2 <211> 1121 <212> PRT <213> CaUBP12 <400> 2 Met Thr Leu Leu Thr Pro Pro Pro Ile Asp Pro Glu Asp Asn Glu Pro 1 5 10 15 Glu Asp Asn Glu Met Leu Val Pro Ser Ser Asp Phe Pro Thr Glu Gly 20 25 30 Pro Gln Pro Met Glu Val Ala Pro Ala Asp Ala Thr Ser Thr Val Asp 35 40 45 Ala Gln Ala Val Asp Asp Pro Ala Ser Ala Arg Phe Thr Trp Thr Val 50 55 60 Asp Asn Phe Ser Arg Leu Asn Val Lys Lys Leu Tyr Ser Asp Ala Phe 65 70 75 80 Asn Val Gly Gly Tyr Lys Trp Arg Ile Leu Ile Phe Pro Lys Gly Asn 85 90 95 Asn Ala Asp His Leu Ser Met Tyr Leu Asp Val Ala Asp Ala Ala Thr 100 105 110 Leu Pro Tyr Gly Trp Ser Arg Tyr Ala Gln Phe Ser Leu Ala Val Ile 115 120 125 Asn Arg Ile His Asn Lys Tyr Thr Val Arg Lys Asp Thr Gln His Gln 130 135 140 Phe Asn Ala Arg Glu Ser Asp Trp Gly Phe Thr Ser Phe Met Pro Leu 145 150 155 160 Ser Glu Ile Tyr Asp Pro Gly Arg Gly Tyr Leu Met Asp Asp Thr Val 165 170 175 Ile Ile Glu Ala Asp Val Ala Val Arg Lys Val Ile Asp Tyr Trp Ser 180 185 190 His Asp Ser Lys Lys Glu Thr Gly Phe Val Gly Leu Lys Asn Gln Gly 195 200 205 Ala Thr Cys Tyr Met Asn Ser Leu Leu Gln Thr Leu Tyr His Ile Pro 210 215 220 Tyr Phe Arg Lys Ala Val Tyr His Met Pro Thr Thr Glu Asn Asp Asn 225 230 235 240 Pro Ser Gly Ser Ile Pro Leu Ala Leu Gln Ser Leu Phe Tyr Lys Leu 245 250 255 Gln Tyr Asn Asp Thr Ser Val Ala Thr Lys Glu Leu Thr Lys Ser Phe 260 265 270 Gly Trp Asp Thr Tyr Asp Ser Phe Met Gln His Asp Val Gln Glu Leu 275 280 285 Asn Arg Val Leu Cys Glu Lys Leu Glu Asp Lys Met Lys Gly Thr Val 290 295 300 Val Glu Gly Thr Ile Gln Gln Leu Leu Glu Gly His His Met Asn Tyr 305 310 315 320 Ile Glu Cys Ile Asn Val Asp Tyr Lys Ser Thr Arg Lys Glu Ser Phe 325 330 335 Tyr Asp Leu Gln Leu Asp Val Lys Gly Cys Arg Asp Val Tyr Ala Ser 340 345 350 Phe Asp Lys Tyr Val Glu Val Glu Arg 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Thr Ile Ile Lys Val Ala Arg 565 570 575 Asp Glu Asp Leu Gly Glu Gln Ile Gly Lys Glu Ile Tyr Phe Asp Leu 580 585 590 Val Asp His Asp Lys Val His Ser Phe Arg Ile Gln Lys Gln Met Pro 595 600 605 Phe Ala Gln Phe Lys Glu Glu Val Ala Lys Glu Phe Gly Ile Pro Val 610 615 620 Gln Phe Gln Arg Tyr Trp Leu Trp Ala Lys Arg Gln Asn His Thr Tyr 625 630 635 640 Arg Pro Asn Arg Pro Leu Thr Ala Gln Glu Glu Val Gln Ser Val Gly 645 650 655 Gln Leu Arg Glu Val Ser Asn Lys Ala Asn Asn Ala Glu Leu Lys Leu 660 665 670 Phe Leu Glu Val Glu Leu Gly Leu Asp Leu Gln Pro Ile Pro Pro Pro 675 680 685 Glu Lys Ile Lys Glu Asp Ile Leu Leu Phe Phe Lys Leu Tyr Asp Pro 690 695 700 Ser Lys Glu Glu Ile Arg Tyr Val Gly Arg Leu Phe Val Lys Gly Ser 705 710 715 720 Gly Lys Pro Leu Glu Ile Leu Ala Lys Leu Asn Glu Leu Ala Gly Phe 725 730 735 Leu Pro Asp Glu Glu Ile Glu Leu Phe Glu Glu Ile Lys Phe Glu Pro 740 745 750 Asn Val Met Cys Glu His Ile Asn Arg Asn Leu Ser Phe Arg Gly Cys 755 760 765 Gln Leu Glu Asp Gly Asp Ile Ile Cys Phe Gln Lys Ser Leu Arg Lys 770 775 780 Gln Gly Asn Glu Gln Tyr Arg Phe Pro Glu Val Pro Ser Phe Leu Glu 785 790 795 800 Tyr Val His Asn Arg Gln Val Val Arg Phe Arg Ser Leu Glu Lys Pro 805 810 815 Lys Glu Asp Glu Phe Thr Leu Glu Leu Ser Lys Gln Asn Asn Tyr Asp 820 825 830 Glu Val Val Glu Cys Leu Ala Arg His Leu His Leu Asp Asp Pro Ser 835 840 845 Lys Val Arg Leu Thr Ser His Asn Cys Tyr Ser Gln Gln Pro Lys Pro 850 855 860 Gln Pro Ile Arg Tyr Arg Gly Val Asp Arg Leu Thr Glu Met Leu Ser 865 870 875 880 His Tyr Asn Gln Thr Ser Asp Ile Leu Tyr Tyr Glu Val Leu Asp Ile 885 890 895 Pro Leu Pro Glu Leu Gln Gly Leu Lys Thr Leu Lys Val Thr Phe Tyr 900 905 910 His Ala Ala Lys Asp Glu Val Thr Ile His Thr Ile Arg Leu Pro Lys 915 920 925 Gln Ser Thr Ile Gly Asp Val Leu Asn Asp Leu Lys Thr Lys Val Glu 930 935 940 Leu Ser Arg Pro Asp Ala Glu Leu Arg Leu Leu Glu Val Phe Tyr His 945 950 955 960 Lys Ile Tyr Lys Ile Phe Ser Leu Asn Glu Arg Ile Glu Asn Ile Asn 965 970 975 Asp Gln Tyr Trp Thr Leu Arg Ala Glu Glu 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Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaUBP12 (Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaUBP12 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
4. 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법:
   (a) CaUBP12(Capsicum annuum ubiquitin specific protease 12) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및
   (b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaUBP12 단백질을 과발현시키는 단계.
5. 제4항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.

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