CN104450742A - 玉米核因子基因ZmNF-YB3及其同源基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米核因子基因ZmNF-YB3，其中所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了所述基因及其同源基因在培育抗逆特性改变植物中的应用，是以正义形式将该基因重组到植物表达载体中，利用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株，从转基因植株及其后代中筛选出抗逆性或产量明显提高的株系，创造出在植物育种中具有应用价值的新种质。

Description

玉米核因子基因ZmNF-YB3及其同源基因的应用

技术领域

本发明属植物生物工程育种领域，具体说，涉及一种玉米核因子基因ZmNF-YB3及其同源基因在培育抗逆特性改变植物中的应用。

背景技术

NF-Y(nuclear factor-y)是真核生物中普遍存在的一种转录因子复合物,由3个不同的亚基(NF-YA/CBF-B/HAP2、NF-YB/CBF-A/HAP3和NF-YC/CBF-C/HAP5)组成，并通过作用于其他调控因子的启动子来调节目的基因的表达。NF-YA是DNA序列特异性的亚基，结合到基因启动子区的核心五聚体核苷酸CCAAT基序(motif)上。NF-YB和NF-YC是分别在结构上类似组蛋白H2A和H2B的亚基。完整的NF-Y转录复合物与靶基因启动子中的CCAAT基序结合,调控靶基因的转录。NF-Y复合体能够作为一个转录激活因子或阻遏因子起作用，其与DNA的结合和转录调控活性也受到其它转录因子调节，后者通过与NF-Y亚基相互作用起作用。植物NF-Y可分为NF-YA、NF-YB和NF-YC三个家族，每家族有8～39名成员，出现了结构和功能的多样化，形成复杂的基因家族，而且每个家族不同成员参与了不同基因表达的调控。

植物NF-Y基因功能初步研究揭示，三个NF-Y家族的基因均有成员参与了植株生长发育调控或植物与微生物相互作用，以及对逆境胁迫的响应。在进化过程中一些亚家族成员形成了参与不同发育途径和代谢过程的特殊功能，如胚胎发育调控、根系发育和开花时间控制、内质网应激调节、干旱胁迫响应、微生物感染及固氮根瘤形成等，在植物生长发育调控中起关键作用。日益增多的证据表明，基于功能的专一性，至少有两类植物NF-Y蛋白质存在：第一类表现较多的非专一性功能，在几个不同组织或不同生理条件下均出现表达，参与NF-Y和其它TF伙伴的合作，可能在基因表达的精细调节方面有重要作用或参与多条代谢及发育途径的调控，在植物对生长环境响应和生长发育调整中扮演着不可替代的角色；第二类蛋白表达时空及强度精准，在特定的过程中起关键作用，很可能通过与特定的转录因子相互作用发挥其特异的调控作用。植物NF-Y家族成员的功能在抗旱、耐盐性状上也有重要作用，过表达AtNF-YB1和ZmNF-YB2能够增强植物抗旱性。

玉米NF-Y家族基因数量大，检索玉米基因组序列，发现玉米NF-YB成员28个。这些NF-Y家族基因的功能研究尚处起步阶段，只见到玉米ZmNF-YB2基因过表达提高了植株的耐旱性的研究报道和孟山都公司申请的专利。

发明内容

针对目前的研究现状，本发明提供了一种玉米核因子基因ZmNF-YB3及其同源基因在培育抗逆特性改变植物中的应用。

本发明所述的玉米核因子基因ZmNF-YB3，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为以下序列之一：

(1)ZmNF-YB3的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

(2)与(1)中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少80％同源的序列；或与(1)中SEQID No.2所示的氨基酸序列至少70％同源的序列。

上述的玉米核因子基因ZmNF-YB3的cDNA的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1所示的序列；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的序列。

本发明所述玉米核因子基因ZmNF-YB3在培育抗逆特性改变植物中的应用。本发明ZmNF-YB3基因通过基因表达调控来参与植物抗逆过程，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。

本发明所述的玉米ZmNF-YB3/GRMZM2G384528基因是从玉米cDNA中克隆，其方法是从玉米基因组中鉴别ZmNF-YB3序列并克隆，以全长部分序列与植物启动子融合(以正义或反义形式)，产生融合基因或RNAi结构，然后将融合基因或RNAi结构插入到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因或RNAi结构导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行性状鉴定，从中筛选出目标性状明显改变的转基因植株及其后代，创造出在植物育种中具有应用前景的新种质和新品种。具体方案如下：

ZmNF-YB3基因的表达分析

以耐旱自交系Q319和干旱敏感自交系65232为材料，比较苗期干旱处理对它们转录组的影响，选出在不同基因型中变化趋势不同的转录因子。然后，采用定量RT-PCR技术测定这些基因的在不同胁迫条件下的表达强度，确定目标基因的表达变化是否与胁迫处理有关和在不同基因型中的差异。ZmNF-YB3在玉米根中表达丰度小于叶片中，渗透胁迫处理24h时，表达丰度在耐旱自交系Q319的叶片中大幅度上升，在根中出现下降；而在旱敏感自交系65232的叶和根中均大幅度下降。耐旱自交系Q319在渗透胁迫处理48h和之后复水24h时，叶和根中ZmNF-YB3表达丰度变化不大，而旱敏感自交系65232在根中的表达水平在渗透胁迫处理48h时明显上升，但仍低于Q319的，复水24h时表现下降，而在叶中处理48h时无明显变化，复水24h又显著上升。根据这种表达特性，可确定当植株遭受干旱胁迫处理时，ZmNF-YB3/GRMZM2G384528的表达在两个耐旱性不同的自交系中有差异，且在耐旱性强的自交系中保持较高表达水平，是进行抗逆转基因研究的候选基因。对ZmNF-YB3基因在拟南芥和水稻中的同源基因进行搜索，依赖于已有的研究资料，未找到可提示ZmNF-YB3基因功能的资料。

转基因植株的产生

将ZmNF-YB3基因编码框或RNAi结构分别与胁迫诱导型的启动子如Prd29B、Prd29A等或组成型启动子融合，重组到植物表达载体中，采用农杆菌介导法或基因枪轰击法将融合基因或RNAi结构转入植物，产生转基因株系。在农杆菌为中介的玉米遗传转化中，首先构建出载体pCambia1300-Prd29B::ZmNF-YB3-PCaMV35S::bar和pFGC5941-Prd29B::ZmNF-YB3-PCaMV35S::bar，ZmNF-YB3由渗透胁迫诱导型启动子Prd29B启动，筛选标记基因bar由花椰菜花叶病毒35SRNA启动子启动。通过遗传转化将质粒的T-DNA区转入玉米骨干自交系。转化苗移栽成活后套袋自交，收获种子，通过除草剂草丁膦筛选和分子生物学检测方法(PCR、Southern blotting、RT-PCR)检测转化植株后代，获得了转基因植株。通过连续3代的自交和分子鉴定，产生了转基因纯合株系。通过选择，获得保持受体基因型特征的ZmNF-YB3基因表达丰度显著高于未转基因植株的过表达株系，和ZmNF-YB3表达丰度显著低于未转基因植株的转RNAi结构的株系。

转基因植株的性状检测及利用

对通过连续套袋自交数代的转基因纯合植株，首先确定它们在正常栽培条件下生长发育是否正常。采用胁迫诱导型启动子启动的ZmNF-YB3基因或其RNAi结构，转基因纯合系一般形态特征和生长发育正常，在非胁迫条件下与未转基因对照植株无明显差异。在此基础上，分析转基因植株和对照植株在胁迫条件下的抗性差异。

耐热性实验：以长在花盆的3-6叶期植株为材料，每盆4株，2株为转基因纯合植株，2株为未转基因对照，每盆为1重复，设10次重复。以玉米为例，将在28℃(照光,13h/d)/22℃(暗,11h/d)下生长的植株移入36℃(照光)下生长2h,再在39℃下连续热处理4天(照光13h/d，暗11h/d)，然后在28℃下恢复生长。在热处理后，未转基因对照几乎全部死亡，而转RNAi结构株系与未转基因差异不明显，均全部死亡；而转基因过表达株系受害不明显，即耐热性显著优于对照植株的。

耐冷性实验：以长在花盆的3-5叶期植株为材料，每盆4株，2株为转基因纯合植株，2株为未转基因对照，每盆为1重复，设10次重复。以玉米为例，将在28℃(照光,13h/d)/22℃(暗,11h/d)下生长的植株在16℃(照光13h/d)、10℃下(照光13h/d)下依次生长1天,然后在4℃下连续冷处理3天(照光13h/d)，再在28℃下恢复生长。在冷处理中，未转基因对照生长慢，处理后明显小于转基因株系的；在4℃处理1天，少数转基因过表达植株与未转基因对照叶片受损，叶尖往往萎蔫，而转RNAi结构植株对冷害敏感，受损较重；4℃处理3天后恢复生长1天，转基因过表达株系受害程度明显低于对照的，其中部分株系只出现叶尖萎蔫，而转RNAi结构植株受损重，小苗几乎全部死亡，而未转基因对照植株介于其间。

耐旱性实验：分苗期干旱处理试验和拔节期/开花授粉期/灌浆期干旱处理试验。苗期以长在土盘的4叶期植株为材料，每盘20株，10株为转基因纯合植株，10株为未转基因对照，每盘为1重复，一般设4-5次重复。以玉米为例，将分别转ZmNF-YB3基因和它的RNAi结构的纯合株系的成熟干燥种子，均匀播种在土盘中，置适宜条件下生长。植株4叶期时停止浇水，干旱处理一周左右，直至植株茎基部变软(环境湿度低，时间短；环境湿度高，时间长)，然后恢复浇水，观测植株恢复速率和成活率，确定植株的抗旱性。结果表明，在苗期降低ZmNF-YB3基因表达降低了植株抗旱性，而ZmNF-YB3基因过表达明显提高了植株的抗旱性。

拔节期或开花授粉期或灌浆期干旱处理试验中，将转ZmNF-YB3基因和其RNAi结构的玉米及未转基因的对照自交系种子播在的花盆或大田，在同样条件下管理，将植株分成3个不同发育时期处理组，每组设4-5次重复，分别在拔节期(雌雄穗发育期，9～13叶期，一般持续7-10天)、开花授粉期(雄穗露出前3-4天开始，持续10天左右)和灌浆期(授粉后10天开始，持续10-15天)进行干旱胁迫处理，即通过控制浇水和避免雨淋，保持土壤相对含水量在60％左右，观察转基因植株和未转基因对照植株的性状差异，检测与植株抗旱性相关的生理指标。通常开放授粉，收获果穗并考种，统计单株产量和/或单行产量。汇总实验结果，确定了转ZmNF-YB3过表达株系抗旱性显著高于未转基因对照和转RNAi结构的，经过干旱胁迫处理后不仅植株受害症状轻，而且解除胁迫后植株恢复生长快，单株籽粒产量等经济性状显著优于未转基因对照和转RNAi结构的；而转RNAi结构的植株抗旱性及籽粒产量明显差于未转基因对照植株的。在此基础上，综合多方面的测试结果，选出优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有一定提高的转基因过表达自交系用于玉米单交种选育。

本发明通过抗逆性检测试验，确定了胁迫诱导型启动子和组成型启动子启动转ZmNF-YB3基因过表达植株的耐旱性、耐热性和耐冷性比未转基因对照显著提高，而配合力无明显改变，创制出玉米等作物的抗逆育种新材料。

具体实施方式

实施例1：转ZmNF-YB3基因创造玉米耐旱自交系

1)ZmNF-YB3基因转化玉米载体的构建

将ZmNF-YB3基因编码框与胁迫诱导型的启动子Prd29B融合，采用常规基因重组技术，将融合基因插入到植物表达载体pCambia1300-PCaMV35S::bar中，产生转化载体pCambia1300-Prd29B::ZmNF-YB3-PCaMV35S::bar。再采用冻融法将转化载体转入农杆菌AGL0或LBA4404中，用于玉米遗传转化。

2)受体系统的建立

以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、昌7-2、DH4866等的自交种子。离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基有：

种子萌发培养基：KNO₃1900mg/l，NH₄O₃1650mg/l，CaCl₂·2H₂O 440mg/l，MgSO₄·7H₂O370mg/l，KH₂PO₄·H₂O 170mg/l，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/l，ZnSO₄·7H₂O 10mg/l，MnSO₄·4H₂O22.3mg/l，H₃BO₃10mg/l，KI 0.83mg/l，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/l，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/l，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，烟酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l,蔗糖30g/l,琼脂粉7g/l，pH 5.8～6.0。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。

A培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5～9.0μmol/l和2，4—D 1.0～3.0μmol/l，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。

B培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于丛生芽组织块分化小苗。

成苗培养基：种子萌发培养基附加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l，用于丛生小芽发育成小苗。

生根培养基：种子萌发培养基附加IBA 2.8～3.6μmol/l，用于无根小苗生根。

基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。

种子灭菌和萌发：玉米种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10--15分钟，然后用无菌水洗涤3--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30--40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23--30℃)下1--2天。萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。

茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化：萌发种子的胚芽伸长到3---5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下(24--27℃)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6--10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4—D浓度取3.0μmol/l；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4—D浓度降为1.0μmol/l，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2--3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5--6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。

3)以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生

将带有双元载体的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)(Mini--Ti质粒为pCambia1300-Prd29B::ZmNF-YB3-PCaMV35S::bar)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone,As)100μmol/l的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5--20倍用于转化。

取继代后培养13--20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的培养基上于黑暗中培养7--12天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4—D的A培养基上恢复培养后产生小芽。

将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-3000lx，光照14-15小时/天。小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40％的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温22--28℃，夜温15--21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。

4)转基因植株的抗性检测和选择利用

取移栽成活植株的叶片进行分子检测确定转基因植株。而后将转基因植株(T0)套袋自交结实。将来自不同T0植株的T1种子播在塑料盘中，3叶期时喷洒使未转基因对照植株全部死亡的除草剂草丁膦溶液(有效浓度因自交系不同而有差异)，8天后拔去死亡植株，14天后将成活的植株移栽到温室或具有防护设施的田间，移栽苗成活后取叶片进行PCR检测。T1代筛选出的转基因植株继续套袋自交，对其子代继续进行分子生物学鉴定和抗逆性检测。通过数代自交纯合、抗性检测和综合性状选择及配合力测定，获得抗逆性和产量得到显著提高的玉米自交系。后者可用于配制玉米优良杂交种。

实施例2：转ZmNF-YB3基因产生玉米耐热自交系

遗传转化所用质粒的构建过程如实例1，玉米转化和转化植株及其后代的选择和利用程序及方法如下：

1).玉米无菌苗获得

玉米优良自交系的种子，用70％乙醇浸泡8分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件(25-28℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，露出茎尖顶端生长锥。

2).农杆菌培养及活化

将带有双元载体(Mini-Ti质粒pCambia1300-Phsp::ZmNF-YB3-PCaMV35S::bar；Phsp：热激蛋白70基因启动子)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100μmol/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释OD₆₀₀0.25-0.4浓度时用于转化。

3).玉米无菌苗转化

(1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使无菌苗的茎尖生长锥浸泡在菌液中，在0.5×10⁵Pa下处理8-12分钟。

(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。

(3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

4).转化植株筛选与定植

转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂(Hoechst Schering AgrEvo GmbH,含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9.6ml—10.8ml/L，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。

5).转基因植株子代分析

T1代植株长到3叶期用10.8ml/L水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交结籽外，采用PCR技术检测外源基因进行Southernblotting验证，并采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系测定植株在不同光强和温度下净光合速率的变化，测定3-7叶期小苗生长速率，统计单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状的观测和比较，选择产量与受体材料相近或略高的株系进行抗逆性系统测定。

6).转基因纯合系的耐热性测定和筛选

苗期耐热性实验：将在28℃(照光,13h/d)/22℃(暗,11h/d)下生长的3-5叶期转基因纯合的玉米植株和未转基因对照植株移入36℃(照光)下生长2h,再在39℃下连续热处理4天(照光13h/d，暗11h/d)，然后在28℃下恢复生长。在热处理后，未转基因对照几乎全部死亡，而转基因株系中只有个别株系与未转基因对照差距不大，绝大多数株系的耐热性显著优于对照的，其中部分转基因株系受害不明显。

拔节期植株耐热性实验：转基因纯合的玉米植株和未转基因对照种子播在花盆中，植株在适宜生长条件下(温度不高于32℃，不低于22℃)长到13-14叶期，然后移入到36℃(照光)下生长4h,再在40℃下持续热处理5天(照光13h/d，暗11h/d)，移入32℃(光)/26℃(暗)下恢复生长，照光13h/d，暗11h/d。热处理后，未转基因对照植株叶片几乎全部受损，下部叶片死亡，雄穗发育不良，无正常花粉，无雌穗发生；转基因株系中只有个别株系与未转基因植株差距不明显，绝大多数株系的耐热性显著优于未转基因植株的，其中部分转基因株系的植株叶片受害轻，仅下部叶片干死脱落，但雄穗发育仍受到严重影响，花粉败育率高达60％，雌穗发育也大幅度推迟，造成花期不育，无法自交结实。

灌浆期植株耐热性实验：播在花盆中的转基因纯合的玉米植株和未转基因对照植株在适宜生长条件下(温度不高于35℃，不低于22℃)生长到授粉后10天，移入36℃(照光)下生长24h,再在40℃下持续热处理5天(照光13h/d，暗11h/d)，然后移入32℃(光)/26℃(暗)下恢复生长，照光13h/d，暗11h/d。热处理后，未转基因对照植株部分死亡，存活植株几乎叶片全部受损，下部叶片死亡，果穗变小，秃顶约占果穗长度的1/3-1/2，籽粒数不到未受胁迫植株的1/2，百粒重不到未受胁迫植株的3/4，单株产量大幅度下降。转基因株系中只有少数株系与未转基因植株的受害程度相近，绝大多数株系的耐热性显著优于对照的，其中部分转基因株系的植株叶片受害轻，只是下部叶片干死，但果穗发育仍受到严重影响，秃顶约占果穗长度的1/3，籽粒数比未受胁迫植株显著减少，百粒重一般下降20-30％，单株产量虽明显下降，但显著高于经过同样处理的未转基因对照植株的。

综合不同生长发育期的转基因玉米耐热性检测结果，从中选出耐热性显著高于受体自交系的稳定纯合株系，经过大田比较试验，选出在正常栽培条件下产量和抗病性等性状与未转基因自交系无明显差异的转基因耐热育种材料。

实施例3：转ZmNF-YB3基因产生玉米耐冷自交系

转化载体和构建过程同实例1，玉米无菌亩茎尖转化、转化植株的移栽管理和筛选、转基因植株的分子鉴定和后代筛选等程序及方法同实例2。在玉米种植区，玉米生长发育一般处在高温季节，但在我国北方春玉米种植区玉米播种后往往会遇到低温天气，造成烂种或小苗受冻，即提高玉米的耐冷性主要是提高它在较低温度下的种子萌发率及长势和小苗的耐冷性。因此玉米耐冷性检测主要在萌发期和苗期进行。通过转ZmNF-YB3基因产生玉米耐冷自交系的关键环节之一是获得了遗传稳定的转基因纯合株系后，对其萌发种子和小苗分别进行抗冷性测定，选择耐冷性明显高于未转基因对照植株的株系并用于培育玉米耐冷自交系。

玉米苗期耐冷性实验：将在28℃(照光,13h/d)/22℃(暗,11h/d)下生长的转基因纯合的玉米植株和未转基因对照植株移入到16℃(照光13h/d)下、10℃(照光13h/d)下依次生长1天,然后在4℃下连续冷处理8天(照光13h/d)，再在28℃下恢复生长。在冷处理中，未转基因对照植株生长慢，处理后明显小于转基因株系的；在4℃处理1天，少数转基因植株与未转基因对照的叶片受损，叶尖往往萎蔫；4℃处理3天后恢复生长1天，而绝大多数转基因株系受害程度明显低于对照的，其中部分株系只出现叶尖萎蔫。

玉米种子的发芽势测定：将非转基因对照和转基因株系的种子分别于25℃、15℃和10℃下萌发，每天统计萌发率。在25℃下，非转基因对照和转基因种子萌发率均在95％以上，发芽势没有明显差异，而在15℃和10℃下萌发率和发芽势表现出明显差异。15℃下非转基因对照和转基因株系最终萌发率在90％左右，但与25℃下的萌发情况相比，转基因株系种子萌发推迟了3-4天，而非转基因对照种子萌发推迟了5-6天。在10℃下，与25℃下相比，种子萌发被推迟10天以上，且最终萌发率明显降低。多数转基因株系的种子最终萌发率为25℃条件下的60-80％，而非转基因对照种子最终萌发率减少到25％左右。即与非转基因对照相比转基因株系发芽势在低温环境中下降较小，种子萌发时耐低温的能力得到增强。

玉米幼苗的生长速率测定：在玉米种子萌发后测定不同培养温度下玉米胚芽鞘及叶片的生长速率，确定植株的耐冷性。在25℃下，转基因与非转基因玉米胚芽鞘及叶片的生长速率差异未达到显著。15℃下，转基因与非转基因胚芽鞘及叶片的生长速率降低为25℃下的55-65％左右，一般转基因小苗生长较快，差异达到差异显著程度。在10℃下，转基因株系胚芽鞘及叶片的生长速率降低为25℃下的20％左右，而非转基因胚芽鞘及叶片的生长速率仅为25℃下10％。这些结果表明，在常温下，玉米幼芽生长速率受到转基因的影响较小；但在10℃低温下，转基因过表达高的植株生长较快，受到的抑制作用小，即对低温胁迫的耐受性较强。

综合转基因玉米耐冷性检测结果，从中选出耐冷性显著高于受体自交系的稳定纯合株系，经过大田比较试验，选出在正常栽培条件下产量和抗病性等性状与未转基因自交系无明显差异的转基因耐冷育种材料。

实施例4：转ZmNF-YB3基因创造高羊茅耐旱新材料

1)遗传转化所用质粒的构建

同实例1所示，选择标记基因也可为除草剂抗性基因als(抗除草剂氯磺隆)、epsps(抗除草剂草甘膦)等。

2)高羊茅芽尖转化受体体系的建立和遗传转化

高羊茅无菌种子苗的获得：高羊茅种子用70％乙醇浸洗3min，自来水洗净残留在种子表面的多余乙醇，再用自来水浸泡4h，倒去自来水，种子再用70％乙醇洗涤1min，用0.2％氯化汞溶液灭菌15min，然后用无菌水冲洗3-5遍。灭菌期间不断摇动三角瓶，以保证种子表面灭菌彻底。消毒后种子放入铺有3层湿滤纸的灭菌三角瓶内，封口后放在黑暗条件(25℃)下萌发。

高羊茅丛生芽体系的诱导及继代培养：生长至2-5cm的高羊茅黄化种子苗，取其生长点处约5mm左右切段，放在诱导培养基上培养15-20天。待切段基部膨大后，将上面多余部分切去，留基部约5mm部位转到继代培养基上继续培养，逐渐有许多小芽从基部生出形成丛生芽。将丛生芽切成小块于新的继代培养基继续培养，每10-15天继代一次，小芽不断扩增。

为确定不同基因型高羊茅丛生芽诱导及继代培养的最佳培养基，特设计以下实验：待种子萌发长成2-5cm黄化苗后，于无菌条件下切取5mm左右的茎尖部位作为外植体，接种于不同配比的2,4-D/6-BA的诱导培养基上，观察茎尖生长及丛生芽产生情况，确定最佳诱导培养基；将诱导产生的丛生芽块转移到附加不同浓度6-BA的继代培养基上，统计丛生芽的增殖率，确定最适继代培养基。

除草剂筛选浓度的确定：将各基因型高羊茅丛生芽切成单芽(3-5mm大小)，分别转入附加不同浓度除草剂草丁膦的丛生芽诱导培养基(附加植物生长调节物质2,4-D/6-BA的MS培养基)中，24±2℃下培养，每15天继代培养一次。连续培养3代后统计存活芽数量。每个基因型每浓度100芽，设3次重复。

高羊茅遗传转化：取-20℃保存的携带质粒pCambia1300-Prd29B::ZmNF-YB3-PCaMV35S::bar的根癌农杆菌，接种于含有抗生素(25mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)的YEP平板上，28℃培养5-7天，至菌斑长出。从平板上挑取单菌落，接种于含同样浓度抗生素的YEP液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养至对数生长期。将对数生长期的菌液于4000rpm/min下离心10min，去上清。将菌体用加入100μmol/l乙酰丁香酮的液体培养基重悬，稀释到不同浓度备用。

将继代后7天的丛生芽块剥取1mm大小的芽尖，在农杆菌OD₆₀₀0.6的菌液中浸染10-12min并附以0.5×10⁵MPa的负压处理，然后转到丛生芽诱导培养基上共培养2天，再转到含有头孢霉素(150mg/L)的培养基上抑菌培养，2周后转移到加有草丁膦(终浓度0.1％左右，因不同基因型而有差异)的培养基上进行筛选。每15天(加草丁膦)继代培养一次，连续筛选3代，得到不同比例的抗性芽，其中部分是转化体。

3)抗性芽的筛选、生根与移栽

将抑菌后的芽丛切成约1cm左右的小块，在含有0.06-0.1％草丁膦的筛选培养基连续筛选3代，得到抗性芽。存活的抗性芽转移到无选择剂的增殖培养基上进行恢复生长。

将2cm左右的高羊茅抗性芽转至生根培养基中诱导生根，20天左右生根；根系发达的小苗移到上层蛭石、下层壤土的花盒中，保持湿度，成活率达90％以上。移栽成活植株定植于大田。

4)转化苗的分子鉴定和选择

CTAB法微量提取转化植株叶片DNA，采用PCR检测转基因。对转基因植株进行分株繁殖或姊妹交结籽。无性克隆苗或子代小苗继续用除草剂草丁膦筛选，抗性植株采用PCR检测转基因、采用RT-PCR检测转基因表达水平，选出转基因表达水平高的植株进行分株繁殖。后者用于抗性检测实验。

5)抗旱性检测

移栽到花盆的小苗在适宜条件下生长2月，选取长势一致的材料进行干旱处理。此时每盆材料的分蘖数在17－25个之间，生长较快。对照处理材料正常浇水，每天浇水量为600毫升。干旱处理的材料先一次性浇足水份，处理期间不再浇水，温度30℃(日)/22℃，相对湿度低于45％，以植株开始萎蔫时记为处理第1天。当干旱处理到第12天时，未转基因受体材料大部分地上部干枯死亡，而部分转基因材料仍然生长较好。然后恢复浇水，未转基因受体材料几乎全部死亡，转基因材料多数株系恢复生长，10天时新叶达到12-15片。即转基因材料表现出明显提高的耐旱性。

为了了解转基因耐旱材料的实用价值，对入选的材料进行控水试验，即将干旱处理的材料平均每天浇水300ml，保证材料叶片在晚间伸展，白天萎蔫(叶片微卷)。与正常浇水材料相比，转基因材料新分蘖发生数少，生长变慢，植株高度稍有降低，叶色稍浅，抽苔时间一般延后15－20天。即在节水50％的条件下，转基因耐旱材料仍生长发育基本正常，是较为理想的草坪草植物。

实施例5：转ZmNF-YB3基因创造草地早熟禾耐热新材料

草地草地早熟禾(Poa pratensis L.)是温带地区最重要的草坪草草种之一。由于它具有色美、抗寒能力强、耐荫、耐修剪等优点，在我国北方及中部地区、南方部分冷凉地区被广泛用作建坪草种。草地早熟禾也有其自身的缺点，如耐高温能力差、不耐炎热、易受病虫危害和抗旱力不强等，在盛夏季节生长停止，甚至部分死亡。这些缺点极大地制约了草地早熟禾在夏季炎热地区的广泛利用。由于草地早熟禾具有孤雌生殖的特性，采用常规育种技术改良这些不利性状难度大，成功率低，因此采用基因工程手段培育草地早熟禾新品种的工作受到国内外学者的重视。本发明通过转ZmNF-YB3基因创造草地早熟禾耐热种质。

1)转化载体的构建：遗传转化所用质粒的构建同实例2所示，选择标记基因也可为除草剂抗性基因als(抗除草剂氯磺隆)、epsps(抗除草剂草甘膦)等。

2)草地早熟禾转化受体的建立:草地早熟禾种子经70％酒精2分钟、0.2％氯化汞14min灭菌，无菌水冲洗3～5遍，播于湿润的无菌滤纸上萌发。10～15d后转入诱导培养基(MS培养基+3mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂)上诱导基部膨大,培养18d后转入丛生芽发生培养基(MS培养基+2mg/L 6-BA+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂)诱导形成丛生芽。丛生芽块转入继代培养基上继代培养。为了使丛生芽块能长期继代培养，通过多种激素组合的比较试验，得出MS培养基+3mg/L 6-BA+0.07mg/L 2,4-D+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂为适宜继代培养基。当2,4-D浓度较高时，丛生芽块基部产生愈伤化组织，分化小芽能力低。当2,4-D浓度较低时，小苗容易老化，不易产生新芽。即使在适宜继代培养基上，继代5次后的丛生芽块小苗老化，增生能力降低。要保持草地早熟禾丛生芽处于幼嫩状态，可在继代4～5次后将丛生芽分成单芽或者2～3mm小块接种在诱导培养基上诱导膨大，然后再转入成丛培养基上产生丛生芽块。培养温度24±2℃，光强500～1000Lx，光照14h/d。取在继代培养基上暗培养5d的丛生芽块作为转化受体。

3)草地早熟禾丛生芽块遗传转化

挑取农杆菌(携带转化用质粒)单克隆培养物，接种到含有利福平25mg/L、卡那霉素50mg/L的液体YEP液体培养基中28℃下振荡(180r/min)培养至对数生长期。菌液4000r/min离心,倒掉上清液,菌体用液体培养基(改良MS培养基+2mg/L 6-BA+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖)重悬,稀释浓度至OD₆₀₀＝0.6备用。在浸染前向此细菌悬液加入0.2％(终浓度)的乙酰丁香酮(AS)。将草地早熟禾丛生芽块切去叶片，剥除叶鞘，然后切成1mm左右的小芽块，并尽量暴露出芽尖顶端的分生组织，放入培养皿中，尽快倒入农杆菌菌液，在0.05MPa负压处理下浸染4-6min。倒出菌液后，用无菌滤纸吸干残留菌液，再将小芽块转入丛生芽发生培养基上在24±2℃暗培养3天。

将共培养后的芽块转到加有100mg/L头孢霉素的丛生芽发生培养基上抑制农杆菌生长，10d后再将丛生芽块分成单芽置于含有0.1-0.2％除草剂草丁膦(浓度因基因型不同而有较大差异)的丛生芽发生培养基上筛选抗性小芽，连续筛选3代，每代筛选15d。筛选3代后获得的抗性小苗转入丛生芽发生培养基上进行恢复和增殖培养。然后转入生根培养基中，约8～15d后长出根。当根生长到2～5cm长时，放在自然光下培养1～2d，去掉封口膜炼苗1～2d后移栽入花盆。花盆下部为土壤，上部为6～8cm厚的蛭石，每5d浇一次1/2MS营养液，隔天浇水一次。移栽成活率为95％～99％。成活2月后取叶片进行PCR检测。

4)转化植株的分子检测

CTAB法提取草地早熟禾再生植株叶片DNA,以其为模板进行PCR检测转基因。对转基因植株进行分株繁殖或姊妹交结籽。无性克隆苗或子代小苗继续喷洒除草剂草丁膦(0.15％浓度)进行筛选，抗性植株采用PCR检测转基因、RT-PCR测定转基因表达水平，选出转基因表达水平高的植株进行分株繁殖。后者用于抗性检测实验。

5)转基因植株耐热性检测

检测分为2组进行，以分别了解对持续高温和短期高温对植株存活和生长的影响。

在选择对持续高温有良好耐性材料的试验中，通常将长势无明显差异的不同株系的克隆材料放入人工气候箱，气候箱设置光周期12h/d，相对湿度70％。温度按30℃→32℃→34℃→36℃→38℃→40℃梯度递增，每个温度2小时，最后40℃下维持3天，观察材料的变化，包括萎蔫程度，存活率，叶色变化等，然后在23℃下恢复培养。经过40℃热胁迫处理，未转基因受体株系与多数转基因株系表现出明显差别，40℃处理1天，未转基因受体植株出现萎蔫，而多数转基因株系植株形态变化不明显。处理3天时，不同株系植株均萎蔫，叶尖干枯，但多数转基因株系受损程度轻，恢复10天时，长势明显好于未转基因受体植株的。选出耐热性优良的株系进行扩繁。

在检测对短期高温胁迫反应的试验中，通常将人工气候室中培养的草地早熟禾植株在光周期12h/d和相对湿度70％下按23℃→38℃(2h)→40℃(2h)→42℃(2h)→44℃(2h)→46℃(5h)→23℃(7d)的程序处理，并分别于处理前、处理结束后2天、7天时照相。其中部分材料热处理结束后将叶片全部剪去，观察生长情况，生长10天后照相。热胁迫处理前各株系植株生长状态一般基本一致，热激处理后，未转基因受体株系和多数转基因株系在44℃处理阶段已出现显著差异，未转基因受体植株很快出现萎蔫，叶尖干枯，处理后恢复过程时间长，生长速率慢。而多数转基因株系植株受害较轻，在胁迫后恢复较快，生长速率可很快恢复到处理前水平。

综合耐热性检测结果，挑选出耐热性显著提高的形态特征无明显变化的草地早熟禾新材料。

实施例6：转ZmNF-YB3基因创造棉花耐旱新材料

1)ZmNF-YB3基因转化载体的构建和农杆菌转化

将ZmNF-YB3基因编码框与胁迫诱导型的启动子Prd29B或组成型启动子PCaMV35S融合，采用常规基因重组技术将融合基因插入到植物表达载体pCambia1300-PCaMV35S::bar中，分别产生转化载体pCambia1300-PCaMV35S::ZmNF-YB3-PCaMV35S::bar(用于株型高大的棉花品种，转基因植株株型变小，适合密植)和pCambia1300-Prd29B::ZmNF-YB3-PCaMV35S::bar。再采用氯化钙法制备感受态根癌农杆菌菌株LBA4404细胞进行质粒转化。即在室温下加入1μg重组质粒DNA到农杆菌感受态细胞悬液中，混匀后冰浴30min，置液氮速冻1min，经37℃保温3min后，加入1ml YEP培养基摇匀，28℃下振荡(150rpm)培养3h。5000rpm离心3min收集菌体，加入100μl YEP液体培养基重悬，涂布于含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP平板上，28℃暗培养2-3d，待转化菌落长到合适大小，挑取单菌落进行培养和鉴定，挑选质粒稳定的LBA4404克隆用于棉花遗传转化。

2)棉花遗传转化

棉花种子经硫酸脱绒后，用70％乙醇浸泡1min、0.1％升汞浸泡15min，然后用无菌水洗涤5遍。消毒后种子放入铺有三层滤纸的无菌瓶中，加入适量无菌水，于30℃温箱中萌发。2-3天后下胚轴长到1-2cm，将萌发种子插到M₁固体培养基中继续培养，取株高7～10cm小苗用于茎尖转化。

挑取LBA4404单克隆培养物，接种到加有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的液体YEP培养基中于27℃，180rpm振荡培养。菌液用4000r/min离心5分钟，倒掉上清液，菌体用1/2MS液体培养基重悬，稀释到OD₆₀₀为0.8左右备用。在浸染前向此细菌悬液加入100mg/L的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。

当棉花种皮脱落或快脱落时，去掉种皮和一片子叶，裸露出小苗茎尖。若苗端已有小叶出现，则用镊子剥去。轻轻划伤顶端分生组织后，将蘸有农杆菌菌液的棉球(由灭菌脱脂棉制备)放到小苗顶端，然后将小苗置于真空干燥器中，辅以0.5×10⁵Pa的负压处理10分钟。浸染过的幼苗于21℃左右暗培养3天，然后在光下培养2～3天后移栽入花盆。花盆下部为壤土，上部为6～8cm厚的蛭石，隔天浇灌1/2MS无机盐溶液。

3)转化植株的筛选与PCR检测

转化小苗在花盆中生长1-2周后(长出1-2片新叶)，将蘸有0.1％草丁膦溶液的棉球置于小苗茎尖进行除草剂筛选，24小时后重复一次。约2周后统计存活植株。采用CTAB法微量提取存活植株基因组DNA，采用PCR反应检测转基因是否存在，筛选出转基因植株。

4)转基因棉花的抗旱性检测

未转基因受体品种和转基因株系的T2代种子经过硫酸脱绒和0.1％升汞消毒后，在铺有三层滤纸的培养皿中于30℃培养箱中萌发。2-3天后下胚轴长到1-2cm，将萌发后的小苗转入装满Hogland营养液的体积约2升的塑料盒中继续培养，每盒培养16株植株。小苗长至3叶期时将小苗转入含有12％PEG6000的Hogland营养液中处理，观测植株生长状况。多数转基因株系的植株长势明显好于未转基因受体品种的，受害轻，表明转基因表达提高了棉花的抗渗透胁迫能力。

为了确定干旱胁迫后转基因株系与未转基因受体品种的表型及生长差异，将它们的种子种在同一个装满蛭石的无盖大盒子里。出苗后间苗，每株系保留2株，每天浇灌1/2MS营养液。四周后，停止浇营养液，进行干旱胁迫2周，统计植株叶片数和株高，然后轻轻的分离棉花根系，烘干后测定根和地上部的生物量。

蕾期和开花期是棉花对水分需求量比较大的关键时期。转基因株系与未转基因受体品种在蕾期和开花期的抗旱性检测以盆栽植株为材料进行，生长条件为昼/夜温度约20/35℃，大气相对湿度约40-55％。将同龄的不同基因型的小苗同期移栽到土壤一致的的花盆中，每盆1株，为1个重复。这些植株分为3组，每组每株系3盆。第一组在刚刚出现花蕾时，一次性浇足营养液，然后不再浇水，直至未转基因受体植株叶片发生严重萎蔫。在蕾期干旱胁迫处理前和胁迫处理后分别测定未转基因受体植株和转基因植株的叶片相对含水量、叶绿素含量、光合作用指标、可溶性糖和游离氨基酸含量以及细胞溶质势。第二组植株从第一朵花出现开始，每天控制浇水量，使土壤含水量保持在12％左右，进行持续干旱胁迫3周，然后恢复正常浇水。第三组一直正常浇水，作为未处理对照。在干旱胁迫过程中，分别在干旱处理前、处理第7、14和21天时测定植株光合效率、气孔导度和蒸腾速率。在收获期测定株高，统计分支数、单株开花数、单株结铃数和籽棉产量。结果显示干旱胁迫不同程度地影响了各株系植株的分支数、单株开花数和结铃数；干旱胁迫后部分转基因植株的分支数比未转基因受体品种多15％-35％，差异达到显著水平；单株开花数比未转基因受体品种多5％-20％；干旱胁迫导致不同基因型棉花单株籽棉产量下降，而部分转基因株系仅下降了15％-20％，而未转基因受体品种下降30％以上。生理参数的测定也支持这些结果。

综合转基因棉花耐旱性检测结果，得出转ZmNF-YB3基因创造出棉花耐旱新材料，这为对提高干旱胁迫下棉花产量具有重要意义。

Claims (7)

1.一种玉米核因子基因ZmNF-YB3，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为以下序列之一：

(1)ZmNF-YB3的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

(2)与(1)中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少80％同源的序列；或与(1)中SEQID No.2所示的氨基酸序列至少70％同源的序列。

2.如权利要求1所述的玉米核因子基因ZmNF-YB3，其特征在于：所述基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1或2所述玉米核因子基因ZmNF-YB3在培育抗逆特性改变植物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抗逆性是指耐旱性、耐涝性、耐热性或耐冷性；所述植物是指栽培的草本作物和牧草。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物是指玉米、棉花、高羊茅和草地早熟禾。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用的方法是以正义形式将基因ZmNF-YB3重组到植物表达载体中，利用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株，从转基因植株及其后代中筛选出抗逆性或产量明显提高的株系，获得在育种中具有应用价值的新种质。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述ZmNF-YB3基因有cDNA形式或基因组基因形式。