CN113817751A - 二色补血草基因LbTRY及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了二色补血草基因LbTRY及其应用。本发明首次从二色补血草中克隆得到基因LbTRY及其启动子，并分析了启动子元件。本发明还考察了基因LbTRY的生物学功能。从二色补血草中敲除LbTRY基因后，叶片表面产生两发光点和三发光点的盐腺，盐腺复合体的细胞数量显著减少，说明LbTRY基因可能在盐腺发育中起到正向调控作用，促进拟分生母细胞分化成多细胞盐腺初始结构。本发明为泌盐盐生植物盐腺发育的机理研究奠定基础。

Description

二色补血草基因LbTRY及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及二色补血草基因LbTRY及其应用。

背景技术

土壤盐渍化已成为世界性问题，越来越多的耕地受到土壤盐渍化影响，因此开发利用盐碱地势在必行。

盐胁迫是一个复杂的过程，影响植物体内几乎所有的生理和生化途径(Nabati,Kafi et al.2011,Abbasi,Jamil et al.2016)。盐渍生境中的高盐离子含量，直接对植物产生渗透胁迫和离子胁迫等原初伤害，造成过氧化胁迫等次生伤害(Gupta and Huang2014)。为了更好的适应盐渍生境，植物体形成了不同的生理和生化耐盐机制。主要包括离子区域化，有机渗透调节物质的积累，增强抗氧化能力，激素调节和NO的合成等(GuptaandHuang 2014)。

根据植物抗盐性的强弱，可以将植物分为盐生植物和非盐生植物。盐生植物能够在大于等于200mM NaCl的盐渍生境中正常生长并且完成其生活史(Flowers and Colmer2008)。但目前发现的绝大多数作物都属于非盐生植物。土壤中过多的盐会对农作物的生长产生威胁，对于农业生产产生严重的制约(Rodziewicz,Swarcewicz et al.2014)。根据盐生植物体内离子积累和运输的特点，Breckle(Breckle 1995)将盐生植物分为三大类：(1)泌盐盐生植物(recretohalophytes)，包括通过盐腺向外泌盐的盐生植物(如二色补血草)和通过盐囊泡向内泌盐的盐生植物(如冰叶日中花)两类；(2)真盐生植物(euhalophytes)，分为叶肉质化真盐生植物和茎肉质化真盐生植物两类。特点是将盐离子积累在液泡中，如盐地碱蓬；(3)假盐生植物(pseudo-halophytes)，可以将盐离子积累在薄壁组织的液泡和根木质部薄壁组织中，如芦苇。

泌盐盐生植物区别于其他盐生植物的最大特点是拥有能够向体外分泌盐分的特化的表皮结构，分为盐腺和盐囊泡两类。其中盐腺很大程度地避免了盐离子对植物体造成的危害，对植物体维持离子稳态和渗透平衡起到至关重要的作用，如二色补血草的盐腺。研究盐腺发育的分子机理，探究并克隆盐腺发育过程中的关键性基因，揭示这些基因在盐腺发育及泌盐过程中的作用，并且利用转基因技术提高盐生植物抗盐能力，甚至使非盐生植物长出具有泌盐能力的盐腺，将对盐碱地的开发和利用具有里程碑式的意义。

发明内容

本发明的目的是提供二色补血草基因LbTRY及其应用。

本发明通过研究二色补血草中表皮毛发育的同源基因LbTRY，克隆该基因的启动子，并构建CRISPR/Cas9基因敲除载体，转化二色补血草，探索LbTRY基因在二色补血草盐腺发育过程中的作用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供二色补血草基因LbTRY，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

第二方面，本发明提供二色补血草基因LbTRY启动子，其为：

i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供含有所述基因LbTRY或所述启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第四方面，本发明提供所述基因LbTRY、所述启动子或含有所述基因LbTRY或所述启动子的生物材料在制备转基因植物中的应用。

第五方面，本发明提供所述基因LbTRY或含有基因LbTRY的生物材料的以下任一应用：(1)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；(2)用于植物品种改良。

优选地，所述植物为二色补血草。

所述调控为正调控，例如正调控盐腺细胞数目，促进拟分生母细胞分化成多细胞盐腺初始结构等。

第六方面，本发明提供一种使二色补血草盐腺细胞数目减少、盐腺发育异常的方法，利用基因工程手段，弱化二色补血草基因LbTRY，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达。

优选地，所述基因工程手段可选自诱变、定点突变、同源重组等中的一种。

进一步地，针对二色补血草中的目标基因LbTRY设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化二色补血草，进而获得该基因功能缺失的转基因植株。

优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TTCTGAGACAGTGGCGTCA-3’和5’-TGATAATCGGACTTCCTCA-3’。

第七方面，本发明提供一种促进植物盐腺发育(包括盐腺细胞数目增加，促进拟分生母细胞分化成多细胞盐腺初始结构等)的方法，所述方法选自如下①或②：①使植物表达所述基因LbTRY编码的蛋白；②在植物中过表达所述基因LbTRY。

优选地，所述植物为泌盐盐生植物，更优选二色补血草。

所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；5)通过导入增强子。

第八方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因植物的以下任一应用：i.用于植物育种；ii.用于盐碱地种植。

所述育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

本发明首次从二色补血草中克隆得到基因LbTRY的启动子，并分析了启动子元件。本发明还考察了基因LbTRY的生物学功能。本发明利用染色体步移法克隆得到LbTRY基因的启动子。LbTRY基因启动子序列有核心启动子元件(转录起始位点上游30bp左右)(TATA-box)，生长素响应元件(TGA-element)，顺式调节元件参与MeJA反应性(CGTCA-motif)，生长素响应顺式调节元件(AuxRR-core)，参与光反应的顺式调节元件(G-Box)，与光反应有关的保守DNA模块的一部分(Box 4)，启动子和增强子区域常见顺式作用元件(CAAT-box)。从二色补血草中敲除LbTRY基因后，叶片表面产生两发光点和三发光点的盐腺，盐腺复合体的细胞数量显著减少，说明LbTRY基因可能在盐腺发育中起到正向调控作用，促进拟分生母细胞分化成多细胞盐腺初始结构。本发明为泌盐盐生植物盐腺发育的机理研究奠定基础。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中以LbTRY 5SPs和APs为引物的1st、2nd、3rd PCR产物电泳图。箭头示目的条带。M，λ-Hind Ⅲ digest；1-3，AP1 1st 2nd 3rd PCR产物；4-6，AP21st 2nd 3rd PCR产物；7-9，AP3 1st 2nd 3rd PCR产物；10-12，AP4 1st 2nd 3rd PCR产物。

图2为本发明较佳实施例中LbTRY基因启动子克隆菌落PCR电泳图。M，λ-Hind Ⅲ酶消化。

图3为本发明较佳实施例中LbTRY基因启动子序列。ATG之后为CDS序列，ATG之前为启动子序列。

图4为本发明较佳实施例中LbTRY基因启动子克隆过程中所用引物位置。

图5为本发明较佳实施例中LbTRY编辑位点引入中间载体。

图6为本发明较佳实施例中pHEC401-2gR-LbTRY表达载体转化大肠杆菌和农杆菌菌落PCR电泳结果。A：转化大肠杆菌菌落PCR电泳图；B：转化农杆菌菌落PCR电泳图。

图7为本发明较佳实施例中基因沉默系lbtry与WT植株LbTRY序列比对。A：碱基序列比对；B：氨基酸序列比对。

图8为本发明较佳实施例中敲除LbTRY基因后二色补血草发育完善叶片的表皮结构。标尺＝20μm。SG，盐腺；ST，气孔；P，表皮细胞。

图9为本发明较佳实施例中敲除LbTRY基因后二色补血草叶片盐腺发育情况。标尺＝50μm。黄色箭头示正常盐腺，红色箭头示两发光点盐腺，绿色箭头示三发光点盐腺。

图10为本发明较佳实施例中荧光显微镜下野生型和LbTRY基因敲除株系的盐腺密度。A：叶片表型；B：盐腺密度。

图11(A～D)为本发明较佳实施例中DIC和荧光显微镜下敲除LbTRY基因后二色补血草叶片上不同的两发光点盐腺发育情况。标尺＝20μm。

图12(A～D)为本发明较佳实施例中DIC和荧光显微镜下敲除LbTRY基因后二色补血草叶片上不同的三发光点盐腺发育情况。标尺＝20μm，箭头示异常部分。

图13为本发明较佳实施例中激光共聚焦显微镜下两发光点盐腺明场、荧光和叠加图。标尺＝25μm。sc，分泌细胞；ac，毗邻细胞；ic，内杯状细胞；oc，外杯状细胞。黄色箭头示异常细胞排列，绿色箭头示加厚角质。A：正常两发光点盐腺；B：异常两发光点盐腺。

图14为本发明较佳实施例中激光共聚焦显微镜下三发光点盐腺明场、荧光和叠加图。标尺＝25μm。sc，分泌细胞；ac，毗邻细胞；ic，内杯状细胞；oc，外杯状细胞。A和B：不同三发光点盐腺。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 LbTRY基因及其启动子的克隆及功能分析

1.实验材料：二色补血草(Limonium bicolor)的种子于2020年10月采自中国山东省东营市黄河三角洲内陆的盐碱地。挑选粒大饱满、大小均一的种子，在使用前置于-4℃冰箱保存6个月，最大程度地消除种子间的个体差异性。

2.实验方法

2.1LbTRY基因启动子的克隆

根据基因DNA序列，设计克隆基因5'端DNA侧翼序列的引物(表1)。

表1 LbTRY基因5'端DNA侧翼序列克隆所用引物

使用TaKaRa Genome Walking Kit(Code No.6108)进行反应，以叶片基因组DNA为模板，反应步骤如下：

(1)1stPCR反应：以AP 1(AP2、AP3、AP4同时进行)作为上游引物，5SP1为下游引物，进行第一次PCR反应。

①按下列组份配制1st PCR反应液：

②1st PCR反应条件如下：

(2)2nd PCR反应：

将1st PCR反应液稀释1～1000倍后，取1μl作为2nd PCR反应的模板，以AP1为上游引物，5SP2为下游引物，进行2nd PCR反应。

①按下列组份配制2nd PCR反应液：

②2nd PCR反应条件如下：

(3)3rd PCR反应：

将2nd PCR反应液稀释1～1000倍后，取1μl作为3rd PCR反应的模板，以AP1为上游引物，5SP3为下游引物，进行3rd PCR反应。

①按下列组份配制3rd PCR反应液：

②3rd PCR反应条件如下：

(4)取1st，2nd，3rd PCR反应液各5μl，用1％琼脂糖凝胶进行电泳。

(5)切胶回收清晰的电泳条带，以5SP3为引物对PCR产物进行DNA测序。

(6)取1st，2nd，3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。

(7)切胶回收清晰的电泳条带，切胶回收，将回收产物转化到PMD18T克隆载体，然后通过热激法转化到大肠杆菌Trans-T1感受态中，挑取单菌落，划线，摇菌，提取质粒进行测序，pMD18 F、AP1、pMD18 R、5SP3为引物对PCR产物进行DNA测序。引物序列如下：

pMD18 F:5-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3

pMD18 R:AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA

以嵌套引物LbTRY 5SP1、LbTRY 5SP2、LbTRY 5SP3和兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4为引物(引物AP1、AP2、AP3、AP4来自TaKaRa公司的Genome Walking Kit，货号Code No.6108)，使用TaKaRa Genome Walking Kit试剂盒，利用染色体步移法，进行PCR后，取第一、二、三次的PCR产物各5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，三次所得的条带如图1所示，根据嵌套引物的位置，3次克隆得到的条带呈梯度减短，对不同条带进行切胶回收，利用LbTRY 5SP3引物测序，与LbTRY基因序列进行比对，结果找到与LbTRY基因序列已知片段高度同源的目的条带。

将此目的条带的回收产物连接到PMD 19T克隆载体上，转化大肠杆菌后，使用LbTRY PF2和LbTRY PR1为引物基因菌落PCR鉴定(图2)，挑取鉴定出来的菌株放入液体LB培养基中，加入Amp进行摇菌，提取质粒后使用通用引物pMD18 F、pMD18 R和LbTRY PF1引物进行序列测定，测序结果显示，所得DNA片段对应LbTRY基因，在测序结果中可以找到基因序列部分(图3)。期间所用引物如图4所示。最终获得LbTRY基因5’端序列1488bp。

二色补血草基因LbTRY启动子的序列如SEQ ID NO:2所示。二色补血草基因LbTRY编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.2LbTRY基因的启动子元件分析

使用PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp./htdocs/PLACE)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网上在线工具对LbTRY的启动子序列顺式作用元件进行分析。

利用PlantCARE数据库分析三个基因启动子的顺式作用调控元件。表2结果显示，LbTRY基因的启动子序列，除了有多个TATA-box和CAAT-box外，还存在MYBHv1结合位点(CCAAT-box)，参与玉米蛋白代谢调节顺式调节元件(O₂-site)，光反应性顺式作用元件(G-box)，对厌氧诱导必不可少的顺式调节元件(ARE)，另外，还有生长素响应元件(TGA-element)，生长素响应的顺式作用调控元件(AuxRR-core)，MeJA反应元件(CGTCA-motif)。

表2 LbTRY启动子序列顺式作用元件分析

结果表明，LbTRY基因的5’序列含有启动子的基本顺式作用元件，除此之外，LbTRY基因的启动子序列上含有CGTCA-motif，表明它可能参与植物非生物胁迫。

启动子是植物基因表达不可缺少的顺式作用元件，作为转录水平的重要顺式调控元件，在调控基因表达的过程中起到十分重要的作用(Twyman 2003)。核心启动子一般含有TATA-box、起始子、CAAT-box以及DPE(下游启动子件)。研究显示，苹果树能通过调整Iron-Regulated Transporter1(IRT1)基因的启动子来适应Fe不足的环境，在该基因编码区上游启动子区插入TATA-box可以显著提高IRT1的表达(Zhang,Lv et al.2016)。

通过对LbTRY基因的启动子序列进行分析发现，序列上不仅有TATA-box和CAAT-box这些基本顺式作用元件，还存在MYBHv1结合位点，光反应性顺式作用元件、生长素响应元件和生长素反应的顺式作用调控元件。另外还有MeJA反应元件，说明LbTRY基因在二色补血草生长发育中可能也起到重要作用，并且其启动子可能主要受到生长素和茉莉酸甲酯的诱导。

基因LbTRY启动子的克隆为今后研究上游调控基因和互作基因提供了方法。通过启动子分析，LbTRY在二色补血草的生长发育的过程中可能起到重要作用，LbTRY基因过量表达或敲除株系中盐腺的发育均产生变化，起到正向调控盐腺发育的作用。结合基因的启动子上的作用元件分析和转录组数据，我们对LbTRY基因在盐腺发育过程中可能的调控机制进行了预测。初步认为，LbTRY基因在盐腺发育的过程中并不是起到决定作用的起始基因，二色补血草中控制盐腺起始的关键基因LbTRY的上游表达，从而促进LbTRY基因的表达，并通过控制下游靶基因(LbGL2、LbGL3等)的表达，起到促进盐腺的产生。另外，LbTRY基因的表达可能受到MeJA等激素的诱导。这些预测结果需要后续通过酵母双杂等来进行验证和优化。

实施例2 CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及基因敲除株系的制备

1.CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

(1)根据CRISPR/Cas9基因编辑技术引物设计要求，设计靶点及引物，所用引物见表3：

表3 CRISPR/Cas9基因编辑所用引物

sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TTCTGAGACAGTGGCGTCA-3’和5’-TGATAATCGGACTTCCTCA-3’。

(2)利用四引物法进行扩增，PCR扩增体系如下(50μl)：

PCR反应程序：

(3)纯化回收PCR产物，进行酶连反应，反应体系如下(15μl)：

反应条件：37℃ 5h；50℃ 5min；80℃ 10min。

(4)取5μl连接产物，转化大肠杆菌Trans T1，使用U6-26启动子上的正向引物(U6-26F：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC)和U6-29启动子末端的反向引物(U6-29R:AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC)进行菌落PCR，鉴定阳性单克隆菌落后，摇菌提取质粒，转化农杆菌。

2.农杆菌介导的二色补血草遗传转化

(1)菌液制备

取出-80℃冰箱保存的农杆菌菌液，冰浴融化后涂布于加有50mg/L Kana和Rif的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养。挑取单克隆菌落，接种于YEB液体培养基，28℃摇床中180rpm培养24小时，取出1ml菌液，重新加入到含有50mg/L Kana和Rif的YEB液体培养基中，加入乙酰丁香酮AS(终浓度20μM)，28℃摇床中180rpm培养6小时。将菌液倒入50ml大离心管中，4℃ 6,000rpm离心5min，去上清，加入液体MS重悬菌体沉淀，加入AS(终浓度200μM)，紫外分光光度计测浓度为0.7-1.0(OD₆₀₀)，用于浸染二色补血草预培养的叶片。

(2)切叶片预培养

二色补血草培养60天无菌苗，切成1cm×1cm大小，置于N2(MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)培养基上，24℃暗培养两天，侵染过程中培养基配制参照袁芳(2014)。

(3)侵染

CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建：预培养两天的叶片浸入到准备好的菌液中，充分侵染20min，用镊子取出叶片，用滤纸将多余的菌液吸干后，将叶片置于放有一层滤纸的芽诱导共培养的培养基(含有10mg/ml葡萄糖)上，黑暗条件下，24℃共培养4天，之后将叶片转移到筛选培养基(MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+600mg/L哌拉西林钠+8mg/L潮霉素)。24℃，光照培养，每隔15天将叶片转移到新的筛选培养基上，待生芽后，掰芽，置于生根培养基(MS+0.5mg/L IBA+8mg/L潮霉素)中。

以中间载体为模板，使用带有携带编辑位点的四个引物进行PCR扩增后，得到626bp的正确的目的条带(图5)。将目的条带酶连到表达载体pHEC401上，对构建好的pHEC401-2gR-LbTRY表达载体转化大肠杆菌，以U6-26F正向引物和U6-29R反向引物进行菌落PCR扩增，扩增出726bp的正确目的片段(图6A)，使用U6-26F和U6-29F(TTAATCCAAACTACTGCAGCCTGAC)引物进行序列测定后包含编辑序列，说明载体构建成功，转化农杆菌后菌落PCR鉴定为阳性菌株(图6B)，用来转化野生型二色补血草。

潮霉素筛选基因敲除株系：利用潮霉素作为筛选压筛选转基因植株，侵染的叶片置于筛选培养基上培养，筛选期间每十五天继代一次，待生芽后掰芽转移到生根培养基上，转基因株系能够正常生长，而非转基因株系会逐渐黄化死亡。

基因敲除株系DNA水平上的鉴定：提取筛选到的补血草LbTRY基因沉默系植株叶片的基因组DNA，用鉴定引物(表4)对沉默系植株的基因序列进行克隆，转大肠杆菌后进行单克隆测序，结果显示，LbTRY基因沉默系是杂合株系，在第一个靶点位置被编辑，缺失14个碱基，造成移码突变，编码氨基酸终止(图7)。

表4 LbTRY基因片段克隆的引物

LbTRY基因敲除植株表型鉴定：二色补血草敲除LbTRY基因后，取叶片制作临时装片观察盐腺的发育情况，从图8可以看到，叶片表皮结构完全发育成熟，可以看到不规则的表皮细胞，发育成熟的盐腺和气孔，发现显微镜视野中除了正常的四个发光点的盐腺外，还有两个和三个发光点的盐腺的存在(图9)，并且两发光点和三发光点盐腺的分布没有固定规律。另外，敲除LbTRY后，叶片表面盐腺密度显著减少(图10)。

进一步对发育异常的盐腺进行观察发现，具有两发光点的盐腺可能由两组细胞组成，在荧光显微镜视野下可以看到两细胞之间的角质层加厚产生的荧光，虽然变成了两组细胞，但盐腺的性状还是近似圆形(图11，A～D)。

叶片上的三发光点盐腺大多数看起来是由三组细胞组成，排列较为整齐(图12，A～D)，但是有部分三发光点盐腺在盐腺紧邻的位置多出一些细胞，在荧光下也产生较强的自发荧光。由于DIC和荧光显微镜下盐腺结构观察时无法同时层切后合成更清晰立体图片，故采用双光子激光共聚焦显微镜进一步观察突变盐腺的结构。

在双光子激光共聚焦显微镜下我们看到，具有两个发光点的盐腺大多数是由两组细胞组成，并且两组细胞基本对称排列，都是由外杯状细胞、内杯状细胞、毗邻细胞和分泌细胞组成，形成八细胞的复合体盐腺(图13A)，与二色补血草正常盐腺的细胞排列是相同的，虽然细胞数量上发生了改变，但是细胞数量是成组平行减少的，由正常盐腺的四组细胞(一个外杯状细胞、内杯状细胞、毗邻细胞和分泌细胞为一组)减少为两组细胞。但是偶尔也有细胞组成存在紊乱情况的两发光点盐腺(图13B)，不同于两组细胞由内到外的排列方式，排列异常的盐腺根据激光共聚焦显微镜观察，在分泌细胞的位置，有四个细胞，但是其他毗邻细胞、内杯状细胞和外杯状细胞只有两个，导致细胞中间排列紊乱，但是外层毗邻细胞、内杯状细胞和外杯状细胞仍然是正常排列的，并且这种异常的两发光点盐腺较少。

具有三发光点的盐腺细胞组成规律也是没有改变的，从内到外依次为分泌细胞、毗邻细胞、内杯状细胞和外杯状细胞，共有三组细胞，构成十二细胞的盐腺复合体，虽然盐腺细胞数量发生改变，但是细胞是成组平行减少的，并且细胞排列规律没有发生改变(图14)，由此猜测三发光点盐腺仍然具有泌盐能力，可能由于细胞成组的减少，所以单个盐腺的泌盐能力可能有所降低。

通过构建LbTRY基因的沉默株系，我们发现LbTRY在二色补血草盐腺发育中起到重要的作用。LbTRY基因敲除时，二色补血草叶片上产生两发光点和三发光点盐腺，盐腺复合体的细胞数量显著减少，并且叶片表面盐腺的密度显著减少。经过观察，盐腺的组成仍然是两组或者三组细胞，在排列规律上没有产生变化，说明该基因敲除后，拟分生母细胞分裂形成两细胞后，两细胞即成为盐腺初始结构，直接进行分化，经过分化产生了八细胞盐腺；若分裂产生的两细胞中只有一个细胞再次经历分裂，便会产生三细胞盐腺初始结构，然后最终分化产生十二细胞复合体。说明LbTRY基因在盐腺发育的过程中可能起到正向调控作用，促进拟分生母细胞分裂后的细胞再次分裂作用。

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术筛选得到的LbTRY沉默系为杂合体，被编辑后缺失了14个碱基。通过敲除株系的盐腺的结构变化可以确定LbTRY基因在二色补血草盐腺的发育过程中起作用，盐腺作为一个十六细胞复合体，可能存在较多控制其发育的基因，在发育过程中，也存在大量的基因冗余现象，而LbTRY基因在调控盐腺发育的过程中也可能存在其它冗余的基因，导致基因敲除后不能产生所有盐腺都产生改变的表型，其上游必然存在命运决定的转录因子或互作基因。而这些基因在盐腺的发育过程中所起的作用以及它们之间的互作，都需要在后续工作中进行深入研究。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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序列表

<110> 山东师范大学

<120> 二色补血草基因LbTRY及其应用

<130> PI202110026

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 1

Met Asp Arg Thr Arg Asn Arg Arg Lys Gln Gln Arg Val Gln Met Thr

1 5 10 15

Thr Ser Ser Ser Ser Ala Leu Asp Gln Glu Val Ser Ser Ala Glu Trp

20 25 30

Glu Pro Val Asn Met Thr Glu Gln Glu Glu Asp Leu Val Asn Arg Met

35 40 45

Tyr Lys Leu Val Gly Pro Arg Trp Asp Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro

50 55 60

Gly Arg Lys Pro Glu Glu Ile Glu Arg Phe Trp Ile Leu Arg Gln Trp

65 70 75 80

Arg His Gly Phe Asp Thr Arg Asn Asn Asn Arg Asp Asp Asp Ser Tyr

85 90 95

Tyr Ser Tyr Asn Phe Asp Asp Asn Arg Thr Ser Ser Arg Ser Ser

100 105 110

<210> 2

<211> 1474

<212> DNA

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 2

aagctttatc cattattacc atccccttgt gggaacacat ctagattagc ataacattcg 60

tacaaaactc tgctgcaacc cagattaatg ccaacacatc ttccacaaat aaggaaaagc 120

ataaacctat acaaacaaaa tgtagaagta agaagcatac atagagtatt gccttattat 180

tggtacatac caaagattgg atgaacaata tacactacaa actgggcaag agtcacccat 240

ctcccgctag tttgcaacaa aaaaattaaa ggctttaggc agccctgggg atccctaaag 300

gccgcctctt aaacgtaact atcagattcg tttccttttt tccgggcctt gattgagatt 360

atcagcacga taagtgattc tcctatcccg aacacgtttc ccttttttac tagtttcatc 420

agttggattt tcttccataa ctcttcaaac aaaccctcat gcaccacctg ataaaaattc 480

cttttatacc ttacgtccac gaatgtctct ttgtcaattt tcatcaaaat aggcatctca 540

tgctcagcct tactaggatt atatatgatc gcctcccaac cttcctacca cttcatgtgt 600

gctatcagtc acatccccca tccgaacatc tgctttatca cggagcccct caacagctga 660

agaatccttt cacattaaac cacaaatatt tccaaacctc atcattgtca tcacctcctc 720

cctccacctt tctcacccca aggtgcacac aaccacggtc catatggata agtgccctct 780

tgcatgtata aagacttgac ttgagaactc tgtccacgta cccagctcaa aggcagggac 840

caaagtggtc tctaaataaa taagcatagt tgtagggaag gattgaagga gggagaagtt 900

gagcaggtcc aacacaataa ataaaagaag agttatccgt atataataag taaaataata 960

ctgtagcaca tgttgataat caatcattca acggtaaagg tgaatgtttg aattgaaccg 1020

atcgaggtaa caataaattg ttatgaacat tcaccaggtg tacgcatcct agcagtagct 1080

agctaggtag atgatatgta aggtaaaaaa tttgacatta tatgttaatg ttatatacta 1140

aaacgacaaa aatatatgat tgatgtgata cgttaaaaga gtgctgcaag tggcggacaa 1200

tttcttatat atatgatctc tctaagatat acagtatata gatagatgga tagagtcgtc 1260

aactacaagt cttgggtcaa acgacgcagg caaagctgtt tgttgggtgc tttgaaatct 1320

tgcttatttc ttccggcctc ttgtatcttc ttatttcagt gataactgat aagcatactc 1380

tctctctctc gtccttcatc atcaagcctc tgttttctcc tatttctagt acacacagaa 1440

tcagctttca tctatctcga tctcttcctt cctt 1474

Claims (10)

1.二色补血草基因LbTRY，其特征在于，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

2.二色补血草基因LbTRY启动子，其特征在于，其为：

i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

3.含有权利要求1所述基因LbTRY或权利要求2所述启动子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

4.权利要求1所述基因LbTRY、权利要求2所述启动子或权利要求3所述生物材料在制备转基因植物中的应用。

5.权利要求1所述基因LbTRY或含有该基因的生物材料的以下任一应用：

(1)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；

(2)用于植物品种改良；

其中，(1)中所述的调控为正调控；

优选地，所述植物为二色补血草。

6.使二色补血草盐腺细胞数目减少、盐腺发育异常的方法，其特征在于，利用基因工程手段，弱化二色补血草基因LbTRY，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达；所述二色补血草基因LbTRY同权利要求1中所述。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程手段选自诱变、定点突变、同源重组中的一种。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，针对二色补血草中的目标基因LbTRY设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化二色补血草，进而获得该基因功能缺失的转基因植株；

优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TTCTGAGACAGTGGCGTCA-3’和5’-TGATAATCGGACTTCCTCA-3’。

9.使二色补血草盐腺细胞数目增加、促进盐腺发育的方法，其特征在于，所述方法选自如下①或②：

①使植物表达二色补血草基因LbTRY编码的蛋白；

②在植物中过表达二色补血草基因LbTRY；

其中，所述二色补血草基因LbTRY同权利要求1中所述；

所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

5)通过导入增强子。

10.根据权利要求9所述方法获得的转基因植物的以下任一应用：

i.用于植物育种；

ii.用于盐碱地种植。

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