JPH0418099A - オスモチン様タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、高等植物細胞のストレス耐性に関与する新規
オスモチン様タンパク、該タンパクをコードするＤＮＡ
配列、該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター、該発現ベク
ターを有する形質転換体、および該形質転換体を用いた
オスモチン様タンパクの調製方法に関する。

（従来の技術） 植物体の生育時には１種々のストレスが該植物体に影響
を与える。例えば、土壌が高塩濃度であったり酸性であ
ること；干ばつに見舞われて乾燥すること；異常な高温
や低温であること：低栄養であること；ウィルスに感染
することなどがストレスとなり植物体に種々の影響を与
える。このような種々のストレスの１種もしくはそれ以
上によって植物体には特定の遺伝子の発現が誘導され。

ある種のタンパクが形成されることが知られている。例
えば、植物体の傷害や病原菌の感染により。

キチナーゼやグルカナーゼをコードする遺伝子。

あるいはＰＲＩタンパク遺伝子からのタンパクの発現が
誘導されることが知られている。さらに、水ストレスに
関係する植物ホルモンであるアブシジン酸によりイネの
ＲＡＢ２１遺伝子の発現が誘導され。

そして塩ストレスによりオスチモン遺伝子の発現が誘導
されることが知られてい、る。これらストレスにより誘
導されるタンパクについては、キチナーゼおよびグルカ
ナーゼのようにその酵素活性が認められているタンパク
もあるが、多（のタンパクについては、その機能が充分
に知られていない。

このように、その存在が知られているが、その機能につ
いては充分に知られていないタンパクのひとつにオスチ
モンがある。オスモチンは、　　Ｎ、Ｋ。

Ｓｉｎｇｈら　（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　　
８５（１９Ｂ？）、　　５２９−５３６）により報告さ
れている。このオスモチンは、−時的な浸透圧ショック
では誘導されないが、植物体または植物細胞を徐々に高
ＮａＣ１濃度、乾燥などの浸透圧ストレス条件下に置く
ことにより誘導・生産され、液胞に封入体（ｉｎｃｌｕ
ｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）として蓄積される。Ｎ、　Ｋ、　
Ｓｉｎｇｈらは、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａ
ｃｕｓ　ｗａｒ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　３ｇ）の培養細
胞から水溶性のオスモチン！、ならびに界面活性剤に可
溶性のオスモチン■の二つの型のオスモチンを単離して
おり、オスモチンＩについては電気泳動的に均一にまで
精製している。オスモチンＩおよびオスモチン■はとも
に約２６ｋｄのタンパクであり、それらのアミノ酸配列
はＮ末端から２２番目までが等しいことが知られている
。これらオスチモンの一次構造は、トウモロコシのアミ
ラーゼおよびトリプシンインヒビターの一次構造と高い
相同性を有することが知られている。そのため、オスチ
モンは。

ストレス環境下で生じた傷害に伴なうタンパクの分解（
プロテアーゼによる分解）を抑制すると考えられる。

このように、オスモチンのようなストレスタンパクにつ
いての研究が高ストレス耐性を有する植物体の育成や耐
ストレス性物質の製造という観点から、さらに望まれて
いる。

（発明が解決しようとする課Ｂ） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、新規オスモチン様タンパク、
該オスモチン様タンパクをコードスルＤＮＡ配列、該配
列を有する発現ベクター、該発現ベクターが導入された
形質転換体、および該形質転換体を用いたオスチモン様
タンパクの調製方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 発明者らは、植物培養細胞における葉緑体分化の制御を
行なう因子についての研究を行なうために、タバコ培養
細胞およびタバコの緑葉の総タンパクの組成の比較を行
った［佐原ら１組織培養。

ｌ５（１）、　７−１１．１９８９］。その結果、タバ
コ培養細胞には、ストレスタンパクとして知られている
オスモチン、キチナーゼなどと高い相同性を有するタン
パクが多量に蓄積されていることを発見し、これについ
てさらに研究を進めることにより本発明を完成するに至
った。

本発明のオスモチン様タンパクは、第１図に示される２
２位のＳｅｒから２５１位のＬｙｓまでのアミノ酸配列
を有する。

本発明のＤＮＡ配列は、上記オスモチン様タンパクをコ
ードする。

本発明の発現ベクターは、上記オスモチン様タンパクを
コードするＤＮＡ配列を有する。

本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを宿主細胞に
導入して得られる。

本発明のオスチモン様タンパクの調製方法は。

上記形質転換体を培養する工程、および該形質転換体に
より生産されたオスチモン様タンパクを採取する工程、
を包含する。

本発明のオスモチン様タンパクは、タバコ（Ｎｉｃｏｔ
ｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）　、　　特にＮ１ｃｏｔｉ
ａｎａ　ｔａｂａｃｕｍＣｙ　Ｓａｍｓｕｒ＋　ＮＮの
培養細胞［ｐｈｏｔｏｍｉｘｏｔｒｏｐｈ（ＰＭ）細胞
；佐原ら（前出）〕内に著量蓄積され、あるいは、タバ
コの根組織において蓄積される。発明者らは上記ＰＭ細
胞を培養し、その細胞粗抽出液の２次元電気泳動を行っ
たところ１通常のタ／イコ緑葉には検出されないｐｌが
７以上の塩基性タンノくりが数種検出された［　Ｆ、　
５ａｔｏら、　　Ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｄＳｅｃｏｎｄ
ａｒｙ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃ
ｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ。

Ｗ、　Ｇ、　Ｗ、　ＫｕｒｚＷＪ、　　２７−３４　（
１９８９）　］。そのうちのひとつは、傷害ホルモンで
あるエチレンにより誘導され、　　ＰＲ（ｐａｔｈｏｇ
ｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ）タン／＜りとして知ら
れているキチナーゼと高い相同性を有することが明らか
となった。さらに他の２種は、　　ＮａＣ１耐性のタバ
コ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　　ｔａｂａｃｕｍ　Ｌ、　ｃ
ｖ　Ｗｉｓｃｏｓｉｎ３８）培養細胞に蓄積するオスモ
チンタン、ｆりと高い相同性を有することが明らかとな
った。このうちのひとつ（オスモチン様タンパク；Ｉ）
Ｉ　７．５．　　分子量２６ｋＤ；上記Ｐｒｉｍａｒｙ
　ａｎｄ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
ｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓではＰ
４という名称で示されている）について、　　ｃＤＮＡ
のクローニング、塩基配列の決定１発現ベクターの構築
、該発現ベクターによる宿主細胞の形質転換および発現
を行った。

以下に１本発明を工程の順に説明する。この工程におい
てのＤＮＡ組換え方法は１例えば、モレキュラークロー
ニング（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら著；　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ
ｅｖ　Ｙｏｒｋ、　１９ｇ２）に記載されている方法に
より行うことができる。

（Ａ）タバコ立　　　からのｃＤＮＡのクローニング本
発明のオスモチン様タンパクをコードするｃＤＮＡのク
ローニングは２例えば、以下の（Ａ−１）〜（Ａ−３）
項に述べる方法により行われ得る。つまり、タバコ培養
細胞から抽出した全ＲＮＡからポリ（八〇）ＲＮＡを単
離し、これを鋳型として合成オリゴヌクレオチドブライ
マーによりｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリーを
作成し、プローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより行なわれ得る。上記プローブ
は、オスモチンタンパクＮ末端の既知のアミノ酸配列を
基にして作成され得る。

その他９例えば、第１図に示される情報により適当なプ
ローブを合成し、これを使用することによりｃＤＮＡを
クローニングすることができる。あるいは、タバコ培養
細胞からの精製オスモチン様タンパクで家兎などの動物
を免疫して得たポリクローナル抗体を用い、　　ｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングすることにより、　　
ｃＤＮＡのクローニングを行うこともできる。

（Ａ−１）タバコ立　　　の　ＲＮＡのオスモチン様タ
ンパクを生産しうるタバコ培養細胞〔例えば、　旧ｃｏ
ｔｉａｎａ　　ｔａｂａｃｕｍ　ａｙ　ＳａｍｓｕｎＮ
ＮのＰＭ細胞；佐原ら（日本植物生理学会講演要旨集。

３７６頁）およびＰｌａｎｔ　　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、　（１９９０）、ｖｏｌ。

３１、２１５〜２２１頁〕の培養細胞を常法により破砕
し。

グアニジウム塩による抽出、塩化セシウム平衡密度勾配
遠心法、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノー
ル沈澱を行うことにより、全ＲＮＡ抽出物が得られる。

（Ａ−２）ポリ　Ａ９ＲＮＡの　　１ 真核細胞のｍＲＮＡには１通常３°末端にポリアデニル
鎖が結合している（ポリ（ＡａＲＮＡ）。これを利用し
て１例えば、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いる
ことにより、全ＲＮＡ抽出物からポリ（八〇）ＲＮＡを
効果的に精製することができる。

（Ａ−３）　ｃＤＮＡライブラリーの　　およびスクリ
ーニ乙１ 合成オリゴヌクレオチドブライマーを用い。

ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ　（Ｇｅｎｅ、　２
５．　２６３（１９８３）］　の方法に従って、上記（
Ａ−２）項で得られたポリ（Ａ’）ＲＮＡ精製物を鋳型
として二本鎖ｃＤＮＡが合成される。

合成オリゴヌクレオチドブライマーとしては１例えば、
　　ｍＲＮＡのポリＡ部分に相補的なオリゴｄＴ部分と
。

制限酵素凪Ｉの切断部位（５−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３°
）とを有するオリゴヌクレオチド（５°−ＧＴＣＧＡＣ
ＴＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴ−３°）が使用され得る。合成された二本鎖ｃＤ
ＮＡは、　　Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端
化した後、制限酵素ＮｏｔＩで消化し、フェノール／ク
ロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行ってＮｏｔｌ
断片とし、大腸菌のプラスミドベクターノーツであるブ
ルースクリプトＵ　（Ｂｌｕｅｓｅｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｋ
Ｓ”）　ＨＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込まれる
。それには、該ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＮ
ｏｔ　Ｉで消化して得られる大きい方のＥｅｏＲＶ　−
Ｎｏｔ　Ｉ断片と。

上記ｃＤＮＡのＮｏｔ　Ｔ断片とをライゲーション反応
により連結することにより行われる。このようにして得
られたベクターで大腸菌Ｈ８１０１株などの適当な宿主
細胞を形質転換することにより、　　ｃＤＮＡライブラ
リーが得られる。

このｃＤＮＡライブラリーを、前述のＴ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら著；モレキュラークローニングのコロニーノ＼
イフソダイゼーション法により１合成オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いてスクリーニングすることにより、こ
のプローブに特異的に結合するｃＤＮＡを有する形質転
換体が得られる。プローブとしては。

第２図に示すプローブＩおよびプローブ■が使用され得
る。プローブＩは、タバコ細胞より抽出されたオスモチ
ン様タンパクのアミノ酸配列のＮ末端から８〜２１位の
アミノ酸に対応する複数種の。

オリゴヌクレオチドを合成し、放射標識することにより
調製される。プローブ２は、オスチモン様タンパクのア
ミノ酸配列のＮ末端から１〜７位のアミノ酸に対応する
複数種の、オリゴヌクレオチドを合成し、放射標識こと
により調製される。第２図において、■は、プローブと
して用いるオリゴヌクレオチドの数を減らすためイノシ
ンを用いたことを示す。これらのプローブと特異的にハ
イブリダイズする陽性クローンを選択し、常法に従って
プラスミドＤＮＡを単離・精製することにより。

目的のｃＤＮＡを有するプラスミドｐＴＯＬ１が得られ
る。

このプラスミドｐＴＯＬ　ｌは、約１　ｋｂｐのＤＮＡ
インサートを含有しており、該ＤＮＡインサートの塩基
配列をジデオキシ法により決定したところ、第１図に示
す塩基配列が得られた。　この配列は、翻訳開始コドン
ＡＴＧからはじまる７５３塩基のアミノ酸翻訳領域（２
５１アミノ酸残基）を含んでいた。このＤＮＡ配列の８
１位から１９７位に対応するアミノ酸配列（２２位から
６０位のアミノ酸配列）は１発明者らが以前に決定した
Ｐ４タンパク［Ｆ、５ａｔｏら、　　Ｐｒｉｍａｒｙ　
ａｎｄ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　
ｏｆ　ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、Ｗ、
Ｇ、Ｗ。

Ｋｕｒｚ編、　２７−３４（１９８９）］のＮ末Ｎ末端
アミノ列配完全に一致していた。

上記の事実ならびにｍＲＮＡ長の分析より、クローニン
グされたｃＤＮＡは、シグナルペプチドをコードする６
３個の塩基配列、およびそれに続いて２３０個のアミノ
酸からなる成熟タンパクをコードする６９０個の塩基配
列を含む、完全長のｃＤＮＡであることがわかった。

このようにして得られたオスモチン様タンパク遺伝子の
ｃＤＮＡの塩基配列から推定されるタバコオスモチン様
タンパクのアミノ酸配列と、以前に報告されているオス
モチンタンパクのアミノ酸配列［ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ
ｊｏｌ、　Ｖｏｌ、９０．１０９８頁（１９８９＞］　
とを比較すると、全アミノ酸配列において約７８％の相
同性が認められた。Ｃ末端領域およびシグナルペプチド
部分の相同性は他の部位に比べてやや低いことが確認さ
れた。

（Ｂ）　　　ベタ　−の 上記ｐＴＯＬ　Ｉから１次のように、オスチモン様タン
パクをコードするＤＮＡ配列を切り出し、適当な発現用
ベクター、例えば原核細胞（例えば、大腸菌の）発現ベ
クターであるｐＴＶｌｌｌｌＮ　（宝酒造）のＮｃｏ１
部位に組み込むことにより発現ベクター（ｐＴＶＴＯＬ
）が構築される。上記ｐＴＯＬ　Ｉからオスモチン様タ
ンパクをコードするＤＮＡ配列を切り出し１発現用ベク
ターに組み込む方法としては、制限酵素を利用する通常
の方法、およびポリメレースチェイン反応（ＰＣＲ）法
のいずれもが利用可能であり、操作が容易であることか
らＰＣＲ法が汎用される。ＰＣＲ反応のブラマーとして
は１例えば、オスモチン様タンパクをコードするＤＮＡ
の開始コドンＡＴＧを含む、該ＡＴＧ近傍の配列であっ
て、かつＮｅｏ　１部位が導入された配列（５−ＴＣＣ
ＡＣＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＴＴ−３°）；および
該オスモチン様タンパクをコードするＤＮＡの下流に存
在するｐＴｏｔ、　１由来のＤＮＡ配列に相捕的に配列
（５°−ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３
”　）が使用され得る。

ＰＣＲ反応で得られた２本鎖ＤＮＡは、　Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて平滑末端とされる。次に制限酵素■
ｏｆおよび匡１で消化されて、　Ｎｃｏｌ−Ｓａｃｌ断
片が得られる。次に、上記ｐＴＶ１１８Ｎを畢１および
５ａｃｌで消化し、大きい方の断片を得、これに、上記
独１−匡１断片を連結することにより、上記発現ベクタ
ーｐＴＶＴＱＬが構築される。

＜Ｃ＞　　主　　の≦　−および発 （Ｂ）項で得られた発現ベクターを適当な宿主１例えば
、大腸菌ＪＭ１０９株などに常法により導入することに
より形質転換体が得られる。この形質転換体を通常の方
法により培養することにより２本発明発明のオスモチン
様タンパクが生産される。例えば、形質転換された大腸
菌を懸濁培養することにより、オスモチン様タンパクが
菌体内に蓄積される。このとき、培養における適当な時
期にイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え
ると、　ｐＴ’７１１８Ｎが有するｌａｃプロモーター
が活性化され、オスモチ様タンパクの生産効率が向上す
る。生産されたオスモチン様タンパクは常法により回収
される。例えば、　４Ｍ尿素、０．２％ＮＰ−４０（商
品名）を含む緩衝液中で菌体を超音波処理することによ
り。

オスモチン様タンパクは可溶化される。これを。

通常のカラムクロマトグラフィーにかけることにより精
製される。得られたオスモチン様タン／（りは、　５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥにより単一のバンドとして確認される。こ
のタンパクは、Ｎ末端のアミノ酸配列力。

タバコ培養細胞により生産されるオスモチン様タンパク
のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致する。

（実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

尖皿五上 以下の実験において、　ＤＪＪＡ組換え方法は、全てモ
レキュラー　クローニング（Ｔ、　ｍａｎｉａｔｉｓら
著。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
　１９８２）に記載の方法に従って行った。

タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ　
Ｓａｍｓｕｎ　ＮＮ）の培養細胞［ＰＭ細胞（前出）］
をナフタレイン酢酸１０μＭ、　　カイネチン１μＭを
含むＬｉｎｓｍｅｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地に接種し、懸
濁培養を行った。培養開始から４日後、液体窒素により
培養細胞を凍結し、乳鉢およびワーリングブレンダーを
用いて細胞破砕した。

得られた細胞破砕物に２００ａｌのグアニジウム溶液（
グアニジウムチオシアネート　１３０ｇ、　　クエン酸
二ナトリウム１．３２ｇ、　　ラウリルザルコシンナト
リウム１　ｇ＋　　β−メルカプトエタノール１．４Ｂ
、　ｐＨ７，０）を加え、ガラスホモジナイザーで磨砕
した後に１０、０００ｇで２０分間遠心分離して上清液
を得た。この上清液３８１を、別の遠心管に入れた塩化
セシウム溶液（５，７Ｍ　ＣｓＣ１，０，１Ｍ　ＥＤＴ
Ａ）　２０ｍ１に重層し。

１０〜１５℃で２２．５００ｒｐｍにて２４時間遠心分
離した（日立ＰＲＳ２５Ｔ−２０−ターを使用）。上清
を除去して得られた沈澱に７０％エタノールを加え、　
　８．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離することにより
沈澱を洗浄した後。

真空乾燥を行った。得られた乾燥物をＴＥ緩衝液〔０，
１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ
８，０））に溶解し、これを全ＲＮＡ粗抽出液とした。

この全ＲＮＡ粗抽出液に、　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら
（前出）の方法に従って等量のフェノール／クロロホル
ム溶液を加えて攪拌した後、遠心分離し、水層を回収し
た（以下、この操作をフェノール／クロロホルム抽出と
する）。この抽出操作をもう一度繰り返し、得られた水
層に１／１ｏｆｆｉの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ）Ｉ　５
．２）および２倍量のエタノールを加え。

−７０°Ｃにて１時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた（
以下、この操作をエタノール沈澱とする）。その後。

遠心分離を行うことにより沈澱物を回収し、真空乾燥し
て全ＲＮＡ抽出物を得た。

（Ａ−２）ポリ　Ａ＋ＲＮＡの　　１ ０、３ｇのオリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｓｉｇｎ＋ａ社
）をＴ　′Ｅ緩衝液に懸濁してカラムに充填し、水５ｍ
ｌ、　次いで５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＯ、　ＩＭ
　ＮａＯＨ５ｍ！で順次洗浄してオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースカラムを作製した。

このカラム用い１次のようにしてポリ　（Ａ”）　ＲＮ
Ａの精製を行った。それにはまず、上記全ＲＮＡ抽出物
を０．５Ｍ　ＮａＣ１を含有するＴＥ緩衝液に溶解させ
、６５°Ｃにて５分間インキコベートした後、氷水にて
急冷した。この溶液を、　　０．５Ｍ　ＮａＣｌを含有
するＴＥ緩衝液で平衡化した上記オリゴ（ｄＴ）セルロ
ースカラムに通し、ポリ（Ａ”）　ＲＮＡを吸着させた
。カラムを０．５Ｍ　ＮａＣ１を含有するＴＥ緩衝液１
０１で洗浄した後、　ＴＥ緩衝液によりポリ（Ａ″″）
ＲＮＡを溶出させた。得られた溶出液はエタノール沈澱
を行い、遠心分離により沈澱物を回収して一７０°Ｃに
て保存した。

（Ａ−３）　ｃＤＮＡライブラリーの　　およびスクリ
ーニング ｃＤＮＡライブラリーを作成する目的で、オリゴヌクレ
オチドプライマー（５−ＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＧＣＧ
ＧＣＣＧＣＴ丁丁Ｔ丁Ｔ丁ＴＴ丁ＴＴ丁Ｔ丁−３′）を
ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステムズ社；　３
８１Ａ型）により合成した。合成されたオリゴヌクレオ
チドプライマーは、アブライドバイオシステムズ社の推
奨する方法で精製した。この合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーは。

ｍＲＮＡのポリＡ部分に相補的なオリゴｄＴ部分の他に
。

制限酵素ニ■の切断部位（５−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’
　）を有する。こ゛のプライマーを用い、上記（Ａ−２
）項の方法で得られたポリ（Ａ“）　ＲＮＡ精製物を鋳
型として。

ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ　（前出）の方法に
従って次のようにして二本鎖ｃＤＮＡを合成した。

まず、ポリ（Ａ”）ＲＮＡ精製物（１３μｇ／１２３μ
１）１１５μｌと９課題を解決するための手段の（Ａ−
３）項に記載の合成オリゴヌクレオチドプライマー（１
ｕｇ／μｌ）　５μｌとを混合し、７０℃にて１０分間
インキュベートした後、水冷した。この溶液に表１に示
す組成の各化合物を加え、４２°Ｃにて６０分間インキ
ュベートした。

表１ ５　Ｘ　ＲＮａｓｅ緩衝液”　　　　　　　　　４０μ
ｍ１６０ｍ１＋ｌピロリン酸ナトリウム　　　　　５μ
１１０＋ｎＭ　４　Ｘ　ｄＮＴＰ”　　　　　　　　　
　　２０μｍ１　Ｍ　ＤＴ７　　　　　　　　　　　　
　　　２μ１ＲＮａｓｅインヒビター （ＴＡＫＡＲＡ　１００Ｕ／μＩ）　　　　　　　３μ
ｌ　　／逆転写酵素 （Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ社、　　２０ｕ／　ｕ　１
）　　　１０μ！”　５００ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ
８り　、　　７００ｍＭ　ＫＣＩおよび５０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２ ”　ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ
をそれぞれ１０ｍＭずつ含有する混合液 インキニベート終了後、フェノール／クロロホルム抽出
を行い、さらにエタノール沈澱を行った。

得られた沈澱物を１３２μｌの水に溶解し、この溶液に
表２に示す組成の各化合物を添加し、　　１２℃にて６
０分間インキュベートした。

表２ ５ＸＰｏｌＩ緩衝液°４０μｍ １０ｍＭ　４　Ｘ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　２ｕ
　１１０ｍＭ　ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　５μＩ
Ｋ２匹１ｉ　ＤＮＡリガーゼ （ＮＥＢ”　１　ｕ／　ｕ　１）　　　　　　　ＩＯｕ
　１ＤＮＡポリメラーゼＩ （ＮＥＢ”ｌｏｕ／　ｕ　ｌ）　　　　　　　　　Ｌｏ
μＩＲＮａｓｅ　Ｈ （ＴＡＫＡＲＡ　４０ｕ／　μｍを１／１０希釈）１μ
＋”　１００ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）　、　
　３５ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜ＳＯＯ＋＋＋Ｍ　ＫＣＩおよ
び２５０μｇ／ｌｌ１ｌ　ＢＳＡ°°ニューイングラン
ドバイオラボ社 反応終了後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタ
ノール沈澱を行い、二本鎖ｃＤＮＡ断片を得た。

得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡポリメラー
ゼにより平滑末端化した後、制限酵素眩口で消化し。

フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を
行ってＮｏｔ　Ｉ断片を得た。

他方、大腸菌のプラスミドベクターの一つであるブルー
スクリプトＩＩ　（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔｆｆ　（ＫＳ
”）　；　Ｓｔ−ｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＶおよびＮｏｔｌで消化し、フェノール／クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱を行って大きい方のＤ
ＮＡ断片＜ＥｃｏＲＶ　−Ｎｏｔｒ断片）を得た。この
ブルースクリプト■のＥｃｏＲＶ　−Ｎｏｔ　Ｉ断片と
、上記ｃＤＮＡのＮｏｔｌ断片とをライゲーション反応
により連結し、得られたプラスミドベクターを大腸１１
１！（８１０１株に導入して形質転換を行った。得られ
た形質転換体は、　Ｔ、　Ｍａｎｊａｔｉｓら（前出）
のコロニーハイブリダイゼーション法によりスクリーニ
ングを行った。それには、プローブとして第２図に示す
プローブＩおよびプローブ■を合成し、これらを順次用
いた。これらのプローブは１課題を解決するための手段
の（Ａ−３）項に記載のように、オスモチン様タンパク
のアミノ酸配列のＮ末端付近の配列をもとに、３２Ｐで
放射標識したオリゴヌクレオチドとして調製された。ノ
＼イブリダイゼーションの結果、これらのプローブと特
異的にハイブリダイズするｅＤＮＡを有するプラスミド
を含有する株（陽性クローン）が得られた。

この陽性クローンを培養し、常法に従ってプラスミドＤ
ＮＡを単離・精製した。これをプラスミドｐＴ。

Ｌｌと命名した。このプラスミドｐＴＯＬｌに挿入され
たｃＤＮＡ断片の塩基配列を、ジデオキシ法にて決定し
たところ、第１図に示す塩基配列が得られた。この配列
は、オスモチン様タンパクをコードする完全長のｃＤＮ
Ａであることがわかった。

ブライマーとして、オスモチン様タンパクをコードする
ＤＮＡの開始コドンＡＴＧを含む、該ＡＴＧ近傍の配列
であって、かつＮｃｏ１部位が導入された配列（５°−
ＴＣＣＡＣＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＴＴ−３’　）
；および該オスモチン様タンパクをコードするＤＮＡの
下流に存在するｐＴＯＬ　ｌ由来のＤＮＡ配列に相捕的
に配列（５°−ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ
Ｔ−３°）を用いた。これらのブライマーをＤＮＡ合成
機（アブライドバイオシステムズ社；３８１Ａ型）で合
成し、さらに逆相法ＨＰＬＣで精製した。

これらの精製ブライマーを用いてＰＣＲ法によってＡＴ
Ｇ　（開始コドン部位）以下の構造遺伝子の増幅を行っ
た。

上記ＰＣＲ法によって増幅された２本鎖のＤＩＪＡを。

Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端とした。次に
。

制限酵素独１および匡１で消化し１次いで精製し。

議Ｉ−塗１断片を得た。

Ｂ−２ベクターの 原核細胞発現ベクターであるｐＴＶ１１８Ｎ　（宝酒造
側）を、制限酵素５ａｃｌ、　Ｎｃｏｌで消化して開環
し、直鎖状ＤＮＡとした後、得られる長い方の断片５ａ
ｃｌ−Ｎｃｏｌ断片を脱リン酸化処理した。脱リン酸化
処理したｐＴＶ１１８Ｎ　（Ｓａｃｌ−Ｎｃｏｌアーム
）ベクターと、　　（Ｂ−１）項で調製したオスモチン
様タンパク構造遺伝子断片とをライゲーションキッド（
タカラ社製）を用い連結して発現ベクターを構築した。

（Ｃ）　　主　　の３−　および発 大腸閉（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＪＭ−１０９フンピーテント
セルを宿主細胞として、（Ｂ）項で構築した発現ベクタ
ーでこれを形質転換した。

形質転換された宿主細胞をアンピシリン５０μｇ／ｍ１
を添加したＬＢ寒天培地（１％トリプトン、５％イース
ト抽出物、５％ＮａＣ１，０，１％グルフース、　　ｐ
）１７．５゜１．５％寒天）に植菌し、−晩培養して、
シングルコロニー群を得た。得られたシングルコロニー
を上記アンピシリンが添加されたＬＢ培地に植菌して。

３０Ｏｒｐｍ、　３７°Ｃで一晩培養し、増殖を行った
。菌体を採取し、得られた菌株からアルカリーラビ・ノ
ド法（Ｔ、　Ｍａｎｉａｌｉｅら著、　Ｍｏ１ｅｃａｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　９０頁）によりプラスミドＤ
ＮＡを抽出し、精製を行った。精製したプラスミドＤＮ
Ａを制限酵素５ａｃｌ、およびＮｃｏ［で消化し、その
消化液を０．８％アガロースゲルで電気泳動にかけた。

このことにより、構造遺伝子断片が挿入されていること
が確認された。完全長の断片（約ｔ　Ｋｂｐ）が挿入さ
れているクローンを選抜した。選抜したクローンを、ア
ンピシリン、５０μｇ／ｍ　ｌを添加したＬＢ液体培地
１００１に植菌して、３００ｒｐｍ、　　３７°Ｃの条
件下で培養した。０Ｄ６ｉ１１１が０．２まで増殖した
ときにＩ　ＰＴＧを０．１ｍＭの濃度となるように添加
し、さらに１２時間、　　３００ｒｐｍ、　３７℃で振
とう培養した。

培養液を４℃にて、　４０００ｇで１０分間遠心処理し
て菌体を採取した。その後閑体を水冷したＳＥＴ緩衝液
（１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，８，Ｏ，Ｉ
Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄した。この菌体
を変性液（５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ６，８
，１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、　　５％β−メル
カプトエタノール、　　０．０２％ＢＰＢ）１ｍｌに懸
濁した後、ウォーターバス中で９０℃にて３分間変性さ
せた後。

水中で常温まで冷却した。

この溶解菌体を含む変性液に多種類存在するタンパクを
、　　１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、
　３０ｍＡの定電流下で電気泳動して分離した。電気泳
動が完了したポリアクリルゲルを０．１％クマ／−ブリ
リアントブルー（ＣＢＢ）で１時間染色し、さらに脱色
してタンパクバンドを顕在化させた。その結果、　　２
６ＫＤａの位置にタンパクのバンドが確認された。これ
は、第１図の、２２位のＳｅｔから２５１位のｔ、ｙＳ
までのアミノ酸配列を有するオスモチン様タンｔｆりの
分子量とよく一致する。

さらに、上記染色されバンドが顕在化したポリアクリル
アミドゲルを竹田らの方法［Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＰｔ
＋ｙｓｉｏ！、（１９９０）、ｖｏｌ、３１．２１５〜
２２１頁］でＰＶＤＦ膜に転写した。転写されたタンパ
クバンドのうち、前述の２６ＫＤａのバンドを切り出し
、ペブチドシークエンサ−（アプライドバイオシステム
ズ社、　　４７７Ａ型）にかけて、Ｎ末端からのアミノ
酸配列を解析した。

その結果、Ｎ末端から２０個のアミノ酸配列は、竹田ら
が報告した［Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、
（１９９０）、ｖｏｌ、３１．２１５〜２２１頁］オス
モチン様タンノくりのｃＤＮＡの塩基配列から予測され
たアミノ酸配列と同一であった。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、植物のストレスタンパク
の一種であるオスモチン様タンノｔり、該タンパクをコ
ードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有する発現ベクタ
ー、該発現ベクターを有する形質転換体、および該形質
転換体を用いたオスモチンタンパクの調製方法が提供さ
れる。これらは９例えば、　ＮａＣ１耐性に優れた新し
い植物品種を得るための品種改良の研究などに利用され
得る。さらに。

これらは、オスモチンタンパクを包含する植物ストレス
タンパクの遺伝子レベルでの発現機構の解明のためのさ
らなる研究に役立つと期待される。

４、　　　　の　　　　な！　ａ 第１図は１本発明のオスモチン様タンパクのアミノ酸配
列およびそれをコードするＤＮＡ配列を示す配列図であ
る。

東２図は１本発明のオスモチン様タンパクをコードする
ＤＮＡ配列を得るために用いたプローブＩおよびプロー
ブ■の塩基配列を示す配列図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図に示される２２位のＳｅｒから２５１位のＬ
   ｙｓまでのアミノ酸配列を有するオスモチン様タンパク
   。 ２、第１図に示される１位のＭｅｔから２５１位のＬｙ
   ｓまでのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のオス
   モチン様タンパク。 ３、請求項１に記載のオスモチン様タンパクをコードす
   るＤＨＡ配列。 ４、第１図の８１位のＴから７７０位のＧでなる塩基配
   列を有する、請求項３に記載のＤＮＡ配列。 ５、第１図の１８位のＡから７７０位のＧでなる塩基配
   列を有する、請求項３に記載のＤＮＡ配列。 ６、請求項３に記載のＤＮＡ配列を有する発現ベクター
   。 ７、請求項６に記載の発現ベクターを宿主に導入して得
   られる形質転換体。 ８、前記宿主細胞が大腸菌である、請求項７に記載の形
   質転換体。 ９、請求項６に記載の形質転換体を培養する工程、およ
   び該形質転換体により生産されたオスチモン様タンパク
   を採取する工程、を包含するオスチモン様タンパクの調
   製方法。