ES2362903T3

ES2362903T3 - Procedimiento para producir plantas que presentan una eficacia de transpiración mejorada y plantas producidas a partir del mismo.

Info

Publication number: ES2362903T3
Application number: ES03735170T
Authority: ES
Inventors: Josette Masle; Graham Douglas Farquhar; Scott Robert Gilmore
Original assignee: Australian National University
Current assignee: Australian National University
Priority date: 2002-07-02
Filing date: 2003-07-02
Publication date: 2011-07-14
Anticipated expiration: 2023-07-02
Also published as: EP1539996A4; DE60336328D1; AU2003236580A1; US20120317676A1; EP1539996B1; AU2003236580B2; NZ537127A; ATE501272T1; CA2491064A1; EP1539996A1; US20100319083A1; US20060137041A1; AUPS333902A0; WO2004005555A1

Abstract

Procedimiento para seleccionar una planta que presenta una eficacia de transpiración mejorada, que comprende detectar un marcador genético para la eficacia de transpiración, comprendiendo dicho marcador un locus ERECTA en el genoma de la planta y seleccionar una planta que comprende o expresa el marcador genético, en el que el marcador genético comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia global de por lo menos 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del cultivo de plantas y a la producción de plantas modificadas mediante ingeniería genética. Más específicamente, la invención descrita en la presente memoria proporciona unos genes que pueden mejorar la eficacia de transpiración de una planta cuando se expresan en la misma. Estos genes son particularmente útiles para la producción de plantas que presentan una eficacia de transpiración mejorada, mediante enfoques tanto de cultivo de plantas tradicional como de ingeniería genética. La invención se extiende además a las plantas producidas mediante los procedimientos descritos en la presente memoria.

Antecedentes de la invención

1. General

La presente memoria contiene información sobre secuencias de aminoácidos y nucleótidos preparada utilizando PatentIn versión 3.1, presentada en la presente memoria tras las reivindicaciones. Cada secuencia de nucleótidos se identifica en la lista de secuencias mediante el indicador numérico <210> seguido por el identificador de secuencia (por ejemplo <210>1, <210>2, etc.). La longitud y el tipo de secuencia (ADN, proteína (PRT), etc.), y el organismo fuente para cada secuencia de nucleótidos, se indican mediante la información proporcionada en los campos de indicadores numéricos <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos a las que se hace referencia en la memoria descriptiva se definen mediante la expresión “SEC ID nº:”, seguido del identificador de secuencia (por ejemplo SEC ID nº: 1 se refiere a la secuencia en el listado de secuencias designada como <400>1).

La designación de los residuos de nucleótido a los que se hace referencia en la presente memoria es la recomendada por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB, en el que A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina, T representa timina, Y representa un residuo de pirimidina, R representa un residuo de purina, M representa adenina o citosina, K representa guanina o timina, S representa guanina o citosina, W representa adenina o timina, H representa un nucleótido distinto de guanina, B representa un nucleótido distinto de adenina, V representa un nucleótido distinto de timina, D representa un nucleótido distinto de citosina y N representa cualquier residuo de nucleótido. Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión “derivado de” se considerará que indica que un número entero especificado se obtiene de una fuente particular aunque no necesariamente de manera directa de esta fuente.

En la presente memoria, a menos que el contexto requiera contrario, la palabra “comprender”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, debe apreciarse que implican la inclusión de una etapa o elemento o número entero o grupo de etapas o elementos o números enteros señalado pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

Los expertos en la materia apreciarán que pueden introducirse en la invención descrita variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe apreciarse que la invención comprende todas estas variaciones y modificaciones. La invención comprende asimismo todas las etapas, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o indicados en la presente memoria, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o dos o más cualesquiera de dichas etapas o características.

La presente invención no estará limitada en su alcance por las formas de realización específicas descritas en la presente memoria, proporcionadas únicamente a título de ejemplo. Los productos, composiciones y procedimientos funcionalmente están comprendidos en el alcance de la invención, tal como se describe en la presente memoria.

2. Descripción de la técnica relacionada

Es conocido que prácticamente todas las plantas requieren una cierta cantidad de agua para un crecimiento y desarrollo adecuados, porque la fijación y asimilación fotosintética de CO2 por parte de las plantas requiere agua. Una cantidad significativa del agua absorbida por las plantas a partir del suelo vuelve a la atmósfera por medio de la transpiración de las plantas.

La eficacia de transpiración es una medida de la cantidad de materia seca producida por una planta por unidad de agua transpirada, o, dicho de otro modo, la ganancia de carbono con respecto a la pérdida de agua a través de la transpiración.

Para las plantas que presentan una baja eficacia de transpiración, o cuando el suministro de agua es reducido, la pérdida de agua a través de la transpiración puede limitar los procesos metabólicos clave asociados con el crecimiento y desarrollo de las plantas. Por ejemplo, durante una sequía, o cuando las plantas que presentan una baja eficacia de transpiración se hacen crecer en ambientes áridos o semiáridos, la productividad de la planta determinada mediante la producción de materia seca o tasa fotosintética, se reduce considerablemente. Por lo tanto, la producción de plantas que presentan una eficacia de utilización de agua o eficacia de transpiración mejorada es sumamente deseable para su adaptación a condiciones áridas o semiáridas, o para mejorar su resistencia a la sequía.

La mejora de la eficacia de utilización de agua o eficacia de transpiración por parte de las plantas es también sumamente deseable teniendo en cuenta el cambio climático global y la creciente presión sobre los recursos de agua en el mundo. Es conocido que la utilización ineficaz del agua para agricultura afecta de manera adversa al suministro de agua navegable, agua potable y agua para uso industrial o recreativo. Por lo tanto, la producción de plantas que presentan una eficacia de transpiración mejorada es sumamente deseable para reducir la presión sobre estos recursos de agua. También es deseable para aumentar la productividad de las plantas en condiciones de riego abundante.

Mejorando la eficacia de transpiración, se mejoran las tasas de ganancia de carbono por unidad de agua transpirada, estimulando de ese modo el crecimiento de la planta en condiciones de riego abundante, o alternativamente, en condiciones de sequía suave o severa. Este se consigue mejorando la ganancia de carbono más que la tasa de transpiración, o reduciendo la cantidad de agua perdida a cualquiera tasa particular de fijación de carbono. Los expertos en la materia también consideran que para una tasa de crecimiento dada, las plantas que presentan una eficacia de transpiración mejorada secan los suelos más lentamente, y utilizan menos agua, que las plantas casi isogénicas menos eficaces.

Se han descrito varios pretratamientos químicos así como medioambientales para mejorar la capacidad de las plántulas para sobrevivir a la sequía, o bien reduciendo la transpiración o bien reduciendo la cantidad de agua que se pierde realmente a la atmósfera.

Los tratamientos medioambientales conocidos implican ampliamente la utilización de barreras físicas. Aunque es conocido que colocar una barrera física sobre los estomas de las plantas reduce la pérdida de agua por medio de transpiración, el procedimiento no siempre es deseable o practicable para cultivos hechos crecer en campo. Por ejemplo, las barreras físicas sobre los estomas de la planta pueden inhibir ciertos procesos de intercambio de gases de la planta. Es más deseable mejorar la eficacia de transpiración o eficacia de utilización de agua real de la planta a través de la manipulación de la función vegetal intrínseca.

Los agentes químicos son normalmente los denominados agentes “antitranspirantes” o “antidesecante”, que se aplican ambos a las hojas. Los antitranspirantes son normalmente antitranspirantes metabólicos o películas.

Estos productos forman una película sobre las hojas, o bien bloqueando de este modo los poros de los estomas o bien recubriendo las células epidérmicas de las hojas con una película impermeable al agua. Los antitranspirantes en película típicos incluyen ceras, emulsiones de cera en aceite, alcoholes superiores, siliconas, plásticos, látex y resinas. Por ejemplo, Elmore, patente US nº 4.645.682 dio a conocer un antitranspirante que consiste en una cera de pasta acuosa; Cushman et al., las patentes US nº 3.791.839 y nº 3.847.641 también dieron a conocer emulsiones de cera para controlar la transpiración en plantas; y Petrucco et al., patente US nº 3.826.671, dio a conocer una composición polimérica que se supone que es eficaz para controlar la transpiración en plantas.

Los antitranspirantes metabólicos generalmente cierran los estomas, reduciendo de ese modo la tasa de transpiración. Los antitranspirantes metabólicos típicos incluyen ácidos succínicos, acetato fenilmercúrico, hidroxisulfonatos, el herbicida atrazina, azida sódica y fenilhidrazonas, así como cianuro de carbono.

Los compuestos que presentan una actividad reguladora del crecimiento de la planta también han demostrado ser útiles para reducir la transpiración. Por ejemplo, Bliesner et al., patente US nº 4.671.816, dieron a conocer un compuesto de acetileno, que se supone que presenta utilidad para regular el crecimiento de la planta, mientras que Kuznetsov et al. (patente rusa nº SU 1.282.492; solicitud de patente rusa nº SU 1.253.559-Al) y Smirnov et al (patente rusa nº SU 1.098.934) dieron a conocer la utilización de derivados de 2-metil-5-hidroxibenzimidazol, y las sales de cloruro o bromuro de los mismos, como reguladores del crecimiento antitranspirantes. Vichnevetskaia (documento USSN 5.589.437 expedida el 31 de diciembre de 1996) también describe derivados de hidroxibenzimidazol para mejorar la resistencia a la sequía de plantas reduciendo la transpiración. Schulz et al., patente US nº 4.943.315, también dieron a conocer formulaciones que comprenden un compuesto de acetileno y uno de fenilbencilurea, para reducir la transpiración en plantas y/o para evitar deterioros a las plantas provocados por el calor y condiciones secas. El ácido abscísico también ha demostrado reducir o suprimir la transpiración en plantas (por ejemplo Helv. Chim. Acta, 71, 931, 1988; J. Org. Chem., 54, 681, 1989; y publicación de patente japonesa nº 184.966/1991).

Los antitranspirantes metabólicos son de producción costosa y a menudo presentan efectos fitotóxicos o inhiben el crecimiento de la planta (Kozlowski (1979), En: Tree Growth and Environmental Stresses (Univ. de Washington Press, Seattle y Londres)), y prácticamente no se utilizan.

Estudios recientes han examinado procedimientos alternativos para mejorar la eficacia de transpiración, particularmente enfoques de cultivo para seleccionar líneas que crecen de manera más eficaz en condiciones de sequía suave. La discriminación de isótopos de carbono se ha utilizado para identificar ecotipos de Arabidopsis con eficacias de transpiración contrastadas (Masle et al., En: Stable isotopes and plant carbon-water relations, Acad. Press, Physiol. Ser., págs. 371-386, 1993) y para ayudar al cultivo convencional de nuevas variedades de plantas en varias especies (Hall et al., Plant Breeding Reviews 4, 81-113, 1994) incluyendo el arroz (Farquhar et al., En: Breaking the Yield Barrier, ed KG Cassman, IRRI, 95, 101) y lo más recientemente el trigo (Rebetzke et al. Crop Science 42:739-745, 2002).

No se ha identificado ningún gen individual que pueda mejorar la eficacia de transpiración cuando se expresa en una planta. La eficacia de transpiración puede muy bien ser multigénica. Como consecuencia, los genes y las rutas de señalización que regulan los componentes fotosintéticos y/o de los estomas del mecanismo de eficacia de transpiración en plantas no se han identificado ni caracterizado.

Además, a pesar de que es conocido que el efecto de expresión por regulación por disminución del gen Rubisco,o la mutación en genes implicados en el ácido abscísico (por ejemplo aba, abi), modifican la eficacia de transpiración en cierta medida a través del cierro de los estomas, la consecuencia de tales modificaciones no es necesariamente específica, dando como resultados efectos pleiotrópicos.

El ecotipo de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta (L-er1) es uno de los ecotipos más populares y se utiliza ampliamente para estudios tanto moleculares como genéticos. Aloja la mutación er1, que confiere una inflorescencia compacta, frutos cerrados y pecíolos cortos. Hay varios alelos mutantes de erecta. La caracterización fenotípica de los alelos mutantes sugiere un papel para el gen ER de tipo natural en la regulación de la morfogénesis de la planta, particularmente las formas de los órganos que se originan del meristemo apical del brote. Torii et al., The Plant Cell 8, 735, 1996, mostraron que el gen ER codifica para una supuesta proteína cinasa receptora que comprende un dominio catalítico de proteína cinasa citoplasmático, una región transmembrana y un dominio extracelular que consiste en repeticiones ricas en leucina, que se cree que interaccionan con otras macromoléculas.

El nº de registro de la base de datos Genbank AY106598 da a conocer una secuencia de nucleótidos que es una secuencia parcial de un gen ERECTA de Zea mays. El documento US 2002/040489 da a conocer secuencias expresadas de Arabidopsis thaliana, que incluyen una secuencia de nucleótidos que es una secuencia parcial de un ARNm de ERECTA. Thumma et al., Journal of Experimental Botany 52(355):203-214 (2001) da a conocer un procedimiento de análisis de loci de carácter cuantitativo para identificar marcadores genéticos asociados con la eficacia de transpiración en Stylosanthes scabra. El documento WO 01/02541 da a conocer un procedimiento para aumentar o reducir la transcripción en una planta modulando el gen de la proteína cinasa activada por ABA (AAPK), que se expresa en células oclusivas de la planta. Torii et al., The Plant Cell 8:735-746 (1996) dan a conocer una secuencia ERECTA de Arabidopsis y mutantes de esta secuencia que presentan una altura de tallo alterada.

Sumario de la invención

En el trabajo que conduce a la presente invención, se pretendió esclarecer los determinantes genéticos específicos de la eficacia de transpiración de las plantas. En las plantas, el desarrollo de marcadores genéticos moleculares, tales como, por ejemplo, marcadores genéticos que se correlacionan con una región del genoma de una planta de cultivo, tal como, por ejemplo, una región del genoma del arroz, genoma del maíz, genoma de la cebada, genoma del sorgo o genoma del trigo, o una región del genoma del tomate o de cualquier Brassicaceae, ayuda en la producción de plantas que presentan una eficacia de transpiración mejorada (Edwards et al., Genetics 116, 113 125, 1987; Paterson et al., Nature 335, 721-726, 1988).

Se identificó un locus que está vinculado a la variación genética en la eficacia de transpiración en plantas. Para esclarecer un locus asociado con la eficacia de transpiración de plantas, los inventores establecieron condiciones experimentales y procedimientos de muestreo para determinar la contribución a la eficacia de transpiración total de los factores que influyen en este fenotipo, y, más particularmente, la contribución genética a la variación total en la eficacia de transpiración. Los factores que influyen en la eficacia de transpiración incluyen, por ejemplo, el genotipo de la planta, el entorno (por ejemplo temperatura, luz, humedad, capa límite alrededor de las hojas, condiciones de crecimiento de la raíz), el desarrollo (por ejemplo edad y/o fase y/o postura de las plantas que modifican el intercambio de gases y/o el metabolismo del carbono) y factores específicos de la semilla (Masle et al. 1993, citado anteriormente). Los exámenes desarrollados por los inventores también se utilizaron para investigar las poblaciones de tipo natural y mutantes para variaciones en la eficacia de transpiración y para identificar ecotipos que presentan eficacias de transpiración diferentes incluyendo las líneas parentales que se habían utilizado por Lister y Dean (1993). Entonces se determinaron las eficacias de transpiración de los elementos de la población de mapeo de línea endogámica recombinante (RIL) de Lister y Dean (1993), y se realizaron análisis de ligamiento frente a marcadores genéticos para determinar las regiones cromosómicas que están vinculadas a la variación genética en la eficacia de transpiración, identificando de ese modo un locus que condiciona la eficacia de transpiración. Pruebas de complementación, en el que las plantas se transformaron con un alelo de tipo natural en este locus confirmaron la funcionalidad del alelo en la determinación de un fenotipo de eficacia de transpiración.

Por lo tanto la presente invención proporciona procedimientos y utilizaciones tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas. En la presente memoria se describe un locus asociado con la eficacia de transpiración de

A. thaliana, tal como, por ejemplo el locus ERECTA en el cromosoma 2 de A. thaliana, o una sonda de hibridación que se correlaciona con la región entre aproximadamente 46 cM y aproximadamente 50,7 cM en el cromosoma 2 de

A. thaliana. Se identificaron alelos ERECTA adicionales o alelos erecta en A. thaliana, arroz, sorgo, trigo y maíz que están relacionados estructuralmente con este alelo ERECTA o erecta de A. thaliana primario. Basándose en el gran número de alelos ERECTA/erecta descritos en la presente memoria, pueden identificarse homólogos del locus ERECTA de A. thaliana de otras especies vegetales que las mostradas específicamente a título de ejemplo, utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria.

En la presente memoria se describe un marcador genético o locus asociado con la variación genética en la eficacia de transpiración de una planta, en el que dicho locus comprende una secuencia de nucleótidos ligada genéticamente a un locus ERECTA en el genoma de la planta. El locus o marcador genético es útil para determinar la eficacia de transpiración de una planta.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones “ligado genéticamente” y “se correlaciona con” deben considerarse que hacen referencia a una proximidad genética suficiente entre un ácido nucleico ligado que comprende un gen, alelo, marcador u otra secuencia de nucleótidos y ácido nucleico que comprende todo o parte de un locus ERECTA para permitir que dicho ácido nucleico ligado sea útil para determinar la presencia de un alelo particular de dicho locus ERECTA en el genoma de una planta. Los expertos en la materia apreciarán que para que un ácido nucleico ligado de este tipo se utilice de esta manera, debe estar suficientemente cerca de dicho locus para no estar en desequilibrio de ligamiento o para presentar una alta frecuencia de recombinación entre dicho ácido nucleico ligado y dicho locus. Preferentemente, el ácido nucleico ligado y el locus están separados menos de aproximadamente 25 cM, más preferentemente separados menos de aproximadamente 10cM, incluso más preferentemente separados menos de aproximadamente 5cM, todavía incluso más preferentemente separados menos de aproximadamente 3cM y todavía incluso más preferentemente separados menos de aproximadamente 1cM.

En la presente memoria se describe un ácido nucleico aislado asociado con la variación genética en la eficacia de transpiración de una planta, comprendiendo dicho ácido nucleico una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a): la secuencia de un gen genómico ERECTA o la 5’-UTR o 3’-UTR o región que codifica para proteínas o una región de intrón de la misma;

(b): la secuencia de una variante alélica de (a) o la 5’-UTR o 3’-UTR o región que codifica para proteínas o una región de intrón de dicha variante alélica;

(c): la secuencia de un fragmento de (a) o (b) que se hibrida específicamente con ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) de una planta en condiciones de hibridación de por lo menos baja rigurosidad; y

(d): una secuencia que es complementaria a (a) o (b) o (c).

En la presente memoria se describe un gen ERECTA aislado de trigo que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i): la secuencia expuesta en SEC ID nº: 19;

(ii): una secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 20; y

(iii) una secuencia que es complementaria a (i) o (ii).

En la presente memoria se describe un gen ERECTA aislado de maíz que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i): la secuencia expuesta en SEC ID nº: 44;

(ii): una secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 45; y

(iii) una secuencia que es complementaria a (i) o (ii).

En la presente memoria se describe un gen ERECTA aislado de arroz que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i): la secuencia expuesta en SEC ID nº: 3;

(ii): una secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 4; y

(iii) una secuencia que es complementaria a (i) o (ii).

En la presente memoria se describe un gen ERECTA aislado de A. thaliana que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i): la secuencia expuesta en SEC ID nº: 1;

(ii): una secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 2; y

(iv): una secuencia que es complementaria a (i) o (ii).

(i): la secuencia expuesta en SEC ID nº: 7;

(ii): una secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 8; y

(v): una secuencia que es complementaria a (i) o (ii).

(i): la secuencia expuesta en SEC ID nº: 9;

(ii): una secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 10; y

(vi): una secuencia que es complementaria a (i) o (ii).

En la presente memoria se describe un gen ERECTA aislado de sorgo que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i): la secuencia expuesta en SEC ID nº: 5;

(ii): una secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 6; y

(vii) una secuencia que es complementaria a (i) o (ii).

A pesar de que un gen genómico o gen estructural ERECTA o erecta o la región que codifica para proteínas del mismo es particularmente útil para fines de producción y/o mapeo, este aspecto no debe limitarse al gen genómico o gen estructural ERECTA o erecta o la región que codifica para proteínas del mismo. Tal como se muestra a título de ejemplo en la presente memoria, el locus ERECTA de A. thaliana primario puede determinarse utilizando cualquier ácido nucleico ligado que se correlaciona con una región en el cromosoma a una distancia genética de hasta aproximadamente 3 cM desde el alelo ERECTA o erecta. El experto en la materia podría fácilmente utilizar sondas similares para identificar el ligamiento a un alelo ERECTA o erecta en cualquier otra especie vegetal, basándose en la enseñanza proporcionada en la presente memoria de que el alelo ERECTA o erecta está vinculado al fenotipo de eficacia de transpiración de plantas.

Preferentemente, todo o parte del locus asociado con el fenotipo de eficacia de transpiración en una planta (es decir, ácido nucleico ligado genéticamente al gen genómico o estructural ERECTA o erecta) se proporciona como ácido nucleico recombinante o aislado, tal como, por ejemplo, en forma de un constructo génico (por ejemplo un cósmido o plásmido recombinante), para facilitar el examen del germoplasma.

El locus ERECTA o un gen que está ligado al locus ERECTA es particularmente útil en un programa de producción, para predecir la eficacia de transpiración de una planta, o alternativamente, como marcador de producción selectivo para seleccionar plantas que presentan una eficacia de transpiración mejorada. Una vez mapeado, la selección asistida por marcadores (MAS) se utiliza para introducir el locus ERECTA o marcadores ligados al mismo en una amplia variedad de poblaciones. La MAS presenta la ventaja de reducir el tamaño de la población de producción requerido, y la necesidad de pruebas recurrentes continuas de la progenie, y el tiempo requerido para desarrollar una línea superior.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para seleccionar una planta que presenta una eficacia de transpiración mejorada, que comprende detectar un marcador genético para la eficacia de transpiración, marcador que comprende un locus ERECTA en el genoma de la planta y seleccionar una planta que comprende o expresa el marcador genético, en el que el marcador genético comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos aproximadamente una identidad de secuencia global del 55% con por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas, incluyendo una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a): una secuencia que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19 SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32 SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38; SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43, SEC ID nº: 44;

(b): una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 20 y SEC ID nº: 45; y

(c): una secuencia complementaria a (a) o (b).

En una forma de realización, el procedimiento comprende:

presentar una eficacia de transpiración mejorada, que comprende:

(a): examinar líneas endogámicas recombinantes o casi isogénicas o mutantes de plantas para segregar alelos en un locus ERECTA;y

(b): identificar un marcador polimórfico ligado a dicho locus ERECTA.

Los datos mostrados a título de ejemplo en la presente memoria para A. thaliana o arroz pueden extrapolarse claramente a las demás especies vegetales. Por ejemplo, la evidencia proporcionada en la presente memoria para el papel del alelo ERECTA de A. thaliana en la determinación del fenotipo de eficacia de transpiración en esas especies vegetales ha permitido esclarecer un rango amplio de alelos homólogos ERECTA en otras especies vegetales, en particular trigo, arroz, sorgo y maíz, que son también probables para determinar el fenotipo de eficacia de transpiración en esas plantas. También se describe en la presente memoria un procedimiento para seleccionar una planta que presenta una eficacia de transpiración mejorada, que comprende seleccionar una planta que comprende o expresa un homólogo funcionalmente equivalente de una región que codifica para proteínas del gen ERECTA de A. thaliana, maíz, trigo, sorgo o arroz.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para seleccionar una planta que presenta una eficacia de transpiración mejorada, que comprende:

(a): identificar un locus en el cromosoma 2 de Arabidopsis (46-50,7 cM) o el cromosoma 6 de arroz asociado con una variación genética en la eficacia de transpiración en una planta;

(b): identificar un ácido nucleico en una especie vegetal diferente que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con la secuencia del locus en (a); y

(c): seleccionar una planta que comprende o expresa el ácido nucleico identificado en (b).

(b): determinar la secuencia de nucleótidos del locus identificado;

(c): identificar un ácido nucleico de una especie vegetal distinta de A. thaliana o arroz que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con la secuencia del locus en (a); y

(d): seleccionar una planta que comprende o expresa el ácido nucleico identificado en (b).

Preferentemente, la planta seleccionada según cualquiera o más de las formas de realización anteriores es Arabidopsis thaliana, arroz, sorgo, trigo o maíz, sin embargo no se excluyen otras especies.

Preferentemente, el procedimiento de selección objeto comprende vincular el fenotipo de eficacia de transpiración de la planta a la expresión del marcador en la planta, o alternativamente, vincular un polimorfismo estructural en el ADN a un fenotipo de eficacia de transpiración en la planta, por ejemplo, mediante un proceso que comprende detectar un polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismo en la conformación de cadenas sencillas (SSCP) o análisis de microsatélites. Tal como conocerá el experto en la materia, una sonda de ácido nucleico o cebador de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas puede hibridarse con el ADN genómico de la planta, y la hibridación detectada utilizando medios de detección, identificando de ese modo el polimorfismo.

Resulta claramente preferido que la planta seleccionada presente una eficacia de transpiración mejorada en comparación con una planta casi isogénica que no comprende ni expresa el marcador genético.

Tal como se muestra a título de ejemplo en la presente memoria, se identificaron asimismo genes o alelos específicos que están ligados al locus ERECTA de A. thaliana y arroz, y determinaron las eficacias de transpiración de esas plantas. Más particularmente, se determinan las eficacias de transpiración de líneas casi isogénicas, que portan, cada una, una mutación dentro de un locus ERECTA, y una correlación entre el fenotipo de eficacia de transpiración y la expresión de ERECTA o el número de copias génicas, proporcionando de ese modo la contribución genética de genes o alelos en el locus ERECTA a la eficacia de transpiración. Este análisis permite una evaluación de la contribución genética de alelos particulares a la eficacia de transpiración, determinando de ese modo las variantes alélicas que están vinculadas a una eficacia de transpiración particular. Por tanto, el esclarecimiento del locus ERECTA para la eficacia de transpiración en plantas facilita el mapeo fino y la determinación de variantes alélicas que modulan la eficacia de transpiración. Los procedimientos descritos en la presente memoria pueden aplicarse a una evaluación de la contribución de alelos específicos al fenotipo de eficacia de transpiración para cualquier especie vegetal que sea susceptible de mutagénesis tal como, por ejemplo, mediante mutagénesis por transposones, irradiación o medios químicos. Tal como conocerá el experto en la materia muchas especies de cultivo, tales como, maíz, trigo y arroz, son susceptibles de tal mutagénesis.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para identificar un gen que determine la eficacia de transpiración de una planta que comprende:

(a): identificar un locus asociado con una variación genética en la eficacia de transpiración en una planta;

(b): identificar un gen o alelo que está ligado a dicho locus, en el que dicho gen o alelo es un gen o alelo candidato para determinar la eficacia de transpiración de una planta; y

(c): determinar las eficacias de transpiración de un grupo de plantas, en el que no todos los elementos de dicho grupo comprende o expresa dicho gen o alelo, y en el que la variación en la eficacia de transpiración entre los elementos de dicho grupo indica que dicho gen está implicado en la determinación de la eficacia de transpiración.

El procedimiento puede comprender:

(b): identificar múltiples alelos de un gen que está ligado a dicho locus, en el que dicho gen es un gen candidato implicado en la determinación de la eficacia de transpiración de una planta; y

(c): determinar las eficacias de transpiración de un grupo de plantas, en el que cada elemento de dicho grupo comprende, y preferentemente expresa, por lo menos uno de dichos múltiples alelos, en el que la variación en la eficacia de transpiración entre los elementos de dicho grupo indica que dicho gen está implicado en la determinación de la eficacia de transpiración.

Preferentemente, el gen identificado o alelo identificado mediante el procedimiento descrito en el párrafo anterior es un alelo ERECTA, o un alelo erecta, de una planta seleccionada de entre el grupo constituido por A. thaliana, sorgo, arroz, maíz y trigo, o un homólogo de los mismos.

El gen o alelo identificado, incluyendo cualquier homólogo de una planta distinta de A. thaliana, tal como, por ejemplo, el alelo ERECTA de tipo natural o un homólogo de los mismos, es útil para la producción de nuevas plantas. Tales plantas se producen, por ejemplo, utilizando técnicas recombinantes, o enfoques de cultivo de plantas tradicionales tales como introgresión.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para modular (es decir, mejorar o reducir) la eficacia de transpiración de una planta que comprende expresar ectópicamente en una planta un gen ERECTA aislado o una variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas de dicho gen ERECTA o dicha variante alélica. También se describe en la presente memoria un procedimiento para mejorar la eficacia de transpiración de una planta que comprende introgresar en dicha planta un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es homóloga a una región que codifica para proteínas de un gen de A. thaliana que se correlaciona con el locus ERECTA en el cromosoma 2.

Una forma de realización adicional de la invención proporciona un procedimiento para modular la eficacia de transpiración de una planta que comprende introducir y preferentemente expresar en la misma, un gen ERECTA aislado o una variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas del mismo en una planta y seleccionar una planta que presenta una eficacia de transpiración diferente en comparación con una planta casi isogénica que no comprende el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas introducido, en el que el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos una identidad de secuencia global del 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas, en el que el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas se introduce en la planta mediante un proceso que comprende transformar material vegetal con un constructo génico que comprende el gen o variante alélica o región que codifica para proteínas del mismo. Preferentemente el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a): una secuencia que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19 SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32 SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, (SEC ID nº: 38; SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43 y SEC ID nº: 44; y

(b): una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 20 y SEC ID nº: 45.

La planta en la que se introduce el gen, etc. se selecciona preferentemente de entre el grupo constituido por Arabidopsis thaliana, arroz, sorgo, trigo y maíz. Tal como resultará evidente a partir de la presente descripción, la eficacia de transpiración se mejora como consecuencia de la expresión ectópica de un alelo ERECTA o la región que codifica para proteínas del mismo en la planta. Por el contrario, la eficacia de transpiración se reduce como consecuencia de la expresión reducida de un alelo ERECTA en la planta (por ejemplo, mediante la expresión de ARN antisentido o ARNi u otro ARN inhibidor).

Un aspecto adicional de la invención proporciona la utilización de un gen ERECTA aislado o una variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas de dicho gen ERECTA o dicha variante alélica en la preparación de un constructo génico para modular (es decir, mejorar o reducir) la eficacia de transpiración de una planta, en la que el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos una identidad de secuencia global del 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas. Por ejemplo, la expresión de proteína ERECTA en la planta puede modificarse mediante la expresión epitópica de un alelo ERECTA en la planta, o alternativamente, reduciendo la expresión de ERECTA endógena utilizando un ARN inhibidor (por ejemplo, antisentido o ARNi).

También se describe en la presente memoria una planta que presenta una eficacia de transpiración mejorada, produciéndose dicha planta mediante un procedimiento descrito en la presente memoria.

Las plantas que presentan una eficacia de transpiración mejorada muestran niveles aumentados de crecimiento en condiciones de crecimiento normales, aumentando de ese modo su biomasa. Por lo tanto, también se describe en la presente memoria un procedimiento para aumentar la biomasa de una planta que comprende mejorar el nivel de expresión de un gen ERECTA o variante alélica del mismo o región que codifica para proteínas del mismo en dicha planta.

El procedimiento puede incluir adicionalmente la etapa de seleccionar una planta que presenta una biomasa aumentada en comparación con una planta sin modificar. Procedimientos para determinar la biomasa de una planta son muy conocidos para los expertos en la materia y/o se describen en la presente memoria.

El nivel de expresión puede mejorarse mediante la modificación genética de una secuencia control, por ejemplo una secuencia promotora, asociada con el gen ERECTA o variante alélica del mismo.

El nivel de expresión puede mejorarse introduciendo (por ejemplo, mediante cultivo clásico, introgresión o medios recombinantes) un gen ERECTA o variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas del mismo en una planta. Preferentemente, el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

una secuencia que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19 SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32 SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38; SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43 y SEC ID nº: 44; y

una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 20 y SEC ID nº: 45.

La planta en la que se introduce el gen, etc. se selecciona preferentemente de entre el grupo constituido por Arabidopsis thaliana, arroz, sorgo, trigo y maíz.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia de una planta a un estrés medioambiental que comprende mejorar el nivel de expresión de un gen ERECTA o variante alélica del mismo o región que codifica para proteínas del mismo en dicha planta, en el que el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos una identidad de secuencia global del 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas.

Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión “estrés ambiental” debe considerarse en su contexto más amplio como que significa una o más condiciones medioambientales que reducen la capacidad de una planta para crecer, sobrevivir y/o producir semilla/grano. En una forma de realización, un estrés ambiental que afecta a la capacidad de una planta para crecer, sobrevivir y/o producir semilla/grano es una condición seleccionada de entre el grupo constituido por niveles de CO2 aumentados o reducidos, una temperatura aumentada o reducida, precipitaciones aumentadas o reducidas, una humedad aumentada o reducida, niveles de sal aumentados en el suelo, compactación y consistencia del suelo aumentadas y sequía.

En una forma de realización, el procedimiento incluye además la etapa de seleccionar una planta que presenta una resistencia alterada a un estrés medioambiental en comparación con cuando se selecciona una planta sin modificar. Procedimientos para determinar la resistencia de una planta a un estrés ambiental son muy conocidos para los expertos en la materia y/o se describen en la presente memoria.

En una forma de realización, el nivel de expresión se mejora mediante la modificación genética de una secuencia control, por ejemplo una secuencia promotora, asociada con el gen ERECTA o variante alélica del mismo.

En otra forma de realización, el nivel de expresión se mejora introduciendo un gen ERECTA o variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas del mismo en una planta. Preferentemente, el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

También se describe en la presente memoria una planta que presenta una resistencia aumentada a un estrés ambiental, en el que dicha planta se produce mediante un procedimiento descrito en la presente memoria.

Tanto la temperatura como la humedad disponible han demostrado influir drásticamente en la polinización y el desarrollo de grano/semilla, procesos conocidos como cuajado de las semillas y llenado de granos. Por lo tanto, un procedimiento que produces una planta que es resistente a un estrés ambiental, es decir, una planta que presenta una eficacia de transpiración aumentada, da como resultado un llenado de granos más eficaz o aumentado y un mayor número de semillas. Dado que ERECTA se expresa durante la floración o el desarrollo de las vainas este gen

o una variante alélica del mismo es útil para aumentar el llenado de granos en una planta.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un procedimiento para aumentar el peso de semilla o de grano en una planta que comprende mejorar el nivel de expresión de un gen ERECTA o variante alélica del mismo o región que codifica para proteínas del mismo en dicha planta, en el que el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos una identidad de secuencia global del 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas.

En una forma de realización, el procedimiento incluye además la etapa de seleccionar una planta que presenta un peso de semilla o de grano aumentado en comparación con cuando se selecciona una planta sin modificar. Procedimientos para determinar el peso de semilla o de grano son muy conocidos para los expertos en la materia y/o se describen en la presente memoria.

En una forma de realización, el nivel de expresión se mejora mediante la modificación genética de una secuencia control, por ejemplo una secuencia promotora, asociada con el gen ERECTA o variante alélica del mismo

En otra realización, el nivel de expresión se mejora introduciendo un gen ERECTA o variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas del mismo en una planta. Preferentemente, el gen ERECTA o variante alélica o región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

También se describe en la presente memoria una planta que presenta un peso de semilla o de grano aumentado, en el que dicha planta se produce mediante un procedimiento descrito en la presente memoria.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para modular el número de semillas producidas mediante una planta que comprende mejorar el nivel de expresión de un gen ERECTA o variante alélica del mismo en dicha planta.

El procedimiento puede incluir adicionalmente la etapa de seleccionar una planta que presenta un número aumentado de semillas en comparación con cuando se selecciona una planta sin modificar. Procedimientos para determinar el número de semillas o de granos son muy conocidos para los expertos en la materia y/o se describen en la presente memoria.

El nivel de expresión puede mejorarse mediante la modificación genética de una secuencia control, por ejemplo una secuencia promotora, asociada con el gen ERECTA o variante alélica del mismo

También se describe en la presente memoria una planta que presenta un número aumentado de semillas, en el que dicha planta se produce mediante un procedimiento descrito en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1a es una representación gráfica que muestra las tasas de asimilación de CO2 (�mol de C m2 s-1) de varios genotipos de A. thaliana. Las mediciones se completaron en hojas en roseta durante las fases de floración prematura y floración. Las plantas se hicieron crecer en suelo fertilizado. Los genotipos de plantas se indican en el eje de las x, y las tasas de asimilación de CO2 se indican en las ordenadas. Col indica un contexto genético del ecotipo Columbia. Ld indica un contexto genético del ecotipo Landsberg. Las plantas que expresan alelos ERECTA de tipo natural estaban o bien en un contexto Col (Col4-ER) o bien en un contexto Ld (Ld-ER). Las plantas que eran homocigóticas para un alelo er mutante estaban en o bien un contexto Ld (Ld-er1) o bien un contexto Col (Col-er105

o Col-er2 (línea 3401 en NASC, también denominada Col-er106 por Torii y colaboradores (véase Lease et al. 2001, New Phytologist, 151:133-143)). Las plantas designadas como F1 (Col-ER x Ld-er) eran ER/er1 heterocigóticas. Los datos indican que, en un contexto Col, la mutación er105 conduce a una tasa de asimilación de CO2 reducida, mientras que la mutación er1 mejora la tasa de asimilación de CO2 en un contexto Ld.

La figura 1b es una representación gráfica que muestra la conductancia estomática (mol de H2O m2 s-1) de varios genotipos de A. thaliana (las mismas plantas que en la figura 1a). Los genotipos de plantas se indican en el eje de las x y son los mismos que los descritos en la leyenda de la figura 1a. Las conductancias estomáticas se indican en las ordenadas. Los datos indican que, en un contexto Col, la mutación er2/er106 mejora significativamente la conductancia estomática, mientras que la mutación er1 mejora significativamente la conductancia estomática en un contexto Ld.

La figura 1c es una representación gráfica que muestra la eficacia de transpiración de (mmol de C mol de H2O m2 s-1) de varios genotipos de A. thaliana, tal como se determina mediante la razón de la tasa de asimilación de CO2 con respecto a la conductancia estomática. Los genotipos de plantas se indican en el eje de las x y son los mismos que los descritos en la leyenda de la figura 1a. La eficacia de transpiración se indica en las ordenadas. Los datos indican que la eficacia de transpiración se mejora en plantas que expresan un alelo ER de tipo natural en relación con un alelo er mutante, en ambos contextos Ld y Col. La menor eficacia de transpiración se observó para plantas que son homocigóticas para el alelo er105 (es decir Col-er105), lo que concuerda con el hecho de que este alelo inhibe la expresión de ERECTA. A partir de los datos en las figuras 1a-1c, resulta evidente que la menor eficacia de transpiración de plantas que expresan el alelo er105 se debe en gran parte a una tasa de fijación de CO2 reducida, mientras que para ambos alelos er2/er106 y er1, la eficacia de transpiración reducida se debe en gran parte a una conductancia estomática mejorada. La eficacia de transpiración de la planta heterocigótica F1 era intermedia entre las eficacias de transpiración de sus progenitores, lo que sugiera una codominancia de estos alelos. Sin embargo, la F1, presenta una eficacia de transpiración más próxima a la del progenitor donador de polen, Ld-er1.

La figura 2a es una representación gráfica que muestra las densidades estomáticas (número de estomas mm-2 de hoja) para varios genotipos de A. thaliana en tres experimentos independientes. Los contextos genéticos de las plantas se indican en el eje de las x (Col, Columbia; Ld, Landsberg), y las densidades estomáticas se indican en las ordenadas. Los genotipos de las plantas se indican en la parte superior de cada barra, tal como sigue: las plantas que expresan alelos ERECTA de tipo natural en un contexto Col fueron Col4ER o Col1ER (barras rayadas); las plantas que expresan alelos ERECTA de tipo natural en un contexto Ld fueron ER (barras vacías); las plantas que expresan alelos erecta mutantes en un contexto Col eran o bien er105 o bien er2/106 (recuadros Col rellenos); y las plantas que expresan el alelo er1 mutante en un contexto Ld eran er1 (recuadros Ld rellenos). Las columnas denominadas a, b son datos de dos experimentos en los que plantas se hicieron crecer en suelo en ausencia de fertilizante. El conjunto de columnas a la derecha de la figura son de un tercer experimento en el que las mismas plantas se hicieron crecer en suelo que comprende fertilizante. Los datos indican que, en un contexto Col, la mutación er105 y la mutación er2/106 mejoran la densidad estomática, que en parte es responsable de las conductancias estomáticas mejoradas y las eficacias de transpiración reducidas de plantas que expresan estos alelos (figuras 1b y 1c). El efecto general de estos alelos no depende del estado nutritivo del suelo. Por el contrario, el alelo er1 sólo mejoró la densidad estomática de las plantas Ld cuando no había fertilizante, lo que sugiere que en este ecotipo la apertura estomática mejorada era responsable de las conductancias estomáticas mejoradas y las eficacias de transpiración reducidas medidas en el mutante er1 con un suministro de nutrientes suficiente (figuras 1b, 1c). Por tanto, la mutación er1 afecta tanto a la apertura estomática como a la densidad estomática pero las contribuciones relativas de estos efectos a la conductancia estomática mejorada por unidad de área de hoja dependen de factores medioambientales y el estado nutritivo de las plantas, y del contexto genético.

La figura 2b es una representación gráfica que muestra el tamaño de célula epidérmica (área superficial, �m2) para varios genotipos de A. thaliana en tres experimentos independientes. Los contextos genéticos y genotipos de las plantas se indican en el eje de las x y en la parte superior de cada columna, respectivamente, como en la leyenda de la figura 2a. Las ordenadas indican el tamaño de célula epidérmica. Las columnas denominadas a,b son datos de dos experimentos en los que las plantas se hicieron crecer en suelo en ausencia de fertilizante. El conjunto de columnas a la derecha de la figura son de un tercer experimento en el que las mismas plantas se hicieron crecer en suelo que comprende fertilizante. Los datos indican que, en un contexto Col, la mutación er105 y la mutación er2/er106 reducen significativamente el tamaño de célula epidérmica, es decir aumentan el número de células epidérmicas por unidad de área de hoja. Esto revela que el gen ER presenta efectos sobre la histogénesis de las hojas que, más allá de sus consecuencias sobre las densidades estomáticas, también pueden afectar directamente a la capacidad de las hojas para realizar fotosíntesis y por tanto la eficacia de transpiración (figuras 1b y 1c). Los efectos generales de estos alelos no dependen del estado nutritivo del suelo. Por el contrario, en un contexto Ld, el alelo er1 redujo el tamaño de célula epidérmica sólo cuando no había fertilizante.

La figura 2c es una representación gráfica que muestra el índica estomático para varios genotipos de A. thaliana en tres experimentos independientes. Los contextos genéticos y genotipos de las plantas se indican en el eje de las x y en la parte superior de cada columna, respectivamente, como en la leyenda de la figura 2a. Las ordenadas indican el índice estomático, tal como se determina a partir de la razón de la densidad estomática con respecto a la densidad de células epidérmicas. Las columnas denominadas a,b son datos de dos experimentos en los que las plantas se hicieron crecer en suelo en ausencia de fertilizante. El conjunto de columnas a la derecha de la figura son de un tercer experimento en el que las mismas plantas se hicieron crecer en suelo que comprende fertilizante. Los datos indican que las mutaciones er sometidas a prueba no modifican significativamente el índice estomático en el contexto Col (porque los aumentos en la densidad estomática están correlacionados con aumentos en los números de células epidérmicas en las plantas mutantes Col) pero sí en el contexto Landsberg. Por lo tanto, el gen ER parece modificar directamente el desarrollo estomático per se. Por tanto, tomadas conjuntamente las figuras 2ac muestran que el gen ERECTA presenta dos tipos de efectos sobre la conductancia estomática de las hojas: a) de desarrollo, b) biofísicos y/o bioquímicos. La expresión de estos efectos y el impacto sobre la tasa de transpiración varían con el contexto genético, lo que sugiere interacciones con otros genes que son polimórficos entre los ecotipos Col y Ld, y también con el estado nutritivo.

La figura 3 es una representación gráfica que muestra la composición de isótopos de carbono (eje de las y; en por mil, para rosetas vegetativas) para 7 series experimentales diferentes (números 1-7) llevadas a cabo en condiciones de cámara de crecimiento y condiciones de invernadero. Para cada serie, la barra izquierda muestra el valor medio de la composición de isótopos de carbono para las líneas que portan el alelo ERECTA, mientras que la barra derecha muestra el valor medio entre las líneas con el alelo erecta. En todos los casos, los valores de composición isotópica de δ13C para las líneas er son más negativos que para las líneas ER, lo que indica menores eficacias de transpiración.

La figura 4a es una representación gráfica que muestra el número de copias de gen ERECTA y los niveles de expresión en plantas de A. thaliana T2 transgénicas para un transgén ER. Estas líneas se generaron transformando el mutante Col-er2/106 con el gen ER de tipo natural bajo el promotor 35S. Se averiguó la transformación eficaz y se cuantificaron los niveles de expresión de ERECTA en varios transformantes independientes utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (ABI PRISM 7700, Sequence Detection System User Bulletin #2. 1997). El número de copias (eje de las y) se indica como una función de la línea vegetal, tras la normalización de ERECTA en relación con el número de copias de un gen control (gen de ARN ribosómico 18S). Se mostró independientemente que la expresión del gen de ARNr 18S no se veía afectada por los cambios en la expresión de ER. La línea 143 es un control nulo (sin inserto). Las líneas 145, 165, 169 y 279 son líneas transformadas que portan el alelo ERECTA. Todas las líneas transgénicas ER, excepto la línea 145, muestran un número de copias de ARNm aumentado: desde 4 hasta 9,5 veces aumentado en comparación con el control nulo.

La figura 4b es una representación gráfica que muestra el número de copias de gen ERECTA y los niveles de expresión en plantas de A. thaliana T2 transgénicas homocigóticas para un transgén ER, y generadas mediante la transformación del mutante Col-er105. Se averiguó la transformación eficaz y se cuantificaron los niveles de expresión de ERECTA en varios transformantes independientes utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (ABI PRISM 7700, Sequence Detection System User Bulletin #2. 1997). El número de copias (eje de las y) se indica como una función de la línea vegetal, tras la normalización de ERECTA en relación con el número de copias de un gen control (gen de ARN ribosómico 18S). Se mostró independientemente que la expresión del gen de ARNr 18S no se veía afectada por los cambios en la expresión de ER. La línea 18 es una línea de control nulo (sin inserto de ER, es decir similar a Col-er105). Las líneas 8, 19, 29 y 61 son líneas transgénicas que portan el alelo ERECTA. Todas las líneas transgénicas ER muestran un número de copias de ARNm aumentado: desde 10 hasta 170 veces aumentado en comparación con el control nulo.

La figura 4c es una representación gráfica que muestra el número de copias de gen ERECTA y los niveles de expresión en los ecotipos de ER Col y Ld y en una línea transgénica Ld-ER (3-7 K) generada mediante la transformación del ecotipo Ld-er1 (NW20) con el gen de tipo natural ER bajo el control del promotor 35S. Se averiguó la transformación eficaz y se cuantificaron los niveles de expresión de ERECTA en varios transformantes independientes utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (ABI PRISM 7700, Sequence Detection System User Bulletin #2. 1997). El número de copias (eje de las y) se indica como una función de la línea vegetal, tras la normalización de ERECTA en relación con el número de copias de un gen control (gen de ARN ribosómico 18S). Se mostró independientemente que la expresión del gen de ARNr 18S no se veía afectada por los cambios en la expresión de ER. Las líneas 933, 1093 y 3176 son los ecotipos Col-4, Col-0 y Col-1d de ERECTA Columbia no transformados.

La línea 105c es una línea Col-er105 (deficiente para ER), utilizada para generar las líneas transgénicas mostradas en la figura 4b. Las líneas marcadas con 2c y 3401 en el eje de las x describen Col-er2/106 (2 lotes de semillas, utilizadas para generar las líneas transgénicas mostradas en la figura 4a). La línea NW20 es Ld-er1. La línea 3-7K es un transformante Ld-ER, obtenido de la transformación de Lder1 con el alelo ERECTA. La línea 3177 es el ecotipo Ld-ER, casi isogénico con NW20.

La figura 5a es una representación gráfica de un primer experimento que muestra el número de copias del producto de transcripción de ARNm del gen ERECTA de arroz en diversos órganos/partes de la planta, cv Nipponbare. L= limbos de hojas maduras; YL= hojas jóvenes en expansión, todavía encerradas en vainas de hojas más viejas; R= raíz madura; YR= raíz joven; SH= vainas; INF= panícula joven no desplegada todavía encerrada en vainas; 07: panículas jóvenes. Se determinaron los números de copias de ARNm ERECTA de arroz mediante PCR cuantitativa en tiempo real, con ARNm 18S como gen de control interno para la normalización de los resultados. Los valores en el eje de las y describen las veces que aumenta el ARNm ERECTA de arroz en diversas partes en comparación con la muestra L (hojas maduras) fijada a un valor de 1 para la normalización. Los datos muestran un patrón de expresión similar que el gen ERECTA en Arabidopsis (véase Torii et al. 1996) es decir la expresión preferencial en tejidos meristemáticos jóvenes, especialmente en órganos reproductores.

La figura 5b es una representación gráfica de un segundo experimento que muestra el número de copias del producto de transcripción de ARNm del gen ERECTA de arroz en diversos órganos/partes de la planta. L= limbos de hojas maduras; YL= hojas jóvenes en expansión, todavía encerradas en vainas de hojas más viejas; R= raíz madura; YR= raíz joven; SH= vainas; INF= panícula joven no desplegada todavía encerrada en vainas; 07: panículas jóvenes. Se determinaron los números de copias de ARNm ERECTA de arroz mediante PCR cuantitativa en tiempo real, con ARNm 18S como gen de control interno para la normalización de los resultados. Los valores en el eje de las y describen las veces que aumenta el ARNm ERECTA de arroz en diversas partes en comparación con la muestra L (hojas maduras) fijada a un valor de 1 para la normalización. Los datos confirman los mostrados en la figura 5a.

La figura 6 es una representación gráfica que muestra la eficacia de transpiración de las hojas (mmol de C mol de H2O-1, figura 6a), calculada a partir de las mediciones directas de la tasa de asimilación de CO2 de las hojas (�mol de C m-2 s-1, figura 6b) y la conductancia estomática (mol de H2O m-2 s-1, figura 6c) mediante técnicas de intercambio de gases, con 350 ppm de CO2 (es decir igual que el [CO2] ambiente durante el crecimiento de la plántula; barra izquierda en cada par de barras) y 500 ppm de CO2 (barra derecha en cada par de barras), para Lder1, y dos líneas Ld_ER: línea T2(+ER), una línea transgénica T2 homocigótica para un transgén ER en el contexto Ld-er1 y la línea 3177, un ecotipo ER casi isogénico con Ld-er1 (información del NASC Stock Centre). Los genotipos se muestran en la parte inferior de la figura. La temperatura de la hoja durante las mediciones se controló a 22ºC, el déficit de presión de vapor de la hoja con respecto al aire a aproximadamente 8 mb.

La figura 7 es una representación gráfica que muestra la eficacia de transpiración de las hojas (mmol de C mol de H2O-1, figura 7a), calculada a partir de las mediciones directas de la tasa de asimilación de CO2 de las hojas (�mol

-2 -1 -2 -1

de C m s , figura 7b) y la conductancia estomática (mol de H2O-1 m s , figura 7c) mediante técnicas de

intercambio de gases, con 350 ppm de CO2 (es decir igual que el [CO2] ambiente durante el crecimiento de la plántula; barra izquierda en cada par de barras) y 500 ppm de CO2 (barra derecha en cada par de barras), para 4 genotipos: Col4 (ER) (par izquierdo), Ld (er1) (par derecho) y su progenie F1 (dos pares centrales). Los genotipos se muestran en la parte inferior de la figura.

La figura 8 es una representación gráfica que muestra la conductancia estomática y la anatomía epidérmica a 350 ppm de CO2 en los genotipos descritos en las figuras 6 y 7 y mostrados en la parte inferior de la figura. La inserción del transgén ER (línea T2+ER) provocó una disminución en la conductancia estomática en comparación con la línea Ld-er1 (figura 8a), que en parte se debía a una disminución en la densidad estomática (véase la figura 8c). Estos dos efectos indican de nuevo complementación. Juntas, la figura 8b y 8c muestran que la disminución en la densidad estomática es relativamente más importante que la de en la densidad de células epidérmicas, lo que indica un efecto del transgén sobre el desarrollo de la epidermis.

La figura 9 es una representación gráfica que muestra una comparación de la densidad estomática y el área de células epidérmicas en una gama de líneas Col_er que portan mutaciones en el gen ER (barras 1 a 8 figura 9a; barras 1 a 7 en la figura 9b, mutantes er105, er106, 108, 111, 114, 116, 117, tal como se describen en Lease et al.

2001; un obsequio de Dr Keiko Torii) y en ecotipos de tipo natural Col-ER (barras 9-11 ó 8-10 en las figuras 9a y 9b, respectivamente: Col0, ecotipo de contexto para estos mutantes; Col1 Col4 (línea parental ColER para el análisis QTL de las RIL de Lister y Dean), dos líneas Ld_er1 (NW20 y CS20, barras 12&13 y 11&12 en las figuras 9a y 9b respectivamente, dos líneas muy similares según NASC; NW20 es la otra línea parental para las RIL de Lister y Dean) y finalmente la línea T2+ER, una línea Ld-ER transgénica que porta el gen de tipo natural ER en el contexto Ld-er1 (barra derecha de extremo en la figura).

La figura 10 es una representación gráfica que muestra la composición isotópica de carbono (por mil, eje de las y) en una gama de líneas (numeradas de 1 a 19 en el eje de las x): mutantes Col-er (línea 1-14);

el ecotipo de contexto Col0 (línea 15); líneas Ld-er1 (líneas 16 y 17); un ecotipo Ld-ER casi isogénico con Ld-er1 (línea 18, línea 3177 en NASC), y una línea Ld-ER T2 transgénica (línea numerada con 19) obtenida mediante la transformación del mutante Ld-er1 con un constructo que porta el alelo ER de tipo natural. Los datos muestran que el alelo ER proporciona menos valores negativos lo que indica una eficacia de transpiración aumentada.

La figura 11 es una representación gráfica que muestra mediciones directas de la eficacia de transpiración en mutantes Col-er transformados con el transgén ER, tanto con alta y baja humedad del aire, tal como sucede durante eventos de alta temperatura que provocan o asociados con sequía. La eficacia de transpiración se midió mediante técnicas de intercambio de gases en hojas maduras de rosetas de Arabidopsis vegetativas, como una función de la diferencia de presión de vapor (vpd) de las hojas con respecto al aire, es decir la humedad del aire alrededor de las hojas. Cuanto mayor sea la vpd, más seco será el aire. Los círculos opacos describen mediciones para 5 líneas T2 transgénicas independientes homocigóticas para un transgén ER; estas líneas se generaron transformando el mutante Col-er105 (cuadrados vacíos) con un constructo que porta el alelo ER bajo el control del promotor 35S. Los datos para las líneas nulas (es decir líneas que pasaron por transgénesis pero que no portan el transgén ER) se representan mediante cuadrados opacos. Esta figura demuestra complementación, por toda la gama de humedad sometida a prueba, siendo las eficacias de transpiración en las líneas ER T2 mayores que aquellas en el mutante Col-er105 complementado, y similares a las medidas en el ecotipo Col0-ER (triángulos vacíos; ecotipo de contexto para Col-er105).

La figura 12 es una representación gráfica de una alineación de secuencias aisladas con toda la región codificante del ortólogo de trigo de ERECTA. La posición de cada una de las secuencias aisladas se muestra en relación con el ortólogo de trigo de ERECTA. Las secuencias se representan mediante o bien un SEC ID nº: o bien un número de registro de genes.

La figura 13 es una representación gráfica de una alineación de secuencias aisladas con toda la región codificante del ortólogo de maíz de ERECTA. La posición de cada una de las secuencias aisladas se muestra en relación con el ortólogo de maíz de ERECTA. Las secuencias se representan mediante o bien un SEC ID nº: O bien un número de registro de genes.

La figura 14 es una representación gráfica de una alineación de secuencias por pares de las proteínas ERECTA aisladas a partir de Arabidopsis (SEC ID nº: 2), maíz (SEC ID nº: 45), arroz (SEC ID nº: 3), sorgo (SEC ID nº: 5) y trigo (SEC ID nº: 20). La alineación se realizó utilizando la herramienta de alineación de múltiples secuencias CLUSTALW. Los residuos que se conservan entre todas las especies se indican mediante asteriscos (*). La conservación de los grupos STA NEQK NHQK NDEQ QHRK MILV MILF HY o FYW se indica mediante “:”. La conservación de los grupos CSA ATV SAG STNK STPA SGND SNDEQK NDEQHK NEQHRK FVLIM HFY se indica mediante “.”. Los huecos se indican mediante guiones “-”.

La figura 15 es una representación gráfica de un árbol filogenético que indica la relación entre cada una de las proteínas ERECTA aisladas a partir de Arabidopsis (SEC ID nº: 2), maíz (SEC ID nº: 45), arroz (SEC ID nº: 3), sorgo (SEC ID nº: 5) y trigo (SEC ID nº: 20).

Descripción detallada de la invención

Loci para la eficacia de transpiración y su identificación

En la presente memoria se describe un locus asociado con la variación genética en la eficacia de transpiración de una planta, en el que dicho locus comprende una secuencia de nucleótidos ligada genéticamente a un locus ERECTA en el genoma de la planta.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “locus” se considerará que significa la ubicación de uno o más genes en el genoma de una planta que afecta a una característica cuantitativa de la planta, en particular la eficacia de transpiración de una planta. En el presente contexto, una “característica cuantitativa” es un fenotipo de la planta para el que la variación fenotípica entre diferentes genotipos es continua y no puede separarse en clases diferenciadas, independientemente del número de genes que determinan o controlan el fenotipo, o la magnitud de los efectos genéticos que presenta un único gen en la determinación del fenotipo, o la magnitud de los efectos genéticos de genes que interaccionan.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

“Asociado con la variación genética en la eficacia de transpiración de una planta” significa que un locus comprende uno o más genes que se expresan para determinar o regular la eficacia de transpiración de una planta, independientemente de la tasa real de transpiración lograda por la planta en una condición ambiental especificada.

Preferentemente, el locus está ligado a o comprende un alelo ERECTA o alelo erecta, o una parte que codifica para proteínas del mismo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “ERECTA” se considerará que hace referencia a un alelo de tipo natural que comprende los siguientes dominios, dominios GTIGYIDPEYARTS, GAAQGLAYLHHDC, y TENLSEKXIIGYGASSTVYKC, en los que X significa Y o H, o dominios con más de un 94% de identidad con estos dominios. Según el conocimiento de los inventores ninguna otra proteína comprende estos dominios. Los alelos ERECTA preferidos comprenden una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos aproximadamente una identidad de secuencia global del 55% con la región que codifica para proteínas de uno cualquiera de los alelos ERECTA mostrados a título de ejemplo descritos en la presente memoria, particularmente una cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15. Preferentemente, el porcentaje de identidad con una cualquiera de dichas SEC ID nº: es por lo menos aproximadamente del 59-61%, o del 70% o del 80%, y más preferentemente por lo menos aproximadamente del 90%, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente del 95% o del 99%.

Los alelos ERECTA preferidos se derivan de, o están presentes en, el genoma de una planta que es intolerante a la desecación o sequía, o poco adaptada al crecimiento en ambientes secos o áridos, o que presenta un vigor o crecimiento reducido durante periodos de precipitaciones reducidas o sequía, o del genoma de una planta con un aumento de la tasa de crecimiento o la duración del crecimiento o el reparto de C al brote y partes recogidas en condiciones de riego abundante.

Más preferentemente, un alelo ERECTA se deriva de, o está presente en, el genoma de una planta del género Brassica, una planta de cultivo extensivo, una gramínea perenne (por ejemplo de la subfamilia Pooidaea, o la tribu Poeae) o un árbol. Incluso más preferentemente, un alelo ERECTA está presente en o se deriva del genoma de una planta seleccionada de entre el grupo constituido por cebada, trigo, centeno, sorgo, arroz, maíz, Phalaris aquatica, Dactylus glomerata, Lolium perenne, Festuca arundinacea, algodón, tomate, semilla de soja, colza, álamo y pino.

El término “erecta” se considerará que significa cualquier variante alélica del alelo ERECTA de tipo natural que modifica la eficacia de transpiración de una planta

Los alelos erecta preferidos incluyen los siguientes alelos erecta de A. thaliana derivados de las líneas erecta (er) Columbia (Col) y Landsberg.

Alelos erecta1: Posición genómica Lesión Dominio afectado

Ler er-1: 2249 T→A PK

Col er-101: 6565 T→A PK

Col er-102/106: 6565 T→A PK

Col er-103: 846 G→A LRR10

Col er-105: inserto de ADN foráneo entre +5 y +1056 inserción alelo nulo

Col er-108: 5649 G→A

Col er-111: 5749 G→A región no traducida entre dominios LRR y

transmembrana

Col er-113: 3274 C→T

Col er-114: 6807 G→A PK

Col er-115: 3796 C→T

Col er-116: 6974 G→A PK

Col er-117: 5203 G→A LRR18

1 alelos descritos por Lease et al. 2001, New Phytologist, 151: 133-143, excepto para Ler er-1, Col ear-103 y Coler105 que se describieron en Torii et al., 1996, The Plant Cell 8:73 5-746

En la presente memoria se describe un alelo ERECTA derivado de, o presente en, el genoma de una planta que es intolerante a la desecación o sequía, o está poco adaptada para el crecimiento en ambientes secos o áridos, o que padece crecimiento o vigor reducido durante periodos de precipitaciones reducidas o sequía, o del genoma de una planta con un aumento de la tasa de crecimiento o duración del crecimiento o el reparto de C al brote y partes recogidas en condiciones de riego abundante.

Para los fines de nomenclatura, la secuencia de nucleótidos de la región que codifica para proteínas ERECTA de Arabidopsis thaliana y la región no traducida en 5’ (UTR) y 3’-UTR, se proporciona en la presente memoria como SEC ID nº: 1. La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado mediante SEC ID nº: 1 se expone en la presente memoria como SEC ID nº: 2.

Un alelo ERECTA particularmente preferido de arroz (Oryza sativa) se deriva del cromosoma 6 de esta especie vegetal. Para los fines de nomenclatura, la región que codifica para proteínas del gen ERECTA de arroz se proporciona en la presente memoria como SEC ID nº: 3. La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado mediante SEC ID nº: 3 se expone en la presente memoria como SEC ID nº: 4.

Un gen ERECTA particularmente preferido derivado del genoma de Sorghum bicolor, se proporciona en la presente memoria como SEC ID nº: 5. La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado mediante SEC ID nº: 5 se expone en la presente memoria como SEC ID nº: 6.

Un gen ERECTA a título de ejemplo adicional derivado de A. thaliana se proporciona en la presente memoria como SEC ID nº: 7. La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado mediante SEC ID nº: 7 se expone en la presente memoria como SEC ID nº: 8.

Un gen ERECTA a título de ejemplo adicional derivado de A. thaliana se proporciona en la presente memoria como SEC ID nº: 9. La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado mediante SEC ID nº: 9 se expone en la presente memoria como SEC ID nº: 10.

Fragmentos de un gen ERECTA a título de ejemplo derivado del genoma de trigo se proporcionan en la presente memoria como las SEC ID nº: 11 a 18.

Un gen ERECTA a título de ejemplo derivado del genoma de trigo se proporciona en la presente memoria como SEC ID nº: 19. La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado mediante SEC ID nº: 19 se expone en la presente memoria como SEC ID nº: 20.

Fragmentos de un gen ERECTA a título de ejemplo derivado del genoma de maíz se proporcionan en la presente memoria como las SEC ID nº: 21 a 43.

Un gen ERECTA a título de ejemplo derivado del genoma de maíz se proporciona en la presente memoria como SEC ID nº: 44. La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado mediante SEC ID nº: 44 se expone en la presente memoria como SEC ID nº: 44.

Múltiples genes pueden estar ligados genéticamente o correlacionarse con el locus ERECTA especificado en el cromosoma 2. Sin restringirse a ninguna teoría o modo de acción, tales múltiples genes ligados pueden interaccionar, tal como, por ejemplo, mediante interacción epistática, para determinar el fenotipo de eficacia de transpiración.

Diferentes alelos de cualquier gen pueden ligarse al locus ERECTA, en el que dicho alelo se expresa para determinar el fenotipo de eficacia de transpiración. Tales alelos pueden identificarse detectando un fenotipo de eficacia de transpiración particular que está vinculado a la expresión del alelo particular. Alternativamente, o además, los diferentes alelos ligados a un locus se identifican detectando un polimorfismo estructural en el ADN (por ejemplo un polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismo en la conformación de cadenas sencillas (SSCP) y similares), que está vinculado a un fenotipo de eficacia de transpiración particular.

Los genes y/o alelos que interaccionan pueden estar ligados genéticamente a un locus ERECTA y se expresan para determinar un fenotipo de eficacia de transpiración. Tales genes y/o alelos que interaccionan ligados se correlacionarán con un locus ERECTA y estarán asociados con la eficacia de transpiración de esa planta. Preferentemente, tales genes y/o alelos que interaccionan comprenden una parte que codifica para proteínas de un gen situado dentro del locus ERECTA del genoma que está asociado con la eficacia de transpiración de esa planta.

En la presente memoria se describen homólogos y/o ortólogos de los alelos mostrados a título de ejemplo. Los expertos en la materia apreciarán que los términos “homólogo” y “ortólogo” se refieren a unidades equivalentes funcionales. En el presente contexto, un homólogo u ortólogo de un gen que se correlaciona con un locus ERECTA se considerará que significa cualquier gen de una especie vegetal que es funcionalmente equivalente a un gen que se correlaciona con un locus ERECTA mostrado a título de ejemplo, y comprende una región que codifica para proteínas en su genoma de planta nativa que comparte un grado de similitud o identidad estructural con una región que codifica para proteínas del gen ERECTA mostrado a título de ejemplo.

Preferentemente, un gen homólogo u ortólogo de una planta distinta de A. thaliana estará asociado con la eficacia de transpiración de dicha planta y estará ligado a una región que codifica para proteínas en su genoma de planta nativa que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos aproximadamente una identidad de secuencia global del 55% con una región que codifica para proteínas ligada con el locus ERECTA. Incluso más preferentemente, el porcentaje de identidad será de por lo menos aproximadamente el 59-61% o el 70% o el 80%, todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente el 90%, e incluso todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente el 95%.

Al determinar si dos secuencias de nucleótidos se encuentran o no dentro de una limitación de porcentaje de identidad particular mencionada en la presente memoria, los expertos en la materia apreciarán que es necesario realizar una comparación lado a lado o una alineación múltiple de secuencias.

En tales comparaciones o alineaciones, pueden surgir diferencias en la ubicación de los residuos no idénticos, dependiendo del algoritmo utilizado para realizar la alineación. En el presente contexto, se considerará que la referencia a un porcentaje de identidad entre dos o más secuencias de nucleótidos se refiere al número de residuos idénticos entre dichas secuencias tal como se determina utilizando cualquier algoritmo convencional conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden alinearse las secuencias de nucleótidos y calcularse su identidad utilizando el programa BESTFIT u otro programa apropiado de Computer Genetics Group, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de America (Devereaux et al, Nucl. Acids Res. 12, 387-395, 1984). En la determinación del porcentaje de identidad de secuencias de nucleótidos utilizando un programa conocido en la técnica o descrito en la presente memoria, es preferible que se utilicen parámetros por defecto.

Alternativamente, o además, un alelo ERECTA o erecta homólogo u ortólogo estará asociado con la eficacia de transpiración de una planta y ligado a una región que codifica para proteínas en su genoma de planta nativa que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que presenta por lo menos aproximadamente una identidad de secuencia global del 55% con un polipéptido codificado por una región que codifica para proteínas ligada al locus ERECTA. Preferentemente, el porcentaje de identidad a nivel de aminoácidos será de por lo menos aproximadamente el 59-61% o el 70% o el 80%, más preferentemente por lo menos aproximadamente el 90%, y todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente el 95%.

Al determinar si dos secuencias de aminoácidos se encuentran o no dentro de estos límites de porcentajes, los expertos en la materia apreciarán que es necesario realizar una comparación lado a lado o una alineación múltiples de secuencias. En tales comparaciones o alineaciones, surgirán diferencias en la ubicación de los residuos no idénticos, dependiendo del algoritmo utilizado para realizar la alineación. En el presente contexto, se considerará que la referencia a un porcentaje de identidad o similitud entre dos o más secuencias de aminoácidos se refiere al número de residuos idénticos y similares respectivamente, entre dichas secuencias tal como se determina utilizando cualquier algoritmo convencional conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden calcularse las identidades o similitudes de secuencias de aminoácidos utilizando el programa GAP y/o alinearse utilizando el programa PILEUP de Computer Genetics Group, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de America (Devereaux et al, 1984, citado anteriormente). El programa GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970, para maximizar el número de residuos idénticos/similares y para minimizar el número y la longitud de los huecos de secuencias en la alineación. Alternativamente o además, cuando se comparan más de dos secuencias de aminoácidos, se utiliza el programa ClustalW de Thompson et al., Nucl. Acids Res. 22, 4673-4680, 1994. En la determinación del porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos utilizando un programa conocido en la técnica o descrito en la presente memoria, es preferible que se utilicen parámetros por defecto.

Alternativamente, o además, un alelo ERECTA o erecta homólogo u ortólogo estará asociado con la eficacia de transpiración de una planta y ligado a una región que codifica para proteínas en su genoma de planta nativa que se hibrida con un ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria a una región que codifica para proteínas ligada a un locus ERECTA, tal como, por ejemplo, de A. thaliana, arroz, sorgo, maíz, trigo o arroz. Preferentemente, tales homólogos u ortólogos se identificarán mediante hibridación en condiciones de por lo menos baja rigurosidad, y más preferentemente en condiciones de hibridación de por lo menos rigurosidad moderada o alta rigurosidad.

Para definir el nivel de rigurosidad, una baja rigurosidad se define en la presente memoria como una hibridación o un lavado llevado a cabo en un tampón 6xSSC, SDS al 0,1% (p/v) a 28ºC o alternativamente, tal como se muestra a título de ejemplo en la presente memoria. Generalmente, la rigurosidad se aumenta reduciendo la concentración de sal en el tampón de hibridación o lavado, tal como, por ejemplo, reduciendo la concentración de SSC. Alternativamente, o además, la rigurosidad se aumenta, aumentando la concentración de detergente (por ejemplo SDS). Alternativamente, o además, la rigurosidad se aumenta, aumentando la temperatura de la hibridación o el lavado. Por ejemplo, una rigurosidad moderada puede realizarse utilizando tampón de 0,2xSSC a 2xSSC, SDS al 0,1% (p/v), a una temperatura de aproximadamente 42ºC a aproximadamente 65ºC. De manera similar, una alta rigurosidad puede realizarse utilizando tampón de 0,1xSSC a 0,2xSSC, SDS al 0,1% (p/v), a una temperatura de por lo menos 55ºC. Las condiciones para realizar reacciones de hibridación de ácido nucleico y el posterior lavado de membrana, se entienden bien por un experto habitual en la materia. Sólo para fines de aclaración adicional, se encuentra una referencia a los parámetros que afectan a la hibridación entre moléculas de ácido nucleico en Ausubel et al., En: Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York, EE.UU., 1992.

Se han descrito varios procedimientos de mapeo para determinar loci útiles y estimar sus efectos (por ejemplo Edwards et al., Genetics 116, 113-125, 1987; Haley y Knott, Heredity 69, 315-324, 1992; Jiang y Zeng, Genetics 140, 1111-1127, 1995; Lander y Botstein, Genetics 121, 185-199, 1989; Jansen y Stam, Genetics 136, 1447-1455, 1994; Utz y Melchinger, En: Biometrics in Plant Breeding: Applications of Molecular Markers. Proc. Ninth Meeting of the EUCARPIA Section Biometrics in Plant Breeding, 6-8 de julio de 1994, Wageningen, Países Bajos, (J.W. van Ooijen y J. Jansen, eds), págs. 195-204, 1994; Zeng, Genetics 136, 1457-1468, 1994). En el presente contexto, estos procedimientos se aplican para identificar el/los componente(s) principal(es) de la varianza genética total que contribuye(n) a la variación en la eficacia de transpiración de una planta, tal como se determina, por ejemplo, mediante la medición de la discriminación de isótopos de carbono (Δ). Más particularmente, la segregación de marcadores conocidos se utiliza para mapear y/o caracterizar un locus subyacente asociado con la eficacia de transpiración. El procedimiento de locus implica buscar asociaciones entre los marcadores moleculares segregantes y la eficacia de transpiración en una población segregante de plantas, para identificar el ligamiento del marcador con el locus.

Para descubrir un ligamiento marcador/locus, se requiere una población segregante. Pueden utilizarse poblaciones experimentales, tales como, por ejemplo, una generación F2, una población de retrocruzamiento (BC), líneas endogámicas recombinantes (RIL) o línea doble haploide (DHL), como población de mapeo. El análisis de segregantes en masa, para la rápida detección de marcadores en regiones genómicas específicas utilizando poblaciones segregantes, se describe por Michelmoore et al., Proc. Natl Acad. Sci. (EE.UU.) 88, 9828-9832, 1991. En el caso de las poblaciones de mapeo F2, las plantas F2 se utilizan para determinar el genotipo, y las familias F2 para determinar el fenotipo. Los expertos en la material conocerán líneas endogámicas recombinantes se producen mediante un descendiente de semilla única. Las líneas endogámicas recombinantes, tales como, por ejemplo, las RIL F9 de A. thaliana (por ejemplo Lister y Dean, Plant J., 4, 745-750, 1993). Se utilizan líneas casi isogénicas (NIL) para mapeo fino, y para determinar el efecto de un locus particular sobre la eficacia de transpiración. Una ventaja de las líneas endogámicas recombinantes y las líneas doble haploides es que son poblaciones permanentes, y como consecuencia, proporcionan la replicación de la contribución de un locus particular al fenotipo de eficacia de transpiración.

Tal como para procedimientos estadísticos, se utiliza un análisis de marcadores individuales (análisis puntual) para detectar un locus en las proximidades de un marcador genético individual. Las eficacias de transpiración medias de una población de plantas que se segrega para un marcador particular, se comparan según la clase de marcador. La diferencia entre dos eficacias de transpiración medias proporciona una estimación del efecto fenotípico de sustituir un alelo por otro alelo en el locus. Para determinar si el efecto fenotípico inferido es significativamente diferente de cero o no, se utiliza una prueba estadística sencilla, tal como la prueba de la t o la prueba de la F. Un valor significativo indica que un locus está ubicado en las proximidades del marcador. El análisis de un solo punto no requiere un mapa de ligamiento molecular completo. Cuanto más alejado esté el locus del marcador, menos probable será detectarlo estadísticamente, como consecuencia de la recombinación entre el marcador y el gen.

En el enfoque de Anova, prueba de la t o GLM, la asociación entre el genotipo del marcador y el fenotipo de eficacia de transpiración comprende:

(i): clasificar la progenie de una población segregante de plantas mediante el genotipo del marcador, tal como por ejemplo, utilizando RFLP, AFLP, SSCP o análisis de microsatélites, estableciendo de ese modo clases de plantas;

(ii): comparar las eficacias de transpiración medias de clases de plantas en la población segregante, utilizando una prueba de la t, GLM o ANOVA; y

(iii) determinar la significación de las diferencias en la media en (ii), una diferencia significativa indicando que el marcador está ligado al locus para la eficacia de transpiración.

Tal como apreciarán los expertos en la materia, la diferencia entre las medias de las clases proporciona una estimación del efecto del locus en la determinación de la eficacia de transpiración de una clase.

En el enfoque de regresión, la asociación entre el genotipo y el fenotipo del marcador está determinada por un proceso que comprende:

(i): asignar códigos numéricos a genotipos de marcador; y

(ii): determinar el valor de regresión r para la eficacia de transpiración frente a los códigos, un valor significativo para r indicando que el marcador está ligado al locus para la eficacia de transpiración, y proporcionando la pendiente de regresión una estimación del efecto de un locus particular sobre la eficacia de transpiración.

Para el mapeo por intervalos de QTL, puede utilizarse el algoritmo Mapmaker desarrollado por Lincoln et al., Constructing genetic linkage maps with MAPMAKER/EXP version 3.0: A tutorial and reference manual. Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, EE.UU., 1993. El principio detrás del mapeo por intervalos es para someter a prueba un modelo para determinar la presencia de un QTL en muchas posiciones entre dos loci de marcador mapeados. Este modelo es un ajuste de un presunto QTL con respecto a la eficacia de transpiración, en el que la idoneidad del ajuste se somete a prueba determinando la probabilidad máxima de que un QTL para la eficacia de transpiración se encuentre entre dos marcadores segregantes. Por ejemplo, en el caso de un QTL ubicado entre dos marcadores segregantes, los genotipos de marcador de 2 loci de una progenie segregante contendrán cada uno mezclas de los genotipos de QTL. Por lo tanto, es posible buscar los parámetros de loci que se aproximan de la mejor manera a la distribución en la eficacia de transpiración para cada clase de marcador. Los modelos se evaluaron calculando la probabilidad de las distribuciones observadas con y sin ajustar un efecto de QTL. La posición de mapeo de un QTL se determina como la probabilidad máxima a partir de la distribución de los valores de probabilidad (puntuaciones LOD: razón de la probabilidad de que el efecto se produzca mediante ligación:probabilidad de que el efecto se produzca por azar), calculada para cada locus.

El mapeo por intervalos mediante regresión (Haley y Knott., Heredity 69, 315-324, 1992) es una simplificación del procedimiento de probabilidad máxima citado anteriormente en el que se realiza una regresión o un análisis de QTL básico en genotipos de marcador codificado, excepto porque los fenotipos se someten a regresión basándose en la probabilidad de un genotipo de QTL tal como se determina a partir del ligamiento entre la eficacia de transpiración y los marcadores flanqueantes más próximos. En la mayoría de los casos, el mapeo por regresión proporciona estimaciones de la posición de QTL y el efecto que son casi idénticas con las proporcionadas mediante el procedimiento de probabilidad máxima. La aproximación sólo se desvía en lugares en los que hay huecos grandes,

o faltan muchos genotipos.

En el procedimiento de mapeo por intervalos compuestos (CIM) (Jansen y Stam, Genetics 136, 1447-1455, 1994; Utz y Melchinger, 1994, citado anteriormente; Zeng, Genetics 136, 1457-1468, 1994), el análisis se realiza de la manera habitual, excepto porque se tiene en cuenta la varianza de otros QTL incluyendo la regresión parcial que proporciona más potencia y precisión que un mapeo por intervalos simples, porque los efectos de otros QTl no están presentes como varianza residual. El CIM puede eliminar el sesgo que puede provocarse mediante los QTL que están ligados a la posición que está sometiéndose a prueba.

Se utiliza software disponible públicamente para mapear un locus para la eficacia de transpiración. Tal software incluye, por ejemplo, lo siguiente:

(i): MapMaker/QTL (ftp://genome.wi.mit.edu/pub/mapmaker3/), para analizar datos de retrocruzamiento o F2 utilizando mapeo por intervalos convencional;

(ii): MQTL, para mapeo por intervalos compuestos en múltiples entornos o para realizar mapeo por intervalos simples utilizando una progenie homocigótica (por ejemplo doble haploides o líneas endogámicas recombinantes);

(iii) PLABQTL (Utz y Melchinger, PLABlocus Version 1.0. A computer program to map QTL, Institut für Pflanzenzüchtung, Saatgutforschung und Populationsgenetik, Universität Hohenheim, 70593 Stuttgart, Alemania, 1995; http: //www.uni-hohenheim.de/∼ipspwww/soft.html) para mapeo por intervalos compuestos y mapeo por intervalos simples de un locus en poblaciones de mapeo derivadas de un cruzamiento biparental mediante autofecundación, o en doble haploides;

(iv): QTL Cartographer (http://statgen.mcsu.edu/qtlcart/cartographer.html) para regresión de marcadores individuales, mapeo por intervalos o mapeo por intervalos compuestos, utilizando poblaciones de retrocruzamiento o F2;

(v): MapQTL (http://www.cpro.dlo.nl/cbw/); Qgene para realizar o bien una regresión de marcadores individuales o bien una regresión por intervalos para mapear loci; y

(vi): SAS para detectar un locus identificando asociaciones entre el genotipo de marcador y la eficacia de transpiración mediante un enfoque de análisis de marcadores individuales tal como ANOVA, prueba de la t, GLM

o REG.

En una forma de realización particularmente preferida, QTL cartographer o MQTL se utiliza para identificar un locus asociado con la eficacia de transpiración de plantas.

Los expertos en la materia también apreciarán que es posible detectar múltiples alelos o genes que interaccionan para un rasgo particular, tal como, por ejemplo, utilizando enfoques de mapeo por intervalos compuestos. Para alcanzar este extremo, el mapeo por intervalos compuestos puede repetirse para buscar loci adicionales. Alternativamente, o además, dos o más regiones distintas del genoma pueden nombrarse como loci candidatos, y construirse una matriz de relación de gametos para cada locus candidato, y realizarse una regresión de 2 locus para cada par de loci, determinando el mejor ajuste para los efectos que interaccionan entre los dos loci o alelos en esos loci, incluyendo cualquier efecto aditivo o de dominancia. El algoritmo descrito por Carlborg et al., Genetics (2000) puede utilizarse para mapeo simultáneo. En el presente contexto, se realiza un análisis de este tipo con referencia a la segregación de los fenotipos de eficacia de transpiración en la población segregante.

Utilización del locus ERECTA para mejorar la eficacia de transpiración de plantas

Como resulta conocido por los expertos en la materia, un único locus, si está presente en el genoma de una planta, puede presentar una influencia significativa sobre el fenotipo de la planta. Por ejemplo, Grandillo et al., Theor. Appl. Genet. 99, 978-987, 1999, mostraron que para tomate una selección realizada a partir de un total de 28 loci que determinaban el peso y el tamaño de la fruta explicaba el 20% de la varianza fenotípica total en este rasgo.

Por lo tanto, en la presente memoria se describe un procedimiento para seleccionar una planta que presenta una eficacia de transpiración mejorada, que comprende:

(a): identificar un locus asociado con una variación genética en la eficacia de transpiración en una planta; y

(b): seleccionar una planta que comprende o expresa un gen que se correlaciona con el locus.

Mediante “eficacia de transpiración mejorada” quiere decirse que la planta pierde menos agua por unidad de materia seca producida, o alternativamente, produce una cantidad aumentada de materia seca por unidad de agua transpirada, o alternativamente, fija una cantidad aumentada de carbono por unidad de agua transpirada, en relación con una planta equivalente. Mediante “planta equivalente” quiere decirse una planta que presenta un contexto genético similar o casi idéntico, tal como, por ejemplo, una planta casi isogénica, una hermana o una parental.

Según este procedimiento, un locus se identifica mediante medios de mapeo de locus convencionales y/o mediante búsqueda de homología para genes que se correlacionan con el locus ERECTA en el cromosoma 2 del genoma de

A. thaliana, tal como, por ejemplo, buscando alelos ERECTA o alelos erecta a partir de una variedad de plantas, tales como, por ejemplo, arroz, trigo, sorgo y maíz, tal como se describe anteriormente en la presente memoria.

Preferentemente, para seleccionar una planta que comprende o expresa el gen apropiado, se utiliza la selección asistida por marcadores (MAS). Tal como sabrán los expertos en la materia, una vez identificado un locus particular, los marcadores genéticos o físicos que están ligados al locus pueden identificarse y utilizarse fácilmente para confirmar la presencia del locus en poblaciones en cultivo. Para un locus que está flanqueado por dos marcadores estrechamente ligados que se recombinan sólo a una baja frecuencia, la presencia de los marcadores flanqueantes es indicativa de la presencia del locus.

Para la selección asistida por marcadores, se prefiere que el marcador sea un marcador genético (por ejemplo un gen o alelo), o un marcador físico (por ejemplo vellosidad en las hojas o forma de la vaina), o un marcador molecular tal como, por ejemplo, un polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), una restricción (RAPD), polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) o una repetición de secuencia corta (SSR) tal como un microsatélite, o SNP. También se encuentra dentro del alcance de la invención utilizar cualquier sonda de hibridación o cebador de amplificación que comprenda por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud derivado de una región cromosómica que está ligada en el genoma de una planta a un locus ERECTA, como marcador para seleccionar plantas. Los expertos en la materia podrán determinar fácilmente tales sondas o cebadores basándose en la divulgación en la presente memoria, particularmente para aquellos genomas de plantas que pueden presentar una secuencia cromosómica suficiente en la región de interés en el genoma (por ejemplo A. thaliana, arroz, algodón, cebada, trigo, sorgo, maíz, tomate, etc.).

Para los marcadores flanqueantes que no están estrechamente ligados, de modo que hay una gran distancia de recombinación entre los mismos, la presencia del gen apropiado se evalúa identificando aquellas plantas que presentan ambos marcadores flanqueantes y seleccionando después de entre aquellas plantas que presentan una eficacia de transpiración mejorada. Naturalmente, cuanto mayor sea la distancia entre dos marcadores, mayor será la población de plantas requerida para identificar una planta que presenta ambos marcadores, el locus que interviene y un gen dentro de dicho locus. Los expertos en la materia podrán determinar fácilmente el tamaño de la población requerido para identificar una planta que presenta una eficacia de transpiración particular, basándose en las unidades de recombinación (cM) entre dos marcadores.

La eficacia de transpiración se determina mediante cualquier medio conocido por el experto en la materia. Preferentemente, la eficacia de transpiración se determina midiendo la acumulación de materia seca en la planta mediante medios gravimétricos, o midiendo la pérdida de agua, o la razón de la tasa de asimilación de CO2 con respecto a la conductancia estomática.

La eficacia de transpiración puede determinarse directamente, midiendo la razón de carbono fijado (tasa de asimilación de carbono) con respecto a la pérdida de agua (tasa de transpiración).

La eficacia de transpiración puede determinarse indirectamente a partir del valor de la discriminación de isótopos de carbono (Δ). Farquhar et al., Aust. J. Plant Physiol. 9, 121-137, 1982, mostraron que la discriminación de isótopos de carbono (Δ; una medida del grado en que la razón de 13C/12C de la materia orgánica es menor que la de CO2 en el aire fuente), es una medida indirecta eficaz de la eficacia de transpiración. La discriminación, (Δ), es aproximadamente la razón isotópica de carbono en el CO2 fuente menos la de carbono orgánico de la planta. En un experimento particular, el CO2 fuente es común para todos los genotipos. La determinación de la eficacia de transpiración de esta manera se basa en la constancia de la razón de 13C:12C atmosférico (aproximadamente 1,1:98,9) y el hallazgo de que las enzimas ribulosa bisfosfato carboxilasa (Rubisco) se discriminan frente a la utilización de 13C. Por tanto, en plantas C3 el 13CO2 se asimila de manera menos eficaz que el 12CO2, y el 13CO2 que queda tiende a difundir de vuelta a través de los estomas dentro y fuera de la hoja. Sin embargo, cuando los estomas pasan a estar casi cerrados, la retrodifusión relativa del 13CO2 es más difícil de conseguir y las concentraciones intracelulares de 13CO2 aumentan, aumentando de ese modo la proporción de este isótopo que se incorpora en 3-fosfoglicerato y posteriormente en materia seca. Como consecuencia, la discriminación de isótopos de carbono (Δ) es la mayor cuando la tasa de asimilación de CO2 global durante la fotosíntesis (A) es pequeña, y la conductancia estomática (gw) con respecto al vapor de agua es grande. Esta relación se representa mediante el siguiente algoritmo:

imagen1

en el que Ca es la concentración de CO2 ambiente (es decir [12CO2+13CO2]). La discriminación, Δ, es aproximadamente la composición isotópica del CO2 fuente menos la del carbono orgánico de la planta.

Para una planta C3 que presenta un valor en el intervalo de aproximadamente el 4,5 ‰ a aproximadamente el 6,7 ‰ para el término 36A/(gw x Ca), un cambio del 1 ‰ en la discriminación de isótopos de carbono (Δ) corresponde a un cambio en la eficacia de transpiración en el intervalo de aproximadamente el 22% a aproximadamente el 15%, respectivamente.

La relación negativa entre la discriminación de isótopos de carbono (Δ) y la eficacia de transpiración se ha establecido para muchas especies de plantas C3, incluyendo trigo (Farquhar y Richards, Aust. J. Plant Physiol. 11, 539-552, 1984; Farquhar et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 40,388-397, 1989), Stylosanthes (Thumma et al., Proc. 9th Aust. Agronomy Conf., Wagga Wagga New South Wales, Australia, 1998), algodón, cebada y arroz. Por lo tanto, un valor de la discriminación de isótopos de carbono (Δ) menor para una planta de prueba en relación con una planta equivalente es indicativo de una eficacia de transpiración mejorada.

En especies C4, como el maíz, los coeficientes en la ecuación anterior son diferentes (Farquhar 1983, Australian Journal of Plant Physiology, 10:205-226; Henderson et al.,1992, Aust. J. Plant Physiol. 19: 263-285):

imagen1

Una diferencia del 1‰ en Δ corresponde a una diferencia de aproximadamente el 38% en la eficacia de transpiración. La relación entre Δ y la eficacia de transpiración es positiva. El 13C se acumula preferentemente en bicarbonato, el sustrato para la carboxilación de PEP, y así la discriminación frente a 13C es la menor cuando A es pequeña y gw es grande. Sin embargo, a medida que aumenta la pérdida de CO2 a partir de la vaina fascicular, las plantas C4 se comportan más como las plantas C3.

Alternativamente, o además, la eficacia de transpiración se determina mediante otro indicador, tal como, por ejemplo, la temperatura de las hojas, el contenido en ceniza, el contenido en minerales, o el peso específico de la hoja (materia seca por unidad de área de hoja). Por ejemplo, el peso específico de la hoja se correlaciona positivamente con la eficacia de transpiración en cacahuetes y otras especies (Virgona et al., Aust. J. Plant Physiol., 17, 207-214, 1990; Wright et al., Crop Sci 34, 92-97, 1994). Por lo tanto, un mayor peso específico de la hoja o una mayor tasa de ganancia de carbono para una planta de prueba en relación con una planta equivalente es indicativo de una eficacia de transpiración mejorada de la planta de prueba.

La presencia del locus puede establecerse hibridando una sonda o cebador que está ligado a un locus ERECTA, tal como, por ejemplo, una sonda o cebador que se hibrida con la región del cromosoma 2 identificada de A. thaliana o la región del cromosoma 6 identificada de arroz.

Preferentemente, la presencia del locus se establece hibridando una sonda o cebador derivado de cualquiera o más de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o de un gen homólogo en otra planta, o una secuencia complementaria a una secuencia de este tipo, con el ADN genómico de la planta, y detectando la hibridación utilizando medios de detección. En una forma de realización, la detección de la hibridación se realiza preferentemente marcando una sonda con una molécula indicadora que puede producir una señal identificable, antes de la hibridación, y detectando después la señal tras la hibridación. Las moléculas indicadoras preferidas incluyen nucleótido trifosfatos marcados radiactivamente y moléculas biotiniladas. Preferentemente, los variantes de los genes mostrados a título de ejemplo en la presente memoria, incluyendo los equivalentes genómicos, se aíslan mediante hibridación con una rigurosidad moderada o más preferentemente, en condiciones de alta rigurosidad, con la sonda.

Alternativamente, o además, la hibridación puede detectarse utilizando cualquier formato de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo AFLP. Para la PCR, dos moléculas cebadoras de ácido nucleico no complementarias que comprenden por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, y más preferentemente por lo menos 30 nucleótidos de longitud se hibridan con diferentes hebras de una molécula molde de ácido nucleico, y copias de la molécula de ácido nucleico específica del molde se amplifican enzimáticamente. Varios formatos de PCR se describen en McPherson et al., En: PCR A Practical Approach, IRL Press, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 1991.

Para mejorar la eficacia de transpiración de una planta en el que el locus es polimórfico, tal como, por ejemplo, un alelo, el procedimiento citado anteriormente se modifica para incluir la detección del/de los alelo(s) específico(s) vinculados a la mejora deseada. En la presente memoria se da a conocer un procedimiento para seleccionar una planta que presenta una eficacia de transpiración mejorada, que comprende:

(d): identificar un locus asociado con una variación genética en la eficacia de transpiración en una planta;

(e): identificar un marcador polimórfico dentro de dicho locus que está vinculado a una eficacia de transpiración mejorada; y

(f): seleccionar una planta que comprende o expresa el marcador.

Se utilizan medios convencionales conocidos para el experto en la materia para identificar un marcador dentro del locus que está vinculado a una eficacia de transpiración mejorada. Generalmente se utiliza una población de plantas que se segrega para el marcador polimórfico, en la que el fenotipo de eficacia de transpiración de plantas se correlaciona o asocia entonces con la presencia de una forma alélica particular del marcador. Tal como se muestra a título de ejemplo en la presente memoria, se examinan líneas endogámicas recombinantes o casi isogénicas de plantas para segregar alelos en el locus ERECTA y para correlacionar una eficacia de transpiración mejorada con la presencia del alelo ERECTA en contraposición a un alelo erecta. Alternativamente, se introducen mutaciones en un alelo ERECTA tal como, por ejemplo, mediante mutagénesis por transposones, mutagénesis química o irradiación de material vegetal, y se establecen y examinan líneas mutantes de plantas para segregar alelos en el locus ERECTA que se correlacionan con la variación genética en la eficacia de transpiración.

Los marcadores adecuados incluyen uno cualquiera o más de los marcadores descritos en la presente memoria como que son adecuados para MAS.

Preferentemente, la selección de plantas según estas formas de realización incluye la etapa adicional de introducir el locus o marcador polimórfico en una planta, tal como, por ejemplo, mediante enfoques de cultivo convencional o mediante medios recombinantes. Esto puede llevarse a cabo al mismo tiempo, o antes, seleccionando el locus o marcador polimórfico.

Los medios recombinantes incluyen generalmente introducir un constructo génico que comprende el locus o marcador en una célula vegetal, seleccionar tejido transformado y regenerar una planta completa a partir del explante de tejido transformado. Los medios para introducir ADN recombinante en tejido o células vegetales incluyen, pero no se limitan a, la transformación utilizando CaCl2 y variaciones de la misma, en particular el procedimiento descrito por Hanahan (1983), captación directa de ADN en protoplastos (Krens et al, Nature 296, 7274, 1982; Paszkowski et al., EMBO J. 3, 2717-2722, 1984), captación mediada por PEG respecto a protoplastos (Armstrong et al., Plant Cell Rep. 9, 335-339, 1990), bombardeo con micropartículas, electroporación (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 82, 5824-5828, 1985), microinyección de ADN (Crossway et al., Mol. Gen. Genet. 202, 179-185, 1986), bombardeo con micropartículas de células o explantes tisulares (Christou et al, Plant Physiol. 87, 671-674, 1988; Sanford, Part. Sci. Technol. 5, 27-37, 1988), infiltración a vacío de tejido con ácido nucleico, o en el caso de plantas, la transferencia mediada por ADN-T desde Agrobacterium al tejido vegetal tal como se describe esencialmente por An et al., EMBO J. 4, 277-284, 1985; Herrera-Estrella et al., Herrera-Estella et al., Nature 303, 209-213, 1983; Herrera-Estella et al., EMBO J. 2, 987-995, 1983; o Herrera-Estella et al., En: Plant Genetic Engineering, Cambridge University Press, N.Y., págs. 63-93, 1985.

Para el bombardeo con micropartículas de células, una micropartícula se propulsa al interior de una célula para producir una célula transformada. Puede utilizarse cualquier aparato y metodología de transformación celular balística adecuada en la realización de la presente invención. Procedimientos y aparatos a título de ejemplo se dan a conocer por Stomp et al. (patente U.S. nº 5.122.466) y Sanford y Wolf (patente U.S. nº 4,945,050). Cuando se utilizan procedimientos de transformación balística, el constructo génico puede incorporar un plásmido que puede replicarse en la célula que va a transformarse.

Los ejemplos de micropartículas adecuadas para su utilización en tales sistemas incluyen esferas de oro de 1 a 5 micras. El constructo de ADN puede depositarse sobre la micropartícula mediante cualquier técnica adecuada, tal como mediante precipitación.

Una planta completa puede regenerarse a partir de la célula transformada o transfectada, según procedimientos muy conocidos en la materia. El tejido vegetal que puede experimentar propagación clónica posterior, ya sea mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con un constructo génico de la presente invención y una planta completa regenerarse a partir del mismo. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clónica disponibles para, y más adecuados para, la especie particular que esté transformándose. Las dianas de tejido a título de ejemplo incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas axilares y meristemos de raíz), y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledones y meristemo de hipocótilos).

El término “organogénesis”, tal como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un proceso mediante el que los brotes y las raíces se desarrollan secuencialmente a partir de centros meristemáticos.

El término “embriogénesis”, tal como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un proceso mediante el que los brotes y las raíces se desarrollan conjuntamente de un modo coordinado (no secuencialmente), ya sea a partir de células somáticas o gametos.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante una variedad de medios, tal como mediante propagación clónica o técnicas de cultivo clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1) puede autofecundarse para proporcionar un transformante de segunda generación (o T2) homocigótico, y las plantas T2 propagarse adicionalmente a través de técnicas de cultivo clásicas.

Los organismos transformados generados contemplados en la presente memoria pueden adoptar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un patrón transformado injertado en una púa no transformada).

Alternativamente, las plantas transformadas se producen mediante un procedimiento de transformación in planta utilizando Agrobacterium tumefaciens, tal como, por ejemplo, el procedimiento descrito por Bechtold et al., CR Acad. Sci. (Paris, Sciences de la vie/Life Sciences) 316, 1194-1199, 1993 o Clough et al., Plant J 16: 735-74, 1998, en el que se aplica A. tumefaciens al exterior de la yema floral en desarrollo y el ADN de vector binario se introduce entonces en la macrospora y/o microspora en desarrollo y/o la semilla en desarrollo, para producir una semilla transformada. Los expertos en la materia apreciarán que la selección de tejido para su utilización en un procedimiento de este tipo puede variar, sin embargo es preferible utilizar generalmente material vegetal en la fase de formación de zigotos para procedimientos de transformación in planta.

Identificación de genes para determinar la eficacia de transpiración de una planta

Tal como se muestra a título de ejemplo en la presente memoria, se identificaron asimismo genes o alelos específicos que están ligados al locus ERECTA de A. thaliana, y arroz y determinan las eficacias de transpiración de esas plantas. Más particularmente, las eficacias de transpiración de líneas casi isogénicas, que portan, cada una, una mutación dentro de un locus ERECTA, y se determinan una correlación entre el fenotipo de eficacia de transpiración y la expresión de ERECTA o el número de copias génicas, proporcionando de ese modo la contribución genética de genes o alelos en el locus ERECTA locus a la eficacia de transpiración. Este análisis permite una evaluación de la contribución genética de alelos particulares a la eficacia de transpiración, determinando de ese modo variantes alélicas que están vinculadas a una eficacia de transpiración particular. Por tanto, el esclarecimiento del locus ERECTA para la eficacia de transpiración en plantas facilita el mapeo fino y la determinación de las variantes alélicas que modulan la eficacia de transpiración. Los procedimientos descritos en la presente memoria pueden aplicarse a una evaluación de la contribución de alelos específicos al fenotipo de eficacia de transpiración para cualquier especie vegetal que sea susceptible de mutagénesis tal como, por ejemplo, mediante mutagénesis por transposones, irradiación o medios químicos conocidos por los expertos en la materia para plantas en mutación.

Por lo tanto, en la presente memoria se describe un procedimiento para identificar un gen que determine la eficacia de transpiración de una planta que comprende:

(c): determinar las eficacias de transpiración de un grupo de plantas, en el que no todos los elementos de dicho grupo comprenden o expresan dicho gen o alelo, y en el que la variación en la eficacia de transpiración entre los elementos de dicho grupo indica que dicho gen está implicado en la determinación de la eficacia de transpiración.

(b): identificar múltiples alelos de un gen que está ligado a dicho locus, en el que dicho gen es un gen candidato implicado para determinar la eficacia de transpiración de una planta; y

(c): determinar las eficacias de transpiración de un grupo de plantas, en el que cada elemento de dicho grupo comprende, y preferentemente expresa, por lo menos uno de dichos múltiples alelos, la variación en la eficacia de transpiración entre los elementos de dicho grupo indicando que dicho gen está implicado en la determinación de la eficacia de transpiración.

El procedimiento puede comprender: En el presente contexto, se considerará que la expresión “plantas casi isogénicas” significa una población de plantas que presentan identidad con respecto a una proporción sustancial de sus genomas, a pesar de la presencia de diferencias suficientemente escasas para permitir la contribución de un alelo o gen distinto a la eficacia de transpiración de una planta que va a determinarse mediante una comparación de los fenotipos de eficacia de transpiración de la población. Tal como conocerá el experto en la materia, las líneas endogámicas recombinantes, las líneas producidas mediante introgresión de un gen o transposón seguido de varias generaciones de retrocruzamiento, o hermanas, son líneas casi isogénicas adecuadas para el presente fin.

Preferentemente, el gen identificado o alelo identificado mediante el procedimiento descrito en el párrafo anterior se selecciona de entre el grupo constituido por alelo ERECTA, alelo erecta y homólogos de ERECTA, en el que dichos homólogos son de especies vegetales diferentes de A. thaliana.

El gen o alelo identificado puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(d): una secuencia que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19 SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32 SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38; SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43 y SEC ID nº: 44;

(e): una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 20 y SEC ID nº: 45; y

(f): una secuencia complementaria a (a) o (b).

Preferentemente, el porcentaje de identidad es de por lo menos aproximadamente el 59-61% o el 70% o el 80%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 90%, e incluso más preferentemente por lo menos aproximadamente el 95% o el 99%. El gen o alelo identificado puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a): una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19 SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32 SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38; SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43 y SEC ID nº: 44;

(b): una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 20 y SEC ID nº: 45; y

(c): una secuencia complementaria a (a) o (b).

Mejora de la eficacia de transpiración utilizando genes aislados

El gen o alelos identificados, incluyendo cualquier homólogo de una planta distinta de A. thaliana, tal como, por ejemplo, el alelo ERECTA de tipo natural, o un homólogo de los mismos, son útiles para la producción de nuevas plantas. Tales plantas se producen, por ejemplo, utilizando técnicas recombinantes.

Por lo tanto, se describe en la presente memoria un procedimiento para mejorar la eficacia de transpiración de una planta que comprende expresar ectópicamente en una planta un gen ERECTA aislado o una variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas del mismo.

Preferentemente, el gen ERECTA o variante alélica comprende una secuencia de nucleótidos que es homóloga a una región que codifica para proteínas de un gen que está ligado al locus ERECTA de A. thaliana en el cromosoma

2.

El gen aislado puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a): una secuencia que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 55% con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19 SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32 SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38; SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43 y SEC ID nº: 44;

(c): una secuencia complementaria a (a) o (b).

Preferentemente, el porcentaje de identidad es de por lo menos aproximadamente el 59-61% o el 70% o el 80%, más preferentemente por lo menos aproximadamente el 90%, e incluso más preferentemente por lo menos aproximadamente el 95% o el 99%.

El gen o alelo aislado puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(c): una secuencia complementaria a (a) o (b).

Para expresar ectópicamente el gen aislado en una planta, la parte que codifica para proteínas del gen se sitúa generalmente en conexión operativa con una secuencia promotora que puede operar en la planta, que puede ser el promotor endógeno o alternativamente, un promotor heterólogo, y una secuencia de terminación de la transcripción, que también puede ser la secuencia endógena o una heteróloga en relación con el gen de interés. El promotor y la parte que codifica para proteínas y la secuencia de terminación de la transcripción se proporcionan generalmente en forma de un constructo génico, para facilitar la introducción y el mantenimiento del gen en una planta en la que debe expresarse ectópicamente. Se han descrito numerosos vectores adecuados para introducir genes en plantas y están fácilmente disponibles. Éstos pueden adaptarse para expresar un gen aislado en una planta para mejorar la eficacia de transpiración en la misma.

La referencia en la presente memoria a un “promotor” debe considerarse en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen genómico eucariota clásico, incluyendo la caja TATA que se requiere para una iniciación de la transcripción precisa, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir secuencias de activación en el sentido de 5’, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o de una manera específica del tejido. En el presente contexto, el término “promotor” se utiliza también para describir una molécula sintética o de fusión, o derivado que confiere, activa o potencia la expresión de dicha molécula sentido en una célula. Los promotores preferidos pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para potenciar adicionalmente la expresión y/o para alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de una molécula de ácido nucleico a la que está conectado de manera operativa. Por ejemplo, los elementos reguladores sensibles al cobre pueden situarse adyacentes a una secuencia promotora heteróloga que desencadena la expresión de una molécula de ácido nucleico para conferir la expresión inducible de cobre en la misma.

Situar una molécula de ácido nucleico bajo el control regulador de una secuencia promotora significar colocar dicha molécula de modo que la expresión esté controlada por la secuencia promotora. Un promotor se coloca habitualmente, pero no necesariamente, en el sentido de 5’ o en 5’ de la parte que codifica para proteínas del gen que regula. Además, los elementos reguladores que comprenden un promotor se colocan habitualmente a como máximo 2 kb del sitio de inicio de la transcripción de las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas estructurales, o un gen quimérico que comprende las mismas. En la construcción de combinaciones de promotor heterólogo / gen estructural se prefiere generalmente colocar el promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción génica que sea aproximadamente igual que la distancia entre ese promotor y el gen que controla en su entorno natural, es decir, el gen del que se deriva el promotor. Tal como se conoce en la técnica, puede darse cabida a cierta variación en esta distancia sin pérdida de la función promotora. De manera similar, la colocación preferida de un elemento de secuencia reguladora con respecto a un gen heterólogo que va a situarse bajo su control se define mediante la colocación del elemento en su entorno natural, es decir, los genes de los que se deriva. De nuevo, tal como se conoce en la técnica, también puede producirse cierta variación en esta distancia.

Los promotores adecuados para su utilización en los constructos génicos de la presente invención incluyen aquellos promotores derivados de los genes de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas que pueden funcionar en células vegetales, incluyendo plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, o tejidos u órganos derivados de tales células. El promotor puede regular la expresión génica de manera constitutiva, o de manera diferencial con respecto al tejido en el que se produce la expresión o, con respecto a la fase de desarrollo en la que se produce la expresión, o en response a estímulos externos tales como estreses fisiológicos, patógenos o iones metálicos, entre otros.

Los ejemplos de promotores útiles al realizar esta realización incluyen el promotor CaMV 35S, el promotor de actina de arroz, el promotor de actina de arroz ligado al intrón de actina de arroz (PAR-IAR) (McElroy et al, Mol and Gen Genetics, 231(1), 150-160, 1991), el promotor NOS, el promotor de octopina sintasa (OCS), el promotor del gen de la SSU de Arabidopsis thaliana, el promotor específico de semilla napin, PcSVMV, promotores que pueden inducir la expresión bajo estrés hídrico, tal como se describe por, por ejemplo, Kasuga et al, Nature Biotechnology, 17, 287291, 1999), el promotor SCSV, el promotor SCBV, el promotor 35s (Kay et al, Science 236, 4805, 1987) y similares. Además de los promotores específicos identificados en la presente memoria, son útiles los promotores celulares para los denominados genes de mantenimiento, incluyendo los promotores de actina o los promotores de genes que codifican para histonas.

El término “terminador” se refiere a una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señaliza la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN no traducidas en 3’ que contienen una señal de poliadenilación, que facilitan la adición de una secuencia de poliadenilación al extremo 3’ de un transcrito primario. Terminadores activos en células derivadas de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas se conocen y se describen en la bibliografía. Pueden aislarse a partir de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas.

Los ejemplos de terminadores particularmente adecuados para su utilización en los constructos génicos de la presente invención incluyen el terminador del gen de la nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, el terminador del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el terminador del gen de la zeína de Zea mays, las secuencias de terminador del gen de la subunidad pequeña (SSU) de Rubisco y los terminadores de secuencia del gen del virus del enanismo del trébol subterráneo (SCSV), entre otros.

Los expertos en la materia apreciarán que las secuencias terminadoras y secuencias promotoras adicionales que pueden ser adecuadas para su utilización en realizar la invención. Tales secuencias pueden utilizarse fácilmente sin excesiva experimentación.

Preferentemente, el constructo génico comprende además un origen de la secuencia de replicación para su replicación en un tipo de célula específico, por ejemplo una célula bacteriana, cuando se requiere mantener dicho constructo génico como un elemento genético episomal (por ejemplo molécula de cósmido o plásmido) en dicha célula. Orígenes de replicación preferidos incluyen, pero no se limitan a, los orígenes de replicación f1-ori y colE1.

Preferentemente, el constructo génico comprende además un gen o genes marcadores seleccionables que son funcionales en una célula en la que se introduce dicho constructo génico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “gen marcador seleccionable” incluye cualquier gen que confiera un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o transforman con un constructo génico descrito en la presente memoria o un derivado del mismo.

Los genes marcadores seleccionables adecuados contemplados en la presente memoria incluyen el de resistencia a la ampicilina (Ampr), gen de resistencia a la tetraciclina (Tcr), gen de resistencia a la kanamicina bacteriana (Kanr), gen de resistencia a la fosfinotricina, gen de la neomicina fosfotransferasa (nptII), gen de resistencia a la higromicina, gen de resistencia a la gentamicina (gent), gen de la �-glucuronidasa (GUS), gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), y gen de la luciferasa, gen de la proteína fluorescente verde (EGFP y variantes), entre otros.

También se describe en la presente memoria la utilización de un gen aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que es homóloga a una región que codifica para proteínas de un gen de A. thaliana que se coloca entre aproximadamente 46 cM y aproximadamente 50,74 cM en el cromosoma 2 en la preparación de un constructo génico para mejorar la eficacia de transpiración de una planta.

Claramente, los genes ERECTA, variantes alélicas y regiones que codifican para proteínas descritos en la presente memoria son útiles en la determinación de otras proteínas que están implicadas en el proceso de transpiración en plantas. Por ejemplo, un gen ERECTA, variante alélica del mismo o región que codifica para proteínas del mismo puede utilizarse en un ensayo de “n” híbridos progresivo para determinar si dicho péptido puede unirse a una proteína o péptido de interés. Los procedimientos de “n” híbridos progresivos son muy conocidos en la técnica, y se describen por ejemplo, por Vidal y Legrain Nucl. Acid Res 27(4), 919-929 (1999) y las referencias en el mismo, e incluyen el de dos híbridos de levadura, dos híbridos bacterianos, dos híbridos de mamífero, (dos) híbridos de PolIII, el sistema Tribrid, el sistema de sensor de proteínas discontinuas a base de ubiquitina y el sistema de reclutamiento SOS.

Al adaptar un ensayo de dos híbridos progresivo convencional a la presente invención, una proteína ERECTA se expresa como proteína de fusión con un dominio de unión a ADN de, por ejemplo, la proteína GAL4 de levadura. Los procedimientos de construcción de constructos de expresión para la expresión de tales proteínas de fusión son muy conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al (En: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour, Nueva York, segunda edición, 1989). Una segunda proteína de fusión también se expresa en toda la levadura, comprendiendo dicha proteína de fusión, por ejemplo, una proteína que se cree que interacciona con una proteína ERECTA, por ejemplo el dominio de activación GAL4. Estos dos constructos se

r rrr

expresan entonces en una célula de levadura en la que, una molécula indicadora (por ejemplo, tet , Amp, Rif, bsdf, zeofr , Kanr , gfp, cobA, LacZ, TRP1, LYS2, HIS3, HIS5, LEU2, URA3, ADE2, MET13, MET15) bajo el control de un promotor mínimo situado en conexión operativa con un sitio de unión a GAL 4. Si las proteínas no interaccionan, no se expresa una molécula indicadora. Sin embargo, si dichas proteínas si interaccionan, se expresa dicha molécula indicadora. Por lo tanto se identifica una proteína, polipéptido, péptido que puede unirse específicamente a una proteína diana.

Un procedimiento de “n” híbridos progresivo puede modificarse para facilitar el examen de alto rendimiento de una biblioteca de péptido, polipéptidos y/o proteínas con el fin de determinar aquellos que interaccionan con una proteína ERECTA. Los procedimientos para examinar bibliotecas de proteínas son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Scopes (En: Protein Purification: Principles and Practice, tercera edición, Springer Verlag, 1994). Las proteínas identificadas mediante este procedimiento están implicadas potencialmente en el proceso de transpiración en plantas.

La presente invención se describe adicionalmente haciendo referencia a los ejemplos no limitativos siguientes.

Ejemplo 1

Discriminación de 12C/13C como marcador para examinar una variación genética en la eficacia de transpiración.

Se establecieron las condiciones experimentales y los procedimientos de toma de muestras para permitir el control de muchos factores, distintos del genético, que influyen en la eficacia de transpiración al nivel de plantas y hojas individuales. Estos factores se encuentran dentro de varias categorías: (a) características del microambiente de la plántula: temperatura, luz, humedad, capa límite alrededor de las hojas, condiciones de crecimiento de la raíz; (b) efectos morfológicos y de desarrollo que modifican el intercambio de gases y metabolismo de C y por tanto la firma isotópica de carbono (por ejemplo edad, fase, postura); y (c) efectos en la semilla.

Se desarrollaron técnicas de espectrómetro de masas de alta resolución para medir las razones de isótopos de C en tejidos completos o compuestos de carbono tales como azúcares solubles, es decir una medida de la eficacia de transpiración integrada a lo largo de la vida de la planta o a lo largo de un día, respectivamente, y también para medir la eficacia de transpiración instantánea durante el intercambio de gases.

Esto significa:

•: Precisión analítica de 0,1 por mil en la medición de la composición isotópica de carbono de hoja. La discriminación, (Δ), es aproximadamente la razón de isótopos de carbono en el CO2 fuente menos la del carbono orgánico de la planta. En un experimento particular, el CO2 fuente es común para todos los genotipos.

•: Precisión biológica de 0,1 por mil, que es la variación entre las plántulas replicadas, cultivadas en suelo, o bien

en cámaras de crecimiento o bien en invernaderos con control de temperatura, humedad y CO2 (que corresponde a aproximadamente el 1,5% de variación en la eficacia de transpiración).

•: La capacidad de hacer crecer y examinar grandes lotes de plántulas en invernaderos o cámaras de crecimiento (hasta 1500), en condiciones de crecimiento de la raíz y la hoja estandarizadas, hasta un tamaño de roseta de varios cm en el plazo de 2-3 semanas que permite mediciones individuales, en la misma planta, de razones de isótopos y también de las propiedades subyacentes (por ejemplo medición de temperatura de la hoja in situ mediante termometría infrarroja como una medida de la conductancia estomática; fluorescencia de clorofila; expansión de las hojas).

Ejemplo 2

Variación genética natural en la eficacia de transpiración en Arabidopsis thaliana

Se examinaron ecotipos de A. thaliana para determinar la Δ de las hojas en condiciones de invernadero. Hubo una gran dispersión de valores (que corresponden a aproximadamente el 30% de la variación genética en la eficacia de transpiración). Sin embargo, se observaron grandes efectos medioambientales. Se seleccionaron algunos ecotipos contrastados en los dos extremos del intervalo de valores de Δ y se comparan en diversas condiciones de irradiancia (150 a 500 µE m-2 s-1), espectro de luz (razones de rojo/rojo lejano) y humedad del aire (del 60 al 90%) mientras que las raíces se regaban siempre de manera abundante. La magnitud de las diferencias genéticas en la eficacia de transpiración se veía muy influida por las condiciones ambientales. Esto se debía en parte a variaciones entre ecotipos en la dependencia de fotosíntesis en caso de déficit de presión de vapor y luz. Las diferencias genéticas fueron máximas en una combinación de humedad baja y luz alta, en cámaras de crecimiento.

Los ecotipos Columbia (Col)y Landsberg erecta (Ld-er) presentan valores de discriminación de isótopos de carbono

13C

extremos, presentando Col siempre valores de Δ más pequeños que Ld-er es decir composiciones isotópicas δmenos negativas, y por tanto una mayor eficacia de transpiración.

Ejemplo 3

Identificación de un locus asociado con la eficacia de transpiración en A. thaliana

Se realizó un análisis de carácter cuantitativo (QTL) de las líneas endogámicas recombinantes de Lister y Dean (1993) (a las que se hace referencia posteriormente como las RIL) para identificar y mapear un locus asociado con la discriminación de isótopos de carbono Δ). Las RIL eran de un cruzamiento entre Col-4 y Ler-0. El análisis mostró la importancia de los genes alrededor del locus ER en chr2 y un papel para los genes distintos de ERECTA en conferir la eficacia de transpiración en A. thaliana.

Más particularmente, se generaron 300 líneas de mapeo RI entre ecotipos Col y Ler, disponibles en el Arabidopsis Stock Centre, a partir de un cruzamiento entre los ecotipos de Arabidopsis Columbia (Col4) y Landsberg erecta (Ler0 que porta er1) (Lister y Dean, 1993), utilizando Columbia como el progenitor macho. Se utilizó un subconjunto de 100 de estas líneas, que se escogieron como las mapeadas de la manera más densa y fiable en el presente análisis.

Se multiplicaron las semillas en un invernadero en un intento por minimizar los efectos en la semilla de confusión en nuestras comparaciones. Se obtuvieron grandes números de semillas para la mayoría de las líneas excepto para algunas, que incluyen la parental Col4, que tuvo que volver a pedirse debido a la baja viabilidad de las semillas de la muestra original enviada por el Stock Centre. Se utilizaron las semillas recogidas en estas series de propagación en todos los experimentos hasta la fecha.

Se analizaron los loci utilizando dos programas, QTL cartographer y MQTL. Estos programas calculan las estadísticas de un rasgo en cada posición del marcador, utilizando una gama de procedimientos [regresión lineal (LR), regresión escalonada (SR) y enfoques de probabilidad (mapeo por intervalos simples (SIM) que trata valores en marcadores individuales como valores independientes, y mapeo por intervalos compuestos (CIM) que permite las interacciones entre marcadores y el locus asociado)]. Por naturaleza cada uno de estos procedimientos presenta algunos sesgos y suposiciones arraigadas, por esto la importancia de analizar los datos con más de un programa. Sólo los resultados que fueron constantes entre los dos programas, y robustos con respecto a las adiciones o deleciones al conjunto de marcadores de contexto que se utilizaron para el mapeo por intervalos compuestos se indican a continuación.

Se realizó un análisis QTL inicial en paralelo a la multiplicación de semillas en un subconjunto de 40 líneas para las que se enviaron suficientes semillas. Una vez que todas las semillas se multiplicaron esto se repitió en el conjunto completo de 100 líneas. Estos dos análisis indicaron la existencia de un locus para discriminación de isótopos de carbono (Δ), que se correlaciona con la región que incluye el locus ERECTA en el cromosoma 2, en aproximadamente 46-51 cM (tabla 1, serie 1 y 2).

Dada la complejidad y naturaleza integrativa de Δ como rasgo fisiológico, no se esperaba un número tan pequeño de loci asociados con el rasgo. Por tanto se diseñaron experimentos posteriores para someter a prueba estos resultados y evaluar su estabilidad por toda la gama de condiciones ambientales conocidas por sus efectos sobre la expresión genética relacionada con Δ (véase anteriormente). Se repitió el análisis QTL en varios conjuntos de datos completamente independientes obtenidos en condiciones sumamente controladas en invernaderos o cámaras de crecimiento, en los que se varió o bien la humedad del aire, el fotoperiodo o bien la irradiancia (cantidad, patrón diurno, variación de día a día). Dependiendo del experimento, se incluyeron las 100 líneas endogámicas recombinantes o sólo el subconjunto de líneas con entrecruzamientos en el cromosoma 2. Estos experimentos confirmaron que una variación genética en Δ podría atribuirse mayoritariamente a una parte del cromosoma 2 (tabla 1) entre aproximadamente 46-50,7 cM.

Cuando las RIL se clasificaron gráficamente según la discriminación de isótopos de carbono y su genotipo en el marcador ER (50,64 cM) y sus proximidades (genotipo Ld-er1 o genotipo Col-ER), las líneas que eran Ld-er en el marcador ERECTA se clasificaron mayoritariamente en el extremo superior de los valores de discriminación isotópica de carbono. Por el contrario, las líneas que presentan un genotipo de marcador Col-ERECTA se clasificaron mayoritariamente en el extremo inferior de los valores de discriminación de isótopos de carbono (datos disponibles a petición). En el medio del intervalo de valores de discriminación de isótopos de carbono, hubo algo de solapamiento entre los dos conjuntos de líneas. Algunas líneas estuvieron siempre en un extremo (en los 18 experimentos realizados), mientras que la clasificación de otras líneas fue más inestable. Estos datos indican un locus para la eficacia de transpiración, tal como se determina mediante el valor de discriminación de isótopos de carbono, en las proximidades del locus ERECTA en el cromosoma 2 (tabla 1). Este locus implica de la manera más probable el gen ER. Dependiendo de las posiciones de los entrecruzamientos entre Ld-er y Col, la recombinación entre ERECTA y uno o más de los otros genes influye en el fenotipo de eficacia de transpiración de la progenie.

Ejemplo 4

Protocolo de transformación para maíz

Transformación biolística

Un procedimiento adecuado para la transformación de maíz se basa en la utilización de una pistola de partículas idéntica a la descrita por J. Finer (1992, Plant Cell Report, 11:323-328). Las células diana son células no diferenciadas que se dividen rápidamente que mantienen una capacidad para regenerarse en plantas completas. Este tipo de células componen el callo embriogénico (denominado tipo II) del maíz. Se obtienen estos callos a partir de embriones inmaduros del genotipo HiII según el procedimiento y en el medio descritos por Armstrong (Maize Handbook; 1994 M. Freeling, V. Walbot Eds; págs. 665-671).

Se disponen estos fragmentos de los callos que presentan una superficie de desde 10 hasta 20 mm2, 4 horas antes del bombardeo, colocando 16 fragmentos por placa en el centro de una placa Petri que contiene un medio de cultivo idéntico al medio de iniciación de los callos, complementado con 0,2 M de manitol + 0,2 M de sorbitol. Los plásmidos que contienen las secuencias ERECTA que van a introducirse, se purifican en una columna QiagenR siguiendo las instrucciones del fabricante.

Entonces, se precipitan en partículas de tungsteno (M10) siguiendo el protocolo descrito por Klein et al, Nature, 327, 70-73, (1987). Las partículas así recubiertas se envían hacia las células diana mediante la pistola según el protocolo descrito por Finer et al, Plant Cell Report, 11:323-328, 1992. Entonces se sellan las placas bombardeadas de callos mediante ScellofraisR, entonces se cultivan en la oscuridad a 27ºC.

El primer trasplante tiene lugar 24 horas después, después cada dos semanas durante 3 meses en medio idéntico al medio de iniciación complementado con un agente selectivo. Tras 3 meses o a veces antes, pueden obtenerse callos cuyo crecimiento no se inhiba mediante el agente selectivo, que consisten habitual y principalmente en células resultan de la división de una célula que presenta integrado en su patrimonio genético una o varias copias del gen de selección. La frecuencia de obtención de tales callos es de aproximadamente 0,8 callos por placa bombardeada.

Se identifican, individualizan, amplifican estos callos, después se cultivan para regenerar plántulas, modificando el equilibrio osmótico y hormonal de las células según el procedimiento descrito por Vain y colaboradores (1989, Plant Cell tissue and organ Culture 18:143-151). Estas plantas se aclimatan entonces en invernadero, en el que pueden cruzarse para obtener híbridos o fertilizarse a sí mismas.

Preferentemente, puede utilizarse un protocolo similar, cuyo principio se describe en Methods of Molecular Biology: Plant gene transfer and expression protocols (1995, vol. 49, págs. 113-123), y en el que los embriones inmaduros de genotipo HiII se bombardean directamente con partículas de oro recubiertas con plásmidos ERECTA para su introducción, preparadas según el protocolo descrito por Barcelo y Lazzeri (1995, Methods of Molecular Biology, 49:113-123).

Las etapas de transformación, selección de los eventos, maduración y regeneración son similares a aquellas descritas en el protocolo previo.

Transformación con Agrobacterium

Otra técnica de transformación útil dentro del marco de la invención utiliza Agrobacterium tumefaciens, según el protocolo descrito por Ishida y colaboradores (1996, Nature Biotechnology 14: 754-750), en particular partiendo de embriones inmaduros tomados 10 días después de la fertilización. Todos los medios utilizados se describen en la referencia citada. La transformación empieza con una fase de cocultivo en el que los embriones inmaduros de las plantas de maíz se ponen en contacto durante por lo menos 5 minutos con LBA 4404 de Agrobacterium tumefaciens que contiene los vectores superbinarios.

El plásmido superbinario es el resultado de una recombinación homóloga entre un vector intermediario que porta el ADN-T, y que contiene el gen de interés y/o el gen marcador de selección, y el vector pSB1 del Japan Tobacco (documento EP 672 752) que contiene: los genes virB y virG del plásmido pTiBo542 presente en la cepa supervirulenta A281 de Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) y una región homóloga encontrada en el vector intermediario, permitiendo una recombinación homóloga.

Se colocan los embriones entonces en medio LSAs durante 3 días en la oscuridad y a 25ºC. Se hace una primera selección en los callos transformados: se transfieren los callos embriogénicos a medio LSD5 que contiene fosfinotricina (5 mg/l) y cefotaxima (250 mg/l) (eliminación o limitación de la contaminación mediante Agrobacterium tumefaciens).

Se realiza esta etapa durante 2 semanas en la oscuridad y a 25ºC. Se realiza la segunda etapa de selección mediante la transferencia de los embriones que se desarrollaron en el medio LSD5, al medio LSD10 (fosfinotricina, 10 mg/l) en presencia de cefotaxima, durante 3 semanas en las mismas condiciones que anteriormente. La tercera fase de selección consiste en cortar los callos de tipo I (fragmentos de desde 1 hasta 2 mm) y en transferirlos durante 3 semanas en la oscuridad y a 25ºC a medio LSD 10 en presencia de cefotaxima. Se realiza la regeneración de plántulas cortando los callos de tipo I que proliferaron y transfiriéndolos al medio LSZ en presencia de fosfinotricina (5 mg/l) y de cefotaxima durante 2 semanas a 22ºC y con luz continua.

Las plántulas que se regeneraron se transfieren a medio RM + G2 que contiene Augmentin (100 mg/l) durante 2 semanas a 22ºC y con iluminación continua durante la etapa de desarrollo. Las plantas obtenidas se transfieren entonces al fitotrón con el objetivo de aclimatarlas.

Ejemplo 5

Detectar la expresión de la proteína ERECTA

Extracción de ERECTA de hojas y semillas de maíz.

Se recogen las hojas e inmediatamente se congelan en nitrógeno líquido. Se realiza la molienda en un mortero limpiado en etanol al 100% y enfriado en hielo. Se extrae un disco foliar de 18 mm de diámetro en 200 µl de tampón de extracción: Tris-HCl pH 8,0, glicerol al 20%, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PVP insoluble al 2% (p/v), arena de Fontainebleau e inhibidores de proteasa: leupeptina 2 mg/l, quimostatina 2 mg/l, PMSF 1 mM y E64 1 mg/l. Se centrifuga entonces el material molido a 4ºC durante 15 minutos a 20000 g para eliminar fragmentos.

En primer lugar se reducen los granos a polvo en una trituradora de perlas (Retsch). Se extraen las proteínas suspendiendo 100 µl de polvo en 400 µl del tampón descrito anteriormente en hielo. Esta mezcla se agita por vórtex y se centrifuga a 4ºC durante 15 minutos a 20000 g para eliminar fragmentos.

Se miden entonces los niveles de proteína ERECTA utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia, y descritas, por ejemplo, en Scopes (En: Protein purification: principles and practice, tercera edición, Springer Verlag, 1994).

Ejemplo 6

Determinación de un rol para el gen ERECTA en la regulación de la eficacia de transpiración

Se compararon ecotipos Col y Ler con líneas mutantes casi isogénicas para el gen erecta, para examinar un posible papel del gen ERECTA en la determinación de la discriminación de isótopos de carbono (Δ).

Las plantas que expresan el gen ERECTA de tipo natural (SEC ID nº: 1), o un alelo mutante erecta en el contexto Columbia (por ejemplo Col-er1, Col-er2, Col-er101 a-er105; o Col-er106 a-er123) y en el contexto Landsberg (Lder1) se han descrito públicamente. Estaban disponibles tres de estos mutantes para su comparación con las líneas isogénica o casi isogénica (tabla 2).

Se incluyeron sistemáticamente Col4 (ER) y Ld-er1, las líneas parentales para las RIL de Lister y Dean en la comparación. Cuando era posible, se incluyeron también otros “ecotipos” Col, (por ejemplo Co10, Col1, Col3-7), para evaluar su similitud con respecto a la discriminación de isótopos de carbono, especialmente en comparación con el ecotipo parental de RIL Col4.

Se describen los resultados de estas comparaciones en la tabla 3. Los datos indican las diferencias en los valores de discriminación de isótopos de carbono entre líneas er y ER para 15 series experimentales diferentes que corresponden al crecimiento con luz de baja a alta (100 a 800 µE m-2 s-1), humedad de baja a alta (del 40 al 85%), días de cortos a largos (8, 10, 24 h), temperaturas de normales a altas (de 22/20ºC a 28/20ºC).

Como se esperaba, la dispersión de los valores de discriminación de isótopos de carbono entre líneas variaba con las condiciones ambientales. Las líneas que portan mutaciones er presentan un valor mayor de discriminación de isótopos de carbono global que aquéllas que presentan en el gen ER de tipo natural (véase la tabla 3, columna 1), indicativo de una eficacia de utilización de agua menor. Hay habitualmente poca diferencia en la discriminación isotópica de C entre las diversas líneas Col, (véanse los promedios similares obtenidos para las columnas 2, 3 y 4 en la tabla 3, en la que er105 se compara con 3 ecotipos Col diferentes Co10, Col4 y 3176 o Col1). Cuando estuvo presente, el mutante er105 siempre presenta el mayor valor de discriminación de isótopos de carbono de todas las líneas, incluyendo er1 y er2 (columnas 2-4 en comparación con columnas 5-6 en la tabla 3, o columna 8 en comparación con la columna 9 en la tabla 3). El valor medido en el mutante er105 es siempre significativamente mayor que en la línea isogénica ER (columna 4 en la tabla 3). El valor medido en er1 (línea parental Landsberg NW20) es habitualmente también mayor que el de las líneas ER 3177 (casi isogénicas, columna 6 de la tabla 3), y en un menor grado Col4 (línea parental Columbia, columna 7 de la tabla 3). Estas observaciones dan evidencia directa de que el gen ERECTA desempeña un papel significativo en la determinación de diferencias genéticas en la discriminación isotópica de carbono en Arabidopsis.

Esta conclusión se confirma independientemente mediante las mediciones de intercambio de gases en la hoja que permiten la medición directa de la eficacia de transpiración (razón de la fijación de CO2 neta con respecto a la pérdida de agua; columna 4 en la tabla 4; figuras 1a-1c, 2a-2c). Mediciones en hojas maduras revelan que las líneas ER se caracterizan por una mayor razón de asimilación de CO2 con respecto a la pérdida de agua que las líneas que portan mutaciones er. Esto resulta más evidente cuando se compara el par Col1/er105 con una eficacia de transpiración un 21% mayor (razón A/E) en Col1 que er105, o el par Col1/er2 con una eficacia de transpiración un 16% mayor en Col1. Concordando con las mediciones de discriminación de isótopos de carbono, el efecto er/ER es relativamente más pequeño en el contexto Ld (una razón A/E un 9% mayor en Ld-ER (3177) que en la línea Ld-er1 (NSW20)).

También concuerda con las mediciones de discriminación de carbono la diferencia del 20% en la eficacia de transpiración entre las dos líneas parentales RIL (4,06 y 3,38 mmol C/mol H2O en Col4-ER y Ld-er1, respectivamente).

Que de los 3 mutantes erecta examinados, er105 presente la mayor discriminación de carbono más extrema y los fenotipos de eficacia de transpiración, sugiere que la mutación er105 afecta a una parte más crucial del gen ERECTA que er2 o er1. Esto concuerda con los datos publicados sobre el mutante er105. Esta mutación corresponde a la inserción de un “inserto foráneo” grande en el gen ERECTA. La inserción inhibe la transcripción del gen y provoca el fenotipo erecta más fuerte de todos los mutantes erecta aislados en Col (con respecto a agrupamiento de inflorescencias y forma y ancho de silicua). Alternativamente, o además, los datos indican que las mutaciones erecta presentan un efecto más fuerte sobre los valores de discriminación de isótopos de carbono en un contexto genético Columbia que en un contexto Landsberg (comparación de efectos fenotípicos de er105 y er1), lo que implica que otros genes, polimórficos entre los ecotipos Landsberg y Columbia, interaccionan con ERECTA en la determinación de la eficacia de transpiración. Esto podría explicar también la diferencia mayor en la eficacia de transpiración entre líneas er/ER en contexto Col que en un contexto Ld (véase anteriormente, tabla 4). Alternativamente, o además, los datos indican que la mutación erecta no es la única mutación presente en el mutante er105. Por ejemplo, las semillas Col mutagenizadas pueden haber portado la mutación gl1, inducida mediante la irradiación de neutrones rápida, que también contribuye al fenotipo observado.

Una comparación de perfiles de transcrito en líneas isogénicas er/ER (en contexto tanto Col como Ld) permite la determinación de la participación de genes adicionales a ERECTA y el efecto del medio ambiente sobre su expresión.

Ejemplo 7

Detección QTL centrada en el marcador ERECTA y el locus del gen ERECTA en el cromosoma 2 de Arabidopsis thaliana

1. Procedimientos

Numerosas series que utilizan las líneas endogámicas recombinantes de Lister y Dean (1993) entre Col-4 y Ler-0 se hicieron crecer en un invernadero de temperatura controlada (20/20ºC) o dentro de cámaras de crecimiento (21ºC y niveles de luz que oscilan desde 100 hasta 500 µE m-2 s-1 de irradiancia y un 50-70% de humedad relativa). Las series incluyeron una variedad de las 100 RIL así como subconjuntos de estas 100 junto con líneas parentales Col-4 y líneas parentales Ler-0 (NW20). Se replicaron las RIL individuales dentro de las series. Las semillas o bien se trataron en frío en papel filtro húmedo durante 2-4 días, se trataron en frío y se plantaron directamente en el suelo; o bien se sembraron en placas en agar, tratadas en frío durante 2-4 días, que se hicieron crecer en agar durante aproximadamente 11-15 días antes de ser transferidas al suelo. Las plantas se regaron de manera abundante y se hicieron crecer durante 4-5 semanas antes de la cosecha. Se recogieron muestras (toda o parte de la roseta) y se secaron en un horno a 80ºC antes de molerse y analizarse para determinar su composición isotópica de C. El valor utilizado para el análisis QTL para una línea individual era el promedio de las plantas replicadas de esa línea dentro de una serie.

2.: Selección de marcadores

El conjunto convencional de 64 marcadores para las líneas recombinantes de Lister y Dean se descargaron de la página web de NASC. Se añadieron marcadores adicionales a este conjunto de datos cuando se determinó en primer lugar la significación para obtener mapeos a escala más fina en las regiones de interés. Un total de 121 marcadores se utilizaron en los 5 cromosomas.

3.: Análisis

Se analizaron las series utilizando mapeo por intervalos simples (SIM) (Lander y Botstein 1989) y mapeo por intervalos compuestos (CIM) (Zeng 1993 y 1994). Se utilizaron dos programas para analizar los datos, QTL Cartographer versión 1.14 (Basten et al. 1999) y MQTL versión 0.98 (Tinker y Mathers 1995). Los dos programas difieren en cómo tratan los marcadores de contexto para mapeo por intervalos compuestos (CIM). En MQTL los marcadores de contexto se escogen al azar y se colocan en el archivo de entrada del mapeo. En QTL Cartographer los marcadores de contexto no se escogen al azar sino que más bien se escogen del análisis de regresión escalonada que selecciona los “mejores” marcadores de contexto. El establecimiento o la selección de estos marcadores también presenta una influencia en el nivel de significación estadística. Tinker argumenta que no es posible encontrar un umbral apropiado para el control del error estadístico cuando se seleccionan los marcadores de contexto basándose en los datos. Por tanto se utilizaron los dos programas y se han concentrado en los QTL que estuvieron presentes en ambos conjuntos de análisis.

a) QTL cartographer

Se utilizó el Qstat para determinar si los datos presentaban una distribución normal (si no, entonces se tomaron medidas para arreglar la distribución). Se realizaron la regresión lineal (LR) y regresión escalonada (SR) utilizando los ajustes por defecto (la regresión escalonada se utilizó de manera progresiva con eliminación regresiva) al 5% de significación. Se realizaron la CIM e intervalos simples utilizando la función Zmap.qtl. Se analizaron los datos en todos los cromosomas con una velocidad de paso de 2 cM. Para el modelo 6 (CIM) el número de parámetros de contexto se dejó por defecto en 5 junto con el tamaño de ventana que se dejó por defecto en 10 cM. Se realizaron mil permutaciones con el CIM (Churchill y Doerge 1994). Entonces se ejecutó Eqtl para determinar los QTL significativos.

b) MQTL

El mismo conjunto de marcadores utilizado en QTL Cartographer se utilizó en MQTL. Se escogieron los marcadores de contexto al azar para CIM. El número de marcadores escogido fue de aproximadamente la mitad del número de RIL utilizadas en el conjunto. Se seleccionó el ajuste por defecto de una velocidad de paso de 5 cM, se realizaron 3000 permutaciones para determinar los niveles de significación con el error de tipo 1 fijado al 5%.

Los QTL que estuvieron presentes en ambos programas y de conjuntos de marcadores de contexto variados del MQTL se consideraron genuinos. Esto, asociado con análisis QTL repetido en experimentos independientes, condujo a un locus repetible significativo que rodea al gen ERECTA en el cromosoma 2 (tabla 5).

Los datos en la tabla 5 indican que hay un QTL principal con una puntuación de LOD significativa en el nivel de probabilidad del 5% y, para la mayoría de series, de incluso el 1%, en el cromosoma 2 de Arabidopsis thaliana. En todos los casos, ese intervalo se encuentra por encima del marcador ER en el cromosoma 2. Dependiendo de la serie experimental, este QTL explica del 18 al 64% (véase la columna R2) de la varianza genética total en la eficacia de transpiración.

Los datos en la figura 3 indican un efecto aditivo positivo del QTL identificado basado en el valor medio de la composición de isótopos de carbono en plantas que portan el alelo Col-4 ERECTA.

Ejemplo 8

Prueba de complementación: transformación de líneas de A. thaliana que portan mutaciones erecta con el gen ERECTA de tipo natural bajo el control del promotor 35S.

1. Procedimientos

Se transformaron dos líneas erecta Columbia utilizando un vector binario cedido generosamente por Dr Keiko Torii. Se construyó ese plásmido utilizando el vector de plásmido pPZP222 (véanse detalles de este vector en Hajdukiewics et al. Plant Mol Biol 25, 989-994, 1994). Los vectores pPZP portan genes quiméricos en un casete de expresión 35S de CaMV que les confiere resistencia a la kanamicina o gentamicina en plantas. El marcador seleccionable de la planta (gen de resistencia a la gentamicina para el vector pPZP222) se clona al lado del LB. Los sitios de clonación para el gen de interés (ER en nuestro caso) están entre el marcador de la planta y las secuencias RB. Esto garantiza que ese gen se transfiera en primer lugar a la planta, seguido del gen gent. Por tanto, la resistencia a la gentamicina se obtendrá sólo si el gen ER también está presente.

Se transfirió el vector binario a una cepa desarmada AGL1 de Agrobacterium tumefaciens mediante apareamientos triparentales convencionales (Ditta et al, 1980, PNAS 77,7347-7351) utilizando la cepa cooperadora pRK2013 de E. coli.

Se transformaron las plantas Arabidopsis utilizando el procedimiento de inmersión floral convencional para la transformación mediante cepas desarmadas de A. tumefaciens (Clough y Bent, 1998, The Plant Journal 16, 735743).

Se transformaron dos líneas erecta Columbia, para las que se tienen numerosos datos que muestran constantemente más valores isotópicos negativos en aquellas líneas (es decir eficacia de transpiración inferior) que en plantas de tipo natural Col ER casi isogénicas. Estas dos líneas fueron tal como sigue:

1.: er 105, un mutante desactivado debido a la inserción de un fragmento grande de ADN en el gen ERECTA y

2.: línea Col-er2 (identificador 3401 NASC), el mismo que er106 (Lease et al. 2001).

Se examinaron las plántulas en placas MS en 100 µg/ml de sulfato de gentamicina. Se transfirieron transformantes putativos al suelo y se examinó su progenie de nuevo para determinar la resistencia a la gentamicina, para la confirmación e identificación de líneas homocigóticas y la recolección de semillas T3.

Se obtuvieron muchas líneas transformantes independientes y entre aquellas había varias líneas homocigóticas ER, que se seleccionaron para su análisis posterior (véase la tabla 6).

También se obtuvo una línea ER Landsberg homocigótica transgénica estable transformando el ecotipo Ld-er1 (NW20) con el mismo constructo que se describió anteriormente cedido por Dr Keiko Torii (línea T3-7K en la tabla 6

o “T2+ER” en las figuras 6-9).

2. Resultados:

El análisis inicial de varios transformantes ER en el contexto Col-er105, Col-er106/er2 y Ld-er1 (tal como se muestra en la tabla 6 anterior):

Se averiguó la transformación eficaz y se cuantificaron los niveles de expresión de ER en varios transformantes T2 independientes utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (ABI PRISM 7700, Sequence Detection System User Bulletin #2. 1997). Básicamente esa técnica permitió cuantificar el número de copias del gen ER en líneas de interés, tras la normalización con respecto al número de copias de un gen control, en las mismas plantas (mismo conjunto de ARN). El gen de ARN ribosómico 18S se utilizó como gen control tras comprobar que su expresión no se veía afectada por los cambios en la expresión de ER.

Se muestran los resultados en las figuras 4a, 4b y 4c, en las que el eje de las y en cada figura describe el número de copias de ARNm de erecta (normalizado al de ARNm 18S) en las líneas ER de tipo natural, mutantes er y transgénicos ER en contextos tanto Columbia como Landsberg.

Todas las líneas transgénicas ER, excepto la línea 145 (figura 4a) mostraron un número de copias de ARNm aumentado: un aumento de desde 4 hasta 170 veces en comparación con los controles nulos. De manera interesante, todas las líneas, incluso aquellas con niveles de ARNm enormemente aumentados parecen “normales”, sanas y de tamaño similar.

El análisis fenotípico inicial muestra complementación del “fenotipo de eficacia de transpiración”. Dicho de otro modo, las líneas transgénicas ER muestran valores de composición isotópica de carbono menos negativos que el control er nulo y las líneas nulas tal como se muestra en la tabla 7. Esos valores convergen hacia los valores medidos para los ecotipos ER de tipo natural. Por tanto, en un contexto Columbia, los transgénicos ER muestran valores del -30,6 al -31,2 por mil en promedio en comparación con valores del -31,7 al -32,2 por mil en los transgénicos nulos (tabla 7), y el -30,9 por mil en el tipo natural ER de Col0 (ecotipo de contexto para mutante er105). Las composiciones isotópicas de carbono menos negativas en transgénicos ER son indicativas de una mayor eficacia de transpiración en estas plantas, como se esperaba.

Se confirman los datos presentados en la tabla 7 mediante la medición directa de la eficacia de transpiración de la hoja (razón A/E de la tasa de asimilación de CO2 por unidad de área de hoja con respecto a la tasa de transpiración) utilizando técnicas de intercambio de gases. También se determinan la densidad estomática, capacidad fotosintética de la hoja y tasa de crecimiento para analizar las causas subyacentes de la reversión del fenotipo de eficacia de transpiración (anatomía y desarrollo de la hoja, propiedades bioquímicas de las hojas, características estomáticas).

Ejemplo 9

Especificidad de tejido en la expresión del gen ERECTA en arroz de tipo natural Oryza sativa (cv Nipponbare):

Se identificó un ortólogo del alelo ERECTA de A. thaliana (SEC ID nº: 1) en arroz in silico mediante búsquedas de homologías de la base de datos de proteínas del NCBI utilizando el programa BLAST en condiciones convencionales. La secuencia de entrada fue SEC ID nº: 2. Se presenta la secuencia de nucleótidos del ortólogo del arroz en SEC ID nº: 3, comprendiendo la proteína codificada la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 4.

Se determinó el número de copias de ARNm del gen ERECTA del arroz para diversos órganos/partes de la planta, tal como se indica en las figuras 5a y 5b. Se determinaron los números de copias de ARNm ERECTA mediante PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando ARNm 18S como gen de control interno para la normalización de los datos. El patrón de expresión de ERECTA en arroz era similar al patrón de expresión génica en A. thaliana, observándose la mayor expresión en tejidos meristemáticos jóvenes, hojas jóvenes e incluso más, las inflorescencias. No se encuentra ninguna o muy baja expresión en raíces, en lo que respecta a A. thaliana.

Estas similitudes en la especificidad de tejido entre el arroz y Arabidopsis indican que el ortólogo del arroz proporcionado en la presente memoria como SEC ID nº: 3 es un ortólogo verdadero del alelo ERECTA de A. thaliana expuesto en SEC ID nº: 1, con función similar.

Ejemplo 10

Demostración de un papel funcional para el gen ERECTA del arroz en la modulación de la eficacia de transpiración

Para determinar un papel funcional para el gen ERECTA del arroz (SEC ID nº: 3), se analizan líneas de plantas de arroz que portan inserciones de transposones que afectan a la expresión de ese gen. Se identificaron nueve de tales mutantes en la colección disponible públicamente de mutantes insercionales de transposones TOS 17 en el Japanese NIAS Institute. Se describe el retrotransposón TOS 17 en detalle por Hirochika, Current Opinion in Plant Biology, 4, 118-122, 2001 y por Hirochika Plant Mol Biol 35, 231-240, 1997. Se identificaron las nueve líneas mutantes a través de la página web URL http://tos.nias.affrc.go.jp/~miyao/ pub/tos17/, y presentan los números de registro NG0578 (mutante A), ND3052 (mutante B), ND4028 (mutante C), NC0661 (mutante D), NE1049 (mutante E), NF8517 (mutante F), NE8025 (mutante G), NE3033 (mutante H) y NF8002 (mutante I).

Se pidieron nueve mutantes insercionales de transposones de NIAS, que portan el inserto de retrotransposón estable TOS17 en diversas partes del gen ERECTA en el contexto Nipponbare, el genotipo utilizado para el secuenciamiento del genoma del arroz: NG0578, ND3052, ND4028, NC0661, NE1049, NF8517, NE8025, NE3033 y NF8002.

Las inserciones de transposones en estas nueve líneas afectan la región transmembrana de la proteína (mutantes I, D, E) o los dominios de repeticiones ricas en leucina (LRR) (mutante H y G) en LRR 7 y LRR 18, respectivamente. En el mutante B, el TOS 17 altera la secuencia de codificación sólo en el sentido de 5’ de las secuencias que codifican para el dominio I de proteína cinasa. En los mutantes C y F, la inserción de TOS17 altera la secuencia que codifica para el dominio VIa de la proteína ERECTA. En el mutante A, la inserción de TOS7 es en una secuencia que codifica para una región entre los dominios IX y X. La información de secuencia en estos mutantes está disponible públicamente de la página web del NIAS.

Utilizando una semilla mutante para líneas A-I recibidas de NIAS, se hicieron crecer las plantas para la amplificación de semilla y análisis. Excepto en dos mutantes en los que varias plantas murieron, las plantas parecían sanas, el buen crecimiento indicando que, como en Arabidopsis, existe gran potencial para alterar el gen ERECTA hacia una eficacia de transpiración alterada sin afectar adversamente al crecimiento y/o a la producción.

Basándose en la información de secuencia para cada mutante A-I, se diseñaron cebadores para amplificar los alelos erecta mutantes a partir del material de plántula derivado de 20 semillas. Se realizó la amplificación en condiciones convencionales, para identificar para cada mutante, plantas que son homocigóticas, heterocigóticas o nulas en el locus ERECTA. Se identificaron los mutantes B y E TOS17 homocigóticos, y las líneas heterocigóticas y las líneas nulas en todas las líneas A-I.

En paralelo a la ganancia de información sobre si las líneas mutantes eran o no mutantes homocigóticas o heterocigóticas o nulas, se extraen partes de la planta específicas para el análisis de las consecuencias de las mutaciones en la expresión del gen ERECTA (niveles y especificidad de tejido de la expresión), utilizando PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en la presente memoria. Adicionalmente, el fenotipo de eficacia de transpiración de cada línea mutante se determina midiendo la composición isotópica C y O y el contenido en ceniza de las muestras de planta.

Los resultados iniciales sobre la composición isotópica de 13C de limbos maduros de plántulas de arroz revela una variación significativa entre las líneas mutantes(del -32,8 al -34,2 por mil) y, en por lo menos 4 mutantes, desviaciones significativas con respecto a los valores de tipo natural, hacia valores más negativos, lo que sugiere que las mutaciones erecta sí afectan a la eficacia de transpiración en arroz, como en Arabidopsis.

Se aplican unos procedimientos similares a los anteriores para analizar la progenie de las plantas mutantes, para facilitar el análisis de los efectos de las mutaciones erecta en una gama de condiciones, que incluyen inundación (como es la práctica más común para Nipponbare), estrés hídrico tal como por secado del suelo (condiciones de crecimiento del arroz de secano) o humedad del aire baja (periodos de calor). Se observan diferencias en la morfología, anatomía y dominancia apical de la planta en cada condición ambiental. Los parámetros que se caracterizan incluyen patrones de labrado, la anatomía de las hojas y meristemos, tasa de crecimiento y desarrollo.

Las comparaciones entre mutantes A-I se utilizan adicionalmente para caracterizar el papel de los diferentes dominios de proteína a la hora de conferir diferentes fenotipos observados para cada línea en diferentes condiciones de crecimiento agrícola y/o ambientales. Es interesante que, entre los 4 mutantes que presentan composiciones isotópicas de C mucho más inferiores que el tipo natural, tres son aquéllos mutantes en los que el inserto TOS17 afecta a la región transmembrana.

Ejemplo 11

Efecto de silenciamiento de la expresión del gen ERECTA sobre la eficacia de transpiración

Para confirmar el papel del gen ERECTA a la hora de conferir el fenotipo de eficacia de transpiración a una planta, la expresión del alelo ERECTA de tipo natural se reduce o inhibe utilizando procedimientos convencionales de biología molecular vegetal, tales como, por ejemplo, inhibición antisentido de la expresión de ERECTA o la expresión de ARN de interferencia inhibidor (ARNi) que tiene como objetivo la expresión de ERECTA a nivel de ARN. Todos los procedimientos de este tipo se llevarán a cabo fácilmente por el experto en la materia utilizando las secuencias de nucleótidos dadas a conocer de los genes ERECTA proporcionados en la presente memoria o secuencias complementarias a las mismas.

Para la transformación del arroz y Arabidopsis, se preparan transgenes en vectores binarios, no tumorígenos, desarmados que portan ADN-T en los límites izquierdo y derecho y un marcador seleccionable operativo en E. coli.

Los vectores binarios utilizados para transferencia de ADN incluyen vectores seleccionados de entre el grupo constituido por:

1.: pPZP222 (Hajdukiewicz et al, 1994, Plant Mol Biol 25, 989-994);

2.: PBI 121 (Clonetech) (Ueda et al 1999, Protoplasma 206, 201-206);

3.: pOCAl8 (Olszewski et al 1988, Nucl. Acid Res, 16 10765-10782);

4.: pGreen y pSoup o variantes de los mismos (Hellens et al., 2000, Plant Mol Biol 42, 819-832) y

5.: vectores binarios desarrollados en las estructuras principales de los vectores pCAMBIA descritos en la página web de CAMBIA.

El material de partida para todos estos vectores era la estructura principal desarrollada por Hajdukiewicz et al., 1994. Las series de vectores pPZP comprenden (i) un origen de replicación de intervalo de huésped amplio del plásmido pVSl de Pseudomonas, que es estable en ausencia de selección; (ii) el origen de replicación pBR322 (de tipo pMB9) para permitir preparaciones de ADN de alto rendimiento en E. coli; (iii) límites izquierdo (LB) y derecho (RB) del ADN-T, incluyendo la secuencia overdrive; y (iv) un casete de expresión de promotor CaMV35S. Aunque las series de vectores pPZP también sirvieron como las estructuras principales para las series pCAMBIA, se han modificado mucho para aplicaciones particulares.

Los vectores que contienen en su ADN-T diversas combinaciones de los siguientes componentes se prefieren particularmente:

1.: casete del gen de resistencia hptII para conferir resistencia a la higromicina en material vegetal transformado, en el que la expresión de hptII está operativamente bajo el control de Ubi 1 o el promotor 3 5 S;

2.: un casete de gen indicador que comprende ácido nucleico que codifica para los indicadores EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) y/o beta-glucuronidasa (GUS y GUSPlus);

3.: casete transactivador Gal4/VP16; y

4.: uno o más casetes de expresión de genes de plantas que comprenden ADNc de genes ERECTA o bien de longitud completa o bien parciales en la orientación sentido o antisentido, o que pueden expresar ARNi que comprende secuencias derivadas del gen ERECTA, incluyendo cualquiera de los fragmentos genómicos de ADN de la planta.

Se transfieren los vectores binarios a una cepa desarmada AGL1 de Agrobacterium tumefaciens mediante apareamientos triparentales convencionales (Ditta et al, 1980, Proc. Natl Acad. Sci. 77,7347-7351) utilizando la cepa cooperadora pRK2013 de E coli. Las plantas A. thaliana se transforman utilizando el procedimiento de inmersión floral convencional para la transformación mediante cepas desarmadas de A tumefaciens (Clough y Bent, 1998, The Plant Journal 16, 735-743). El arroz se transforma generando callos embriogénicos a partir de embriones cortados y sometiendo los callos embriogénicos a una transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens según procedimientos publicados (por ejemplo Wang et al 1997, J Gen and Breed, 51 325-334, 1997). Se analizan las plantas transformadas para confirmar que aquellas líneas que expresan constructos de ARNi o antisentido presentan una expresión reducida de la proteína ERECTA funcional y se asemejan de manera más próxima al fenotipo erecta que las plantas de tipo natural o las plantas que expresan ectópicamente un gen ERECTA de tipo natural en la orientación sentido.

Ejemplo 12

Identificación de un ortólogo de sorgo de ERECTA de A. thaliana

Se identificó un ortólogo del alelo ERECTA de A. thaliana (SEC ID nº: 1) en sorgo in silico mediante búsqueda de homologías de la base de datos de proteínas del NCBI utilizando el programa BLAST en condiciones convencionales. La secuencia de entrada era SEC ID nº: 2. La secuencia de nucleótidos del ortólogo de sorgo se presenta en SEC ID nº: 5, comprendiendo la proteína codificada la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 6.

Ejemplo 13

Identificación de homólogos de ERECTA de A. thaliana

Se identificaron dos homólogos del alelo ERECTA de A. thaliana (SEC ID nº: 1) in silico mediante búsqueda de homologías de la base de datos de proteínas del NCBI utilizando el programa BLAST en condiciones convencionales. La secuencia de entrada era SEC ID nº: 2. Las secuencias de nucleótidos de los homólogos de ERECTA de A. thaliana se presentan en las SEC ID nº: 7 y 9, comprendiendo las proteínas codificadas las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID nº: 8 y 10, respectivamente.

Los mutantes insercionales de ADN-T para estos dos genes homólogos, ambos en chr5, se han identificado en la colección mutante del Salk Institute (dirección web: signal.salk.edu/cg:-bin/tdnaexpress). Se pidieron varios de estos mutantes: Salk_007643 y Salk_026292 para el gen At5g07180; Salk_045045 y Salk_081669 para el gen At5g62230. Se diseñaron pares de cebadores con el fin de determinar número de copias de inserto y la homocigocidad/heterocigocidad en las plántulas que se hicieron crecer a partir de las semillas que se recibieron. Se identificaron las líneas homocigóticas con 1 inserto y están en caracterización con el fin de comparar los patrones de expresión (localización de tejido y niveles de ARNm) de los dos genes y del gen ERECTA en una gama de condiciones ambientales y determinar si los tres genes está relacionados funcionalmente.

Ejemplo 14

Identificación de ortólogos de trigo de ERECTA de A. thaliana

Se identificó inicialmente un secuencia de ADNc parcial de ortólogos del alelo ERECTA de A. thaliana (SEC ID nº: 1) en trigo in silico mediante búsqueda de homologías de la base de datos de proteínas del NCBI utilizando el programa BLAST en condiciones convencionales. Fue necesario, sin embargo, realizar búsquedas adicionales de bases de datos privadas con el fin de vincular las secuencias parciales identificadas en la base de datos del NCBI. La corrección de secuencias parciales ubicadas en la base de datos del NCBI fue también necesaria con el fin de generar un cóntigo que correspondiera al ortólogo ERECTA de trigo.

La secuencia de entrada es la secuencia de aminoácidos de A. thaliana (SEC ID nº: 2) o de arroz (SEC ID nº: 4) o una secuencia de nucleótidos que codifica para la misma. Se presentan las secuencias de nucleótidos del ortólogo de trigo en las SEC ID nº: 11-19, comprendiendo las proteínas codificadas las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID nº: 20.

Las secuencias expuestas en las SEC ID nº: 11 a 18 son secuencias de ADNc parciales. Se aísla la secuencia correspondiente del ortólogo ERECTA de trigo (SEC ID nº: 19) mediante un examen de hibridación de ácido nucleico convencional de una biblioteca de ADNc de trigo.

Para confirmar el papel de los ortólogos ERECTA de trigo en la eficacia de transpiración, se utilizan conjuntos de datos de expresión para estudios in silico de la expresión del gen ERECTA en una gama de tejidos de plantas de trigo que se hacen crecer en una gama de condiciones ambientales, proporcionando de ese modo indicaciones de especificidades de tejido en patrones de expresión y los datos preliminares sobre los tipos de ambientes en los que el ortólogo ERECTA es más probable que desempeñe un papel fisiológico en relación con el agua utilizada en esta especie. En estos estudios, los ácidos nucleicos que comprenden la secuencia expuesta en SEC ID nº: 11 a 19, o una secuencia complementaria a la misma, se utilizan para producir sondas de hibridación y/o cebadores de amplificación.

Adicionalmente, se introduce un gen ERECTA (SEC ID nº: 11 a 19) en la orientación sentido o antisentido en el trigo, produciendo de ese modo líneas de expresión transformadas. Los constructos génicos son específicamente para silenciar la expresión del gen ERECTA utilizando tecnología de ARNi, o alternativamente, para expresar ectópicamente el marco de lectura abierto completo del gen.

Basándose en una función similar, también se introduce el marco de lectura abierto del gen ERECTA de A. thaliana (es decir, SEC ID nº: 1) en el material vegetal del trigo en la orientación sentido, expresando de ese modo ectópicamente ERECTA de A. thaliana en trigo.

Se introducen los constructos génicos en el trigo siguiendo uno cualquiera de varios procedimientos convencionales, tales como, por ejemplo, utilizando la transformación mediada por A. tumefaciens tal como se describe en los documentos publicados AU 738153 o EP 856.060-A1 o CA 2.230.216 para Monsanto Company, o utilizando procedimientos de transformación biolística publicados tal como se describe por Pellegrineschi et al., Genome 45(2), 421-30, 2002. Por lo tanto, la transformación genética se utiliza fácilmente para generar líneas de trigo con expresión alterada de un gen ERECTA. Aproximadamente se producen de 30 a 40 transformantes diferentes, dependiendo de la eficacia del ARNi en reducir la expresión de ERECTA en trigo.

Los transformantes primarios (T0) se caracterizan para determinar el número y loci en los que se insertan los transgenes. Se generan entonces las progenies segregantes T1 y T2 a partir de transformantes T0 seleccionados, y se analizan para determinar la razón de segregación y confirmar el número de loci que presentan los transgenes insertados. Se seleccionan aquellas líneas T1 y/o T2 que presentan inserciones transgénicas únicas y se utilizan para generar y multiplicar la semilla para estudios fisiológicos.

Se determina la eficacia de utilización de agua en las líneas T1 y/o T2 a través de (a) mediciones gravimétricas de aumentos de biomasa y agua transpirada; (b) discriminación isotópica de 13C en tejidos de la planta, (es decir, determinando Δ; y (c) contenido en ceniza del tejido de la planta.

Se analiza también el desarrollo de las hojas y los meristemos, especialmente con respecto a la diferenciación y anatomía de la epidermis, los complejos estomáticos y el tejido mesófilo y examinando las propiedades de intercambio de gases de la hoja. Esto se realiza utilizando microscopía, técnicas de obtención de imágenes in situ y mediciones en línea concurrentes de discriminación isotópica de C (Δ) y de CO2 y los flujos de agua que entran y salen de las hojas. La información sobre la regulación de genes y la red de genes en los que el ortólogo ERECTA opera en sus efectos sobre la eficacia de transpiración, se determina mediante el análisis de transcriptoma de un conjunto restringido de las líneas transgénicas con expresión de ERECTA alterada.

Tal como se describe en la presente memoria para A. thaliana y arroz, las correlaciones entre las mediciones fisiológicas y el número de copias o nivel de expresión de genes confirman el papel del ortólogo en conferir el fenotipo de eficacia de transpiración en trigo.

Ejemplo 15

Identificación de un ortólogo de maíz de ERECTA de A. thaliana

Se identificó inicialmente un secuencia de ADNc parcial de ortólogos del alelo ERECTA de A. thaliana (SEC ID nº: 1) en maíz in silico mediante búsqueda de homologías de la base de datos de proteínas del NCBI utilizando el programa BLAST en condiciones convencionales. Fue necesario, sin embargo, realizar búsquedas adicionales de bases de datos privadas con el fin de vincular las secuencias parciales identificadas en la base de datos del NCBI. La corrección de secuencias parciales ubicadas en la base de datos del NCBI fue también necesaria con el fin de generar un cóntigo correspondiente al ortólogo ERECTA de maíz.

La secuencia de entrada fue SEC ID nº: 2. Se presenta la secuencia de nucleótidos de un ortólogo de maíz en las SEC ID nº: 21 a 44, comprendiendo la proteína codificada la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº: 45.

Las secuencias expuestas en las SEC ID nº: 21 a 43 son secuencias de ADNc parciales. Se aisló la secuencia correspondiente del ortólogo de maíz (SEC ID nº: 44) mediante un examen de hibridación de ácido nucleico convencional de una biblioteca de ADNc de trigo.

Para confirmar el papel del ortólogo ERECTA de trigo en la eficacia de transpiración, se utilizan conjuntos de datos de expresión para estudios in silico de la expresión del gen ERECTA en una gama de tejidos de plantas de maíz que se hacen crecer en una gama de condiciones ambientales, proporcionando de ese modo indicaciones de especificidades de tejido en patrones de expresión y los datos preliminares sobre los tipos de ambientes en los que el ortólogo ERECTA es más probable que desempeñe un papel fisiológico en relación con el agua utilizada en estas especies. En estos estudios, el ácido nucleico que comprende la secuencia expuesta en SEC ID nº: 15, o una secuencia complementaria a la misma, se utiliza para producir sondas de hibridación y/o cebadores de amplificación.

Adicionalmente, se busca en las colecciones de mutantes de maíz etiquetadas con transposones para seleccionar aquéllos que presentan inserciones que afectan a la expresión del gen ERECTA y el nivel de expresión y/o número de copias del ortólogo ERECTA se correlaciona con la eficacia de transpiración en la gama de condiciones de crecimiento ambientales, esencialmente tal como se describe en la presente memoria para A. thaliana y arroz.

Adicionalmente, se introduce un gen ERECTA en la orientación sentido o antisentido en el maíz, produciendo de ese modo líneas de expresión transformadas. Los constructos génicos son específicamente para silenciar la expresión del gen ERECTA utilizando tecnología de ARN, o alternativamente, para expresar ectópicamente el marco de lectura abierto completo del gen.

Basándose en una función similar, también se introduce el marco de lectura abierto del gen ERECTA de A. thaliana (es decir, SEC ID nº: 1) en el material vegetal de maíz en la orientación sentido, expresando de ese modo ectópicamente ERECTA de A. thaliana en maíz.

Se introducen los constructos génicos en el maíz siguiendo uno cualquiera de varios procedimientos convencionales, tales como, por ejemplo, cualquiera de los procedimientos descritos por Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2(7), 603-618, 1990; la patente US nº 5.177.010 concedida a la University of Toledo; la patente US nº 5.981.840 concedida a Pioneer Hi-Bred; o la solicitud US publicada nº 20020002711 A1 (Goldman y Graves);. Por lo tanto, la transformación genética se utiliza para generar líneas de maíz con expresión alterada de un gen ERECTA.

Se producen de aproximadamente 30 a 40 transformantes diferentes, dependiendo de la eficacia del ARNi en reducir la expresión de ERECTA.

Se determina la eficacia de utilización de agua en las líneas T1 y/o T2 a través de (a) mediciones gravimétricas de aumentos de biomasa y agua transpirada; (b) discriminación isotópica de 13C en tejidos de la planta, (es decir, determinando Δ); y (c) contenido en ceniza del tejido de la planta.

Se analiza también el desarrollo de las hojas y los meristemos, especialmente con respecto a la diferenciación y anatomía de la epidermis, los complejos estomáticos y el tejido mesófilo y examinando las propiedades de intercambio de gases de la hoja. Esto se realiza utilizando microscopía, técnicas de obtención de imágenes in situ y mediciones en línea concurrentes de Δ y de CO2 y los flujos de agua que entran y salen de las hojas. La información sobre la regulación de genes y la red de genes en los que el ortólogo ERECTA opera en sus efectos sobre la eficacia de transpiración, se determina mediante el análisis de transcriptoma de un conjunto restringido de las líneas transgénicas con expresión de ERECTA alterada.

Tal como se describe en la presente memoria para A. thaliana y arroz, las correlaciones entre las mediciones fisiológicas y el número de copias o nivel de expresión de genes confirman el papel del ortólogo en conferir el fenotipo de eficacia de transpiración en maíz.

Ejemplo 16

Mecanismo de una eficacia de transpiración mejorada y herencia de ERECTA en Arabidopsis (contextos Landsberg y Columbia)

Se realizaron mediciones directas de la eficacia de transpiración (razón de la tasa de asimilación de CO2 con respecto a la tasa de transpiración) en contextos tanto Landsberg como Columbia. Para confirmar el papel de ERECTA en una gama más amplia de condiciones relevantes de manera agronómica, se determinaron las eficacias de transpiración de plantas transformadas que portan un alelo ERECTA en respuesta a las condiciones ambientales variables (es decir, agua en el suelo y contenido en iones, humedad atmosférica y niveles de CO2) y se compararon con la respuesta de plantas de tipo natural (por ejemplo, ER). Los resultados de estos experimentos se presentan en las figuras 6-11, y las tablas 8 y 9.

Los datos en las figuras 6 muestran que la eficacia de transpiración mejorada obtenida insertando un transgén que porta el alelo ER de tipo natural en el mutante Ld-er1 (línea T2+ER) se debe principalmente a una conductancia estomática disminuida. El fenotipo de la línea transgénica (T2+ER en los gráficos) es similar a la de un ecotipo Ld-ER casi isogénico a un Ld-er1 obtenido del Stock Centre (línea 3177 en los gráficos). La eficacia de transpiración aumentada en ER transgénico, en comparación con los niveles observados en línea ER del tipo natural se observa tanto en niveles de CO2 ambientales actuales como en niveles de CO2 aumentados que están dentro de los límites que está previsto que se produzcan a nivel mundial durante las próximas dos décadas.

Los datos en la figura 8 muestran que la conductancia estomática reducida en la línea transgénica T2 ER en comparación con la línea Ld-er1 está, por lo menos en gran parte, provocada por una densidad estomática reducida (reducción en el número de estomas por unidad de área en más de la mitad, hasta niveles similares a aquellos observados en el Ld-ER de tipo natural). Esta reducción en la densidad estomática es relativamente más alta que la que en la densidad de células epidérmicas cuya área superficial aumenta en sólo aproximadamente el 10%. Por tanto se deduce que el transgén ER ha afectado al desarrollo estomático, específicamente, y provocó una reducción en el índice estomático. Estos datos muestran complementación con respecto a los procesos que llevan a la variación en la eficacia de transpiración.

También se realizaron cruces recíprocos entre las dos líneas parentales NW20 (Ld-er1) y Col4 (Col-ER). La notación F2 (Col*Ld) se refiere a las plantas F1 en las que Col era el receptor de polen Ld, mientras que la notación F1 (Ld*Col) indica lo contrario (ovario Ld que recibe polen Col). Se ha realizado un análisis inicial de estos dos tipos de plantas F1 para determinar: las propiedades fotosintéticas y de intercambio de gases, la eficacia de transpiración (figura 7) y la composición isotópica de C (tabla 9), la tasa de desarrollo y la forma de la roseta, la anatomía de la epidermis de la hoja (figura 8), la fecha de floración, la inflorescencia y la forma de la vaina. Concordando con nuestros experimentos de análisis de complementación, los datos muestran que el gen ERECTA afecta a todos estos fenotipos y no sólo a la inflorescencia y la forma de la vaina.

Los datos también muestran una herencia compleja del gen ERECTA, de manera que el gen es dominante, sin efecto recíproco sobre la forma de la vaina (vainas más largas, tallos más largos y pedicelos en todas las plantas F1, similar a la parental Col-ER). Sin embargo, para otros rasgos, los resultados indican efectos maternales: por tanto los valores de eficacia de transpiración (véase la figura 7a) y composición de isótopos de carbono de rosetas en plantas F1 (tabla 9) son intermedios entre los valores parentales, pero diferentes entre los dos conjuntos de plantas F1: los valores para las plantas F1 (Col*Ld) están más próximos a los valores Col, mientras que aquéllos para las plantas F1 (Ld*Col) están más próximos a los valores para el parental Ld.

Los datos en la figura 8 indican que la conductancia estomática (transpiración por unidad de área de hoja, figura 8a) muestra valores próximos al parental Ld-er1 en todas las plantas F1, a pesar de que las densidades estomáticas están próximas a la del parental Col-ER (figura 8c). Esto muestra que el gen ER no sólo afecta al desarrollo de la epidermis sino también a la apertura estomática (dinámica de los estomas) y que aunque el efecto de ER sobre densidad estomática parece ser dominante, el efecto sobre la apertura estomática no lo es.

Los datos en la figura 9 muestran el efecto de diversas mutaciones er (en el contexto Col, mutantes obtenidos del Stock Centre o Dr Torii) en el número de estomas por unidad de área de hoja. Las densidades estomáticas para todos a excepción de dos de esos mutantes son mayores que las de las hojas de tipo natural ColER, y confirman el efecto del gen ERECTA sobre ese parámetro.

Los datos en la figura 10 muestran que se confirma una eficacia de transpiración mejorada en la línea transgénica ER en comparación con Lder1 nulo (sin inserción del transgén) mediante los valores de la composición isotópica de C menos negativos medidos en el material de la hoja (comparar valores para líneas NW20 y CS20 (Ld er1; líneas 16 y 17 en el eje de las x) y una línea ld-ER T2 transgénica, homocigótica para el transgén ER (línea 19 en la figura). Los valores isotópicos de C medidos en la línea transgénica ER son similares a aquéllos en los ecotipos Ld-ER casi isogénicos (línea 18 en la figura 10). Esto demuestra la complementación en este rasgo fenotípico, y valida una vez más la utilización de la composición isotópica de C como un indicador cuantitativo (sustituto) de la eficacia de transpiración.

Los datos en la figura 10 también las composiciones isotópicas de C de una gama de mutantes Col-er, incluyendo aquéllos que analizados en la figura 9 para determinar las densidades estomáticas. La mayoría de los mutantes muestran valores isotópicos de C más negativos que el ecotipo COL-ER. Estos concuerda con las densidades

5 estomáticas aumentadas descritas en la figura 9 y con todas las otras comparaciones de composiciones isotópicas de C o mediciones directas de eficacias de transpiración en las líneas er/ER y de nuevo indicativo del efecto positivo del alelo ER sobre la eficacia de transpiración.

Algunos mutantes en la figura 10 destacan, por ejemplo Col-er105, o línea 3140 (una línea de NASC que porta

10 mutaciones er1 y gl1-1). Como la información genética para estos mutantes está disponible (naturaleza y posición de las mutaciones) estos mutantes proporcionan información funcional muy útil funcional sobre el/los dominio(s) de proteína de la proteína ERECTA que son esenciales para conferir el fenotipo de eficacia de transpiración y los procesos subyacentes.

15 Se realizaron también mediciones directas de la eficacia de transpiración (razón de la tasa de asimilación de CO2 con respecto a la tasa de transpiración) en varios transformantes T2 generados en un contexto Columbia (es decir transformación del mutante er-105 y er-2/106 anterior). Los resultados de estas mediciones se muestran en la figura

11. Estos datos muestran que el fenotipo puede complementarse en un contexto Columbia, tal como se determina midiendo la eficacia de transpiración, tasas de asimilación de CO2 y transpiración. Se observa complementación en

20 condiciones tanto de humedad alta como de humedad baja, de ahí la demostración de que el gen ERECTA desempeña un papel en el control de la eficacia de transpiración en condiciones tanto de riego abundante como de sequía, y que la sobreexpresión de ese gen tiene el potencial para aumentar el crecimiento y la resistencia a la sequía y los estreses relacionados con la sequía.

25 Más particularmente, los datos en la figura 11 demuestran el papel del gen ERECTA sobre la eficacia de transpiración en una gama de humedades, incluyendo humedades bajas tales como las que prevalecen en áreas cálidas y secas:

-El mutante er-105 portador de una mutación inactiva de ERECTA (casi ningún transcrito ER) (cuadros negros 30 abiertos) en contexto Col0 presenta una eficacia de transpiración inferior a la del Col0 casi isogénico de tipo natural (triángulos abiertos).

-Este mutante se transformó con un transgén ER bajo el promotor 35S y se produjeron varias líneas T2 homocigóticas ER (círculos opacos). Aquellas líneas (5 transformantes independientes se incluyen en el gráfico)

35 presentan eficacias de transpiración muy aumentadas (del +40 al 70%) en comparación con las líneas nulas (cuadrados opacos) y similares a aquellas medidas para la línea ER-Col0 de tipo natural, en toda la gama de déficits de presión de vapor en las hojas con respecto al aire sometidos a prueba en los experimentos.

Adicionalmente, las líneas nulas que no son portadoras de ninguna inserción de transgén pero que fueron sometidas

40 a transformación y selección en antibióticos muestran valores similares como el mutante er-105 de partida lo que demuestra que estas manipulaciones por sí mismas no presentan efectos de confusión detectables sobre la eficacia de transpiración.

TABLA 1 45

Análisis QTL de discriminación de isótopos de carbono en las líneas endogámicas recombinantes de Lister y Dean

SERIE nº Condiciones experimentales: locus de chr2 (cM) Método de análisis QTL locus de chr4 (cM) CONCLUSIÓN

número de QTL: posición en el mapeo prevista

Serie 1 (40 líneas) Invernadero

12 h de duración de día: 58,5 SIM y CIM 2 chr2: 58,5-61,02

Irradiancia 150-350 µE m-2 s -1: 46,77 SIM y CIM chr2: 46,77-50,75

Plántulas transferidas de placas con agar: 61,02 SIM 108,5

Datos de la serie 1 pero con la utilización de diferentes marcadores

de 56,94 a 58,00: CIM y SIM 1

de 46,77 a 50,75: SIM

63,02

Serie 1 con diferente número de líneas

de 58,5 a 61,02: 2

56-61

TABLA 1

número de QTL: posición en el mapeo prevista

Serie 2 Invernadero septiembre de semillas sembradas en suelo

lote 1: 50,75 CIM (QTL cart) 2 chr2: 56,94-61,02

61,0 2: MQTL chr2: 50,75

lote 2: ?50,75 MQTL NS

lotes 3-5

todos los lotes: 58,5 MQTLcart NS

Serie 2: 56,94-58,5 MQTL

Serie 3 37 líneas: parentales y líneas con entrecruzamientos en el cromosoma 2 5 condiciones de crecimiento que difieren en humedad, irradiancia, modo de establecimiento (semillas sembradas en suelo o plántulas trasplantadas de agar)

lote B: 61,02-61,06 108 NS

lote C: 56,94-58,00

lote D: 63,02 QTLcar

63,02: MQTL

todos los lotes (condiciones): 58,5 lor 2 chr2: 56,94-58,5

61,02: 3 chr2: 61,02-63,02

Serie 4 mismas líneas que en la serie 3 cámaras de crecimiento 10 h de luz de día

50,74: chr2:
50,74

Serie 5 repetición de la serie 1 PERO TODAS las líneas

50,74: 1 chr2:
50,74

Serie 7 mismas líneas que en la serie 1 pero en cámara de crecimiento y luz más alta

10 h de duración de día: 46,77-50,75 CIM y SIM 1 chr 2: 46,77-5065

Serie 7 470-510 �E m-2 s -1 irradiancia

TABLA 2

Contexto: Mutación Nombre Stock Centre línea ER isogénica y nombre Stock Centre

Landsberg: er1 CS20 o NW20 a 3177 o CS163

Columbia: er2b/er106 3401 Col1 o 3176

Columbia: er105c Col3 con marcador gl1 o Col0

a, NW20 es un parental Ler para las líneas recombinantes de Lister y Dean, que porta la mutación er1. Las líneas 3177 o CS163 son las líneas ER isogénicas más próximas. b, er2 es un alelo er identificado por Rédéi en contexto Col. Coll o 3176 son las líneas casi isogénicas Col más próximas. La er2 es la misma mutación que la mutación er-106 notificada posteriormente por Torii y colaboradores (Lease et al. 2001) c, er105 se aisló a partir de una población de semillas Col sometidas a irradiación de neutrones rápida (Torii et al., 1996). d, Col4, el parental Col para el parental de Lister y Dean se incluyó sistémicamente en todas las comparaciones.

TABLA 3

Comparación de líneas er/ER tanto en contexto Col como Ld para los valores de discriminación de isótopos de carbono (por mil) en material de hoja en una gama condiciones ambientales

Serie nº: Diferencias en los valores de discriminación de isótopos de carbono medios (por mil)

(1) er-ER (todas las líneas): (2) er105Col0 (3) er105Col4 (4) er1053176 (5) er2-3176 (6) er1-3177 (7) er1-Col4 (líneas parentales para las RIL) (8) er105Coli (9) er1-Coli

1: 0,13 0,16 0,16

2: 0,89 1,18 1,18

3: 0,26 0,11 0,11

4: 1,12 1,60 1,60

5: 1,03 1,83 1,67 0,92 0,64 0,82 1,75 0,73

6: 0,70 1,13 1,01 0,71 0,27 0,74 0,73 0,95 0,73

7: 0,70 1,32 1,12 1,23 0,75 0,35 0,05 1,22 0,15

8: 0,59 1,16 1,11 1,19 0,54 0,28 0,06 1,16 0,17

9: 0,30 1,09 0,77 0,77 0,02 0,00 0,56 0,88 0,28

10: 0,56 1,05 0,94 0,87 0,38 0,39 0,33 0,95 0,36

11: 0,48 0,40 0,52 0,40 0,52

12: 0,36 0,82 1,31 1,08 0,33 0,05 0,07 1,07 0,01

13: 0,38 0,90 0,82 0,07 0,60 0,52 0,86 0,56

14: 0,65 1,42 0,60 0,58 0,06 1,01 0,32

15: 0,82 0,82 0,82

Para todas las series:

Media: 0,60 1,01 1,00 1,04 0,41 0,40 0,41 0,95 0,42

E.E.: 0,07 0,14 0,11 0,11 0,10 0,08 0,09 0,12 0,08

Para series comunes:

Media:: 0,58 1,10 1,12 1,04 0,41 0,38 0,39 1,11 0,37

E.E.: 0,08 0,05 0,11 0,11 0,10 0,09 0,10 0,10 0,09

TABLA 4Serie 9 de diciembre de 2001: Mediciones de intercambio de gases en las hojas en líneas de Arabidopsis er/ER

(1): (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)

Genotipo: E A Gw A/E pa pi pi/pa 1-pi/pa

(mmolH2 O/m 2 /s): (�molC/m 2 /s) (molm2 /s) (mmolC/molH2 O) (�bar) (�bar)

Fila (1): Ld—R 3177 Media 3,38 12,33 0,273 3,67 360 282 0,782 0,218

E.E.: 0,48 1,64 0,039 0,14 10 11 0,010 0,010

Fila (2): Ld-er NW20 Media 2,59 8,73 0,218 3,38 348 280 0,804 0,196

E.E.: 0,07 0,31 0,005 0,04 5 4 0,002 0,002

Fila (3): Col-ER 933 Media 3,41 13,55 0,291 4,06 350 270 0,772 0,228

E.E.: 0,40 1,16 0,040 0,22 4 7 0,020 0,020

Fila (4): Col-ER 3176 (col1) Media 2,23 10,13 0,180 4,55 346 254 0,734 0,266

E.E.: 0,50 1,47 0,048 0,24 5 9 0,021 0,021

Fila (5): Col-er er105 Media 2,27 8,55 0,198 3,76 356 283 0,795 0,205

E.E.: 0,03 0,17 0,005 0,07 11 10 0,006 0,006

Fila (6): Col-er er2 Media 3,06 11,90 0,256 3,92 357 279 0,780 0,220

E.E.: 0,22 0,56 0,027 0,12 1 6 0,014 0,014

CONCLUSIÓN:

Comparación Ld-ER/Ld-er: La línea er presenta una menor A/E con menor g y mayor A. La diferencia en A/E se debe a A

Comparación 933/NW20: NSW20 (er1) presenta una menor A/E con menor g y menor A

Comparación Col1/Ld-er1: La diferencia en A/E se debe a A

Comparación Col1/Col-er105: er105 presenta una A/E MUCHO menor con mayor g y menor Aes decir, la diferencia en A/E se debe a A y g

Comparación Col1/Col-er2: er2 presenta menor A/E con MUCHO mayor g y MAYOR Aes decir, la diferencia en A/E se debe a g y se opone o no se debe a A

NOTA: pa y pi son las presiones parciales ambiente e intercelular de CO2 , respectivamente.

TABLA 5

Serie experimental: LOD P(0,05) P(0,01) Hueco de cM en la posición QTL LOD-LODp0,05 R2 R2 total

1: 5,2861 4,7469 5,9923 39,32-50,65 0,5392 0,19 0,89

4: 3,519 3,3561 4,2134 50,63-50,65 0,1629 0,29 0,57

7: 9,6489 3,9627 4,9083 50,63-50,65 5,6862 0,53 0,77

9: 6,1748 4,2328 5,0278 46,77-50,65 1,942 0,44 0,81

10: Cero Qtl 3,6051 4,3889

16: 11,5132 3,188 3,8896 48,96-50,65 8,3252 0,64 0,65

2 (lote1): 5,5459 3,3264 4,2907 50,63-51,02 2,2195 0,26 0,40

LOD = log10 de la razón de probabilidades

TABLA 6

Tabla resumen de las líneas utilizadas para la caracterización funcional inicial y el análisis de efectos ER:

Ecotipo de contexto: Transformantes ER homocigóticos T2 estables Control er nulo

Col-er105: T8; T29; T19; T61 T18

Col-er106/er2/3401: T165; T169; T279; T290 T143

Ld-er1: T3-7K NW20

TABLA 7 TABLA 9

Composición de isótopos de carbono (por mil) de 3 hojas maduras, molidas conjuntamente, recogidas el 4/6/03 es decir 32 días tras la siembra a partir de rosetas todavía vegetativas

Transformantes homocigóticos ER T2: Transgénicos nulos (er) Mutante er de contexto

Línea:: T46 T29 -31,4 -31,2 T18 -32,2 Col-er105

Línea: Promedio: Ee:: T145 T165 T279 T290 -30,4 -31 -30,5 -30,8 -30,6 0,15 T154 T143 T247 -31,5 -32 -31,7 -31,7 0,12 Col er106/er2 /3401 -31,7

línea: T3-7K -30,4 Ld-er1 NW20 -31,3

10: TABLA 8

Línea de alelo erecta: Nombre de la línea Composición isotópica de C (por mil)

Serie 14: Err. est. Serie 18 Err. est.

Promedio
Promedio

Mutantes Col_er

102K: -29,4 0,011

103K: -29,0 0,10

105C: -31,4 0,12 -30,3 0,09

105KH: -30,2 -29,3 0,11

105KS: -29,8 0,07 -29,5 0,07

3401: -30 0,21 -29,4 0,05

106C: -30,2 0,04 -29,4 0,12

108K: -30,2 0,07 -29,5 0,06

111KH: -30,4 0 -29,5 0,11

111KS: -30,2 0,11 -29,7 0,12

114K: -30,2 0,11 -29,5 0,04

116K: -29,7 0,21 -29,0 0,13

117K: -29,7 0,18 -29,3 0,08

3140: -32,2 0,06

Col0_ER: 1093 -29,6 0 -29,0 0,10

Ld_er1: NW20 -30,0 0,25 -28,9 0,15

CS20: -29,9 0,08

Ld_ER Ld_er1 transgénico: 3177 -29,4 -28,2 0,09

+ ER de tipo natural: 3-7K -29,5 0,07 -28,4 0,10

Composición de isótopos de C (por mil)

Col-ER (línea 933): -28,1

F1 (Col*Ld): -28,5

F1 (Ld*COL): -29,3

Ld-er1 (línea NW20): -29,9

Listado de secuencias

5

<110> The Australian National University

<120> PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR PLANTAS QUE PRESENTAN UNA EFICACIA DE TRANSPIRACIÓN

MEJORADA Y PLANTAS PRODUCIDAS A PARTIR DEL MISMO 10

<130> 94948/MRO

<150> AU PS3339

<151> 2002-07-02 15

<160> 45

<170> PatentIn versión 3.1 20 <210> 1

<211> 3176

<212> ADN

<213> Alelo ERECTA de Arabidopsis thaliana 25 <400> 1

imagen2

imagen3

imagen1

<210> 2 5 <211> 976

<212> PRT

<213> Alelo ERECTA de Arabidopsis thaliana

<400> 2 10

imagen1

imagen3

<210> 3

<211> 3000 10 <212> ADN

<213> ERECTA de arroz

<400> 3

imagen3

imagen1

imagen3

<210> 4

<211> 999

<212>: PRT 10 <213> ERECTA de arroz

<400> 4

<210> 6

<211> 921

<212> PRT

<213> ERECTA de sorgo

<400> 6

<210> 7

<211> 2751

<212>: ADN 10 <213> Homólogo ERECTA de Arabidopsis thaliana

imagen4

imagen3

imagen1

5

<210> 5

<211> 2766

<212> ADN

<213> ERECTA de sorgo

10

<400> 5

imagen4

imagen3

imagen1

imagen5

imagen3

<400> 7

imagen1

imagen3

imagen1

5 <210> 8

<211> 932

<212> PRT

<213> Homólogo ERECTA de Arabidopsis thaliana

10 <400> 8

imagen1

imagen3

<210> 9

<211> 2901

<212> ADN

<213> Homólogo ERECTA de Arabidopsis thaliana

<400> 9

imagen6

imagen3

<210> 10

<211> 966 10 <212> PRT

<213> Homólogo ERECTA de Arabidopsis thaliana

<400> 10

imagen1

imagen3

imagen7

<212> ADN

<213> ERECTA de trigo parcial

<400> 11 10

imagen1

15 <210> 12

<211> 466

<212> ADN

<213> ERECTA de trigo parcial

20 <400> 12 <210> 13

imagen1

<211> 372 5 <212> ADN

<213> ERECTA de trigo parcial

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (62)..(62)

<223> no determinado

<400> 13

imagen4

imagen1

<210>: 14 20 <211> 357

<212> ADN

<213> ERECTA de trigo parcial

<400> 14

<210>: 15 30 <211> 314

imagen8

<212> ADN

<213> ERECTA de trigo parcial

<400> 15 35

imagen1

<210> 16

<211> 549

<212> ADN

<213> ERECTA de trigo parcial

<400> 16

imagen6

<210> 17 15 <211> 615

<212> ADN

<213> ERECTA de trigo parcial

<400> 17 20

imagen1

<210> 18

<211> 719

<212> ADN

<213> ERECTA de trigo parcial

<400> 18

imagen1

10 <210> 19

<211> 1346

<212> ADN

<213> ERECTA de trigo

15 <400> 19 5 <210> 20

imagen9

imagen1

<211> 448

<212> PRT

<213> ERECTA de trigo

10 <400> 20

imagen4

imagen3

<210> 21

<211> 1273

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 21

imagen6

15 <210> 22

<211> 100

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

20 <400> 22

imagen1

<210> 23 25 <211> 599

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<220>

<221> misc_feature

<222> (529)..(529)

<223> no determinado

<400> 23

imagen6

imagen1

<210> 24

15: <211> 436

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 24

20: imagen1

<210> 25

25: <211> 509

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 25

30

imagen1

imagen10

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 26 10

imagen1

<210> 27 15 <211> 103

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 27 20

imagen1

<210> 28

<211>: 458 25 <212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 28

<210> 29

<211>: 593 35 <212> ADN

imagen2

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 29

imagen3

<210> 30 10 <211> 206

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 30 15

imagen1

<210> 31

<211> 534 20 <212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 31

imagen8

<210> 32 30 <211> 527

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 32

imagen1

10 <210> 33

<211> 412

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

15 <400> 33

imagen1

20 <210> 34

<211> 533

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

25 <400> 34

imagen1

<210> 35

<211> 191

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 35

imagen6

<210> 36

<211> 683

<212> ADN 15 <213> ERECTA de maíz parcial

<400> 36

imagen9

imagen1

<210> 37 25 <211> 610

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 37 30 <212> ADN

imagen1

imagen11

<213> ERECTA de maíz parcial

<220> 10 <221> misc_feature

<222> (138)..(138)

<223> no determinado

<400> 38 15

imagen1

<210> 39

<211> 634 20 <212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 39

imagen8

<210> 40 30 <211> 558

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 40

imagen1

10 <210> 41

<211> 429

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

15 <400> 41 <212> ADN

imagen1

20

<210> 42

<211> 556

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz parcial

25

<400> 42

imagen1

imagen12

<213> ERECTA de maíz parcial

<400> 43 10

imagen1

15 <210> 44

<211> 2315

<212> ADN

<213> ERECTA de maíz

20 <400> 44

imagen1

imagen3

imagen1

10 15: <210> 45 <211> 675 <212> PRT <213> ERECTA de maíz

88

<400> 45

imagen3

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Procedimiento para seleccionar una planta que presenta una eficacia de transpiración mejorada, que comprende detectar un marcador genético para la eficacia de transpiración, comprendiendo dicho marcador un locus ERECTA en el genoma de la planta y seleccionar una planta que comprende o expresa el marcador genético, en el que el marcador genético comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia global de por lo menos 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas.
2.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el marcador genético comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a)

una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 55% con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº:3, SEC ID nº:5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº:12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº:14, SEC ID nº:15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº:17, SEC ID nº:18, SEC ID nº:19, SEC ID nº:21, SEC ID nº:22, SEC ID nº:23, SEC ID nº:24, SEC ID nº:25, SEC ID nº:26, SEC ID nº:27, SEC ID nº:28, SEC ID nº:29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº:32, SEC ID nº:33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº:36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº:38; SEC ID nº:39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº:42, SEC ID nº: 43 y SEC ID nº:44;

(b)

una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos 55% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 20 y SEC ID nº: 45; y

(c)

una secuencia complementaria a (a) o (b).
3.

Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la planta se selecciona de entre el grupo constituido por Arabidopsis thaliana, arroz, sorgo, trigo y maíz.
4.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende vincular el fenotipo de eficacia de transpiración de la planta a la expresión del marcador en la planta.
5.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende vincular un polimorfismo estructural en el ADN a un fenotipo de eficacia de transpiración en la planta.
6.

Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el polimorfismo está determinado por un proceso que comprende detectar un polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismo en la conformación de cadenas sencillas (SSCP) o análisis de microsatélites.
7.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende hibridar una sonda o cebador de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas con el ADN genómico de la planta, y detectar la hibridación utilizando unos medios de detección.
8.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la planta seleccionada presenta una eficacia de transpiración mejorada en comparación con una planta casi isogénica que no comprende o no expresa el marcador genético.
9.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección del marcador genético comprende:

(a)

cribar las líneas endogámicas recombinantes o casi isogénicas o mutantes de plantas para segregar los alelos en un locus ERECTA;e

(b)

identificar un marcador polimórfico ligado a dicho locus ERECTA.
10.

Procedimiento para modular la eficacia de transpiración de una planta que comprende introducir un gen ERECTA aislado o una variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas del mismo en una planta y seleccionar una planta que presenta una eficacia de transpiración diferente en comparación con una planta casi isogénica que no comprende el gen ERECTA o la variante alélica o la región que codifica para proteínas introducidos, en el que el gen ERECTA o la variante alélica o la región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia global de por lo menos 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas, en el que el gen ERECTA o la variante alélica o la región que codifica para proteínas se introduce en la planta mediante un proceso que comprende transformar material vegetal con un constructo génico que comprende el gen o la variante alélica o la región que codifica para proteínas del mismo.
11.

Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el gen ERECTA o la variante alélica o la región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(c)

una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 55% con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº:3, SEC ID nº:5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº:12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº:14, SEC ID nº:15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº:17, SEC ID nº:18, SEC ID nº:19, SEC ID nº:21, SEC ID nº:22, SEC ID nº:23, SEC ID nº:24, SEC ID nº:25, SEC ID nº:26, SEC ID nº:27, SEC ID nº:28, SEC ID nº:29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº:32, SEC ID nº:33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº:36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº:38; SEC ID nº:39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº:42, SEC ID nº: 43 y SEC ID nº:44; y

(d)

una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos 55% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 20 y SEC ID nº: 45.
12.

Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que la planta se selecciona de entre el grupo constituido por Arabidopsis thaliana, arroz, sorgo, trigo y maíz.
13.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende además expresar el gen o variante alélica o región que codifica para proteínas introducido en la planta.
14.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la eficacia de transpiración se mejora en la planta.
15.

Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la eficacia de transpiración se mejora como consecuencia de la expresión ectópica de un alelo ERECTA o la región que codifica para proteínas del mismo en la planta.
16.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la eficacia de transpiración se reduce en la planta.
17.

Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la eficacia de transpiración se reduce como consecuencia de la expresión reducida de un alelo ERECTA en la planta.
18.

Utilización de un gen ERECTA aislado o variante alélica o región que codifica para proteínas del mismo, que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos una identidad de secuencia global del 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas, en la preparación de un constructo genético para modular la eficacia de transpiración de una planta.
19.

Utilización según la reivindicación 18, en el que el gen ERECTA o la variante alélica o la región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a)

una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 55% con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35, SEC ID nº: 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38; SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43 y SEC ID nº: 44; y

(b)

una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos 55% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 20 y SEC ID nº: 45.
20.

Procedimiento para aumentar la resistencia de una planta a un estrés medioambiental que comprende mejorar el nivel de expresión de un gen ERECTA o una variante alélica del mismo o una región que codifica para proteínas del mismo en dicha planta, en el que el estrés medioambiental se selecciona de entre precipitaciones elevadas, precipitaciones reducidas o sequía, y en el que el gen ERECTA o la variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas del mismo comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia global de por lo menos 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas.
21.

Procedimiento para aumentar el peso de semilla o de grano en una planta que comprende mejorar el nivel de expresión en dicha planta de un gen ERECTA o variante alélica del mismo o región que codifica para proteínas del mismo que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia global de por lo

menos 55% con por lo menos 20 nucleótidos de longitud de cualquiera de las SEC ID nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 19 ó 21 a 44 o una secuencia complementaria a las mismas.
22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, en el que el nivel de expresión se mejora introduciendo un gen 5 ERECTA o una variante alélica del mismo o la región que codifica para proteínas del mismo en una planta
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que el gen ERECTA o la variante alélica o región que codifica para proteínas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

10 (a) una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 55% con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº:12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº: 28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 33, SEC ID nº: 34, SEC ID nº: 35,

15 SEC ID nº:36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38; SEC ID nº: 39, SEC ID nº: 40, SEC ID nº: 41, SEC ID nº: 42, SEC ID nº: 43 y SEC ID nº:44; y

(b) una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos

55% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, 20 SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 20 y SEC ID nº: 45.