CN117604155A - 一种筛选高愈伤诱导率油棕种质资源的snp分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种筛选高愈伤诱导率油棕种质资源的SNP分子标记及应用，属于植物遗传育种技术领域。本发明筛选获得一种与油棕愈伤诱导率关联的SNP位点，位于Chr12染色体第12704856位碱基，在SEQ ID NO：1所示序列的第501位存在A/G多态性，包括GG、AG、AA共3种基因型，其中GG基因型与油棕高愈伤诱导率显著相关。根据该位点多态性开发了基于PCR扩增的引物，经PCR扩增和电泳后，在212bp处没有条带时，供试油棕材料具有高愈伤诱导率。所述SNP分子标记可应用于快速筛选高愈伤诱导率的油棕种质资源，进一步用于组培育苗或生物育种，且不受取样条件限制、检测成本低、准确性高。
Description
技术领域
本发明属于植物遗传育种技术领域，特别涉及一种筛选高愈伤诱导率油棕种质资源的SNP分子标记及应用。
背景技术
油棕是热带木本油料作物，有“世界油王”的美称。油棕常规育种主要采用杂交育种，育种周期长，成本高。基于组织培养开展基因编辑等生物育种技术研究是发展趋势之一。油棕组培苗具有一致性好，产量高等优势。然而，组织培养具有基因依赖性，有些基因型的单株很难或者不能诱导出愈伤组织，限制了组织培养技术在油棕生物育种中的应用。因此挖掘与油棕愈伤诱导率关联的位点，并开发分子标记，可为分子标记辅助选择奠定基础，提高选择效率，加快品种改良进程。
全基因组关联分析(Genome-Wide Association Studies，GWAS)不需要构建作图群体，可以利用自然群体快速挖掘与性状关联的SNP标记。单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。相比早期RAPD、AFLP、SSR等分子标记，SNP分子标记具有在个体基因组上分布广泛、数量较多，易于基因分型、适于快速、规模化筛查等优势，并且可以转换成用PCR扩增的SNP标记，用于分子标记辅助选择。然而目前还没有关于油棕愈伤诱导率关联SNP分子标记的报道，无法利用分子标记筛选高愈伤诱导率的油棕种质资源，不利于油棕组织培养技术发展和无性系优良品种培育。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种筛选高愈伤诱导率油棕种质资源的SNP分子标记及应用，从而利用分子生物学手段实现对油棕种质资源的早期、快速鉴定。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种与油棕愈伤诱导率关联的SNP分子标记，所述SNP分子标记为：在SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第501位存在A/G多态性。
当油棕样本在该位点的基因型为GG时，该油棕样本愈伤诱导率显著高于其他基因型。
本发明提供了一种基于所述SNP分子标记的用于检测油棕愈伤诱导率的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。
本发明提供了一种检测油棕愈伤诱导率的试剂盒，包括所述引物和检测试剂。
优选的，所述检测试剂包括扩增缓冲液和标准品；所述标准品为核苷酸序列如SEQID NO:1所示的DNA分子。
本发明提供了所述SNP分子标记、所述引物或所述试剂盒在检测或预测油棕愈伤诱导率或油棕育种中的应用。
优选的，当油棕材料的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果在212bp处没有条带时，所述油棕愈伤诱导率较高；选择没有条带的油棕材料用于后续育种。
本发明提供了一种基于所述SNP分子标记辅助选育高愈伤诱导率油棕品种的方法，包括以下步骤：
1)提取待选育材料的基因组DNA；
2)以步骤1)中获得的基因组DNA为模板，以所述引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)将步骤2)中所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果在212bp处没有条带材料，说明待选择材料的油棕具有较高愈伤诱导率的性状，作为育种材料用于后续育种。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增的反应体系为：
2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μl
10μM正向引物0.5μl
10μM反向引物0.5μl
DNA模板1μl
ddH2O 8μl。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增的反应程序为95℃3min；94℃25s、53℃25s，72℃5s，32个循环；72℃5min。
本发明的有益效果：
本发明提供一个与油棕愈伤诱导率关联的SNP分子标记，其位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列上，自该序列5'端起第501位碱基为SNP位点；该SNP位点位于Chr12染色体第12704856碱基处。基于GWAS分析方法筛选获得所述SNP分子标记与油棕愈伤诱导率显著相关(P<0.05)，具有A/G多态性，并且经过实验验证，GG基因型(在212bp处没有条带)与油棕高愈伤诱导率极显著相关。
本发明提供的基于所述SNP分子标记辅助选育高愈伤诱导率油棕种质资源的方法，以含有所述SNP分子标记的核苷酸序列为模板设计引物对，以油棕基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得212bp长度的扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳，当在212bp处没有条带时，说明该材料具有高愈伤诱导率性状。本发明提供的方法有助于快速筛选高愈伤诱导率的油棕种质资源，提高组织培养成功率，缩短新品种培育周期，且不受取样条件限制、检测成本低、准确性高。
附图说明
图1为本发明中与油棕愈伤诱导率显著相关的SNP标记的曼哈顿图；
图2为本发明中与油棕愈伤诱导率显著相关的SNP标记所在Chr12染色体局部区间的曼哈顿图和连锁不平衡单倍型块图，其中区间内最右侧标记为本发明筛选的分子标记；
图3为本发明中与油棕愈伤诱导率显著相关的SNP标记不同基因型间的愈伤诱导率差异比较，GG基因型与高愈伤诱导率显著相关。
图4为本发明中当油棕材料基因型为GG时(愈伤诱导率较高)，用SNP分子标记C1-SNP12-W的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳时，在212bp处没有条带。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种与油棕愈伤诱导率关联的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第501位，该位点存在A/G多态性。
SEQ ID NO:1：
CATGTTCGAAGAATCGTTGATCCTTCGAGAGTTTCTAGCCGATATGCACCCAGTCTAAAAGTTTCAGATATTCTGTAAGGTCCTTCCCAGTTCAGAGATAGTTTTTCTTGATTCAAGGATTTTGAGACTTCTGCTTTTCTTAAGACCAAATCTCCTGATCAGAAGACCTTTGGCTTGACTCTTGTATTATAATATCGGACTATCCTTTGTCGATATGTAGCCATTCGAACTTGAGCTTGCTGTTGGAGTTCTAGAAGGAGATCTAAGTCGACTCTCTGATATTCAAAGTTGTTCGGTTCACTATATTATTCGACTCTTGTTGATGGCAATCCGATCTCGAGCAGCATCATTGCTTTTATCCCATAAGCTAAATTGAAGGAGAATTCTCTAGTCGGTATGTGGAGAGTCATTTGATACGTCCATAAGATCGGATATAGTTCTTCCACCCAGAGGCCTTTGGCTTCATTCAGTTGGATTTTTCGCCCGTGCAGAATTATCTGGTTATTTTCTTCCACCTCACCATTTGATTGTGGATAGCCGACTGACGTGAGTTTATGCGTAATATGAAATTTCGCACAAAACTCTCTAAAATTTTGGTTGTCAAATTATCTACCATTGCGATGATGATGGTGTGTGACAAATCGAATCTGTAAATGATGAATTTCTGAATGAAGTCTTCCATCTTGCTTTCAGTGATTTGCATCAGAGATTCGGCTTCTACCTATTTGGTAAAGTAGTCCATGACAATCACTGAATTTTTTTTGACTAAATACCGAAGAAAAAAGACCAAGTATGCCAATTTCCCATTGCACAAAGGGCCATGATGCTACAATCGATGTCAGATGACTAGCTGGTTGATGTTGTATATTTACATATTTTTGACATGGTTCACACCTTCGAACGAGTTCGGTTGCATCATTTTTCATGGTGGGCCAATAATATCCTTGTCATAGAATTTTATAAGTCAGAGACTTGCCCCCTAAGTAATTTTCACAAATTCC。
本发明提供了一种基于所述SNP分子标记检测油棕愈伤诱导率的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：2(CCCGTGCAGAATTATCTAA)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:3(ACTGAAAGCAAGATGGAAGA)所示的反向引物。本发明对所述引物的来源没有特殊限制采用本领域所熟知的引物来源即可。在本发明实施例中，所述引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明提供了一种筛选高油棕愈伤诱导率材料的试剂盒，包括所述引物和检测试剂。
在本发明中，所述检测试剂优选包括扩增缓冲液和标准品。所述扩增缓冲液优选为PCR扩增MIX液。本发明对所述扩增缓冲液的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的扩增缓冲液即可。在本发明实施例中，所述扩增缓冲液购自北京聚合美生物科技有限公司。所述标准品为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子。所述标准品作为Marker用于指示目标扩增条带。
基于所述SNP分子标记与油棕愈伤诱导率显著相关，因此，本发明提供了所述SNP分子标记、所述引物或所述试剂盒在检测或预测油棕愈伤诱导率或油棕育种中的应用。
在本发明中，当油棕材料的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果在212bp处没有条带材料，说明待选择材料的油棕具有较高愈伤诱导率。选择在212bp处没有条带材料的油棕材料用于后续组培育苗或生物育种。
本发明提供了一种基于所述SNP分子标记辅助选育高愈伤诱导率油棕种质资源的方法，包括以下步骤：
1)提取待选育材料的基因组DNA；
2)以步骤1)中获得的基因组DNA为模板，以所述引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)将步骤2)中所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果在212bp处没有条带材料(基因型为GG)，说明待选择材料的油棕具有较高愈伤诱导率的性状，可用于后续组培育苗或生物育种。
本发明在SNP分子标记筛选时是以从马来西亚、尼日利亚、哥斯达黎加、中国海南等地收集到的198份油棕为研究材料，经过GWAS分析筛选获得。可见本发明是以世界上存在的众多的油棕种质资源为基础筛选获得的SNP分子标记。因此，理论上本发明提供的方法适用于大部分油棕种质资源。
本发明对提取待选育材料的基因组DNA没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取植物DNA的方法即可，例如试剂盒法或CTAB法。在本发明实施例中，采用试剂盒法提取待选育材料的基因组DNA。所述试剂盒为天根植物基因组DNA提取试剂盒，购自天根公司。提取基因组DNA后，利用超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测DNA的含量以及完整性。经过验证表明，电泳条带清晰、胶孔内无明显蛋白质残留，OD260/OD280介于1.8～1.9，浓度大于>100ng/μL的DNA样品进行后续检测。
检测合格后，本发明以所述基因组DNA为模板，以所述引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系为：
2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μl
10μM正向引物0.5μl
10μM反向引物0.5μl
DNA模板1μl
ddH2O 8μl。
所述PCR扩增的反应程序为95℃3min；94℃25s、53℃25s，72℃5s，32个循环；72℃5min。本发明对所述PCR扩增所用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的PCR仪即可。PCR扩增结束后，优选将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
本发明提供了一种与油棕愈伤诱导率关联的SNP分子标记，有助于快速检测高愈伤诱导率大量油棕种质资源，用于组培育苗或生物育种。
下面结合实施例对本发明提供的一种与油棕愈伤诱导率关联的SNP分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.油棕全基因组SNP标记开发
将从马来西亚、尼日利亚、哥斯达黎加、中国海南等地收集到的198份油棕，保存于中国热带农业科学院文昌基地，土壤肥力中等、无病虫害，树龄12年，取第14片叶处的未成熟雄花序用于愈伤诱导，收集接种于培养基后1个月的愈伤诱导率表型性状数据，表型性状数据经Excel2016整理后用于后续分析。
从油棕未成熟雄花序上取新鲜幼嫩组织1～2g，液氮研磨后按照选用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取油棕材料DNA。利用超微量分光光度计及1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量和浓度，选择电泳条带清晰、胶孔内无明显蛋白质残留，OD260/OD280介于1.8～1.9，浓度大于>100ng/μL的DNA样品进行建库测序。
采用超声波破碎(或酶切)的方法，将DNA随机打断成300bp左右的片段，DNA片段经末端修复、3'端加A、加测序接头偶、纯化、PCR扩增完成测序文库的构建。文库经质检合格后通过华大基因DNBSEQ平台进行测序。测序数据下机后需要按一定的标准对原始数据(Rawreads)进行质控，过滤标准如下：(1)去除带接头(adapter)的序列，(2)去除单端序列含氮量>10％的一对序列，(3)去除低质量碱基数超过50％的一对序列。去除低质量序列、接头序列、不准确序列后的Clean reads进行下一步序列比对。参考基因组选择非洲油棕基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_000442705.1/)，使用BWA mem软件将Clean reads与参考基因组序列比对，使用samtools软件对比对结果排序，GATK4.0软件去除PCR重复序列后进行变异检测，以QD>2.0，QUAL>30.0，FS<60.0，MQ>40.0的硬标准过滤变异合集，保留具有统计学意义的变异位点数据集。按MAF(次等位基因频率)>＝0.05，miss(缺失率)<＝0.2为标准再次过滤变异位点，获得高质量的变异位点合集。
2.GWAS分析油棕愈伤诱导率关联SNP位点
利用基因组DNA区间特征描述文件对变异位点进行注释，分别统计落于基因编码区、非编码区、基因间区、非同义突变等变异位点的数量。通过群体结构分析获得群体亲缘关系矩阵后，结合表型性状数据进行全基因组关联分析，如图1和图2所示，在Chr12染色体检测到与油棕愈伤诱导率显著相关(log10(P value)>9)、大小为29kb的连锁不平衡区域。
筛选候选标记基于GWAS分析中关联到的区域内的SNP标记，比较等位基因频率、性状差异、基因表达量差异，结果见表1。在Chr12染色体12704827-12704856区域筛选到与油棕愈伤诱导率显著相关的SNP位点(图3)，其中GG基因型与油棕高愈伤诱导率显著正相关(P<0.05)。
表1群体中分子标记不同基因型个体数和愈伤诱导率平均值
| SNP位点 | 基因型 | 个体数 | 愈伤诱导率(％) |
| Chr12_12704856 | AA/AG | 172 | 2.86b |
| Chr12_12704856 | GG | 13 | 18.84a |
注：字母a、b表示在P＝0.05水平下显著相关。
实施例2
以包含实施例1筛选获得的油棕愈伤诱导率显著相关的SNP位点(Chr12_12704856(A/G))的序列为模板，利用Primer 5.0软件设计一对引物，引物序列如下：
正向引物：CCCGTGCAGAATTATCTAA(SEQ ID NO:2)；
反向引物：ACTGAAAGCAAGATGGAAGA(SEQ ID NO:3)。
利用上述引物对对待筛选的材料的基因组DNA进行普通PCR扩增，扩增体系如下：2X M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μl；10μM正向引物0.5μl；10μM反向引物0.5μl；DNA模板1μl；ddH2O 8μl。PCR扩增的反应程序为95℃3min；94℃25s、53℃25s，72℃5s，32个循环；72℃5min。得到212bp的DNA片段后，进行琼脂糖凝胶电泳，如果在212bp处没有条带(基因型为GG)，说明待选择材料的油棕具有较高愈伤诱导率的性状(图4)。由此，可以达到检测或预测愈伤诱导率，进而对愈伤诱导率进行有效选择，加速高愈伤诱导率油棕品种选育的进程。
实施例3
为验证本发明中所述SNP标记实用性，从中国热带农业科学院文昌基地油棕种植区随机挑选30株油棕(不包括用于SNP标记开发的198份油棕)，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和油棕愈伤诱导率调查。
表2 30株油棕SNP标记C1-SNP12-W检测结果和愈伤诱导率统计
| 212bp处条带有无 | 基因型 | 材料数 | 愈伤诱导率(％) |
| 有 | AA/AG | 19 | 4.96b |
| 无 | GG | 11 | 22.08a |
注：字母a、b表示在P＝0.05水平下显著相关。
由表2可知，SNP标记C1-SNP12-W在212bp处没有条带(GG基因型)时，与油棕高愈伤诱导率显著正相关(P<0.05)。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种与油棕愈伤诱导率关联的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为：在SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第501位存在A/G多态性。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，当油棕样本的基因型为GG时，该油棕样本愈伤诱导率显著高于其他基因型。
3.用于检测油棕愈伤诱导率的引物，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。
4.一种检测油棕愈伤诱导率的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述引物和检测试剂，所述检测试剂包括PCR扩增缓冲液和标准品；所述标准品为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子。
5.权利要求1所述SNP分子标记、权利要求2所述引物或权利要求3-4任一项所述试剂盒在检测或预测油棕愈伤诱导率中的应用。
6.权利要求1所述SNP分子标记、权利要求2所述引物或权利要求3-4任一项所述试剂盒在油棕育种中的应用。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，当油棕材料的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳时，在212bp处没有条带时，所述油棕愈伤诱导率较高。
8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，当油棕材料的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳时，在212bp处没有条带时，所述油棕愈伤诱导率较高；选择没有条带的油棕材料用于后续育种。
9.一种基于权利要求1所述SNP分子标记辅助选择高愈伤诱导率油棕种质资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待选育材料的基因组DNA；
2)以步骤1)中获得的基因组DNA为模板，以权利要求2所述引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)将步骤2)中所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果在212bp处没有目标条带，说明该材料具有高愈伤诱导率的潜力，将其用于后续育种。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增的反应体系为
2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μl
10μM正向引物0.5μl
10μM反向引物0.5μl
DNA模板1μl
ddH2O 8μl；
步骤2)中所述PCR扩增的反应程序为95℃3min；94℃25s、53℃25s，72℃5s，32个循环；72℃5min。
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