CN107058306A - 与豌豆抗白粉病等位基因er1‑9共分离的分子标记及其应用 - Google Patents

与豌豆抗白粉病等位基因er1‑9共分离的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供与豌豆抗白粉病等位基因er1‑9共分离的分子标记，该分子标记位于豌豆遗传图谱第VI连锁群上，与等位基因er1‑9的遗传距离为0cM。本发明根据感病品种坝豌6号中感白粉病基因PsMLO1与抗病资源G0004400中同源PsMLO1(er1‑9)的cDNA序列比对，er1‑9的928处，T碱基缺失，利用竞争性等位基因特异性PCR技术设计引物，开发了与豌豆抗白粉病等位基因er1‑9共分离的分子标记。经抗病资源G0004400与感病品种坝豌6号杂交衍生的F2群体检测，验证该标记为与基因er1‑9共分离的共显性标记。本发明的分子标记可用于豌豆抗白粉病的分子标记辅助选择育种，加速育种进程。

Description

与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及植物病理学、遗传育种及分子生物学检测技术领域，具体地说，涉及一种与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记及其应用。
背景技术
由豌豆白粉菌(Erysiphe pisi D.C.)引起的豌豆白粉病是世界性豌豆病害(Nisar et al.,2011；Fondevilla et al.,2012)。防治豌豆白粉病最为经济、有效且环境安全的方法是种植抗病品种。目前，国外已经鉴定了大量的抗白粉病豌豆资源，并在抗性资源中鉴定了3个独立遗传的抗白粉病基因(er1，er2，Er3)(Harland et al.,1948；Heringaet al.,1969)，而大量抗性资源筛选和遗传分析结果表明，许多不同地理起源的抗白粉病豌豆资源的抗性均由er1基因控制(Tiwari et al.,1997；Ghafoor et al.,2012；Liu etal.,2003；Vaid et al.,1997)。er1基因具有广谱、持久抗性，已在欧洲、北美洲及澳大利亚的豌豆育种中广泛应用(Fondevilla et al.,2007)。抗病基因er1和er2分别被定位在豌豆遗传图谱的第6连锁群(LG VI)(Timmerman et al.,1994)和第3连锁群(LG Ⅲ)(Katoch etal.,2010)。
最近研究发现，豌豆抗白粉病基因er1是由感病基因PsMLO1功能丧失而产生的(Humphry et al.，2011；Pavan et al.,2011)。在自然和诱变条件下，豌豆感白粉病基因PsMLO1的序列发生碱基缺失、插入、替换等导致不同的er1等位基因产生，目前已经鉴定了7个er1等位基因即er1-1、er1-2、er1-3、er1-4、er1-5、er1-6和er1-7(Humphry et al.,2011；Pavan et al.,2011；Sun et al.,2016a；Sun et al.,2016b)。除了er1-2是由大片段的插入和缺失产生的，其他6个等位基因都是由单碱基或小片段的插入、缺失或替换产生的。随着分子标记技术在分子辅助育种中的广泛应用，基于不同的分子标记技术，开发了已鉴定的er1的7个等位基因的功能标记(Pavanet al.,2013；Sun et al.,2016a；Sun etal.,2016b)，其中功能标记er1-6和er1-7的有效性已被验证。近年来，KASP(Kompetitiveallele specific PCR)即竞争性等位基因特异性PCR技术，是近几年兴起的一种新的SNP分型方法，具有准确性高、灵活性强和成本低等特点，已经在多种植物上被广泛应用于高通量的SNP分型以及InDels检测(Semagn et al.,2014)。
最近研究人员在豌豆资源中筛选出了一些白粉病免疫资源(王仲怡等，2012)。通过PsMLO1同源序列分析在豌豆资源G0004400中鉴定了一个新等位基因er1-9，该基因在PsMLO1cDNA序列开放阅读框第928碱基处发生突变，T碱基缺失，这一碱基缺失突变导致第310个氨基酸由丝氨酸(S)变为亮氨酸(L)，从而引起PsMLO1蛋白功能的变化。为了通过分子辅助选择快速、高效的将er1-9应用于育种中，，开发与er1-9共分离的功能性分子标记成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记，所述分子标记位于豌豆遗传图谱第VI连锁群上，与er1-9的遗传距离为0cM，用于扩增所述分子标记的3条特异性引物具有如下核苷酸序列：
正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC
正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT
通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA。
本发明提供了上述分子标记在豌豆抗白粉病的分子标记辅助选择育种中的应用。
本发明提供了用于扩增与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记的引物组合，其含有：
正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC
正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT
通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA。
本发明提供了上述引物组合在豌豆抗白粉病的分子标记辅助选择育种中的应用。
本发明提供了上述分子标记或引物组合在鉴定豌豆抗白粉病种质资源中的应用。
具体为，采用PCR扩增待测豌豆的基因组DNA，当扩增产物长度为75bp时，待测豌豆为含有er1-9的抗白粉病豌豆；当扩增产物长度为79bp时，待测豌豆为不含有er1-9的抗白粉病或感白粉病豌豆。
本发明提供的上述分子标记或引物组合在鉴定豌豆抗白粉病种质资源中的应用，具体包括以下步骤：
1)提取待测豌豆的基因组DNA；
2)以待测豌豆的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应；所述特异性引物为：
FAM正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC
HEX正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT
COM通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA；
3)利用KASP分析技术检测PCR扩增产物。
其中，步骤2)中PCR扩增反应使用的扩增体系以5μl计为：豌豆基因组DNA 2.0μl(10ng/μl)，KASP Master Mix 2.5μl，混合引物0.07μl，ddH2O 0.43μl。
步骤2)中进行PCR扩增反应的条件为：95℃热激活15分钟；95℃变性20秒，65-55℃退火和延伸25秒，10个循环，每循环降低1.0℃；95℃变性10秒，56℃退火和延伸60秒，30个循环。
步骤3)中利用KASP分析技术检测PCR扩增产物，利用LGC系统的SNPline平台进行SNP分型检测。所有含有等位基因er1-9的豌豆资源均出现在红色散点区域，该基因具有FAM标签序列，其基因型为--，而不含有等位基因er1-9的抗病资源和感白粉病豌豆资源均出现在蓝色散点区域，该基因具有HEX标签序列，其基因型为TT，杂合材料均出现在绿色散点区域，该基因具有FAM和HEX两种标签序列，同时具有两种标签的基因型为T-。
本发明还提供了用于检测抗白粉病豌豆资源的试剂盒，所述试剂盒中含有本发明所述述的特异性引物组合。
进一步地，步骤3)的PCR扩增反应使用的扩增体系以5μl计为：豌豆基因组DNA 2.0μl(10ng/μl)，KASP Master Mix 2.5μl，混合引物0.07μl，ddH2O 0.43μl。
PCR扩增反应的条件为：95℃15分钟；95℃20秒，65-55℃25秒，10个循环(每循环降低1.0℃)，95℃10秒，56℃60秒，30个循环。
在本发明的实施例中，利用KASP分析技术检测PCR扩增产物，所有含有等位基因er1-9的豌豆资源均扩增出75bp的片段，经KASP分析检测其结果均出现在红色散点区域，而其他不含有等位基因er1-9的抗白粉病和感白粉病豌豆资源均扩增出79bp的片段，经KASP分析检测其结果均出现在蓝色散点区域。
本发明还提供用于PCR检测抗白粉病豌豆资源的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的用于PCR扩增所述分子标记的特异性引物对。
优选地，所述试剂盒还包括KASP Master Mix和ddH2O、标准阳性模板等中的至少一种。
本发明进一步提供所述的试剂盒在植物分子标记辅助育种中的应用。
具体地，本发明的与豌豆抗白粉病er1等位基因er1-9共分离的分子标记是通过以下方法获得的：
利用抗病资源G0004400与感病品种坝豌6号同源的PsMLO1 cDNA序列的SNP差异(T碱基缺失)，基于KASP技术在同源的PsMLO1 cDNA序列SNP突变位点两侧分别设计KASP特异性引物，开发与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记，随后，将该标记用于鉴定抗病亲本G0004400与感病亲本坝豌6号杂交衍生的F2群体的各个单株的基因型，通过KASP技术分析，该标记在F2群体中出现三组明显不同的散点区域，分别对应于纯合抗病基因型、纯合感病基因型和杂合基因型三种类型。这三种基因型与该F2群体衍生的F3群体的各个家系表现型一一对应，证明该标记为与抗病基因er1-9共分离的分子标记。随后，将所述分子标记用于鉴定豌豆抗白粉病资源。结果表明，所述分子标记能够有效区分出含有抗白粉病等位基因er1-9的豌豆资源。本发明为豌豆抗白粉病分子辅助选择育种提供分子标记，从而加速豌豆抗白粉病育种工作进程。
具体实施方案：
(1)er1-9的功能分子标记开发
根据含有er1-9的抗病资源G0004400和感病品种坝豌6号的同源PsMLO1序列比对结果，G0004400的cDNA与坝豌6号的cDNA序列之间存在单碱基差异(928处，T碱基缺失)，利用KASP技术在序列SNP突变位点两侧设计KASP的三个特异引物，包括两个正向引物，一个共用反向引物，开发功能性标记。引物设计及合成由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司完成。
首先，用G0004400和坝豌6号及20个F2单株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，根据基因分型检测引物的有效性，如果能明显区分出3组不同的散点区域，证明是有效的。随后将开发的的分子标记用于鉴定抗病亲本G0004400和感病亲本坝豌6号杂交衍生的F2群体的119个单株的基因型。发现该标记在F2群体中形成明显不同的三组散点区域，分别对应于纯合抗病、纯合感病和杂合三种基因型，这三种不同的散点区域与F3群体的性状表现型一一对应(图1)，这表明所述分子标记是与er1-9共分离的共显性功能标记。
(2)功能分子标记的应用
将开发的分子标记在豌豆抗白粉病资源鉴定中进行应用和功能验证。结果表明，在所有检测的豌豆资源中，PCR产物经KASP技术分析，只有含有抗白粉病等位基因er1-9的豌豆资源G0004400出现在红色散点区域(图2)。而含有其它er1等位基因er1-1(Tara、Cooper、云豌8号)、er1-2(X9002、须菜1号、云豌21、云豌23)、er1-4(YI)、er1-6(G0001778、G0001752、G0001763)、er1-7(DDR11)的豌豆资源以及80份感病资源(坝豌6号、陇豌1号、奇珍76等)均出现在蓝色散点区域。分析结果证明所述分子标记能够准确区分含抗病等位基因er1-9的豌豆资源。此结果验证了所述分子标记在豌豆抗白粉病资源鉴定中的有效性。
本发明开发了与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记，该抗病基因er1-9是在引进豌豆资源中鉴定的，对我国豌豆白粉病具有广谱抗性，可有效控制我国豌豆白粉病的发生，减轻该病害造成的产量损失。基于PCR扩增和KASP分析技术，将与该基因共分离的分子标记有效的应用到分子标记辅助育种中；KASP具有高通量、操作简便、成本低等优点；本发明利用KASP技术开发的分子标记在豌豆生产、育种工作和抗病机理的研究中具有重要价值。其优点在于：
(一)本发明的与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记，是在G0004400及其抗性稳定的杂交后代家系中获得并验证的功能标记。可有效应用于豌豆抗白粉病资源鉴定和豌豆抗白粉病后代群体的分子标记辅助育种。
(二)利用本发明的与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记，能够成功鉴定含抗白粉病基因er1-9的豌豆资源，从而证明该分子标记在豌豆抗白粉病资源鉴定中具有有效性。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用KASP技术分析与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记在抗病资源G0004400和感病品种坝豌6号杂交衍生的F2群体所有单株的基因型散点图；其中，1为红色散点区，红色点为纯合抗病基因型--，2为绿色散点区，绿色点为杂合基因型T-，3为蓝色散点区，蓝色点为纯合感病基因型TT。
图2为本发明实施例2中利用KASP技术分析与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记在12份已明确豌豆抗白粉病基因的豌豆抗病资源及80份豌豆感病资源中形成的基因型散点图；其中，1为红色散点区，红色点为er1-9的基因型--，3为蓝色散点区，蓝色点为非er1-9的基因型TT。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本实施例所采用的豌豆种质资源均来自国家种质资源库。
实施例1 与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记的开发
根据豌豆抗白粉病资源G0004400和感病品种坝豌6号的基因PsMLO1的cDNA序列及野生型PsMLO1序列比对结果，发现G0004400含有一个新的等位基因er1-9，该等位基因在的PsMLO1序列开放阅读框第928处发生单碱基(T)缺失，利用KASP技术开发用于PCR扩增所述分子标记的特异性引物，包括3种特异性引物(正向引物1、正向引物2和共用反向引物)，如下，在抗感亲本上扩增产物大小分别为75bp和79bp；
FAM正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC
HEX正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT
COM通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA
引物设计及合成由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司完成。
首先用G0004400和坝豌6号和20个F2群体单株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，检测引物的有效性。
PCR扩增反应使用的扩增体系以5μl计为：豌豆基因组DNA 2.0μl(10ng/μl)，KASPMaster Mix 2.5μl，混合引物0.07μl，ddH2O 0.43μl。
PCR扩增反应的条件为：95℃15分钟；95℃20秒，65-55℃25秒，10个循环(每循环降低1.0℃)，95℃10秒，56℃60秒，30个循环。
利用KASP技术检测PCR产物在抗、感亲本及衍生F2群体的基因型。KASP分析结果显示分子标记在抗、感亲本及20个F2单株间形成三组明显不同的散点区域，分别代表三种基因型。表明分子标记在抗、感品种间具有多态性。随后将该分子标记进行F2整个群体(119个单株)验证，通过KASP技术分析，群体中出现三组明显不同的散点区域，这三组颜色不同的散点区域分别对应于纯合抗病、纯合感病和杂合三种基因型(图1)。并且标记在F2群体中的分离模式通过X2检验，符合1:2:1比例，表明所述分子标记为共显性标记。三组散点区域分别与F3群体的纯合抗病、纯合感病和抗感分离的株系的表现型一一对应，这表明该分子标记是与抗病基因er1-9共分离的功能标记。通过mapmaker 3.0软件计算遗传连锁距离，使用MapDraw构建遗传连锁图谱。该标记与抗病基因er1-9的遗传距离为0cM，所述分子标记是与er1-9共分离的功能标记。
实施例2 与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记的应用
将开发的er1-9的功能性分子标记在97份已明确抗白粉基因的豌豆资源上进行应用和功能验证。结果表明，所述分子标记在所有检测的抗病和感病豌豆资源中呈现出两组明显不同的散点区域。通过KASP分析技术，含有抗病等位基因er1-9的豌豆资源G0004400出现在红色散点区域(图2)。含有其它er1等位基因er1-1(Tara、Cooper、云豌8号)、er1-2(X9002、须菜1号、云豌21、云豌23)、er1-4(YI)、er1-6(G0001778、G0001752、G0001763)、er1-7(DDR11)以及80份感病资源(坝豌6号、陇豌1号、奇珍76等)均出现在蓝色散点区域(图2)。结果表明该标记利用KASP分析技术能够准确鉴定出含抗病基因er1-9的豌豆资源。此结果验证了所述分子标记在豌豆抗白粉病资源鉴定中的有效性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记及其应用
<130> KHP171111433.2TQ
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgttatatgg gcagggtggt atc 23
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttttgttata tgggcagggt ggtatt 26
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caaaatgtag attatgctta caattagtgg a 31
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 豌豆
<400> 4
tgttatatgg gcagggtggt atcttattat tggcttccat ttcttccact aattgtaagc 60
ataatctaca ttttg 75
<210> 5
<211> 79
<212> DNA
<213> 豌豆
<400> 5
ttttgttata tgggcagggt ggtattctta ttattggctt ccatttcttc cactaattgt 60
aagcataatc tacattttg 79

Claims (10)

1.与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于豌豆遗传图谱第VI连锁群上，与er1-9的遗传距离为0cM，用于扩增所述分子标记的3条特异性引物具有如下核苷酸序列：
正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC
正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT
通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA。
2.用于扩增与豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分离的分子标记的引物组合，其特征在于，其含有：
正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC
正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT
通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA。
3.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合在豌豆抗白粉病的分子标记辅助选择育种中的应用。
4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合在鉴定豌豆抗白粉病种质资源中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，PCR扩增待测豌豆的基因组DNA，当扩增产物长度为75bp时，待测豌豆为含有er1-9的抗白粉病豌豆；当扩增产物长度为79bp时，待测豌豆为不含有er1-9的抗白粉病或感白粉病豌豆。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测豌豆的基因组DNA；
2)以待测豌豆的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应；所述特异性引物为：
FAM正向引物序列1：TGTTATATGGGCAGGGTGGTATC
HEX正向引物序列2：TTTTGTTATATGGGCAGGGTGGTATT
COM通用反向引物序列：CAAAATGTAGATTATGCTTACAATTAGTGGA；
3)利用KASP分析技术检测PCR扩增产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR扩增反应使用的扩增体系以5μl计为：10ng/μl豌豆基因组DNA 2.0μl，KASP Master Mix 2.5μl，混合引物0.07μl，ddH2O0.43μl。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中进行PCR扩增反应的条件为：95℃热激活15分钟；95℃变性20秒，65-55℃退火和延伸25秒，10个循环，每循环降低1.0℃；95℃变性10秒，56℃退火和延伸60秒，30个循环。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3)中利用KASP分析技术检测PCR扩增产物，利用LGC系统的SNPline平台进行SNP基因型分型检测。所有含有等位基因er1-9的豌豆资源均出现在红色散点区域，该基因具有FAM标签序列；而不含有等位基因er1-9的抗白粉病和感白粉病豌豆资源均出现在蓝色散点区域，该基因具有HEX标签序列；抗感亲本杂交获得的群体中的杂合株系均出现在绿色散点区域，该基因具有FAM和HEX两种标签序列。
10.用于检测抗白粉病豌豆资源的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求2所述的特异性引物组合。
CN201710175612.8A 2017-03-22 2017-03-22 与豌豆抗白粉病等位基因er1‑9共分离的分子标记及其应用 Pending CN107058306A (zh)

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