CN116656866A - 黑胚病抗性QTL QBp.caas-2BL的分子标记及其应用 - Google Patents
黑胚病抗性QTL QBp.caas-2BL的分子标记及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116656866A CN116656866A CN202310824337.3A CN202310824337A CN116656866A CN 116656866 A CN116656866 A CN 116656866A CN 202310824337 A CN202310824337 A CN 202310824337A CN 116656866 A CN116656866 A CN 116656866A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wheat
- resistance
- black
- embryo
- genotype
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 79
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title abstract description 8
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims abstract description 187
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims abstract description 187
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 46
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 55
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 32
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 21
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 21
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 21
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 abstract description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 101000988395 Homo sapiens PDZ and LIM domain protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001161843 Chandra Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了黑胚病抗性QTL QBp.caas‑2BL的分子标记及其应用。本发明提供了小麦基因组上SNP位点AX‑86165074(位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，为C或T)的单核苷酸多态性作为标记物在鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性中的应用。本发明根据两个标记开发了KASP引物，可以对黑胚病基因进行分子标记辅助筛选。本发明对于培育黑胚病抗体增强的小麦品种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及黑胚病抗性QTL QBp.caas-2BL的分子标记及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum.L)作为世界上栽培最广泛的作物之一，养活了世界上近40％的人口。黑胚病是一种世界性病害，主要症状表现为籽粒胚部呈现明显的黑褐色斑点，严重影响籽粒外观、加工及营养品质，降低小麦商品等级。近年来，随着土壤条件的改善以及全球气候的变化，黑胚病愈发严重，威胁小麦生产安全。使用种子包衣剂并在灌浆期喷施药剂是防治小麦病害的主要方式，但会带来生产成本增加及环境污染等问题，相较于化学防控措施，选育抗病品种是防治黑胚病最经济有效的方法。
黑胚病抗性是由多基因控制的复杂数量性状，不同品种间抗性差异显著，发掘抗性基因并开发紧密连锁标记是黑胚病抗性育种亟需解决的问题。迄今为止，小麦黑胚病的遗传研究较少。Lehmensiek等(2004)构建了2个小麦DH群体，Sunco/Tasman和Cascades/AUS1408，定位了9个小麦抗黑胚病抗性QTL，位于1D、2A、2B、2D、3D、4A、5A和7A(2)染色，解释4.5％-18.4％的表型变异。Liu等(2016)利用临麦2号/中892RIL群体进行连锁分析，在2AL、2BL、3AL、3BL、5AS、6A、7AL(2)和7BS染色体上定位到9个QTL，解释3.7％-13.4％的表型变异。Lv等(2020)利用406份小麦品种进行GWAS分析，检测到76个显著关联位点，分布在所有染色体上，并用双亲群体对3A、6D和7D上位点进行验证。Li等(2021)以“宛原白1号/山农4143”RIL群体为材料，采用BSR-seq在4A和5A上定位到两个黑胚病主效QTL，解释4.4-15.1％与3.3-13.9％的表型变异。目前，尚没有见到能直接应用于黑胚抗病育种分子标记的报道。因此，在挖掘黑胚抗性基因的同时，尽快开发出育种可用分子标记，加快小麦黑胚抗病育种进程。
KASP标记已广泛应用于小麦、水稻和玉米等作物的基因型检测(Ertiro等，2015；Chandra等，2016；Steele等，2018)，相比于传统Taqman方法，可通过通用荧光探针来代替针对位点荧光探针，有效节约成本，高效应用于大批量材料的特异标记检测工作。利用小麦SNP芯片的基因型数据进行QTL定位和GWAS分析，将连锁SNP转化为KASP标记(Liu等，2016；Rasheed，2017；Jia 2018；Fu等，2020；Jiang等，2021)，有助于高效、低成本和精准开展小麦复杂农艺性状MAS育种工作。
济麦22是高产、多抗、优质中筋小麦品种，2006年通过国家黄淮北片审定，并于2010和2011年分别完成安徽和河南两省的引种备案工作，适宜黄淮冬麦区北片和黄淮冬麦区南片的河南和安徽两省适宜区域种植。中麦578是高产、多抗、优质强筋小麦品种，于2021年6月通过国家审定，适宜在黄淮冬麦区北片水地种植。
发明内容
本发明的目的是提供黑胚病抗性QTL QBp.caas-2BL的分子标记及其应用。
第一方面，本发明要求保护小麦基因组上SNP位点AX-86165074的单核苷酸多态性作为标记物在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品。
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T。所述SNP位点AX-86165074对应于小麦参考基因组Chinese SpringRefSeq v1.0的563.9Mb(https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/)(下同)。
第二方面，本发明要求保护用于检测小麦基因组上SNP位点AX-86165074的单核苷酸多态性的物质在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品。
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T。
其中，用于检测小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074的单核苷酸多态性的物质可为后文第三方面中所述的KASP引物或后文第四方面中所述的试剂或试剂盒。
第三方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的KASP引物。
本发明要求保护的用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的KASP引物由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列A和SEQ IDNo.1的第22-44位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列B和SEQ ID No.2的第22-44位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的单链DNA。
其中，所述荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，其核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光标签序列B为荧光标签序列HEX，其核苷酸序列可为SEQ IDNo.2的第1-21位。
进一步地，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
第四方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的试剂或试剂盒。
本发明所要求保护的试剂盒含有所述试剂；所述试剂含有前文第三方面中所述的KASP引物。
第五方面，本发明要求保护特异性DNA分子。
本发明要求保护的特异性DNA分子如SEQ ID No.4所示。
其中，SEQ ID No.4的第31位的Y为C或T。
第六方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的成套引物或前文第四方面中所述的试剂或试剂盒或前文第五方面中所述的特异性DNA分子在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
(A9)小麦育种。
在(A9)中，所述育种的目的是获得黑胚病抗性增强的小麦品种。
第七方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法I：一种比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的方法，可包括如下步骤：
(D1)检测待测小麦基因组上SNP位点AX-86165074处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，根据所述待测小麦的基因型按照如下确定所述待测小麦的黑胚病抗性强弱：C:C基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性强于或候选强于T:T基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性；
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸为C的纯合型；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸为T的纯合型
方法II：一种选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，可包括如下骤：
检测待测小麦的基因组上SNP位点AX-86165074处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，选择C:C基因型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择C:C基因型的小麦，最终获得黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸为C的纯合型。
方法III：一种筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的方法，可包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上SNP位点AX-86165074处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，剔除T:T基因型的所述待测小麦单株；
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸为T的纯合型。
在上述方法中，检测所述待测小麦的基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸可通过直接测序完成，也可按照包括如下步骤的方法进行：利用前文第四方面中所述的试剂或试剂盒对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测小麦的基因组中所述SNP位点AX-86165074的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列A对应的信号，则所述待测小麦为T:T基因型；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列B对应的信号，则所述待测小麦为C:C基因型。
在本发明的具体实施方式中，所述黑胚病抗性强弱是通过籽粒的黑胚率高低体现的。籽粒的黑胚率高说明黑胚病抗性弱，籽粒的黑胚率低说明黑胚病的抗性强。
在本发明中，所述小麦可选自中麦578和济麦22的杂交后代或者表2中165份小麦材料。
本发明确定了一个小麦抗黑胚病基因QTL及其连锁分子标记，该QTL被命名为QBp.caas-2BL，位于2B染色体上，侧翼标记为AX-179560603和AX-86165074，物理区间为558.3–563.9Mb；其紧密连锁的SNP标记为AX-86165074，在被检测的2个环境条件下，可解释表型变异的4.06-15.91％。并根据相应标记开发了KASP引物，可以对黑胚病基因进行分子标记辅助筛选。本发明对于培育黑胚病抗体增强的小麦品种具有重要意义。
附图说明
图1为中麦578×济麦22RIL群体中定位的QBp.caas-2BL曲线图。
图2为KASP标记Kasp_2B_BP对165份小麦品种的基因分型结果。蓝色为中麦578基因型，红色为济麦22基因型，黑色为空白对照，绿色为杂合。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、中麦578×济麦22RIL群体中黑胚病抗性QTL的发现及其KASP标记的获得与应用
一、表型数据获取
以中麦578为母本，济麦22为父本，采用单粒传法构建了含有262个家系的F5RIL群体，于2021-2022年度种植于河南新乡(34°53′N,113°23′E)和山东德州(37°45′N,116°37′E)，采用拉丁方设计，三次重复，6行区，行长3.0m，行宽0.2m，每平方米机械条播270粒种子。在整个小麦生育过程中，田间管理按照当地常规栽培技术进行。在正常收获脱粒后，每次重复的单个株系随机选取200粒籽粒，采用统一标准(籽粒胚部有肉眼可见黑褐色斑点)统计黑胚籽粒个数，并计算黑胚率。
采用CTAB法提取262个家系幼叶基因组DNA，用NanoDrop2000c分光光度计测定DNA浓度，并将DNA样品调至标准浓度50ng/μl，然后用0.8％的琼脂糖凝胶检测DNA质量，质量合格DNA进行SNP分型。利用中国农业科学院作物科学研究所和Affymetrix Axiom公司合作完成的50K SNP芯片进行SNP分析。
二、连锁图谱构建
利用CapitalBio Corporation(http://www.capitalbio.com)公司的小麦50KSNP芯片对RILs和两个亲本进行基因分型，共包含55,224个SNPs。基因型数据过滤标准为筛除非多态性标记、标记缺失率大于20％的家系和最小等位基因频率小于30％的标记，将剩余的9354个高质量多态性标记用于后续分析。利用IciMapping v4.2(http://www.isbreeding.net/；Meng et al.2015)中的BIN功能处理过滤后的多态性标记，使基因分型相同的标记分到一个bin内，构建连锁群有34个，包括1501个bin。采用JoinMap v4.0和MapChart v2.32软件(https://www.wur.nl/en/show/Mapchart.htm；Voorrips,2002)绘制遗传连锁图谱。
三、QTL分析
利用IciMapping v4.2的完备区间作图法检测QTL，LOD阈值选取2.8。在2B染色体定位到1个较稳定的QTL，将其命名为QBp.caas-2BL(图1)。侧翼标记为AX-179560603和AX-86165074，物理区间为558.3–563.9Mb。在不同环境条件下，可解释表型变异的4.06–15.91％(见表1，图1)。其侧翼标记AX-86165074转化为Kasp_2B_BP，并检测165份小麦品种的基因型。
表1、复合区间作图法检测中麦578×济麦22RIL群体的QBp.caas-2BL
| 环境 | 遗传位置(cM) | 标记区间 | 物理位置(Mb) | LOD值 | PVE(％) | Add |
| 新乡 | 110.0 | AX-179560603-AX-86165074 | 558.3–563.9 | 7.25 | 4.06 | -1.05 |
| 德州 | 110.0 | AX-179560603-AX-86165074 | 558.3–563.9 | 10.40 | 15.91 | -2.83 |
四、KASP引物的设计以及利用
1、KASP引物的设计
对应Kasp_2B_BP标记，SNP位点AX-86165074位于小麦参考基因组(2B染色体)Chinese Spring RefSeq v1.0的563.9Mb(参考基因组的网址https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/)处。针对与QBp.caas-2BL紧密连锁的标记AX-86165074(正义链)在中麦578和济麦22之间的SNP变异及其周边核苷酸如SEQ ID No.4所示(y代表C或T)。
根据SNP位点记AX-86165074所在反义链设计KASP标记引物序列，如下：
上游引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT TGATACTACACGGTTAATGGCAA-3’(SEQ IDNo.1，下划线部分为特异荧光标签序列FAM)；
上游引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT TGATACTACACGGTTAATGGCAG-3’(SEQ IDNo.2，下划线部分为特异荧光标签序列HEX)；
下游引物R：5’-GCTCACTAGAAGCTGACGCA-3’(SEQ ID No.3)。
两条上游引物的3’末端最后一个碱基对应SNP位点AX-86165074(反义链)。SNP位点AX-86165074在小麦2B染色体对应SEQ ID No.4(正义链)的第31位，为C或T(在SEQ IDNo.4中用Y表示)。
上游引物F1用于扩增小麦2B染色体上SNP位点AX-86165074(反义链)处核苷酸为A的情况(对应正义链，该SNP位点处核苷酸为T)，上游引物F2用于扩增小麦2B染色体上SNP位点AX-86165074(反义链)处核苷酸为G的情况(对应正义链，该SNP位点处核苷酸为C)；下游引物R为通用引物。
上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦2B染色体上SNP位点AX-86165074(反义链)处核苷酸为A纯合(对应正义链，该SNP位点的基因型为T:T纯合型)的片段。
上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦2B染色体上SNP位点AX-86165074(反义链)处核苷酸为G纯合(对应正义链，该SNP位点的基因型为C:C纯合型)的片段。
上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ IDNo.3所示的单链DNA分子扩增小麦2B染色体上SNP位点AX-86165074(反义链)处核苷酸为A和G杂合(对应正义链，该SNP位点的基因型为C:T杂合型)的片段。
2、KASP检测方法的建立
KASP的原理：两条正向竞争性引物(引物5’端有与荧光集团HEX和FAM互补配对的碱基序列，其它序列仅在3’端的SNP处有差异)和一条反向共同引物；PCR反应体系中含有荧光基团和淬灭基团修饰的通用序列(Master Mix由LGC公司提供)，两条正向引物可以发出两种颜色不同的光，若该位点为纯合则发出单一的荧光，若为杂合则可同时发出两种荧光。
KASP标记PCR扩增体系如下：2.0μl KASP 2x Master Mix(LGC,货号：13448166)、0.048μl KASP引物(3条引物混合，总浓度为50μM，其中两条上游引物和一条下游引物的摩尔比为2:2:5)、1.952μl模板DNA(50ng/μl)。扩增使用384孔PCR仪(BIO-RAD，S1000TMThermal Cycler)，程序如下：94℃15min；94℃20s、63-55℃1min(每个循环降1℃)，10个循环；94℃20s、55℃60s，32个循环。PCR扩增产物放在自动聚焦荧光多功能酶标仪(PHERAstarplus SNP，BMG LABTECH)中读取最终荧光数据，然后将数据导入Klustercallerv3.4(LGC，Hoddesdon,UK)进行基因分型。
针对Kasp_2B_BP标记(SNP位点AX-86165074)：若扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析靠近Y轴(FAM荧光信号)，则代表该位点(正义链)基因型为TT纯合型；若扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析靠近X轴(HEX荧光信号)，则代表该位点(正义链)基因型为CC纯合型；若扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析位于X轴和Y轴中间(同时有FAM和HEX信号)，则代表该位点(正义链)的基因型为CT杂合型。
3、KASP检测
实验材料为165份黄淮麦区品种，具体见表2。
165份黄淮麦区品种种植于河南安阳(35°12'N，113°37'E)(2012-2013、2013-2014和2014-2015年度)和安徽濉溪(35°12'N，113°37'E)(2012-2013和2013-2014年度)。所有试验均采用随机区组设计，3次重复，3行区，行长2m，行距25cm，50粒/行。田间管理按当地常规管理规程进行，进行黑胚病抗性鉴定。在小麦正常收获脱粒后，每次重复的单个株系随机选取200粒籽粒，采用统一标准(籽粒胚部有肉眼可见黑褐色斑点)统计黑胚籽粒个数，并计算黑胚率。
分别提取所有实验材料的基因组DNA，以其为模板，利用步骤2设计的KASP引物进行检测，具体操作参见步骤2。
结果见表2和图2。165份小麦品种中，121品种为中麦578基因型(CC)，27品种显示为济麦22基因型(TT)，CC纯合型的小麦品种比TT纯合型的小麦品种的黑胚率的平均值降低了21.0％，在0.05水平上有显著差异(表3)。
表2、165份小麦品种的基因型检测结果
/>
/>
/>
注：CC：中麦578基因型；TT：济麦22基因型；TC：杂合基因型；-未识别基因型。
表3、QBp.caas-2B165份自然群体黑胚率效应
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.小麦基因组上SNP位点AX-86165074的单核苷酸多态性作为标记物在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T。
2.用于检测小麦基因组上SNP位点AX-86165074的单核苷酸多态性的物质在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：用于检测小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074的单核苷酸多态性的物质为权利要求4或5中所述的KASP引物或权利要求6或7所述的试剂或试剂盒。
4.用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列A和SEQ ID No.1的第22-44位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列B和SEQ ID No.2的第22-44位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的单链DNA。
5.根据权利要求4所述的KASP引物，其特征在于：所述荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，其核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光标签序列B为荧光标签序列HEX，其核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-21位；
进一步地，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
6.用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有所述试剂；所述试剂含有权利要求4或5中所述的KASP引物。
7.特异性DNA分子，如SEQ ID No.4所示。
8.权利要求4或5所述的KASP引物或权利要求6所述的试剂或试剂盒或权利要求7所述的特异性DNA分子在如下任一中的应用：
(A1)鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性；
(A2)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的黑胚病抗性的产品；
(A3)比较待测小麦的黑胚病抗性强弱；
(A4)制备用于比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的产品；
(A5)选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
(A6)制备用于选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(A7)筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株；
(A8)制备用于筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的产品；
(A9)小麦育种。
9.如下任一方法：
方法I：一种比较待测小麦的黑胚病抗性强弱的方法，包括如下步骤：
(D1)检测待测小麦基因组上SNP位点AX-86165074处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，根据所述待测小麦的基因型按照如下确定所述待测小麦的黑胚病抗性强弱：C:C基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性强于或候选强于T:T基因型的所述待测小麦的黑胚病抗性；
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸为C的纯合型；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸为T的纯合型；
方法II：一种选育黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上SNP位点AX-86165074处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，选择C:C基因型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择C:C基因型的小麦，最终获得黑胚病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T；
所述C:C基因型为在小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸为C的纯合型；
方法III：一种筛选剔除黑胚病抗性相对较弱的小麦单株的方法，包括如下步骤：
检测待测小麦的基因组上SNP位点AX-86165074处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，剔除T:T基因型的所述待测小麦单株；
所述SNP位点AX-86165074位于小麦2B染色体上SEQ ID No.4的第31位，该SNP位点处的核苷酸为C或T；
所述T:T基因型为在小麦基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸为T的纯合型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：检测所述待测小麦的基因组上所述SNP位点AX-86165074处的核苷酸按照包括如下步骤的方法进行：利用权利要求6所述的试剂或试剂盒对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测小麦的基因组中所述SNP位点AX-86165074的基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列A对应的信号，则所述待测小麦为T:T基因型；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列B对应的信号，则所述待测小麦为C:C基因型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310824337.3A CN116656866A (zh) | 2023-07-06 | 2023-07-06 | 黑胚病抗性QTL QBp.caas-2BL的分子标记及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310824337.3A CN116656866A (zh) | 2023-07-06 | 2023-07-06 | 黑胚病抗性QTL QBp.caas-2BL的分子标记及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116656866A true CN116656866A (zh) | 2023-08-29 |
Family
ID=87726301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310824337.3A Pending CN116656866A (zh) | 2023-07-06 | 2023-07-06 | 黑胚病抗性QTL QBp.caas-2BL的分子标记及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116656866A (zh) |
-
2023
- 2023-07-06 CN CN202310824337.3A patent/CN116656866A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108998562B (zh) | 基于小麦品种中麦895遗传背景下粒长基因标记及应用 | |
| CN113584216B (zh) | 小麦粒重基因TaCYP78A16的KASP标记开发及其应用 | |
| CN112080582A (zh) | 一种与小麦穗长主效qtl位点紧密连锁的kasp分子标记及其应用 | |
| CN109295179B (zh) | 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒 | |
| CN111893209B (zh) | 一种与小麦千粒重相关的插入缺失位点检测标记及其应用 | |
| CN111575400B (zh) | 小麦抗条锈病qtl分子标记iwb12253及其应用 | |
| CN114657277B (zh) | 一种与小麦籽粒长度相关的kasp分子标记与应用 | |
| CN112322772B (zh) | 一种与玉米籽粒镉含量相关基因ZmCd9的单倍型分子标记及其应用 | |
| CN106755465B (zh) | 与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-2D紧密连锁的分子标记及应用 | |
| CN111793712A (zh) | 小麦snp iwa586位点的单核苷酸多态性的物质的用途 | |
| CN108531642B (zh) | 一组用于鉴别玉米品种的ssr分子标记及其应用 | |
| CN116121445A (zh) | 一种用于检测多环境下小麦粒重和粒宽的kasp分子标记及应用 | |
| CN115927718A (zh) | 用于鉴定小麦粒重和粒宽的kasp分子标记及应用 | |
| CN115852021A (zh) | 鉴定小麦粒重和粒长的snp分子标记及其应用 | |
| CN112226532B (zh) | 检测玉米基因组中snp的多态性的物质在鉴定玉米镉含量中的应用 | |
| CN114908188A (zh) | 与小麦粒重和粒长相关的kasp分子标记的应用及其引物组合物 | |
| CN116656866A (zh) | 黑胚病抗性QTL QBp.caas-2BL的分子标记及其应用 | |
| CN111485032A (zh) | 一种鉴定黄瓜雌性系的方法及其使用的snp引物组合 | |
| CN116790794A (zh) | 抗黑胚病QTL QBp.caas-2AL与QBp.caas-5BL的KASP标记 | |
| CN105950615B (zh) | 一种检测TaAGPL基因等位变异的方法及试剂盒 | |
| CN117230230A (zh) | 一个鉴定小麦的黑胚病抗性的分子标记及其方法 | |
| CN117187432A (zh) | 一种与高粱株高相关基因SbPH14的单倍型分子标记及其应用 | |
| CN108060246B (zh) | 一种与陆地棉7号染色体纤维强度相关的单体型 | |
| CN115820914A (zh) | 高粱SbDW3基因的SNP分子标记及应用 | |
| CN115820909A (zh) | 一种筛选不同千粒重小麦的方法及其使用的引物组 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |