CN114438244A - 检测小麦粒重TaRSR-A1基因的KASP标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测小麦粒重TaRSR‑A1基因的KASP标记及其应用，属于分子遗传育种技术领域，本发明提供特异成套引物Kasp‑TaRSR‑A1，利用所述Kasp‑TaRSR‑A1进行小麦千粒重TaRSR‑A1基因的检测，人为误差低，分析通量高，适用大量样本的检测。本发明提供的共显性分子标记应用于TaRSR‑A1基因的转育，对于加快利用小麦千粒重TaRSR‑A1基因进行遗传改良，提高育种效率具有重要实践意义。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传育种技术领域，特别涉及千粒重TaRSR-A1基因高通量KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR）标记开发及应用。
背景技术
小麦是世界三大粮食作物之一，育种的重要目标是提高产量并改良加工品质。小麦单产是一个复杂性状，为方便研究，可将其表示为单位面积粒数和粒重的乘积，而单位面积的粒数又可以分解为单位面积穗数和每穗粒数。每一项增加都可以提高单产，但各因子相互制约，只有协调发展穗数、粒数、粒重，才能达到高产。通过对不同年份育成品种的研究发现，上世纪小麦单产的提高主要依赖于单位面积粒数的增加（Fischer 2008;Hawkesford et al. 2013）。1980年以来，粒重在产量提高方面所起作用日益显现（Calderini and Ortiz-Monasterio 2003; Sadras and Lawson 2011）。过去几十年里，我国河南和山东小麦的产量潜力仍在继续增长，穗粒数显著提高，其中河南省的粒重也在明显增加（Gao et al. 2017; Xiao et al. 2012; Zheng et al. 2011）。
虽然已经定位很多粒重相关的QTL，但其在育种中的应用却鲜有报道。主要原因有以下两点：（1）与QTL连锁的标记距离基因太远，不能对其进行准确选择，因此，标记没有通用性，仅对与定位群体有关的材料有效（Bagge et al. 2007; Liu et al. 2012）；（2）普通小麦是经过多次杂交形成的异源六倍体，具有ABD三个亚基因，基因组既庞大又复杂（Penget al. 2011; Salamini et al. 2002），测序进展缓慢，导致QTL精细定位和基因克隆很难实现。不过在最近十几年，利用禾本科植物基因组的共线性关系和基因功能在不同物种间保守性，已从小麦中克隆了很多基因并开发了功能标记，其中很多与粒重性状相关。这些基因分布在1A、1B等17个染色体。
近年来，小麦的遗传转化取得重大进展、基因编辑技术日益成熟，一些基因的功能得到验证，如TaGW2（Wang et al. 2018）、TaGASR7（Zhang et al. 2016）、TaPSTOL（Milneret al. 2018），使我们对小麦粒重和籽粒大小的调控机制有了一定了解。Liu et al(2016)研究表明，通过大麦条纹花叶病毒-病毒诱导基因沉默 (BSMV-VIGS)方法，确定了TaRSR1基因在调节小麦淀粉合成中的功能。TaRSR1作为负调节因子，通过调节特定淀粉合成相关酶基因的表达，在小麦籽粒淀粉合成中发挥重要作用。同时，影响千粒重和籽粒大小。
KASP标记已广泛应用于检测小麦、水稻和玉米等作物的SNP位点（Ertiro等，2015；Chandra等，2016；Steele等，2018），无需电泳，可实现高通量基因分型。利用小麦SNP芯片的基因型数据进行QTL定位和全基因组关联分析，将连锁SNP转化为KASP标记（Liu等，2016；Rasheed，2016，2017；Jia 2018；Fu等，2020；Jiang等，2021），可直接应用于分子标记辅助选择育种。
发明内容
针对上述情况，本发明通过对黄淮麦区96份自然群体中高低千粒重各4份品种的TaRSR-A1（TraesCS1A02G058400）基因进行序列分析，发现在第七外显子存在一个碱基由T突变为C，针对该突变位点转化成了KASP标记，并在自然群体中进行了粒重效应验证，可用于分子标记辅助育种。
本发明采用的具体方案为：
本发明的目的一在于提供检测小麦粒重TaRSR-A1基因的KASP标记，所述KASP标记为由引物1、引物2和引物3组成的成套引物Kasp-TaRSR-A1；
所述引物1自5’端到3’端依次为标签序列A和SEQ ID NO：01的第22-39位所示的单链DNA；
所述引物2自5’端到3’端依次为标签序列B和SEQ ID NO：02的第22-39位所示的单链DNA；
所述引物3为SEQ ID NO：03所示的单链DNA；
作为对上述KASP标记的进一步优化，所述标签序列A为FAM荧光标签序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：01的第1-21位所示；所述标签序列B为HEX荧光标签序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：02的第1-21位所示。
本发明的目的二在于提供一种检测小麦粒重TaRSR-A1基因的试剂盒，所述试剂盒包含上述的成套引物Kasp-TaRSR-A1。
本发明的目的三在于提供一种检测或辅助检测小麦TaRSR-A1基因型的方法，包括以下步骤：
步骤一、提取待测小麦基因组DNA；
步骤二、以所述待测小麦基因组DNA为模板，采用成套引物Kasp-TaRSR-A1进行PCR扩增，得扩增产物；
所述成套引物Kasp-TaRSR-A1由引物1、引物2和引物3组成，所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：02所示，所述引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：03所示；
步骤三、将步骤二所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果进行基因分型。
作为对上述方法的进一步优化，步骤二中所述PCR扩增体积为5 µl，反应体系如下：0.056 μl Primer Mix，2.5 μl Master Mix，2.2μl Template DNA（50 ng/μl），0.244 μl ddH2O；所述Master Mix中包含荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述Primer Mix的配比为：12%的引物1、12%的引物2和30%的引物3。
作为对上述方法的进一步优化，步骤三中，按照如下确定小麦TaRSR-A1基因型：若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析呈现蓝色，则小麦TaRSR-A1基因型为AA；若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析呈现红色，则小麦TaRSR-A1基因型为GG；若待测小麦扩增的产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析呈现绿色，则小麦TaRSR-A1基因型为AG。
本发明的目的四在于提供所述KASP标记、试剂盒或上述方法在如下（A）-（F）任意一种中的应用：
（A）：用于检测小麦或小麦杂交后代的TaRSR-A1基因；
（B）：用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；
（C）：用于培育、筛选或辅助筛选具有高或低千粒重性状的小麦单株、株系、品系或品种；
（D）：制备用于检测小麦或小麦杂交后代的TaRSR-A1基因的产品；
（E）：制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状的产品；
（F）：制备用于培育、筛选或辅助筛选具有高或低千粒重性状的小麦单株、株系、品系或品种的产品。
有益效果：本发明是基于KASP技术，根据目标基关键突变位点设计引物，利用引物末端碱基的特意匹配来对相应的SNP进行分型。该技术可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率，减少时间和人工成本，非常有利于田间大规模筛选TaRSR-A1基因高千粒重基因型的情况，缩短了小麦TaRSR-A1基因的转育进程，提高了育种效率。
附图说明
图1是D3引物扩增TaRSR-A1基因琼脂糖凝胶检测结果图；
图2是突变位点附近序列信息对比图；
图3 是Kasp-TaRSR-A1对96份小麦品种基因分型结果图。
具体实施方式
本发明提出一种高通量、低成本和低失误率的检测SNP分型方法。用于检测千粒重TaRSR-A1基因的KASP标记引物，可用于育种中籽粒蛋白质的分子标记辅助选择。
KASP的原理：扩增需要3条引物，两条正向竞争性引物（引物5’端有与荧光集团HEX和FAM互补配对的碱基序列，其它序列仅在3’端的SNP和InDel处有差异）和一条反向共同引物；PCR反应体系中含有荧光基团和猝灭基团修饰的通用序列（Master Mix由LGC公司提供），因此正向引物可以特异性地结合与其基因型一样的DNA，两条正向引物可以发出两种颜色不同的光，若模板链中该位点为纯合，则发出单一的、与其匹配的荧光，若为杂合，则可同时发出两种荧光。KASP标记PCR扩增体系，每5 µl反应体系如下：0.056 μl Primer Mix，2.5 μl Master Mix，2.2μl Template DNA（50 ng/μl），0.244 μl ddH2O，Master Mix购买自LGC公司，Primer Mix的配比为：12%HEX引物、12%FAM引物、30%的Common引物，引物由上海英俊公司合成。扩增使用384孔PCR仪（BIO-RAD, S1000TMThermal Cycler），程序如下：94℃15 min；94℃ 20s、63-55℃ 1 min（每个循环降1℃），10个循环；94℃ 20s、55℃ 60s，32个循环。PCR扩增产物放在自动聚焦荧光多功能酶标仪（PHERAstarplus SNP, BMG LABTECH）中读取最终荧光数据，然后将数据导入Klustercaller v3.4软件（LGC, Hoddesdon, UK）进行基因分型。
通过已公布的中国春TaRSR1基因序列，设计五对特异引物（表2）扩增出济南17、烟农15、冀师02-1、矮抗58、周8425B、中麦895、中育9号和周麦18的 TaRSR-A1（TraesCS1A02G058400）基因序列全长，送生工基因公司测序，利用DNAMAN软件比对相关序列发现引物D3扩增的产物序列中，8个品种的产物在TaRSR-A1（TraesCS1A02G058400）基因序列起始密码子下游1008处碱基由T突变为C。五对引物序列信息如表2所示。
依据SNP突变信息特点，设计特异成套KASP引物（表1），由引物1、引物2和引物3组成。引物1自5’端到3’端依次为标签序列A和表1中序列1的第22-39位单链DNA。引物2自5’端到3’端依次为标签序列B和表1中序列2的第22-39位单链DNA。引物3为核苷酸序列如表1中序列3所示的单链DNA。
具体地，引物1为核苷酸序列如表1中序列1所示的单链DNA；引物2为核苷酸序列如表1中序列2所示的单链DNA；引物3为核苷酸序列如表1中序列3所示的单链DNA。
利用上述特异成套KASP引物，可用于制备检测小麦千粒重TaRSR-A1基因的试剂盒，所述试剂盒包含所述的成套KASP引物，还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针A。
在本发明中，所述荧光探针A的5’端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A的3’端连接荧光淬灭基团；所述荧光探针B的5’端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B的3’端连接荧光淬灭基团。其中，所述荧光报告基团A为FAM，所述荧光报告基团B为HEX，所述荧光淬灭基团为BHQ。
在本发明中所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和淬灭探针B是存在于KASP 2×Master Mix，其中所述KASP 2×Master Mix是英国LGC公司产品，产品目录号为KBS-1016-002（适用千96/384的孔板）。
检测或者辅助检测待测小麦TaRSR-A1基因的基因型的方法为常规方法：以所述待测小麦基因组DNA为模板，采用所述试剂盒（所述荧光基团Ａ为FAM，荧光基团B为HEX）进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定小麦TaRSR-A1基因型：若待测小麦扩增的产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析呈现蓝色，则小麦小麦TaRSR-A1基因型为AA；若待测小麦扩增的产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析呈现红色，则小麦TaRSR-A1基型为GG；若待测小麦扩增的产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析呈现绿色，则小麦TaRSR-A1基型为AG。
上述KASP标记引物可用于检测小麦TaRSR-A1基因、检测小麦杂交后代的TaRSR-A1基因，也可应用于小麦育种中对小麦籽粒千粒重的辅助选择。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可在常规生化试剂商店购买。
实施例中，小麦千粒重的TaRSR-A1基因高通量KASP标记设计以其专用引物序列开发。
通过已公布的中国春TaRSR1基因序列，设计五对特异引物（表2）扩增出济南17、烟农15、冀师02-1、矮抗58、周8425B、中麦895、中育9号和周麦18的TaRSR-A1（TraesCS1A02G058400）基因序列全长，切胶回收送生工基因公司测序，利用DNAMAN软件比对相关序列发现引物D3扩增的产物序列中，8个品种的产物在TaRSR-A1（TraesCS1A02G058400）基因序列起始密码子下游1008处碱基由T突变为C。
表1 检测小麦千粒重TaRSR-A1基因的Kasp-TaRSR-A1引物序列表。
| 标记名称 | 序列名称 | 序列 | 序列表序号 |
| <i>Kasp-TaRSR-A1</i> | 1 | <u>GAAGGTGACCAAGTTCATGCT</u>TCATTGAGCAGCTCCGCA | SEQ ID NO：01 |
| 2 | <u>GAAGGTCGGAGTCAACGGATT</u>TCATTGAGCAGCTCCGCG | SEQ ID NO：02 | |
| <i></i> | 3 | ATGGTAGAGAGGCCGTGACC | SEQ ID NO：03 |
注：表1中，GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为标签序列A，
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为标签序列B。
表2 扩增TaRSR-A1基因的引物序列表。
| 引物 | 引物名称 | 序列 | 序列表序号 | |
| D1 | DF1 | GGATCAATGGGATCGTGCTTCT | <u></u> | SEQ ID NO：04 |
| DR1 | CGCCGAGATCACCACTTCCA | 1203 | SEQ ID NO：05 | |
| D2 | DF2 | CCCACCTTTCTGACACCGC | SEQ ID NO：06 | |
| DR2 | ACAACAGAGTCAGAACTCAGAATTC | 1476 | SEQ ID NO：07 | |
| D3 | DF3 | TGAACCACCTGTACTGCAACT | SEQ ID NO：08 | |
| DR3 | GGTGAATATAGTTTGGGCGGC | 1556 | SEQ ID NO：09 | |
| D4 | DF4 | CGATTAGCTGATGAACTTGAACTC | SEQ ID NO：10 | |
| DR4 | GCTTCCAAGTAAAGCTGTGAGAT | 1332 | SEQ ID NO：11 | |
| D5 | DF5 | AGACACTTATTTGACGGACGG | SEQ ID NO：12 | |
| DR5 | GACATTTCTAGGCATACTTTCTAGC | 1475 | SEQ ID NO：13 |
依据SNP突变信息特点，设计特异成套KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成。两条上游引物（引物1和引物2)3'末端为等位变异碱基C/A，下游引物3的序列选择要保证扩增片段在60-120bp。上游引物5'端连接有荧光标签序列，其中引物1的5'端连接为FAM荧光标签序列5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，引物2的5'端连接为HEX荧光标签序列5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。本发明基于小麦千粒重TaRSR-A1基因开发的KASP标记及其专用引物序列，其序列有序列1、序列2和序列3组成，序列1中下划线序列为FAM街头序列，序列2中下划线序列为HEX接头序列。
引物对的利用：
实验材料为96个小麦品种，具体见表3。
1、将各个实验材料于2012-2013和2013-2014年度种植于河南安阳和安徽濉溪，每个材料4行、1.5m行长，常规管理，成熟后收获籽粒，万深公司SC-G型自动考种及千粒重分析仪测量千粒重。
2、利用Kasp-TaRSR-A1标记检测所有实验材料。
结果见表3和图3。96个小麦品种中，85个品种显示为AA基因型，四个环境千粒重分别为42.3g和51.2g；11个品种显示为GG基因型，四个环境千粒重分别为36.4g和44.6g；统计测验显示Kasp-TaRSR-A1的基因效应达到显著差异（P <0.05）。
表3 96份小麦品种的基因型检测结果和千粒重。
| 编号 | 品种名称 | 标记 | 13AY | 14AY |
| 1 | 石4185 | AA | 39.56 | 48.39 |
| 2 | 石家庄15 | AA | 45.47 | 50.92 |
| 3 | 小偃22 | AA | 39.97 | 49.11 |
| 4 | 豫麦13 | AA | 40.9 | 51.09 |
| 5 | 豫麦2号 | AA | 41.26 | 48.51 |
| 6 | 豫麦50 | AA | 43.15 | 57.82 |
| 7 | 周麦22 | AA | 46.99 | 56.92 |
| 8 | 矮抗58 | AA | 37.78 | 49.75 |
| 9 | 武农148 | AA | 37.23 | 49.28 |
| 10 | Norin 61 | AA | 32.03 | 42.76 |
| 11 | Norin 67 | AA | 31.33 | 39.71 |
| 12 | Sagittario | AA | 36.58 | 45 |
| 13 | Sunstate | AA | 50.31 | 58.84 |
| 14 | 济麦20 | AA | 42.43 | 52.87 |
| 15 | 济麦22 | AA | 41.91 | 51.8 |
| 16 | 济南13 | AA | 50.72 | 52.83 |
| 17 | 良星66 | AA | 41.41 | 51.13 |
| 18 | 良星99 | AA | 44.64 | 55.08 |
| 19 | 临旱2号 | AA | 49.77 | 57.14 |
| 20 | 鲁麦15 | AA | 40.63 | 52.27 |
| 21 | 鲁麦21 | AA | 39.13 | 49.22 |
| 22 | 鲁麦23 | AA | 47 | 54.78 |
| 23 | 鲁麦6号 | AA | 40.39 | 49.88 |
| 24 | 洛旱2号 | AA | 41.21 | 49.71 |
| 25 | 泰山1号 | AA | 40.19 | 49.28 |
| 26 | 泰山5号 | AA | 43.24 | 49.56 |
| 27 | 皖麦19 | AA | 40.5 | 48.95 |
| 28 | 皖麦29 | AA | 38.16 | 51.29 |
| 29 | 皖麦50 | AA | 42.34 | 51.29 |
| 30 | 皖麦53 | AA | 40.42 | 50.92 |
| 31 | 小偃6号 | AA | 42.1 | 50 |
| 32 | 小偃81 | AA | 39.82 | 45.52 |
| 33 | 新麦19 | AA | 38.45 | 48.45 |
| 34 | 新麦9408 | AA | 40.34 | 47.03 |
| 35 | 新麦9号 | AA | 41.22 | 49.09 |
| 36 | 偃展4110 | AA | 43.3 | 51.45 |
| 37 | 豫麦34 | AA | 46.72 | 54.93 |
| 38 | 豫麦57 | AA | 41.89 | 54.42 |
| 39 | 豫麦63 | AA | 46.77 | 50.89 |
| 40 | 郑9023 | AA | 44.68 | 52.57 |
| 41 | 郑麦366 | AA | 40.67 | 46.83 |
| 42 | 郑州3号 | AA | 43.11 | 51.29 |
| 43 | 周麦19 | AA | 40.94 | 51.45 |
| 44 | 周麦23 | AA | 45.71 | 51.13 |
| 45 | 周麦31 | AA | 42.39 | 57.5 |
| 46 | 淄麦12 | AA | 44.77 | 49.9 |
| 47 | 淄选2号 | AA | 35.23 | 43.43 |
| 48 | 临抗12 | AA | 50.02 | 52.83 |
| 49 | 鲁麦7号 | AA | 41.75 | 49.75 |
| 50 | 烟农18 | AA | 45.62 | 55.33 |
| 51 | 中麦871 | AA | 40.25 | 50.56 |
| 52 | 兰考2号 | AA | 40.29 | 46.69 |
| 53 | 陕150 | AA | 39.58 | 49.75 |
| 54 | 豫麦18 | AA | 41.34 | 51.93 |
| 55 | 豫麦49 | AA | 43.52 | 52.76 |
| 56 | 郑引1号 | AA | 43.93 | 53.75 |
| 57 | 85中33 | AA | 52.58 | 59.25 |
| 58 | Dorico | AA | 35.36 | 46.92 |
| 59 | Nidera Baguette 10 | AA | 30.11 | 37.18 |
| 60 | 观35 | AA | 40.64 | 53.78 |
| 61 | 鲁麦11 | AA | 42.39 | 53.67 |
| 62 | 鲁麦9号 | AA | 41.53 | 46.44 |
| 63 | 洛麦21 | AA | 47.57 | 56.25 |
| 64 | 西农1376 | AA | 36.82 | 46.29 |
| 65 | 中892 | AA | 46.74 | 54.54 |
| 66 | 中麦871 | AA | 47.35 | 60.22 |
| 67 | 中麦895 | AA | 48.68 | 55.76 |
| 68 | 周8425B | AA | 51.69 | 61.25 |
| 69 | 周麦11 | AA | 43.35 | 47.67 |
| 70 | 周麦12 | AA | 44.8 | 55.17 |
| 71 | 周麦13 | AA | 43.07 | 51.61 |
| 72 | 周麦16 | AA | 45.5 | 60.42 |
| 73 | 周麦18 | AA | 45.63 | 55.26 |
| 74 | 周麦25 | AA | 38.26 | 45.2 |
| 75 | 周麦26 | AA | 40.24 | 51.93 |
| 76 | 周麦28 | AA | 39.17 | 50.73 |
| 77 | 周麦32 | AA | 42.29 | 51.18 |
| 78 | 临麦4号 | AA | 46.2 | 50.29 |
| 79 | 陕麦94 | AA | 47.47 | 55.4 |
| 80 | 皖23094 | AA | 40.09 | 53.56 |
| 81 | 皖麦33 | AA | 40.58 | 50.89 |
| 82 | 小偃54 | AA | 39.3 | 46.16 |
| 83 | 烟农15 | AA | 33.22 | 41.76 |
| 84 | 豫麦47 | AA | 41.89 | 48.96 |
| 85 | 中育9号 | AA | 49.24 | 56.08 |
| 86 | ProINTA Colibr 1 | GG | 28.09 | 33.31 |
| 87 | Aca 801 | GG | 33.42 | 41.9 |
| 88 | Genio | GG | 35.49 | 41.5 |
| 89 | Mantol | GG | 34.18 | 45.03 |
| 90 | 碧蚂4号 | GG | 38.53 | 42.92 |
| 91 | 藁城8901 | GG | 38.63 | 49.5 |
| 92 | 济麦19 | GG | 43.18 | 50.92 |
| 93 | 济南17 | GG | 38.11 | 45.83 |
| 94 | 冀师02-1 | GG | 33.38 | 45.13 |
| 95 | 皖麦38 | GG | 37.64 | 47.7 |
| 96 | 西农2000-7 | GG | 39.38 | 47.31 |
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 检测小麦粒重TaRSR-A1基因的KASP标记及其应用
<130> 1
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc ttcattgagc agctccgca 39
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat ttcattgagc agctccgcg 39
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atggtagaga ggccgtgacc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ggatcaatgg gatcgtgctt ct 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
cgccgagatc accacttcca 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cccacctttc tgacaccgc 19
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
acaacagagt cagaactcag aattc 25
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tgaaccacct gtactgcaac t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggtgaatata gtttgggcgg c 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cgattagctg atgaacttga actc 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gcttccaagt aaagctgtga gat 23
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
agacacttat ttgacggacg g 21
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gacatttcta ggcatacttt ctagc 25
Claims (7)
1.检测小麦粒重TaRSR-A1基因的KASP标记，其特征在于：所述KASP标记为由引物1、引物2和引物3组成的成套引物Kasp-TaRSR-A1；
所述引物1自5’端到3’端依次为标签序列A和SEQ ID NO：01的第22-39位所示的单链DNA；
所述引物2自5’端到3’端依次为标签序列B和SEQ ID NO：02的第22-39位所示的单链DNA；
所述引物3为SEQ ID NO：03所示的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的KASP标记，其特征在于：所述标签序列A为FAM荧光标签序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：01的第1-21位所示；所述标签序列B为HEX荧光标签序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：02的第1-21位所示。
3.一种检测小麦粒重TaRSR-A1基因的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的KASP标记。
4.一种检测或辅助检测小麦TaRSR-A1基因型的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、提取待测小麦基因组DNA；
步骤二、以所述待测小麦基因组DNA为模板，采用成套引物Kasp-TaRSR-A1进行PCR扩增，得扩增产物；
所述成套引物Kasp-TaRSR-A1由引物1、引物2和引物3组成，所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：02所示，所述引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：03所示；
步骤三、将步骤二所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果进行基因分型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤二中所述PCR扩增体积为5 µl，反应体系如下：0.056 μl Primer Mix，2.5 μl Master Mix，2.2μl Template DNA，0.244 μlddH2O；所述Master Mix中包含荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述PrimerMix中各引物的配比为：12%的引物1、12%的引物2和30%的引物3。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤三中，按照如下确定小麦TaRSR-A1基因型：若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析呈现蓝色，则小麦TaRSR-A1基因型为AA；若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析呈现红色，则小麦TaRSR-A1基因型为GG；若待测小麦扩增的产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析呈现绿色，则小麦TaRSR-A1基因型为AG。
7.权利要求1或2所述的KASP标记、权利要求3所述的试剂盒、或权利要求4-6任意一种所述的方法在如下（A）-（F）任意一种中的应用：
（A）：用于检测小麦或小麦杂交后代的TaRSR-A1基因；
（B）：用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；
（C）：用于培育、筛选或辅助筛选具有高或低千粒重性状的小麦单株、株系、品系或品种；
（D）：制备用于检测小麦或小麦杂交后代的TaRSR-A1基因的产品；
（E）：制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状的产品；
（F）：制备用于培育、筛选或辅助筛选具有高或低千粒重性状的小麦单株、株系、品系或品种的产品。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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