CN107034306B

CN107034306B - 一组snp位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用

Info

Publication number: CN107034306B
Application number: CN201710468604.2A
Authority: CN
Inventors: 吴明生; 赵海艳; 律宝春; 云晓敏; 彭瑞迪
Original assignee: Beijing Seed Control Station
Current assignee: Beijing Seed Control Station
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2037-06-20
Also published as: CN107034306A

Abstract

本发明公开了一组SNP位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用。本发明提供了用于检测16个SNP位点的产品在小麦品种鉴定中的应用；所述16个SNP位点如表2所示。本发明还保护用于检测所述16个SNP位点的引物组合。本发明为小麦品种室内快速鉴定提供了技术支撑。

Description

一组SNP位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用

技术领域

本发明涉及一组SNP位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用。

背景技术

SNP(single nucleotide polymorphism)，即单核苷酸多态性，具有分布密度高、遗传稳定性强、检测通量高、数据容易整合和标准化等特点，被认为是最有效DNA标记方法之一，在作物的品种鉴定中得到应用，也被国际植物新品种保护联盟(UPOV)被推荐作为品种鉴定和数据库构建的优选标记。目前针对SNP的分型检测方法有多种，不同的方法在检测通量及成本上差异较大，其中KASP分型法是比较经济适用的方法之一，具有位点扩展性性强、操作便捷、结果容易分析等特点，尤其适合大量样本的少量SNP位点的分析。

发明内容

本发明的目的是提供一组小麦SNP位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用。

本发明提供了一种用于检测16个SNP位点的产品在小麦品种鉴定中的应用；

所述16个SNP位点如下所示：

第1个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列1自5’端第51位核苷酸，该SNP为T/C多态；

第2个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列2自5’端第51位核苷酸，该SNP为A/C多态；

第3个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列3自5’端第51位核苷酸，该SNP为T/C多态；

第4个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列4自5’端第51位核苷酸，该SNP为A/G多态；

第5个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列5自5’端第51位核苷酸，该SNP为T/C多态；

第6个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列6自5’端第51位核苷酸，该SNP为A/G多态；

第7个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列7自5’端第51位核苷酸，该SNP为A/C多态；

第8个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列8自5’端第51位核苷酸，该SNP为T/C多态；

第9个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列9自5’端第51位核苷酸，该SNP为T/G多态；

第10个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列10自5’端第51位核苷酸，该SNP为T/G多态；

第11个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列11自5’端第51位核苷酸，该SNP为A/C多态；

第12个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列12自5’端第51位核苷酸，该SNP为A/G多态；

第13个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列13自5’端第51位核苷酸，该SNP为A/G多态；

第14个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列14自5’端第51位核苷酸，该SNP为T/G多态；

第15个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列15自5’端第51位核苷酸，该SNP为T/C多态；

第16个SNP位点：小麦基因组中序列表中序列16自5’端第51位核苷酸，该SNP为T/C多态。

所述“用于检测16个SNP位点的产品”为引物组合；所述引物探针组合由16个引物组组成；

引物组1由引物F1-1、引物F1-2和引物R1组成；所述引物F1-1为序列表的序列17所示的单链DNA分子；所述引物F1-2为序列表的序列18所示的单链DNA分子；所述引物R1为序列表的序列19所示的单链DNA分子；

引物组2由引物F2-1、引物F2-2和引物R2组成；所述引物F2-1为序列表的序列20所示的单链DNA分子；所述引物F2-2为序列表的序列21所示的单链DNA分子；所述引物R2为序列表的序列22所示的单链DNA分子；

引物组3由引物F3-1、引物F3-2和引物R3组成；所述引物F3-1为序列表的序列23所示的单链DNA分子；所述引物F3-2为序列表的序列24所示的单链DNA分子；所述引物R3为序列表的序列25所示的单链DNA分子；

引物组4由引物F4-1、引物F4-2和引物R4组成；所述引物F4-1为序列表的序列26所示的单链DNA分子；所述引物F4-2为序列表的序列27所示的单链DNA分子；所述引物R4为序列表的序列28所示的单链DNA分子；

引物组5由引物F5-1、引物F5-2和引物R5组成；所述引物F5-1为序列表的序列29所示的单链DNA分子；所述引物F5-2为序列表的序列30所示的单链DNA分子；所述引物R5为序列表的序列31所示的单链DNA分子；

引物组6由引物F6-1、引物F6-2和引物R6组成；所述引物F6-1为序列表的序列32所示的单链DNA分子；所述引物F6-2为序列表的序列33所示的单链DNA分子；所述引物R6为序列表的序列34所示的单链DNA分子；

引物组7由引物F7-1、引物F7-2和引物R7组成；所述引物F7-1为序列表的序列35所示的单链DNA分子；所述引物F7-2为序列表的序列36所示的单链DNA分子；所述引物R7为序列表的序列37所示的单链DNA分子；

引物组8由引物F8-1、引物F8-2和引物R8组成；所述引物F8-1为序列表的序列38所示的单链DNA分子；所述引物F8-2为序列表的序列39所示的单链DNA分子；所述引物R8为序列表的序列40所示的单链DNA分子；

引物组9由引物F9-1、引物F9-2和引物R9组成；所述引物F9-1为序列表的序列41所示的单链DNA分子；所述引物F9-2为序列表的序列42所示的单链DNA分子；所述引物R9为序列表的序列43所示的单链DNA分子；

引物组10由引物F10-1、引物F10-2和引物R10组成；所述引物F10-1为序列表的序列44所示的单链DNA分子；所述引物F10-2为序列表的序列45所示的单链DNA分子；所述引物R10为序列表的序列46所示的单链DNA分子；

引物组11由引物F11-1、引物F11-2和引物R11组成；所述引物F11-1为序列表的序列47所示的单链DNA分子；所述引物F11-2为序列表的序列48所示的单链DNA分子；所述引物R11为序列表的序列49所示的单链DNA分子；

引物组12由引物F12-1、引物F12-2和引物R12组成；所述引物F12-1为序列表的序列50所示的单链DNA分子；所述引物F12-2为序列表的序列51所示的单链DNA分子；所述引物R12为序列表的序列52所示的单链DNA分子；

引物组13由引物F13-1、引物F13-2和引物R13组成；所述引物F13-1为序列表的序列53所示的单链DNA分子；所述引物F13-2为序列表的序列54所示的单链DNA分子；所述引物R13为序列表的序列55所示的单链DNA分子；

引物组14由引物F14-1、引物F14-2和引物R14组成；所述引物F14-1为序列表的序列56所示的单链DNA分子；所述引物F14-2为序列表的序列57所示的单链DNA分子；所述引物R14为序列表的序列58所示的单链DNA分子；

引物组15由引物F15-1、引物F15-2和引物R15组成；所述引物F15-1为序列表的序列59所示的单链DNA分子；所述引物F15-2为序列表的序列60所示的单链DNA分子；所述引物R15为序列表的序列61所示的单链DNA分子；

引物组16由引物F16-1、引物F16-2和引物R16组成；所述引物F16-1为序列表的序列62所示的单链DNA分子；所述引物F16-2为序列表的序列63所示的单链DNA分子；所述引物R16为序列表的序列64所示的单链DNA分子。

本发明还保护所述引物组合。

本发明还保护所述引物组合在小麦品种鉴定中的应用。

本发明还保护所述引物组合的试剂盒，所述试剂盒的用途为鉴定小麦品种。

本发明保护一种鉴定小麦品种的方法(方法甲)，包括如下步骤：检测待测小麦品种在所述16个SNP位点上的基因型；根据基因型确定待鉴定小麦的品种。

本发明还保护一种鉴定小麦品种的方法(方法乙)，包括如下步骤：提取待鉴定小麦品种的基因组DNA；利用所述引物组合对所述基因组DNA分别进行所述16个SNP位点的检测，从而获得待测小麦品种在所述16个SNP位点上的基因型数据；根据基因型数据确定待鉴定小麦的品种。

所述方法乙具体包括如下步骤：(1)提取待鉴定小麦品种的基因组DNA；(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，依次采用所述引物组合中的每个SNP位点对应的各条引物对模板进行KASP PCR扩增；(3)对步骤(2)得到的扩增的荧光信号进行收集和分析，获得待测小麦品种在所述16个SNP位点上的基因型数据，根据基因型数据确定待鉴定小麦的品种。

所述KASP PCR反应体系具体可为：PCR混合液(KASP 2×Master Mix)(英国Laboratory of the Government Chemist，货号：KBS-1016-002)2.5μL，正向引物1和正向引物2各0.2μL(终浓度0.2μM)，反向引物0.3μL(终浓度0.3μM)，模板0.5μL(DNA含量为25-50ng/μL)，ddH₂O 1.3μL,总体积5μL。

所述KASP PCR扩增可在ABI-ViiA7实时荧光定量PCR仪上进行，由仪器自带的ViiA^TM7Software v1.2.2软件对扩增的荧光信号进行收集和分析(参照软件使用说明书)。

本发明还保护一种用于鉴定小麦品种的试剂盒，包括权利要求所述引物组合及记载有所述方法乙的说明书。

以上任一所述小麦品种具体可为表1中所示的小麦品种。

本发明通过SNP芯片技术筛选出适合品种鉴定的多态性SNP位点，根据SNP位点DNA序列信息设计KASP分型引物，再利用KASP分型技术对44个审定小麦品种进行了鉴定分析，评价引物鉴别能力，构建了一组适合小麦品种鉴定SNP位点组合及快速分型方法，为小麦品种室内快速鉴定提供技术支撑。

附图说明

图1为44个小麦品种BS00074301_51位点的基因分型图。

图2为16个SNP位点对44个小麦品种遗传聚类分析结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例中的44个小麦品种见表1。表1中的所有品种均可从北京种子管理站农作物标准样品库获得。

表1 44个小麦品种及来源

实施例1、用于小麦品种鉴定的SNP位点的开发

取22个小麦常规种(编号1-22)和2个杂交种(编号7，8)及其亲本作为位点筛选材料，按照Illumina公司提供的基于光纤微珠芯片Infinium技术的操作流程进行，利用小麦Illumina 90K全基因组SNP芯片对这28个小麦品种进行分型鉴定，用IScan芯片扫描仪扫描分型结果，获得原始数据。用GenomeStudio软件进行数据分析，获得待测样品SNP位点的基因型数据。

结果显示，在81587个SNP位点中，平均数据获得率(Call rate值)为92.8％，其中16499个位点表现出多态性(表现为2或3种基因型),多态性位点比率为20.2％。根据多态性位点数据缺失率(低于5％)、重复性、信号强度、以及是否符合遗传规律，筛选出3467个SNP位点作为小麦品种鉴定的候选位点，并从中挑选16个基因型分布较为均匀(每种基因型比率不小于5％)的SNP位点(见表2)。

表2 SNP位点信息

实施例2、用于小麦品种鉴定的引物的开发

针对实施例1筛选得到的16个SNP位点设计引物，具体如表3所示。

每个SNP位点共有3个引物，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。

表3中的各条引物在使用时均以工作液的形式加入至反应体系中，引物在工作液的浓度均为5μM。

实施例3、小麦品种鉴定

1、提取表1中各小麦品种的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，依次采用表3中每个SNP位点对应的各条引物对模板进行KASP PCR扩增。

KASP PCR反应体系(5μL)：PCR混合液(KASP 2×Master Mix)(英国Laboratory ofthe Government Chemist，货号：KBS-1016-002)2.5μL，正向引物1和正向引物2各0.2μL(终浓度0.2μM)，反向引物0.3μL(终浓度0.3μM)，模板0.5μL(DNA含量为25-50ng/μL)，ddH₂O1.3μL。

扩增反应在ABI-ViiA7实时荧光定量PCR仪上进行，由ViiA^TM7Software v1.2.2对扩增的荧光信号进行收集和分析。采用PowerMarker 3.25软件计算SNP位点的多态性信息含量(PIC)，NTSYS-pc Version 2.0软件计算品种间的遗传相似性系数并进行遗传聚类分析。

44个小麦品种在表2中编号为11的BS00074301_51位点的分型图如图1所示。遗传聚类分析结果如图2所示(图2中，右侧数字对应表1中的小麦品种编号)。结果显示16个SNP位点在这些品种中的平均数据获得率为98.6％，多态性信息量(PIC)变幅为0.34-0.375之间，平均为0.365(表2)，均为中高度多态性信息引物。品种间遗传相似性系数介于0.167-0.96之间，平均遗传相似性系数为0.522，遗传聚类分析结果显示44个小麦品种之间至少有1个以上差异位点，说明该16个SNP位点组合具有较强的品种鉴别能力，能正确将44个小麦品种鉴别开，适合小麦品种鉴定。

<110> 北京市种子管理站

<120> 一组SNP位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用

<160> 64

<210> 1

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦

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<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n is c or t

<400> 1

gggtaacggc gctggagaag actgtcaggg aatttgcgga gcatccaggc naagtggtta 60

tggtgccaaa gattggaaca acttttgaca cgctcggaga a 101

<210> 2

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦

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<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n is a or c

<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 小麦

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<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n is c or t

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 小麦

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<400> 4

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gtgcctccac acacctactt tattcctctg ctgactctga c 101

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<212> DNA

<213> 小麦

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<221> misc_feature

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<223> n is c or t

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gaaactacag cagcaccttg cgaggttaac acttctcaaa ccgaggtatc nccttcactg 60

ccacttggag ttgcaaaaat ggaagtagaa tcactggagg t 101

<210> 6

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<213> 小麦

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 小麦

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<212> DNA

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gtgaactcag gctaatgcat ggatttcttt gccgggtgga tgtccggaat ntgaagaatc 60

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 小麦

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<221> misc_feature

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<400> 13

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aatgatttct ctcttataaa ctttagggtt aattctggtg g 101

<210> 14

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<212> DNA

<213> 小麦

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<221> misc_feature

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<223> n is g or t

<400> 14

ggctcaactg agattaattc tgttcggttc ttgtgctcat gcttgtctac ncctcagtat 60

ctccaccccg aggtagtcca cgacgccctg caccgcgacg t 101

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<212> DNA

<213> 小麦

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<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n is c or t

<400> 15

attattccgt tcatgattct tgtttcgtga gcgcgattaa catatgttca nacatagata 60

gataatataa gacacagaga tcgatcggct caactgagat t 101

<210> 16

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦

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<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n is c or t

<400> 16

ctgctgcatt gctggcagaa ccgctggacg gtatttccga ccaccgcggt ntttgcctta 60

gcatgcatct cgcagacctt gtgacgccga tggtaatcct t 101

<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gaatttgcgg agcatccagg ca 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttccaatctt tggcaccata accactt 27

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cttggtagtt tggttcgcct 20

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<212> DNA

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cacaaagcag caacaaacac gaccta 26

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gatcattttc tagttcttga attgcaactt t 31

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<213> 人工序列

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atcattttct agttcttgaa ttgcaacttc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgcagagca atgcatactt ctaaagaaa 29

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 33

actaagggct agcagttcca cg 22

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 34

ctccttcatg gttttcctct cagctt 26

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 35

atgtattgtc aaatacaaac acgccttaat 30

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 36

gtattgtcaa atacaaacac gccttaag 28

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 37

tgcagacgat tcatttggac tcagtaatt 29

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 38

ccgacgcatt atcttgtatg ttgca 25

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 39

cgacgcatta tcttgtatgt tgcg 24

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 40

agggcgtcaa accagggatg aaata 25

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 41

agcgagctag agaggaagtg aaat 24

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 42

gcgagctaga gaggaagtga aac 23

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 43

tcgctgtcca tcattcacct gctt 24

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 44

ccagattcca tagttctgat tcttcat 27

<210> 45

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 45

cagattccat agttctgatt cttcag 26

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 46

ttgccgggtg gatgtccgga at 22

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 47

cgcccaagtt catgtccgca t 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 48

cgcccaagtt catgtccgca g 21

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 49

cgtccagtaa gctgtgaaga aggaa 25

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 50

gtagtttcac cagctgccta gaaa 24

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 51

agtttcacca gctgcctaga ag 22

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 52

ctggaacgag catagcaaaa tcaaactta 29

<210> 53

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 53

ttataagaga gaaatcattt gcagcaagt 29

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 54

ataagagaga aatcatttgc agcaagc 27

<210> 55

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 55

cgtccatact cgttcttatg catacaata 29

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 56

gttcttgtgc tcatgcttgt ctact 25

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 57

cttgtgctca tgcttgtcta cg 22

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 58

ggactacctc ggggtggaga ta 22

<210> 59

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 59

cgtgagcgcg attaacatat gttcat 26

<210> 60

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 60

gtgagcgcga ttaacatatg ttcac 25

<210> 61

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 61

agccgatcga tctctgtgtc ttatattat 29

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 62

gtatttccga ccaccgcggt a 21

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 63

gtatttccga ccaccgcggt g 21

<210> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 64

tctgcgagat gcatgctaag gcaaa 25

Claims

1.引物组合，由16个引物组组成；

2.权利要求1所述的引物组合在小麦品种鉴定中的应用。

3.含有权利要求1所述的引物组合的试剂盒，所述试剂盒的用途为鉴定小麦品种。

4.一种鉴定小麦品种的方法，包括如下步骤：检测待测小麦品种在16个SNP位点上的基因型；根据基因型确定待鉴定小麦的品种;

所述16个SNP位点如下所示：

5.一种鉴定小麦品种的方法，包括如下步骤：提取待鉴定小麦品种的基因组DNA；利用权利要求1所述的引物组合对所述基因组DNA分别进行16个SNP位点的检测，从而获得待测小麦品种在所述16个SNP位点上的基因型数据；根据基因型数据确定待鉴定小麦的品种；

所述16个SNP位点如下所示：

6.一种用于鉴定小麦品种的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组合及记载有权利要求5所述方法的说明书。