CN114592083B - 一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记及其应用 - Google Patents

一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记及其应用。本发明针对玉米基因组上控制直链淀粉含量sbeⅡb基因的第5号染色体171764222位和171764104位的两处的SNP位点设计相应的KASP分子标记，每个KASP分子标记包括两条正向特异性引物和一条反向通用引物，根据本发明提供的KASP标记进行基因分型，在PCR扩增后不用酶切和电泳，可以高通量检测多个样品，快速检测sbeⅡb等位基因在高直链淀粉玉米和普通分离群体中的分布情况，结果准确性好，与常规分子标记相比具有快捷、简便和成本较低等优点，对于玉米的分子标记辅助选择育种具有重要意义。

Description

一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记及其应用。
背景技术
玉米作为现有重要的粮食作物之一，在粮食发展中具有至关重要的地位。玉米种子主要由胚乳、胚、种皮等三部分组成，其中胚乳占种子体积的85％。成熟的胚乳含有淀粉、蛋白质和脂肪等高分子碳水化合物。粮食作物中的淀粉含量约占籽粒胚乳的70％，其次是蛋白质10％和脂肪4.5％。植物在光合作用过程中产生的过量葡萄糖以淀粉的形式储藏在淀粉体中并为植物种子、胚乳和块茎的生长提供能源。
淀粉是自然界中的第二大可再生的碳水化合物，也是人类获取能量的主要来源。玉米淀粉的分子结构特征是其功能特性(如糊化特性等)以及体外和体内消化率的主要决定因素。淀粉颗粒由两种不同的葡萄糖聚合物-直链淀粉(Amylose)和支链淀粉(Amylopectin)组成，直链淀粉是一种由α-1,4-糖苷键连接而成的线性分子。当直链淀粉含量占总淀粉含量50％～70％时该玉米品种被称为高直链淀粉玉米。直链淀粉因其具有独特的结构特性和理化功能区别于支链淀粉，现有技术中无论是抗性淀粉在医疗保健中的作用还是以淀粉为材料而生产的生物可降解塑料在环保中的益处都离不开直链淀粉的贡献，它的应用前景也越来越广泛。
sbeⅡb基因是直链淀粉合成的主效基因。sbeⅡb基因的隐性突变能使淀粉合成途径中的淀粉分支酶(SBEⅡb)的活性降低，支链淀粉合成减少而胚乳直链淀粉百分含量明显增高。
利用基于表型选择的传统育种方法进行玉米直链淀粉含量的改良，选择准确性差，需要对每一代群体的植株均进行直链淀粉含量的测定，操作繁琐，不利于实验材料的高通量筛选。利用分子标记尤其是功能性分子标记进行直链淀粉含量的辅助选择，不受季节、环境限制，选择准确性更高；不存在基因是否表达的问题，在苗期即可对植株的直链淀粉含量进行基因型检测，大幅度提高了育种效率。单核苷酸多态性(SNP)是目前应用最为广泛的分子标记，关于SNP位点的检测方法有直接测序、分子信标、探针、等位基因特异性PCR(Allele specific PCR,AS-PCR)、竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive allelespecific PCR，KASP)等。玉米籽粒直链淀粉合成相关基因sbeⅡb的KASP分子标记的开发可以为高直链淀粉玉米新品种的高效分子标记辅助选择育种打下基础。
尽管关于SBEⅡb基因的功能研究已经有所报道，但是玉米功能标记及其利用研究还比较少，特别是有关玉米直链淀粉KASP标记研究尚未见应用。
发明内容
为了解决现有技术存在技术问题，本发明提供一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记及其应用。
第一方面，本发明提供一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记，包括(SEQID NO.1-3)：
正向引物1：5'-CGTTTTGGTACCCCAGAAGAA-3'，
正向引物2：5'-CGTTTTGGTACCCCAGAAGAT-3'，
反向通用引物：5'-CAAACCAAGCTCATGTGCTC-3'。
第二方面，本发明提供一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记，包括(SEQID NO.4-6)：
正向引物1：5'-TCTTAAATTTTAGTTCCGAATGATA-3'，
正向引物2：5'-TCTTAAATTTTAGTTCCGAATGATG-3'，
反向通用引物：5'-CGACGTTGTCATGTTGTTTGT-3。
本发明进一步提供包括上述两个KASP分子标记的KASP分子标记组合。
本发明进一步提供包括上述两个KASP分子标记中至少一个的试剂盒。
本发明进一步提供一种SNP位点在检测玉米的直链淀粉玉米基因sbeⅡb中的应用；
所述SNP位点为所述玉米的基因组5号染色体控制直链淀粉含量的sbeⅡb基因第171764222位，多态性为T/A；和/或，所述玉米的基因组5号染色体控制直链淀粉含量的sbeⅡb基因第171764104位，多态性为G/A。
本发明进一步提供所述KASP分子标记，所述KASP分子标记组合和所述试剂盒在检测玉米的直链淀粉玉米基因sbeⅡb中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测直链淀粉玉米基因sbeⅡb的方法，包括：
采用前述两个KASP分子标记PCR检测待测样本的DNA；
若检测结果中，第三外显子的SNP位点检测结果为T，和/或，第二内含子的SNP位点检测结果为G，
则认为所述待测样本含有直链淀粉玉米基因sbeⅡb。
进一步地，若第三外显子的SNP位点检测结果为A，和/或，第二内含子的SNP位点检测结果为A，则认为所述待测样本不含有直链淀粉玉米基因sbeⅡb。
进一步地，所述KASP分子标记中的正向引物1带有FAM荧光标签，正向引物2带有HEX荧光标签，通过荧光信号判断所述的KASP分子标记所检测的SNP位点的多态性。
本发明具备如下有益效果：
本发明提供了检测玉米高直链淀粉含量基因sbeⅡb的KASP分子标记，根据玉米基因组5号染色体sbeⅡb基因第171764104位处发生由A→G和第171764222位处发生由A→T的突变开发得到，根据本发明提供的KASP分子标记进行基因分型，在PCR扩增后不用酶切和电泳，可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率，为技术人员筛选携带sbeⅡb等位基因的水稻育种材料提供了一种高通量、低成本快速检测的方法，有效加快了育种进程，这对于选育高直链淀粉玉米具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的玉米不同材料中ZmSBEⅡb基因的全长cDNA PCR检测电泳图；其中M为DNA分子标准Marker，1-2泳道为B73和Mo17的n基因PCR扩增结果，3-8泳道为高直链淀粉材料PCR扩增结果，9泳道为空白对照，从全长序列扩增结果可以看出不同材料的SBEⅡb序列长度无明显差异。
图2位本发明实施例1提供的KASP标记对高直链淀粉样品和普通玉米样品部分植株sbeⅡb等位基因突变位点的检测电泳图；其中，M为DNA分子标准Marker，1-10泳道为普通玉米材料PCR扩增结果，11-24泳道为高直链淀粉材料PCR扩增结果。
图3为本发明实施例1提供的利用sbeⅡbKASP分子标记对高直链淀粉样品和普通玉米样品部分植株sbeⅡb等位基因的分型示意图。
图4为本发明实施例2提供的4种玉米材料的示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1、玉米材料准备
所用实验材料为高直链淀粉玉米、普通玉米，均是由新疆农业科学院核技术生物技术研究所玉米分子遗传育种实验室选育的携带高直链淀粉含量基因sbeⅡb的高直链淀粉玉米品种和携带低直链淀粉含量基因sbeⅡb的普通玉米品种等。
2、玉米叶片DNA的提取
玉米叶片在幼苗期采集，取100mg叶片加入液氮充分研磨，磨好的粉末利用CTAB法进行DNA提取。采用Thermo科技公司的NanoDrop ONE进行DNA浓度测定用于PCR扩增。
采用所设计的引物对待测样本的基因组DNA进行目标序列的PCR扩增并送测序；所述引物序列为(SEQ ID NO.7-8)：
sbeⅡb-F：5'-TGCAAATAATGGCAATCCAA-3'；
sbeⅡb-R：5'-AATCTTCCCCTCCCTTCCTGA-3'；
PCR部分结果如图1所示，其中M为DNA分子标准Marker，1-2泳道为B73和Mo17的n基因PCR扩增结果，3-8泳道为高直链淀粉材料PCR扩增结果，9泳道为空白对照，从全长序列扩增结果可以看出不同材料的SBEⅡb序列长度无明显差异。
3、KASP标记开发
KASP标记(sbeⅡb–KASP)是根据sbeⅡb基因编码区第13外显子SNP1突变位点和sbeⅡb基因非编码区第12内含子开发得到SNP2突变位点(基因组版本：Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)，sbeⅡb KASP标记引物根据互补链SNP1和SNP2位点前后各50bp的碱基序列进行设计，包括两条正向特异性引物和一条反向通用引物，两条正向引物分别对应FAM和HEX两种荧光信号，具体引物序列信息如下：
所述sbeⅡb-KASP(A-T)分子标记的引物序列为：
正向引物1：5'-CGTTTTGGTACCCCAGAAGAA-3'，
正向引物2：5'-CGTTTTGGTACCCCAGAAGAT-3'，
反向通用引物：5'-CAAACCAAGCTCATGTGCTC-3'。
所述sbeⅡb-KASP(A-G)的引物序列为：
正向引物1：5'-TCTTAAATTTTAGTTCCGAATGATA-3'，
正向引物2：5'-TCTTAAATTTTAGTTCCGAATGATG-3'，
反向通用引物：5'-CGACGTTGTCATGTTGTTTGT-3。
4、KASP分子标记sbeⅡb KASP的实施
(1)PCR扩增反应
将提取的DNA分别加入全裙边96孔板，配制反应体系进行PCR扩增反应。
PCR反应体系：反应体系总体积为10μL，包括2×KASP Master mix 5μL，KASPPrimer mix 0.14μL，模板DNA 1μL，dd H2O 3.86μL。
PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。
扩增结果如图2所示，其中，M为DNA分子标准Marker，1-10泳道为普通玉米材料PCR扩增结果，11-24泳道为高直链淀粉材料PCR扩增结果。从不同玉米自交系SBEⅡb突变区域的扩增结果可以看出不同材料的SBEⅡb序列长度无明显差异。
(2)KASP分子标记sbeⅡb KASP的基因分型
PCR扩增反应结束后，将数据导入R语言数据处理软件进行数据分析并做图根据颜色分类，如图3所示聚合在接近X轴的显示红色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示绿色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型。左下角显示紫色的样本为空白对照。
(3)直链淀粉含量测定
称取普通玉米淀粉和高直链玉米淀粉各0.1g于100mL烧杯中,加10mL 1mol/LKOH；将烧杯置于60℃水浴中充分搅拌10min，用蒸馏水定容至100mL，即可得1mg/mL浓度的工作液。在分光光度计测定两种淀粉的吸光谱,确定直链淀粉含量，如表1所示，通过测定结果发现高直链淀粉玉米直连淀粉含量在52.9-66.4％之间，普通玉米材料直链淀粉含量在20.9-29.5％之间。
基因分型结果如图3所示，60个单株被分成2组，其中20个单株与高直链淀粉A55_ae基因型相同，38个单株与普通玉米自交系B73基因型相同(图3)。
表1玉米高直链的方法材料KASP分型结果及直链淀粉含量
实施例2
1、玉米材料准备
所用实验材料为引自美国玉米遗传资源共享中心(http://maizecoop.cropsci.uiuc.edu/)的高直链淀粉材料517B_ae1、普通玉米自交系Mo17、白糯玉米品种万糯2018和高淀粉玉米材料HS19-1(图4)。
2、玉米叶片DNA的提取
玉米叶片在幼苗期采集，取100mg叶片加入液氮充分研磨，磨好的粉末利用CTAB法进行DNA提取。将稀释DNA至合适浓度。
3、KASP分子标记sbeⅡb-KASP的实施
(1)PCR扩增反应
将提取的DNA分别加入全裙边96孔板，配制反应体系进行PCR扩增反应。
PCR反应体系：反应体系总体积为10μL，包括2×KASP Master mix 5μL，KASPPrimer mix 0.14μL，模板DNA 1μL，dd H2O 3.86μL。
PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。
(2)KASP分子标记sbeⅡb-KASP的基因分型
PCR扩增反应结束后，将数据导出进行分析。基因分型结果显示，Mo17、万糯2018、HS19-1基因型与普通玉米自交系B73基因型相同，517_ae1与高直链淀粉A55_ae基因型相同。
(3)直链淀粉含量测定
称测定方法同实施案例1。在分光光度计测定两种淀粉的吸光谱,确定直链淀粉含量，如表2所示，通过测定结果发现高直链淀粉玉米517_ae1直连淀粉含量为59.2％，自交系Mo17直链淀粉含量在22.1％，万糯2018直链淀粉含量为5.3％，高淀粉玉米材料HS19-1直链淀粉含量为29.4％。
表2四种玉米材料的基因分型以及相应的直链淀粉含量检测结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 新疆农业科学院核技术生物技术研究所（新疆维吾尔自治区生物技术研究中心）
<120> 一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记及其应用
<130> KHP211125991.1
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgttttggta ccccagaaga a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgttttggta ccccagaaga t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaaccaagc tcatgtgctc 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcttaaattt tagttccgaa tgata 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcttaaattt tagttccgaa tgatg 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgacgttgtc atgttgtttg t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcaaataat ggcaatccaa 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatcttcccc tcccttcctg a 21

Claims (9)

1.一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记，其特征在于，包括：
正向引物1：5' -CGTTTTGGTACCCCAGAAGAA -3'，
正向引物2：5'- CGTTTTGGTACCCCAGAAGAT- 3'，
反向通用引物：5'- CAAACCAAGCTCATGTGCTC -3'。
2.一种直链淀粉玉米基因sbeⅡb的KASP分子标记，其特征在于，包括：
正向引物1：5' - TCTTAAATTTTAGTTCCGAATGATA -3'，
正向引物2：5'- TCTTAAATTTTAGTTCCGAATGATG- 3'，
反向通用引物：5'- CGACGTTGTCATGTTGTTTGT -3。
3.一种KASP分子标记组合，其特征在于，包括权利要求1所述的KASP分子标记和权利要求2所述的分子标记。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1和2所述的KASP分子标记。
5.一种SNP位点在检测玉米的高直链淀粉玉米基因sbeⅡb中的应用；
基于基因组版本Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0，所述SNP位点为所述玉米的基因组5号染色体控制直链淀粉含量的sbeⅡb基因第171764222位，多态性为T/A；和，所述玉米的基因组5号染色体控制直链淀粉含量的sbeⅡb基因第171764104位，多态性为G/A。
6.权利要求3所述的KASP分子标记组合，或权利要求4所述的试剂盒在检测玉米的高直链淀粉玉米基因sbeⅡb中的应用。
7.一种检测高直链淀粉玉米基因sbeⅡb的方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1和2所述的KASP分子标记PCR检测待测样本的DNA；
若检测结果中，权利要求1所述的KASP分子标记检测的SNP位点多态性为T，和，权利要求2所述的KASP分子标记检测的SNP位点多态性为G，则认为所述待测样本含有高直链淀粉玉米基因sbeⅡb。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，权利要求1和2所述的KASP分子标记中的正向引物1带有FAM荧光标签，正向引物2带有HEX荧光标签，通过荧光信号判断权利要求1和2所述的KASP分子标记所检测的SNP位点的多态性。
9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，所述PCR检测的程序为：
95℃预变性10min；95℃变性15s；61℃退火延伸60s，10个循环；95℃变性15s；55℃退火延伸60s，35个循环。
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