CN101768602A

CN101768602A - sh2、bt2过表达和sbeⅡa、sbeⅡb的RNAi抑制表达提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案及应用

Info

Publication number: CN101768602A
Application number: CN200910206267A
Authority: CN
Inventors: 张举仁; 李宁; 李坤朋; 李蓓; 杨爱芳; 张可炜
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2009-05-07
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2010-07-07

Abstract

本发明公开一种通过Sh2、Bt2基因过表达和SBEIIa、SBEIIb基因的RNAi抑制表达提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案及应用，其方法是将从玉米中克隆的Sh2和Bt2基因的正义形式分别用胚乳特异的启动子融合，然后重组到植物表达载体中，采用转基因技术将其导入玉米细胞，获得籽粒增大和淀粉含量高的转基因株系；同时将SBEIIa、SBEIIb基因的由胚乳特异启动子启动的RNAi结构转入同一基因型的玉米中，筛选出高直链淀粉的株系，通过转基因植株的杂交，创造出高直链淀粉且籽粒产量高的玉米新种质和新品种。也可将Sh2和Bt2基因和SBEIIa、SBEIIb基因的RNAi结构重组到同一植物表达载体中，通过转基因技术获得籽粒产量高的高直链淀粉的转基因植株及其后代。

Description

sh2、bt2过表达和sbeⅡa、sbeⅡb的RNAi抑制表达提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案及应用

技术领域

本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过sh2、bt2基因过表达和sbe IIa、sbe IIb基因的RNAi抑制表达提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案及应用。

背景技术

直链淀粉是重要的工业原料，用途广泛，涉及到各个领域，如食品、医疗、纺织、造纸、包装、石油、环保、光纤、高度印刷线路板和电子芯片等行业；另一个潜在利用价值是玉米高直链淀粉是生产光解塑料的最佳原料，利用直链淀粉生产光解塑料是解决目前严重“白色污染”的有效途径。但是普通玉米的直链淀粉含量在22％至28％之间，从普通玉米中提取直链淀粉成本很高。目前，我国所需的直链淀粉主要依赖进口，价格昂贵，是普通淀粉的16倍，每年花去大量外汇。迄今为止国内尚没有高直链淀粉的玉米品种。直链淀粉的合成受控于复杂的基因环境互作的影响，增加直链淀粉含量，则要降低产量和其它农艺性状。利用常规育种技术选育高直链淀粉玉米品种主要利用ae突变体及相关的修饰基因，遇到的主要问题是灌浆期籽粒水分含量较高，成熟后籽粒秕，淀粉含量少，籽粒产量低。利用基因工程技术创造高直链淀粉玉米则可采用完全不同的途径及方法，有希望攻克高直链淀粉玉米常规育种中遇到的难题。

淀粉合成的主要场所是淀粉体和叶绿体，整个过程受到一系列酶活性的调控，已知ae1(amylose extender1)、bt2(brittle endosperm2)、sh1(shrunken1)、sh2(shrunken2)、su1(sugary1)、和wx1(waxy1)基因等参与该过程。

在淀粉合成过程中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase(EC 2.7.7.27))起着关键作用，它催化了淀粉合成反应中的第一步反应，用一磷酸葡萄糖和ATP为底物，产生ADP-葡萄糖和焦磷酸PPi，即产生有活性的葡糖基供体ADP-葡萄糖。谷物胚乳中的AGPase有85％-95％都是胞质型的，是由两个大亚基和两个小亚基组成的异源四聚体，大小亚基是由不同基因编码的。玉米胚乳中编码该酶大小亚基的基因分别是Sh2、Bt2。磷酸根Pi对AGPase的反馈抑制作用限制淀粉合成和作物产量。但是也有证据证明在谷物的胚乳中，这种调节并没有在其它器官如叶子中重要。AGPase的修饰能引起对Pi抑制敏感性减少，结果产量提高，在马铃薯中淀粉含量增加，在玉米中表现为籽粒重量增加。AGPase的不稳定性或许是限制禾谷类产量的另一个因素，它是淀粉合成途径中热稳定性最差的酶。在玉米的大亚基中一个氨基酸的取代增加了大小亚基作用的稳定性。这样，降低了对变构抑制的敏感性，增加异四聚体的稳定性，显著提高了AGPase活性和增加籽粒产量。有研究表明，玉米点突变的AGPase基因转入其他作物后，也由于增强了亚基之间的相互作用，降低了磷的抑制效应，AGPase活力更强，最终增加了种子重量及总的生物量(Girouxet al.1996)。

提高淀粉含量成功的报道还包括采用反义技术抑制蔗糖磷酸合成酶基因的表达减少糖循环的竞争性抑制(Geigenberger et al.1999)，减少马铃薯块茎中催化丙酮酸向苹果酸转变的酶(NAD-dependent malic enzyme)活性(Jenner et al.2001)在这些实例中转基因块茎中的最大淀粉含量分别是对照的124％和117％。

淀粉分支酶是植物淀粉生物合成过程中另一个起重要调节作用的酶，一方面它能切开以α(1，4)糖苷键连接的葡萄糖，另一方面它又能把切下的短链通过α(1，6)糖苷键连接于受体链上，形成分枝结构。因此降低或抑制淀粉分支酶基因的表达则可以影响细胞内该酶含量或活性，从而减少支链淀粉的含量，提高直链淀粉的比例。玉米SBE可分为三种同工酶SBE I、SBEIIa、SBElIb。SBEI、SBEIIb主要存在于胚乳中，SBEIIa主要存在于叶片中。SBEI作用的底物是直链淀粉，它能使较长的糖苷链转移到直链淀粉上，但转移到支链淀粉上的能力很弱；SBEII的作用底物是支链淀粉，能使较短的糖苷键转移到支链淀粉上，且2a活性大大高于IIb。但SBEIIb对胚乳直链淀粉含量的作用最大，其编码基因的突变(玉米ae突变体)可使玉米胚乳中直链淀粉的含量达到50％。另外，颗粒结合的淀粉合成酶控制直链淀粉的合成，存在于质体基质中的可溶性淀粉合成酶参与支链淀粉合成。

由于SBE II以支链淀粉为底物，因此，抑制SBEII比抑制SBEI更能增加直链淀粉的含量。SBE IIa主要在叶片淀粉合成中发挥作用，抑制其表达对植株的正常发育有一定影响。SBE IIb主要存在于胚乳中，降低或抑制SBE IIb的表达则可以影响胚乳内该酶的含量或活性，从而减少支链淀粉的含量，提高直链淀粉的含量及比例。

提高玉米籽粒直链淀粉含量的现有途径主要有2条，1)利用ae突变体及相关的修饰基因的常规育种途径，已获得直链淀粉高达60％的玉米品种，但籽粒产量低，生产成本高；2)采用反义技术或RNAi技术的生物工程途径，目前国内外许多实验室均在探索该途径，但直链淀粉超过50％的材料尚未见报道。

研究进展

提高作物收获器官淀粉含量的植物基因工程从上世纪80年代后期以来一直受到重视，已有大量的工作。由于植物AGPase是一个变构调节酶，许多实验室关注于无变构调节特性的AGPase基因的利用，或通过突变降低AGPase活性的反馈抑制调节。到目前为止，最成功的实例是利用细菌的非反馈调节的AGPase基因转入植物的研究，将该酶基因转入马铃薯实现异源表达，转基因的块茎淀粉积累量是对照的135％(David et al.1992)。然而，在另一个马铃薯品种中转入该基因并未显著提高淀粉含量(Sweetlove et al.1996)。将这个AGPase基因转入烟草，转基因愈伤组织的淀粉积累量是对照的791％(Davidet al.1992)。谷类的产量是籽粒数和籽粒重的函数，后二者主要被籽粒库强度控制。变构酶AGPase在调节禾谷类籽粒中的淀粉合成起核心作用，很可能是种子库容强度是最重要的决定因子。Giroux等于1996报道，玉米胚乳AGPase大亚基的一个天然突变rev6引起Pi对AGPase活性的变构抑制作用减弱，玉米籽粒重量增加了15％左右。Smidansky等用一个修饰的玉米Sh2基因(Sh2r6hs)转化小麦，这个改变的大亚基导致该酶对负调节因子Pi敏感性降低和大小亚基结合更稳定。转基因Sh2r6hs小麦在连续种植5代后仍然保持其性状，从转基因植株的正发育种子提取AGPase，在体外一系列无机磷浓度下检测酶活性，得出比对照小麦明显升高的酶活性。转基因Sh2r6hs小麦单株籽粒重平均增加38％，总生物量增加31％。王国英实验室(2007)将来自大肠杆菌的突变基因glgC(glgC16)即编码对反馈抑制不敏感的AGPase的基因与胚乳特异性的启动子融合后转入玉米，提高了玉米籽粒重量。在该工作中，正发育的转基因玉米籽粒的AGPase体外在抑制性Pi浓度(5mM磷酸盐)存在下表现出比对照更高的酶活性，约上升2-4倍；具有较高细胞质AGPase活性的转基因植株的种子比未转基因植株的对照重13-25％。另外，所有转基因植株的种子均籽粒饱满，果穗籽粒数和对照相比未出现明显差异。从这些结果看出，增加胞质AGPase活性对库活性有明显效应，增加籽粒重量。

ae1基因编码SBEIIb，其突变导致玉米籽粒皱缩，重量大幅度减少，直链淀粉含量大幅度增加(Fisher et al.，1996；Kim et al.，1998)。1997年，Gao等报道了SBEIIa基因的部分mRNA序列(U65948.1)，长度2795bp，其中编码框为2446bp，编码814个氨基酸。1998年，Kim等向GenBank提交了SBEIIb基因cDNA序列(AF072725.1)，全长2400bp，编码799个氨基酸，确定了是由ae基因编码。Blast分析表明这2个基因之间存在82％的相似性，并有高度保守区存在。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过sh2、bt2基因过表达和sbe IIa、sbe IIb基因的RNAi抑制表达提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案及应用。

本发明通过RT-PCR方法从玉米胚乳cDNA或基因组中克隆到了玉米胚乳AGP酶的大小亚基基因Sh2和Bt2和玉米淀粉分支酶基因SBE IIa、IIb特异区和保守区的部分片段，克隆的AGP酶的大小亚基基因Sh2、Bt2和SBE IIa、IIb的片段经测序验证，然后与胚乳特异性表达的启动子融合，插入到植物表达载体中，Sh2和Bt2基因可以单基因形式也可以双基因串联形式重组到植物表达载体甲，SBE IIa、IIb的特异区和保守区的部分片段插入植物表达载体中产生植物RNAi结构。

在本发明中，考虑到RNAi的效率很难预测，为了实现靶基因的表达被有效抑制，参考已发表的SBE IIa和SBE IIb的核苷酸序列，通过对序列的分析，找出它们的基因保守区及特异区，然后人工合成引物，用Pyrobest Taq酶以梯度PCR的方法从玉米胚乳cDNA库中分别扩增出不同长度的SBE IIa和SBE IIb基因的保守区和特异区片段，并根据序列特点进行克隆片段的组合，构建不同的RNAi载体。

在本发明中，从玉米基因组中克隆出27kd和22kd醇溶蛋白基因的启动子序列(分别为P27kd和P22kd，胚乳特异性表达的启动子)，经测序后确定，选择正确的序列重组到植物表达载体pCAMBIA3300-P35S-bar中，得到pCAMBIA3300-P27kd-P35S-bar和pCAMBIA3300-P22kd-P35S-bar。其中P35S为来自花椰菜花叶病毒的35SRNA的启动子，为组成型启动子。

在本发明中，从玉米cDNA文库中分别克隆到的玉米胚乳特异性的AGP酶的大小亚基基因Sh2和Bt2，经测序鉴定后重组到植物表达载体pCAMBIA3300-P27kd-P35S-bar或pCAMBIA3300-P22kd-P35S-bar，获得质粒pCAMBIA3300-P27kd-Bt2-P35S-bar和pCAMBIA3300-P22kd-Sh2-P35S-bar，并通过限制性内切酶消化鉴定确保插入方向正确。

在本发明中，用EcoRI和Hind III双酶切植物表达载体pCAMBIA3300-P27kd-Bt2-P35S-bar，回收外源DNA片段加上EcoRI-HindIII adaptor，经HindIII酶切后回收片段。同时用HindIII酶切载体pCAMBIA3300-P22kd-P35S-bar，回收载体并脱磷后与外源片段连接得到载体pCAMBIA3300-P27kd-Bt2-P22kd-P35S-bar。用XbaI酶切质粒T-easy-Sh2，回收大约1.7Kb的Sh2全长片段，将其插入用XbaI酶切的SK⁺载体中，然后再用BamH I和Sac I双酶切得到带有BamH I和Sac I酶切位点的Sh2。同时用BamH I和Sac I双酶切载体pCAMBIA3300-P27kd-Bt2-P22kd-P35S-bar，回收后与Sh2连接得到植物表达载体pCAMBIA3300-P27kd-Bt2-P22kd-Sh2-P35S-bar。

在本发明中，ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆主要采用PCR扩增技术。首先从数据库查询和文献查阅得到已发表的玉米胚乳特异性的AGP酶大、小亚基基因Sh2和Bt2的核苷酸序列。因在已有资料中Sh2没有全长cDNA序列，在已发表序列的5’端可能缺少了200bp左右的核甘酸，因此，设计嵌套引物进行5’RACE得到其完整的5’端，进而设计引物通过PCR扩增得到该基因的cDNA全长。用于Sh2基因cDNA序列5’RACE的特异性引物为：GSP1：5’CGATGAATATGGCGGTTAAGCGAAGTAG 3’，NGSP1：5’ATCTGGTGAGGACCTGAGTTCGTG3’；用于扩增Sh2编码区全长序列的引物序列为：

5’端引物5’GCTCTAGAGCTCGGGAGGCAAGTGCGATTT 3’，

3’端引物5’GCTCTAGAGCGTCAAGCGGCTCTTACCATACCAA 3’，在引物5’端均加上带有保护碱基的限制性内切酶位点XbaI(下划线处)。以玉米胚乳cDNA为模板，用HotStart Taq酶进行5’RACE的Touchdown PCR反应。5’RACE的PCR反应条件为：95℃ 4min；95℃1min、72℃ 1min，5 cycles；95℃ 1min、72℃ 1min(dT＝-1℃)、72℃ 1min，6 cycles；95℃ 1min、65℃ 1min、72℃ 1min，29 cycles；最后再在72℃下延伸5min。Sh2全长扩增用Pyrobest Taq酶进行梯度PCR，反应条件：95℃ 5min；95℃ 1min、57℃ 1min(±4℃)、72℃ 2min，35 cycles；72℃ 7min。

Bt2有全长序列报道，直接人工合成引物，用PCR方法从玉米中扩增其全长序列。为了转基因方便，先以玉米未成熟种子mRNA为模板合成胚乳cDNA库，然后采用RT-PCR方法直接用Pyrobest Taq酶扩增Bt2全序列，得到一条特异的目的基因扩增产物，分子量大小1.7kb左右，与预期分子量大小一致。用于扩增Bt2编码区全长序列的引物序列为：

5’端引物5’GACTAGTCATGGACATGGCTTTGGC 3’，

3’端引物5’GACTAG TCATGTATCCCCAAATCCAGGC 3’，在引物5’端均加上带有保护碱基的限制性内切酶位点SpeI(下划线处)。PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、57℃ 1min(±4℃)、72℃ 2min，35 cycles；72℃ 7min。Bt2的PCR产物经纯化后与pGEM-T-easy载体连接，从阳性克隆中提取质粒DNA并进行限制性内切酶酶切分析，初步确定克隆的Bt2基因的大小是正确的。Bt2的编码区全序列长为1428bp，与预期设计的完全相符。将测得的Bt2的编码区全序列与GenBank中已发表的核苷酸序列(Accession No.AF330035)进行比较，同源性为99％，只有2个碱基不同。这2个碱基均位于编码区内，但都没有影响读码框。其中第969个碱基突变造成了由异亮氨酸(323)向甲硫氨酸的突变，第1347个碱基突变造成了由甲硫氨酸(449)向精氨酸的突变。为了防止由测序造成的错误，连续测定两个克隆，得到为同样结果。通过对其保守区的分析，发现氨基酸的突变均在其保守范围之内，有可能是由于材料不同造成这样的差异。

在本发明中，采用PCR方法分别扩增玉米淀粉分支酶基因SBE IIa和IIb的特异区和保守区片段。即用Pyrobest Taq酶以梯度PCR的方法从玉米cDNA文库中扩增不同长度的SBE IIa和SBE IIb基因的保守区和特异区的片段。用于扩增SBE IIa特异区片段的引物为：特5’长：5’ACTTGCCGTCGGTGCTCT3’，特3’长：5’CCAACATTGGGTCAATCT CAT 3’；特5’短：5’ATGACTTGCTTTCCTCCG 3’，特3’短：5’TCCTCAGCCTCAACTCCT 3’；在引物5’端分别加上1个带有保护碱基的限制性内切酶位点Xho I和XbaI，扩增产物为：SBE IIa特长片段和SBE IIa特短片段分别为417bp和154bp。用于扩增SBE IIb特异区片段的引物为：特5’：5’CGGTCGCTGGGGTTTTAG 3’，特3’：5’GAGCCGAGT CAGCCCTTG3’，在引物的5’端各加上1个带有保护碱基的限制性内切酶位点BamHI和NcoI，扩增产物为SBE IIb特异区片段。用于扩增SBE IIb和SBE IIa保守区片段的引物为：保5’长：5’AGTCCTCCCAAGAATAAAA 3’，保5’中：5’CACTCATCACGG ATTACAA 3’，保3’(通用)：5’TATGTAATGCTATCCCACG 3’，在引物的5’端各加上1个带有保护碱基的限制性内切酶位点XbaI和NcoI，扩增产物为：SBEIIb保长片段和SBEIIb保中片段，分别为893bp和467bp。

在本发明中，扩增SBE IIa特异区短片段和SBE IIb保守区中片段的PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、50℃ 1min(±5℃)、72℃ 30s，35 cycles；72℃ 7min。扩增SBE IIb特异区片段的PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、59℃ 1min(±5℃)、72℃ 30s，35 cycles；72℃ 7min。扩增SBE IIa特异区长片段的PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、55℃ 1min(±5℃)、72℃ 30s，35 cycles；72℃ 7min。扩增SBE IIb和SBE IIa保守区长片段的PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、53℃1min(±5℃)、72℃ 1min，35 cycles；72℃ 7min。

在本发明中，RNAi载体的构建采用常规分子生物学技术。首先将分别克隆到pGEM-T载体中的玉米淀粉分支酶基因SBE IIa和SBE IIb的基因片段测序，选择正确的重组子进行RNAi载体的构建。分别选用合适的限制性内切酶酶切T-easy-SBE IIa特长片段、T-easy-SBE IIa特短片段、T-easy-SBE IIb特异区片段、T-easy-SBE IIb保守区长片段和T-easy-SBE IIb保守区中片段，然后按照合适的顺序将它们连入pFGC5941 RNAi载体中。

在本发明中，考虑到RNAi载体效率的问题，设计引物从pCAMBIA1305.1中克隆出Catalase intron，将pFGC5941 RNAi载体中的内含子更换，然后再插入SBE IIb保守区长片段，比较不同内含子对干扰效率的影响。

在本发明中，构建好的SBE II基因的RNAi结构及选择基因有：P35S-2bc-bar；P27kd-2bc-bar；P35S-2b中-bar；P27kd-2b中-bar；P35S-in’-bar；P27kd-in’-bar；P35S-2ac-2bt-bar；P27kd-2ac-2bt-bar；P35S-2ad-2bt-bar；P27kd-2ad-2bt-bar。其中，2bc，2b中分别代表从淀粉分支酶基因SBE IIb和IIa的同源序列中选择的长为893bp和467bp的片段，2ac，2ad分别代表从淀粉分支酶基因SBE IIa中选择的长为417bp和154bp的特异序列，且均与SBE IIb的保守区的一段295bp序列相连，2bt代表从淀粉分支酶基因SBE IIb扩增的SBE IIb；in’代表将原载体为1300bp的内含子更换为200bp的gus基因内含子，干扰结构仍以2bc为基础。bar为抗除草剂草丁膦基因，由花椰菜花叶病毒35S启动子启动。

在本发明中，用含有目标基因或RNAi结构的植物表达载体转化玉米，获得转基因或RNAi结构的植株。可采用玉米自交系胚性愈伤组织遗传转化方法获得转基因植株。

在本发明中，玉米(Zea mays L.)自交系植株在自交授粉后9-15天，取果穗剥去苞叶后于70％酒精中浸泡5min，无菌条件下挑取约1.0-1.2mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养基每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织作为遗传转化的受体材料。

在本发明中，采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取1.0μm大小的金粉，经70％乙醇洗涤后静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水彻底清洗3次，然后50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl₂、20μl 0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。离心弃上清液后，加70％乙醇静置。然后离心弃上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。

在本发明中，在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养皿中每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6-9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。将材料转入加有选择剂(如1.8-1.2ml

/L)的培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继代时淘汰变褐死亡的组织块。经过筛选的抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约10cm高时栽到大田中，自交结实。转基因植株采用PCR检测法筛选，Southern blotting验证。

在本发明中，转基因玉米植株的检测及利用的一般程序为：采用PCR方法检测出含转基因的玉米阳性植株，套袋自交或姊妹交结实。收获的种子播种在土盆中，喷洒除草剂水溶液，并以未转基因自交系种子为对照。对照自交系植株出苗后很快死亡。采用实时定量RT-PCR或Northern杂交分析表明目标基因在这些转基因植株胚乳中的表达水平，并以未转基因植株和不含目的基因的空载体转化植株的胚乳为对照材料。选出优异的转基因植株套袋自交纯合。具体方法为：

T1-T3代植株获得将阳性T0代的种子，各选取淀粉含量或组分有变化的5-6个株系进行加代种植，(为防止雌雄发育不同期的问题，分两批种，间隔10天)，三叶期对T1代植株进行除草剂初筛，然后将抗性好的植株定植入温室或大田，长出新叶后进行PCR检测和实时定量RT-PCR或Northern杂交分析，采用Southern杂交确定转基因的插入位点数目。T1代植株进行自交和部分杂交，获得到过表达和干扰表达的T2代自交材料，杂交一代材料。种子完全晾干后，每种材料选8-10粒种于花盆，三叶期时进行除草剂筛选，然后进行PCR和实时定量RT-PCR检测。T2代植株进行自交和部分杂交，收获T3代和F1代。分子检测方法参照常规的分子生物学方法。

在本发明中，转基因材料淀粉含量测定采用常规方法。即随机挑选各株系4-5粒玉米籽粒，沸水煮3分钟，脱去种皮，去掉胚，于50℃下烘干至恒重。用研钵将烘干的胚乳研磨碎，过80目筛，即得到备用粗淀粉品。总淀粉含量测定选用高氯酸法，即脱去可溶性糖后测定粗淀粉。具体步骤为：

1.称取50mg淀粉样品，入7.5ml小管，加入4ml80％乙醇，80℃水浴40min，其间不断搅拌混匀；5000rpm离心10min，收集上清；往残渣中加入2ml80％乙醇，重复抽提2次，合并上清；上清中加入10mg活性炭，80℃脱色30min；定容至10ml，过滤取滤液测定；显色及比色吸取上述提取液0.5ml，加入5ml蒽酮试剂，沸水浴2min，取出冷却，在625nm处测定OD值。

2.将上述去除可溶性糖50℃烘干后，往残渣中加入3ml ddH₂O，混匀搅拌，沸水浴15min，冷却后加入2ml高氯酸(72％)，混匀搅拌提取15min，10000rpm离心5min，取上清入10ml管；往残渣中加入2ml高氯酸(72％)，重复抽提一次，合并上清。(此次抽提离心后不容物为悬浮物，浮在液面上，容易破碎，吸取上清时要非常小心)；取0.5ml提取液稀释至10ml，从中吸取0.5ml液体，加5ml蒽酮，沸水2min，测定OD620nm的光吸收值。以可溶性淀粉制作标准曲线，通过标准曲线确定样品淀粉含量。

在本发明中，直链淀粉含量测定采用常规方法。具体步骤为：

1.样品分散：称取相当于0.1000g粗淀粉的样品于100ml容量瓶中，加1ml无水乙醇，充分湿润样品，再加入9ml 1mol·L^-1氢氧化钠溶液，于沸水浴中分散10min，迅速冷却，用蒸馏水定容。

2.脱脂：取20ml分散液于50ml刻度试管中，加入7～10ml石油醚，间歇摇动10min，静止15min，分层后吸去上部石油醚层。

3.测定：吸取脱脂后的碱分散液0.5ml于10ml容量瓶中，再加入1mol·L^-1乙酸溶液1ml及碘试剂2ml，用ddH₂O定容。显色10min后，在620nm处读取吸光度。直链淀粉遇碘变蓝，而支链淀粉遇碘变红。

在本发明中，不同转基因材料通过套袋杂交产生高籽粒产量高直链的玉米材料。用转Bt2基因和Sh2基因且籽粒淀粉含量显著增加的植株作父本或母本，同转RNAi结构且直链淀粉含量显著升高的植株杂交，从其后代中选育高籽粒产量高直链淀粉的自交系。然后将来自不同杂交优势群的转基因自交系杂交，选择高籽粒产量高直链淀粉的杂交种。

本发明的有益效益

根据本发明方案，将Bt2基因和Sh2基因共同转入玉米骨干自交系，籽粒产量与为转基因自交系相比增加8-12％，淀粉可高于76％；将单一的RNAi干扰结构转入玉米骨干自交系，直链淀粉含量最高达55％以上，籽粒总淀粉含量和对照相比差异不显著；同时干扰淀粉分支酶SBE IIa和SBE IIb基因的表达，直链淀粉含量达60％，总淀粉含量和对照相比略有降低，但差异未达到显著水平。将来自同一自交系的转基因高淀粉植株和转基因高直链淀粉植株杂交，获得的转基因纯合自交系籽粒产量和未转基因对照自交系相近，籽粒总淀粉含量达70％左右，高直链淀粉含量最高为62％。即同现有的高直链淀粉商业品种相比，籽粒产量高，直链淀粉含量相近，即单位面积玉米生产的直链淀粉量成倍增加。

具体实施方式

实施例1：SBE IIa和SBE IIb基因的RNAi结构的构建和选择

1)SBE IIa和SBE IIb基因片段的克隆

采用PCR方法分别扩增玉米淀粉分支酶基因SBE IIa和IIb的特异区和保守区片段。根据SBE IIa和IIb基因的序列，设计用于扩增SBE IIa和IIb的特异区和保守区片段的引物。用于扩增SBE IIb基因特异片段的引物为：特5’：5’CGGTCGCTGGGGTTTTAG 3’，和特3’：5’GAGCCGAGTCAGCCCTTG 3’，在引物的5’端各加上1个带有保护碱基的限制性内切酶位点BamHI和NcoI。用于扩增SBE IIa基因特异片段的引物为：特5’长：5’ACTTGCCGTCGGTGCTCT 3’，和特3’长：5’CCAACATTGGGTCAATCTCAT 3’；特5’短：5’ATGACTTGCTTTCCTCCG 3’，和特3’短：5’TCCTCAGCCTCAACTCCT 3’；在引物5’端分别加上1个带有保护碱基的限制性内切酶位点XhoI和XbaI。用于扩增SBE IIb和SBE IIa基因保守区片段的引物为：保5’长：5’AGTCCTCCCAAGAATAAAA 3’、保5’中：5’CACTCATCACGGATTACAA3’，和保3’(通用)：5’TATGTAATGCTA TCCCACG 3’，在引物的5’端各加上1个带有保护碱基的限制性内切酶位点XbaI和NcoI。选用Pyrobest Taq酶，采用梯度PCR方法从玉米cDNA文库中扩增不同片段。为SBE IIb特异区片段扩增产物长462bp，SBE IIa特长片段扩增产物为417bp，SBE IIa特短片段扩增产物为154bp；SBE IIa和SBE IIb基因的保守区的保中片段为467bp，保长片段为893bp。

扩增SBE IIa特异区短片段和SBE IIb保守区中片段的PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、50℃ 1min(±5℃)、72℃ 30s，35 cycles；72℃ 7min。扩增SBE IIb特异区片段的PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、59℃ 1min(±5℃)、72℃ 30s，35 cycles；72℃ 7min。扩增SBE IIa特异区长片段的PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、55℃ 1min(±5℃)、72℃ 30s，35 cycles；72℃ 7min。扩增SBE IIb和SBE IIa保守区长片段的PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、53℃ 1min(±5℃)、72℃ 1min，35 cycles；72℃ 7min。

2)RNAi结构的构建

RNAi结构的构建采用常规分子生物学技术。首先将扩增出的玉米淀粉分支酶基因SBE IIa和SBE IIb的基因片段分别克隆到pGEM-T载体中的测序，选择正确的扩增片段用于构建RNAi结构。选用合适的限制性内切酶分别酶切T-easy-SBE IIa特长片段、T-easy-SBE IIa特短片段、T-easy-SBE IIb特异区片段、T-easy-SBE IIb保守区长片段和T-easy-SBE IIb保守区中片段，然后将它们分别与胚乳特异的启动子P27kd相连，再插入pFGC5941RNAi载体中，让SBE IIa和/或SBE IIb基因片段的转录本能形成RNAi干扰所需的发夹结构。

3)含RNAi结构的植物表达载体的构建

首先将分别克隆到T-easy载体中的玉米淀粉分支酶基因SBE IIa和SNE IIb的基因片段测序，选择正确的重组子进行RNAi结构的构建。分别选用合适的限制性内切酶酶切T-easy-SBE IIa特长片段、T-easy-SBE IIa特短片段、T-easy-SBE IIb特异区片段、T-easy-SBE IIb保守区长片段和T-easy-SBE IIb保守区中片段，然后按照合适的顺序将它们连入RNAi结构表达载体中，获得含有不同RNAi结构的植物表达载体。然后通过酶切鉴定，确定重组体是否正确。

4)转不同RNAi结构的玉米获得

用携带不同RNAi结构的植物表达载体分别转化玉米，利用除草剂抗性基因bar进行筛选，获得抗草丁膦的转基因的植株，利用PCR、Southern blotting和RT-PCR等方法检测并选择转基因植株。转基因套袋自交3-4代，选择转基因纯合株系测定籽粒淀粉含量和直链淀粉含量。采用玉米自交系胚性愈伤组织遗传转化方法或无菌苗生长点转化方法获得转基因植株。

5)不同RNAi结构的选择

根据转基因纯合株系籽粒的直链淀粉含量及淀粉含量，以及单位面积的玉米籽粒产量，选择直链淀粉含量和籽粒产量的RNAi结构，并用于批量转化玉米。

实施例2：多基因(RNAi结构)转化载体的构建和高直链淀粉高产玉米创造

1)玉米胚乳AGP酶的大小亚基基因Sh2和Bt2的克隆

根据玉米胚乳特异性的AGP酶大、小亚基基因Sh2和Bt2的核苷酸序列，利用已构建的胚乳cDNA文库，设计引物通过PCR扩增得到基因的cDNA全长。用于扩增Sh2编码区全长序列的引物序列为：5’端引物5’GCTCTAGAGCTCGGGAGGCAAGTGCGA TTT 3’，3’端引物5’GCTCTAGAGCGTCAAGCGGCTCTTACCATACCAA 3`，在引物5’端均加上带有保护碱基的限制性内切酶位点XbaI(下划线处)。Sh2全长扩增用Pyrobest Taq酶进行梯度PCR，反应条件：95℃ 5min；95℃ 1min、57℃ 1min(±4℃)、72℃ 2min，35 cycles；72℃ 7min。用于扩增Bt2编码区全长序列的引物序列为：5’端引物5’GACTAG TCATGGACATGGCTTTGGC 3’，3’端引物5’GACTAGTCATGTATCCCCAAATCCAGG C 3’，在引物5’端加上带有保护碱基的限制性内切酶位点SpeI(下划线处)。PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 1min、57℃ 1min(±4℃)、72℃ 2min，35 cycles；72℃ 7min。

PCR产物经纯化后与T-easy载体连接，从阳性克隆中提取质粒DNA并进行限制性内切酶酶切分析，初步确定克隆的基因的大小是正确的。然后测序鉴定得，并与GenBank中已发表的核苷酸序列进行比较，确定克隆的基因为Sh2和Bt2。

2)SBE IIa和SBE IIb基因片段的克隆

同实施例1。

3)含RNAi结构的植物表达载体的构建

首先将分别克隆到T-easy载体中经测序验证的玉米Sh和Bt2基因分别与胚乳特异表达的启动子P27kd和P22kd相连、形成融合基因。同时将用淀粉分支酶基因SBE IIa和SBE IIb的基因片段构建不同的RNAi结构。然后分别选用合适的限制性内切酶将融合基因和RNAi结构重组到植物表达载体中，产生质粒pCAMBIA3300-P27kd-Bt2-P22kd-Sh2-P27kd-2ac-2bt-P35S-bar、pCAMBIA3300-P27kd-Bt2-P22kd-Sh2-P22kd-2ad-2bt-P35S-bar等多基因表达载体。然后通过酶切鉴定，确定重组体是否正确。重组采用常规的分子生物学技术。

4)转基因玉米的产生和选择

用携带不同多基因转化质粒的根瘤农杆菌分别转化玉米自交系，利用除草剂抗性基因bar进行筛选，获得抗草丁膦的转基因的植株，利用PCR、Southern blotting和RT-PCR等方法检测并选择转基因植株。转基因套袋自交3-4代，选择转基因纯合株系测定籽粒淀粉含量和直链淀粉含量。遗传转化步骤及方法见实施例3和实施4。

根据转基因纯合株系籽粒的直链淀粉含量及淀粉含量，以及单位面积的玉米籽粒产量，选择直链淀粉含量和籽粒产量的多基因转化载体用于批量转化玉米。

实施例3：玉米丛生芽组织块转化创造高直链淀粉高产自交系及应用

1)受体系统的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、掖478、掖515等的自交种子。离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基有：

种子萌发培养基：KNO₃ 1900mg/l，NH4NO₃ 1650mg/l，CaCl₂·2H₂O 440mg/l，MgSO₄·7H₂O 370mg/l，KH₂PO₄·H₂O 170mg/l，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/l，ZnSO₄·7H₂O 10mg/l，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/l，H₃BO₃ 10mg/l，KI 0.83mg/l，Na₂MoO₄·2 H₂O 0.5mg/l，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/l，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，烟酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30g/l，琼脂粉7g/l，pH 5.8-6.0。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。

A培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5～9.0μmol/l和2，4-D 1.0-3.0μmol/l，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。

B培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于丛生芽组织块分化小苗。

成苗培养基：种子萌发培养基附加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l，用于丛生小芽发育成小苗。

生根培养基：种子萌发培养基附加IBA 2.8-3.6μmol/l，用于无根小苗生根。

基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。

种子灭菌和萌发：玉米种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10--15分钟，然后用无菌水洗涤3--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30-40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下1-2天。萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。

茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化：萌发种子的胚芽伸长止3-5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下(24-27℃)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6-10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4-D浓度取3.0μmol/l；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为1.0μmol/l，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2-3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5-6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。

2)以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生

将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有选择剂抗性基因和目标基因)的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol/l的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5--20倍用于转化。

取继代后培养13--20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的培养基上于黑暗中培养7-12天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂草丁膦的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4-D的A培养基上恢复培养后产生小芽。

将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-3000lx，光照14-15小时/天。小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40％的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。

3)转基因植株籽粒的淀粉含量测定和选择利用

取移栽成活的转化植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。采用PCR方法检测出转入基因的玉米阳性植株，套袋自交或姊妹交结实。收获的种子播种在土盆中，喷洒除草剂草丁膦水溶液，并以未转基因自交系种子为对照。草丁膦浓度的因玉米基因型不同而有差异，以未转基因小苗在15天左右(日温26-32℃，夜温20℃左右)全部死亡为宜。对照自交系植株出苗后半月内死亡，转基因植株虽在喷施后3-7天间生长变慢，部分叶片出现药害，但很快恢复正常生长。在转基因植株套袋自交后的20天左右，取部分果穗的未成熟籽粒提取mRNA并检测胚乳中酶活性，采用RT-PCR或实时定量RT-PCR技术检测目标基因的表达强度，结合酶活性测定值，选择出转基因表达强度高的植株。结果表明，在未转基因植株和不含目的基因的空载体转化植株胚乳中目标基因的表达水平差别不显著。选出优异的转基因植株用于传代。

对3叶期T₂代植株进行除草剂初筛，之后，将抗性好的植株定植入温室大田，长出新叶后，进行PCR、Southern杂交、RT-PCR或Northern杂交分子检测。转基因植株进行自交和部分杂交，果穗单株收获，称取籽粒百粒重，部分籽粒用于淀粉含量测定。选取淀粉含量有明显提高的T2、T3代株系进行种植、自交和部分杂交，获得转基因过表达稳定和转基因纯合的株系。

然后在适宜生长环境下进不同株系的产量比较试验和籽粒性状及植株抗逆性分析，对入选株系进行籽粒直链淀粉含量和粗淀粉含量测定。测定采用常规方法进行，设3次重复测定。进而选择出高直链淀粉高产量株系用于杂交种组配。

实施例4：利用玉米无菌苗转基因创造高直链淀粉高产玉米新材料

1)玉米无菌苗获得

玉米优良品种的种子，用70％乙醇浸泡1-3分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件(20-25℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。

2)农杆菌培养及活化

将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因bar和目标基因或RNAi结构)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2 MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2 MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

3)玉米无菌苗转化

(1)将菌液倒在9厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×10⁵Pa大气压下处理5-12分钟。

(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。

(3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2 MS培养基无机盐。

4)转化植株筛选与定植

转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂(Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9.6ml-10.8ml

/L，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后5天后停止生长，15天左右死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶左右，将其定植到田间。然后取叶片提取DNA，采用PCR技术检测转基因植株。

5)转基因植株后代分析及选择

转基因植株产生的种子在浸水萌动后用10.8ml

/L水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；提取抗除草剂植株的叶片DNA，采用PCR技术检测外源基因，用Southern blotting最终确定转基因植株；提取授粉后15天籽粒的mRNA，用RT-PCR等方法检测目标基因的表达强度，选择目标基因表达强度高的转基因株系。并统计外源基因在子代植株中的分离比例，获得纯系后用于产量比较和直链淀粉含量测定。

实施例5：利用转基因聚合技术创造高直链淀粉高产玉米

采用实施例1和实施例3所列的技术，分别获得高淀粉玉米自交系和高直链淀粉的自交系。以来自同一自交系的高淀粉及抗除草剂玉米和高直链淀粉及抗除草剂的玉米为亲本进行杂交，对F1植株进行自交，产生F2群体。将F2植株播种于田间，通过除草剂抗性筛选和转基因表达强度测定，选择Sh2基因和Bt2基因表达强度高而SBE IIb表达被抑制的个体进行套袋自交，创造高淀粉高直链淀粉的玉米材料。将F3植株播种于田间，套袋自交和与测配自交系杂交，收获籽粒后测定百粒重和淀粉含量，选择出高淀粉含量和高直链淀粉的玉米自交系或新品种。

序列表

<110>山东大学

<120>sh2、bt2过表达和sbe IIa、sbe IIb的RNAi抑制表达提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案及应用

<141>2009-5-7

<160>15

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>GSP1

<400>1

cgatgaatat ggcggttaag cgaagtag 28

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>NGSP1

<400>2

atctggtgag gacctgagtt cgtg 24

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>扩增sh2 5’端引物

<400>3

gctctagagc tcgggaggca agtgcgattt 30

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>扩增sh2 3’端引物

<400>4

gctctagagc gtcaagcggc tcttaccata ccaa 34

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>扩增Bt2 5’端引物

<400>5

gactagtcat ggacatggct ttggc 25

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>扩增Bt2 3’端引物

<400>6

gactagtcat gtatccccaa atccaggc 28

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>特5’长

<400>7

acttgccgtc ggtgctct 18

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>特3’长

<400>8

ccaacattgg gtcaatctca t 21

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>特5’短

<400>9

atgacttgct ttcctccg 18

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>特3’短

<400>10

tcctcagcct caactcct 18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>特5’

<400>11

cggtcgctgg ggttttag 18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>特3’

<400>12

gagccgagtc agcccttg 18

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>保5’长

<400>13

agtcctccca agaataaaa 19

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>保5’中

<400>14

cactcatcac ggattacaa 19

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>保3’(通用)

<400>15

tatgtaatgc tatcccacg 19

Claims

1.一种通过Sh2、Bt2基因过表达和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi抑制表达提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案及应用，其方法是将从玉米中克隆的Sh2和Bt2基因的正义形式分别用胚乳特异的启动子融合，然后重组到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入玉米细胞，获得籽粒增大和淀粉含量高的转基因株系，同时将SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构转入同一基因型的玉米中，筛选出高直链淀粉的株系，然后通过转基因植株的杂交，创造出高直链淀粉且产量高的玉米新种质和新品种；也可将Sh2和Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构重组到同一植物表达载体中，通过多基因转化技术获得籽粒产量高的高直链淀粉转基因植株及其后代。

2.如权利要求1所述转Sh2、Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案的应用，其特征是，Sh2、Bt2基因过表达和RNAi抑制SBE IIa、SBE IIb基因表达技术的有效组合。

3.如权利要求1所述转Sh2、Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案的应用，其特征是，所述Sh2、Bt2基因有cDNA形式或基因组基因形式，其全序列以正义形式与胚乳特异的启动子融合构建成融合基因，转入玉米；所述的RNAi结构能依据SBE IIa、SBE IIb基因的编码区设计，与胚乳特异的启动子融合，可与Sh2、Bt2基因一同或分别转入玉米。

4.如权利要求1或3所述转Sh2、Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案的应用，其特征是，Sh2、Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构能以单基因或单RNAi结构的形式转入玉米，也能以双基因或双RNAi结构串联的形式转入玉米，也能以Sh2、Bt2基因和RNAi结构不同组合的形式转入玉米，也能以多基因和多RNAi结构的形式转入玉米。

5.如权利要求1或4所述转Sh2、Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案的应用，其特征是，只转入Sh2、Bt2基因的玉米植株籽粒淀粉含量高于未转基因植株的；转入RNAi结构的植株籽粒直链淀粉含量大幅度提高。

6.如权利要求1或3所述转Sh2、Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案的应用，其特征是，用于构建RNAi结构的序列可以来自SBE IIa、SBE IIb基因的保守区，也可以来自SBE IIb基因的特异序列，也可以是来自不同区域的重组片段，不受片段大小的限制。

7.如权利要求1或6所述转Sh2、Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案的应用，其特征是，用于构建RNAi结构的来自SBE IIa、SBE IIb基因的片段允许少数碱基发生变化或有缺失或有插入序列，变异的核苷酸不能以五联体及以上形式存在，序列的相似性不低于80％。

8.如权利要求1、2或4所述转Sh2、Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案的应用，其特征是，分别转Sh2、Bt2基因或单RNAi结构的玉米植株可以彼此杂交，实现转基因Sh2、Bt2和RNAi结构的聚合，也可利用转基因株系为材料，进行二次或多次遗传转化实现转基因Sh2、Bt2和RNAi结构聚合，也可以将多基因和多RNAi结构重组到一个植物表达载体中一次性转入玉米。

9.如权利要求1或8所述转Sh2、Bt2基因和SBE IIa、SBE IIb基因的RNAi结构提高玉米籽粒直链淀粉含量的方案的应用，其特征是，创造籽粒产量高的高直链淀粉玉米自交系和杂交种。