CN110144366B - 一种敲除sip1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法，属于基因工程领域，主要包括：构建CRISPR/Cas9‑SIP1基因敲除载体，通过农杆菌转化目的玉米获得SIP1基因敲除的玉米植株。该基因工程方法通过干预SIP1对主基因ZmSBEII参与的淀粉分支作用，提升玉米籽粒中直链淀粉的含量。该方法的实现对利用ZmSBEII互作蛋白开发高直链淀粉玉米新品种具有重要的实践指导意义。

Description

一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法
技术领域
本发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法。
背景技术
淀粉是玉米籽粒的重要组成部分，约占籽粒总重量的70％。淀粉根据结构差异，可分为直链淀粉和支链淀粉两种，前者由α-1，4糖苷键连接而成，为线性多聚糖；后者由α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键连接而成，是具有分支的多聚糖。在普通玉淀粉中，直链淀粉约占淀粉总量的27％，其余为支链淀粉。高直链玉米淀粉是指直链淀粉含量超过50％的玉米淀粉，这种淀粉在工业上有广泛的利用价值。在食品工业中，高直链淀粉被广泛运用于生产减肥食品、煎炸食品及保健食品。在非食品工业中，高直链淀粉除了在制药、建筑、石油开采、造纸、纺织、粘合剂等领域发挥着不可替代的作用外，还被用于生产可降解塑料。利用高直链玉米淀粉生产的光解塑料膜在自然条件下很容易被降解，是解决目前日益严重的“白色污染”的有效途径。随着人类对淀粉认识的进一步加深和技术的不断进步，高直链淀粉作为一种无公害的工业原料被高度重视，这也是近年来高直链淀粉生物合成机制成为研究热点的重要原因。
进入21世纪以后，对于植物淀粉生物合成机制，特别是对淀粉生物合成核心酶的认识有了很大的突破，同时各种植物，特别是单子叶植物的遗传转化体系的相继建立，使得利用基因工程手段来改良淀粉品质成为可能。国际上的高直链淀粉玉米品种就是源于内源淀粉生物合成核心酶ZmSBEIIb（Starch branching enzyme IIb）受到抑制后，玉米籽粒中直链淀粉的含量有了较大的提高。国际专利WO9722703A2报道了反义抑制内源ZmSBEIIb基因能使转基因玉米淀粉粒中较长葡聚糖链增加两倍。这一专利显示出SBEIIb在改良淀粉品质方面的巨大潜力，但是由于SBEIIb同时也是淀粉生物合成的核心酶，抑制SBEIIb基因虽然可以显著提高直链淀粉的含量，但它同时引起籽粒总淀粉含量的下降和含水量的增加，高直链淀粉玉米杂交种的平均产量只有普通玉米的65-75%。虽然淀粉分支酶在淀粉代谢中的基本生理功能已研究的非常清楚，但是关于该蛋白在高直链淀粉形成中的分子机制及其调控机理的知识仍相当缺乏。本项研究在利用一系列的候选实验技术鉴定出SIP1是SBEIIb的可能互作调控因子的基础上，利用CRISPR/Cas9系统敲除玉米的SIP1基因，有效提升了玉米籽粒直链淀粉的含量，将为利用基因工程手段改良玉米淀粉品质提供重要的实践指导意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供了一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法，包括：
构建CRISPR/Cas9-SIP1基因敲除载体，通过农杆菌转化目的玉米获得SIP1基因敲除的玉米植株。所述的SIP1基因敲除转基因玉米的直链淀粉含量高于非转化植株。所述的SIP1基因敲除CRISPR/Cas9载体中的sgRNA 对应核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2。其中sgRNA启动子为OsU3，Cas9蛋白的启动子为加强型玉米Ubi启动子，卡那霉素抗性基因的启动子为CaMV 35S。所述的农杆菌为LBA4404。
进一步地，采用基因编辑的方法将目的特种玉米中的SIP1基因敲除，包括以下步骤：
用CRISPR/Cas9的方法将目的玉米中的两条SIP1基因敲除，包括以下步骤：
根据SIP1基因序列确定 sgRNA 靶向序列（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）；
以sgRNA 靶向序列的多聚寡核苷酸为基础，在正义链的5'加A，反义链的5'加T；
将正义、反义多聚寡核苷酸双链退火形成二聚体后与改造的CRISPR/Cas9载体相连构建真核表达重组质粒；
将构建的CRISPR/Cas9质粒在细菌中扩增后转入农杆菌LBA4404；
利用农杆菌将CRISPR/Cas9质粒（混合分别带SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列的两种CRISPR/Cas9质粒）导入普通玉米，筛选获得SIP1基因沉默的转基因植株。
本发明在利用一系列的候选实验技术鉴定出SIP1是SBEIIb的可能互作调控因子的基础上，利用CRISPR/Cas9系统敲除玉米的SIP1基因，有效提升了玉米籽粒直链淀粉的含量，将为利用基因工程手段改良玉米淀粉品质提供重要的实践指导意义。
序列表
<110> 陈超
<120> 一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 1
gctctcccca gggtccccat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 2
tgcttccgct acttgatata 20
附图说明
 图1 为CRISPR/Cas9载体图谱。
 图2 为转基因玉米SIP1基因PCR鉴定图。A为检测SEQ ID NO.1靶向序列，B为检测SEQ ID NO.2靶向序列的电泳图。
 图3 为转基因和对照组玉米籽粒重量（图A）及直链淀粉含量比例柱状图（图B）。
实施方式
具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1。
一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法，包括以下步骤。
 （1）酵母双杂交筛选SIP1与ZmSBEIIb的相互作用。
 实验采用BD公司的的Library construction & Screening kits试剂盒，文库构建的总RNA分离于高直链玉米Hamy ae 20 DAP 的籽粒。本系统以质粒pGBKT7作为DB载体，以pGADT7为AD载体，利用2个报告基因(HIS3和ADE2) 筛选与ZmSBEIIb互作的蛋白，经筛选，发现SIP1是ZmSBEIIb的互作蛋白。经ZmSBEIIb互作候选基因回转检测及β-半乳糖苷酶活性测试，初步认定SIP1与ZmSBEIIb存在蛋白互作可能。
 （2）SIP1 SgRNA靶向序列设计。
 下载SIP1（GenBank accession number : FJ766095）基因序列，在MaizeGDB数据库中与B104玉米品系的基因比对后发现有两个基因：Zm00001d011685和Zm00001d043703。针对这两个转录本，使用在线 SgRNA靶向序列设计工具（https://zlab.bio/guide-design-resources）设计SgRNA序列分别如下：GCTCTCCCCAGGGTCCCCAT（T1），TGCTTCCGCTACTTGATATA（T2）。合成DNA双链的同时在序列两段加BstN I（CC^AGG）酶切位点。
 （3）CRISPR/Cas9质粒构建。
 合成T1 的Forward oligo： AGCTCTCCCCAGGGTCCCCAT和 Reverse oligo：TATGGGGACCCTGGGGAGAGC。合成T2的Forward oligo： ATGCTTCCGCTACTTGATATA和 Reverseoligo：TTATATCAAGTAGCGGAAGCA。在10 μl体系中加入100 μM两条oligo各1μl，使用PCR仪加热至 95℃，5 min，缓慢降温至室温1 hr，1:200稀释T1和T2的二聚体备用。
 依据BstN I酶切使用说明书，用10 μl体系（NEBuffer™ 2.1）酶切CRISPR/Cas9质粒（图1）2 μg，60℃孵育1 hr。胶回收质粒片段-20 ℃保存备用。使用T4 DNA连接酶，将2μl质粒和6 μl 二聚体 16℃连接过夜，取连接产物2 μl，转化感受态DH5 α，37℃培养16hr，挑取单克隆菌落，以碱裂解小量法提取质粒，进行PCR鉴定。鉴定正确后，送公司测序。-80℃保存含正确插入序列的T1或T2的CRISPR/Cas9质粒的单克隆菌落。
 （4）CRISPR/Cas9质粒转化至农杆菌LBA4404。
 将农杆菌LBA4404菌种从-80℃冰箱取出，划平板28℃培养（TYNG/Rif，TYNG： 10g/L Bacto-tryptone，5 g/L Yeast extract，5 g/L NaCl ，0.2 g/L MgSO4，pH 7.5，Rif终浓度为50 μg/ml），形成单克隆后，挑取单菌落在5ml TYNG/Rif/Kan（kan，50 μg/ml）培养基中28℃培养过夜。次日，将0.5 ml培养物接种至60 ml TYNG/ Rif/kan，26.5℃振荡培养过夜（225～250 rpm）。次日中午，冰上预冷离心管、无菌CaCl2溶液（20 mM），并预冷离心机，将培养物置冰上10 min，5200 rpm 4℃离心6 min，弃上清，然后用1 ml预冷的CaCl2溶液漂洗，离心，弃上清， 最后用1 ml的CaCl2溶液重悬，分装，可冻存于-70℃。在150 μl冰上融化的感受态LBA4404中加入75 μl的质粒（40 ng/μl，共3 μg），轻弹使混匀，放于液氮中5 min，室温放置5～10 min，加入1 ml TYNG（不加抗生素），200 rpm培养过夜（28 ℃），将培养物倒入平板（TYNG/Rif/ Kan，Rif和Kan各 25 μg/ml），28℃培养。
 （5）农杆菌介导转化玉米愈伤组织。
 分别挑含T1和T2插入片段的农杆菌阳性单菌落过夜培养（LB/Rif/ Kan，3ml），加入50 ml培养基（无抗性）中扩增培养至OD为0.5。取三盘继代后14-20天的生长良好的玉米愈伤组织，用镊子夹成两粒黄豆大小的小块放菌液（含T1和T2插入片段的农杆菌混合物）中浸泡20 min，取出后用灭菌滤纸吸干多余菌液，置于无抗性的MS琼脂平板上培养两天。无菌水洗涤愈伤4次，然后用含Amp 500 μg/ml的无菌水浸泡60分钟，取出愈伤 用灭菌滤纸吸干水分，置于含有双抗（Amp 500 μg/ml和Kan 25 μg/ml）的MS琼脂平板上，直至有新的愈伤长出（约需2-3周）。新的愈伤组织转移到含有目的基因抗性(Kan 25 μg/ml)的平板上继续培养，每四周继一次代。
 （6）分化培养。
 所述分化培养基由MS培养基、肌醇、蔗糖、6-BA和植物凝胶组成，肌醇的浓度为0.15 g/L，蔗糖的浓度为30 g/L，6-BA的浓度为0.5 μg/ml，植物凝胶的浓度为8 g/L。分化培养的条件为28℃，每天光照18 hr培养16天。生根壮苗后移入大田。
 （7）转基因植株鉴定。
将F0代玉米叶片组织放入到1.5 ml离心管中，然后加入DNA提取缓冲液750 μl，用枪头充分捣碎后混匀。将离心管置于65℃水浴中1-2 hr，水浴过程中温和混匀几次。取出离心管，每管加入等体积的酚/氯仿（V/V=1:1）溶液600-700 μl，混匀后离心，10000 rpm，10min。上清移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，10000 rpm， 6 min。然后转移上清到另一离心管中，加入0.6 倍体积的异丙醇，混匀，10000 rpm，离心10 min，用70％乙醇冲洗2次，干燥后将其溶于500 μl TE中，加入3 μl RNA 酶溶液，37 ℃保温1 hr。 加入等体积的酚/氯仿溶液，混匀后，10000 rpm离心6 min。取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000 rpm离心6 min。取上清液，加入1/10体积3 M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇。10000 rpm离心6 min，用70％乙醇冲洗2次后，干燥，最后溶解于50 μl的TE中，-80℃保存备用。SIP1检测引物含两组如下：
Zm00001d011685的检测引物为：
Zm749S1: TATGAGTTGAGTTGCCAGTCCAA
Zm749A1: CCTCTATTATCTGCCTCGTTCGG；
Zm00001d043703的检测引物为：
Zm703S1: TGAGTTCATCAAGGTCTGTGACCCA
Zm703A1: CAAGCCAATTAAGTGCCCAA。94℃变性1 min，58℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行检测，结果见图2。PCR 产物经测序验证，SIP1基因被敲除。
（8）淀粉质量和直链淀粉含量测定。
 随机选取3种转基因事件品系的T1代，取60颗玉米，50℃ 烘干过夜后，称取其质量。重复上述步骤3次后，使用GB/T 15683-2008 标准方法测量相应直链淀粉含量。从图3中的A中可以看出，在高直链淀粉品系中，将SIP1基因敲除，玉米颗粒质量无明显变化。但直链淀粉和支链淀粉的组成比例发生显著变化（图3中的B），其中Zmsip_1提升4.6%、Zmsip_2提升12.7%、Zmsip_3提升10.9%。
结论：本发明利用基因工程技术获得了SIP1基因敲除的提升玉米直链淀粉含量的植株。T1代玉米颗粒平均质量无明显变化，但直链淀粉和支链淀粉的组成比例发生显著变化，其中Zmsip_1植株提升4.6%、Zmsip_2植株提升12.7%、Zmsip_3植株提升10.9%。说明SIP1具有直链淀粉合成代谢的修饰作用。SIP1与SBEIIb互作的关系表明其有可能是SBEIIb的有效调控因子，这为完善对直链淀粉合成代谢的理解提供了新的实验证据。
以上为本发明的一种详细实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

Claims (3)

1.一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的方法，其特征在于，包括：构建CRISPR/Cas9-SIP1基因敲除载体，通过农杆菌转化目的玉米获得SIP1基因敲除的玉米植株，所述SIP1基因在GenBank的登录号是FJ766095。
2. 根据权利要求1所述的一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述的SIP1基因敲除的玉米植株的直链淀粉含量高于非转化植株；所述的SIP1基因敲除CRISPR/Cas9载体中的sgRNA 对应核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2，其中sgRNA启动子为OsU3，Cas9蛋白的启动子为加强型玉米Ubi启动子，卡那霉素抗性基因的启动子为CaMV 35S；所述的农杆菌为LBA4404。
3. 根据权利要求1所述的一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9的方法将目的玉米中的两条SIP1基因敲除，包括以下步骤：根据SIP1基因序列确定 sgRNA 靶向序列分别为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；以sgRNA 靶向序列的多聚寡核苷酸为基础，在正义链的5'加A，反义链的5'加T；将正义、反义多聚寡核苷酸双链退火形成二聚体后与改造的CRISPR/Cas9载体相连构建真核表达重组质粒；将构建的CRISPR/Cas9质粒在细菌中扩增后转入农杆菌LBA4404；利用农杆菌将混合分别带SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2序列的两种CRISPR/Cas9质粒导入普通玉米，筛选获得SIP1基因敲除的转基因植株。
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