CN102348801A - 调控植物分枝的基因、启动子、含有其的遗传构建物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码TCP家族转录因子并在腋芽发育和分枝生长中有生物学作用的基因。另外，本发明涉及转录所述基因的启动子，含有它的遗传构建物及其应用，包括调节这些基因表达的试剂用于调节植物结构的应用。

Description

调控植物分枝的基因、启动子、含有其的遗传构建物及其应用
本发明涉及分子生物学、生物技术和植物改良领域，特别是涉及编码TCP家族转录因子，并在腋芽发育和分枝生长中具有生物学功能的基因。还涉及所述基因的转录启动子，包含它的遗传构建物及其应用，包括调节这些基因表达的试剂用于改变植物结构的应用。
现有技术
生物学中的一个核心问题是形态差异中基因组进化的影响。个体计划是由大分类学群体中广泛保留的遗传途径决定的。控制这些途径的基因活性的改变引起形态学模板中的变化。这些改变大部分是有害的，但是少数也使得形态发生进化。
在被子植物中，分枝模板是由形成分枝的位置决定的。由种子发芽后叶子的腋芽中形成的分生组织产生分枝。腋生分生组织(AM)产生腋芽，带有短节间的预先形成分枝的结构，叶原基、新生AM和通常花分生组织。芽在很长的时间内可以是不活跃的，或可响应环境或内源信号通过节间延伸发芽产生分枝。这个决定确定了植物结构，并影响植物生活的关键方面，例如每个生长轴能获得的营养物量，植物高度，果实的阳光保护，光吸收效率或其对于传粉者的可见性。
已在不同的被子植物物种中确定了控制AM起始，芽发育及其发芽的基因。这些研究标明，腋芽的发育受到开花植物光照前就发生的保守基因途径的控制。在番茄(Solanum lycopersicum)、拟南芥和水稻中，AM起始受到基因Ls/LAS/MONOCULM1以及基因Blind/RAX1的控制。植物生长素和独角金内酯(strigolactone)分别是在芽尖和根中合成的激素，促进长距离信号传递，以抑制各种物种中的分枝。拟南芥和豌豆中独角金内酯的合成和通过保守途径MAX/RMS的响应也在单子叶植物矮牵牛花(Petunia hybrida)和水稻中发现。在芽内起作用，延迟其发生和生长的基因也是保守的。玉米和其它单子叶植物中分离的基因Teosinte branched1(Tb1)编码TCP家族的转录因子。TCP基因是植物独有的，编码含有所谓TCP结构域(具有一个碱性区域和一个螺旋-环-螺旋结构域的59个氨基酸的序列)的转录因子，其具有连接DNA与其它蛋白质的功能(Cubas等，1999，Plant Journal.18：215-222)，其在AM和腋芽中表达，从而抑制生长。Tb1还控制开花和花序发育。在双子叶植物中，Tb1的复制可产生三类基因(CYC1，CYC2和CYC3)，其中CYC1-型似乎至少在拟南芥中保留大部分分枝抑制活性，其中该基因被命名为BRANCHED1(BRC1)。BRC1在芽中起作用，阻止其发育。BRC1受到MAX途径的转录控制，响应环境和发育刺激抑制分枝。
尽管在控制腋生(组织)发育中具有关键作用的基因高度保守，在被子植物中发现的分枝模式的多样性提示该过程的调控可分成不同系统发生群(进化枝)，这得到了豌豆、拟南芥和水稻中MAX型基因不同调控的支持。很可能BRC1型基因的功能和调控进化也也在这种进化中起到了重要作用。与常常产生不想要的多向效应的信号传递途径中的变化不同，局部表达的转录因子调控的改变能够更容易地被接受，所述转录因子例如仅在腋芽中起作用的BRC1。转录调控在许多形态特征的进化中起到了关键作用。事实上，在玉米驯化中，获得具有强顶端优势的植物的遗传改良导致了对过表达Tb1的植物的筛选。CYCLOIDEA是TCP家族的另一种转录因子，引起花的对侧对称的进化，这是一种在不同进化枝中独立进化的形态改进。
腋芽发生的控制极具应用潜力，因为了解其遗传基础能够控制农业上有兴趣的植物的结构。
通过抑制腋芽发生，我们可促进在用于木材生产的木质植物中，或以高密度生长的如禾本科植物等，或那些侧茎在机械化采集中成为障碍的植物的单轴向长茎生长，如需要可具有几个茎节。我们偏爱营养物向产生果实(例如番茄)，或延长发芽会使其质量下降的一些产物的储藏寿命(例如马铃薯、洋葱、大蒜)的轴分布。经典改良能够在一些物种(例如向日葵)中获得具有单茎(或独茎(monostem))的变种，但是在其它物种(例如烟草、番茄)中，不可能获得具有这种特征的高产品系。用于获得具有单茎的植物的可选技术(手工除去侧枝，施用化学产品)不仅令生产更昂贵，而且会利于疾病传播，还可导致环境污染问题。为了促进腋芽发生，可产生灌木结构，提高叶和花、以及观赏植物或以果实作为消费产品的物种中所需的元素的产生。芽形成的增加在覆盖地表的物种中也有利，在这种情况下看重密集生长(例如草地或牧场的禾本科植物)。提高适应有侵蚀威胁，草皮维持昂贵的贫瘠土地上的爬行植物间生生长有巨大生态价值。新芽的产生也在植物繁殖和体外培养中很重要。
最后，在一些木质物种中，控制生理和激素调控与草本植物相当的腋芽发生在经济上也非常重要。在藤本植物、樱桃树、苹果树和木质物种中，腋芽需要接触数日或数周的寒冷才能发芽。已经在通常达不到低温的温暖国家(例如巴西和泰国)开始培育这些物种，因此，为了能够发芽，农民被迫使用剧毒化合物处理(氢氰酸、二硝基邻甲酚)或昂贵的迅速降解且产生不良反应的激素处理。
茄科例如番茄植物(Solanum lycopersicum)和马铃薯植物(Solanumtuberosum)是具有巨大经济重要性的植物，其中一些感兴趣的农业特征由其腋芽的活性决定。发芽改变了光吸收的产生和消耗之间的关系，且能影响产量。
因此在农业、林业或园艺等领域，对能够控制腋芽发生和分枝延伸有很大兴趣。
发明内容
本发明的作者分离和研究了玉米的Teosinte branched1和拟南芥的BRANCHED1(BRC1)在茄科的两种物种番茄植物(Solanum lycopersicum L.)和马铃薯植物(Solanum tuberosum L.)中的直向同源基因。这些基因编码TCP家族的转录因子。植物独有的TCP蛋白是具有BHLH结构域的转录因子，具有与DNA和其它蛋白连接的能力。在拟南芥中，BRC1的作用被证实是在腋生分生组织起始、芽发生和分枝生长时作为阻抑蛋白。
作者发现，在每种植物中有两个基因与BRC1有关，在番茄中称作SIBRC1L1和SIBRC1L2，在马铃薯中称作StBRC1L1和StBRC1L2。他们也证明在两种物种中，BRC1L1和BRC1L2在抑制腋芽发生和分枝延伸中起到了主要作用。在马铃薯中，StBRC1L1he StBRC1L2还控制匍匐枝及其分枝的形成，以及块茎芽眼的发芽。BRC1L1和BRC1L2在腋芽中特异性表达，但其表达水平对于每种基因是不同的。每一种的功能丧失表型表明，虽然都控制分枝，每种基因有一定程度的特异化和功能多样性。在马铃薯中，StBRC1L1优选控制匍匐枝的分枝，StBRC1L2控制地上分枝的延伸；在番茄植物中，SIBRC1L1可能比SIBRC1L1在控制分枝延伸中有更重要的作用。
因此，本发明编码这些基因蛋白质产物的核酸序列、启动子和遗传构建产物组成了操纵腋芽发生、分枝控制的有效工具，以提高植物产率，尤其是马铃薯和番茄。本发明还涉及包含这些序列的遗传构建物，掺有它们的转化的细胞、载体和转基因植物。还涉及调节这些基因的表达以至于生物活性的试剂，以及含有这些调节剂的新组合物，这些序列、遗传构建物、调节剂和组合物用于操纵腋芽、植物生长和分枝的应用，特别是用于番茄植物和马铃薯。
本发明还包括操纵植物结构，特别是分枝，从而操纵掺有本发明的表达和/或抑制构建物的植物产量的方法。
在茄科这两种物种的具体例子中，RNA干扰技术(RNAi)对新基因(SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1，StBRC1L2)表达的抑制在番茄植物中增加了地上分枝(仅抑制SIBRC1L2)，在马铃薯植物中进一步提高了匍匐枝的产生及其分枝，提高了该物种的农业产量。相反，提高这些新基因表达能在番茄植物中减少分枝数量，有利于使营养物分布到产生果实的轴，且避免使用获得单茎植物的其它技术(例如人工修剪侧枝或施加化学产品)，这些技术不仅令生产更加昂贵，而且助长了疾病传播，还可能引起环境污染的问题。
因此，本发明的第一个方面涉及分离的RNA或DNA多核苷酸，下文称作本发明的第一多核苷酸，其能翻译成与SEQ ID NO：1具有选自下列相同性的多肽：
a.至少95％，或
b.至少99％。
在本发明该方面的一个优选例中，分离的RNA或DNA多核苷酸能翻译成氨基酸序列SEQ ID NO：1。
本发明的另一方面涉及分离的RNA或DNA多核苷酸，下文称作本发明的第二多核苷酸，其能翻译成与SEQ ID NO：2具有选自下列相同性的多肽：
a.至少95％，或
b.至少99％。
在本发明该方面的一个优选例中，分离的RNA或DNA多核苷酸能翻译成氨基酸序列SEQ ID NO：2.
本发明的另一方面涉及分离的RNA或DNA多核苷酸，下文称作本发明的第三多核苷酸，其能翻译成与SEQ ID NO：3具有选自下列相同性的多肽：
a.至少95％，或
b.至少99％。
在本发明该方面的一个优选例中，分离的RNA或DNA多核苷酸能翻译成氨基酸序列SEQ ID NO：3.
本发明的另一方面涉及分离的RNA或DNA多核苷酸，下文称作本发明的第四多核苷酸，其能翻译成与SEQ ID NO：4具有选自下列相同性的多肽：
a.至少95％，或
b.至少99％。
在本发明该方面的一个优选例中，分离的RNA或DNA多核苷酸能翻译成氨基酸序列SEQ ID NO：4.
基因SIBRC1L1翻译成两种蛋白质，一种较长的346个氨基酸(SEQ ID NO：1)和另一种较短的325个氨基酸(SEQ ID NO：50).因此，本发明的另一方面涉及分离的RNA或DNA多核苷酸，下文称作本发明的第十一多核苷酸，其能翻译成与SEQ ID NO：50具有选自下列相同性的多肽：
a.至少95％，或
b.至少99％。
在本发明该方面的一个优选例中，分离的RNA或DNA多核苷酸能翻译成氨基酸序列SEQ ID NO：50.
本发明的作者还检测了所述基因的调控表达序列，其能指导感兴趣的基因在番茄的腋生分生组织中，而不是顶端分生组织中的表达。使用本发明提供的启动子能够遗传操纵植物，获得具有改良特征的植物，能够改变植物结构，从而改变腋芽生长或发生，而不改变主轴的生长。
因此，本发明的另一方面涉及分离的RNA或DNA多核苷酸，下文称作本发明的第五多核苷酸，其能指导腋芽中感兴趣基因的表达，与SEQ ID NO：5具有选自下列相同性：
a.至少95％，或
b.至少99％。
在本发明该方面的一个优选例中，分离的RNA或DNA多核苷酸具有SEQ IDNO：5包含的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及分离的RNA或DNA多核苷酸，下文称作本发明的第六多核苷酸，其能指导腋芽中感兴趣基因的表达，与SEQ ID NO：6具有选自下列相同性：
a)至少95％，或
b)至少99％。
在本发明该方面的一个优选例中，分离的RNA或DNA多核苷酸具有SEQ IDNO：6包含的核苷酸序列。
可预期与序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(番茄植物)以及SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4(马铃薯)所包裹的同源的蛋白质的相同性/相似性程度在番茄(Solanum lycopersicum L.)和马铃薯(Solanum tuberosum L.)的不同变种和亚种中为至少80％或更高，更优选为至少85％、90％、95％或99％。可用本领域已知的方法确定推测序列的氨基酸序列与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中包括的序列的对应性。序列比较方法是本领域已知的，包括但不限于程序BLASTP或BLASTN，以及FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1999)。
本说明书所用的术语“同源性”指两种结构之间由于共同进化祖先导致的相似性，更具体地，指两条或多条核苷酸或氨基酸序列之间的相似性。由于如果两条序列具有相同进化起源，一般被认为有同源性，假设它们高于95％的相似性或相同性值将表示同源性。因此，我们可以认为至少99％的相同性百分数可维持SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中所含直向同源氨基酸序列的功能。
术语“直向同源”指不同物种的同源结构，具有共同祖先，特别是两条或多条核苷酸或氨基酸序列之间的相似性。
本说明书中使用的术语“相同性”指所比较的两条核苷酸或氨基酸序列之间的相同核苷酸或氨基酸的比例。比较序列的方法是本领域已知的，包括但不限于GAG程序，包括GAP(Devereux等，Nucleic Acids Research 12：287(1984)威斯康星大学遗传学计算机组，麦迪逊市，威斯康辛州)；BLAST，BLASTP或BLASTN，以及FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1999)。
在本发明的另一个方面，提供了DNA或RNA的遗传构建物，在此称作本发明的第一遗传构建物，包括下列序列类型之一：
a)核苷酸序列，包含至少本发明的第一多核苷酸，或SEQ ID NO：1的编码序列，用于其体外或体内转录，或
b)核苷酸序列，对应于基因表达系统或载体，含有本发明的第一多核苷酸，其至少与一种启动子可操纵性连接，该启动子指导所述核苷酸序列转录，并与转录必需或适用于转录及其适当时空调控的其它序列可操纵性连接，这些序列包括例如起始和终止信号，切割位点，聚腺苷酸信号，复制起始点，转录增强子，转录沉默子等。
在本发明该方面的一个优选例中，启动子是本发明的第五多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了DNA或RNA的遗传构建物，在此称作本发明的第二遗传构建物，包括下列序列类型之一：
a)核苷酸序列，包含至少本发明的第二多核苷酸，或SEQ ID NO：2的编码序列，用于其体外或体内转录，或
b)核苷酸序列，对应于基因表达系统或载体，含有本发明的第二多核苷酸，其至少与一种启动子可操纵性连接，该启动子指导所述核苷酸序列转录，并与转录必需或适用于转录及其适当时空调控的其它序列可操纵性连接，这些序列包括例如起始和终止信号，切割位点，聚腺苷酸信号，复制起始点，转录增强子，转录沉默子等。
在本发明该方面的一个优选例中，启动子是本发明的第六多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了DNA或RNA的遗传构建物，在此称作本发明的第三遗传构建物，包括下列序列类型之一：
a)核苷酸序列，包含至少本发明的第三多核苷酸，或SEQ ID NO：3的编码序列，用于其体外或体内转录，或
b)核苷酸序列，对应于基因表达系统或载体，含有本发明的第三多核苷酸，其至少与一种启动子可操纵性连接，该启动子指导所述核苷酸序列转录，并与转录必需或适用于转录及其适当时空调控的其它序列可操纵性连接，这些序列包括例如起始和终止信号，切割位点，聚腺苷酸信号，复制起始点，转录增强子，转录沉默子等。
在本发明的另一个方面，提供了DNA或RNA的遗传构建物，在此称作本发明的第四遗传构建物，包括下列序列类型之一：
a)核苷酸序列，包含至少本发明的第四多核苷酸，或SEQ ID NO：4的编码序列，用于其体外或体内转录，或
b)核苷酸序列，对应于基因表达系统或载体，含有本发明的第四多核苷酸，其至少与一种启动子可操纵性连接，该启动子指导所述核苷酸序列转录，并与转录必需或适用于转录及其适当时空调控的其它序列可操纵性连接，这些序列包括例如起始和终止信号，切割位点，聚腺苷酸信号，复制起始点，转录增强子，转录沉默子等。
在本发明的另一个方面，提供了DNA或RNA的遗传构建物，在此称作本发明的第五遗传构建物，包括下列序列类型之一：
a)核苷酸序列，包含至少本发明的第十一多核苷酸，或SEQ ID NO：50的编码序列，用于其体外或体内转录，或
b)核苷酸序列，对应于基因表达系统或载体，含有本发明的第十一多核苷酸，其至少与一种启动子可操纵性连接，该启动子指导所述核苷酸序列转录，并与转录必需或适用于转录及其适当时空调控的其它序列可操纵性连接，这些序列包括例如起始和终止信号，切割位点，聚腺苷酸信号，复制起始点，转录增强子，转录沉默子等。
在本发明的另一个方面，提供了DNA或RNA的遗传构建物，在此称作本发明的第六遗传构建物，包括下列序列类型之一：
a)核苷酸序列，包含本发明的第五多核苷酸，或
b)核苷酸序列，包含本发明的第六多核苷酸，其与感兴趣的基因可操纵性连接。所述构建物能够指导感兴趣基因在腋芽中特异性表达。
本领域技术人员能够用常规方法获得大量这样的构建物、系统或表达载体，形成本发明的一部分。
“载体”是复制子或整合载体，其与另一条多核苷酸片段连接，行使连接片段的复制和/或表达。
“复制子”是任意遗传元件，其在细胞内作为多核苷酸复制的自主单位，即能自身控制复制。
整合载体是任何整合入细胞基因组且在其中保持稳定的基因元件。
“控制序列”指实现所连接的序列表达必需的多核苷酸序列。所述控制序列的性质视宿主生物而不同，在原核细胞中，所述控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止信号；在真核细胞中，通常所述控制序列包括启动子、终止信号、增强子和可能的沉默子。术语“控制序列”至少包括表达所必需的所有成分，还可以包含其存在会有利的其它成分。
本文所用的术语“启动子”指转录起始点DNA上游，特别是能够引发植物细胞中转录的区域，不论启动子是否是植物来源。启动子的例子包括但不限于获自植物、植物病毒和能在植物细胞中表达基因的细菌的启动子，所述细菌例如农杆菌或根瘤菌。发育控制下的启动子的例子包括优选在例如叶、根或种子等一些组织中起始转录的启动子。在本说明书中列出的所述启动子对于一类组织是优选的。还有在特定类型组织中起始转录的其它启动子，被称作“特异性组织”。“可诱导”或“可抑制”启动子是环境控制下的启动子。影响转录的环境条件的例子如厌氧条件，或光的存在。特异性组织，优选组织，对细胞类型特异性的启动子或可诱导启动子构成了“非组成型”启动子家族。“组成型”启动子是在大部分环境条件下有活性的启动子。
“可操纵性连接”指并列，其中如此描述的组分的关系允许其以所需方式发挥功能。与转录所连接的本发明核苷酸序列的序列“可操纵性连接”的控制序列能在控制序列条件下实现编码序列的表达。
“编码序列”是多核苷酸序列，其在合适的调控序列控制下转录成mRNA和/或翻译成多肽。编码序列的界限是由5’末端翻译起始密码子和3’末端的翻译终止密码子决定的。编码序列可包括但不限于mRNA、cDNA以及重组多核苷酸序列。
本文所用的术语“多核苷酸”和“核酸”可互换，指任意长度的多聚形式，同时指核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)。
术语“氨基酸序列”、“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，指任意长度的氨基酸多聚形式，可以是或不是化学或生物化学修饰的。
本发明的另一个方面涉及本发明多核苷酸、本发明遗传构建物的应用，用于产生细胞和具有改变的植物结构的转基因植物。
在本说明书中，“植物结构”理解为一种生物(植物)可观察到的结构性质的总和，例如，植物垂直或匍匐生长的倾向，以及组成所述生物表型的功能性质，它是基因型和环境之间相互作用的结果。
本说明书中“植物”应理解是所有能够归类到绿色植物界的生物，包括绿藻和陆生植物(有胚植物)。
茄属的生物属于真核生物超界绿色植物界被子植物门菊亚纲茄目茄科。Solanum tuberosum是马铃薯植物的学名，Solanum lycopersicum是番茄植物的学名。
在本发明的另一个方面，提供了一种改变植物结构的方法，包括：
a)将本发明的多核苷酸或遗传构建物转染入细胞或宿主细胞培养物，
b)在合适的培养基中培养宿主植物细胞的细胞或培养物，直到再生成完整植物。
本说明书使用的“宿主”或“宿主细胞”指生物、细胞或组织，特别是植物细胞，其作为转染元件(例如本发明的多核苷酸或遗传构建物)的目标或受体。宿主细胞也可表示表达感兴趣的重组蛋白(例如本发明的多核苷酸表达产物)的细胞或宿主，其中宿主细胞被含有本发明多核苷酸或还有指导感兴趣基因表达的启动子的表达载体转化。
本文中的“转染”或“转基因”应理解为外源DNA转移入生物体的过程，由此称作“转基因的”。
术语“转基因”在本发明中用于描述植物，在其中有外源DNA序列稳定掺入，特别是本发明的多核苷酸或遗传构建物。
在本发明该方面的一个优选例中，细胞、植物细胞培养物和/或在分类学上可以分类为马铃薯的植物。在本发明该方面的一个优选例中，细胞、植物细胞培养物和/或植物可以在分类学上分类为番茄。
本发明提供的用于改变植物的植物结构的方法包括任何植物转化方法，其中引入的异源元件包括本发明的多核苷酸或遗传构建物。
在本发明的另一个方面，提供了在植物的腋生分生组织中表达感兴趣基因的方法，包括：
a)在宿主植物细胞的细胞或培养物中转染多核苷酸或遗传构建物，
b)在合适的培养基中培养细胞或宿主植物细胞培养物，直到再生出完整植物。
在本发明该方面的一个优选例中，细胞、植物细胞培养物和/或植物可以分类学上分为马铃薯(Solanum tuberosum L)。在本发明该方面的一个优选例中，细胞、植物细胞培养物和/或植物可以分类学上分为番茄(Solanum lycopersicum)。
本发明提供的在植物腋生分生组织中表达感兴趣基因的方法包括任何植物转化方法，其中引入的异源元件包括本发明的多核苷酸或本发明的遗传构建物。
本发明的多核苷酸和一些遗传构建物以暂时和局部调控形式和受控水平表达(例如在某些发育阶段和某些组织，腋芽中)。本发明的一个方面包括改变(提高或降低)所述表达水平。
本发明还包括本发明多核苷酸编码的蛋白质表达的调节剂，和/或在番茄植物和马铃薯中组成型编码这些蛋白质的基因(SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2。随着反义技术的开发，与某条DNA或RNA序列互补的特定核苷酸的序列能够形成复合物，且阻断转录或翻译。另外，随着转录后基因沉默，特别是干扰RNA(RNAi)的进展，开发了能够特异性抑制基因表达的工具。基因SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRCIU和StBRC1L2的表达抑制因此组成型抑制其生物活性，从而调节所述植物中的活性。
在本发明中，SIBRC1L1定义为一条核苷酸序列或多核苷酸，其构成蛋白质SIBRC1L1的编码序列，并且包含以下的不同变体：
a)核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或SEQ ID NO：50的氨基酸序列的多肽，
b)核酸分子，其互补链与(a)的多核苷酸序列杂交，
c)核酸分子，其序列与(a)和/或(b)由于遗传密码的简并性而不同，
d)核酸分子，其编码一多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：50具有至少95％、98％或99％的相同性的氨基酸序列，其中所述核酸编码的多肽具有蛋白质SIBRC1L1的活性和结构特征。
能翻译成SEQ ID NO：1的核苷酸序列可以是但不限于SEQ ID NO：7包括的序列。
在本发明中，SIBRC1L2定义为一条核苷酸序列或多核苷酸，其构成蛋白质SIBRC1L2的编码序列，并且包含以下的不同变体：
a)核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，
b)核酸分子，其互补链与(a)的多核苷酸序列杂交，
c)核酸分子，其序列与(a)和/或(b)由于遗传密码的简并性而不同，
d)核酸分子，其编码一多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少95％、98％或99％的相同性的氨基酸序列，其中所述核酸编码的多肽具有蛋白质SIBRC1L2的活性和结构特征。
能翻译成SEQ ID NO：2的核苷酸序列可以是但不限于SEQ ID NO：8包括的序列。
在本发明中，StBRC1L1定义为一条核苷酸序列或多核苷酸，其构成蛋白质StBRC1L1的编码序列，并且包含以下的不同变体：
a)核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，
b)核酸分子，其互补链与(a)的多核苷酸序列杂交，
c)核酸分子，其序列与(a)和/或(b)由于遗传密码的简并性而不同，
d)核酸分子，其编码一多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：3具有至少95％、98％或99％的相同性的氨基酸序列，其中所述核酸编码的多肽具有蛋白质StBRC1L1的活性和结构特征。
能翻译成SEQ ID NO：3的核苷酸序列可以是但不限于SEQ ID NO：9包括的序列。
在本发明中，StBRC1L2定义为一条核苷酸序列或多核苷酸，其构成蛋白质StBRC1L2的编码序列，并且包含以下的不同变体：
a)核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽，
b)核酸分子，其互补链与(a)的多核苷酸序列杂交，
c)核酸分子，其序列与(a)和/或(b)由于遗传密码的简并性而不同，
d)核酸分子，其编码一多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：4具有至少95％、98％或99％的相同性的氨基酸序列，其中所述核酸编码的多肽具有蛋白质StBRC1L2的活性和结构特征。
能翻译成SEQ ID NO：4的核苷酸序列可以是但不限于SEQ ID NO：10包括的序列。
另外，由于存在不同等位基因，StBR1L2基因翻译成的氨基酸序列可变化，包含在另选的序列SEQ ID NO：51中。能翻译成SEQ ID NO：51的核苷酸序列可以是但不限于包括在SEQ ID NO：52中的序列。
“反义多核苷酸”应理解为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，其能通过以下两种机制之一抑制这些基因的活性：
1-通过与结构基因或与编码这些转录因子(SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2)的基因的调节子或启动子区域杂交，干扰转录。由于转录或表达被反义寡核苷酸和DNA的杂交有效阻断，这些转录因子的产生减少。
2-反义核苷酸在胞质中与mRNA连接，干扰实际转录复合物的形成，抑制翻译复合物，抑制mRNA翻译成蛋白质。
转录后基因沉默，特别是干扰RNA使得这些转录因子的产生减少。干扰RNA或RNAi是导致特定基因的RNA降解的RNA分子。在本说明书中，干扰RNA包括siRNA(小干扰RNA)和tsRNA(“反式剪接RNA”)、VIGS(“病毒诱导的基因沉默”)和miRNA或微小RNA。siRNA是RNA双链，完美互补，长约20-21个核苷酸，在每个3’端有2个游离核苷酸。每条RNA链具有一个5’磷酸基团和一个3′羟基(-OH)基团。该结构来自Dicer(一种在siRNA中切割双链(dsRNA)中的长链)的方法。siRNA中的一条链(反义链)装配在称作RISC(RNA诱导的沉默复合物)的蛋白质复合物中，用siRNA链作为引导，识别互补信使RNA。RISC复合物催化切割互补mRNA为两半，通过细胞机制降解，因此阻断基因表达。miRNA是小干扰RNA，其从基因组中编码的特定前体产生，在转录后能够折叠成分子内发夹，含有不完美互补的片段。前体加工通常以两阶段进行，由两种酶，核中的Drosha和胞质内的Dicer催化。与siRNA中出现的那样，miRNA的一条链(反义链)掺入与RISC类似的复合物。根据miRNA与mRNA的互补程度，miRNA可以抑制mRNA的翻译或诱导其降解。然而，与siRNA途径不同，miRNA介导的mRNA降解始于mRNA中polyA尾的酶消化。
因此，可以是任何siRNA或miRNA，其能与编码这些转录因子(SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2)的核酸分子杂交；或是RNA构建物，其至少含有任何可能的siRNA或miRNA核苷酸序列，这些序列能够抑制本发明BRC1直向同源蛋白的翻译，且不受任何本发明其余部分所限，任何上述本发明的序列和RNA构建物，其经过修饰，优选化学修饰，对核糖核酸酶的作用更稳定且具有更高的效力。没有所述修饰，假设作用机制改变(其是与RISC(RNA诱导的沉默复合物)复合物的特异性联系)，激活它或者产生更高解旋酶活性，将两条链分开，仅留下反义链与复合物结合。
另外，本领域技术人员会明白，由于遗传编码是简并的，可将大量mRNA多核苷酸翻译成蛋白质SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2。任何能够抑制这些mRNA翻译的siRNA或miRNA也构成本发明的一部分。
本发明的作者开发了四种干扰RNA的序列，其中两种针对降低番茄植物基因SIBRC1L1和SIBRC1L2的mRNA水平(分别是本发明的第七多核苷酸-SEQ IDNO：11和第八多核苷酸-SEQ ID NO：12)，两种针对降低马铃薯植物基因StBRC1L1和StBRC1L2的mRNA水平(分别是本发明的第九和第十多核苷酸-SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)。因此，本发明的另一个方面涉及一种选自SEQID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的序列。
本发明的干扰RNA序列可以改变植物的植物结构，特别是在番茄植物和马铃薯中。如本发明的实施例所示，番茄植物的SIBRC1L1基因不产生植物结构上(或其表型)的明显改变(对于地上分枝的延伸)。这表明虽然两种基因都控制分枝，但每种具有一定程度的特异性和功能多样性，因此在番茄植物中，SIBRC1L2比SIBRC1L1在控制分枝延伸上更重要。另一方面，在马铃薯植物中，StBRC1L1优选控制匍匐枝的分枝，StBRC1L2控制地上分枝的延伸。
DNA的遗传构建物也形成本发明的一部分，其指导本发明的siRNA、miRNA或RNA构建物在体外或胞内转录，包括至少下列类型的序列之一：a)DNA核苷酸序列，优选双链，包含至少本发明的siRNA或miRNA序列或本发明的RNA构建物用以转录，或b)DNA核苷酸序列，优选双链，对应于基因表达系统或载体，其包含转录成本发明的RNA序列的序列，该序列至少与指导所述感兴趣的核苷酸序列转录的一个启动子可操纵性连接，并看与其他转录和时空调控中必须或适合的序列可操纵性连接，这些调控例如起始和终止信号，复制起始点，转录增强子，转录沉默子等。所述遗传构建物可用于植物结构的改变。这些构建物、系统或表达载体中许多能用本领域技术人员已知的常规方法获得(Sambrook等.2001.《分子克隆实验手册》，冷泉港实验室出版社，纽约)。这些构建物的例子包括但不限于用于产生品系35SCaMV::SIBRC1L1RNAi，35SCaMV::SIBRC1L2RNAi，35SCaMV::StBRC1L1RNAi和35SCaMV::StBRC1L2RNAi的双元DNA质粒，其包括在本说明书的图7中。
本领域技术人员应当理解本发明其他siRNA或miRNA序列或本发明RNA构建物的制备，并且可用化学方法合成，其中能够允许化学修饰在产物中掺入不同核苷酸和在任意末端掺入其他化学化合物。另一方面，也可用任何可能的RNA聚合酶进行酶促合成。酶合成也能化学修饰产物或抑制性RNA。
本发明的siRNA或miRNA核苷酸序列的设计对于本领域技术人员来说也是明显的。因此，对于siRNA来说，可通过随机设计进行，其中可选择靶mRNA的19-25个碱基，而不需要考虑序列或转录物中的位置信息。本发明的另一个非限制性可选方法是通过核苷酸BLAST分析实现的技术先锋们开发的简单参数的传统设计(Calipel等，2003.J Biol Chem.278(43)：42409-12418)。另一种可能性是一种推理设计，其中用计算机方法实现mRNA中siRNA最佳靶标的识别。同时对每组19个核苷酸进行靶序列分析，根据结合大量热动力学和序列参数的算法鉴定具有最佳特征的组。
可用能与蛋白质SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2连接的抗体抑制所述蛋白质的活性，因此调节所述活性。因此，在本发明该方面的一个优选例中，调节剂选自抗体，其片段或任何其组合。抗体可以是多克隆(通常包括针对不同决定簇或表位的不同抗体)或单克隆(针对抗体中单一决定簇)。可通过遗传操纵，或通过合成生物化学改变单克隆抗体，其可能完整性或部分缺乏抗体，或缺乏识别蛋白质SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2不需要的部分，用其他部分取代，这些部分可对抗体带来其他有利性质。抗体还可以是重组、嵌合、合成或任何前述组合。
本说明书使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与蛋白质SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2特异性结合(免疫反应性)的抗原固定位点的分子。免疫学上活性的免疫球蛋白分子部分的例子包括片段F(ab)和F(ab′)2，其可通过用酶(例如胃蛋白酶)处理抗体产生。可能是单克隆或多克隆抗体。
“重组抗体或多肽”(rAB)是在被多肽的编码核酸转化或转染的宿主细胞中产生的那些，或作为同源重组的结果产生的多肽。
当掺入合适的胞内导向序列时，可表达这些rAC并引导到特定细胞亚区室。这些抗体被叫做胞内抗体，并已显示了其不仅能将蛋白质从所在区室驱出或阻断在信号传递途径中蛋白质的相互作用，而且还能激活胞内蛋白。
本发明的一部分是能够转录成肽、抗体或抗体片段的DNA遗传构建物，用于改变植物结构。所述DNA遗传构建物可指导抗体或其片段的体外或胞内转录，包括至少以下一类序列：a)DNA核苷酸序列，优选双链，包含至少本发明抗体或本发明抗体片段的编码序列，用于其体外或胞内转录，b)DNA核苷酸序列，优选双链，对应于基因表达系统或载体，包含本发明抗体序列或其片段的编码序列，其至少与指导感兴趣的核苷酸序列转录的启动子可操纵性连接，以及其它转录和时空调控中必须或适合的序列可操纵性连接，这些调控例如起始和终止信号，切割位点，聚腺苷酸信号，复制起始点，转录增强子，转录沉默子等，所述遗传构建物可用于植物结构的改变。
还可用核酶作为蛋白质SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2活性的调节剂。本发明中理解的“核酶”指催化性多核苷酸(通常为RNA)，其可建立成通过杂交特异性识别mRNA使其片段化或消除其表达。可将核酶引入细胞作为催化性RNA分子或作为表达成RNA催化性分子的遗传构建物。
含有调节基因SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2表达的反义寡核苷酸、反义(siRNA、mRNA或RNA构建物)，抗体或遗传构建物的组合物也构成本发明的一部分。本发明的组合物能够实现本发明的siRNA、miRNA或RNA构建物体内或体外转染到细胞的内部。转染的进行包括但不限于直接转染或促进siRNA、miRNA或RNA构建物到达细胞内部的载体。因此，这些载体的例子包括但不限于病毒、非病毒性DNA双元质粒，和分子偶联物。因此例如，本发明的siRNA以及这些siRNA、miRNA或RNA构建物的RNA或DNA前体可以与释放肽或其它化合物偶联，以利于这些RNA转运到细胞内部。
另一个方面涉及种子，下文称作本发明的种子，整合了本发明的分离的多核苷酸(还包括调节剂，例如但不限于在SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：14中列出的那些)或本发明的遗传构建物的遗传物质。在一个优选例中，本发明的种子可被分类学上分为属于马铃薯种。在一个优选例中。本发明的种子可被分类学上分为番茄种。
另一个方面涉及植物细胞，下文称作本发明的植物细胞，其中的遗传物质整合了本发明的分离的多核苷酸或本发明的遗传构建物。优选本发明的植物细胞可被分类学上分为属于马铃薯种。在另一个优选例中。本发明的种子可被分类学上分为番茄种。
另一个方面涉及植物细胞培养物，下文称作本发明的植物细胞培养物，其中的遗传物质整合了本发明的分离的多核苷酸或本发明的遗传构建物。优选本发明的培养物植物细胞可被分类学上分为属于马铃薯种。在另一个优选例中，他们可被分类学上分为属于番茄种。
本说明书中的术语“细胞培养物”指从其分离的细胞培养物或不同类型的组织，或在植物部分或组织(组织培养物)中得到的所述细胞集合。这类培养物类型是例如原生质体培养物，愈伤组织(能够再生出完整植物的未分化植物细胞群)，以及分离自植物或植物部分的植物细胞，例如胚胎、原生质体、分生组织细胞、花粉、叶或花粉囊。
本发明的另一个方面涉及一组细胞，其分类学上分为属于马铃薯种，其遗传物质中整合了本发明的分离的多核苷酸或本发明的遗传构建物，形成块茎、小块茎或微块茎。
已知“小块茎″或″父本种子(papa seed)″是不超过3cm直径的小块茎，用于进行大量商业栽培马铃薯作物。不然，则用中等尺寸的块茎或其部分具有至少一个芽眼(即芽)。
另一个方面涉及植物，下文称作本发明的植物，包含本发明的细胞或植物细胞培养物，和/或在培养本发明的种子后获得的植物。所述植物可在其遗传物质中整合本发明的多核苷酸和/或本发明的遗传构建物。优选，本发明的培养物的植物细胞可以分类学上分为属于马铃薯种。在另一个优选例中，它们可分类学上分为属于番茄种。
因此，基因SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2中的修饰能够改变植物的植物结构。由于在本发明中包括了这些基因的序列以及其翻译出的各种蛋白质，可用多种方法获得植物结构改变的植物。
通过选择自发突变：应记住在各种细胞分化中，有小部分可能性发生基因改变，因此并不惊奇在大细胞团中群体是异源性的。这种分布可能有产量问题，因为总的说变体比亲本群体的生产水平要小。在基因型允许的变化中，可将这些绝对改变(突变)与由于环境变化且发生在表达相同生理改变的生理表型区分开。在自发突变中，如果引起突变的元件是未知的，很难将这些表型变体与在负责植物结构且稳定和可遗传的基因改变区分开。本发明提供了筛选这些突变体的必需工具，其不仅通过观察感兴趣的形态特征，还通过检测引起所述突变的基因中的突变(SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2)，对突变体的特定类型设计简单的选择性筛选法。例如，可通过形态学筛选具有有利植物结构植物(优选番茄植物或马铃薯)，然后检查是否基因SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2相对于野生基因型对照有突变。
因此，本发明的另一个方面涉及番茄植物、果实、种子、细胞、细胞群或植物部分，其相对于对照型番茄植物具有改变的植物结构，其中植物结构的改变是由于番茄基因SIBRC1L1和SIBRC1L2中的非转基因型突变。
本发明的另一个方面涉及番茄植物、果实、种子、细胞、细胞群或植物部分，其相对于对照型马铃薯植物具有改变的植物结构，其中植物结构的改变是由于马铃薯基因StBRC1L1和StBRC1L2中的非转基因型突变。
本说明书中使用的术语“基因型”指个体的遗传或基因组成；所有包含在细胞中的遗传物质，总体称作核物质。
本说明书中使用的术语“表型”涉及基因型和环境之间的相互作用导致的生物体产物可观察结构和功能性质的总和。
术语“型”指根据属、亚属、种、变种或其它分类学类别的植物，从分类学出发点来看，“型”是对某个名称永久指定的分类单位的一个元素，是根据符合可得性或可靠公布的条件的描述特征。本说明书还描述了番茄或马铃薯对照植物，同一分类学类别的其它植物与其比较，以观察植物结构是否有改变，然后鉴定番茄植物中的基因SIBRC1L1和SIBRC1L2和马铃薯中的StBRC1L1和StBRC1L2与对照植物相比是否具有突变。由此，可以将植物结构中由于生理学、环境或其它类型因素导致的改变与番茄植物中基因SIBRC1L1和SIBRC1L2和马铃薯植物中StBRC1L1和StBRC1L2突变导致的改变分辨开。
诱导突变过程涉及两个阶段：用所选诱变剂处理群体，然后分离突变体用于随后测试和筛选。在植物中诱导突变是改良植物的非常宝贵的工具，尤其是在需要在良好适应的物种或变种中改良一个或两个易于鉴定的特征时。另外，其优点是诱导突变导致的可变性与进化过程中的自发突变导致的区别不大。诱变剂的选择一般由实践考虑而定。在一些情况下，更方便的是使用一种以上诱变剂，而不是大量使用一种诱变剂。当可以分离突变体时，其改良特征(感兴趣的植物结构)必须被用作选择因素。诱变剂可归类为物理(紫外光、X射线、γ射线、β辐射、快中子、重离子束)和化学诱变剂。大多数化学诱变剂属于烷基化剂(甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(dES)等)，但也有其它类别，例如碱基类似物(例如5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤)以及结构诱变剂(例如二氨基吖啶或吖啶橙)。
诱变剂主要产生独立的突变和小缺失、插入、颠换和/或转换(约1-5个核苷酸大小)。例如但不限于，诱变剂还可以是以下，例如：甲磺酸甲酯(MMS)、亚硝基胍(NTG)、N-乙基-N-亚硝基胍(ENU)、三乙基三聚氰胺(TEM)、N-甲基-N-亚硝基胍(MNU)、甲基苄肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(MNNG)、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7，12二甲基-苯并蒽(DMBA)、环氧乙烷、六甲基磷酰胺、白消安、二环氧烷(二环氧辛烷(DEO)、二环氧丁烷(BEB)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯-乙基)氨基丙基胺]吖啶双盐酸盐(ICR-170)、甲醛等。
因此，例如种子可受到化学诱变剂作用，在所述种子的基因组中产生一系列突变。所述种子长成成体植株(M1)，其自花授粉产生M2代。对M2植物的DNA进行筛选，以鉴定是否在感兴趣的基因中有突变。一旦在感兴趣的基因中鉴定到突变，播种携带所述突变的M2植物的种子产生M3植物，其进行筛选，鉴定是否具有与感兴趣基因有关的表型特征。
本领域技术人员理解各种植物材料都可进行诱变，包括但不限于种子、花粉、细胞或植物组织。进行诱变的植物材料的类型改变了植物DNA中的阶段，然后进行筛选以找到突变。因此例如，当花粉在植物授粉前被诱变，得到的种子产生M1植物。所述M1植物中的各个细胞可以含有花粉中诱导的突变，因此必需等到M2的产生才能进行筛选。该过程在本领域中被称作耕作。
因此，本发明的另一个方面涉及一种获得与野生对照植物相比具有改变的植物结构的番茄植物的方法，包括：
a)从番茄植物(亲本)获得植物材料，
b)对步骤(a)的植物材料进行诱变；
c)培养突变的植物材料直到再生出完整植物及其子代，
d)分析步骤(c)的植物的子代，以在至少一个拷贝中检测BRC1直向同源基因(SIBRC1L1和SIBRC1L2)的至少一个突变，
e)筛选基因SIBRC1L1和SIBRC1L2中的至少一个拷贝中的至少一个突变的子代，其与对照型植物相比植物结构改变，
f)可任选地培育所选植物，获得其具有所述植物结构改变的子代。
在本发明该方面的一个优选例中，突变在基因SIBRC1L2的至少一个拷贝中产生。在另一个优选例中，步骤(b)的突变是通过化学诱变剂(mutagen)诱导的。
本发明的另一个方面涉及一种获得与野生对照植物相比具有改变的植物结构的马铃薯植物的方法，包括：
a)从马铃薯植物(亲本)获得植物材料，
b)对步骤(a)的植物材料进行诱变；
c)培养突变的植物材料直到再生出完整植物及其子代，
d)分析步骤(c)的植物的子代，以在至少一个拷贝中检测BRC1直向同源基因(StBRC1L1和StBRC1L2)的至少一个突变，
e)筛选基因StBRC1L1和StBRC1L2中的至少一个拷贝中的至少一个突变的子代，其与对照型植物相比植物结构改变，
f)可任选地培育所选植物，获得其具有所述植物结构改变的子代。
在本发明的该方面的一个优选例中，步骤(b)的突变是通过化学诱变剂(mutagen)诱导的。
在整篇说明书和权利要求书中，词语“包含”及其变体并不意味着排除任何其它技术特征、添加、成分或步骤。对于本领域技术人来说，本发明的其它目的、优点和特征包含在说明书的部分和本发明的实践中。下列附图和实施例是为了说明，而不是为了限制本发明。
附图说明
图1.转基因番茄品系的表型，其基因SIBRC1L1和SIBRC1L2的活性下降。Moneymaker变种对照植物(A)和品系35SCaMV::SIBRC1L1 RNAi(B)的一般视图。对照植物(C)和植物35SCaMV::SIBRC1L2 RNAi(D)的腋芽细节。E.品系35SCaMV::SIBRC1L2 RNAi的一般视图。
图2.对对照番茄植物、品系35SCaMV::SIBRC1L1 RNAi(A)和35SCaMV::SIBRC1L2 RNAi(B)的植物分枝表型进行定量
图3.基因StBR1L1和StBR1L2在地上芽和匍匐枝中的差异表达，用半定量RT-PCR定量。
图4.StBRC1L1活性下降的转基因马铃薯品系的表型。A.Desiree变种对照植物(左)和植物35SCaMV::StBRC1L1 RNAi(右)的一般视图。B.对照植物和品系35SCaMV::StBRC1L1 RNAi地上分枝的表型。X轴代表分枝数量。C.对照植物和品系35SCaMV::StBRC1L1 RNAi的地下分枝(匍匐枝)的表型。X轴代表匍匐枝数量。
图5.品系35SCaMV::StBRC1L1的匍匐枝表型。A.转基因植物(RNAi)比对照植物(wt)产生更多数量的匍匐枝。B.转基因植物与对照植物不同，产生有分支的匍匐枝。
图6.StBRC1L1活性下降的转基因品系的产量。A.对照个体(顶部)和来自品系35SCaMV::StBRC1L1 RNAi(底部，编号列)的块茎的总产率。B.块茎生产的定量。C.块茎总重定量。
图7.用于产生35SCaMV::SIBRC1L1 RNAi和35SCaMV::SIBRC1L2 RNAi品系(左侧)和35SCaMV::StBRC1L1 RNAi和35SCaMV::StBRC1L2 RNAi(右)的双元质粒图谱。其中标明有义序列(A盒)和反义序列(盒B)的片段，它们由丙酮酸脱氢酶激酶的内含子(PDK内含子)隔开，构成RNAi结构。在有义片段A前方有烟草花叶病毒的35S启动子(35S启动子)和作为终止子的真蛸碱合成酶终止子(OCSter)。还标出了T-DNA的末端，LB(左端)和RB(右端)以及新霉素磷酸转移酶基因的位置，其赋予卡那霉素抗性(NPTII kanR)。
实施例
下文通过本发明人进行的实验说明了本发明，其揭示了基因SIBRC1L1，SIBRC1L2，StBRC1L1和StBRC1L2表达对番茄植物和马铃薯植物植物结构改变中的特异性和效力。
实施例1：基因SIBRC1L1和SIBRC1L2的基因组、启动子和编码序列的克隆
为了克隆番茄植物的BRC1直向同源物，对不同茄科数据库中BRC1-型TCP基因进行了研究：TIGR茄科基因组学来源BLAST页，TIGR植物转录集合数据库和SOL基因组学网络。为了进行比较，使用拟南芥的BRC1蛋白的TCP盒的氨基酸序列，发现一种EST(表达序列标记)和cDNA，其翻译能够产生一拟南芥BRC1具有高度同源性的蛋白质。EST EST522935长447bp，部分cDNAAY168167长415bp。基因SIBRC1L1和SIBRC1L2的核苷酸序列分别列于SEQID NO：7和SEQ ID NO：8。
为了扩增两种基因的完整cDNAs(SIBRC1L1是SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：16为SIBRC1L2)，使用两种不同策略。对于SIBRC1L1，设计了两种嵌套引物(Le1，SEQ ID NO：17和Le2，SEQ ID NO：18)，其位于基因的5’区域，通过PCR，使用来自番茄植物腋芽的cDNA的oligo dT扩增完整cDNA。对于基因SIBRC1L2，可得的序列不包括5’和3’端，因此通过SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)对两端进行克隆。通过使用该试剂盒，在从番茄植物的腋芽的总RNA中进行cDNA合成的过程中在5’和3’末端掺入合成接头。对于使用合成性接头对两端扩增，在基因SIBRC1L2的可得序列中设计了两对嵌套引物：用于3’末端的LeTCP2-F1(SEQ ID NO：19)和嵌套的LeTCP2-F1(SEQ ID NO：20)和用于5’端的LeTCP2-R1(SEQ ID NO：21)和嵌套的LeTCP2-R1(SEQ ID NO：22)。一旦获得了5’和3’重叠片段，设计引物(LeTCP2 cDNA-F，SEQ ID NO：23)和LeTCP2 cDNA-R，SEQ ID NO：24)扩增完整基因。
对于基因SIBRC1L1，扩增两类cDNA。因为不同内含子处理，一种具有开放的长阅读框(1041pb)，另一类具有开放的短阅读框(978pb)，而在SIBRC1L2中仅扩增出一类cDNA，其开放阅读框为1014bp。对应于三种cDNA的PCR片段克隆在pGEMT-easyTM载体(Promega)中。
一旦了解了两种基因的完整序列，使用包括对应于各基因的5’和3’区的引物扩增对应于其基因组序列的片段(对于SIBRC1L1的SEQ ID NO：7和SIBRC1L2的SEQ ID NO：8)，其中Le1(SEQ ID NO：17)和Le3(SEQ ID NO：25)用于扩增SIBRC1L1的基因组序列，用SIBRC1L2 cDNA-F(SEQ ID NO：23)和LeTCP2cDNA-R(SEQ ID NO：24)扩增SIBRC1L2的基因组序列。对于SIBRC1L1，通过将基因组序列与编码区的序列进行比较，观察到两个内含子的存在，其在短cDNA中被除去，但其中一个留在长cDNA中。对于基因SIBRC1L2，将基因组序列与编码序列比较显示一个内含子的存在。
用Genome WalkerTM(Clontech)番茄文库进行分离两种基因的启动子区域(SEQ ID NO：5对应SIBRC1L1和SEQ ID NO：6对应SIBRC1L2)。使用这种策略，从基因组DNA中通过用不同酶消化产生钝端(DraI，EcoRV，PvuII和SspI)然后在消化产生的末端连接合成性接头，产生不同的Genome WalkerTM文库。从对两种基因(GSP1-TCP1，GSP2-TCP1，分别为SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27，用于SIBRC1L1；而GSP1-TCP2，GSP2-TCP2-分别为SEQ ID NO：28和SEQID NO：29，用于SIBRC1L2)和对于接头可得的atg设计的大约为100bp的嵌套引物，PCR扩增出两个1.kb和0.7kb大小的片段，其对应于基因SIBRC1L1和SIBRC1L2的启动子区。两个片段都克隆在pGEMT-easyTM载体中。
实施例2：具有通过RNAi技术沉默的基因SIBRC1L1和SIBRC1L2功能丧失的转基因番茄植物(Solanum Lycopersicum，Moneymaker变种)。
所选的进行RNA干扰的DNA片段位于TCP盒和R盒之间，是高度保守的区域且是TCP基因特征性的。所述片段独特地响应所选序列的部分，其保证了沉默对于SIBRC1L1和SIBRC1L2单独的特异性。
用于沉默基因SISRC7L1的片段长225个碱基对，序列包括在SEQ ID NO：11中，是本发明的第七多核苷酸。
用于沉默基因SIBRC1L2的片段具有415个碱基对，序列包括在SEQ ID NO：12，是本发明的第八多核苷酸。
用于产生基因SIBRC1L1和SIBRC1L2的RNAi构建物的策略
为了获得RNAi的特征性发夹结构，将所选的片段克隆在pHannibal质粒(CSIRO)中，其携带青霉素抗性。指导该克隆，使得片段以5’-3’方向进入靶点BamHI和ClaI，进行克隆，并在内含子PDK(742pb)的另一端使用3’-5’方向，使用靶点XhoI和KpnI。因此，使用在5’末端含有不同限制性酶目标序列的引物扩增所选片段(SIBRC1L1的5’末端的引物包含于序列SEQ ID NO：30，SIBRC1L1的3’末端的引物包含于序列SEQ ID NO：31，SIBRC1L2的5’末端的引物包含于序列SEQID NO：32，SIBRC1L2的3’末端的引物包含在序列SEQ ID NO：33中)。
一旦获得具有RNAi发夹结构的重组质粒，并通过测序检查后，将表达盒转移到用NotI切割的pHannibal转基因(3330pb)中，克隆入Bluescript SK+质粒的同一限制性酶位点中。如此，可以在序列一侧留下SacI位点，在另一端留下SmaI位点，因此能通过两种酶消化片段和双元质粒pBIN19(图7)，亚克隆两个片段，产生的构建物引入番茄植物(图7)。选择这种质粒是因为众所周知pBIN19质粒有效转化番茄，在细菌和植物中产生卡那霉素抗性。由烟草花叶病毒的35S启动子(CaMV35S)(1346pb)指导转基因的表达以促进其组成型表达，而在基因3’末端引入在土壤杆菌中发现的真蛸碱合成酶(OCS终止子(766pb))，作为转录终止子。一旦获得大肠杆菌中的构建物，制备质粒，以转化根瘤土壤杆菌LBA4404。从携带我们的质粒的集落中选择一个菌落，用于转化番茄植物。
番茄植物的转化
为了稳定转化番茄植物，使用了Ellul等.(2003)Theor Appl Genet.106(2)：231-8.的方案。根据该方案，从体外条件在含有维生素，补充有2％蔗糖的MS培养基(Physiol.Plant.15：473-497，1962)中生长的植物转化番茄子叶。一旦长出第一片真叶，根据尺寸横向将子叶切成一或两个部分(外植体)，将其置于暗处两日，倒转与预培养基(PCM)接触，其中含有激素AIA和激动素，最终浓度为4mg/l。48小时后，将外植体在土壤杆菌培养物中浸泡8分钟进行感染。在除去过量土壤杆菌后，将外植体置于共培养基(CCM)中，其与先前具有相同的激素组成，但加入了乙酰丁香酮。外植体与细菌在暗处一起培养48小时。
共培养期结束后，在漂洗培养液(WM)加上抗生素头孢噻肟(500mg/l)中洗涤外植体，除去土壤杆菌，在无菌滤纸上干燥，将其转移到没有选择压力(AIA/激动素/头孢噻肟)的回收培养基(RM)中。在该培养基中，光照培养两日，然后转移到加入另一种激素玉米素(1mg/l)和筛选转基因的抗生素卡那霉素(50mg/l)的第一选择培养基(SM)中。外植体在选择培养基中培养，直到三周后第一次更换新鲜培养基(成分相同)。从这些外植体产生的愈伤组织经过4次3周的亚培养，然后产生第一个顶端。
一旦顶端充分发育，切下愈伤组织，将其转移到生根培养基(RM)中，其中包含低浓度的AIA(0.1mg/l)，利于根部发生。一旦其充分发育，将番茄植株转移到泥煤和蛭石3∶1的混合物中，将植物维持在高湿度条件下至少1周，防其枯萎。
预培养基(PCM)
MS基础盐混合物，含有0.8％琼脂
蔗糖(30g/l)
肌醇(100mg/l)
SH维生素(10ml/l)
IAA(4mg/l)
激动素(4mg/l)
共培养基(CCM)
MS基础盐混合物，含有0.8％琼脂
蔗糖(30g/l)
肌醇(100mg/l)
SH维生素(10ml/l)
IAA(4mg/l)
激动素(4mg/l)
乙酰丁香酮(39.2g/l)
漂洗培养液(WM)
MS基础盐混合物
蔗糖(20g/l)
肌醇(100mg/l)
头孢噻肟(500mg/l)
回收培养基(RM)
MS基础盐混合物，含有0.8％琼脂
蔗糖(30g/l)
肌醇(100mg/l)
SH维生素(10ml/l)
IAA(4mg/l)
激动素(4mg/l)
头孢噻肟(300mg/l)
选择培养基(MS)
MS基础盐混合物，含有0.8％琼脂
蔗糖(30g/l)
肌醇(100mg/l)
SH维生素(10ml/l)
IAA(4mg/l)
激动素(4mg/l)
玉米素(1mg/l)
卡那霉素(500mg/l)
头孢噻肟(300mg/l)
生根培养基(RM)
MS基础盐混合物，含有0.8％琼脂
蔗糖(30g/l)
肌醇(100mg/l)
盐酸硫胺(1mg/l)
IAA(0.1mg/l)
品系RNAi 35S::SIBRC1L1和35S::SIBRC2L2的特征鉴定
从携带有构建物35S::SIBRC1L1 RNAi番茄植物的Moneymaker(摇钱树)变种载体产生10个独立的转基因品系，以及从携带有构建物35S::SIBRC1L2 RNAi的产生另10个品系，进行表型分析。T1个体表示，虽然35S::SIBRC1L1 RNAi个体具有强顶端优势(没有分枝)，在相同条件下，35S::SIBRC1L2 RNAi个体与野生分枝相比，具有明显过量的侧枝(图1和2)。这些结果显示，基因SIBRC1L2比SIBRC1L1在控制番茄植物中侧枝生长中更为重要。
实施例3：基因StBRC1L1和StBRC1L2的基因组、启动子和编码序列的克隆
为了克隆马铃薯植物BRC1的直向同源物，在不同数据库中对BRC1型TCP基因进行了检索：TIGR茄科基因组学来源BLAST页，TIGR植物转录本集合数据库和SOL基因组学网络。为了进行比较，使用拟南芥的BRC1蛋白的TCP盒的氨基酸序列。发现了两种独特基因：TC168465和TC129597，分别被称为StBRC1L1和StBRC1L2。另外，考虑到番茄和马铃薯之间的高度同源性，以及已经克隆到的SIBRC1L1番茄基因，用相同引物测试了基因组马铃薯DNA，5’末端使用Le1(SEQ.ID NO：17)和Le2(SEQ ID NO：18)，后者是前者的嵌套引物，3’末端使用Le3(SEQ ID NO：25)。根据该序列，设计了特异性引物(racest1-5\SEQID NO：34)，利用来自马铃薯腋芽和匍匐枝的cDNA，通过PCR-RACE技术来定位基因的5’末端。根据获得的序列，在5’末端设计引物：StTCPI-ORF1(SEQ ID NO：35)。为了扩增cDNA序列，使用从相同RNA合成的cDNA作为5’末端，但使用引物B26(SEQ ID NO：36)，其在序列中在引物B25(SEQ ID NO：37)的序列后包含有一个polyT尾，使其不能用作3’末端的引物。
用引物基因组(genomic)-StTCPI A(SEQ ID NO：38)和基因组(genomic)-StTCPI B(SEQ ID NO：39)从DNA扩增基因StBRC1L1。
首先对于StBRC1L1使用的相同cDNA扩增出部分StBRC1L2。3’末端使用引物B25，5’末端使用StTCP2A(SEQ ID NO：40)和StTCP2B(SEQ ID NO：41)(前者的嵌套引物)，根据EST TC129597的序列设计。从获得的序列用PCR-RACE和特异性引物St2-Seq 1(SEQ ID NO：42)及其嵌套引物St2-Seq 2(SEQ ID NO：43)定位5’末端。
为了扩增完整cDNA，使用引物StTCP2-5′(SEQ ID NO：44)和B25。cDNA序列具有一系列多态性，我们认为这是两个等位基因，产生等位基因1和等位基因2，并相应产生其蛋白质。对于基因组序列，使用引物StTCP2-5′和StTCP2-3′(SEQ ID NO：45)。
将对应于基因的部分和所有序列的所有扩增的PCR片段克隆入pGEMT-easyTM载体(Promega)。
实施例4：转基因马铃薯植物的产生(马铃薯Desiree变种)，其中的RNAi技术沉默StBRC1L1和StBRC1L2基因导致功能缺失
用于干扰StBRC1L1的片段位于TCP盒和R盒之间，是高度保守的TCP基因的特征性区域。所述片段除了与确保StBRC1L1基因的特异性沉默的所选序列部分成环外，不与任何其它部分成环。该片段长185个碱基对，序列包括在SEQ IDNO：13中，构成本发明的第九多核苷酸。
选择用于干扰StBRC1L2的片段也位于TCP盒和R盒之间。所述片段仅与所选序列的部分杂交，其确保特异性沉默基因StBRC1L2。该片段长168个碱基对，序列包括在SEQ ID NO：14中，构成本发明的第十多核苷酸。
用于产生基因StBRC1L1和StBRC1L2的RNAi构建物所用的策略
为了获得RNAi的特征性发夹结构，所选的片段克隆入pHannibal质粒(CSIRO)，其携带对氨苄青霉素的抗性。指导所述克隆，使得片段以5’-3’方向进入靶点BamHI和ClaI，进行克隆，在内含子PDK(742pb)的另一端使用靶点XhoI和KpnI按照3’-5’方向进行克隆。因此，用含有用于5’末端的不同限制性酶的目标序列的引物扩增所选的片段。
对于StBRC1L1
5’末端的引物：(SEQ ID NO：46)
3’末端的引物：(SEQ ID NO：47)
对于StBRC1L2
5’末端的引物：(SEQ ID NO：48)
3’末端的引物：(SEQ ID NO：49)
一旦获得具有RNAi发夹结构的重组质粒并通过测序检查后，用NotI切割提取pHannibal转基因(3330pb)，将其克隆入双元质粒pART27(Gleave，1992 PlantMol Biol.1992 Dec；20(6)：1203-7)同一限制性酶的位点(图7)，其在细菌内赋予对链霉素和壮观霉素的抗性以及在植物中赋予对卡那霉素的抗性。pART27的NotI位点位于质粒右侧和左侧边缘，确保了转移到植物细胞上并能对其转化。转基因旁侧有用于组成型表达的烟草花叶病毒的35S启动子(CaMV35S)(1346pb)和土壤杆菌的真蛸碱合酶基因(OCS终止子)(766pb)，其作为转录终止子。
一旦获得大肠杆菌中的构建物，用质粒的制备物转化根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGLO。从携带我们的质粒的集落中选出一个，用于转化马铃薯植物。
马铃薯植物的转化
在含有维生素，补充有2％蔗糖的MS培养基(MS2)(Physiol.Plant.15：473-497，1962)中培养马铃薯植物。植物必须在从植物顶端在新鲜培养基中漂洗后的3-4周间。
从植株上摘下叶片，用解剖刀除去叶柄部分，在中央叶脉切割一两刀，而不碰到叶片边缘。将这样的十片树叶顶部朝下放置在含有10ml MS2培养基的9厘米直径的皿中。
皿和80μl土壤杆菌培养物一起培养。在补充有合适抗生素的YEB培养基中，在600nm的光密度(OD)为0.2时开始所述培养。当其达到0.8的OD600nm时，离心洗涤，重悬浮在不含抗生素的同样体积的YEB培养液中，用于接种。
皿在暗处培养2日，其温度和湿度条件与其后生长的相同。将其转移到愈伤组织诱导培养基(CIM)中保持叶片位置向下倒转。7-8日后，将其移入分枝诱导培养基(BIM)中。其维持在该培养基中，直到愈伤组织出现，并在叶片上发展。每8-10日更换一次培养基。
当分枝在0.5到1cm之间时，将其转移到由不含任何激素的含有1.6％葡萄糖、卡那霉素(50mg/l)和头孢噻肟(250mg/l)MS培养基的生根培养基中，避免土壤杆菌的生长。
生根和植物开始生长后，切除顶端，转移到含卡那霉素和头孢噻肟的MS2培养基中，用如上所述相同条件培养。
为了在温室中培养植物，将在MS2培养基中1-2周的植物转移到具有50ml基质的容器中。根被基质覆盖，整株植物用塑料覆盖以维持湿度，使用体外生长的特征性条件。3-4天后除去覆盖物。
含有1.6％葡萄糖的愈伤组织诱导培养基(CIM)
NAA(5mg/L)
BAP(0.1mg/L)
头孢噻肟(250mg/L)
卡那霉素(50mg/L)
植物琼脂Duchefa(5.5g/L)
分枝诱导培养基(MIR)
含有1.6％葡萄糖的MS
玉米素腺嘌呤核苷(2mg/l)
NAA(0.02mg/l)
GA3(0.02mg/l)
头孢噻肟(250mg/l)
卡那霉素(50mg/l)
植物琼脂Duchefa(5.5g/l/L)
品系RNAi 35S::StBRC1L1和35S::StBRC2L2的特征确定
在马铃薯植物中有几种腋芽：产生分枝的地上芽和产生匍匐枝的地下芽，产生块茎的匍匐枝产生块茎。包含在块茎中的匍匐枝的腋芽是块茎芽眼。
结果显示，马铃薯植物中匍匐枝芽中的StBRC1L1表达水平比在地上芽中高，而StBRC1L2显示相反的表达模式(图3)。这可能揭示了BRC1各种直向同源物在不同类型的芽中控制的特异性。
缺乏StBRC1L1功能的表型支持其匍匐枝延伸和分枝中的抑制作用。产生了七种马铃薯35S::RNAiStBRC1L1的转基因品系，Desiree变种，对其进行两代分析。
StBRC1L1同时影响地上芽和匍匐枝芽的发生，因为沉默品系具有更多数量的侧枝，地上匍匐枝和地下匍匐枝(图4和5)。
地下匍匐枝(产生块茎)是分枝的，与显示强烈顶端优势的野生匍匐枝不同(图5)，这些品系中的块茎化时间不被影响。由于每个匍匐枝的末端通常产生一个块茎，大量分枝的匍匐枝可使得每株植物比野生植物产生更多数量的块茎(图6A和6B，比对照多64-276.9％)。在培养植物的实验条件下(20cm直径的花盆)，块茎总重的产量也有轻微上升(17-19％)(图6C)。很可能在最佳条件下，产量相对于野生植物会更高。另外，该品系具有相当的活力，且衰老延迟。
Figure IPA00001434026400011
Figure IPA00001434026400021
Figure IPA00001434026400031
Figure IPA00001434026400041
Figure IPA00001434026400051
Figure IPA00001434026400081
Figure IPA00001434026400091
Figure IPA00001434026400101
Figure IPA00001434026400111
Figure IPA00001434026400121
Figure IPA00001434026400141
Figure IPA00001434026400151
Figure IPA00001434026400161
Figure IPA00001434026400181

Claims (39)

1.能够翻译成氨基酸序列的分离的RNA或DNA多核苷酸，所述氨基酸序列含有一种与选自下列的氨基酸序列具有至少95％相同性的肽：
a.SEQ ID NO：1，
b.SEQ ID NO：2，
c.SEQ ID NO：3，
d.SEQ ID NO：4，或
e.SEQ ID NO：50。
2.能够翻译成氨基酸序列的分离的RNA或DNA多核苷酸，所述氨基酸序列含有一种与选自下列的氨基酸序列具有至少99％相同性的肽：
a.SEQ ID NO：1，
b.SEQ ID NO：2，
c.SEQ ID NO：3，
d.SEQ ID NO：4，或
e.SEQ ID NO：50。
3.如前述权利要求所述的分离的RNA或DNA多核苷酸，能够被翻译成选自下列的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：1，
b.SEQ ID NO：2，
c.SEQ ID NO：3，
d.SEQ ID NO：4，或
e.SEQ ID NO：50，
f.SEQ ID NO：51。
4.分离的RNA或DNA多核苷酸，能够指导植物腋生分生组织中感兴趣基因的表达，所述基因与SEQ ID NO：5具有以下任一的相同性：
a.至少95％，或
b.至少99％。
5.分离的RNA或DNA多核苷酸，能够指导植物腋生分生组织中感兴趣基因的表达，所述基因与SEQ ID NO：6具有以下任一的相同性：
a.至少95％，或
b.至少99％。
6.分离的RNA或DNA多核苷酸，能够指导植物腋生分生组织中感兴趣基因的表达，所述基因选自以下：
a.SEQ ID NO：5，或
b.SEQ ID NO：6。
7.DNA或RNA遗传构建物，其包含以下类型的序列之一：
a.核苷酸序列，包含至少如权利要求1-3任一所述的多核苷酸，用于体外或体内转录，或
b.核苷酸序列，对应于包含如权利要求1-3任一所述的多核苷酸的基因表达系统或载体，可任选地与至少一种指导所述核苷酸序列转录的启动子以及转录和时空上合适调控必需或适当的其它序列可操纵性连接。
8.如前述权利要求所述的遗传构建物，其中所述启动子选自如权利要求4-6任一所述的多核苷酸。
9.DNA或RNA遗传构建物，含有如权利要求4-6任一所述的多核苷酸，其与感兴趣的基因可操纵性连接。
10.如权利要求1-6任一所述的多核苷酸，或如权利要求7-9任一所述的遗传构建物的应用，用于改变植物结构。
11.如权利要求4-6任一所述的多核苷酸，或如权利要求9所述的遗传构建物的应用，用于在植物腋生分生组织中表达感兴趣的基因。
12.用于改变植物的植物结构的方法，包括：
a.在宿主植物细胞的细胞或培养物中转染如权利要求1-6任一所述的多核苷酸，或如权利要求7-9任一所述的遗传构建物；
b.在合适的培养基中培养宿主植物细胞的细胞或培养物，直到再生成完整植物。
13.在植物腋生分生组织中表达感兴趣基因的方法，包括：
a.在宿主植物细胞的细胞或培养物中转染如权利要求1-6任一所述的多核苷酸，或如权利要求7-9任一所述的遗传构建物；
b.在合适的培养基中培养宿主植物细胞的细胞或培养物，直到再生成完整植物。
14.如权利要求12-13任一所述的方法，其中转染的细胞可在分类学上分为属于马铃薯种(Solanum tuberosum)。
15.如权利要求12-13任一所述的方法，其中转染的细胞可在分类学上分为属于番茄种(Solanum lycopersicum)。
16.基因SIBRC1L1、SIBRC1L2、StBRC1L1和StBRC1L2或如权利要求1-3任一所述的多核苷酸的表达调节剂，所述表达调节剂选自下列物质：
a.反义寡核苷酸；
b.干扰RNA，或
c.抗体(或其片段)。
17.如权利要求16所述的调节剂，其由能抑制基因SIBRC1L2表达的反义寡核苷酸组成。
18.如权利要求16所述的调节剂，由包含核苷酸序列SEQ ID NO：11的分离的DNA或RNA多核苷酸组成。
19.如权利要求16所述的调节剂，由包含核苷酸序列SEQ ID NO：12的分离的DNA或RNA多核苷酸组成。
20.如权利要求16所述的调节剂，由包含核苷酸序列SEQ ID NO：13的分离的DNA或RNA多核苷酸组成。
21.如权利要求16所述的调节剂，由包含核苷酸序列SEQ ID NO：14的分离的DNA或RNA多核苷酸组成。
22.含有如权利要求18-21任一所述的分离的多核苷酸的遗传构建物。
23.含有如权利要求16-21任一所述的调节剂或如权利要求22所述的遗传构建物的组合物。
24.如权利要求16-21任一所述的多核苷酸，或如权利要求22所述的遗传构建物的应用，用于改变植物结构。
25.整合了如权利要求1-6或18-21任一所述的多核苷酸的遗传物质或权利要求7-9或22任一所述的遗传构建物的种子。
26.整合了如权利要求1-6或18-21任一所述的多核苷酸的遗传物质或如权利要求7-9或22任一所述的遗传构建物的植物细胞。
27.如权利要求26所述的植物细胞培养物。
28.包含如权利要求26-27任一所述的细胞，和/或在如权利要求25所述的种子生长后获得的植物。
29.其遗传物质为如权利要求26-27任一所述细胞的遗传物质衍生物的花粉颗粒。
30.如权利要求25所述的种子，如权利要求26所述的植物细胞，如权利要求27所述的植物细胞培养物，如权利要求28所述的植物，或如权利要求29所述的花粉颗粒，其可在分类学上分为茄科(Solanaceae)。
31.如权利要求25所述的种子，如权利要求26所述的植物细胞，如权利要求27所述的植物细胞培养物，如权利要求28所述的植物，或如权利要求29所述的花粉颗粒，其可在分类学上分为属于马铃薯种。
32.如权利要求25所述的种子，权利要求26所述的植物细胞，权利要求27所述的植物细胞培养物，权利要求28所述的植物，或权利要求29所述的花粉收获物，其可在分类学上分为属于番茄种(Solanum lycopersicum)。
33.如权利要求26所述的细胞群，其形成块茎或微块茎。
34.番茄植物的植株、果实、种子、细胞、细胞群或部分，其具有相对于对照型植物改变的植物结构，其中植物结构的改变是由于番茄植物中基因SIBRC1L1和SIBRC1L2的非转基因突变引起的。
35.马铃薯植物的植株、果实、种子、细胞、细胞群或部分，其具有相对于对照型植物改变的植物结构，其中植物结构的改变是由于马铃薯中基因StBRC1L1和StBRC1L2的非转基因突变引起的。
36.获得与野生对照植物相比具有改变的植物结构的番茄植物的方法，包括：
a.从番茄植物(亲本)获得植物材料，
b.使步骤(a)的植物材料经历诱变，
c.培养突变的植物材料直到再生成完整植物及其子代，
d.分析步骤(c)中子代，以检测基因SIBRC1L1和SIBRC1L2中至少一个拷贝的至少一个突变，
e.筛选在基因SIBRC1L1和SIBRC1L2中具有至少一个拷贝的至少一个突变的子代，其与对照型植物相比植物结构改变，
f.可任选的，培养所选植物，获得具有所述植物结构改变的子代。
37.如前述权利要求所述的方法，其中选择在基因SIBRC1L2中具有突变的突变体。
38.获得与野生对照植物相比具有改变的植物结构的马铃薯植物的方法，包括：
a.从马铃薯植物(亲本)获得植物材料，
b.使步骤(a)的植物材料经历诱变，
c.培养突变的植物材料直到再生成完整植物及其子代，
d.分析步骤(c)中子代，以检测基因StBRC1L1和StBRC1L2中至少一个拷贝的至少一个突变，
e.筛选在基因StBRC1L1和StBRC1L2中具有至少一个拷贝的至少一个突变的子代，其与对照型植物相比植物结构改变，
f.可任选的，培养所选植物，获得具有所述植物结构改变的子代。
39.如权利要求36-38任一所述的方法，其中步骤(b)的诱变是用化学诱变原进行的。
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