ES2683734T3 - Genes reguladores de la ramificación de plantas, promotores, construcciones genéticas que los contienen y usos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a genes que codifican para factores de transcripción de la familia TCP y que tienen un papel biológico en el desarrollo de las yemas axilares y el crecimiento delas ramas. También se refiere a los promotores de la transcripción de dichos genes, a las construcciones genéticas que los contienen y a sus usos, incluyendo el empleo de agentes que modulen la expresión de estos genes, para modificar la arquitectura de las plantas.

Description

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DESCRIPCION

Genes reguladores de la ramificacion de plantas, promotores, construcciones geneticas que los contienen y usos.

La presente divulgacion se encuentra dentro del campo de la biologfa molecular, la biotecnologfa y la mejora vegetal, y espedficamente se refiere a genes que codifican para factores de transcripcion de la familia TCP y que tienen un papel biologico en el desarrollo de las yemas axilares y el crecimiento de las ramas. Tambien se refiere a los promotores de la transcripcion de dichos genes, a las construcciones geneticas que los contienen y a sus usos, incluyendo el empleo de agentes que modulen la expresion de estos genes, para modificar la arquitectura de las plantas.

ESTADO DE LA TECNICA

Una de las cuestiones centrales en biologfa es el efecto que tiene la evolucion de los genomas en la diversidad morfologica. Los planes corporales estan determinados por las rutas geneticas de desarrollo ampliamente conservadas en grandes grupos taxonomicos. Cambios en la actividad de los genes que controlan estas vfas, dan lugar a alteraciones en los patrones morfologicos. La mayona de estos cambios son deletereos, pero unos pocos pueden dar lugar a la evolucion de la forma.

En las plantas angiospermas los patrones de ramificacion se determinan por la posicion en que se forman las ramas. Las ramas se generan a partir de meristemos formados en las axilas de las hojas tras la germinacion de las semillas. Los meristemos axilares (MA) dan lugar a yemas axilares, estructuras que contienen ramas preformadas con entrenudos cortos, primordios foliares, nuevos MA y, a menudo, meristemos florales. Las yemas pueden permanecer inactivas durante largos periodos de tiempo, o brotar dando lugar a ramas por elongacion de los entrenudos, en respuesta a senales ambientales o endogenas. Esta decision determina la arquitectura de la planta y afecta a aspectos claves de la vida de la planta, tales como la cantidad de nutrientes que recibira cada eje de crecimiento, la altura de la planta, la proteccion solar de los frutos, la eficiencia en la absorcion de la luz o su visibilidad para los polinizadores.

Los genes que controlan la iniciacion de los MA, el desarrollo de las yemas y su brotacion han sido caracterizados en varias especies de angiospermas. Estos estudios indican que el desarrollo de las yemas axilares esta controlado por rutas geneticas conservadas que evolucionaron antes de la radiacion de las plantas con flores. La iniciacion de MA esta controlada por los genes Ls/LAS/MONOCULM1 y los genes Blind/RAXI en tomate (Solanum lycopersicum), Arabidopsis, y arroz. La auxina y la estrigolactona, hormonas sintetizadas en los apices de los brotes y en la rafz, respectivamente, promueven la senalizacion a larga distancia para suprimir la ramificacion en varias especies. La smtesis y la respuesta a las estrigolactonas a traves de la via conservada MAX/RMS, descrita en Arabidopsis y guisante, se ha encontrado tambien en monocotiledoneas petunia (Petunia hybrida), y arroz. Los genes que actuan dentro de las yemas retrasando su desarrollo y crecimiento tambien estan conservados. El gen Teosinte branchedl (Tb1) aislado en mafz y en otras monocotiledoneas codifica para un factor de transcripcion de la familia TCP. Los genes TCP, exclusivos de plantas, codifican para factores de transcripcion que contienen el llamado dominio TCP, secuencia de 59 aminoacidos con una region basica y un dominio helice-lazo- helice, que confiere capacidad de union DNA y a otras protemas (Cubas et al., 1999. Plant Journal. 18:215-222), que se expresa en los Ma y en las yemas axilares, donde suprime su crecimiento. Tb1 tambien controla la floracion y el desarrollo de la inflorescencia. En dicotiledoneas, la duplicacion de Tb1 ha dado lugar a tres tipos de genes (CYC1, CYC2 y CYC3) uno de los cuales, el tipo CYC1, parece haber retenido la mayor parte de la actividad supresora de la ramificacion, al menos en Arabidopsis, donde este gen recibe el nombre de BRANCHED1 (BRC1). BRC1 actua dentro de las yemas impidiendo su desarrollo. BRC1 esta controlado a nivel transcripcional por la ruta MAX y responde a estfmulos ambientales y de desarrollo suprimiendo la ramificacion.

A pesar de que los genes que tienen un papel clave en el control del desarrollo axilar estan muy conservados, la diversidad de los modelos de ramificacion encontrados en angiospermas sugiere que la modulacion de este proceso ha divergido en los diferentes grupos filogeneticos (clados), lo que es soportado por la diferente regulacion de los genes de tipo MAX en guisante, Arabidopsis y arroz. Es muy posible que la evolucion funcion y regulacion de los genes tipo BRC1 tambien haya jugado un importante papel en esta evolucion. Al contrario que las alteraciones en las vfas de senalizacion, que a menudo generan efectos pleiotropicos no deseados, las modificaciones en la regulacion de factores de transcripcion que se expresan localmente, como BRC1, que actua exclusivamente en las yemas axilares, podna ser mas facilmente toleradas. Los reguladores transcripcionales han jugado un papel clave en la evolucion de muchos rasgos morfologicos. De hecho, durante la domesticacion del mafz, la mejora genetica para obtener plantas con una fuerte dominancia apical, dio lugar a la seleccion de plantas que sobreexpresaban Tb1. CYCLOIDEA, otro factor de transcripcion de la familia TCP, ha sido responsable de la evolucion de la simetna bilateral floral, una innovacion morfologica que ha evolucionado independientemente en distintos clados.

El control del desarrollo de las yemas axilares tiene un gran potencial aplicado ya que conocer sus bases geneticas nos puede permitir controlar la arquitectura de plantas de interes agronomico.

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Mediante inhibicion del desarrollo axilar podemos promover el crecimiento en un unico eje favoreciendo tallos largos y con pocos nudos como es deseable, por ejemplo, en especies de lenosas que se explotan para produccion de madera, otras que se cultivan a alta densidad como ciertas gramfneas o aquellas en las que los tallos laterales son una traba para la recoleccion mecanizada. Podemos favorecer el aporte de nutrientes a los ejes que estan desarrollando frutos (Ej. tomate) o prolongar la vida media de almacenamiento de ciertos productos cuyos brotes reducen su calidad (Ej. patatas, cebollas, ajos). La mejora clasica ha permitido obtener variedades con un unico tallo o "monostem" en algunas especies (Ej. girasol), sin embargo, en otras (Ej. tabaco, tomate) no se ha conseguido disponer de este caracter en lfneas de alta produccion. Las tecnicas alternativas empleadas para obtener plantas con un unico tallo (eliminacion manual de las ramas laterales, aplicacion de productos qufmicos) no solo encarecen la produccion, sino que favorecen la propagacion de enfermedades y pueden conllevar problemas de contaminacion ambiental. Favoreciendo el desarrollo axilar, podemos generar arquitecturas arbustivas y aumentar la produccion de hojas y flores, elementos apreciados en especies ornamentales o en aquellas en las que las hojas o los frutos son los productos de consumo. El incremento de la formacion de retonos tiene tambien interes en especies que se utilizan para el tapizado de terrenos, en las que se valora el crecimiento compacto (Ej. gramfneas de cesped o pasto). Serfa de gran valor ecologico fomentar el crecimiento intercalar en especies rastreras adaptadas a terrenos aridos amenazados por la erosion en los que la hierba resulta costosa de mantener. La produccion de nuevos brotes tambien tiene importancia en propagacion vegetativa y cultivo in vitro.

Por ultimo, en ciertas especies de lenosas el control de la brotacion de las yemas axilares cuya regulacion fisiologica y hormonal es comparable a la de herbaceas tiene gran importancia economica. En vides, cerezos, manzanos, y otras lenosas, las yemas axilares requieren una exposicion al frfo de dfas o semanas para brotar. Estas especies se han empezado a cultivar en pafses calidos (Ej. Brasil y Tailandia) en los que no se suelen alcanzar temperaturas bajas, por lo que los agricultores se ven obligados a emplear, para hacer brotar las yemas, tratamientos qufmicos muy toxicos (acido cianhfdrico, dinitro-orthocresol), o costosos tratamientos hormonales de rapida degradacion y que producen efectos no deseados.

Las Solanaceas, y entre ellas la tomatera (Solanum lycopersicum) y la patata (Solanum tuberosum), son plantas de gran importancia economica, en las que algunas de sus caracterfsticas de interes agronomico dependen de la actividad de sus yemas axilares. La brotacion de las yemas altera la relacion entre la produccion y consumo de fotoasimilados, pudiendo afectar a la produccion.

Reeves PA y Olmstead RG (Reeves PA y Olmstead RG. Mol Biol Evol. 2003 Dec;20(12): 1997-2009) divulga un analisis cladfstico de los genes TCP de varias especies de plantas, y su participacion en el desarrollo de simetrfa floral bilateral, pero no revela nada sobre el papel biologico de los genes tCp en el desarrollo de los yemas axilares y crecimiento de ramificaciones.

La solicitud de patente internacional WO2005108587A1 se refiere a una secuencia identificada de aproximadamente 1.7 kilobases, que comprende el promotor del gen BRANCHED 1 de Arabidopsis thaliana, el cual puede regular especfficamente la expresion axilar, pero no la expresion apical, de un gen particular.

Por tanto, en campos como la agricultura, la silvicultura y la horticultura, resultana de elevado interes poder controlar el desarrollo de las yemas axilares y la elongacion de ramas.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Los autores de la presente divulgacion han aislado e investigado el papel de los genes ortologos de Teosinte branched1 de mafz y BRANCHED1 (BRC1) de Arabidopsis en dos especies de la familia Solanaceae, la tomatera (Solanum lycopersicum L.) y la patata (Solanum tuberosum L.). Estos genes codifican para factores de transcripcion de la familia TCP. Las protefnas TCP, exclusivas de plantas, son factores de transcripcion con un dominio BHLH que confiere capacidad de union DNA y a otras protefnas. En Arabidopsis se ha demostrado el papel de BRC1 como represor durante la iniciacion de los meristemos axilares, el desarrollo de las yemas y el crecimiento de las ramas.

Los autores han encontrado que existen dos genes relacionados con BRC1 en cada especie (denominados SlBRC1L1 y SlBRC1L2, en tomatera y StBRC1L1 y StBRC1L2 en patata). Tambien han demostrado que, en ambas especies, BRC1L1 y BRC1L2 juegan un papel fundamental en la supresion del desarrollo de las yemas axilares y la elongacion de las ramas. En patata, StBRC1L1 y StBRC1L2 controlan tambien la formacion de los estolones y su ramificacion, y la brotacion de los ojos de los tuberculos. BRC1L1 y BRC1L2 se expresan especfficamente en yemas axilares pero sus niveles de expresion son diferentes para cada gen. El fenotipo de perdida de funcion de cada uno indica que, aunque ambos controlan la ramificacion, cada gen presenta un cierto grado de especializacion y divergencia funcional: en patata, StBRC1L1 controlarfa preferentemente la ramificacion de los estolones y StBRC1L2 la elongacion de ramas aereas; en tomatera, SlBRC1L2 podrfa tener un papel mas importante que SlBRC1L1 en el control de la elongacion de las ramas.

Por tanto, las secuencias de acidos nucleicos que codifican las protefnas producto de estos genes, promotores y las construcciones geneticas producto de esta divulgacion constituyen una valiosa herramienta para la manipulacion del

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desarrollo de las yemas axilares, y el control de la ramificacion, para incrementar el rendimiento de las plantas, y en particular de la patata y el tomate. La divulgacion tambien se refiere a las construcciones geneticas que comprenden estas secuencias, asf como celulas transformadas, vectores y plantas transgenicas que las incorporan. Ademas, se refiere a agentes moduladores de la expresion, y por tanto de la actividad biologica, de estos genes, asf como nuevas composiciones incluyendo estos agentes moduladores, y los usos de estas secuencias, construcciones geneticas, agentes moduladores y composiciones para la manipulacion de las yemas axilares, el crecimiento y la ramificacion de las plantas, y en particular de la tomatera y de patata.

La presente divulgacion tambien comprende metodos para manipular la arquitectura de las plantas, en particular la ramificacion, y por tanto el rendimiento de dichas plantas incorporando las construcciones de expresion y/o inhibicion de la divulgacion

En el caso particular de estas dos especies de Solanaceae, la inhibicion de la expresion de los nuevos genes (SIBRC1L1, SIBRC1L2, StBRC1L1, StBRC1L2) mediante tecnologfa de interferencia de RNA (RNAi), incrementa la ramificacion aerea en el caso de la tomatera (solo la inhibicion de SIBRC1L2) y, en el caso de patata aumenta ademas la produccion de estolones y su ramificacion, incrementando el rendimiento agrfcola de esta especie. Incrementar la expresion de estos nuevos genes, por el contrario, darfa lugar a una reduccion en el numero de ramas, en el caso de la tomatera, favoreciendo el aporte de nutrientes a los ejes que estan desarrollando frutos, y evitando el empleo de tecnicas alternativas empleadas para obtener plantas con un unico tallo (como la poda manual de las ramas laterales o la aplicacion de productos qufmicos) que no solo encarecen la produccion, sino que favorecen la propagacion de enfermedades y pueden conllevar problemas de contaminacion ambiental.

Por tanto, se divulga aquf un polinucleotido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacfdica que comprende un peptido que presenta una identidad con la SEQ ID NO: 1, seleccionada de entre cualquiera de las siguientes:

a) al menos un 95%, o

b) al menos un 99%.

La presente divulgacion muestra que, el polinucleotido de ARN o ADN aislado es capaz de traducirse a la secuencia aminoacfdica SEQ ID NO: 1.

Adicionalmente, aquf se divulga un polinucleotido de ARN o ADN aislado, capaz de traducirse a una secuencia aminoacfdica que comprende un peptido que presenta una identidad con la SEQ ID NO: 2 seleccionada de entre cualquiera de las siguientes:

a) al menos un 95%, o

b) al menos un 99%.

En un primer aspecto de la presente invencion, se relaciona un polinucleotido aislado, de aquf en adelante primer polinucleotido de la invencion, capaz de traducirse a la secuencia aminoacfdica SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto de la presente invencion, se revela una secuencia aminoacfdica aislada que comprende la SEQ ID NO: 2.

La presente divulgacion tambien revela un polinucleotido de ARN o ADN aislado, , capaz de traducirse a una secuencia aminoacfdica que comprende un peptido que presenta una identidad con la SEQ ID NO: 3 seleccionada de entre cualquiera de las siguientes:

a) al menos un 95%, o

b) al menos un 99%.

La presente divulgacion revela el polinucleotido de ARN o ADN aislado es capaz de traducirse a la secuencia aminoacfdica SEQ ID NO: 3.

Otro aspecto de esta divulgacion se refiere a un polinucleotido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacfdica que comprende un peptido que presenta una identidad con la SEQ ID NO: 4 seleccionada de entre cualquiera de las siguientes:

a) al menos un 95%, o

b) al menos un 99%.

La presente divulgacion se refiere a el polinucleotido de ARN o ADN aislado es capaz de traducirse a la secuencia aminoacfdica SEQ ID NO: 4.

El gen SIBRC1L1 se traduce a dos protefnas, una larga, de 346 aminoacidos (SEQ ID NO: 1) y otra corta, de 325 aminoacidos (SEQ D NO: 50). Por tanto, otro aspecto de esta divulgacion se refiere a un polinucleotido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacfdica que comprende un peptido que presenta una identidad con la SEQ ID NO: 50 seleccionada de entre cualquiera de las siguientes:

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a) al menos un 95%, o

b) al menos un 99%.

La presente divulgacion se refiere a l polinucleotido de ARN o ADN aislado es capaz de traducirse a la secuencia aminoacfdica SEQ ID NO: 50.

Los autores de la presente divulgacion tambien han detectado las secuencias reguladoras de la expresion de dichos genes, que son capaces de dirigir la expresion de un gen de interes en meristemos axilares pero no en meristemos apicales en tomate. El empleo de un promotor como el proporcionado por esta divulgacion permite manipular geneticamente las plantas y obtener plantas con caracterfsticas mejoradas, permitiendo modificar la arquitectura vegetal alterando el crecimiento o desarrollo de sus yemas axilares sin alterar el crecimiento del eje principal.

Por tanto, aquf esta divulgado un polinucleotido de ARN o ADN aislado capaz de dirigir la expresion de un gen de interes en las yemas axilares, que presenta una identidad con la SEQ ID NO: 5 seleccionada de entre cualquiera de las siguientes:

a) al menos un 95%, o

b) al menos un 99%.

La presente divulgacion muestra que el polinucleotido de ARN o ADN aislado presenta la secuencia nucleotfdica que se recoge en la SEQ ID NO: 5.

Otro aspecto de esta invencion se refiere a un polinucleotido aislado, de ahora en adelante segundo polinucleotido de la invencion, capaz de dirigir la expresion de un gen de interes en las yemas axilares, siendo preferiblemente el gen de interes el polinucleotido aislado del primer aspecto de la presente invencion, en el que la secuencia de expresion reguladora es la SEQ ID NO: 6.

Puede esperarse que el grado de identidad/similaridad de las protefnas homologas a las recogidas en la secuencias SEQ ID NO: 1 y sEq ID NO: 2 (para la tomatera), y SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 (para la patata), sean, en distintas variedades y subespecies de Solanum lycopersicum L. y Solanum tuberosum L., de al menos de un 80% o mayor, y mas preferiblemente de al menos un 85%, un 90, un 95% o un 99%. La correspondencia entre la(s) secuencia(s) aminoacfdica(s) de la(s) secuencia(s) putativa(s) y las secuencias recogidas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 se puede determinar por metodos conocidos en la tecnica. Los metodos de comparacion de secuencias son conocidos en el estado de la tecnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1999).

El termino “homologfa”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva comun, y mas concretamente, a la semejanza entre dos o mas secuencias de nucleotidos o aminoacidos. Puesto que dos secuencias se consideran homologas si tienen el mismo origen evolutivo, en general, se asume que valores superiores de similitud o identidad del 95% indicarfan homologfa. Podemos considerar, por tanto, que porcentajes de identidad de, al menos, un 99%, podrfan mantener la funcion de las secuencias aminoacfdicas ortologas recogidas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

El termino “ortologo” hace referencia a estructuras homologas de especies distintas, que tienen un antepasado comun, y en concreto, a la semejanza entre dos o mas secuencias de nucleotidos o aminoacidos.

El termino “identidad”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporcion de nucleotidos o aminoacidos identicos entre dos secuencias nucleotfdicas o aminoacfdicas que se comparan. Los metodos de comparacion de secuencias son conocidos en el estado de la tecnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403410 (1999).

En la presente divulgacion, se proporciona una construccion genetica de ADN o ARN que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias:

a) secuencia de nucleotidos, que comprende, el primer polinucleotido de la invencion para su transcripcion in vitro o in vivo, o

b) secuencia de nucleotidos, correspondiente a un sistema o vector de expresion genica que comprende el polinucleotido de a), operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripcion de dicha secuencia de nucleotidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripcion y su regulacion adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, senales de inicio y terminacion, sitios de corte, senal de poliadenilacion, origen de replicacion, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc.

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La presente divulgacion se refiere a que el promotor es el polinucleotido capaz de dirigir la expresion de un gen de interes en las yemas axilares, teniendo una identidad con SEQ ID NO: 5 seleccionada de una de las siguientes a) al menos un 95%, o b) al menos un 99%.

La presente divulgacion tambien se refiere a una construccion genetica de ADN o ARN, que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias:

a) secuencia de nucleotidos, que comprende, al menos, el primer polinucleotido de la invencion, para su transcripcion in vitro o in vivo, o

b) secuencia de nucleotidos, correspondiente a un sistema o vector de expresion genica que comprende el primer polinucleotido de la invencion, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripcion de dicha secuencia de nucleotidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripcion y su regulacion adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, senales de inicio y terminacion, sitios de corte, senal de poliadenilacion, origen de replicacion, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc.

La presente divulgacion establece que, el promotor es el segundo polinucleotido de la invencion.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una construccion genetica que comprende:

a. El primer polinucleotido de la presente invencion, o

b. El segundo polinucleotido de la presente invencion operativamente unido al primer polinucleotido de la presente invencion.

Un gran numero de estas construcciones, sistemas o vectores de expresion pueden ser obtenidos por metodos convencionales conocidos por los expertos en la materia y forman parte de la presente divulgacion.

Un “vector” es un replicon, o un vector integrativo, al que se ha unido otro segmento polinucleotido, para realizar la replicacion y/o expresion del segmento unido.

Un “replicon” es cualquier elemento genetico que se comporta como una unidad autonoma de replicacion polinucleotfdica dentro de una celula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.

Un vector integrativo es cualquier elemento genetico que se integra y se mantiene estable en el genoma de una celula.

“Secuencia de control” se refiere a secuencias de polinucleotidos que son necesarias para efectuar la expresion de las secuencias a las que estan ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huesped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de union ribosomal, y senales de terminacion; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, senales de terminacion, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el termino “secuencias de control” incluya, como mfnimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresion, y tambien puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.

Como se usa aquf, el termino “promotor” hace referencia a una region del ADN aguas arriba del punto de inicio de la transcripcion, y en el particular, que es capaz de iniciar la transcripcion en una celula vegetal, sea el origen del promotor una planta o no. Ejemplos de promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores obtenidos de plantas, virus de plantas, y bacterias que pueden expresar genes en celulas de plantas, como Agrobacterium o Rhizobium. Ejemplos de promotores bajo el control del desarrollo incluyen promotores que preferentemente inician la transcripcion en ciertos tejidos, tales como hojas, rafces, o semillas. Tales promotores se denominan en esta memoria como preferentes de un tipo de tejidos. Hay otros promotores que inician la transcripcion en un determinado tipo de tejidos, y se denominan como “tejido especfficos”. Un promotor “inducible” o “reprimible” es un promotor que se encuentra bajo el control del medio ambiente. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripcion son las condiciones anaerobicas, o la presencia de luz. Los promotores de tejido especffico, tejido preferido, especfficos de un tipo celular, o promotores inducibles son tipos constituyen la clase de promotores “no constitutivos”. Un promotor “constitutivo” es un promotor que esta activo en la mayorfa de las condiciones ambientales.

“Unidos de forma operativa” se refiere a una yuxtaposicion en la que los componentes asf descritos tienen una relacion que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control “unida de forma operativa” a una secuencia que se transcribe a la secuencia nucleotfdica de la presente divulgacion, esta ligada de tal manera que la expresion de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Una “secuencia codificadora” o “secuencia codificante” es una secuencia de polinucleotidos que se transcribe a mRNA y/o se traduce a un polipeptido cuando esta bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los lfmites de la secuencia codificante se determinan mediante un codon de inicio de traduccion en el extremo 5' y un codon de

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finalizacion de la traduccion en el extremo 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a mRNA, cDNA, y secuencias de polinucleotidos recombinantes.

Los terminos “polinucleotido” y “acido nucleico” se usan aquf de manera intercambiable, refiriendose a formas polimericas de nucleotidos de cualquier longitud, tanto ribonucleotidos (ARN o RNA) como desoxiribonucleotidos (ADN o DNA).

Los terminos “secuencia aminoacfdica”, “peptido”, “oligopeptido”, “polipeptido” y “protefna” se usan aquf de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimerica de aminoacidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, qufmica o bioqufmicamente modificados.

La presente divulgacion se refiere al uso de los polinucleotidos, o las construcciones geneticas aquf descritas, en la produccion de celulas y plantas transgenicas que presentan una arquitectura vegetal modificada.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del primer polinucleotido, o del segundo polinucleotido, o de la primera construccion genetica, o de la secuencia aminoacfdica aislada que comprende la sEq ID NO: 2, de la presente invencion, para modificar la arquitectura de una planta, reduciendo el numero de ramificaciones respecto a la planta control.

En esta memoria se entiende como “arquitectura vegetal” la suma de las propiedades estructurales observables de un organismo (vegetal), por ejemplo, la tendencia de las plantas a crecer vertical o arbustivamente, junto con las propiedades funcionales constituyen el fenotipo de dicho organismo, que es el resultado de la interaccion entre el genotipo y el medio ambiente.

Por “planta” en esta memoria, se entienden todos los organismos que pueden ser clasificados dentro del reino Viridiplantae, que incluye las algas verdes y a las plantas terrestres (Embryophyta).

Los organismos del genero Solanum pertenecen al Superreino Eukaryota, Reino Viridiplantae, Phylum Streptophyta, Subclase Asteridae, Orden Solanales, Familia Solanaceae. Solanum tuberosum es el nombre cientffico de la patata, y Solanum lycopersicum el de la tomatera.

En otro aspecto de la presente invencion, se refiere a una planta, de aquf en adelante la primera planta de la invencion, que comprende la primera construccion genetica de la invencion que comprende el primer polinucleotido de la invencion.

En una realizacion preferida de la presente invencion, la planta puede ser clasificada taxonomicamente por pertenecer a la especie Solanum lycopersicum.

La presente divulgacion tambien se refiere a una planta, de aquf en adelante la segunda planta de la divulgacion, la cual puede ser clasificada taxonomicamente por pertenecer a la especie Solanum lycopersicum que tiene una arquitectura de planta modificada mostrando un numero reducido de ramificaciones con respecto a la planta control, donde el numero reducido de ramificaciones se debe a mutaciones no transgenicas en el polinucleotido de acuerdo con el primer polinucleotido de la presente invencion.

En otro aspecto de la presente invencion, se refiere a una semilla, una celula vegetal, una parte de la planta o un grano de polen, que pueden ser clasificados taxonomicamente por pertenecer a la especie Solanum lycopersicum, que comprende la primera construccion genetica de la presente invencion.

En otro aspecto de la invencion se proporciona un metodo para modificar la arquitectura vegetal de una planta, reduciendo el numero de ramificaciones con respecto a una planta control, donde el metodo comprende:

a) transfectar el primer polinucleotido de la invencion o la primera construccion genetica de la invencion en una celula o cultivo de celulas vegetales hospedantes, y

b) crecer la celula o el cultivo de celulas vegetales hospedantes en un medio adecuado, hasta regenerar una planta completa.

En una realizacion preferida de este aspecto de la presente invencion, la celula transfectada puede ser clasificada taxonomicamente por pertenecer a la especie Solanum lycopersicum.

Un “hospedador”, “celula hospedadora” o “celula hospedante” como se emplea en esta memoria se refiere a un organismo, celula o tejido, particularmente a una celula vegetal, que sirve como diana o recipiente de los elementos transfectados (por ejemplo, el primer polinucleotido o la primera construccion genetica de la invencion). Una celula hospedadora u hospedador puede indicar, tambien, una celula u hospedador que expresa una protefna recombinante de interes (por ejemplo, el producto de la expresion del primer polinucleotido de la invencion) donde la celula hospedadora se transforma con un vector de expresion conteniendo los polinucleotidos o tambien los promotores de la presente divulgacion que dirigen la expresion de un gen de interes.

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Se entiende por “transfectar” o “transgenesis” en esta memoria al proceso de transferir ADN no propio a un organismo, que pasa de esta manera a denominarse “transgenico”.

El termino “transgenico” se usa en el contexto de la presente divulgacion para describir plantas en las que se ha incorporado de forma estable una secuencia de ADN no propio, y en concreto los polinucleotidos o las construcciones geneticas de la divulgacion.

La descripcion divulga que la celula, el cultivo de celulas vegetales y/o la planta pueden clasificarse taxonomicamente en la especie Solanum tuberosum L.

En una realizacion preferida de la presente invencion, la celula, el cultivo de celulas vegetales y/o la planta pueden clasificarse taxonomicamente en la especie Solanum lycopersicum.

El metodo para modificar la arquitectura vegetal de una planta proporcionado por la invencion comprende cualquier proceso de transformacion de plantas en el que los elementos alogenos introducidos comprenden el primer polinucleotido de la invencion o la primera construccion genetica de la invencion.

La presente divulgacion tambien se refiere a un metodo para expresar un gen de interes en los meristemos axilares de una planta que comprende:

a) transfectar los polinucleotidos o las construcciones geneticas divulgadas en la presente divulgacion en una celula o cultivo de celulas vegetales hospedantes,

b) crecer la celula o el cultivo de celulas vegetales hospedantes en un medio adecuado, hasta regenerar una planta completa.

Adicionalmente, la presente divulgacion se refiere a la celula, el cultivo de celulas vegetales y/o la planta las cuales pueden clasificarse taxonomicamente en la especie Solanum tuberosum L. Ademas, la divulgacion tambien se refiere a la celula, el cultivo de celulas vegetales y/o la planta pueden clasificarse taxonomicamente en la especie Solanum lycopersicum.

El metodo para expresar un gen de interes en los meristemos axilares de una planta proporcionado por la presente divulgacion comprende cualquier proceso de transformacion de plantas en el que los elementos alogenos introducidos comprenden los polinucleotidos o las construcciones geneticas divulgadas aquf.

Los polinucleotidos y algunas de las construcciones geneticas de la presente divulgacion se expresan de forma regulada temporal y espacialmente (por ejemplo, en determinados estadfos del desarrollo y en ciertos tejidos, yemas axilares) y a niveles controlados. Adicionalmente, la presente divulgacion tambien se refiere a alterar.

La presente divulgacion tambien comprende agentes moduladores de la expresion de las protefnas codificadas por los polinucleotidos de la presente divulgacion, y/o de los genes constitutivos que codifican para estas protefnas en la tomatera y la patata (SlBRC1L1, SlBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2). Con el desarrollo de la tecnologfa antisentido, secuencias de nucleotidos especfficamente complementarios a una determinada secuencia de ADN o ARN, podrfan formar complejos y bloquear la transcripcion o traduccion. Ademas, con el progreso del silenciamiento genico post- transcripcional, y en particular del ARN de interferencia (RNA interferente o RNAi), se han desarrollado herramientas que permiten la inhibicion especffica de la expresion de un gen. La inhibicion de la expresion de los genes SlBRC1L1, SlBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2 constituirfa por ende la inhibicion de su actividad biologica, permitiendo la modulacion de dicha actividad en la planta.

En el contexto de la presente divulgacion, SlBRC1L1 se define por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la protefna SlBRC1L1, y que comprenderfa diversas variantes procedentes de:

a) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacfdica de la SEQ ID NO: 1, o la secuencia aminoacfdica de la SEQ ID NO: 50,

b) moleculas de acido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotfdica de a),

c) moleculas de acido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneracion del codigo

genetico,

d) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacfdica con una identidad de al menos un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 o con la SEQ ID NO: 50, en las que el polipeptido codificado por dichos acidos nucleicos posee la actividad y las caracterfsticas estructurales de la protefna SlBRC1L1.

Una secuencia nucleotfdica capaz de traducirse a la SEQ ID NO: 1 podrfa ser, pero sin limitarse a, la secuencia que se recoge en la SEQ ID NO: 7.

En el contexto de la presente divulgacion, SlBRC1L2 se define por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido,

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que constituye la secuencia codificante de la protefna SIBRC1L2, y que comprenderfa diversas variantes procedentes de:

a) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacfdica de la SEQ ID NO: 2,

b) moleculas de acido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotfdica de a),

c) moleculas de acido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneracion del codigo

genetico,

d) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacfdica con una identidad de al menos un 95%, un 98% o un 99% con la sEq ID NO: 2, en las que el polipeptido codificado por dichos acidos nucleicos posee la actividad y las caracterfsticas estructurales de la protefna SlBRC1L2.

Una secuencia nucleotfdica capaz de traducirse a la SEQ ID NO: 2 podrfa ser, pero sin limitarse a, la secuencia que se recoge en la SEQ ID NO: 8.

En el contexto de la presente divulgacion, StBRC1L1 se define por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la protefna StBRC1L1, y que comprenderfa diversas variantes procedentes de:

a) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacfdica de la SEQ ID NO: 3,

b) moleculas de acido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotfdica de a),

c) moleculas de acido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneracion del codigo

genetico,

d) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacfdica con una identidad de al menos un 95%, un 98% o un 99% con la sEq ID NO: 3, en las que el polipeptido codificado por dichos acidos nucleicos posee la actividad y las caracterfsticas estructurales de la protefna StBRC1L1.

Una secuencia nucleotfdica capaz de traducirse a la SEQ ID NO: 3 podrfa ser, pero sin limitarse a, la secuencia que se recoge en la SEQ ID NO: 9.

En el contexto de la presente divulgacion, StBRC1L2 se define por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la protefna StBRC1L2, y que comprenderfa diversas variantes procedentes de:

a) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacfdica de la SEQ ID NO: 4,

b) moleculas de acido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotfdica de a),

c) moleculas de acido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneracion del codigo

genetico,

d) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacfdica con una identidad de al menos un 95%, un 98% o un 99% con la sEq ID NO: 4, en las que el polipeptido codificado por dichos acidos nucleicos posee la actividad y las caracterfsticas estructurales de la protefna StBRC1L2.

Una secuencia nucleotfdica capaz de traducirse a la SEQ ID NO: 4 podrfa ser, pero sin limitarse a, la secuencia que se recoge en la SEQ ID NO: 10.

Ademas, debido a la existencia de diferentes alelos, la secuencia aminoacfdica a la que se traduce el gen StBRC1L2 puede variar, recogiendose en una secuencia alternativa en la SEQ ID NO: 51. Una secuencia nucleotfdica capaz de traducirse a la SEQ ID NO: 51 podrfa ser, pero sin limitarse a, la secuencia que se recoge en la SEQ ID NO: 52.

Por “polinucleotidos antisentido” se entienden cadenas de ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos que pueden inhibir la actividad de estos genes por uno de estos dos mecanismos:

1- Interfiriendo la transcripcion, al hibridar con el gen estructural o en una region reguladora o promotora del gen que codifica para estos factores de transcripcion (SIBRC1L1, SIBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2). Puesto que la transcripcion o expresion es bloqueada de manera efectiva por la hibridacion del oligonucleotido antisentido con el ADN, disminuye la produccion de estos factores de transcripcion.

2- La union del oligonucleotido antisentido en el citoplasma con el mRNA, interfiriendo con la formacion del complejo de traduccion propiamente dicho, inhibiendo la traduccion del mRNA a protefna.

El silenciamiento genico post-transcripcional, y en particular del ARN de interferencia tambien da lugar a una menor produccion de estos factores de transcripcion. El ARN interferente o ARN de interferencia (ARNi, interfering RNA o iRNA), es una molecula de ARN que provoca la degradacion del ARN de genes especfficos. En esta memoria, dentro del ARN de interferencia se incluye tanto el siRNA (small interfering RNA o ARNipJ, como el tsRNA (“transsplicing RNA”), VIGS (“ Virus induced gene silencing”) y el miRNA o microARN. Los siRNA son hebras de ARN doble banda perfectamente complementarias de aproximadamente 20-21 nucleotidos (nt) con 2 nucleotidos libres en cada extremo 3'. Cada hebra de ARN tiene un grupo fosfato 5' y un grupo hidroxilo (-OH) 3'. Esta estructura proviene del

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procesamiento llevado a cabo por Dicer, una enzima que corta hebras largas de ARN doble banda (dsRNA, double strand RNA) en siRNAs. Una de las hebras del siRNA (la antisentido) se ensambla en un complejo proteico denominado RISC (RNA-induced silencing complex), que utiliza la hebra de siRNA como gufa para identificar el ARN mensajero complementario. El complejo RISC cataliza el corte del ARNm complementario en dos mitades, que son degradadas por la maquinaria celular, bloqueando asf la expresion del gen. Los miRNAs son pequenos ARN interferentes que se generan a partir de precursores especfficos codificados en el genoma, que al transcribirse se pliegan en horquillas (hairpins) intramoleculares que contienen segmentos de complementariedad imperfecta. El procesamiento de los precursores ocurre generalmente en dos etapas, catalizado por dos enzimas, Drosha en el nucleo y Dicer en el citoplasma. Una de las hebras del miRNA (la antisentido), como ocurre con los siRNAs, se incorpora a un complejo similar al RISC. Dependiendo del grado de complementariedad del miRNA con el ARNm, los miRNAs pueden bien inhibir la traduccion del ARNm o bien inducir su degradacion. Sin embargo, a diferencia con la via de los siRNAs, la degradacion de ARNm mediada por miRNAs se inicia con la eliminacion enzimatica de la cola de poly-A del ARNm.

Por tanto, podrfa ser cualquier siRNA o miRNA capaz de hibridar una molecula de acido nucleico que codifique estos factores de transcripcion (SlBRC1L1, SlBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2), o una construccion de ArN que al menos contenga una cualquiera de las secuencias de nucleotidos posibles de siRNA o miRNA capaces de inhibir la traduccion de las protefnas ortologas de BRC1 de la divulgacion, y sin perjuicio de que adicionalmente formen parte de la presente divulgacion cualquiera de las secuencias y construcciones de RNA de la divulgacion anteriormente descritas que sean objeto de modificaciones, preferentemente qufmicas, que conduzcan a una mayor estabilidad frente a la accion de ribonucleasas y con ello a una mayor eficiencia. Sin que dichas modificaciones supongan la alteracion de su mecanismo de accion, que es la union especffica al complejo RISC (RNA-induced silencing complex), activandolo y manifestando una actividad helicasa que separa las dos hebras dejando solo la hebra antisentido asociada al complejo.

Adicionalmente resulta evidente para un experto en la materia que una gran cantidad de polinucleotidos de mRNA pueden traducirse a las protefnas SlBRC1L1, SlBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2 como consecuencia, por ejemplo, de que el codigo genetico es degenerado. Cualquier siRNA o miRNA capaz de inhibir la traduccion de estos mRNA tambien forman parte de la divulgacion.

Los autores de la presente invencion han desarrollado cuatro secuencias de RNA interferente, dos de ellas dirigidas a reducir los niveles del mRNA de los genes SlBRC1L1 y SlBRC1L2 de la tomatera (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente) y dos de ellas dirigidas a reducir los niveles de mRNA de los genes StBRC1L1 y StBRC1L2 de la patata (SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 respectivamente). Por tanto, la presente divulgacion tambien se refiere a una secuencia que se selecciona de la lista que comprende la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID O: 13 o SEQ ID NO: 14.

Las secuencias de RNA interferente de la divulgacion aquf servirfan para modificar la arquitectura vegetal de las plantas, y en concreto de la tomatera y de la patata. Tal y como se demuestra en los ejemplos de la presente divulgacion, la inhibicion del gen SlBRC1L1 de la tomatera no produce una modificacion aparente (respecto de la elongacion de las ramas aereas) de la arquitectura de la planta (o de su fenotipo). Esto es indicativo de que, aunque ambos genes controlan la ramificacion, cada uno presenta un cierto grado de especializacion y divergencia funcional de forma que en tomatera, SlBRC1L2 podrfa tener un papel mas importante que SlBRC1L1 en el control de la elongacion de ramas. Por otro lado, en patata, StBRC1L1 controlarfa preferentemente la ramificacion de los estolones y StBRC1L2 la elongacion de ramas aereas.

Tambien forman parte de la presente divulgacion una construccion genetica de ADN, la cual dirigirfa la transcripcion in vitro o intracelular de la secuencia siRNA, miRNA, o construccion de ARN de la presente divulgacion, y que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de nucleotidos de aDn, preferentemente de doble cadena, que comprende, al menos, la secuencia del siRNA o miRNA de la divulgacion o de la construccion de ARN de la presente divulgacion para su transcripcion, o, b) secuencia de nucleotidos de ADN, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresion genica que comprende la secuencia que se transcribe a la secuencia de ARN de la presente divulgacion operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripcion de dicha secuencia de nucleotidos de interes, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripcion y su regulacion adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, senales de inicio y terminacion, sitios de corte, senal de poliadenilacion, origen de replicacion, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc...Dicha construccion genetica podrfa ser usada en la modificacion de la arquitectura de las plantas. Muchas de estas construcciones, sistemas o vectores de expresion pueden ser obtenidos por metodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Sambrook et al. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Ejemplos de estas construcciones serfan, pero sin limitarse, los plasmidos de DNA binario utilizados para la generacion de las lfneas 35SCaMV:: SlBRC1L1 RNAi, 35SCaMV:: SlBRC1L2 RNAi, 35SCaMV:: StBRC1L1 RNAi y 35SCaMV:: StBRC1L2 RNAi, y que se recogen en la Fig. 7 de esta memoria.

La preparacion de otras secuencias de siRNA o miRNA o de las construcciones de RNA de la presente divulgacion

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serfan evidentes para un experto en la materia, y se podrfa llevar a cabo por sfntesis qufmica, lo cual permite ademas la incorporacion de modificaciones qufmicas tanto en los distintos nucleotidos del producto como la incorporacion de otros compuestos qufmicos en cualquiera de los extremos. Por otro lado, la sfntesis tambien podrfa realizarse enzimaticamente utilizando cualquiera de las RNA polimerasas disponibles. La sfntesis enzimatica tambien permite alguna modificacion qufmica de los productos o RNAs inhibidores.

El diseno de las secuencias de nucleotidos del siRNA o miRNA que se divulgan aquf tambien serfa evidente para un experto en la materia. Asf, para el siRNA se podrfa realizar mediante un diseno aleatorio en el que se seleccionen 19-25 bases del mRNA diana sin tener en cuenta la secuencia o la informacion posicional que tiene en el transcrito. Otra alternativa no limitativa divulgada en la presente divulgacion serfa el diseno convencional mediante parametros simples desarrollados por los pioneros de la tecnica (Calipel et al., 2003. J Biol Chem. 278(43): 42409-42418) completados con un analisis BLAST de nucleotidos. Otra posibilidad podrfa ser un diseno racional, en el que se emplee un procedimiento informatico dirigido a identificar las dianas optimas de siRNA en un mRNA. Las secuencias diana se analizan en grupos de 19 nucleotidos a la vez y se identifican las que tienen mejores caracterfsticas en funcion de un algoritmo que incorpora un gran numero de parametros termodinamicos y de secuencia.

Los anticuerpos capaces de unirse a las protefnas SlBRC1L1, SlBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2 pueden ser empleados para inhibir la actividad de dichas protefnas, modulando por tanto dicha actividad. Por tanto, la presente divulgacion describe quel el agente modulador se selecciona de entre anticuerpos, fragmentos de los mismos, o cualquiera de sus combinaciones. Los anticuerpos pueden ser policlonales (incluyen tfpicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epftopos distintos) o monoclonales (dirigidos contra un unico determinante en el antfgeno). El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioqufmicamente, por manipulacion genetica, o puede ser sintetico, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento de las protefnas SlBRC1L1, SlBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2 y estando sustituidas por otras que comunican al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. El anticuerpo puede ser tambien recombinante, quimerico, sintetico o una combinacion de cualquiera de los anteriores.

El termino “anticuerpo” tal como se emplea en esta memoria, se refiere a moleculas de inmunoglobulinas y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulinas, es decir, moleculas que contienen un sitio de fijacion de antfgeno que se une especfficamente (inmunorreacciona) con las protefnas SIBRC1L1, SIBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2. Ejemplos de porciones de moleculas de inmunoglobulinas inmunologicamente activas, incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina. Puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal.

Un “anticuerpo o polipeptido recombinante” (rAC) es uno que ha sido producido en una celula hospedadora que ha sido transformada o transfectada con el acido nucleico codificante del polipeptido, o produce el polipeptido como resultado de la recombinacion homologa.

Estos rAC se pueden expresar y dirigir hacia subcompartimentos celulares especfficos cuando se les incorpora las secuencias apropiadas para el trafico intracelular. Estos anticuerpos se denominan intrabodies, y han demostrado su eficacia no solo para desviar protefnas de su compartimento habitual o bloquear interacciones entre protefnas implicadas en vfas de senalizacion, sino tambien para activar protefnas intracelulares.

Forman tambien parte de la divulgacion las construcciones geneticas de DNA capaces de transcribirse a un peptido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para su uso en la modificacion de la arquitectura vegetal. Dicha construccion genetica de DNA dirigirfa la transcripcion in vitro o intracelular de la secuencia del anticuerpo o fragmento del mismo, y comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de nucleotidos de DNA, preferentemente de doble cadena, que comprende, al menos, la secuencia codificante del anticuerpo de la presente divulgacion o del fragmento de anticuerpo de la presente divulgacion para su transcripcion in vitro, o intracelular, b) secuencia de nucleotidos de DNA, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresion genica que comprende la secuencia codificante de la secuencia de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente divulgacion operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripcion de dicha secuencia de nucleotidos de interes, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripcion y su regulacion adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, senales de inicio y terminacion, sitios de corte, senal de poliadenilacion, origen de replicacion, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc. para su uso en la modificacion de la arquitectura de las plantas.

Las ribozimas tambien podrfan utilizarse como agentes moduladores de la actividad de las protefnas SlBRC1L1, SlBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2. Un “ribozima” tal y como se entiende en la presente divulgacion, se refiere a un polinucleotido catalftico (tfpicamente RNA), que puede construirse para reconocer especfficamente, por hibridacion, un mRNA y fragmentarlo o eliminar su expresion. Las ribozimas pueden introducirse en la celula como moleculas de RNA catalfticas o como construcciones geneticas que se expresan a moleculas catalfticas de RNA.

Forman tambien parte de la invencion las composiciones que comprenden los oligonucleotidos antisentido (siRNA, miRNA o la construccion de ARN), los anticuerpos, o las construcciones geneticas moduladoras de la expresion de

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los genes SIBRC1L1, SIBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2 de la presente divulgacion. Las composiciones de la presente divulgacion permiten la transfeccion del siRNA, miRNA o la construccion de ARN de la presente divulgacion al interior de una celula, in vivo o in vitro. La transfeccion se podrfa llevar a cabo, pero sin limitarnos a, transfeccion directa o vectores que faciliten el acceso del siRNA, miRNA o la construccion de ARN al interior de la celula. Asf, ejemplos de estos vectores son, sin limitarse a, virus, plasmidos binarios de DNA no virales, y conjugados moleculares. Asf, por ejemplo, los siRNA de la presente divulgacion, asf como ARN o ADN precursores de estos siRNA, miRNA o construcciones de ARN pueden conjugarse con peptidos de liberacion u otros compuestos para favorecer el transporte de estos RNA al interior de la celula.

Otro aspecto se refiere a una semilla, de ahora en adelante semilla de la invencion, cuyo material genetico integra los polinucleotidos aislados de la presente divulgacion (incluyendo tambien los agentes moduladores, como por ejemplo, pero sin limitarnos, los recogidos en las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14) o las construcciones geneticas de la divulgacion. En una invencion preferida, la semilla comprende la primera

construccion genetica de la presente invencion. En una realizacion preferida, la semilla de la invencion puede

clasificarse taxonomicamente como pertenecientes a la especie Solanum tuberosum L. La presente divulgacion se refiere a la semilla de la presente divulgacion la cual puede clasificarse taxonomicamente como pertenecientes a la especie Solanum lycopersicum.

Adicionalmente, la presente divulgacion se refiere a una celula vegetal, cuyo material genetico integra los polinucleotidos aislados o las construcciones geneticas de la presente divulgacion. Preferiblemente, las celulas vegetales de la presente divulgacionpueden clasificarse taxonomicamente como pertenecientes a la especie Solanum tuberosum L. La presente divulgacion tambien afirma que, puede clasificarse taxonomicamente como perteneciente a la especie Solanum lycopersicum.

En otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un cultivo de celulas vegetales, , cuyo material genetico integra los polinucleotidos aislados o las construcciones geneticas de la presente divulgacion. Preferiblemente, las celulas vegetales del cultivo de la presente divulgacion pueden clasificarse taxonomicamente como pertenecientes a la

especie Solanum tuberosum L.particularmente, pueden clasificarse taxonomicamente como pertenecientes a la

especie Solanum lycopersicum.

El termino “cultivo de celulas” en esta memoria, hace referencia a un cultivo de celulas aisladas del mismo o diferente tipo de tejido, o una coleccion de tales celulas organizadas en partes de una planta o en tejidos (cultivos tisulares). Tipos de cultivos de este tipo son, por ejemplo, cultivos de protoplastos, callos (grupos de celulas vegetales indiferenciadas capaces de regenerar una planta completa) y celulas vegetales que estan aisladas de plantas o partes de las plantas, tales como embriones, protoplastos, celulas meristematicas, polen, hojas o anteras.

La presente divulgacion tambien se refiere a un grupo de celulas, que pueden clasificarse taxonomicamente como pertenecientes a la especie Solanum tuberosum L cuyo material genetico integra los polinucleotidos aisladoso las construcciones geneticas de la presente divulgacion, y que forman los tuberculos, los minituberculos o los microtuberculos.

Se conocen como “minituberculos”, o “papa semilla” a pequenos tuberculos de no mas de 3 cm de diametro utilizados para realizar las grandes plantaciones comerciales del cultivo de papa. En su defecto se usan tuberculos medianos o trozos de ellos que lleven al menos un ojo (esto es, una yema).

Otro aspecto de la presente divulgacion, se refiere a una planta que comprende las celulas o el cultivo de celulas vegetales de la presente divulgacion, y/o que se ha obtenido tras el crecimiento de la semilla de la presente divulgacion. Dicha planta integrarfa en su material genetico los polinucleotidos, y/o las construcciones geneticas de la presente divulgacion. Preferiblemente, las celulas vegetales del cultivo de la divulgacion pueden clasificarse taxonomicamente como pertenecientes a la especie Solanum tuberosum L. Ademas, las celulas vegetales del cultivo de la divulgacion,, pueden clasificarse taxonomicamente como pertenecientes a la especie Solanum lycopersicum.

Modificaciones en los genes SlBRC1L1, SlBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2, permitirfa, por tanto, modificar la arquitectura vegetal de una planta. Puesto que en esta divulgacion se recoge la secuencia de estos genes, asf como las respectivas protefnas a las que se traducen, la obtencion de plantas cuya arquitectura vegetal se encuentre modificada, se podrfa hacer por varios metodos.

Por seleccion de mutantes espontaneos: se debe tener en cuenta que en cada division celular hay una pequena probabilidad de que ocurra un cambio genetico, por lo cual no es sorprendente que en una gran masa celular la poblacion sea heterogenea. Esta distribucion puede presentar problemas de rendimiento debido a que en general las variantes tienen menores niveles de produccion que la poblacion parental. Estos cambios definitivos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones fenotfpicas que dependen de las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las celulas de la poblacion que expresan la misma modificacion fisiologica, dentro de las variaciones permitidas por su genotipo. En las mutaciones espontaneas, si el elemento responsable de la mutacion no es conocido, es muy diffcil diferenciar estas variaciones fenotfpicas de aquellas que presentan modificaciones en

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los genes responsables de la arquitectura vegetal y que son estables y hereditarias. La presente divulgacion proporciona las herramientas necesarias para lleva a cabo una seleccion de aquellos mutantes no solo mediante la observacion de las caracterfsticas morfologicas de interes, sino tambien mediante la deteccion de mutaciones en los genes responsables de dichas mutaciones (SIBRC1L1, SIBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2), disenando un procedimiento simple de cribado selectivo para un tipo particular de mutantes. Por ejemplo, se podrfan seleccionar morfologicamente aquellas plantas, preferiblemente la tomatera o la patata, que presenten una arquitectura vegetal ventajosa, y comprobar posteriormente si los genes SIBRC1L1, SIBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2 presentan mutaciones respecto a un genotipo silvestre control.

Por tanto, otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a una planta de tomate, un fruto, semilla, celulas, grupo de celulas o partes de la planta, que presentan una arquitectura vegetal modificada con respecto a las plantas tipo control de tomate, donde la modificacion de la arquitectura vegetal se debe a mutaciones no transgenicas en los genes SIBRC1L1 y SIBRC1L2 de tomate.

La presente divulgacion tambien se refiere a una planta de patata, un fruto, semilla, celulas, grupo de celulas o partes de la planta, que presentan una arquitectura vegetal modificada con respecto a las plantas tipo control de patata, donde la modificacion de la arquitectura vegetal se debe a mutaciones no transgenicas en los genes StBRC1L1 y StBRC1L2 de patata.

El termino “genotipo”, tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la constitucion hereditaria o genetica de un individuo; todo el material genetico contenido en una celula, al que, por lo general, se denomina material nuclear.

El termino “fenotipo”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la suma total de las propiedades estructurales y funcionales observables de un organismo producto de la interaccion entre el genotipo y el medio ambiente.

El termino “tipo” hace referencia a la planta designada como el tipo de un genero, subgenero, especie, variedad u otra categorfa taxonomica, siendo el “tipo” bajo el punto de vista taxonomico, el elemento simple de un taxon al cual se le asigna permanentemente el nombre y sobre el que estan basadas las caracterfsticas descriptivas que satisfacen las condiciones de disponibilidad o de publicacion validas. En esta memoria tambien describe una planta control de tomatera o patata con la que se comparan otras plantas de la misma categorfa taxonomica para observar si presenta su arquitectura vegetal modificada, para posteriormente analizar si los genes SIBRC1L1 y SIBRC1L2 (en la tomatera) y StBRC1L1 y StBRC1L2 (en la patata) presentan mutaciones respecto a los genes de la planta control. De esta manera, se pueden distinguir las modificaciones en la arquitectura vegetal que se deben a factores fisiologicos, ambientales, o de otro tipo, frente a las provocadas por mutaciones en los genes SIBRC1L1 y SIBRC1L2 (en la tomatera) y StBRC1L1 y StBRC1L2.

El procedimiento de mutacion inducida implica dos etapas, el tratamiento de la poblacion con el mutageno elegido y luego el aislamiento de los mutantes para su posterior ensayo y seleccion. Inducir mutaciones en una planta es una herramienta muy valiosa para el mejoramiento de plantas, especialmente cuando se desea mejorar uno o dos caracteres facilmente identificables en una especie o variedad bien adaptada. Ademas, tiene a ventaja de que la variabilidad causada por las mutaciones inducidas no es esencialmente diferente de la causada por las mutaciones espontaneas durante la evolucion. La eleccion de un agente mutagenico depende en general de consideraciones practicas. En algunos de los casos es mas conveniente el empleo de mas de uno en lugar del uso masivo de uno solo. Hasta donde sea posible el aislamiento del mutante deberfa utilizar la caracterfstica mejorada del mismo (la arquitectura vegetal de interes) como factor de seleccion. Los agentes mutagenicos pueden ser agrupados en ffsicos (luz ultravioleta, rayos X, radiacion gamma, radiacion beta, neutrones rapidos, haces de iones pesados, ...) y qufmicos. La mayorfa de los mutagenos qufmicos pertenecen al grupo de los agentes alquilantes (metanosulfonato de etilo (EMS), sulfato de dietilo (dES),...) pero existen otros grupos, como los analogos de bases (como el 5- bromuracilo y la 2-aminopurina) y mutagenos estructurales (como la proflavina o naranja acridina).

Los mutagenos crean, principalmente, mutaciones puntuales y pequenas delecciones, inserciones, transversiones y/o transiciones (de alrededor de 1 a 5 nucleotidos). Por ejemplo, pero sin limitarnos a, podrfan ser mutagenos como el metilmetano sulfonato (MMS), Nitrosoguanidina (NTG), N-etil-N-nitrosurea (ENU), trietilmelamina (TEM), N-metil- N-nitrosourea (MNU), procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, dietil sulfato, monomero de acrilamida, melfalan, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina (MNNG), nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno (DMBA), oxido de etileno, hexametilfosforamida, bisulfan, diepoxialcanos (diepoxioctano (DEO), diepoxibutano(BEB), 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)aminopropilamino] acridina dihidroclorida (ICR- 170), formaldehfdo, etc.

Asf, por ejemplo, las semillas son sometidas a la accion de mutagenos qufmicos, que da lugar a una serie de mutaciones en el genoma de dichas semillas. Se crecen dichas semillas dando lugar a plantas adultas (M1), que se autopolinizan, dando lugar a una generacion M2. El DNA de las plantas M2 se somete a un cribado para ver si presenta mutaciones en el gen de interes. Una vez se identifica la mutacion en el gen de interes, las semillas de las plantas M2 portando dicha mutacion se crecen, dando lugar a plantas M3, que se someten a un cribado para ver si manifiestan las caracterfsticas fenotfpicas asociadas con el gen de interes.

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Un experto en la materia entiende que una variedad de material vegetal puede ser sometido al proceso de mutagenesis, incluyendo, pero sin limitarnos, semillas, polen, celulas o tejidos de la planta. El tipo de material vegetal que se somete a mutagenesis modifica la etapa en la el DNA de las plantas es sometido al cribado para encontrar la mutacion. Asf, por ejemplo, cuando se somete a mutagenesis el polen antes de la polinizacion de una planta no mutagenica, las semillas resultantes dan lugar a plantas M1. Cada celula de dichas plantas M1 puede contener las mutaciones inducidas en el polen, por lo que no hay que esperar a la generacion M2 para realizar el cribado. Este procedimiento es conocido en el estado de la tecnica como tilling.

Asf, la presente divulgacion se refiere a un metodo para obtener plantas de tomatera con arquitectura vegetal modificada, en comparacion con la planta silvestre control, que comprende:

a) obtener material vegetal de una planta (parental) de tomatera,

b) someter a un proceso de mutagenesis el material vegetal del paso (a),

c) cultivar el material vegetal mutado hasta regenerar una planta completa, y su descendencia,

d) analizar la descendencia de las plantas del paso (c) para detectar al menos una mutacion en al menos una copia los genes ortologos de BRC1 (genes SIBRC1L1 y SIBRC1L2),

e) seleccionar los descendientes con al menos una mutacion en al menos una copia de los genes SIBRC1L1 y SIBRC1L2 que presenten su arquitectura vegetal modificada en comparacion con una planta tipo control,

f) opcionalmente, cultivar la planta seleccionada para obtener descendencia que presente dicha modificacion de la arquitectura vegetal.

La presente divulgacion tambien se refiere a que la mutacion se produce en al menos una copia del gen SIBRC1L2. Particularmente, la induccion de la mutacion del paso (b) se realiza mediante mutagenos qufmicos.

Otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a un metodo para obtener plantas de patata con arquitectura vegetal modificada, en comparacion con la planta silvestre control, que comprende:

a) obtener material vegetal de una planta (parental) de patata,

b) someter a un proceso de mutagenesis el material vegetal del paso (a),

c) cultivar el material vegetal mutado hasta regenerar una planta completa, y su descendencia,

d) analizar la descendencia de las plantas del paso (c) para detectar al menos una mutacion en al menos una copia los genes ortologos de BRC1 (genes StBRC1L1 y StBRC1L2),

e) seleccionar los descendientes con al menos una mutacion en al menos una copia de los genes StBRC1L1 y StBRC1L2 que presenten su arquitectura vegetal modificada en comparacion con una planta tipo control,

f) opcionalmente, cultivar la planta seleccionada para obtener descendencia que presente dicha modificacion de la arquitectura vegetal.

La presente divulgacion tambien se refiere a que la induccion de la mutacion del paso (b) se realiza mediante mutagenos qufmicos.

En otro aspecto de la presente divulgacion, se refiere a un metodo para obtener la planta de la presente invencion, preferiblemente la planta la cual puede ser clasificada taxonomicamente por pertenecer a la especie SoIanum Iycopersicum que tiene una arquitectura de planta modificada mostrando un numero reducido de ramificaciones con respecto a la planta control, en la que el numero reducido de ramificaciones es debido a mutaciones no transgenicas en el primer polinucleotido de la presente invencion, donde el metodo comprende:

a. obtener material vegetal de una planta (parental) la cual puede ser clasificada taxonomicamente por

pertenecer a la especie SoIanum Iycopersicum,

b. someter al material vegetal de la etapa (a) a un proceso de mutagenesis,

c. cultivar el material vegetal mutado hasta regenerar una planta completa, y sus descendientes,

d. analizar los descendientes de las plantas de la etapa (c) para detectar al menos una mutacion en al menos

una copia del primer polinucleotido de la presente invencion,

e. seleccionar los descendientes con al menos una mutacion en al menos una copia del primer polinucleotido

de la presente invencion, el cual tiene su arquitectura de planta modificada mostrando un numero reducido de ramificaciones en comparacion con la planta control,

f. opcionalmente, cultivar la planta seleccionada para obtener descendientes los cuales tienen modificada la

arquitectura de la planta mostrando un numero reducido de ramificaciones.

A lo largo de la divulgacion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterfsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterfsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

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Fig. 1. Fenotipo de lineas transgenicas de tomate con actividad reducida de los genes SIBRC1L1 y SIBRC1L2. Aspecto general de planta control variedad Moneymaker (A) y lfnea 35SCaMV::SlBRC1L1 RNAi (B). Detalle de yema axilar de planta control (C) y de planta 35SCaMV:: SlBRC1L2 RNAi (D). E. Aspecto general de plantas de lineas 35SCaMV:: SlBRC1L2 RNAi.

Fig. 2. Cuantificacion del fenotipo de ramificacion de plantas de tomatera control, lineas 35SCaMV:: SlBRC1L1 RNAi (A) y 35SCaMV:: SlBRC1L2 RNAi (B).

Fig. 3. Expresion diferencial de los genes StBR1L1 y StBR1L2 en yemas aereas y estolones, cuantificada mediante RT-PCR semicuantitativa.

Fig. 4. Fenotipo de lineas transgenicas de patata con actividad reducida de StBRC1L1. A. Aspecto general de planta control variedad Desiree (izquierda) y planta 35SCaMV:: StBRC1L1 RNAi (derecha). B. Fenotipo de ramificacion aerea de plantas control y lineas 35SCaMV:: StBRC1L1 RNAi. En abscisas se representa el numero de ramas. C. Fenotipo de ramificacion subterranea (estolones) de plantas control y lineas 35SCaMV:: StBRC1L1 RNAi. En abscisas se representa el numero de estolones.

Fig. 5. Fenotipo de estolones de lineas 35SCaMV::RNAi StBRC1L1. A. Las plantas transgenicas (RNAi) producen un mayor numero de estolones que las plantas control (wt). B. Las plantas transgenicas producen estolones ramificados a diferencia de las plantas control

Fig. 6. Rendimiento de las lineas transgenicas con actividad reducida de StBRC1L1. A. Produccion total de tuberculos de individuos control (arriba) e individuos de lineas independientes 35SCaMV:: StBRC1L1 RNAi (abajo, paneles numerados). B. Cuantificacion de la produccion de tuberculos. C. Cuantificacion del peso total de tuberculos.

Fig. 7. Mapas de los plasmidos binarios utilizados para la generacion de las lineas 35SCaMV:: SlBRC1L1 RNAi y 35SCaMV:: SlBRC1L2 RNAi (izquierda) y 35SCaMV:: StBRC1L1 RNAi y 35SCaMV:: StBRC1L2 RNAi (derecha). En ella se indican los fragmentos de secuencia sentido (caja A) y antisentido (caja B) que se clonan separadas por el intron de la piruvato deshidrogenasa kinasa (PDKintron), constituyendo la estructura de RNAi. Delante del fragmento sentido A se encuentra el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35Spromoter) y como terminador de la transcripcion se utiliza el terminador de la octopina sintetasa (OCSter). Tambien se indican los extremos del T-DNA, LB (extremo izquierdo) y RB (extremo derecho) y la posicion del gen de de la neomicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a kanamicina (NPTII KanR).

EJEMPLOS

A continuacion, se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de las modificaciones en la expresion de los genes SIBRC1L1, SIBRC1L2, StBRC1L1 y StBRC1L2 en la alteracion de la arquitectura de las plantas de la tomatera y de la patata.

EJEMPLO 1: Clonaje de las secuencias genomicas, promotoras y codificantes de los genes SIBRC1L1 y SIBRC1L2.

Para clonar los ortologos a BRC1 de tomatera se realizo una busqueda de genes TCP tipo BRC1 en diferentes bases de datos de solanaceas: TIGR Solanaceae Genomics Resource BLAST page, TIGR Plant Transcript Assemblies Database y SOL Genomics Network. Para llevar a cabo la comparacion se utilizo la secuencia de aminoacidos de la caja TCP de la protefna BRC1 de Arabidopsis, y se encontro una EST (Expressed Sequence Tags) y un cDNA cuya traduccion daban lugar a protefnas con alta homologfa con BRC1 de arabidopsis. El EST EST522935 tenia 447 bp y el cDNA parcial AY168167, 415 bp. Las secuencias nucleotfdicas de los genes SlBRC1L1 y SlBRC1L2 se recogen en la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente.

Para amplificar los cDNAs completos (SEQ ID NO: 15 para SlBRC1L1 y SEQ ID NO: 16 para SlBRC1L2) de ambos genes, se siguieron dos estrategias diferentes. En el caso del SlBRC1L1, se disenaron dos cebadores anidados (Le1, SEQ ID NO:17 y Le2, SEQ ID NO:18) en la region 5' del gen, y se amplifico por PCR el cDNA completo con oligo dT a partir de cDNA de yemas axilares de tomatera. En el caso del gen SlBRC1L2, la secuencia disponible no inclufa ni el extremo 5' ni el 3', por lo que se procedio al clonaje de ambos extremos mediante el kit SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (Clontech). Mediante el uso de este kit, se incorporaron adaptadores sinteticos en los extremos 5' y 3' durante la sfntesis del cDNA realizada a partir de RNA total de yemas axilares de tomatera. Para la amplificacion de ambos extremos utilizando la secuencia de los adaptadores sinteticos, se disenaron dos pares de cebadores anidados en la secuencia disponible del gen SlBRC1L2: LeTCP2-F1 (SEQ ID NO: 19) y LeTCP2-F1 nested (SEQ ID NO: 20) para el extremo 3' y LeTCP2-R1 (SEQ ID NO: 21) y LeTCP2-R1 nested (SEQ ID NO: 22) para el extremo 5'. Una vez obtenida la secuencia de ambos fragmentos solapantes 5' y 3' se disenaron cebadores (LeTCP2 cDNA-F, SEQ ID NO: 23) y LeTCP2 cDNA-R, SEQ ID NO: 24) para amplificar el gen completo.

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En el caso del gen SIBRC1L1, se amplificaron dos tipos de cDNA, uno con una fase abierta de lectura larga (1041 pb) y uno con una fase abierta de lectura corta (978 pb) por un procesaminento de intrones diferente, mientras que en el caso de SIBRC1L2 solo se amplifico un tipo de cDNA con una fase de lectura abierta de 1014 pb. Los fragmentos de PCR correspondientes a los tres cDNAs se clonaron en el vector pGEMT-easy™ (Promega).

Una vez conocida la secuencia completa de ambos genes, se amplificaron los fragmentos correspondientes a su secuencia genomica (SEQ ID NO: 7 para SIBRC1L1 y SEQ ID NO: 8 para SIBRC1L2), utilizando cebadores que incluyeran las zonas 5' y 3' correspondientes a cada gen: Le1 (SEQ ID NO: 17) y Le3 (SEQ ID NO: 25) para amplificar la secuencia genomica de SIBRC1L1, y SIBRC1L2 cDNA-F (SEQ ID NO: 23) y LeTcP2 cDNA-R (SEQ ID NO: 24) para amplificar la de SIBRC1L2. En el caso de SIBRC1L1, al comparar la secuencia genomica con la correspondiente a la zona codificante, se observo la existencia de dos intrones, que se eliminaban en el cDNA corto, pero uno de los cuales se mantiene en el cDNA largo. En el caso del gen SIBRC1L2, la comparacion de la secuencia genomica con la codificante mostro la existencia de un intron.

El aislamiento de las zonas promotoras de ambos genes (SEQ ID NO: 5 para SlBRC1L1 y SEQ ID NO: 6 para SlBRC1L2) se realizo utilizando una librerfa Genome Walker™ (Clontech) de tomate. Mediante esta estrategia, se crearon, a partir de DNA genomico, distintas librerfas Genome Walker™ mediante digestion con diferentes enzimas que produzcan extremos romos (DraI, EcoRV, PvuII y SspI) y posterior ligacion de adaptadores sinteticos en los extremos producidos por la digestion. A partir de cebadores anidados disenados a unos 100bp del atg de ambos genes (GSP1-TCP1, GSP2-TCP1 - SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27 respectivamente - para SlBRC1L1 y GSP1- TCP2, GSP2-TCP2 - SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 29 respectivamente - para SlBRC1 L2) y de los disponibles para los adaptadores, se amplificaron por PCR dos fragmentos de 1,7kb y 0,7kb de tamano, correspondientes a las zonas promotoras de los genes SlBRC1L1 y SlBRC1L2 respectivamente. Ambos fragmentos fueron clonados en el vector pGEMT-easy™.

EJEMPLO 2: Generacion de plantas transgenicas de tomate (Solanum Lycopersicum variedad Moneymaker) con perdida de funcion de los genes SlBRC1L1 y SlBRC1L2 silenciados por la tecnica de RNAi.

Los fragmentos de DNA elegidos para realizar la interferencia de RNA estan situados entre la caja TCP y la caja R, zonas altamente conservadas y caracterfsticas de los genes TCP. Dicho fragmento anilla exclusivamente con la parte de secuencia elegida lo que asegura que el silenciamiento sea especffico cada gen por separado, SIBRC1L1 y SIBRC1L2.

El fragmento utilizado para silenciar el gen SIBRC1L1 tiene 225 pares de bases, y la secuencia se recoge en la SEQ ID NO: 11

El fragmento utilizado para silenciar el gen SIBRC1L2 tiene 415 pares de bases, y la secuencia se recoge en la SEQ ID NO: 12.

Estrategia utilizada para la generacion de las construcciones RNAi para los genes SIBRC1L1 y SIBRC1L2.

Para la obtencion de la estructura en horquilla caracterfstica del RNAi, se clono el fragmento seleccionado en el plasmido pHannibal (CSIRO), que porta la resistencia a ampicilina. Dicho clonaje es dirigido, de forma que el fragmento entra en direccion 5'-3' clonandolo con las dianas BamH I y CIa I, y en 3'-5' al otro lado del intron PDK (742 pb), utilizando las dianas Xho I y Kpn I. Para ello, los fragmentos seleccionados se amplificaron usando cebadores que contenfan en el extremo 5' las secuencias diana para las distintas enzimas de restriccion a utilizar (el cebador para el extremo 5'de SIBRC1L1 se recoge en la secuencia SEQ ID NO: 30, para el extremo 3'de SIBRC1L1 en la secuencia SEQ ID NO: 31, para el extremo 5'de SIBRC1L2 en la secuencia sEq ID NO: 32 y para el extremo 3'de SIBRC1L2 en la secuencia SEQ ID NO: 33).

Una vez obtenidos los plasmidos recombinantes con la estructura en horquilla del RNAi, y comprobados por secuenciacion, se extrajo el casette con el transgen (3330 pb) del pHannibal cortando con Not I y se clono en el sitio para la misma enzima de restriccion del plasmido pBluescriptII SK+. De esta forma se consiguio dejar a un lado de la secuencia un sitio SacI y al otro lado un sitio SmaI, de manera que mediante una digestion con ambos enzimas de los fragmentos y del plasmido binario pBIN19 (Fig. 7), se subclonaron ambos fragmentos dando lugar a las construcciones que se han introducido en la planta de tomate (Figura 7). Se opto por la utlizacion de este plasmido binario ya que ha sido bien establecido que el plasmido pBIN19 transforma tomate eficazmente, confiriendo resistencia a kanamicina en bacteria y en planta. La expresion del transgen esta dirigida por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) (1346 pb) promoviendo su expresion constitutiva, mientras que en el extremo 3' del gen se encuentra la octopina sintasa (terminador OCS) (766 pb) de Agrobacterium que actua como terminador de la transcripcion. Una vez obtenidas las construcciones en Escherichia coli, se realizo una preparacion de los plasmidos que se utilizaron para transformar Agrobacterium tumefaciens LBA4404. De las colonias portadoras de nuestros plasmidos, se selecciono una unica colonia que se utilizo para la transformacion de las plantas de tomatera.

Transformacion de plantas de tomatera.

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Para transformar de forma estable plantas de tomatera, se empleo el protocolo de Ellul et al. (2003) Theor Appl Genet. 106(2): 231-8.). Siguiendo este protocolo, se transformaron cotiledones de tomate procedentes de plantas crecidas en condiciones in vitro en medio Murashige y Skoog con vitaminas (Physiol. Plant. 15:473-497,1962) suplementado con un 2% de sacarosa. Una vez desarrolladas las primeras hojas verdaderas, los cotiledones fueron cortados transversalmente en una o dos porciones (explantes), dependiendo del tamano, y se colocaron durante dos dfas en oscuridad con el enves en contacto con el medio de precultivo (MPC), que incluye las hormonas AIA y kinetina, a una concentracion final de 4mg/l. Pasadas 48 horas, se infectaron los explantos sumergiendolos durante 8 minutos en el cultivo de Agrobacterium. Despues de eliminar el exceso de Agrobactetrium, los explantes se colocaron en el medio de cocultivo (MCC), que lleva la misma composicion de hormonas que el anterior, anadiendo acetosiringona. Los explantes se incubaron con la bacteria durante 48 horas en oscuridad.

Concluido el periodo de cocultivo, los explantes se limpiaron en medio de lavado (ML) mas el antibiotico claforan (500mg/l) para eliminar el Agrobacterium, y se secaron sobre papel de filtro esteril para pasarlos a medio de recuperacion (MR) sin presion selectiva (AIA/Kinetina/Claforan). En este medio se cultivaron a la luz durante dos dfas, despues de lo cual se transfirieron al primer medio selectivo (MS) al que se le anadio otra hormona mas, la zeatina (1mg/l) y el antibiotico de seleccion del transgen kanamicina (50mg/l). Los explantes se cultivaron en este medio selectivo hasta el primer cambio a medio fresco (con la misma composicion) a las tres semanas. A partir de estos explantes se desarrollaron callos que pasaron por cuatro subcultivos de tres semanas antes de empezar a desarrollar los primeros apices.

Una vez bien desarrollados los apices, se cortaron de los callos y se transfirieron a medio de enraizamiento (ME), que incluye AIA en baja concentracion (0,1 mg/l) para favorecer el desarrollo de rafces. Una vez que estuvieron bien desarrolladas, se transfirieron las plantas de tomate a una mezcla de turba y vermiculita 3:1, manteniendo las plantas en condiciones de alta humedad durante al menos una semana para evitar su marchitamiento.

MEDIO DE PRECULTIVO (MPC)

MS basal salt mixture con 0,8% agar

Sacarosa 30g/l

Myo-inositol 100mg/l

Vitaminas SH 10ml/l

IAA 4mg/l

Kinetina 4mg/l

MEDIO DE COCULTIVO (MCC)

MS basal salt mixture con 0,8% agar

Sacarosa 30g/l

Myo-inositol 100mg/l

Vitaminas SH 10ml/l

IAA 4mg/l

Kinetina 4mg/l

Acetosiringona (39,2g/l)

MEDIO DE LAVADO (ML)

MS basal salt mixture Sacarosa 20g/l Myo-inositol 100mg/l Claforan 500 mg/l

MEDIO DE RECUPERACION (MR)

MS basal salt mixture con 0,8% agar

Sacarosa 30g/l

Myo-inositol 100mg/l

Vitaminas SH 10ml/l

IAA 4mg/l

Kinetina 4mg/l

Claforan 300 mg/l

MEDIO DE SELECCION (MS)

MS basal salt mixture con 0,8% agar

Sacarosa 30g/l

Myo-inositol 100mg/l

Vitaminas SH 10ml/l

IAA 4mg/l

Kinetina 4mg/l

Zeatina 1mg/l

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Kanamicina 50mg/l Claforan 300mg/l

MEDIO DE ENRAIZAMIENTO (ME)

MS basal salt mixture con 0,8% agar Sacarosa 30g/l Myo-inositol 100mg/l Tiamina HCl 1mg/l IAA 0,1mg/l

Caracterizacion de las ifneas RNAi 35S::SlBRC1L1 y 35S::SlBRC2L2.

Se generaron 10 lfneas transgenicas independientes de tomatera de la variedad Moneymaker portadoras de la construccion 35S::SlBRC1L1 RNAi y otras 10 portadoras de la construccion 35S::SlBRC1L2 RNAi que fueron analizadas fenotfpicamente. Los individuos de T1 indicaron que, mientras que los individuos 35S::SlBRC1L1 RNAi tenfan una fuerte dominancia apical (no tenfan ramas), bajo las mismas condiciones, los individuos 35S::SlBRC1L2 RNAi tenfan un claro exceso de ramas laterales en comparacion con las plantas silvestres (Figuras 1 y 2). Estos resultados muestran que el gen SIBRC1L2 tiene una mayor importancia que SIBRC1L1 en el control del crecimiento de las ramas laterales en la tomatera.

EJEMPLO 3: Clonaje de las secuencias genomicas, promotoras y codificantes de los genes StBRC1L1 y StBRC1L2.

Para clonar los ortologos a BRC1 de patata se realizo una busqueda de genes TCP tipo BRC1 en diferentes bases de datos de solanaceas: TIGR Solanaceae Genomics Resource BLAST page, TIGR Plant Transcript Assemblies Database y SOL Genomics Network. Para llevar a cabo la comparacion se utilizo la secuencia de aminoacidos de la caja TCP del gen BRC1 de Arabidopsis. Se encontraron dos unigenes: TC168465 y TC129597 que se denominaron StBRC1L1 y StBRC1L2, respectivamente. Ademas, conociendo la alta homologfa existente entre tomate y patata, y teniendo clonado el gen SlBRC1L1 de tomate, se probaron los mismos cebadores con ADN genomico de patata, para el extremo 5' Le1 (SEQ ID NO:17) y Le2 (SEQ ID NO:18), siendo este ultimo un cebador anidado del anterior, y Le3 (SEQ ID NO:25) para el extremo 3'. En base a esta secuencia se diseno un cebador especffico (racest1-5', SEQ ID NO: 34) para localizar el extremo 5' del gen usando la tecnica PCR-RACE con cDNa de yemas axilares y estolones de patata. En base a la secuencia obtenida se diseno un cebador en el extremo 5': StTCP1-ORF1 (SEQ ID NO: 35). Para amplificar la secuencia de cDNA se uso cDNA sintetizado a partir del mismo ARN que para el extremo 5', pero utilizando el cebador B26 (SEQ ID NO: 36) que incluye en su secuencia una cola de poliT a continuacion de la secuencia del cebador B25 (SEQ ID NO: 37), lo que permite usarlo como cebador del extremo 3'.

El gen StBRC1L1 se amplifico de ADN usando los cebadores genomico-StTCP1 A (SEQ ID NO: 38) y genomico- StTCP1 B (SEQ ID NO: 39).

StBRC1L2 fue amplificado primero parcialmente a partir de mismo cDNA utilizado para el gen StBRC1L1. Se uso el cebador B25 para el extremo 3', y, para el extremo 5' se usaron los cebadores StTCP2A (SEQ ID NO: 40) y StTCP2B (SEQ ID NO: 41) (anidado del anterior) que habfan sido disenados en funcion de la secuencia del EST TC129597. A partir de la secuencia obtenida se localizo el extremo 5' usando PCR-RACE y los cebadores especfficos St2-Seq 1 (SEQ ID NO: 42) y el anidado de este St2-Seq 2 (SEQ ID NO: 43).

Para la amplificacion del cDNA completo se usaron los cebadores StTCP2-5' (SEQ ID NO: 44) y B25. La secuencia del cDNA mostro una serie de polimorfismos que consideramos como dos alelos dando lugar al alelo 1 y al alelo 2, asf como a sus respectivas protefnas. Para la secuencia genomica se usaron los cebadores StTCP2-5' y StTCP2-3' (SEQ ID NO: 45).

Todos los fragmentos de PCR amplificados correspondientes tanto a partes como a la totalidad de las secuencias de los genes se clonaron en el vector pGEMT-easy™ (Promega).

EJEMPLO 4 DE REFERENCIA: Generacion de plantas transgenicas de patata (Solanum tuberosum variedad Desiree) con perdida de funcion de los genes StBRC1L1 y StBRC1L2 silenciados por la tecnica de RNAi.

El fragmento elegido para la interferencia de StBRC1L1 esta situado entre la caja TCP y la caja R, zonas altamente conservadas y caracterfsticas de los genes TCP. Dicho fragmento no anilla mas que con esa parte de secuencia elegida lo que asegura un silenciamiento especffico del gen StBRC1L1. El fragmento tiene 185 pares de bases, y la secuencia se recoge en la SEQ ID NO: 13.

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El fragmento elegido para la interferencia de StBRC1L2 tambien esta situado entre la caja TCP y la caja R Dicho fragmento solo hibrida con la parte de secuencia elegida, lo que asegura el silenciamiento especffico del gen StBRC1L2. El fragmento tiene 168 pares de bases, se recoge en la SEQ ID NO: 14.

Estrategia utilizada para la generation de las construcciones RNAi para los genes StBRC1L1 y StBRC1L2.

Para la obtencion de la estructura en horquilla caracterfstica del RNAi, se clono el fragmento seleccionado en el plasmido pHannibal (CSIRO), que porta la resistencia a ampicilina. Dicho clonaje es dirigido, de forma que el fragmento entra en direccion 5'-3' clonandolo con las dianas BamH I y Cla I, y en 3'-5' al otro lado del intron PDK (742 pb), utilizando las dianas Xho I y Kpn I. Para ello, los fragmentos seleccionados se amplificaron usando cebadores que contenfan en el extremo 5' las secuencias diana para las distintas enzimas de restriccion a utilizar.

Para StBRC1L1

Cebador del extremo 5': (SEQ ID NO: 46)

Cebador del extremo 3': (SEQ ID NO: 47)

Para StBRC1L2

Cebador del extremo 5': (SEQ ID NO: 48)

Cebador del extremo 3': (SEQ ID NO: 49)

Una vez obtenido el plasmido recombinante con la estructura en horquilla del RNAi, y comprobada por secuenciacion, se extrajo el transgen (3330 pb) del pHannibal cortando con Not I y se clono en el sitio para la misma enzima de restriccion del plasmido binario pART27 (Gleave, 1992 Plant Mol Biol. 1992 Dec;20(6):1203-7) (Figura 7), que confiere resistencia a estreptomicina y espectinomicina en bacteria y a kanamicina en planta. El sitio NotI del pART27 se localiza entre los bordes derecho e izquierdo del plasmido, lo que garantiza su transferencia a la celula vegetal al transformarla. El transgen esta flanqueado por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) (1346 pb) para una expresion constitutiva y el extremo 3' del gen de la octopina sintasa (terminador OCS) (766 pb) de Agrobacterium que actua como terminador de la transcripcion.

Una vez obtenida la construccion en Escherichia coli, se hizo una preparacion del plasmido que se utilizo para transformar Agrobacterium tumefaciens AGL0. De las colonias que portaban nuestro plasmido, fue seleccionada una que se utilizo para la transformacion de las plantas de patata.

Transformation de plantas de patata.

Se transformaron hojas de patata de plantas crecidas en condiciones in vitro en medio Murashige y Skoog con vitaminas (Physiol. Plant. 15:473-497,1962) suplementado con un 2% de sacarosa (MS2). Las plantas deben tener entre 3 y 4 semanas contadas desde el momento en que el apice de la planta se repica en medio fresco.

Las hojas son retiradas de la planta y con un bisturf se elimina la parte del pecfolo y se les hace uno o dos cortes en la vena central, sin que lleguen a los bordes de la hoja. Diez de estas hojas se colocan con el haz hacia abajo, en una placa de 9 cm de diametro que contiene 10 ml de medio MS2.

La placa es inoculada con 80 pl del cultivo de Agrobacterium. Dicho cultivo se inicia a una densidad optica (DO) a 600 nm de 0.2 en medio YEB con los antibioticos adecuados. Cuando llega a una DO600 nm de 0.8 se lava por centrifugacion y se resuspende en el mismo volumen de medio YEB sin antibioticos, que es el que se utiliza para la inoculacion.

Las placas se incuban durante 2 dfas en oscuridad, pero en las mismas condiciones de temperatura y humedad en la que van a crecer posteriormente. Despues se pasan a medio de induccion de callos (MIC) manteniendo la posicion de las hojas con el enves hacia abajo. Despues de 7-8 dfas se pasan al medio de induccion de ramas (MIR). En este medio permaneceran hasta la aparicion de callos y su desarrollo en hojas. El medio se refresca cada 8-10 dfas.

Cuando las ramas tienen entre 0,5 y 1 cm se transfieren al medio de enraizamiento que consiste en medio MS con 1,6% de glucosa, sin ninguna hormona, pero con kanamicina 50 mg/L y claforan 250 mg/L para evitar el crecimiento de Agrobacterium.

Despues de enraizar y cuando las plantas han crecido, se corta el apice y se transfiere a medio MS2 con kanamicina y claforan en las mismas concentraciones indicadas mas arriba.

Para crecer las plantas en invernadero, plantas que llevan en medio MS2 entre 1 o 2 semanas son transferidas a recipientes con una capacidad de 50 ml de sustrato. Las rafces se tapan con el sustrato, y la planta al completo se

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cubre con plastico para mantener alta la humedad, condicion caracterfstica de crecimiento in vitro. Despues de 3-4 dfas dicha cubierta se retira.

Medio de induccion de callos (MIC) con 1,6% glucosa

NAA

BAP

Claforan 25

Kanamicina

Plant Agar Duchefa

250 mg/L

5 mg/L 0.1 mg/L

50 mg/L 5.5 g/L

Medio de induccion de ramas (MIR)

MS con 1.6% glucosa

Zeatinroboside 2 mg/l

NAA

GA3

Claforan 250 mg/l

Kanamicina

Plant Agar Duchefa

0.02 mg/l 0.02 mg/l

50 mg/l 5.5 g/l

Caracterizacion de las ifneas RNAi 35S::StBRC1L1 y 35S::StBRC2L2.

En patata existen varios tipos de yemas axilares: las yemas aereas que dan lugar a las ramas, y las yemas subterraneas que dan lugar a estolones, tallos subterraneos que tuberizan dando lugar a los tuberculos. Las yemas axilares de los estolones que quedan incluidas en tuberculos son los ojos de los tuberculos.

Los resultados muestran que, en patata, StBRC1L1 se expresa a niveles mas altos en las yemas de los estolones que en las yemas aereas, mientras que StBRC1L2 muestra un patron de expresion inverso (Fig. 3). Esto podrfa revelar la especializacion de cada ortologo de BRC1 en el control de diferentes tipos de yemas.

El fenotipo de la falta de funcion de StBRC1L1 apoya su papel en la supresion de la elongacion y ramificacion de los estolones. Se generaron siete lfneas transgenicas de 35S::RNAiStBRC1L1 de patata variedad Desiree, y se analizaron durante dos generaciones.

StBRC1L1 afecta tanto al desarrollo de las ramas aereas, como al de los estolones ya que las lfneas silenciadas tienen un mayor numero de ramas laterales, estolones aereos y estolones subterraneos (Fig. 4 y 5).

Los estolones subterraneos (que dan lugar a los tuberculos) estan ramificados, a diferencia de los estolones silvestres que muestran una fuerte dominancia apical (Fig. 5). El tiempo de tuberizacion no se ve afectado en estas lfneas. Dado que cada extremo del estolon normalmente da lugar a un tuberculo, el elevado numero de estolones ramificados, hace que cada planta genere un mayor numero de tuberculos que las plantas silvestres (Fig, 6A y 6B, 64-276,9% mas que los controles). En las condiciones experimentales en las que se crecieron las plantas (tiestos de 20 cm de diametro) se produce un incremento moderado del rendimiento (17-19%) del peso total de los tuberculos (Figura 6C). Es muy probable que en condiciones optimas el rendimiento sea mayor respecto de las plantas silvestres. Ademas las lfneas son bastante vigorosas y tienen la senescencia retrasada.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de Investigaciones Cientfficas (CSIC).

<120> Genes reguladores de la ramificacion de plantas, promotores, construcciones geneticas que los contienen y usos.

<130> ES1664.344

<150> PCT/ES2009/070538 <151> 2009-11-27

<160> 52

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1 <211> 346 <212> PRT

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<213> Solanum lycopersicum <400> 1

Met Tyr Pro Ser Ser Asn Tyr Ser Pro Asn Ile Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15

Phe Phe His Ile Asn Ile Pro Ser Pro Ser Met Gln Tyr Glu Pro Glu 20 25 30

Phe Ile Gln Tyr Phe His Asp Phe Gln Phe Ile Gln Pro Ser Tyr Asp 35 40 45

Gln Asn Thr Asn Ile Pro Ala Glu Glu Ala Ala Asp Ser Asp Lys Leu 50 55 60

Asp Lys Ile Glu Glu Asp Gln Ser Ile Ile Lys Ser Cys Asn Asn Asn 65 70 75 80

Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ile Arg Arg Lys 85 90 95

Asn Asn Lys Arg Thr Thr Ser Gly Ser Ala Gly Val Gly Pro Ser Lys 100 105 110

Lys Asp Arg His Ser Lys Ile Asn Thr Ala His Gly Pro Arg Asp Arg 115 120 125

Arg Met Arg Leu Ser Leu Glu Ile Ala Arg Lys Phe Phe Asn Leu Gln 130 135 140

Asp Leu Leu Gly Phe Asp Lys Ala Ser Lys Thr Val Glu Trp Leu Leu 145 150 155 160

Thr Lys Ser Lys Ser Ala Val Asn Asp Leu Val Gln Lys Ile Asn Lys 165 170 175

Asp Lys Cys Ser Gly Ser Glu Asn Pro Asn Ile Ala Thr Val Ser Ser 180 185 190

Pro Ser Ala Glu Ser Cys Glu Val Ile Asp Glu Ser Ala Ala Thr Asn 195 200 205

Thr Ala Glu Thr Gln Lys Gln Gln Lys Lys Lys Val Lys Ser Ile Arg 210 215 220

Arg Ala Ile Ile His Pro Val Val Ala Lys Glu Ser Arg Lys Glu Ala 225 230 235 240

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Arg Ala Arg Ala Arg Glu Arg Thr Ile Ile Lys Lys Ser Leu Asn Asp 245 250 255

Asn Thr Asn Asn Asn Asn Asn Gly Asp Gln Ser Met Ala Asp Glu Asp 260 265 270

Leu Thr Arg Ser Leu Arg Ser T rp Asn Thr Thr Phe Glu Asp His Gln 275 280 285

Ser Gly Ile Gln Gly Tyr Asn Asn Asn Asn Asn Met Asn Val Val Asp 290 295 300

Asn Phe Asn Leu Val Asp Thr Ser Asn T rp Ser Pro Phe Met Phe Asn 305 310 315 320

Tyr His Gln Ile Asn Thr Glu Ile Ser Gln Glu His Gln Phe Ala Asn 325 330 335

Phe Arg Tyr Ser Gly Lys Leu Trp Glu Ala 340 345

<210> 2 <211> 337 <212> PRT

<213> Solanum lycopersicum <400> 2

Met Gln Tyr Glu His Glu Leu Tyr Phe Gln Ser Phe Asn His Asp Asn 1 5 10 15

Gln Tyr Tyr Phe Gln Gln Gln Gln Leu Val Pro Ser Ile Asp Asp Leu 20 25 30

Ser Pro His Ile Leu Ala Asp Ser Cys Thr Glu Ile Ile Thr Lys Pro 35 40 45

Ser Asn Cys Asn His Glu Leu Gln Gly Met Glu Glu Gly Arg Gly Glu 50 55 60

Lys Lys Gly Asp Asp Asp Val Met Ser Ser Arg Ile Ser Gly Arg Ile 65 70 75 80

Ser Lys Asn Asn Lys Arg Ser Ser Asn Lys Asp Arg His Ser Lys Ile 85 90 95

Asn Thr Ala Arg Gly Pro Arg Asp Arg Arg Met Arg Leu Ser Leu Asp 100 105 110

Ala Ala Arg Lys Phe Phe Arg Leu Gln Asp Leu Leu Gly Phe Asp Lys

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Ala Ser Lys Thr Val Glu T rp Leu Leu Thr Gln Ser Asp Ser Ala Ile 130 135 140

Glu Glu Leu Val Ala Ala Lys Gly Asn Asp Ala Gln Val Ala Gln Gln 145 150 155 160

Thr Ser Cys Asn Thr Pro Thr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Ala Ile Cys 165 170 175

Ala Ser Asn Ser Ile Ser Glu Ser Cys Glu Val Ile Ser Gly Thr Asp 180 185 190

Glu Thr Ser Ser Asn Asp Lys Asn Lys Glu Thr Ala Gln Asp Glu Glu 195 200 205

Lys Lys Lys Arg Lys Lys Val Val Asn Thr Ala Arg Arg Ala Val Leu 210 215 220

Glu Pro Leu Thr Lys Glu Ser Arg Asn Gln Ala Arg Ala Arg Ala Arg 225 230 235 240

Glu Arg Thr Lys Ser Lys Lys Met Ser Gln Thr Gly Lys Ser Lys Ser 245 250 255

Leu Ala Asn Asp Leu Asn Pro Ser Gly Ser Arg Arg Pro Ala Asn Lys 260 265 270

Thr Cys Glu Glu Pro Gly Thr His Glu Glu Leu Asn Phe His Gln Glu 275 280 285

Lys Asn Thr Val Asp Asp Cys Asn Phe Met Val Asn Gly Asn T rp Asn 290 295 300

Pro Phe Thr Ile Phe Ser Tyr His Glu Gln Tyr Ala Gly Ile Ser Asn 305 310 315 320

Glu His Gln Leu Val Thr Asp Leu Gln Phe Cys Gly Lys Leu Trp Glu 325 330 335

Gly

<210> 3 <211> 353 <212> PRT

<213> Solanum tuberosum <400> 3

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Met Tyr Pro Ser Ser Pro Asn Ile Ser Ser Ser Ser Ser Phe Phe His 1 5 10 15

Ile Asn Ile Pro Ser Pro Ser Met Gln Tyr Glu Pro Glu Phe Ile Gln 20 25 30

Tyr Phe His Asp Phe Gln Phe Ile Gln Pro Ala Ala Tyr Asp Gln Asn 35 40 45

Asn Leu Asp Thr Asn Ile Thr Ala Glu Glu Ala Asp His Lys Met Glu 50 55 60

Glu Asp Glu Leu Ile Met Lys Ser Cys Lys Asn Lys Lys Asp Glu Ser 65 70 75 80

Thr Ser Thr Thr Thr Thr Ile Arg Arg Lys Asn Asn Lys Arg Thr Thr 85 90 95

Ser Gly Thr Gly Val Gly Pro Ser Lys Lys Asp Arg His Ser Lys Ile 100 105 110

Asn Thr Ala His Gly Pro Arg Asp Arg Arg Met Arg Leu Ser Leu Glu 115 120 125

Ile Ala Arg Lys Phe Phe Asn Leu Gln Asp Leu Leu Gly Phe Asp Lys 130 135 140

Ala Ser Lys Thr Val Glu Trp Leu Leu Thr Lys Ser Lys Ser Ala Val 145 150 155 160

Asn Asp Leu Val Gln Lys Ile Asn Lys Gly Lys Cys Ser Ala Ser Thr 165 170 175

Asn Pro Asn Ile Gly Val Val Ser Ser Pro Ser Glu Ser Cys Glu Val 180 185 190

Ile Ser Gly Val Ile Asp Glu Ser Ala Ala Thr Asn Asn Thr His Lys 195 200 205

Gln Gln Lys Lys Lys Lys Ser Ile Arg Arg Ala Ile Phe His Pro Val 210 215 220

Val Ala Lys Glu Ser Arg Lys Glu Ala Arg Ala Arg Ala Arg Glu Arg 225 230 235 240

Thr Lys Ile Lys Lys Ser Leu Asn Asn Asn Asn Gly Asp Gln Ser Met 245 250 255

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Ala Pro Asp Glu Asp Leu Thr Arg Ser Leu Gly Ser T rp Ser Thr Thr 260 265 270

Phe Glu Asp His Gln Ser Gly Ile Gln Ala Tyr Asn Asn Thr Asn Asn 275 280 285

Ile Met Asn Ala Val Asp Asn Phe Asn Leu Val Asp Thr Ser Asn Trp 290 295 300

Ser Pro Phe Met Phe Asn Tyr His Gln Ile Asn Thr Glu Ile Ser Gln 305 310 315 320

Glu Val Cys Ile Asn Leu Ile Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile 325 330 335

Arg Ser Pro Ile Tyr Leu Phe Leu Phe Leu Phe Phe Cys Cys Ser Ile 340 345 350

Asn

<210> 4 <211> 364 <212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> misc_feature <222> (28)..(28)

<223> Xaa puede ser cualquier amino acido que ocurre de forma natural <400> 4

Met Tyr Pro Pro Ser Asn Asn Asn Cys Asn Tyr Ser Pro Ile Leu Ser 1 5 10 15

Ser Phe Ile Cys Gln Asn Ile Pro Ser Ser Pro Xaa Met Gln Tyr Glu 20 25 30

His Glu Leu Tyr Phe Gln Asn Phe Asn His Asp Asp Gln Tyr Tyr Phe 35 40 45

Gln Leu Gln Gln Gln Val Pro Leu Ile Asp Asp Leu Ser Pro His Val 50 55 60

Leu Ala Asp Ser Cys Thr Glu Thr Val Thr Lys Pro Ser Asn Cys Asn 65 70 75 80

His Val Leu Glu Gly Met Glu Glu Gly Arg Gly Gly Asn Lys Gly Asp 85 90 95

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Asp Val Val Met Ser Ser Arg Ile Ser Ile Ile Ser Gly Arg Ile Ser 100 105 110

Lys Asn Asn Lys Arg Ser Ser Asn Lys Asp Arg His Ser Lys Ile Asn 115 120 125

Thr Ala Arg Gly Pro Arg Asp Arg Arg Met Arg Leu Ser Leu Asp Ala 130 135 140

Ala Arg Lys Phe Phe Arg Leu Gln Asp Leu Leu Gly Phe Asp Lys Ala 145 150 155 160

Ser Lys Thr Val Glu Trp Leu Leu Thr Gln Ser Asp Ser Ala Ile Glu 165 170 175

Glu Leu Val Ala Val Lys Gly Asn Asp Ala Gln Val Pro Gln Gln Thr 180 185 190

Ser Cys Asn Thr Pro Thr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Ala Ile Cys Ala 195 200 205

Ser Asn Ser Ile Ser Glu Ser Cys Glu Val Ile Ser Gly Thr Asp Glu 210 215 220

Thr Ser Ser Asn Asp Lys Asn Lys Glu Thr Thr Ala Lys Asp Glu Lys 225 230 235 240

Glu Lys Lys Lys Lys Pro Val Asn Thr Ala Arg Arg Pro Ala Phe Glu 245 250 255

Pro Leu Thr Lys Glu Ser Arg Asn Gln Ala Arg Ala Arg Ala Arg Glu 260 265 270

Arg Thr Lys Thr Lys Lys Met Ser Gln Val Gly Lys Ser Lys Ser Pro 275 280 285

Ala His Asp Leu Asn Pro Ser Gly Ser Arg Arg Pro Ala Asn Arg Thr 290 295 300

Cys Glu Glu Pro Gly Thr His Glu Gln His Thr Phe His His Val Asp 305 310 315 320

Asp Ser Ser Phe Val Val Asn Gly Asn Trp Asn Pro Phe Thr Ile Phe 325 330 335

Thr Ser His Glu Gln Tyr Ala Gly Ile Ser Asn Glu His Gln Leu Val 340 345 350

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Thr Asp Leu Gln Phe Tyr Gly Lys Leu Trp Glu Ser 355 360

<210> 5 <211> 1723 <212> PRT

<213> Solanum lycopersicum <400> 5

agtctgaacc cctttcacct caactgtggg aagcaggaag aattcaccaa aactttaata 60 acatattcag taaaaatttt tataatgcgt ctaagaaaag taaaatgtac gtagaattta 120 tcctgcctcg taaaaataaa gattgtatct aaaaaaaacc tcgactcaaa taatacatat 180 taacaaaatt acaaattaac tatcactcaa ccccaatatt tacttcaagt tgttagggat 240 cacttaaggg cctttctttt tctccttttt tttttttttt ttggagaaga tgaaggtgaa 300 agagatggtg gatgatggag ctaggaaaga ggagattgaa gggtattttt tttgtcaaag 360 tatgtgtcag ttgctatcac gtgaacttga aactaagggg caccattaga gaagacttta 420 gctataatat acattcattt ctataaaaaa aaatcacmac ataaacatgc ccttttttaa 480 cttagcttta atatatcttt taaatttgat tatgcagaaa tagatattta aatttatata 540 aaatttaaaa agtctatcta acaatgttgt gtcctacata tattatatct ggtatgatat 600 atatgtgtta cttgtttaat tttatataaa tttaaatatt tatttatgca aattcaaaat 660 taagagatat aaatatcaag ctaaatcgaa gttcaatgaa atatatatat ataattatgc 720 caatataaaa tcagtgtaac tatacaacaa gtactatagt gtcccctcca ctcttttttt 780 ctcaaattcc ctttcatact ttaaactccc acatgagcta gctagagaag tctttttttt 840 ttttaaagat tcgkggtgtt tacatcaatt taaacatatt ttgactaatt tcatagaata 900 tttatcatct cttattaata acatgtgtca tattcataaa tgaatagaaa ttactaaata 960 cagtagtact ycttttaatt tttttctaat aaaatttaaa cgtgaaacct catgattcct 1020 aattatccac ttcagtaacc atcgactcac accaaccctt tggtgcaagc gaagccttct 1080 ttatctttat agcagatagg ggtcctttga aaagatggaa gtacaattac acctctcttt 1140 gtccctttgc aggtaataac ataacatgac ttttctttat cttcatcttt ctttctttgt 1200 caacaagaac atacaccacc atgaatgtct ctcccattag ctaatatatt ccagctaact 1260 agcttaaata tatagtgcta atacytgcac gaacacaaaa atagccacta atatacacct 1320 atacctagct attattatta ttatcataat taagcacwca ccaagcaaca tacatgtaaa 1380 gccacatatt tttaatcacc tgtctttctc aaccaaaaag ctatattatc atcattatat 1440 tgaaaaaaaa attaaaaata accacatatc ctttcccact ttctctatgt gctatctttg 1500 tattcaaaat ttatatatcc aagagaatta tgaagagtct ctctcaaaaa aagttttaat 1560 taatttataa ccttttcttt tttcctactt tttgttgatg cagctaggta gctagattat 1620

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<210> 6 <211> 665 <212> DNA

<213> Solanum lycopersicum <400> 6

tcacatgaag gggcacgata acaagttgtt cgtatccatc cattcacttc caacaatacc 60 gctacgtacc actacctgct tccttcctat ccccagtctt tgtcaaactt cctttccctt 120 tccaattact ttttctttaa tagagatgtt tgtttccttt tcccttcccc ccatattctt 180 cccttttttt tttatctctc tttcacaata gtagcaccat gcctgtagct ttgatgctta 240 gacgggcgca cgcgcacgcg cactcacaca actagaatag aatcactctc tctatatatt 300 catagttatc aaaactactt atcatatacc aaaaaaaacc actgtcattc tcaagcaaat 360 aatatttttt ttaaaaaaga agaactacat atatatatat agtactacta ctattttcat 420 catcactttg gtcaatccat acagttctaa gtagtcattg cttcctctgt caaattactg 480 tatacagtac attgaactag ctaggggaaa attaatctac taactctaat ttgtttgttt 540 aattctcttc ttattgcagc tagatttgcc taattagcag aaaaaccaaa agctgtgttc 600 atactgtctt tctcaagatc tagacccacc atatagaccg cctcaactac agctactcca 660 caaga 665

<210> 7 <211> 1133 <212> DNA

<213> Solanum lycopersicum <400> 7

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<210> 8 <211> 1124 <212> DNA

<213> Solanum lycopersicum <400> 8

atgcaatatg aacacgaact atactttcaa agctttaatc atgataacca atattatttt 60 caacaacagc aactagttcc ctcgatagat gatttgagtc ctcacatctt agctgacagc 120 tgcaccgaga ttattactaa gccttcgaat tgcaaccacg aactacaagg aatggaagaa 180 ggccgaggcg aaaagaaagg agatgatgat gttatgagta gcagaattag tggacggatc 240 tcaaaaaata ataagagatc ttccaataaa gatcgacaca gcaagatcaa caccgctcgt 300 ggtccaagag atcgaaggat gagactttca cttgatgctg ctcgcaagtt tttccgtttg 360 caggacttat tgggattcga taaggccagc aaaactgttg aatggttgct tactcaatcg 420 gattctgcaa ttgaagagct tgttgccgct aaaggcaatg atgcacaggt tgctcagcaa 480 actagctgca atacccccac tactactact ggaattggtg caatttgtgc atctaattct 540 atttctgagt cgtgtgaagt tatatcagga actgatgaaa cttcctctaa tgacaaaaac 600 aaggaaaccg ctcaagatga ggagaagaag aaaaggaaga aggtggttaa cacagctcgt 660 agagctgtgt tagaacctct tacgaaggaa tcgaggaatc aagcaagagc cagggctaga 720 gagagaacaa aatcaaagaa aatgagccaa actggaaaat ccaaatccct agctaatgat 780 ttgaaccctt caggatctcg gaggccggct aataaaactt gtgaagaacc tggaacacat 840 gaagaactca acttccatca agagaagaac actgtcgatg actgtaattt tatggtaaat 900 ggaaattgga atccatttac aatctttagc tatcatgagc aatacgctgg aatttccaac 960 gaggtgaggg tttcagactt tgttttttag ggcttcaata attgaaccca catattcttc 1020 tcatcttctg attattattt tttttaaaaa aaaaaattct tgtttctctg cagcatcaat 1080 tggttacaga cttgcaattt tgtggaaagc tatgggaagg ctag 1124

<210> 9 <211> 1059 <212> DNA

<213> Solanum tuberosum

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 9

atgtaccctt cgagccccaa tatttccagc tcttcatctt tctttcacat taatattcca 60 tctccttcta tgcaatatga accggaattc atccaatatt tccatgactt tcaattcatc 120 caacctgctg cttacgatca gaataatttg gataccaata ttacggcaga agaagctgat 180 cataagatgg aagaagatga attgatcatg aaaagctgca agaacaagaa ggatgagagt 240 actagtacca ctactactat tcgtaggaaa aacaacaaga gaactacgag tggtactggt 300 gtaggacctt cgaagaaaga tagacacagc aaaataaaca cggcacatgg cccaagagac 360 cgaagaatga gactttcact tgaaattgct agaaaattct tcaatttgca agacttgctt 420 gggttcgata aggctagcaa aactgtagaa tggctactca caaagtcaaa atcagctgta 480 aacgatctcg ttcagaaaat taacaaagga aaatgcagcg ctagtacaaa tcctaatatt 540 ggtgttgtat catctccctc cgagtcatgt gaagtcatat ctggagtaat cgacgaatca 600 gcagcaacta ataatactca caagcaacag aagaaaaaaa agtcgattcg tagggcaata 660 tttcatccag ttgttgcaaa ggaatcaagg aaagaagcaa gggcaagggc aagggaaaga 720 acaaaaataa agaaaagcct aaataataat aatggtgatc aatccatggc gcctgatgag 780 gatttaacaa gatcattagg atcttggagt actacatttg aagatcatca atcaggtatt 840 caagcctata ataatactaa caatattatg aatgctgttg ataactttaa tttggtggat 900 actagcaatt ggagcccatt tatgttcaac tatcaccaaa tcaatactga aatttctcag 960 gaggtatgta ttaacttaat tagattatta ttattattat tattaatccg atcgccaata 1020 tatttatttt tatttttatt cttctgttgc agcatcaat 1059

<210> 10 <211> 1092 <212> DNA

<213> Solanum tuberosum <400> 10

atgtatcctc caagcaacaa taactgcaac tacagcccaa ttttgtcttc tttcatatgc 60 caaaatattc catcttctcc ttgtatgcaa tatgaacacg aactatactt tcaaaacttc 120 aatcatgatg accaatatta ttttcaacta cagcaacaag ttcccttgat agatgacttg 180 agtcctcacg tcttagctga cagctgcact gagactgtta ctaagccttc aaattgcaat 240 cacgtactag aaggaatgga agaaggccga ggcggaaaca aaggagatga tgttgttatg 300 agtagcagaa ttagtattat tagtggacgg atctcgaaaa acaataagag atcttccaat 360 aaggatcgac acagcaagat caacacggct cgtggtccaa gagatcgaag gatgagactt 420 tcacttgatg ctgctcgcaa gtttttccgt ttgcaggact tgttgggatt tgataaggcc 480 agcaaaactg tagaatggtt gcttactcaa tcrgattccg caattgaaga gctcgtcgcc 540 gttaaaggca atgatgctca ggttcctcag caaactagct gcaatacccc cactactact 600

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

actggaattg gtgcaatttg tgcatctaat tctatttctg agtcatgtga agttatatca 660 ggaactgatg aaacttcctc taatgacaaa aacaaggaaa ctactgctaa agatgagaag 720 gagaaaaaga agaagccggt taacacagct cgtagacctg cgtttgaacc tcttacaaag 780 gaatcaagga atcaagcaag agccagggct agagagagaa caaaaacaaa gaaaatgagc 840 caagttggaa aatccaaatc cccagctcat gatttgaacc cttcaggatc tcggaggccg 900 gctaatagaa cttgtgaaga acctggaaca catgaacaac acaccttcca tcatgttgat 960 gacagtagtt ttgtggttaa tggaaattgg aatccattta caatcttcac ttctcatgaa 1020 caatatgctg gaatttccaa tgagcatcaa ttagttacag acttgcaatt ttatggaaag 1080 ctgtgggaaa gc 1092

<210> 11 <211> 225 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> RNAi para el gen SlBRC1L1 <400> 11

tggctactca caaagtcaaa atcagcggtg aacgatctgg ttcagaaaat taacaaagac 60 aaatgcagcg gtagtgaaaa tcctaatatt gctactgtat catctccttc cgccgaatca 120 tgtgaagtta tcgacgaatc agctgcaact aatacagcag aaactcagaa gcaacagaag 180 aaaaaagtta agtcgattcg tagggcaata attcatccag ttgtt 225

<210> 12 <211> 415 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> RNAi para el gen SlBRC1L2 <400> 12

caacaccgct cgtggtccaa gagatcgaag gatgagactt tcacttgatg ctgctcgcaa 60 gtttttccgt ttgcaggact tattgggatt cgataaggcc agcaaaactg ttgaatggtt 120 gcttactcaa tcggattctg caattgaaga gcttgttgcc gctaaaggca atgatgcaca 180 ggttgctcag caaactagct gcaatacccc cactactact actggaattg gtgcaatttg 240 tgcatctaat tctatttctg agtcgtgtga agttatatca ggaactgatg aaacttcctc 300 taatgacaaa aacaaggaaa ccgctcaaga tgaggagaag aagaaaagga agaaggtggt 360 taacacagct cgtagagctg tgttagaacc tcttacaaag gaatcgagga atcaa 415

<210> 13 <211> 185 <212> DNA

<213> Artificial Sequence

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> RNAi para el gen StBRC1L1 <400> 13

agaaaattag caaaggaaaa tgcagcgcta gtacaaatcc taatattggt gttgtatcat 60 ctccctccga gtcatgtgaa gtcatatctg gagtaatcga cgaatcagca gcaactaata 120 atactcacaa gcaacagaag aaaaaaaagt cgattcgtag ggcaatattt catccagttg 180 ttgca 185

<210> 14 <211> 168 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> RNAi para el gen StBRC1L2 <400> 14

gccgttaaag gcaatgatgc tcaggttcct cagcaaacta gctgcaatac ccccactact 60 actactggaa ttggtgcaat ttgtgcatct aattctattt ctgagtcatg tgaagttata 120 tcaggaactg atgaaacttc ctctaatgac aaaaacaagg aaactgct 168

<210> 15 <211> 1041 <212> DNA

<213> Solanum lycopersicum <400> 15

atgtaccctt cgagcaatta cagccccaat atttccagct cttcatcttt ctttcacatt 60 aatattccat ctccttctat gcaatatgaa cccgaattca tccaatattt ccatgatttt 120 caattcatcc aacctagtta cgatcagaat accaatattc ctgcagaaga agctgctgat 180 tcggacaaac tagataaaat agaagaagat caatcaatca taaaaagctg caataataac 240 aagaaggatg agaagagtag tagcagtact agtactattc gtagaaaaaa caacaagaga 300 actacgagtg gtagtgctgg tgtaggacct tcgaagaaag atagacacag caaaatcaac 360 acggcacatg gcccaagaga ccgaagaatg agactatcac ttgaaattgc tcgcaaattc 420 ttcaatttgc aagacttgct tgggttcgat aaagccagca aaactgtaga atggctactc 480 acaaagtcaa aatcagcggt gaacgatctg gttcagaaaa ttaacaaaga caaatgcagc 540 ggtagtgaaa atcctaatat tgctactgta tcatctcctt ccgccgaatc atgtgaagtt 600 atcgacgaat cagctgcaac taatacagca gaaactcaga agcaacagaa gaaaaaagtt 660 aagtcgattc gtagggcaat aattcatcca gttgttgcaa aggaatcaag gaaagaagca 720 agagcaaggg caagggaaag aacaataata aagaaaagcc taaatgataa cacgaataat 780 aataataatg gtgatcaatc tatggctgat gaggatttaa caagatcatt aagatcttgg 840 aatactacat ttgaagatca tcaatcaggt attcaaggct ataataataa taataatatg 900

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aatgttgttg ataactttaa tttggtggat actagcaatt ggagcccatt tatgttcaac 960 tatcaccaaa tcaatactga aatttctcaa gagcatcaat ttgcgaactt ccagtattct 1020 gggaagttat gggaagctta a 1041

<210> 16 <211> 1014 <212> DNA

<213> Solanum lycopersicum <400> 16

atgcaatatg aacacgaact atactttcaa agctttaatc atgataacca atattatttt 60 caacaacagc aactagttcc ctcgatagat gatttgagtc ctcacatctt agctgacagc 120 tgcaccgaga ttattactaa gccttcgaat tgcaaccacg aactacaagg aatggaagaa 180 ggccgaggcg aaaagaaagg agatgatgat gttatgagta gcagaattag tggacggatc 240 tcaaaaaata ataagagatc ttccaataaa gatcgacaca gcaagatcaa caccgctcgt 300 ggtccaagag atcgaaggat gagactttca cttgatgctg ctcgcaagtt tttccgtttg 360 caggacttat tgggattcga taaggccagc aaaactgttg aatggttgct tactcaatcg 420 gattctgcaa ttgaagagct tgttgccgct aaaggcaatg atgcacaggt tgctcagcaa 480 actagctgca atacccccac tactactact ggaattggtg caatttgtgc atctaattct 540 atttctgagt cgtgtgaagt tatatcagga actgatgaaa cttcctctaa tgacaaaaac 600 aaggaaaccg ctcaagatga ggagaagaag aaaaggaaga aggtggttaa cacagctcgt 660 agagctgtgt tagaacctct tacgaaggaa tcgaggaatc aagcaagagc cagggctaga 720 gagagaacaa aatcaaagaa aatgagccaa actggaaaat ccaaatccct agctaatgat 780 ttgaaccctt caggatctcg gaggccggct aataaaactt gtgaagaacc tggaacacat 840 gaagaactca acttccatca agagaagaac actgtcgatg actgtaattt tatggtaaat 900 ggaaattgga atccatttac aatctttagc tatcatgagc aatacgctgg aatttccaac 960 gagcatcaat tggttacaga cttgcaattt tgtggaaagc tatgggaagg ctag 1014

<210> 17 <211> 30 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador Le1 <400> 17

atgtaccctt cgagcaatta cagccccaat 30

<210> 18 <211> 31 <212> DNA

<213> Artificial Sequence

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> cebador Le2 <400> 18

tatttccagc tcttcatctt tctttcacat t 31

<210> 19 <211> 22 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador LeTCP2-F1 <400> 19

caacaccgct cgtggtccaa ga 22

<210> 20 <211> 28 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador LeTCP2-F1 nested <400> 20

ccaagagatc gaaggatgag actttcac 28

<210> 21 <211> 23 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador LeTCP2-R1 <400> 21

ttgattcctc gattcctttg taa 23

<210> 22 <211> 25 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador LeTCP2-R1 nested <400> 22

gaggttctaa cacagctcta cgagc 25

<210> 23 <211> 22 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador LeTCP2 cDNA-F <400> 23

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

gaatgcaata tgaacacgaa ct

22

<210> 24 <211> 24 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador LeTCP2 cDNA-R <400> 24

atgaactgca tcgtagtttt attc 24

<210> 25 <211> 30 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador Le3 <400> 25

attgagaatg acttgaaaga taaagatgag 30

<210> 26 <211> 27 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador GSP1-TCP1 <400> 26

tgtgaaagaa agatgaagag ctggaaa 27

<210> 27 <211> 25 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador GSP2-TCP1 <400> 27

ttggggctgt aattgctcga agggt 25

<210> 28 <211> 27 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador GSP1-TCP2 <400> 28

tcagctaaga tgtgaggact caaatca 27

<210> 29 <211> 28

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador GSP2-TCP2 <400> 29

atctatcgag ggaactagtt gctgttgt

<210> 30 <211> 34 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador para el extremo 5'de SIBRC1L1 <400> 30

ggggctcgag ggatccagaa aattagcaaa ggaa

<210> 31 <211> 34 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador para el extremo 5'de SlBRC1L1 <400> 31

ggggggtacc atcgattgca acaactggat gaaa

<210> 32 <211> 40 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador para el extremo 5'de SlBRC1L2 <400> 32

ggggctcgag ggatccgccg ttaaaggcaa tgatgctcag

<210> 33 <211> 41 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador para el extremo 5'de SlBRC1L2 <400> 33

ggggggtacc atcgatagca gtttccttgt ttttgtcatt a

<210> 34 <211> 26 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador racest1-5'

28

34

34

40

41

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 34

tgggctccaa ttgctagtat ccacca

<210> 35 <211> 26 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador StTCP1-ORF1 <400> 35

atgtaccctt cgagccccaa tatttc

<210> 36 <211> 34 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador B26 <400> 36

gactcgagtc gacatcgttt tttttttttt tttt

<210> 37 <211> 17 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador B25

<400> 37 gactcgagtc gacatcg

<210> 38 <211> 27 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador genomico-StTCP1A <400> 38

tgaatagaag tgtagtaggt tgtcctt

<210> 39 <211> 25 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador genomico-StTCP1B <400> 39

tgaaagataa agatgagctt attta

26

34

17

27

25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 40 <211> 29 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador StTCP2-A <400> 40

agagatcttc caataaggat cgacacagc 29

<210> 41 <211> 29 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador StTCP2-B <400> 41

atcaacacgg tcgtgggtcc aagagatcg 29

<210> 42 <211> 30 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador St2-Seq 1 <400> 42

tcatctcctt tgtttccgcc tcggccttct 30

<210> 43 <211> 27 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador St2-Seq 2 <400> 43

cttccattcc ttctagtacg tgattgc 27

<210> 44 <211> 26 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador StTCP2-5'

<400> 44

atgtatcctc caagcaacaa taactg 26

<210> 45 <211> 28 <212> DNA

<213> Artificial Sequence

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> cebador StTCP2-3'

<400> 45

gctttcccac agctttccat aaaattgc 28

<210> 46 <211> 34 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador del extremo 5' de StBRC1L1 <400> 46

ggggctcgag ggatccagaa aattagcaaa ggaa 34

<210> 47 <211> 34 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador del extremo 3' de StBRC1L1 <400> 47

ggggggtacc atcgattgca acaactggat gaaa 34

<210> 48 <211> 40 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador del extremo 5'

<400> 48

ggggctcgag ggatccgccg ttaaaggcaa tgatgctcag 40

<210> 49 <211> 41 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> cebador del extremo 3' del gen StBRC1L2 <400> 49

ggggggtacc atcgatagca gtttccttgt ttttgtcatt a 41

<210> 50 <211> 325 <212> PRT

<213> Solanum lycopersicum <400> 50

Met Tyr Pro Ser Ser Asn Tyr Ser Pro Asn Ile Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Phe Phe His Ile Asn Ile Pro Ser Pro Ser Met Gln Tyr Glu Pro Glu 20 25 30

Phe Ile Gln Tyr Phe His Asp Phe Gln Phe Ile Gln Pro Ser Tyr Asp 35 40 45

Gln Asn Thr Asn Ile Pro Ala Glu Glu Ala Ala Asp Ser Asp Lys Leu 50 55 60

Asp Lys Ile Glu Glu Asp Gln Ser Ile Ile Lys Ser Cys Asn Asn Asn 65 70 75 80

Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ile Arg Arg Lys 85 90 95

Asn Asn Lys Arg Thr Thr Ser Gly Ser Ala Gly Val Gly Pro Ser Lys 100 105 110

Lys Asp Arg His Ser Lys Ile Asn Thr Ala His Gly Pro Arg Asp Arg 115 120 125

Arg Met Arg Leu Ser Leu Glu Ile Ala Arg Lys Phe Phe Asn Leu Gln 130 135 140

Asp Leu Leu Gly Phe Asp Lys Ala Ser Lys Thr Val Glu Trp Leu Leu 145 150 155 160

Thr Lys Ser Lys Ser Ala Val Asn Asp Leu Val Gln Lys Ile Asn Lys 165 170 175

Asp Lys Cys Ser Gly Ser Glu Asn Pro Asn Ile Ala Thr Val Ser Ser 180 185 190

Pro Ser Ala Glu Ser Cys Glu Val Ile Asp Glu Ser Ala Ala Thr Asn 195 200 205

Thr Ala Glu Thr Gln Lys Gln Gln Lys Lys Lys Val Lys Ser Ile Arg 210 215 220

Arg Ala Ile Ile His Pro Val Val Ala Lys Glu Ser Arg Lys Glu Ala 225 230 235 240

Arg Ala Arg Ala Arg Glu Arg Thr Ile Ile Lys Lys Ser Leu Asn Asp 245 250 255

Asn Thr Asn Asn Asn Asn Asn Gly Asp Gln Ser Met Ala Asp Glu Asp 260 265 270

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Leu Thr Arg Ser Leu Arg Ser T rp Asn Thr Thr Phe Glu Asp His Gln 275 280 285

Ser Ala Ile Gly Ala His Leu Cys Ser Thr Ile Thr Lys Ser Ile Leu 290 295 300

Lys Phe Leu Lys Ser Ile Asn Leu Arg Thr Ser Ser Ile Leu Gly Ser 305 310 315 320

Tyr Gly Lys Leu Asn 325

<210> 51 <211> 362 <212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> misc_feature <222> (28)..(28)

<223> Xaa puede ser cualquier amino acido que ocurre de forma natural <400> 51

Met Tyr Pro Pro Ser Asn Asn Asn Cys Asn Tyr Ser Pro Ile Leu Ser 1 5 10 15

Ser Phe Ile Cys Gln Asn Ile Pro Ser Ser Pro Xaa Met Gln Tyr Glu 20 25 30

His Glu Leu Tyr Phe Gln Asn Phe Asn His Asp Asp Gln Tyr Tyr Phe 35 40 45

Gln Leu Gln Gln Gln Val Pro Leu Ile Asp Asp Leu Ser Pro His Val 50 55 60

Leu Ala Asp Ser Cys Thr Glu Thr Val Thr Lys Pro Ser Asn Cys Asn 65 70 75 80

His Val Leu Glu Gly Met Glu Glu Gly Arg Gly Gly Asn Lys Gly Asp 85 90 95

Asp Val Met Ser Ser Arg Ile Ser Ile Ile Ser Gly Arg Ile Ser Lys 100 105 110

Asn Asn Lys Arg Ser Ser Asn Lys Asp Arg His Ser Lys Ile Asn Thr 115 120 125

Ala Arg Gly Pro Arg Asp Arg Arg Met Arg Leu Ser Leu Asp Ala Ala 130 135 140

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Arg Lys Phe Phe Arg Leu Gln Asp Leu Leu Gly Phe Asp Lys Ala Ser 145 150 155 160

Lys Thr Val Glu T rp Leu Leu Thr Gln Ser Asp Ser Ala Ile Glu Glu 165 170 175

Leu Val Ala Val Lys Gly Asn Asp Ala Gln Val Pro Gln Gln Thr Ser 180 185 190

Cys Asn Thr Pro Thr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Ala Ile Cys Ala Ser 195 200 205

Asn Ser Ile Ser Glu Ser Cys Glu Val Ile Ser Gly Thr Asp Glu Thr 210 215 220

Ser Ser Asn Asp Lys Asn Lys Glu Thr Ala Lys Asp Glu Lys Glu Lys 225 230 235 240

Lys Lys Lys Pro Val Asn Thr Ala Arg Arg Ala Ala Phe Glu Pro Leu 245 250 255

Thr Lys Glu Ser Arg Asn Gln Ala Arg Ala Arg Ala Arg Glu Arg Thr 260 265 270

Lys Thr Lys Lys Met Ser Gln Val Gly Lys Ser Lys Ser Pro Val His 275 280 285

Asp Leu Asn Pro Ser Gly Ser Arg Arg Pro Ala Asn Arg Thr Cys Glu 290 295 300

Glu Pro Gly Thr His Glu Gln His Thr Phe His His Val Asp Asp Thr 305 310 315 320

Asn Phe Val Val Asn Gly Asn T rp Asn Pro Phe Thr Ile Phe Ser Ser 325 330 335

His Glu Gln Tyr Ala Gly Ile Ser Asn Glu His Gln Leu Val Thr Asp 340 345 350

Leu Gln Phe Tyr Gly Lys Leu T rp Glu Ser 355 360

<210> 52 <211> 1086 <212> DNA

<213> Solanum tuberosum <400> 52

atgtatcctc caagcaacaa taactgcaac tacagcccaa ttttgtcttc tttcatatgc 60

5

10

15

20

25

30

35

caaaatattc catcttctcc ttgtatgcaa tatgaacacg aactatactt tcaaaacttc 120 aatcatgatg accaatatta ttttcaacta cagcaacaag ttcccttgat agatgacttg 180 agtcctcacg tcttagctga cagctgcact gagactgtta ctaagccttc aaattgcaat 240 cacgtactag aaggaatgga agaaggccga ggcggaaaca aaggagatga tgttatgagt 300 agcagaatta gtattattag tggacggatc tcaaaaaaca ataagagatc ttccaataag 360 gatcgacaca gcaagatcaa cacggctcgt ggtccaagag atcgaaggat gagactttca 420 cttgatgctg ctcgcaagtt tttccgtttg caggacttat tgggatttga taaggccagc 480 aaaactgtag aatggttgct tactcaatca gattccgcaa ttgaagagct cgtcgccgtt 540 aaaggcaatg atgctcaggt tcctcagcaa actagctgca atacccccac tactactact 600 ggaattggtg caatttgtgc atctaattct atttctgagt catgtgaagt tatatcagga 660 actgatgaaa cttcctctaa tgacaaaaac aaggaaactg ctaaagatga gaaggagaaa 720 aagaagaagc cggttaacac agctcgtaga gctgcgtttg aacctcttac aaaggaatca 780 aggaatcaag caagagccag ggctagagag agaacaaaaa caaagaaaat gagccaagtt 840 ggaaaatcca aatccccagc tcatgatttg aacccttcag gatctcggag gccggctaat 900 agaacttgtg aagaacctgg aacacatgaa caacacacct tccatcatgt tgatgacact 960 aattttgtgg ttaatggaaa ttggaatcca tttacaatct tcagctctca tgaacaatat 1020 gctggaattt ccaatgagca tcaattagtt acagacttgc aattttatgg aaagctgtgg 1080 gaaagc 1086

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un polinucleotido aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacfdica que comprende la SEQ ID NO: 2.
2. 2. Un polinucleotido aislado capaz de dirigir la expresion de un gen de interes en los meristemos axilares de una planta, siendo preferiblemente el gen de interes el polinucleotido aislado de acuerdo a la reivindicacion 1, donde la secuencia reguladora de expresion es SEQ ID NO: 6.
3. 3. Una construccion genetica que comprende:

   a. el polinucleotido de segun la reivindicacion 1, o

   b. el polinucleotido segun reivindicacion 2 operativamente unido al polinucleotido de acuerdo a la reivindicacion 1.
4. 4. Una planta que comprende la construccion genetica segun reivindicacion 3 (a) o (b) que comprende el polinucleotido segun reivindicacion 1.
5. 5. La planta segun reivindicacion 4, la cual es clasificada taxonomicamente perteneciente a la especie Solanum lycopersicum.
6. 6. Una semilla, una celula vegetal, una parte de una planta o un grano de polen los cuales son clasificados taxonomicamente pertenecientes a la especie Solanum lycopersicum que comprende la construccion genetica segun reivindicacion 3.
7. 7. Una secuencia aminoacfdica aislada que comprende la SEQ ID NO: 2.
8. 8. Un uso del polinucleotido segun reivindicacion 1, o el polinucleotido segun reivindicacion 2, o la construccion genetica segun reivindicacion 3 (a) o (b) que comprende el polinucleotido segun reivindicacion 1, o la secuencia aminoacfdica aislada segun reivindicacion 7, para modificar la arquitectura de la planta, reduciendo el numero de ramificaciones en respecto al control de la planta.
9. 9. Un metodo para modificar la arquitectura de una planta, reduciendo el numero de ramificaciones en respecto a el control de la planta, que comprende:

   a. Transfectar un polinucleotido segun reivindicacion 1, o una construccion genetica segun reivindicaciones 3 (a) o (b) que comprende el polinucleotido segun reivindicacion 1, en una celula o cultivo de celulas vegetales huesped, y

   b. Crecer la celula o el cultivo de celulas vegetal huesped en un medio adecuado, hasta la regeneracion de una planta completa.
10. 10. El metodo segun reivindicacion 9, en el que la celula transfectada es clasificada taxonomicamente perteneciente a la especie Solanum lycopersicum.