BR112018070041A2 - planta de tabaco e método para fabricação da mesma - Google Patents
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Abstract
a presente invenção fornece uma planta de tabaco a qual é adequada para cultivo para colheita das folhas de tabaco. a presente invenção inclui (i) uma planta de tabaco na qual uma mutação para suprimir o desenvolvimento de brotos auxiliares é introduzida e (ii) um método para a fabricação da planta de tabaco.
Description
PLANTA DE TABACO E MÉTODO PARA FABRICAÇÃO DA MESMA CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção se refere a (i) uma planta de tabaco a qual é adequada para cultivo para colheita de folhas de tabaco e (ii) um método para a fabricação da planta de tabaco.
ESTADO DA TÉCNICA [002] No processo de crescimento das sementes de plantas, os embriões nas sementes se desenvolvem de modo a formar cotilédones e meristemas apicais (meristemas apicais de broto). A divisão celular do meristema apical (meristema apical de broto) faz com que a folha primordial seja sequencialmente formada, e faz com que os meristemas axilares sejam formados em uma lateral adaxial da folha primordial. Os meristemas axilares, então, atuam como meristemas apicais (meristemas apicais de broto) e resultam em brotos axilares. Durante o crescimento vegetative de uma planta, usualmente, o desenvolvimento de brotos axilares está temporariamente em um estado adormecido (suprimido) . Nos casos em que os meristemas apicais (meristemas apicais de broto) de um broto primário se transformam de um estado de crescimento vegetative em um estado de crescimento reprodutivo, ou nos casos em que os meristemas apicais (meristemas apicais de broto) morrem, o desenvolvimento dos brotos axilares não está mais em estado adormecido e é promovido. Em relação ao desenvolvimento de brotos axilares, existe uma pluralidade de relatórios de pesquisa acerca de plantas solanáceas (por exemplo, tomates e tabacos) e em outras plantas (por exemplo, arroz e Arabídopsís thaliana) .
[003] Uma planta de tabaco, a qual é cultivada para a
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2/135 colheita das folhas, é submetida à poda (corte do talo de uma porção apical com uma flor) durante o cultivo, para fins de melhoria da qualidade e quantidade de folhas a serem colhidas (por exemplo, para fins de acúmulo da composição das folhas e maturação e expansão das folhas) . A poda faz com que brotos axilares da planta de tabaco comecem vigorosamente a se desenvolver a partir de bases de folhas (axila foliar) . 0 desenvolvimento de brotos axilares naturalmente consome nutrientes e, dessa forma, causa uma diminuição relativa nos nutrientes os quais são fornecidos às folhas a serem colhidas. Sendo assim, o desenvolvimento e crescimento dos brotos axilares leva a uma diminuição na qualidade e rendimento de folhas a serem colhidas. Por um motivo similar àquele da poda, os brotos axilares são submetidos a um tratamento, tal como a remoção ou supressão do desenvolvimento, durante um período entre a poda e a colheita das folhas. Note que, no caso de pelo menos uma planta de tabaco, é conhecido que, mesmo após a remoção de um broto axilar, brotos axilares repetidamente se desenvolvem a partir de uma base da mesma folha. Sendo assim, no cultivo de plantas de tabaco para a colheita de folhas de tabaco, o controle de brotos axilares é uma questão importante que deve ser eliminada.
[004] Exemplos de um método de remoção de um broto axilar abrange um método no qual um broto axilar é coletado pela mão ou por máquina. Coletar um broto axilar pela mão envolve (i) uma grande quantidade de trabalho (e, de acordo, um aumento nos custos do trabalho) e (ii) um problema de baixa eficiência. Coletar um broto axilar por máquina é menos preciso do que coletá-lo com as mãos e, dessa forma, cria um
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3/135 problema de dano de uma planta. Exemplos de um método de supressão do desenvolvimento de um broto axilar abrange (1) supressão pelo uso de agroquímicos e (11) supressão por modificação genética. 0 uso de agroquímicos envolve problemas tais como aplicação repetida para a manutenção de um efeito, um impacto no crescimento de uma planta, um impacto nas folhas a serem colhidas devido aos resíduos de agroquímicos, e um aumento no custo de inspeção para resíduos de agroquímicos.
[005] Note que as literaturas patentárias 1 e 2 e literaturas não patentárias 1 a 19 revela aspectos relacionadas ao desenvolvimento de brotos axilares. As literaturas patentárias 1 e 2 descrevem técnicas para a supressão do desenvolvimento de brotos axilares.
[006] Com referência à literatura não patentária 1 a 19, os genes envolvidos na formação do meristema axilar serão descritos abaixo.
[007] Uma pluralidade de genes de plantas que não sejam plantas de tabaco foi reportada como genes envolvidos na formação do meristema axilar. Exemplos representativos de tais genes abrangem lateral suppressor (LS), blind (Bi), revoluta (REV) e cup-shaped cotyledons (CUC).
[008] Foi reportado que LS é isolado de Arabidopsis thallana (literatura não patentária 1), tomate (literatura não patentária 2) e arroz (literatura não patentária 3), e é um gene necessário para a formação de um meristema axilar. Em um mutante de gene LS de Arabidopsis thallana, enquanto os brotos axilares das folhas do caule são normais, os brotos axilares das rosetas de folhas que não sejam as duas rosetas de folhas mais superiores foram dificilmente observados
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4/135 (literatura não patentária 1) . Em um mutante de gene LS de um tomate, enquanto os brotos axilares não estão presentes durante o estágio vegetative, brotos axilares foram formados em duas partes mais superiores durante o estágio reprodutivo (literatura não patentária 2). Em um mutante do gene LS de arroz (mod), nenhum perfilho, o qual é equivalente aos brotos axilares do arroz, foi de todo observado durante ambos um estágio de perfilhamento e um estágio de espigamento (literatura não patentária 3) . Em relação aos tabacos, enquanto a sequência de cDNA prevista como um gene ortólogo LS é publicada (número de acesso: EU0935581.1), a função do gene nos tabacos não é confirmada.
[009] O gene BI é isolado de Arabídopsís thalíana (literaturas não patentárias 4 e 5) e tomate (literatura não patentária 6) . Em tomates, mesmo em um caso em que uma cobertura tenha sido realizada, os brotos axilares foram dificilmente formados apesar da posição da folha, devido à um mutante de um gene (literaturas não patentárias 6 e 7). Com relação à Arabídopsís thalíana, pelo menos três genes os quais são redundantes e BI ortólogos (regulador do meristema axilar (RAX) 1, 2 e 3) foram reportados. Enquanto um único mutante RAX1 mostrou supressão dos brotos axilares, em RAX1, 2, triplo mutantes 3, brotos axilares de roseta de folhas foram dificilmente formados e aquelas folhas do caule foram amplamente reduzidas (literaturas não patentárias 4 e 5). Nos únicos mutantes RAX1, mesmo após a cobertura, o crescimento dos brotos axilares a partir da roseta de folhas inferior, onde nenhuma formação de brotos axilares foi observada antes da cobertura, não foi observado. Com base na comparação da homologia entre (i) a sequência putativa de
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5/135 aminoácidos prevista a partir da sequência do gene RAX da Arabídopsís thalíana e (ii) a sequência putativa de aminoácido prevista a partir das sequências do genoma de uva e tomate, foi previsto que o gene ortólogo do tomate de RAX1 de Arabídopsís thaííana inclui o gene C que não seja o Blind. No entanto, o gene C não foi relevante para a formação dos brotos axilares, porém foi relevante para a morfogênese das folhas (literatura não patentária 8) . Embora não tenha havido qualquer relato acerca da sequência de cDNA prevista como gene ortólogo BI em tabacos, a sequência putativa de aminoácido prevista a partir de uma sequência EST idêntica em 93 % à sequência de aminoácido do tomate BI foi publicada (número de acesso: FS402940.1) . No entanto, a função do gene no tabaco permanece desconhecida.
[010] O gene REV foi isolado de Arabídopsís thalíana (literaturas não patentárias 10 e 11). Em um mutante de REV, a formação de brotos axilares foi diminuída em ambas a roseta de folhas e folhas do caule, e promoção da formação de um meristema axilar pela decapitação não foi observada (literaturas não patentárias 9, 10 e 12). Embora não tenha havido relatos da sequência de cDNA prevista como gene ortólogo REV em tabacos, a sequência putativa de aminoácido prevista a partir de uma sequência EST idêntica em 79 % em um nível de aminoácido para Arabídopsís thalíana REV foi publicada (número de acesso: FG135778.1). Em adição, uma sequência de cDNA de comprimento completo prevista como gene ortólogo REV em um tabaco (variedade: SR-1) foi publicada (número de acesso: JQ686937). No entanto, não foi reportado qualquer relato acerca da função de um gene, em um tabaco, o qual é altamente homólogo ao REV.
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6/135 [Oil] Três genes (CUC1, CUC2 e CUC3) como CUC são isolados de Arabídopsís thalíana (literaturas não patentárias 16 a 18) . A função de ambos CUC1 e CUC2 é controlar os meristemas apicais de broto e redundante (literatura não patentária 15). Embora uma única mutação em CUC3 reprima a formação de brotos axilares, a dupla mutação em CUC2 e CUC3 mostrou a repressão melhorada (literaturas não patentárias 13 e 14). Embora não haja qualquer relato em uma sequência de cDNA prevista como ortóloga ao CUC em tabacos, a sequência putativa de aminoácido prevista a partir de uma sequência EST (FG644078.1) idêntica em 81 % à sequência de aminoácido da sequência de domínio NAM, a qual é um domínio conservado do gene CUC1 de Arabídopsís thalíana, foi publicado. Foi também reportado que o RNAi de tabaco transgênico usando a sequência prevista como CUC3 de Apocynum venetum mostrou a expressão reduzida de um determinado gene (a sequência não está publicada) e anormalidade morfológica das folhas mostradas nos mutantes CUC de Arabídopsís thalíana (literatura não patentária 19). No entanto, a função de um gene, em um tabaco, em que o gene é altamente homólogo ao CUC, não está clara, e, pelo menos, a função em relação a um broto axilar não foi reportada.
LISTA DE CITAÇÕES
Literatura patentária
Literatura patentária 1 [012] Pedido de patente US publicado n° 2009/0249518 (Data de publicação: 1 de outubro de 2009) .
Literatura patentária 2 [013] Panfleto da Publicação Internacional n° WO 2010/081917 (Data de publicação: 22 de julho de 2010)
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Literatura não patentária
Literatura não patentária 1 [014] Greb T, Clarenz O, Schafer E, Muller D, Herrero R, Schmitz G, Theres K (2003) Molecular analysis of the lateral suppressor gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillary meristem formation. Genes Dev. 17: 1175 - 1187.
Literatura não patentária 2 [015] Schumacher K, Schmitt T, Rossberg M, Schmitz G, Theres K (1999) The Lateral suppressor (Ls) gene of tomato encodes a new member of the VHTTD protein family. Proc Natl Acad Sci USA 96: 290 - 295.
Literatura não patentária 3 [016] Xueyong L, Qian Q, Zhiming F, Yonghong W, Guosheng X, Dali Z, Xiaoqun W, Xinfang L, Sheng T, Fujimoto H, Ming Y, Da L, Bin H & Jiayang L (2003) Control of tillering in rice. Nature 402(10): 618 - 621.
Literatura não patentária 4 [017] Keller, T., Abbott, J., Moritz, T., e Doerner, P (2006) Arabidopsis regulator of axillary meristems 1 controls a leaf axil stem cell niche and modulates vegetative development. The plant cell 18: 598 - 611.
Literatura não patentária 5 [018] Muller D, Schmitz G, Theres K (2006) Blind homologous R2R3 Myb genes control the pattern of lateral meristem initiation in Arabidopsis. The plant cell 18: 586 - 597.
Literatura não patentária 6 [019] Schmitz G, Tillman E, Carriero F, Fiore C, Cellini F, TheresK (2002) The tomato Blind gene encodes a
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MYB transcription factor that controls the formation of lateral meristems. Proc Natl Acad Sci USA 99: 1064 - 1069.
Literatura não patentária 7 [020] Mapelli SC, Lombardi L (1982) A comparative auxin and cytokinin study in normal and to-2 mutante tomato plants. Plant Cell Physiol. 23: 751 - 757.
Literatura não patentária 8 [021] Busch BL, Schmitz G, Rossmann S, Piron F, Ding J, BendahmaneA, Theres K (2011) Shoot branching and leaf dissection in totato are regulated by homologous gene modules. The plant cell 23: 3595 - 3609.
Literatura não patentária 9 [022] Talbert PB, Adler HT, Parks DW, Cornai L (1995) The revolutum gene is necessary for apical meristem development and for limiting cell divisions in the leaves and stems of Arabidopsis thaliana. Development 121: 2723 2735.
Literatura não patentária 10 [023] Otsuga D, DeGuzman B, Prigge MJ, Drews GN, Clark SE (2001) Revoluta regulates meristem initiation at lateral positions. The Plant Journal 25: 223 - 236.
Literatura não patentária 11 [024] Zhong R, Ye ZH (1999) TFL1, a gene regulating interfascicular fiber differentiation in Arabiodpsis, encodes a homeodomain-leucine zipper protein. The plant cell 11: 2139 - 2152
Literatura não patentária 12 [025] Zhong R, Taylor JJ, Ye ZH (1997) Disruption of interfascicular fiber differentiation in an Arabidopsis mutante. The Plant Cell 9: 2159 - 2170.
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Literatura não patentária 13 [026] Hibara K, Karim MR, Takada S, Taoka K, Furutani Μ, Aida Μ, Tasaka Μ (2006) Arabidopsis cup-shaped cotilédoneã regulates postembryonic shoot meristem and organ boundary formation. The plant cell 18: 2946 - 2957.
Literatura não patentária 14 [027] Raman, S., Greb, T., Peaucelle, A., Blein, T.,
Laufs, P. and Theres, K (2008) Lnterplay of miR164, cupshaped cotilédone genes and lateral suppressor controls axillary meristems formation in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 55: 65-76.
Literatura não patentária 15 [028] Takada, 5., Hibara, K., Ishida, T., and Tasaka, M (2001) The cup-shaped cotyledonel gene of Arabidopsis regulates apical shoot meristem formation. Development 128: 1127 - 1135.
Literatura não patentária 16 [029] Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H and Tasaka
M (1997) Genes involved in organ separation in arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledone mutant. The Plant cell 9: 841 - 857.
Literatura não patentária 17 [030] Takada S, Hibara K, Ishida T and Tasaka M (2001) The cup-shaped cotilédonel gene of Arabidopsis regulates apical shoot meristem formation. Development 128: 1127-1135.
Literatura não patentária 18 [031] Vroemen CW, Mordhorst AP, Albrecht C, Kwaaitaal MA, de Vries SC (2003) The cup-shaped cotyledone 3 gene is required for boundary and shoot meristem formation in Arabidopsis. The plant cell 15(7): 1563 - 77.
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Literatura não patentária 19 [032] Sun J, Jia H, Wang X, Yuan X e Zhao B (2012) Inhibition of tobacco axillary stem differentiation by silencing cup-shaped cotilédone 3 Afr. J. Biotech 11(16): 3929 - 3927.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Problema técnico [033] No entanto, o que pode ser conhecido a partir da literatura acima é meramente que brotos axilares podem ser reduzidos em plantas que não sejam plantas de tabaco. Sendo assim, ainda não é claro como obter uma planta de tabaco na qual os problemas resultado antes do desenvolvimento de brotos axilares são resolvidos ou reduzidos e a qual deve ser cultivada para a colheita de folhas de tabaco.
[034] É um objeto da presente invenção fornecer uma planta de tabaco a qual é adequada para cultivo para a colheita de folhas de tabaco.
Solução do problema [035] Em vista dos problemas acima, os inventores da presente invenção identificaram o gene o qual espera-se estar envolvido no desenvolvimento de brotos axilares em plantas de tabaco, e então procuraram por um efeito vantajoso o qual pode ser obtido pela diminuição da abundância, em uma planta de tabaco, de proteínas expressas a partir do gene. Isto leva à conclusão da presente invenção.
[036] Especificamente, a fim de alcançar o objeto, uma planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é uma planta de tabaco na qual uma mutação é introduzida no genoma, em que a mutação causa a supressão funcional de um gene contendo, como uma região codante, um
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11/135 polinucleotídeo que codifica quaisquer dos seguintes polipeptideos (1) a (5):
polipeptideos (1) a (5) (1) pelo menos um de um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1 e um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 3;
(2) pelo menos um de um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 5 e um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 7;
(3) pelo menos um de um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 9 e um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 11;
(4) pelo menos um de um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 13 e um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 15; e (5) pelo menos um de um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 17 e um
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12/135 polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 19, a supressão funcional suprimindo o desenvolvimento de brotos axilares.
[037] A fim de alcançar o objeto, um método de produção de uma planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é um método para a fabricação de uma planta de tabaco, incluindo a etapa de: (a) introdução de uma mutação que causa a supressão funcional de um gene contendo, como uma região codante, um polinucleotideo que codifica quaisquer dos seguintes polipeptideos (1) a (5):
polipeptideos (1) a (5) (1) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 3;
(2) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 5 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 7;
(3) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 9 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela
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SEQ ID NO. 11;
(4) pelo menos um de um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 13 e um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 15; e (5) pelo menos um de um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 17 e um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 19, a supressão funcional suprimindo o desenvolvimento de brotos axilares.
Efeitos vantajosos da invenção [038] A presente invenção pode seletivamente suprimir o desenvolvimento de brotos axilares e pode, dessa forma, vantajosamente fornecer uma planta de tabaco a qual é adequada para o cultivo para colheita de folhas de tabaco.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [039] A figura 1 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por expressão suprimida do gene NtREV de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[040] A figura 2 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por expressão suprimida do gene NtBll de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[041] A figura 3 é uma vista que mostra os resultados
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14/135 dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por expressão suprimida do gene NtLS de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[042] A figura 4 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por expressão suprimida do gene #15360 de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[043] A figura 5 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por expressão suprimida do gene #07437 de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[044] A figura 6 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes NtREV de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[045] A figura 7 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes NtLS de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[046] A figura 8 é uma vista que ilustra esquematicamente uma construção de um vetor usado para a introdução de uma mutação dentro do gene NtBll pelo sistema CRISPR/Cas9.
[047] A figura 9 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes NtBll de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[048] A figura 10 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes NtBll de acordo com os
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Exemplos da presente invenção.
[049] A figura 11 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos na posição dos brotos axilares desenvolvidos por mutações introduzidas nos genes NtBll ou genes NtLS de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[050] A figura 12 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no crescimento das plantas de tabaco por mutações introduzidas nos genes NtBll de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[051] A figura 13 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no crescimento das plantas de tabaco por mutações introduzidas nos genes NtLS de acordo com os Exemplos da presente invenção.
[052] A figura 14 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no crescimento das plantas de tabaco por mutações introduzidas nos genes NtREV.
[053] A figura 15 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no crescimento das plantas de tabaco por mutações introduzidas nos genes LS.
[054] A figura 16 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes LS.
[055] A figura 17 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes REV.
[056] A figura 18 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes LS.
[057] A figura 19 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por
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16/135 mutações introduzidas nos genes REV.
[058] A figura 20 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes REV.
[059] A figura 21 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas no gene #15360.
[060] A figura 22 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes Bll.
[061] A figura 23 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes Bll.
[062] A figura 24 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes Bll.
[063] A figura 25 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes LS.
[064] A figura 26 é uma vista que mostra os resultados dos efeitos no desenvolvimento dos brotos axilares por mutações introduzidas nos genes LS.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES
Planta de tabaco[1] [065] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma planta de tabaco na qual uma mutação é introduzida dentro do genoma, em que a mutação causa a supressão da função de um gene contendo, como uma região codante, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo específico. Deve ser notado que a supressão funcional acima é para suprimir o desenvolvimento
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17/135 de brotos axilares.
[066] Exemplos concretos do polipeptideo especifico abrangem (i) pelo menos um de (a) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1 e (b) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 3; (ii) pelo menos um de (a) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 5 e (b) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 7; (iii) pelo menos um de (a) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 9 e (b) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 11; (iv) pelo menos um de (a) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 13 e (b) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 15; e (v) pelo menos um de (a) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 17 e (b) um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 19.
[067] Como demonstrado nos Exemplos descritos a
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18/135 seguir, embora a planta de tabaco não apresente qualquer diferença substancial de uma planta tipo selvagem em termos de número ou peso de brotos axilares primários, a planta de tabaco tanto (i) mostra uma diminuição considerável (por exemplo, 1/2 ou menos do que uma planta do tipo selvagem) no número ou peso de brotos axilares (isto é, brotos axilares secundários e brotos axilares terciários) a serem gerados após a remoção dos brotos axilares primários ou (ii) não apresenta quaisquer brotos axilares após remoção dos brotos axilares primários. Sendo assim, os brotos axilares são completamente removidos da planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção por, substancialmente, um processo de remoção único. Isto permite que a quantidade de trabalho, o qual está envolvido no controle de brotos axilares no cultivo de uma planta de tabaco para a colheita de folhas de tabaco, seja inferior a uma fração da quantidade de trabalho envolvido em tal controle convencional dos brotos axilares.
[068] Como descrito acima, a literatura que descreve tecnologias convencionais meramente descreve que o desenvolvimento de brotos axilares é totalmente suprimido em plantas que não sejam planta de tabacos. Pelas razões descritas abaixo, no entanto, a supressão do desenvolvimento completo dos brotos axilares não necessariamente traz apenas vantagens. A capacidade de desenvolvimento dos brotos axilares é uma função importante para a manutenção da saúde dos indivíduos de plantas de sementes. Por exemplo, em um caso em que o meristema dos brotos apicais é danificado, um indivíduo tenta sobreviver fazendo com que um broto axilar comece a crescer em vez do tecido. Sendo assim, espera-se
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19/135 que, em um caso em que esta função é totalmente perdida, a saúde dos indivíduos está inevitavelmente em risco. De fato, a literatura não patentária 9 (legenda da A figura 1) menciona parcialmente a diminuição do crescimento de uma planta. Em adição, um indivíduo, o qual perdeu completamente os brotos axilares e está danificado, por exemplo, por ventos ou inundações, está em alto risco de morte. Sendo assim, em vista da produção de folhas de tabaco, o desenvolvimento de brotos axilares é altamente significativo em alguns casos. Em um caso em que um broto primário é danificado durante o crescimento, um rendimento de folhas de tabaco pode ser garantido, fazendo com que um broto axilar em um nó inferior se estenda e se desenvolva em vez de um broto primário.
[069] Como aqui usado, planta de tabaco e tabaco abrangem (i) um indivíduo inteiro (tal como uma planta madura, uma muda e uma semente), (ii) tecido (tal como uma folha, um caule, uma flor, uma raiz, um órgão reprodutor, um embrião, e uma parte de qualquer um destes) e (iii) um produto seco de qualquer um desses.
[070] Como aqui usado, broto axilar se refere a ambos (i) um galho o qual é gerado a partir de um meristema axilar formado em uma axila foliar de uma folha primordial e (ii) um broto obtido como um resultado do desenvolvimento do galho. Após a poda, brotos axilares se desenvolvem em uma ordem de brotos axilares primários, brotos axilares secundários e, então, brotos axilares terciários, em uma base da mesma folha. Primeiro, após a poda, os brotos axilares primários se desenvolvem. Após os brotos axilares primários serem removidos, os brotos axilares secundários se desenvolvem. O desenvolvimento de um broto axilar
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20/135 significa gue o broto axilar, o qual permanece como tecidos diferenciados do meristema axilar, começa um vigoroso desenvolvimento devido a, por exemplo, remoção de um broto apical (poda) , de modo que o broto axilar cresça e se estenda.
[071] O número ou peso de brotos axilares significa o número ou uma massa total (peso fresco) de brotos axilares os quais tenham se desenvolvido em um indivíduo e tenham sido coletados. O número ou peso se aplica a quaisquer brotos axilares primários, brotos axilares secundários e brotos axilares terciários.
[072] Como aqui usado, identidade de sequência (de uma sequência de aminoácido) significa uma proporção de porcentagem na qual uma determinada sequência (aminoácido) combina com uma sequência de referência (aminoácido). Note que uma parte da sequência, cuja parte não combina, é uma parte na qual um resíduo de aminoácido é substituído, adicionado, deletado ou inserido.
[073] Note que o termo polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela [...], o qual especifica o polipeptídeo com uso de uma sequência de aminoácido listada em uma listagem de sequência, significa um polipeptídeo de tipo selvagem. O polipeptídeo de tipo selvagem significa um polipeptídeo o qual está tipicamente presente em uma planta Nícotíana descrita a seguir.
[074] Sendo assim, um polipeptídeo específico, o qual é diminuído em abundância na planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção, necessita apenas ser um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90
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21/135 % ou mais com cada da sequência de aminoácidos listada na listagem de sequência. Uma identidade de sequência mais alta é mais preferível (por exemplo, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % ou mais alta).
[075] A diminuição em abundância de um polipeptideo significa a presença do polipeptideo em uma quantidade de 70 % ou menos, 60 % ou menos, 50 % ou menos, 40 % ou menos, 30 % ou menos, 20 % ou menos, 10 % ou menos, 5 % ou menos ou 1 % ou menos, em relação à abundância de um polipeptideo de tipo selvagem como uma referência. A abundância do polipeptideo em relação àquela do polipeptideo de tipo selvagem como uma referência pode ser selecionada como adequada a partir dos valores acima os quais resultam em uma diminuição no número ou peso dos brotos axilares secundários.
[07 6] É preferível que a diminuição em abundância acima descrita de um polipeptideo na planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é, com estabilidade, geneticamente herdado por uma célula cultivada, calo, protoplasto, semente e descendentes, em que quaisquer destes são obtidos de uma planta de tabaco. Sendo assim, a planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção pode ser um indivíduo desenvolvido a partir de célula cultivada, célula, calo, protoplasto, semente e descendentes, quaisquer dos quais é produzido através de uma operação artificial. Em adição, estes materiais, a partir dos quais os indivíduos se desenvolvem, estão também abrangidos no escopo da presente invenção.
[077] O escopo de uma planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção pode ainda abranger a progênie criada obtida pelo cruzamento. A reprodução com o
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22/135 uso de mutantes foi realizada em muitas espécies de plantas. Exemplos representativos de tais espécies de plantas abrangem arroz, trigo, cevada e soja. Por exemplo, um mutante isolado de uma população de mutante tratada por um mutagênico apresenta múltiplas mutações além de uma região de um gene alvo. Em geral, sendo assim, o retro cruzamento não deve ser realizado para remover mutações em excesso. Durante a reprodução, o mutante pode ser cruzado com uma cultivar apresentando uma excelente característica, de modo que uma característica do mutante seja introduzida na cultivar. Isto resulta na obtenção de uma cultivar apresentando altos valores adicionais. Uma vez que a característica de um mutante é derivada de uma mutação, é necessário selecionar um indivíduo apresentando uma mutação de modo a proceder com o retro cruzamento. A fim de proceder com um retro cruzamento eficiente, é necessário realizar um método no qual é fácil determinar (i) se ou existe ou não uma mutação e (ii) se a mutação é ou não uma homozigose ou heterozigose. Este método pode ser realizado através de um método de detecção de uma mutação (descrito a seguir). Em adição, em um caso em que a seleção assistida por marcador (MAS) é realizada com o uso de um marcador de fundo indicativo de um polimorfismo entre o mutante e a cultivar, é possível obter, de forma eficiente, com menos vezes de cruzamento, uma linhagem apresentando uma alta proporção de genoma da cultivar. Um marcador polimórfico pode ser SNP ou repetição de sequência simples (SSR), cada um das quais é publicamente conhecida para o tabaco. Se necessário, uma sequência de genoma do tabaco é analisar de modo a identificar (i) uma diferença na sequência de nucleotideo e (ii) uma diferença no número de sequências
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23/135 repetidas. Isto permite que um novo marcador polimórfico seja obtido e utilizado.
[078] Como aqui usado, supressão funcional de um gene significa um estado no qual o gene em um genoma não está atendendo sua função original. Sendo assim, supressão funcional de um gene é um termo que abrange (i) rompimento de gene, (ii) mutação do gene e (iii) supressão da expressão do gene por outro gene (incluindo um gene exógeno).
[079] O gene e o genoma serão descritos abaixo tomando a Nícotíana tabacum (N. tabacum) como uma referência. Nícotíana tabacum (N. tabacum), a qual atua como uma referência na descrição abaixo, é um anfidiploide e apresenta ambos um genoma S e um genoma T derivado de Nícotíana sylvestrís e Nícotíana tomentosíformís, respectivamente, cada uma da qual é uma espécie ancestral da mesma. Em N. tabacum, em muitos casos, genes indicados por um nome idêntico estão presentes em cada genoma. Sendo assim, tais genes incluem dois alelos no genoma S e dois genes alélicos em um genoma T. Em outras palavras, no genoma de N. tabacum, quatro genes indicados por um nome idêntico estão presentes em muitos casos.
[080] Note que, na região codante de uma planta de tabaco, uma sequência de nucleotideo de parte (não completa) dos genes que codificam proteínas, os quais possuem substancialmente a mesma função entre espécies, podem apresentar (i) 1 % a diversas % de diferença entre cultivares e (ii) aproximadamente 10 % ou menos de diferença entre uma cultivar e uma espécie selvagem.
[081] Rompimento de gene significa que (i) um gene,
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24/135 o qual está originalmente presente em um genoma, não está presente no genoma ou (ii) um produto transcrito não é produzido a partir de um gene em um genoma. Mutação do gene significa (i) uma mutação de um gene de modo que uma proteína apresentando uma função original não é produzida, (ii) uma mutação do gene de modo que, enquanto uma proteína é produzida, a quantidade da proteína produzida é diminuída, ou (iii) uma mutação do gene de modo que, embora uma proteína seja produzida, a estabilidade da proteína é diminuída. Supressão da expressão do gene significa um estado no qual embora nenhuma mudança tenha ocorrido no gene, a função do gene (a partir da transcrição em RNAm à subsequente tradução em proteína) é modificada através de outro fator de modo que (i) a quantidade de proteína produzida é diminuída ou (ii) nenhuma proteína é produzida. A supressão da expressão do gene pode ocorrer como um resultado de, por exemplo, a degradação do RNAm o qual é transcrito a partir do gene.
[082] Como aqui usado, mutação tem o significado como comumente entendido no campo técnico do presente pedido, e significa, por exemplo, uma mudança em um nucleotídeo em um genoma de uma planta tipo selvagem ou uma mudança no resíduo de aminoácido em uma proteína de uma planta tipo selvagem (exemplos da mudança abrangem substituição, deleção, inserção, adição, duplicação e inversão). Exemplos da mudança no nucleotídeo no genoma ainda abrangem a translocação de uma pluralidade de nucleotídeos.
[083] Um polipeptídeo, o qual apresenta uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19, é um polipeptídeo o qual está presente em uma planta
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25/135 do tipo selvagem (ou uma variante da mesma). Sendo assim, a abundância do polipeptideo na planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é diminuída em comparação com àquela de uma planta do tipo selvagem. Isto faz com que a planta de tabaco seja inferior à planta do tipo selvagem em termos de função. Exemplos da função abrangem uma função de uma planta do tipo selvagem, tal como (i) uma função para formar meristema axilar, (ii) uma função para diferenciar um broto axilar do meristema axilar, ou (iii) uma função para manter ou promover a capacidade de desenvolvimento de um broto axilar.
[084] Um polipeptideo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO. 2. Um polipeptideo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 3 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO. 4. Estes polinucleotídeos são, cada, cDNA do gene NtREV demonstrado nos Exemplos descritos a seguir. A SEQ ID NO. 2 representa uma sequência de cDNA de gene NtREV de um genoma S. A SEQ ID NO. 4 representa uma sequência de cDNA de gene NtREV de um genoma T. A SEQ ID NOs. 21 e 22 representam sequências de nucleotídeo de um genoma S e um genoma T, respectivamente, do gene NtREV. As SEQ ID NOs. 54 e 55 representam uma sequência de nucleotídeos de um genoma S e um genoma T, respectivamente, do gene NtREV (incluindo 5' à montante e 3' à jusante).
[085] Um polipeptideo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 5 é codificado por,
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26/135 por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotideo representada pela SEQ ID NO. 6. Um polipeptideo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 7 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotideo representada pela SEQ ID NO. 8. Estes polinucleotídeos são, cada, cDNA de gene NtLS demonstrado nos Exemplos descritos a seguir. A SEQ ID NO. 6 representa uma sequência de cDNA de gene NtLS de um genoma S. A SEQ ID NO. 8 representa uma sequência de cDNA de gene NtLS de um genoma T. A SEQ ID NOs. 23 e 24 representam sequências de nucleotideo de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de gene NtLS. As SEQ ID NOs. 56 e 57 representam sequências de nucleotideo de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de gene NtLS (incluindo 5' à montante e 3' à jusante).
[086] Um polipeptideo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 9 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotideo representada pela SEQ ID NO. 10. Um polipeptideo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 11 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotideo representada pela SEQ ID NO. 12. Estes polinucleotídeos são, cada, cDNA de gene NtBll demonstrado nos Exemplos descritos a seguir. A SEQ ID NO. 10 representa uma sequência de cDNA de gene NtBll de um genoma S. A SEQ ID NO. 12 representa uma sequência de cDNA de gene NtBll de um genoma T. As SEQ ID NOs. 25 e 26 representam sequências de nucleotideo de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de gene NtBll. As SEQ ID NOs. 58 a 61 representam sequências
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27/135 de nucleotídeo de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de gene NtBll (incluindo 5' à montante e 3' à jusante).
[087] Um polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 13 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO. 14. Um polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 15 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO. 16. Estes polinucleotídeos são, cada, cDNA de #15360 demonstrado nos Exemplos descritos a seguir. A SEQ ID NO. 14 representa uma sequência de cDNA de #15360 de um genoma S. A SEQ ID NO. 16 representa uma sequência de cDNA de #15360 de um genoma T. As SEQ ID NOs. 27 e 28 representam sequências de nucleotídeo de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de #15360. As SEQ ID NOs. 62 e 63 representam sequências de nucleotídeo de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de #15360 (incluindo 5' à montante e 3' à jusante).
[088] Um polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 17 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO. 18. Um polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 19 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO. 20. Estes polinucleotídeos são, cada, cDNA de #07437 demonstrado nos Exemplos descritos a seguir. A SEQ ID NO. 18 representa uma sequência de cDNA de #07437 de um genoma S. A SEQ ID NO. 20
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28/135 representa uma sequência de cDNA de #07437 de um genoma T. As SEQ ID NOs. 29 e 30 representam sequências de nucleotideo de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de #07437.
[089] Acredita-se que o gene #07437 é, devido à homologia da sequência, um gene o qual deve ser classificado como CUC. Para os genes CUC na Arabídopsís thalíana, três genes CUC, CUC1 a CUC3, foram reportados. É também conhecido que uma pluralidade de mutações acumuladas mostra um efeito maior em um fenótipo de um mutante do que uma única mutação. Os inventores da presente invenção isolaram cinco genes como genes de família do tabaco, outros além do #07437. Esperase que estes genes de família produzam um grande efeito quando sendo usados junto com #07437.
[090] Na planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção, uma abundância do polipeptídeo específico acima descrito é preferencialmente diminuído. Especificamente, a abundância é diminuída através da mutação, rompimento, ou expressão suprimida de um gene que codifica o polipeptídeo de tipo selvagem.
[091] A mutação do gene ou o rompimento de gene ocorre como um resultado de, por exemplo, mutação espontânea, tratamento mutagênico, edição do genoma ou nocaute do gene. A mutação espontânea do gene, em geral, ocorre devido a (i) erros de replicação e (ii) danos ao gene. A causa de danos é, por exemplo, exposição a mutagênicos publicamente conhecidos, de ocorrência natural ou mutagênicos publicamente conhecidos os quais foram produzidos artificialmente e, então, permaneceram em um ambiente natural (por exemplo, radiação, raios ultravioletas, ou substâncias que induzem a mutação (tais como EMS)). O gene
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29/135 pode ser submetido a um tratamento mutagênico por artificialmente fazer com que o mutagênico tenha efeito em uma planta de tabaco (se necessário, em combinação com a supressão de um gene com função de reparo) . A recombinação do gene pode ser realizada pela recombinação homóloga de todos ou parte de um gene alvo com uma sequência recombinante de acordo com um método de recombinação genética publicamente conhecido. A edição do genoma do gene pode ser realizada por uma técnica publicamente conhecida (por exemplo, nucleases dedo de zinco: ZFN, nucleases efetoras do tipo ativadoras da transcrição: TALEN, e sistema CRISPR/Cas9). 0 nocaute do gene pode ser realizado por (1) transferência do gene com o uso de uma transposase publicamente conhecida ou (ii) introdução de um T-DNA.
[092] Como descrito acima, uma planta de tabaco, em muitos casos, apresenta dois 2 conjuntos de genes em cada um do genoma T e do genoma S. Sendo assim, a fim de desaparecer completamente com as funções dos genes, é necessário prejudicar as funções de todos os (quatro) genes no genoma T e no genoma S. No entanto, em um caso em que um efeito de dosagem é exibido, as funções dos genes podem ser suprimidas mesmo se as funções de todos os no genoma T e no genoma S não sejam prejudicadas.
[093] Em um caso em que as funções são prejudicadas pela substituição, a substituição pode estar presente em pelo menos um dos seguintes: uma sequência promotora (tal como uma sequência à montante (extremidade 5') e uma sequência à jusante (extremidade 3') com a região codante como uma referência) , uma região não traduzida 5' e uma região não traduzida 3' , uma sequência conservada (5'GT
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AG3') presente em ambas as extremidades de um intron, e uma região codante. Espera-se que, em um caso em que a substituição ocorre à sequência de nucleotídeos (uma sequência promotora, uma região não traduzida 5' e uma região não traduzida 3') as quais são importantes para a regulação da atividade de transcrição dos genes, a quantidade de produto transcrito dos genes, a qual depende da atividade de transcrição e estabilidade dos genes, diminuições, de modo que a quantidade de proteínas diminua. Em um caso em que a substituição ocorre a uma sequência conservada de um intron, a divisão não ocorre normalmente, de modo que o intron possa ser traduzido adicionalmente. Espera-se que as proteínas apresentando sequências de aminoácido diferentes das sequências originais são, sendo assim, geradas pela translação devido deslocamento de fase. Espera-se que, em casos em que a substituição ocorre a uma região codante, por exemplo, substituição dentro de um códon de parada o qual não codifica um aminoácido (mutação sem sentido) causa a tradução em uma proteína apresentando um lado de C terminal diminuído de modo a apresentar um comprimento incompleto, de modo que uma função é prejudicada. Enquanto uma posição na qual uma mutação sem sentido ocorre não está limitada desde que uma proteína de comprimento completo não é gerada, é preferível que o comprimento é diminuído por diversos aminoácidos iguais ou mais longos.
[094] Alternativamente, espera-se que a substituição de uma sequência de aminoácido faça com que a função de uma proteína diminua. Também se espera que a substituição de uma sequência de aminoácido resulte em (i) uma mudança de uma estrutura terciária e (ii) uma mudança de um aminoácido o
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31/135 qual é importante para uma função. A substituição não conservativa faz facilmente com que a diminuição na função, e é, dessa forma, preferível como substituição de um aminoácido. Exemplos de substituição não conservativa abrangem (i) substituição de um aminoácido por outro aminoácido apresentando uma diferente carga elétrica ou uma diferente hidrofobicidade (por exemplo, substituição de um aminoácido básico por um aminoácido ácido ou substituição de um aminoácido polar por um aminoácido apoiar) e (ii) substituição de um aminoácido por outro aminoácido apresentando um diferente volume (tamanho tridimensional) em uma cadeia lateral.
[095] No caso de uma mutação que não seja substituição tal como deleção e inserção, espera-se que a mutação, a qual ocorreu dentro de uma sequência promotora, uma região não traduzida 5' e uma região não traduzida 3' , cause uma diminuição na atividade de transcrição e estabilidade como no caso da substituição, de modo que (i) a quantidade de produto transcrito é reduzida e (ii) a quantidade de proteína é reduzida. Em uma sequência conservada de um intron, também se espera que, como no caso da substituição, proteínas apresentando sequências de aminoácido diferentes das sequências originais sejam geradas por tradução. Espera-se que a mutação, a qual ocorreu em uma região codante, faça com que proteínas, as quais apresentam sequências de aminoácido diferentes das sequências originais, sejam geradas por tradução, a diferença na sequência de aminoácidos ocorrendo devido a (i) deleção ou inserção de um resíduo de aminoácido (causado pela deleção ou inserção de nucleotídeos consecutivos os quais são múltiplos de 3) ou (ii)
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32/135 deslocamento de fase. Nos casos em que uma grande deleção do gene em si total ou uma inserção de um grande fragmento, também se espera que a expressão do gene pode ser completamente perdida.
[096] Um indivíduo, o qual foi gerado como um resultado da mutação do gene ou rompimento de gene, é aqui chamado de mutante (aqui simplesmente referido como mutante) de uma planta de tabaco. O mutante pode apresentar a mutação em qualquer de um genoma S ou um genoma T, e preferencialmente apresenta a mutação em ambos o genoma S e o genoma T. Note que (i) uma única mutação ou uma pluralidade de mutações podem ocorrer em um único gene e (ii) o tipo de mutação para prejudicar uma função não está limitado. O total de quatro genes, os quais incluem dois genes em um genoma S e dois genes em um genoma T, podem apresentar mutações idênticas ou mutações diferentes.
[097] Exemplos de supressão da expressão do gene abrangem (i) supressão da transcrição do gene para um RNAm, (ii) supressão (por exemplo, degradação do RNAm) da tradução do gene em uma proteína através de um RNAm e (iii) supressão da função da proteína a qual é gerada por translação. A supressão da transcrição pode ser alcançada por, por exemplo, (i) inibição de um fator de transcrição o qual promove a transcrição do gene ou (ii) inibição do acesso de um fator de início de transcrição para o gene. A supressão da tradução pode ser alcançada pelo uso de uma molécula de RNA antissenso (antisense) , uma molécula de RNAi, ou uma molécula de cosupressão. A supressão da função da proteína pode ser alcançada por uma molécula a qual inibe a função de uma proteína funcional pela ligação à proteína funcional.
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Exemplos de tal molécula abrange ácido nucleico chamariz (decoy), ribozima, anticorpo e peptideo inibidor.
[098] As diversas mutações descritas acima podem ser facilmente introduzidas em uma planta de tabaco por um técnico no assunto o qual tenha sido referido a, por exemplo, (i) quaisquer das seguintes sequências de genoma de genes publicamente conhecidas e (ii) sequências de genoma dos genes representadas pela SEQ ID NOs. 54 a 63. Especificamente, com base nos pedaços de informação de sequência, é possível determinar, de formar adequada, uma região a qual está presente em um genoma de quaisquer das diversas plantas de tabaco abrangidas no escopo da presente invenção e na qual uma mutação deve ser introduzida.
[099] NtREV: (genoma S) acesso ao Sol Genomics Network (SOL) # Ntab-K326_AWQJ-SS17907 e (genoma T) acesso ao SOL # Ntab-K326_AWOJ-SS9429 [100] NtLS: (genoma S) acesso ao SOL # Ntab-K326_AWOJSS1238 e (genoma T) acesso ao SOL # Ntab-K326_AWOJ-SS5309 [101] NtBll: (genoma S) acesso ao SOL # Ntab-K326_AWOJSS18396 e (genoma T) acesso ao SOL # Ntab-K326_AWOJ-SS12956 [102] #15360: (genoma S) acesso ao SOL # NtabK326_AWOJ-SS587 e (genoma T) acesso ao SOL # Ntab-K326_AWOJSS20471
| tios: | ] #07437: (genoma S) | acesso a | o | SOL # | Ntab- |
| K32 6_AWOJ· | -SS943 e (genoma T) | acesso | ao | GeneBank # | |
| AYMY01348769.1, AWOKO1667329.1 e | ASAG010524 | 65. | 1. | ||
| [104: | ] A supressão acima | descrita ( | :da | transcrição, | |
| tradução | e função da proteína) | podem ser | alcançadas | , por | |
| exemplo, | (i) pela introdução direta das | moléculas | para | ||
| alcançar | a supressão dentro de | uma planta | ou (ii) | pela |
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34/135 expressão das moléculas as quais são expressas a partir de genes em um vetor introduzido dentro de uma planta por transformação. Na transformação da planta, o gene alvo para a expressão das moléculas necessita apenas ser integrado com qualquer região de um genoma da planta, e não necessariamente necessitam ser integrados com ambos um genoma S e um genoma T.
[105] A planta de tabaco não está limitada a qualquer particularidade desde que a planta de tabaco seja uma planta Nícotíana a qual não está limitada a qualquer particularidade desde que a planta Nícotíana seja uma planta que pertence a Nícotíana. Exemplos da planta de tabaco abrangem Nícotíana acaulis, Nícotíana acuminata, Nícotíana acuminata var.
muítzjíora, Nícotíana africana, Nícotíana alata, Nícotíana amplexicauíis, Nícotíana arentsii, Nícotíana attenuata, Nícotíana benavidesii, Nícotíana benthamiana, Nícotíana bígelovii, Nícotíana bonariensis, Nícotíana cavicola, Nícotíana clevelandii, Nícotíana cordifolia, Nícotíana corymbosa, Nícotíana debneyi, Nícotíana excelsior, Nícotíana forgetiana, Nícotíana fragrans, Nícotíana glauca, Nícotíana glutinosa, Nícotíana goodspeedii, Nícotíana gossei, Nícotíana ingulba, Nícotíana kawakamii, Nícotíana knightiana, Nícotíana langsdorfi, Nicotianuma linearis, Nícotíana longiflora, Nícotíana marítima, Nícotíana megalosiphon, Nícotíana miersii, Nícotíana noctíflora, Nícotíana nudícaulís, Nícotíana obtusífolia, Nícotíana occidentalís, Nícotíana occidentalis subsp. Hesperis, Nícotíana otophora, Nícotíana paniculata, Nícotíana pauczjlora, Nícotíana petunioides, Nícotíana plumbagini folia, Nícotíana quadrívalvís, Nícotíana
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35/135 raimondii, Nicotiana repanda, Nicotiana rosulata, Nicotiana rosulata subsp. Ingulba, Nicotiana rotundifolia, Nicotiana rustica, Nicotiana setchellii, Nicotiana simulans, Nicotiana solanifolia, Nicotiana spegauinii, Nicotiana stocktonii, Nicotiana suaveolens, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana thyrsi flora, Nicotiana tomentosa, Nicotiana tomentosifomis, Nicotiana trigonophylla, Nicotiana umbratica, Nicotiana undulata, Nicotiana velutina, Nicotiana wigandioides e um híbrido de plantas Nicotiana. Dentre estas plantas Nicotiana, Nicotiana benthamiana, Nicotiana rustica e Nicotiana tabacum são mais preferidas. Nicotiana rustica e Nicotiana tabacum, as quais são usadas como materiais para produzir folhas de tabaco, são particularmente preferidas.
[106] Em adição à ação acima, a planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção apresenta uma característica em que a posição de um broto axilar primário muda a partir da base de uma folha. Isto causa praticidade no local de cultivo efetivo em que os brotos axilares podem ser removidos sem danificar as folhas. Em conjunto com essa praticidade, a planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é preferencialmente configurada de modo que o genoma seja introduzido com uma mutação que cause supressão de uma função de um gene contendo, como uma região codante, um polinucleotídeo que codifica qualquer um de: um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 5 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 7; e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com
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36/135 uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 9 e um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 11.
[107] A supressão da função é preferencialmente supressão do desenvolvimento de um broto axilar. Em adição, como demonstrado nos Exemplos descritos a seguir, a planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é particularmente preferencialmente um mutante no qual a mutação é introduzida dentro de NtBll e NtLS.
Método para a fabricação da planta de tabaco[2] [108] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para a fabricação de uma planta de tabaco. O método inclui uma etapa de introdução de uma mutação que causa a supressão de uma função de um gene contendo, como uma região codante, um polinucleotídeo que codifica quaisquer dos polipeptídeos específicos descritos acima.
[109] A etapa de introdução resultados na supressão do desenvolvimento de brotos axilares através da supressão funcional do gene, a qual é causada pela mutação. A supressão do desenvolvimento de brotos axilares através da supressão funcional do gene é realizada como destacado acima. Sendo assim, como exemplos concretos de realização da etapa de introdução, a seguinte descrição irá discutir a supressão da expressão do gene e introdução de uma mutação dentro de um gene, as quais são realizadas através da transformação de uma planta de tabaco com uso de um vetor.
[110] O vetor a ser usado para a transformação de uma planta de tabaco para fins de supressão da expressão do gene ou a introdução da mutação dentro de um gene não está
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37/135 limitada a qualquer particularidade, desde que um polinucleotideo inserido dentro do vetor possa ser expresso em uma célula vegetal. Exemplos de vetores adequados abrangem vetores pBI, pPZP e pSMA cada um dos quais permite a introdução de um polinucleotideo alvo dentro de uma célula vegetal por meio de Agrobacteríum. Em particular, plasmídeos de vetores binários (por exemplo, pBIG, pBIN19, pBHOl, pBI121, pBI221 e pPZP202) são preferíveis.
[111] Nos casos em que a supressão da expressão do gene é alcançada por RNAi, uma sequência de partida, a qual é usada pelo RNAi para suprimir a expressão do gene alvo, é inserida no vetor. Exemplos da sequência de partida abrangem (i) um polinucleotideo (porção RNA senso (sense)) a qual é (a) uma parte de um polinucleotideo (a qual pode apresentar uma substituição de 0,1 % a 1 %) que codifica um polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ou 19 ou uma parte de um polinucleotideo (a qual pode apresentar uma substituição de 0,1 % a 1 %) apresentando SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20 e (b) representada por uma sequência de nucleotideo de pelo menos 21 a 30 bases consecutivas (por exemplo, 21 ou mais bases, 22 ou mais bases, 23 ou mais bases, 24 ou mais bases, 25 ou mais bases, 26 ou mais bases, 27 ou mais bases, 28 ou mais bases, 29 ou mais bases e 30 ou mais bases) e (ii) um polinucleotideo (porção RNA antissenso(antisense) ) representada por uma sequência de nucleotideo a qual é complementar ao polinucleotideo (i) . Mais especificamente, a sequência de nucleotideo de pelo menos 21 a 30 bases consecutivas descritas acima significam uma sequência de nucleotideo de
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38/135 ou mais bases consecutivas, 23 ou mais bases consecutivas, ou mais bases consecutivas, 30 ou mais bases consecutivas, ou mais bases consecutivas, 40 ou mais bases consecutivas, ou mais bases consecutivas, 50 ou mais bases consecutivas, ou mais bases consecutivas, 70 ou mais bases consecutivas, ou mais bases consecutivas, 90 ou mais bases consecutivas ou 100 ou mais bases consecutivas.
[112] Como descrito acima, a supressão da expressão do gene na planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é preferencialmente geneticamente herdada. Sendo assim, a sequência de partida é preferencialmente integrada ao genoma de uma planta de tabaco.
[113] A introdução de uma mutação dentro de um gene de uma planta de tabaco pode ser alcançada por uma técnica de edição do genoma publicamente conhecida. Exemplos da técnica de edição do genoma abrangem o sistema CRISPR / Cas9, TALEN e ZFN. De acordo com o sistema CRISPR / Cas9, a edição do genoma é possível se os RNAs guia e uma proteína Cas9 estão presentes em uma célula alvo. De acordo com TALEN e ZFN, a edição do genoma é possível se uma proteína de fusão (na qual os domínios de ligação do DNA e nuclease são fundidos) está presente em uma célula alvo. Sendo assim, os RNAs guia, as proteínas Cas9 e as proteínas de fusão podem ser diretamente introduzidas dentro de uma célula alvo. Exemplos de um método de introdução direta de quaisquer desses dentro de uma célula alvo abrangem o método PEG, um método de eletroporação e um método de bombardeamento de partículas.
[114] De acordo com o sistema CRISPR / Cas9, (i) uma sequência, a qual é complementar a uma sequência de nucleotideo localizada imediatamente à montante de XGG em um
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39/135 genoma, forma um par de base com parte de um RNA guia e (ii) um DNA genômico de dupla fita é cortado por Cas9 na sequência de nucleotídeo. Exemplos da sequência de nucleotídeo abrangem uma parte de (i) um polinucleotídeo (o qual pode apresentar uma substituição de 0,1 % a 1 %) que codifica um polipeptideo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ou 19 ou (ii) um polinucleotídeo (o qual apresenta uma substituição de 0,1 % a 1 %) apresentando SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20, cuja parte apresenta 10 ou mais bases consecutivas (por exemplo, 15 ou mais bases consecutivas, preferencialmente 17 ou mais bases consecutivas, mais preferencialmente 18 ou mais bases consecutivas, ainda mais preferencialmente 19 ou mais bases consecutivas e a mais preferencialmente 20 ou mais bases consecutivas) localizadas imediatamente à montante de XGG.
[115] De acordo com o TALEN, um par de domínios ligantes de DNA em nucleases artificiais que formam um dímero ligam, cada, a uma sequência de nucleotídeo correspondente, a qual está presente em cada terminal de um domínio de divagem Fokl de modo a estar afastado do terminal por um espaçador de 5 a 20 bases. A sequência de nucleotídeo está presente em uma e o na outra fita de DNA genômico de dupla fita. Sendo assim, um dos pares de domínios ligantes de DNA se liga a uma fita, e o outro par de domínios ligantes de DNA se liga à outra fita. O domínio ligante de DNA é composto de uma unidade de repetição (módulo) a qual inclui 33 a 34 resíduos de aminoácido. O número de módulo corresponde ao número de nucleotídeos ao qual o domínio ligante de DNA se liga. Contanto que 33 a 34 resíduos de aminoácido atuem como
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40/135 uma unidade de repetição (módulo), o domínio ligante de DNA contém módulos, o número que corresponde ao número de nucleotídeos que se ligam. A sequência de nucleotídeo a qual
| o domínio ligante de | DNA se liga | é de | 6 ou mais | bases |
| consecutivas, | preferencialmente | 10 | ou mais | bases |
| consecutivas, | e mais | preferencialmente | 18 ou mais | bases |
consecutivas, as quais estão presentes em cada terminal de um domínio de divagem Fokl de modo a estar afastado do terminal por um espaçador de 5 a 20 bases e as quais são (i) uma parte de um polinucleotídeo (o qual pode apresentar uma substituição de 0,1 % a 1 %) que codifica um polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ou 19, ou um polinucleotídeo (o qual pode apresentar uma substituição de 0,1 % a 1 %) apresentando SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 e (ii) uma parte de uma fita complementar formadora de polinucleotídeo com o polinucleotídeo acima.
[116] De acordo com ZFN, como no caso de TALEN, um par de domínios ligantes de DNA em nucleases artificiais que formam um dímero, em que cada um se ligam a um correspondente de uma sequência de nucleotídeos, a qual está presente em cada terminal de um domínio de divagem Fokl de modo a estar afastado do terminal por um espaçador de 5 a 20 bases. O domínio ligante de DNA contém uma pluralidade de módulos de dedo de zinco. A sequência de nucleotídeo é de 9 ou mais bases consecutivas, preferencialmente 12 ou mais bases consecutivas, e mais preferencialmente 18 ou mais bases consecutivas, as quais estão presentes como terminal respectivo de um domínio de divagem Fokl com um espaçador de 5 a bases entre as mesmas e as quais são (i) uma parte de
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41/135 um polinucleotídeo (o qual pode apresentar uma substituição de 0,1 % a 1 %) que codifica um polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ou 19, ou um polinucleotídeo (o qual pode apresentar uma substituição de 0,1 % a 1 %) apresentando a SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 e (ii) uma parte de uma fita complementar formadora de polinucleotídeos com o polinucleotídeo acima.
[117] As descrições de RNAi, sistema CRISPR / Cas9, TALEN e ZFN pode, cada, ser lidas de forma que, de acordo com a descrição de cada detalhe, o polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ou 19 é substituído por um polipeptídeo ortólogo o qual (i) apresenta uma identidade de sequência de 90 % ou mais com o polipeptídeo e (ii) está presente em outro tipo incluído na planta Nícotíana. Da mesma forma, a descrição do parágrafo anterior pode ser lida de modo que um polinucleotídeo apresentando SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 é substituído por um polinucleotídeo de gene ortólogo, o qual (i) apresenta uma identidade de sequência de 90 % ou mais com o polinucleotídeo e (ii) está presente em outro tipo incluído na planta Nícotíana.
[118] Como descrito acima, a mutação do gene introduzido na planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é preferencialmente geneticamente herdada. No entanto, um polinucleotídeo exógeno introduzido em uma planta de tabaco por edição do genoma é preferencialmente eliminado de uma planta de tabaco após a confirmação de que uma mutação desejada é introduzida na planta de tabaco. Nos
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42/135 casos em que o polinucleotideo exógeno é retido na planta de tabaco, uma mutação indesejada pode (continua a) ser introduzida. Isto pode fazer com que uma característica desejada (tal como a supressão de brotos axilares secundários) seja perdida, ou pode ameaçar a sobrevivência de uma planta de tabaco.
[119] A introdução de uma mutação em um gene de uma planta de tabaco pode ser alcançada através de outro método biotecnológico (por exemplo, um método no qual um transposon ou Agrobacteríum é utilizado). Exemplos concretos do método abrangem um método no qual uma planta de tabaco é introduzida com (i) retrotransposon tntl de tabaco ou transposon de outra planta ou (ii) T-DNA of TI plasmídeo of Agrobacterium.
[120] Alternativamente, a introdução de uma mutação dentro de um gene de uma planta de tabaco pode ser alcançada através de outro método (tratamento mutagênico de uma planta de tabaco). Exemplos da fonte da mutação abrangem pequenos compostos moleculares (tais como etil metano sulfonato (EMS), N-etil-N-nitrosoureia (ENU), azida de sódio) e radiações (tais como raios gama, feixes de ions pesados, raios X, feixes de nêutrons e raios ultravioleta).
[121] Uma mutação pode ser introduzida dentro de qualquer planta de tabaco regenerável. Exemplos da planta de tabaco abrangem sementes, raízes, folhas, flores, órgãos reprodutores e embriões. Um exemplo preferido é embriões.
[122] O que pode ser obtido pelos métodos acima pode ser uma população mutante de uma planta a qual apresenta diversas mutações (ou nenhuma mutação). Sendo assim, um indivíduo que exibe um fenótipo desejado pode ser, ainda, selecionado da população de mutante. Como um exemplo da
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43/135 seleção de um indivíduo, a seguinte descrição irá discutir um procedimento para a seleção de um indivíduo desejado de uma população de mutante (panei) o qual é obtido em um caso em que o tabaco é tratado com o uso de um mutagênico.
[123] Um mutante de tabaco com perda de função, o qual apresenta mutações em um total de quatro genes em um genoma T e um genoma S, pode ser obtido por, por exemplo, o seguinte método. 0 tabaco é tratado com um mutagênico como descrito acima para preparar uma população (panei) de tabacos mutantes com mutações em todo o genoma do tabaco, e DNAs genômicos são extraídos. Pelo uso de iniciadores específicos para um gene de cada um do genoma S e do genoma T, gene alvos (polinucleotídeo) são amplificados a partir do DNAs genômicos do panei. Subsequentemente, as sequências de nucleotídeo dos produtos resultado antes são determinadas e uma linhagem apresentando uma mutação de homozigose é, então, selecionada. Primeiro, uma linhagem (M2) apresentando uma mutação de homozigose em um genoma S e uma linhagem (M2) apresentando uma mutação de homozigose em um genoma T são obtidas e, então, cruzadas para obter indivíduos F1. Subsequentemente, uma progênie autofecundada (F2) é cultivada a partir de indivíduos Fl. A partir da progênie autofecundada (F2), é obtida uma linhagem apresentando mutações de homozigose em ambos um genoma S e um genoma T (tal linhagem é obtida em uma probabilidade de 1/16, uma vez que dois elementos são recessivos).
[124] 0 método para a fabricação da planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção ainda inclui a etapa de seleção, a partir da planta de tabaco produzida pela etapa de produção acima, um indivíduo no qual o número
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44/135 ou peso de brotos axilares secundários desenvolvidos após a remoção de brotos axilares primários é diminuído para 1/2 ou menos em comparação com a planta do tipo selvagem. Esta etapa de seleção é realizada com base em, por exemplo, rompimento, mutação ou expressão suprimida de genes que codifica os polipeptídeos específicos descritos acima.
[125] A mutação ou rompimento de um gene é determinada pela identificação da presença / ausência de uma mutação do gene. Um método de identificação da mutação do gene necessita permitir a determinação de presença / ausência da mutação. Exemplos do método abrangem (1) um método no qual uma sequência de DNA é diretamente codificada com o uso de um sequenciador comercialmente disponível, (2) um método no qual uma diferença na sequência é detectada por uma diferença na distância da eletroforese com o uso do método de Polimorfismo de Conformação de Fita Simples (SSCP), (3) um método no qual um Polimorfismo de Único Nucleotídeo (SNP) é detectado pelo método de Clivagem por PCR, (4) um método no qual a presença / ausência de uma mutação é identificada pela clivagem de sítio(s) incompatível(eis) com o uso de uma T7 Endonucleasel ou similares, (5) um método de Sequência Polimórfica Amplificada Clivada (CAPS) no qual a presença / ausência de uma mutação pode ser determinada pela presença / ausência de clivagem por um tratamento de enzima de restrição, (6) um método CAPS derivado (dCAPS) no qual um conjunto de iniciadores incluindo um incompatível seja intencionalmente usados de modo que a presença / ausência de uma mutação pode ser determinada pela presença / ausência de clivagem por enzimas de restrição, (7) um método (por exemplo, um método PCR no qual uma sonda TaqMan é usada,
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45/135 análise MassARRAY) na qual a presença / ausência de uma mutação é determinada pela identificação, pelo uso de uma sonda a qual especificamente hibridiza uma sequência mutante, se um sonda é ou não hibridizada e (8) um método no qual, em um caso em que a mutação é de deleção ou inserção, a mutação é detectada por uma diferença na mobilidade da eletroforese. Alternativamente, a mutação ou rompimento de um gene pode ser determinada pela detecção (por exemplo, por Western blotting) de (i) uma proteína que resulta da modificação do gene ou (ii) um nível de expressão de uma proteína de uma planta tipo selvagem.
[126] Antes da etapa descrita acima de introdução de uma mutação, os procedimentos (1 e 2) descritos abaixo são realizados como necessários de modo a determinar (i) um gene cuja expressão deve ser suprimida e / ou (ii) um gene dentro do qual uma mutação deve ser introduzida.
Isolamento do gene do tabaco o qual é previsto para regular o desenvolvimento do broto axilar [127] Um gene, o qual possivelmente regula os brotos axilares, pode ser obtido a partir de genes de tabaco pela (i) seleção de um gene de outras plantas com base em um documento do estado da técnica (por exemplo, Literatura Não Patentária na qual uma relação entre um gene e um broto axilar é confirmada) e (ii) uso, como um índice, da identidade da sequência de nucleotideo e identidade da sequência de aminoácido dos genes selecionados. Por exemplo, uma sequência de nucleotideo e uma sequência de aminoácido de um gene do tabaco ou um gene de uma espécie de planta (por exemplo, tomate) publicamente conhecidos os quais estão intimamente relacionados ao tabaco podem ser obtidos pela
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46/135 condução de uma busca em sequências registradas em um banco de dados publicamente conhecido com o uso de uma Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico (blast). Em um caso em que uma sequência publicamente conhecida é de comprimento parcial, um cDNA de comprimento completo pode ser obtido a partir da informação de sequências conhecidas por um método comum tal como (i) seleção a partir de uma biblioteca de cDNA ou (ii) método de rápida amplificação de extremidades de cDNA (Race).
[128] Um gene, o qual possivelmente regula um broto axilar de maneira nova, pode ser obtido por, por exemplo, seleção de um gene o qual é expresso de acordo com um tecido alvo ou um tratamento alvo. 0 tecido alvo e o tratamento alvo podem ser selecionados com base na informação listada abaixo. É conhecido que (i) um gene, o qual está envolvido na formação de um meristema axilar, é expresso antes da formação de um meristema axilar e (ii) um gene, o qual está envolvido na manutenção e no crescimento de um meristema axilar, é expresso no meristema axilar (por exemplo, LS, gene blind). É conhecido que um gene, o qual está envolvido na dormência ou desenvolvimento de um broto axilar, é expresso em uma quantidade aumentada ou diminuído, dependendo da dormência ou não dormência do broto axilar (por exemplo, BRANCHED1). É também conhecido que alguns hormônios de planta estão envolvidos na regulação de brotos axilares. A auxina está envolvida na dominância apical. A estrigolactona está envolvida na supressão do desenvolvimento de brotos axilares. A citocinina está envolvida no crescimento de brotos axilares. 0 ácido abscísico está envolvido na dormência.
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47/135 [129] A nova seleção de urn gene o qual possivelmente regula o desenvolvimento de um broto axilar pode ser realizado por um método comum no qual a especificidade da expressão é utilizada. Os seguintes (1) a (3) são exemplos do método. (1) Métodos tais como (a) um método no qual os dados de perfil da expressão do gene são obtidos a partir de uma sequência de nucleotideo de cDNA, (b) um método no qual uma biblioteca de cDNA de genes que são expressos em um tecido submetido é preparada e, então, uma sequência terminal é sequenciada, e (c) um método de Análise Seriada da Expressão do Gene (SAGE) no qual os fragmentos de restrição estão conectados em séries e sequenciados. (2) Um método no qual os dados de perfil da expressão do gene são obtidos por hibridização diferencial. Macro ensaios e chips de DNA são bem conhecidos. (3) Genes (Genes Diferencialmente Expressos: DEGs) os quais diferem em nivel de expressão entre uma pluralidade de amostras podem ser obtidos por um método de exibição diferencial. Exemplos abrangem um método no qual as quantidades de fragmentos de amplificação de PCR são comparadas.
Amplificação de genes isolados [130] Amplificação de um polinucleotideo pode ser realizada por Reação de Cadeia de Polimerase (PCR), porém, alternativamente, podem ser realizados, por exemplo, por Reação de Cadeia de Ligase (LCR) ou Amplificação Isotérmica Mediada por Ciclos (LAMP).
[131] Um iniciador para a amplificação de um polinucleotideo necessita apenas ser um iniciador o qual permita a amplificação especifica de um gene alvo de cada genoma dos genomas de tabaco nos quais os genes de um genoma
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S e urn genoma T são misturados. Desde que o gene alvo possa ser especificamente amplificado, uma ou mais substituições, deleções, inserções e adições podem ser incluídas. Em adição, como necessário, o iniciador pode ser marcado com, por exemplo, uma substância fluorescente ou uma radiação.
[132] A extração do DNA genômico a ser usado como um modelo de amplificação pode ser realizado publicamente por um método conhecido, e pode ser realizado pelo uso de um kit de extração comercialmente disponível. 0 DNA genômico pode ser um cruamente purificado obtido através de uma extração simples ou pode ser um purificado obtido através de uma etapa de purificação.
Identificação de gene o qual espera-se estar envolvido no desenvolvimento do broto axilar [133] Efeitos de um gene alvo podem ser confirmados pelo (i) preparo de recombinantes e mutantes nos quais as expressões e funções do gene alvo estão suprimidas e (ii) cultivo de recombinantes e de mutantes em uma estufa, um phytotron, uma tenda de rede ou um campo. Ao comparar o número e peso dos brotos axilares desenvolvidos com os controles, é possível confirmar os efeitos do crescimento e desenvolvimento de brotos axilares. Enquanto o número e o peso dos brotos axilares podem ser obtidos sem a realização de poda, o número e o peso dos brotos axilares são preferencialmente obtidos enquanto (i) os brotos axilares estão em um estado de não dormência devido à poda e (ii) o desenvolvimento dos brotos axilares está sendo assim promovidos. 0 exame do número e peso dos brotos axilares pode ser realizado uma vez ou mais do que uma vez em qualquer estação. Uma medida única permite a avaliação de brotos
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49/135 axilares primários, porém não é adequada para avaliações de brotos axilares secundários e brotos axilares terciários. Sendo assim, é preferível realizar a medida uma pluralidade de vezes. A fim de confirmar os efeitos dos brotos axilares secundários e brotos axilares terciários, é preferível remover os brotos axilares primários e brotos axilares secundários, respectivamente. Enquanto a remoção dos brotos axilares primários e brotos axilares secundários pode ser realizada após o desenvolvimento dos mesmos, é preferível não deixar brotos axilares remanescentes. É preferível remover brotos axilares quando a extensão dos brotos dos brotos axilares é confirmada. Em um caso em que os exames são realizados uma pluralidade de vezes, é preferível examinar separadamente os brotos axilares primários, os brotos axilares secundários, e os brotos axilares terciários. Por exemplo, é possível realizar um método de (i) separadamente, contar os respectivos números de brotos axilares primários, brotos axilares secundários e brotos axilares terciários, uma vez a cada semana, (ii) coletar os brotos axilares primários, os brotos axilares secundários e os brotos axilares terciários e (iii) examinar os respectivos pesos dos brotos axilares primários, os brotos axilares secundários e os brotos axilares terciários.
[134] 0 exame pode ser realizado com foco apenas nos brotos axilares específicos (por exemplo, galhos secundários) ou o exame pode ser realizado de modo que o exame com foco apenas no número de brotos axilares e exame com foco apenas no peso são realizados separadamente. Em tais casos, é preferível que um número adequado de vezes de exames e intervalos adequados entre os exames sejam
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50/135 determinados de acordo com cada exame.
Método para seletívamente suprimir os brotos axilares secundários da planta de tabaco[3] [135] Em um aspecto, a presente invenção fornecer um método para seletivamente suprimir brotos axilares secundários de uma planta de tabaco. A supressão seletiva de brotos axilares secundários ocorre como um resultado da introdução de uma mutação a qual causa a supressão da função de um gene contendo, como uma região codante, um polinucleotídeo que codifica quaisquer dos polipeptídeos específicos descritos acima em uma planta de tabaco. Deve ser notado que a supressão funcional acima é para suprimir o desenvolvimento de brotos axilares. Especificamente, a supressão funcional ocorre em uma planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção. No método para a fabricação da planta de tabaco de acordo com outro aspecto da presente invenção, a supressão funcional ocorre em uma planta de tabaco durante a etapa de produção da planta de tabaco. Sendo assim, para detalhes do método que faz com que a supressão funcional ocorra em uma planta de tabaco, uma referência pode ser feita às descrições anteriores em relação ao método para a fabricação da planta de tabaco.
[136] Com as modalidades acima consideradas juntas, a presente invenção pode ser sumarizada como segue.
[137] Especificamente, uma planta de tabaco na qual uma mutação é introduzida no genoma, em que a mutação causa a supressão funcional de um gene contendo, como uma região codante, um polinucleotídeo que codifica quaisquer dos seguintes polipeptídeos (1) a (5):
1) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma
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51/135 identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 3;
2) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 5 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 7;
3) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 9 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 11;
4) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 13 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 15; e
5) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 17 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 19, a supressão funcional suprimindo o desenvolvimento de brotos axilares.
[138] De acordo com a planta de tabaco, a supressão funcional preferencialmente suprime o desenvolvimento de todos os brotos axilares, brotos axilares secundários os
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52/135 quais se desenvolvem após a remoção de brotos axilares primários.
[139] De acordo com a planta de tabaco, a supressão funcional preferencialmente causa a diminuição do número ou peso dos brotos axilares secundários para não mais do que 1/2 daqueles da planta de tipo selvagem.
[140] De acordo com a planta de tabaco, a supressão funcional é preferencialmente uma diminuição em abundância do polipeptídeo em comparação com uma planta do tipo selvagem.
[141] De acordo com a planta de tabaco, a supressão funcional é preferencialmente uma diminuição em uma quantidade de tradução do polipeptídeo em comparação com uma planta do tipo selvagem.
[142] De acordo com a planta de tabaco, a supressão funcional é preferencialmente uma diminuição em uma quantidade de transcrição do gene para um RNAm em comparação com uma planta do tipo selvagem.
[143] De acordo com a planta de tabaco, a supressão funcional é preferencialmente a promoção da degradação de um RNAm transcrito de um gene.
[144] De acordo com a planta, a mutação é preferencialmente introduzida dentro do gene.
[145] De acordo com a planta de tabaco, a mutação é preferencialmente introduzida por mutação espontânea, tratamento mutagênico, edição do genoma ou nocaute do gene.
[146] De acordo com a planta de tabaco, a mutação é preferencialmente inserção, dentro de uma região externa na qual o gene está presente, de um polinucleotídeo que expressa um fator o qual promove a degradação do RNAm.
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53/135 [147] De acordo com a planta de tabaco, o fator é preferencialmente uma molécula de RNA antissenso(antisense), uma molécula de RNAi ou uma molécula de co-supressão.
[148] A planta de tabaco preferencialmente pertence a Nicotiana tabacum ou Nicotiana rustica.
[149] Um método para a fabricação de uma planta de tabaco, incluindo a etapa de:
(a) Introduzir uma mutação que causa a supressão funcional de um gene contendo, como uma região codante, um polinucleotídeo que codifica quaisquer dos seguintes polipeptídeos (1) a (5):
1) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 3;
2) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 5 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 7;
3) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 9 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 11;
4) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 13 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com
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54/135 uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 15; e
5) pelo menos um de um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 17 e um polipeptideo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 19, a supressão funcional suprimindo o desenvolvimento de brotos axilares.
[150] O método preferencialmente ainda inclui a etapa de: (b) selecionar, a partir de indivíduos produzidos pela etapa (a) , um indivíduo no qual o desenvolvimento de todos os brotos axilares, brotos axilares secundários que se desenvolvem após a remoção de brotos axilares primários é suprimido.
[151] De acordo com o método, na etapa (b), um indivíduo, no qual o número ou peso dos brotos axilares secundários é diminuído em comparação com àquele de uma planta do tipo selvagem, é preferencialmente selecionado.
[152] De acordo com o método, a etapa (a) preferencialmente inclui introduzir a mutação dentro do gene.
[153] De acordo com o método, a etapa (a) é preferencialmente realizada por mutação espontânea, tratamento mutagênico, edição do genoma ou nocaute do gene.
[154] De acordo com o método, a etapa (a) preferencialmente inclui a inserir, dentro de uma região externa na qual o gene está presente, um polinucleotídeo que expressa um fator o qual promove a degradação de um RNAm transcrito do gene.
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55/135 [155] De acordo com o método, o fator é preferencialmente uma molécula de RNA antissenso(antisense), uma molécula de RNAi ou a molécula de co-supressão.
[156] Os descendentes ou uma progênie criada, na qual: os descendentes são de (i) uma planta de tabaco ou (ii) uma planta de tabaco produzida pelo método acima; e a progênie criada é obtida pelo cruzamento de (i) uma planta de tabaco ou (ii) uma planta de tabaco produzida pelo método acima.
[157] Uma folha de tabaco colhida da (i) planta de tabaco acima, (ii) uma planta de tabaco produzida pelo método acima ou (iii) os descendentes acima ou a progênie criada acima.
[158] A descrição a seguir irá discutir detalhes da modalidade da presente invenção com referência aos Exemplos. A presente invenção não está, claro, limitada aos Exemplos abaixo e particularidades podem apresentar diversos aspectos. Ainda, a presente invenção não está limitada às modalidades, porém pode ser alterada por um técnico no assunto dentro do escopo das reivindicações. Uma modalidade derivada da combinação adequada de meios técnicos revelados em relação a diferentes modalidades está também abrangida no escopo técnico da presente invenção. Além disso, todas as literaturas descritas neste relatório são aqui incorporadas por referência.
EXEMPLOS
Gene candidato envolvido no desenvolvimento de brotos axilares de tabaco[1] [159] Candidatos do tabaco ortólogo de uma pluralidade de genes (Revolutla (REV) de Arabidopsis thaliana, Lateral suppressor (LS) de tomate e Blind (Bl) de tomate) envolvidos
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56/135 no desenvolvimento de brotos axilares de outras plantas (tais candidatos são aqui simplesmente referidos como grupo candidato A) foram determinados por uma análise com Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico (blast). Enquanto isso, candidatos dos genes envolvidos no desenvolvimento de brotos axilares em uma planta de tabaco (tais candidatos são aqui simplesmente referidos como grupo candidato B) foram determinados por análise de transcriptoma. Os genes, os quais foram obtidos com base nas análises e os resultados das análises, serão descritos abaixo.
Grupo candidato A[l-1]
Análise blast(a) [160] Com uma sequência de aminoácido do gene REV de Arabidopsis thaiiana atuando como consulta, a busca tblastn foi realizada em uma página da web da NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Como um resultado, as sequências do gene homologo REV do tomate apresentando uma alta identidade de sequência de aminoácido de 80 % foram obtidas. Com uma sequência de aminoácido do gene homologo REV do tomate atuando como uma consulta, a busca tblastn foi conduzida em relação aos resultados da análise do Marcador de Sequência Expressa (EST) da biblioteca de cDNA (derivada de uma mistura de folhas, broto apical e raízes de Tsukuba No. 1) . Como um resultado, o grupo clone de cDNA REV putativo de tabaco foi selecionado.
[161] A sequência de cDNA do tabaco apresentando uma identidade de sequência de aminoácido de 87 % com o gene LS do tomate foi registrada em um Banco de Dados público (número de acesso: EU935581). Além disso, uma sequência EST de tabaco
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57/135 (número de acesso: AM848584) apresentando uma alta identidade com EU935581 foi registrada em um Banco de Dados público.
[162] Com uma sequência de aminoácido do gene Bi de tomate atuando como consulta, a busca tblastn foi realizada em relação aos resultados da análise de EST da biblioteca de cDNA (derivada de uma mistura de folhas, broto apical e raízes de Tsukuba No. 1). Como um resultado, o grupo do clone Bi putativo de tabaco foi selecionado.
Preparo de fragmentos DNA genômico e cDNA derivados de indivíduos (derivado de RNA total) (b) [163] Fragmentos de DNA genômico foram extraídos de folhas de tabaco (Tsukuba No. 1 ou Petit Havana SR-1 (SR-1)) de acordo com um método de extração simples ou um método CTAB. 0 método CTAB é publicamente conhecido e, sendo assim, não será descrito em detalhes. 0 método de extração simples foi realizado de acordo com o seguinte procedimento. Um segmento de folha, o qual foi posicionado em 0,3 ml a 0,5 ml de tampão de extração (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 0,4 M NaCl, 25 mM EDTA e 0,5 % SDS), foi triturado (2500 rpm, 1 minuto) com o uso de um dispositivo de trituração (por exemplo, Multi Beads Shocker (Yasui Kiki Corporation) ou Shake Master Neo (Bio Medical Science)). Um sobrenadante é obtido a partir de um homogenato após a trituração. Então, os fragmentos de DNA genômico são purificados do sobrenadante através da precipitação com etanol.
[164] 0 RNA total foi extraído como segue. Um broto apical, uma muda e um broto axilar de tabaco foram, cada, imersos em RNAlater (Ambion) e, então, criopreservados. Então, uma amostra foi fundida e, então, 0,5 ml de um tampão
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RTL (QIAGEN) , ao qual 20 μΐ de 1 M DTT foi adicionado, foi adicionado à amostra fundida. Uma mistura resultante foi triturada (2500 rpm, 1 minuto) com o uso de Multi Beads Shocker (Yasui Kiki Corporation). O homogenato após a trituração foi submetido à separação por centrífuga (15000 rpm, 10 minutos), de modo que um sobrenadante tenha sido obtido. A partir do sobrenadante, o RNA total foi purificado com o uso de Magtration (Precision System Science Co., Ltd.) ou kit RNeasy (QIAGEN), na presença de DNase.
[165] A partir do RNA total, o cDNA foi preparado com o uso de quaisquer dos seguintes kits de acordo com o manual incluído no kit.
- Kit de síntese da primeira fita de cDNA PrimeScript II (Takara-Bio Inc.)
- Kit de reagentes PrimeScript RT com gDNA Eraser (Takara-Bio Inc.)
Produção de genes do grupo candidato A(c) [166] Por RT-PCR no qual o cDNA obtido em (b) foi usado como modelo, três genes foram amplificados. Em um caso em que a DNA polimerase PrimeSTAR Max (Takara-Bio Inc.) foi usada como uma enzima, as condições reacionais foram definidas como segue.
- 30 segundos a 94 °C
- 30 ciclos a 40 ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98 °C, 5 segundos a 55 °C e 10 segundos a 72 °C
- 10 segundos a 72 °C* *Uma reação de extensão a 72 °C foi definida por 10 segundos por kb do comprimento de um fragmento de amplificação.
[167] Em um caso em a DNA polimerase Tks Gflex (TakaraBio Inc.) foi usada como uma enzima, as condições reacionais
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59/135 foram definidas como segue.
- 30 segundos a 94 °C
- 30 ciclos a 40 ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98 °C, 15 segundos a 55 °C e 60 segundos a 68 °C
- 60 segundos a 68 °C* *Uma reação de extensão a 68 °C foi definida por 60 segundos por kb do comprimento de um fragmento de amplificação.
[168] Combinações de um gene alvo e um iniciador para RT-PCR são como segue.
(Conjunto 1: NtLS, genoma T, muda de Tsukuba No.
D
Combinação de LS_Tom_Fl: AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC e
NtLS_qRVl: ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT
Combinação de LS2_F2: ACACCTAATGCATCATCTAATGTT e LS_Syl_Rl: CAAATAAAGATTAAGTTCAGGATCTG (Conjunto 2: NtLS, genoma S, muda de Tsukuba No.
D
Combinação de LS_F2_seq: ATTTCCCCTCCTCCATCATTG e
NtLS_qRVl: ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT
Combinação de LS1_F2: CTTGACACCATCTAATGTTGTTG e
LS_Tom_Rl: CAAATAAAGATTAAGTTCAGGATCTG (Conjunto 3: NtREV, genoma T, muda de Tsukuba No. 1)
Combinação de REV_RT_F2: AAGCTGTTTGCAGGGAATATATC e G053330_RV3: TCTCTGGCTAAATGTTCGAAG
Combinação de REV_RT_F3: GTAAGTTGTGAGTCTGTGGTAACTAC e REV_RT_R1: GGAAACAAACATCTGCACTCAA (Conjunto 4: NtBl, genoma S, muda de Tsukuba No.
D
Combinação de Bll_Flseq2: GTCCATCTGTCTATATAGGTAGAATG e
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B11-2_RT_R1: TGAATCTTCTTGGCAACCCCC (Conjunto 5: NtREV, genoma S, broto axilar de SR-1) Ns_in0_F1: TTGTTTGGGATTTTGGGGTTTGAGGG e REV_S_R1:
AAT T GTAT GGCCAAGT GGCAT TAT TAT C T GA
REV_S_F1: CACTTCCGTTCCTCTTTCACCGCTG e NtREV_S_RVl:
TCCGTTCAACTGTGTTCCTGG (Conjunto 6: NtREV, genoma T, broto axilar de SR-1)
REV_RT_F2: AAGCTGTTTGCAGGGAATATATC e NtREVl_RVl:
TCCGTTCAACTGTGTTCCTG (Conjunto 7: NtLS, genoma S, broto axilar de SR1)
Combinação de LS_Tom_Fl: AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC e LS_Tom_Rl: CAAATAAAGATTAAGTTCAGGATCTG (Conjunto 8: NtLS, genoma T, broto axilar de SR1)
Combinação de LS_Tom_Fl: AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC e LS2-F2compR: AACATTAGATGATGCATTAGGTGT
Combinação de LS2-F2: ACACCTAATGCATCATCTAATGTT e LS_Syl_Rl: TTGGCCTCTAATTAAATAGACTGATA.
[169] Para o PCR genômico no qual o fragmento de DNA genômico obtido em (b) foi usado como um modelo, três genes foram amplificados. Uma vez que as enzimas usadas e as condições reacionais para as enzimas são similares àquelas para o RT-PCR, combinações de um gene alvo e um iniciador são como segue.
(Conjunto 1: NtREV, genoma S, folhas de Tsukuba No. 1)
Combinação de REV_F3: TCTCAAAGCTGGCTGTTTTATGTAT e
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REV_R14: TACCATTCTCCAGGGTGGTTGTGTAT
Combinação de Ns_in4_Fl: GAAAATTCAGTATTGCCATGTC e G053330_RV2: GCAAAAACTAGTTCAGAACA
Combinação de NtREV_TrFW2: CACCGCCTATGTAGCTTCGTCAATG e NtREV_RT-Rl: GGAAACAAACATCTGCACTCAA (Conjunto 2: NtREV, genoma T, folhas de Tsukuba No. 1)
Combinação de REV_F3: TCTCAAAGCTGGCTGTTTTATGTAT e REV_R14: TACCATTCTCCAGGGTGGTTGTGTAT
Combinação de Nt_in4_Fl: AAAAAAATTCAGTATTGCCACGTGC e G053330_RV2: GCAAAAACTAGTTCAGAACA
Combinação de NtREV_TrFW2: CACCGCCTATGTAGCTTCGTCAATG e NtREV_RT-Rl: GGAAACAAACATCTGCACTCAA (Conjunto 3: NtLS, genoma S, folhas de Tsukuba No. 1)
Combinação de LS_Fl_seq: AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC e LS_TRV_R3: TCGCTTGATTAGCAGTCAGC
LS_Fl_seq: AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC e NtLS_QPCR_RVl: ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT
Combinação de LS_TRV_F3: CACCGAAGAAACTGATGATCAACGG e LS_TRV_R2: GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAG (Conjunto 4: NtLS, genoma T, folhas de Tsukuba No. 1)
Combinação de LS_F2_seq: ATTTCCCCTCCTCCATCATTG e NtLS_QPCR_RVl: ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT
Combinação de LS_TRV_F3: CACCGAAGAAACTGATGATCAACGG e LS_TRV_R2: GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAG
- (Conjunto 5: NtBll, genoma S, folhas de Tsukuba No.
e SR-1)
Combinação de Bll_Flseq2: GTCCATCTGTCTATATAGGTAGAATG e
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B11_R1s e q: CACCATGTTTGATATTAGGCCTTA
Combinação de Bll_F3seq2: TGATGAGATTTATGTTGGGAACTG e B11_R2 s e q: TCTCATCATT GAACACGAACATAC T (Conjunto 6: NtBll, genoma T, folhas de Tsukuba No. 1 e SR-1)
Combinação de Bll_Flseql: CCACTTGTCTATATAGCAAGAAAGA e B11_R1s e q: CACCATGTTTGATATTAGGCCTTA
Combinação de Bll_F2seq: CTAAGGCCTAATATCAAACATGGT e Bll_R2seq: TCTCATCATTGAACACGAACATACT.
Determinação da sequência de genes obtida(d) [17 0] Cada um dos produtos de PCR, os quais foram obtidos pela amplificação dos três genes, foram clonados com o uso kit de clonagem para kit de sequenciamento PCR Zero Blunt TOPO (Life Technologies Corporation). Como necessário, os produtos de PCR foram purificados antes da clonagem por um método comum no qual a eletroforese com gel de agarose e coluna MiniElute (QIAGEN) foram combinadas. A respectiva sequência de nucleotideos dos genes clonados foi determinada (SEQ ID NOs. 21 a 30) por um sequenciador por capilaridade analisador de DNA 3730x1 (ABI) com o uso do kit de ciclo de sequenciamento (ABI) com Terminador BigDye (marca registrada) v3.1.
Grupo candidato B[l-2] [171] A análise do transcriptoma foi realizado a fim de identificar genes os quais espera-se serem expressos, de forma aumentada, na folha primordial de uma planta.
Preparo da amostra de extração do RNA(a) [172] Um bloco de parafina, no qual a porção do broto apical obtida de uma planta de tabaco jovem (variedade: SR1) de 4 semanas a 5 semanas após a semeadura foi embebida,
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63/135 foi preparada (para detalhes, vide Takahashi H, Kamakura H, Sato Y, Shiono K, Abiko T, Tsutsumi N, Nagamura Y, Nishizawa NK, Nakazono M. (2010) A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. J Plant Res 123: 807-813). O bloco de parafina foi cortado em diversas seções apresentando uma espessura de 20 pm com o uso de um micrótomo (RM2125 RTS; Leica). A partir das diversas seções, as seções incluindo uma parte central e sua proximidade ao Meristema dos Brotos Apicais (SAM) foram selecionadas. A partir das seções, com o uso do sistema de microdissecação por captura de laser Applied Biosystems (marca registrada) ArcturusXT (marca), uma base de folha primordial cujo meristema axilar não é formado (amostra de meristema axilar), folha primordial e uma parte inferior do meristema dos brotos apicais (amostra controle) foram cortados para apresentar um tamanho de modo que o diâmetro foi de 100 pm a 200 pm. A amostra de meristema axilar e a amostra controle foram, cada, coletadas em CapSure (marca registrada) LCM Cap (Applied Biosystems, Inc.), transferida para um tubo para a extração do RNA e criopreservada a -80°C até a extração do RNA.
Purificação do RNA(b) [173] Com o uso do kit de isolamento de RNA PicoPure (Arcturus), o RNA total foi purificado a partir das amostras de extração de RNA de (a) de acordo com o manual incluído no kit. Com o uso de um bioanalisador (Agilent Technologies Inc.), a concentração do RNA da solução da RNA purificado foi estimado e a qualidade da solução (grau de decomposição do RNA) foi confirmada.
Sequenciamento com o uso do sequenciador de próxima
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64/135 geração (Sequenciador de genoma 454 Titanium, Roche) e nível da predição da expressão do gene(c) [174] 0 RNA obtido em (b) foi enviado para Takara-Bio Inc. e foi requerido que Takara-Bio Inc. preparasse uma biblioteca de cDNA para uso na análise do sequenciador. Então, Genaris foi encarregado da análise da sequência de nucleotídeo da extremidade 5' do cDNAs da biblioteca de cDNA biblioteca. Na determinação da sequência de nucleotídeo, 3/4 de uma placa de cada porção da planta, a partir da qual as bibliotecas de cDNA foram derivadas, foram submetidas ao sequenciamento. De novo, a análise do conjunto no qual as informações sobre as sequências inteiras obtidas para cada porção foram usadas, uma sequência do conjunto foi obtida. Para a sequência do conjunto, então, obtida, uma sequência de leitura obtida das bibliotecas de cDNA, as quais são derivadas de cada porção, foram mapeadas (alinhadas). Os números de leituras correspondentes a cada gene foram contados para cada porção. 0 número de leituras, então, contado foi normalizado entre as bibliotecas de cDNA a partir das quais cada porção foi obtida. Com base no número normalizado de leituras, o nível de expressão do gene inteiro foi previsto para cada porção.
Determinação do grupo candidato B(d) [175] A partir da amostra de meristema axilar (vide (a) descrito acima), os seguintes genes foram selecionados como genes candidatos primários os quais estão envolvidos na formação de meristema axilar: genes os quais apresentam uma sequência de 200 ou mais bases de dados e cujo números de leituras seja 4 ou mais de modo a apresentar um nível de expressão de 10 vezes ou mais em comparação com aqueles da
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65/135 amostra controle. Espera-se que um gene, o qual deve atuar como um interruptor principal para o controle da formação de órgãos tais como a formação do meristema axilar, é um fator de transcrição o qual controla uma pluralidade de expressões de genes. Sendo assim, genes candidatos secundários, os quais provavelmente codificam fatores de transcrição, foram, ainda, selecionados (restritos) a partir dos genes candidatos selecionados pelas características de expressão primárias. Ao examinar se a supressão da expressão destes genes suprime ou não o desenvolvimento de brotos axilares de tabaco, o grupo candidato B (2 genes) foram finalmente determinados.
Produção de sequência de comprimento completo e sequência de cDNA de 2 genes(e) [176] Pelo conjunto da sequência de leitura com base nos resultados da análise da sequência de próxima geração, sequências consensus isogroupl5360 e isogroup07437 foram obtidas. Por meio de Race, RT-PCR e PCR genômico usando estas sequências consensus, uma sequência de comprimento completo
| e uma sequência de | cDNA | de 2 genes foram | produzidas. | |
| [177] 0 Race | foi | realizado com o | uso | do RNA total |
| preparado de acordo | com | a descrição em (b) de | 1-1 acima e | |
| com o uso do Kit | de | Amplificação de | cDNA | SMARTer RACE |
(Clonetech) de acordo com o manual incluído no kit. Para o PCR aninhada (nested PCR) de Race, os produtos de PCR primários, os quais foram diluídos 300 vezes, foram usados como um modelo. As condições reacionais em Race foram definidas como segue.
(Primeiro PCR) ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98 °C
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66/135 e 10 segundos a 72 °C
| 5 ciclos | enquanto | cada ciclo | inclui | 10 | segundos | a | 98 | |
| C, | 5 segundos | a 70 °C < | e 5 segundos | a 72 ° | C | |||
| 25 ciclos | enquanto | cada ciclo | inclui | 10 | segundos | a | 98 | |
| C, | 5 segundos | a 60 °C < | e 5 segundos | a 72 ° | C | |||
| -(PCR aninhada (nested PCR)) | ||||||||
| 25 ciclos | enquanto | cada ciclo | inclui | 10 | segundos | a | 98 | |
| C, | 5 segundos | a 55°C e | 5 segundos | a 72 °C | • |
[178] Como os iniciadores para Race, os iniciadores incluídos no kit e os iniciadores específicos para os seguintes genes foram usados.
(Primeiro PCR: #15360, genoma S e genoma T, broto apical de SR-1)
Combinação de primeiro iniciador 5' Race: RGAACCACCAGGGACTAAACTCTGCAA e primeiro iniciador 3’ Race: FTTGCAGAGTTTAGTCCCTGGTGGTTC (PCR aninhada (nested PCR): #15360, genoma S e genoma T, broto apical de SR-1)
Combinação de iniciador aninhado (nested) 5' Race: RGAAACGATCACTGATTCTATGCC e iniciador aninhado (nested) 3’ Race: F-TACAATGTTAGAAGAAGCAATTCAC.
[179] De acordo com a descrição em (c) de 1 - 1, o RTPCR foi realizado. Os iniciadores e genes alvos usados foram como segue.
(Conjunto 1: #07437, genoma S, broto apical de SR-1)
Combinação de forward: TACTTCCCTTTCTCACTTTGGTTTC e reverse: AATATTCCCATCAATAGATCACAAC (Conjunto 2: #07437, genoma T, muda de Tsukuba No. 1)
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Combinação de O7437_T_F1: CTACTACATCACTTAATATCATTCATT e 07437_Tom_RT_Rl: CAATAGATTGCAACTTTACATTAGTCG (Conjunto 3: #07437, genoma S, muda de Tsukuba No. 1)
Combinação de O7437_S_F1: TACTATCACTTAATACCATCATTCATC e 07437_Syl_RT_Rl: CCCATCAATAGATCACAACTTTAGT (Conjunto 4: #15360, genoma S, muda de Tsukuba No. 1)
Combinação de 15360-2_F2: AAATAGAGGTAATTAGTTGTATCAATGG e 15360-Nts_R2: ACAACATACCATACTACCACACACTA (Conjunto 5: #15360, genoma T, muda de Tsukuba No. 1)
Combinação de 1536O-1_F1: TGCATGGACAATCTCCTCTT e 15360Nts_R2: ACAACATACCATACTACCACACACTA (Conjunto 6: #15360, genoma S, broto axilar de SR-1)
Combinação de 1536O-2_F1: GCATGGACAATCTCATCTTCTC e 15360-l_Rl-2: CAACAGGAGTTGAGTTATTCTCAT (Conjunto 7: #15360, genoma T, broto axilar de SR-1)
Combinação de 15360_TrFWl: CACCTTCTTCAAGCAAAATTAATGAC e 15360_TrRVl: ATTAGAGTCATGAGCCATTAGC.
[180] De acordo com a descrição em (c) de 1 - 1, o PCR genômico foi realizado. Os iniciadores e genes alvos usados foram como segue.
(Conjunto 1: #15360, genoma S, folhas de Tsukuba No. 1)
Combinação de 1536O-2_F1: GCATGGACAATCTCATCTTCTC e 1536O-2_R1: CTGGGCAATATTCCACCATT
Combinação de 15360-2 F2: AATGGTGGAATATTGCCCAG e
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15360_NtsR2: ACAACATACCATACTACCACACACΤΑ (Conjunto 2: #15360, genoma T, folhas de Tsukuba No. 1)
Combinação de 1536O-1_F1: TGCATGGACAATCTCCTCTT e 15360l_Rl-2: CAACAGGAGTTGAGTTATTCTCAT
Combinação de 15360-l_F2-2: ATGAGAATAACTCAACTCCTGTTG e 15360_NtsR2: ACAACATACCATACTACCACACACTA (Conjunto 3: #07437, genoma S, folhas de Tsukuba No. 1)
Combinação de O7437-S_F1: TACTATCACTTAATACCATCATTCATC e O7437-S_R1: TCCCTGTACTTTGGGACATGA
Combinação de 07437-S_F2: GTGTACCAGCTAGTTATTATTGCG e 07437-S_R2: CCTGATCCGTTCTGATAGATCG
Combinação de 07427-S_F3: ATTTGTTAAAAAGTTGTAATAAAATTGG e 07437-S_R3: TTTCTTTGAATTGCTAACGAGGA
Combinação de 07437-S_F4: TCCTCGTTAGCAATTCAAAGAAA e 07437-S_R5: AGAATATAAAGAGCAGCCTGAATTAC
Combinação de O7437-S_F1: TACTATCACTTAATACCATCATTCATC e 07437-S_R2: CCTGATCCGTTCTGATAGATCG
Combinação de 07437-S_F2: GTGTACCAGCTAGTTATTATTGCG e 07437-S_R3: TTTCTTTGAATTGCTAACGAGGA (Conjunto 4: #07437, genoma T, folhas de Tsukuba No. 1)
Combinação de O7437-T_F1: CTACTACATCACTTAATATCATTCATT e O7437-T_R1: TCCCTGTACTTTGGGACATGA
Combinação de 07437-T_F2: TGCATTAACATGAATGCGAC e 07437T_R2: TCTAAATAGCGAGTAATAAGGATGAGA
Combinação de 07437-T_F3: GTTTGTTAAAAAATTGTAATAAACTTGG e 07437-T_R3: TTTCTTTGAAGTGCAAAAGGAAT
Combinação de 07437-T F4: ATTCCTTTTGCACTTCAAAGAAA e
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07437-T_R4: ATTATGGAAAAACAACTCTTCTATT
Combinação de O7437-T_F1: CTACTACATCACTTAATATCATTCATT e 07437-T_R2: TCTAAATAGCGAGTAATAAGGATGAGA
Combinação de 07437-T_F2: TGCATTAACATGAATGCGAC e 07437T_R3: TTTCTTTGAAGTGCAAAAGGAAT.
Determinação da sequência de comprimento completo do gene alvo no genoma[l-3] [181] Fragmentos de DNA genômico foram obtidos de acordo com a descrição em (b) de 1 - 1 por PGR, no qual os fragmentos de DNA genômico usados como modelos, 5' à montante e 3' à jusante do gene alvo, foram, cada, amplificados. As condições reacionais do PCR foram definidas como descrito em (c) de 1 - 1 e os iniciadores usados no PCR são como segue.
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Tabela 1
| Nome do iniciador | Sequência | Amostra alvo | Genoma analisado |
| REV Sg FWl | AAGAACATTGGCTTTAGTCCTCTAA | Tsukuba No. 1 | genoma S _ 5' à montante |
| Ns exl Rl | AC CAT CAC T CAT C TAAC TTATCCCAT | ||
| REV 3Tg Fl | AGACAGGAACACAGTTGAACGGA | genoma S _ 3' à jusante | |
| REV Sg RVl | C T T GACAAACAC T C T GAT T C T ACAC | ||
| REV Sg RV2 | T T GAGATAGC T T GTATAT TAT GCAT GC | ||
| REV Tg FWl | TTGTACCCATT GAAG GAT GAC TACT | genoma T _ 5' à montante | |
| Nt exl Rl | T C CAT CAC T GAT C TAAC TAAT C CAAG | ||
| REV 3Tg Fl | AGACAGGAACACAGTTGAACGGA | genoma T _ 3' à jusante | |
| REV Tg RV2 | CACGGGCGTTACCTCCACTAGTAT | ||
| LS Sg FWl | AAGGTCATTAGAATATGCGGAGC | genoma S _ 5' à montante | |
| LS Sg FW2 | TCTTCACTAGTTTCGGGCTCAAG | ||
| LS2-R1 | AACAT TAGAT GAT GCAT TAGG T G T | ||
| LSI,2-F4 | GTGGAGGCTTTGGATTATTATG | genoma S _ 3' à jusante | |
| LS Sg RVl | CGTCAGAACTTCGGATTAATTACTTC | ||
| LS Tg FWl | AAATGAGGCCTGAGCACAAG | genoma T 5' à montante | |
| LS1-R1 | CAACAACAT TAGAT G G T G T CAAG | ||
| LSI,2-F4 | GTGGAGGCTTTGGATTATTATG | genoma T 3' à jusante |
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| LS Tg RVl | TTATGGGATTTGATGATGCAGAG | ||
| LS Tg RV2 | AC C TAGAT T C C T T TACATAAC CAC T C | ||
| Bl Sg FWl | AT AT AGAAG GAT GAGAC AT AG T AAC AT AC C | genoma S _ 5' à montante | |
| Bl Sg FW2 | G T C TACAAGAAAATATGCAT CCGGA | ||
| B11-2 R1 | CTTTGTCCCTTCGATTCATGA | ||
| B11-2 F4 | AGGCCTAAATCATCAGTCCA | genoma S _ 3' à jusante | |
| Bl Sg RVl | GCTGGTGTCGATAATTGCTATTTAG | ||
| Bl Sg RV2 | CCTTAGTGGTTTTGCATGCTATGTT | ||
| Bl Tg FW2 | GGCAGGATACTATTCTACCACTAGG | Tsukuba No. 1 | genoma T _ 5' à montante |
| B11-1 R1 | CGCTTCGATTCTGGGAATAAG | ||
| B11-1 F4 | TACAGGCCTAAATCAGTCCA | genoma T _ 3' à jusante | |
| Bl Tg RV2 | AT G T GAAGACAAT GAAT T C C G C | ||
| 15360 Sg FWl | GTGTCGTCTATGGATATTATCGGC | genoma S _ 5' à montante | |
| 15360-2 Nsyl Rl | CTGGGCAATATTCCACCATT | ||
| 15360-2 Nsyl F2 | AATGGTGGAATATTGCCCAG | genoma S _ 3' à jusante | |
| 15360 Sg RVl | G T T C G CAGAAT GAGAAACAGAGT | ||
| 15360 Tg FWl | CAT GAG TAGAGATAT TAG GAG T G CAT C | genoma T _ 5' à montante | |
| 15360 Tg FW2 | GTGAATAATGTGTTGCAGGTCTC | ||
| 15360-l Ntom Rl | TCTCAACAGGAGTTGAGTTATTCTC |
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| 15360-l Ntom F2-2 | ATGAGAATAACTCAACTCCTGTTG | genoma T _ 3' à jusante | |
| 15360 Tg RVl | AGTTTGAACATTGGATATGGTG | ||
| 15360 Tg RV2 | T CATAC T CAC G C T T G T TATACAC G | ||
| Bl Sg FW3 | GCTCTCCTCTGATACATGGCTAT | SR1 | genoma S _ 5' à montante |
| Bll-1,2 R1 | TGTTTCAGTCTCAAATTCAT | ||
| B11-2 F4 | AGGCCTAAATCATCAGTCCA | genoma S _ 3' à jusante | |
| Bl Sg RVl | GCTGGTGTCGATAATTGCTATTTAG | ||
| Bl Tg FW2 | GGCAGGATACTATTCTACCACTAGG | genoma T _ 5' à montante | |
| B11-1 R1 | CGCTTCGATTCTGGGAATAAG | ||
| B11-1 F4 | TACAGGCCTAAATCAGTCCA | genoma T _ 3' à jusante | |
| Bl Tg RV2 | AT G T GAAGACAATGAAT T CCGC |
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73/135 [213] Com o uso do kit de clonagem de PCR Zero Blunt (marca registrada) TOPO (marca registrada) (Thermo Fisher Scientific) , E. coll (Maehl (marca)-T1R) foi transformada com cada um dos produtos de PCR amplificados de acordo com o manual incluído no kit. A E. coll transformada foi inoculada em uma placa. A colônia do PCR foi realizada com o uso da colônia formada na placa. 0 produto de amplificação obtido pela colônia do PCR foi purificado com o uso de ExoSAP-IT (marca registrada) para Produto de PCR Clean-UP (Affimetrix) de acordo com o manual do mesmo. Então, o produto resultante foi usado como um modelo em uma reação em sequência descrita posteriormente. Ao mesmo tempo, a colônia foi submetida à cultura líquida. Então, com o uso do Mini Kit de Plasmídeo QIAGEN (QIAGEN), um plasmídeo foi extraído de células bacterianas cultivadas. 0 plasmídeo então extraído foi também usado como modelo na reação da sequência descrita posteriormente.
[182] 0 modelo foi reagido com o uso do Kit de Sequenciamento em Ciclo BigDye (marca registrada) Terminator v3.1 (Applied Biosystems) de acordo com o manual do mesmo. 0 produto de reação foi purificado com o uso do Kit de Purificação BigDye (marca registrada) XTerminator (marca) (Thermo Fisher Scientific). A sequência de nucleotideo do produto de reação purificado foi determinada pelo uso de um sequenciador de capilaridade analisador de DNA 3730x1 (Applied Biosystems). O iniciador da sequência foi projetado como adequado a partir da informação da sequência e foi usado.
[183] A sequência de nucleotideo então determinada foi conectada com o uso do software do conjunto de sequência
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ATGC (GENETYX CORPORATION) de modo que uma sequência de nucleotídeo é uma região não traduzida do gene alvo foi determinada. A região não traduzida e a parte do gene estrutural foi, ainda, conectada, de modo que uma sequência de DNA genômica de comprimento completo do gene alvo foi determinada (SEQ ID NOs. 54 a 63).
Resultados[1-4] [184] Os genes do tabaco ortólogos de REV, LS e Bl, os quais foram determinados como grupo candidato A, foram nomeados NtREV, NtLS e NtBll, respectivamente. Em adição, a partir dos resultados da análise do transcriptoma, os genes determinados como do grupo candidato B foram nomeados #15360 e #07437.
Exame dos efeitos da supressão da expressão de cada um dos grupos candidatos A e B no desenvolvimento dos brotos axilares[2] [185] A fim de examinar os efeitos da supressão da expressão de cada um dos grupos candidatos A e B no desenvolvimento de brotos axilares, a verificação foi realizada pelas mudanças no desenvolvimento de brotos axilares em recombinantes nos quais cada expressão do gene foi suprimida (tal recombinante é aqui referido simplesmente como recombinante).
Preparo dos recombinantes[2-1]
Preparo para a transformação(a) [186] A fim de preparar os recombinantes, vetores para a transformação foram, primeiro, preparados como descrito abaixo.
[187] A sequência de partida RNAi para a supressão da expressão de NtREV, NtBll, NtLS, #15360 e #07437 (aqui também
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75/135 coletivamente referido como gene alvos) foram amplificados por PCR no qual a DNA polimerase PrimeSTAR Max (Takara-Bio Inc.) foi usada, enquanto o cDNA derivado de SR-1 produzido com base nos resultados de 1 foi usado como um modelo. As condições e os iniciadores do PCR são como segue.
(Condições do PCR) segundos a 94 °C ciclos a 40 ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98 °C, 5 segundos a 55 °C e 10 segundos a 72 °C segundos a 72 °C (Iniciador para #15360)
Combinação de 15360_TrFWl: CACCTTCTTCAAGCAAAATTAATGAC e 15360_TrRVl: ATTAGAGTCATGAGCCATTAGC (Iniciador para #07437)
Combinação de 07437_TrFWl: ACCACCTGGTTTTAGGTTTCATCC e 07437_TrRVl: TATTCTGCATATCACCCATTCC (Iniciador para NtLs)
Combinação de LS_TRV_F3: CACCGAAGAAACTGATGATCAACGG e LS_TRV_R3: TCGCTTGATTAGCAGTCAGC (Iniciador para NtBll)
Combinação de N.t_BL(hit1)_TRV_F1:
CACCTCAAGAAAAAGCTTATGGG e N.t_BL(hit1)_TRV_R1:
GCAGCAGCTAACAAGTTGTA (Iniciador para NtREV)
Combinação de NtREV_TrFW2: CACCGCCTATGTAGCTTCGTCAATG e NtREV_TrRV2: CACTGTAGCCAGAGACCACA.
[188] Para a supressão da expressão de NtREV, uma sequência de uma região traduzida à jusante (extremidade 3') de um domínio HD-Zip foi selecionada como uma sequência de partida RNAi. Para a supressão da expressão de NtBll, uma
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76/135 sequência de uma região traduzida à jusante (extremidade 3') de um domínio Myb foi selecionada como uma sequência de partida RNAi. Para a supressão da expressão de NtLS, um lado da extremidade 5' da região traduzida foi selecionado como uma sequência de partida RNAi. Para a supressão da expressão de #15360, uma sequência incluindo um domínio bHLH foi selecionada como uma sequência de partida RNAi. Para a supressão da expressão de #07437, uma sequência de uma região de domínio NAM foi selecionada como uma sequência de partida RNAi. Em adição, cada sequência de partida RNAi amplificada por PCR foi adicionada com um CCAC na extremidade 5', e foi projetado de modo que a sequência de partida RNAi apresenta um comprimento de 400 bp a 500 bp.
[189] Os produtos de PCR foram clonados para vetores pENTR (marca) / D-TOPO (Life Technologies Corporation). Então, a sequência de nucleotídeo de cada sequência de partida RNAi foi verificada. Então, com o uso de uma mistura de Enzimas Clonase II Gateway LR (Life Technologies Corporation), cada sequência de partida RNAi foi introduzida em um vetor pSP231. A fim de verificar a sequência introduzida, cada sequência de partida RNAi introduzida no vetor pSP231 foi amplificada por PCR no qual TakaRa Ex Taq e DNA polimerase PrimeSTAR Max (Takara-Bio Inc.) foram usadas, de modo que uma fita senso (sense) e uma fita antissenso(antisense) foram individualmente amplificadas (o vetor pSP231 é um vetor no qual um cassete de expressão de GFP (gene de proteína verde fluorescente) foi inserido dentro de um sítio Saci de pHellsgate 12 (vide a literatura: Wesley et al. , 2001, Plant J., 27, 581 - 590) e é um vetor binário que pode expressar, com um gene promotor do vírus 35S de
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77/135 mosaico de couve-flor, uma sequência RNAi formada com um intron pdk / cat localizado entre sequências repetidas invertidas da sequência de partida) . Os produtos de PCR foram purificados com o uso de MiniElute (QIAGEN) e, então, submetidos ao sequenciamento. A sequência de nucleotídeos das sequências de partida RNAi introduzidas no vetor pSP231 são tal como representadas pela SEQ ID NO. 31 (NtREV), SEQ ID NO. 32 (NtBll), SEQ ID NO. 33 (NtLS), SEQ ID NO. 34 (#15360) e SEQ ID NO. 35 (#07437). Note que na sequência de nucleotídeos mostrada em uma listagem de sequência, CACC na extremidade 5' é omitido.
[190] Com o uso do vetor pSP231 contendo cada sequência de partida, Agrobacteríum (Agrobacteríumu tumef adens) LBA4404 foi transformado por eletroporação. Após ter sido confirmado por PCR que cada sequência de partida RNAi foi amplificada em LBA4404, a Agrobacteríum foi usada para a transformação de tabaco.
Transformação do tabaco e coleta de sementes transformadas(b) [243] Com uso da variedade MC1 (transformação de NtBll) ou SR-1 (transformação de cada um de NtREV, NtLS, #15360 e #07437), o tabaco foi transformado por um método comum, tal como descrito abaixo. Uma seção de uma folha de tabaco foi infectada com a Agrobacteríum e então transformada e foi cultivada em meio Linsmaier e Skoog contendo canamicina, de modo que calos foram obtidos. A partir dos calos então obtidos, indivíduos re-diferenciados, os quais são resistentes a canamicina, foram obtidos. A partir destes indivíduos re-diferenciados, os seguintes indivíduos foram selecionados: o indivíduo no qual (i) fluorescência intensa
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78/135 com base no GFP na folha inteira foi confirmado e (ii) expressão em alto nível de uma porção de espaçador (intron PPDK) foram confirmadas. Os indivíduos então selecionados (indivíduos TO) foram transplantados para vasos de 9 cm e foram cultivados sob condições fixadas em uma estufa de contenção de 23 °C a 25 °C. Os indivíduos TO foram autof ecundados, que modo que as sementes TI tenham sido coletadas.
Seleção de TI recombinantes(c) [191] As sementes TI foram assepticamente semeadas em meio Linsmaier e Skoog e a fluorescência baseada em GFP do broto foi observado. A partir da proporção de segregação dos genótipos (segregantes (homo) / hemizigose (hetero) e nula (null)) de transgenes, linhagens nas quais o número de loci dos transgenes foi previsto como 1 ou 2 foram selecionados.
[192] Por qPCR, no qual o RNA total isolado de uma folha ou raiz da linhagem TI foi usado, o nível de expressão dos genes alvos foi determinado. 0 nível de expressão foi avaliado como a proporção do nível de expressão em linhagens homo em relação ao nível de expressão em linhagens nulas. A partir das linhagens homo e linhagens nulas, linhagens nas quais a proporção acima é pequena (isto é, o grau no qual as expressões dos genes alvos suprimidas é grande) foram selecionadas. Os detalhes do qPCR são como segue.
[193] Os iniciadores e sondas do qPCR foram projetados com uso de software específico (Primer Express, ABI) ou Sigma-Aldrich Japan foi requerido para realizar tal projeto. Como descrito em (b) de 1 - 1, o cDNA foi sintetizado a partir do RNA total isolado da folha ou raiz. 0 qPCR foi realizado com o uso de (i) cDNA o qual foi diluído de 2 a 5
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79/135 vezes, (ii) os iniciadores obtidos como descrito acima e (iii) mistura Taq Man Fast Advanced Master (ABI) . Como um controle de quantificação, gene de alongamento eucariótico factor-la (acesso n° AF120093, efla) foi amplificado. Como uma sonda de quantificação, uma combinação de corante reporter e supressor (FAM-TAMURA (gene a ser analisado) e VIC-TAMURA (controle)) foram usados. As sequências dos iniciadores e sondas para qPCR são mostradas abaixo. Na sequência que direciona para cada gene abaixo, a primeira é um iniciador forward, a segunda é um iniciador reverse e a terceira é uma sonda.
- (NtLS)
NtLS_qFWl: CCGGTACTGGAAATGACCTTGA
NtLS_qRVl: ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT NtLS_Pl: CCCTTCGTAGAACCGGAGATCGTTTAGCT
- (NtBll)
NtBll_qFWl: GAGAAAACAAATGTAAGTACACCATTAGG
NtBll_qRVl: GAAAAAGTTTGAATCTTCTTGCCAA
NtBll_Pl: GATTTGAAAGGGCGTTTGGGTATGGG
- (NtREV)
NtREVl_qFWl: TCTCCAGGCTCCCCTGAAG
NtREVl_qRVl: TGTCCCCATGTGATAACTGTAGCT NtREVl_Pl: AACGTTGTCGCACTGGATCTGCCA
- (#07437)
Nt_0 7 43 7_1-F: ATGGCTACCCTACAAGCTTGAAA
Nt_07437_l-R: TTGCCAATGTGTAGTTGTTGTGG
Nt_0 7 43 7_1-P: TCTTAACACAGCAACATCAGCAGAAGCAGC
- (#15360)
Nt_l5360_48821-F: ACTCCTGTTGAGAATGCACAAATAA
Nt 15360 48821-R: CCAGAAATATTAGTTTCTTCTCCTTGG
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Nt_l53 6 0_4 8 8 21-P: CCATCTGAAAATGCATAACCTGGAAGCTGC.
[194] Como um resultado da seleção acima, os indivíduos a serem submetidos ao teste para avaliação do broto axilar foram selecionados por gene alvo cuja expressão é suprimida. Os indivíduos são como segue.
[195] NtREV: 3 indivíduos da linhagem Tl, selecionados dentre 10 indivíduos da linhagem Tl cujo nível de expressão foi avaliado, o qual apresenta um lócus e exibe uma notável supressão da expressão (número da linhagem: 3, 8 e 14) [196] NtBll: 3 indivíduos da linhagem Tl, selecionados dentre 15 indivíduos da linhagem Tl cujo nível de expressão foi avaliado, o qual apresenta um lócus e exibe uma notável supressão da expressão (número da linhagem: 6, 9 e 12) [197] NtLS: 3 indivíduos da linhagem Tl, selecionados dentre 24 indivíduos da linhagem Tl cujo nível de expressão foi avaliado, o qual apresenta um lócus e exibe uma notável supressão da expressão (número da linhagem: 10, 15 e 19) [198] #15360: 3 indivíduos da linhagem Tl, selecionados dentre 22 indivíduos da linhagem Tl cujo nível de expressão foi avaliado, o qual apresenta um ou dois loci e exibe uma notável supressão da expressão (número da linhagem: 11, 14 e 17) [199] #07437: 3 indivíduos da linhagem Tl, selecionados dentre 20 indivíduos da linhagem Tl cujo nível de expressão foi avaliado, o qual apresenta um lócus e exibe uma notável supressão da expressão (número da linhagem: 1, 10 e 22) [200] As proporções dos níveis de expressão dos genes alvos na família Tl de cada recombinante (em que o nível de expressão em linhagens nulas é definido por 1) são como
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81/135 segue .
| NtREV | - linhagem | 3 : | 0,56, linhagem | 8 : | 0,57, linhagem | |
| 14 : | 0,74 | |||||
| NtBll | - linhagem | 6: | 0,33, linhagem | 9: | 0,35, linhagem | |
| 12 : | 0,25 | |||||
| NtLS - | linhagem 10: | 0,50, linhagem | 15: | 0,58, linhagem | ||
| 19: | 0,43 | |||||
| #15360 | - linhagem | 11: | : 0,07, linhagem | 14 : | 0,10, linhagem | |
| 17 : | 0, 08 | |||||
| #07437 | - linhagem | 1: | 0,24, linhagem | 10 : | 0,17, linhagem | |
| 22 : | 0, 13 |
Avaliação de brotos axilares em estufa[2-2] [201] As sementes da linhagem TI de cada recombinante obtidos como descrito acima foram semeadas e cultivados em uma estufa de contenção ou Koitotron (Koito Manufacturing Co., Ltd.). As condições da estufa de contenção foram definidas de modo que a temperatura foi mantida em temperatura ambiente de 23 °C a 25 °C e o comprimento do dia foi de um dia natural. As condições do Koitotron foram definidas de modo que o comprimento do dia foi de 12 horas e a temperatura foi de 25 °C (periodo do dia) e 18 °C (período da noite). Os indivíduos foram cultivados em vasos de 15 cm os quais foram preenchidos com solo rico apresentando um volume de 500 mL / vaso. A composição do solo rico era como segue. Composto: 40 L, solo selvagem: 30 L, solo Akadama (pequeno): 10 L, solo Akadama (médio): 10 L, vermiculite: 10 L, fertilizante (S625): 1000 g.
[202] A poda foi realizada quando 12 a 13 folhas verdadeiras foram produzidas durante um período que começa com os galhos e termina antes da floração. O alvo selecionado
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82/135 para ser avaliado foi um broto axilar o qual foi produzido em uma quarta folha verdadeira do final de uma parte aérea ou uma folha mais alta. Cada semana desde a poda, o número de brotos axilares com um broto apresentando um comprimento de aproximadamente 5 mm ou maior foi registrado. Os brotos axilares, então, registrados foram coletados a mão a partir da base do mesmo e o peso fresco (FW) dos brotos axilares então coletados foi medido. Até que o desenvolvimento de novos brotos axilares não tenha sido mais observado, o número e peso dos brotos axilares foram medidos ao longo de substancialmente 5 vezes.
[203] Primeiro, a figura 1 mostra os resultados da avaliação do desenvolvimento do broto axilar nos recombinantes nos quais a expressão da NtREV foi suprimida (cultivada na estufa de contenção) . Todas as 3 linhagens homo (na figura 1, H é adicionado após o número da linhagem) dos recombinantes nos quais a Expressão de NtREV foi suprimida mostrou que o número de brotos axilares secundários foi estatisticamente significativamente diminuído em comparação com as linhagens nulas correspondentes (na figura 1, N é adicionado após o número da linhagem). Das 3 linhagens homo, 2 linhagens não produziram brotos axilares secundários. Enquanto isso, não houve diferença estatisticamente significativa encontrada entre as linhagens homo e as linhagens nulas em relação ao número e peso fresco dos brotos axilares primários, exceto que 12 linhagens homo mostraram que o número de brotos axilares primários foi estatisticamente significativamente aumentado em comparação com as linhagens nulas correspondentes. Nas Figuras 2 a 5, o significado de N e
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H é idêntico ao da figura 1.
[204] A figura 2 mostra os resultados da avaliação do desenvolvimento do broto axilar nos recombinantes nos quais a expressão de NtBll foi suprimida (cultivada em Koitotron). Nenhuma das 3 linhagens homo dos recombinantes nos quais a expressão de NtBll foi suprimida produziram brotos axilares secundários e as linhagens nulas correspondentes produziu brotos axilares secundários. Enquanto isso, não houve diferença estatisticamente significativa entre as linhagens homo e as linhagens nulas em relação ao número e peso fresco dos brotos axilares primários.
[205] A figura 3 mostra os resultados da avaliação do desenvolvimento do broto axilar nos recombinantes nos quais a expressão de NtLS foi suprimida (cultivado em Koitotron). Todas as 3 linhagens homo dos recombinantes nos quais a expressão de NtLS foi suprimida mostraram que o número de brotos axilares secundários foi estatisticamente significativamente diminuído em comparação com as linhagens nulas correspondentes. Em adição, 1 linhagem homo mostrou uma diminuição estatisticamente significativa no peso fresco dos brotos axilares secundários em comparação com a linhagem nula correspondente, e as 2 linhagens homo restantes mostraram uma diminuição no peso fresco embora não estatisticamente significativa. Enquanto isso, não houve diferença estatisticamente significativa entre as linhagens homo e as linhagens nulas em relação ao número e peso fresco dos brotos axilares primários.
[206] A figura 4 mostra os resultados da avaliação do desenvolvimento do broto axilar nos recombinantes nos quais a expressão de #15360 foi suprimida (cultivada em Koitotron).
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Todas as 3 linhagens homo dos recombinantes nos quais a expressão de #15360 foi suprimida mostraram que o número de brotos axilares secundários foi estatisticamente significativamente diminuído em comparação com as linhagens nulas correspondentes. Em adição, 2 linhagens homo mostraram uma diminuição estatisticamente significativa no peso fresco dos brotos axilares secundários em comparação com as linhagens nulas correspondentes, e a 1 linhagem homo restante mostrou uma diminuição no peso fresco embora não estatisticamente significativa. Enquanto isso, não houve diferença estatisticamente significativa entre as linhagens homo e as linhagens nulas em relação ao número e peso fresco dos brotos axilares primários, exceto que 17 linhagens homo mostraram gue o peso fresco dos brotos axilares primários foi estatisticamente significativamente aumentado em comparação com as linhagens nulas correspondentes.
[207] A figura 5 mostra os resultados da avaliação do desenvolvimento do broto axilar nos recombinantes nos quais a expressão de #07437 foi suprimida (cultivada em Koitotron). 1 linhagem homo dentre as 3 linhagens homo dos recombinantes nos quais a expressão de #07437 foi suprimida mostrou que o número e peso fresco dos brotos axilares secundários foram estatisticamente significativamente diminuídos em comparação com a linhagem nula correspondente. Em adição, as 2 linhagens homo restantes mostraram uma diminuição no número e peso fresco dos brotos axilares secundários em comparação com as linhagens nulas correspondentes, embora a diminuição não seja estatisticamente significativa. Enquanto isso, não houve diferença estatisticamente significativa entre as linhagens homo e as linhagens nulas em relação ao número e
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85/135 peso fresco dos brotos axilares primários.
[208] A partir dos resultados acima, observou-se que a expressão suprimida nos 5 genes alvos pode seletivamente suprimir o desenvolvimento de brotos axilares secundários sem suprimir o desenvolvimento de brotos axilares primários.
Confirmação do efeito da mutação introduzida no gene alvo no desenvolvimento de brotos axilares (1)[3]
Mutante produzido por tratamento EMS)[3-1]
Seleção do mutante(a) [209] Sementes foram submetidas a tratamento com etilmetano sulfonato (EMS) de modo que o panei mutante (TUM) do tabaco (variedade: Tsukuba No. 1) foi preparado (literatura: The 2011 Annual Meeting of the
Phytopathological Society of Japan, P234, Construction of mutante panel in Nicotiana tabacum L.). Este panel mutante consiste de (i) um conjunto de sementes (volume de sementes M2) da progênie mutante autofecundada obtida de cada indivíduo (geração Ml) criado a partir de várias centenas de sementes as quais foram submetidas ao tratamento com EMS como um tratamento mutagênico e (ii) um conjunto de volume de DNA extraído de mudas de 8 indivíduos de cada linhagem crescida a partir das sementes M2 semeadas. Mutantes apresentando mutações em NtREV ou NtlS foram selecionadas com base nos resultados de desempenho, com estas amostras de DNA como um modelo, análise do polimorfismo da conformação da fita única (SSCP) de genomas de uma biblioteca de mutante ou sequenciamento direto de fragmentos de amplificação de PCR. No SSCP, o sítio alvo foi amplificado pelo uso de PCR usando iniciadores de PCR aos quais corantes fluorescentes foram ligados. Então, os fragmentos amplificados foram
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86/135 detectados com o uso de um aparelho de eletroforese por capilaridade (analisador ABI 3130xlDNA). Com o uso do kit de PCR QIAGEN Multiplex (QIAGEN), o PCR foi realizado de acordo com o manual incluído no kit. As sequências dos iniciadores do PCR são como segue.
(NtREV, genoma S)
Combinação de Nt_inO_Fl: TTGGTTTGGGATTTTGAGGTTTGAGG e Nt_exl_Rl: TCCATCACTGATCTAACTAATCCAAG
Combinação de Ns_inl_Fl: TTTGGAATTGAGGGTGAACATTGTGC e Ns_in2_Rl: ACGTTACCATTCGTCTACAGTAAGC
Combinação de Ns_in2_Fl: CCAATAAACAAGAAACAGATGATGG e Ns_in3_Rl: GAATGGACACCATAGACGGAAAGGA
Combinação de Ns_in3_Fl: TTTCCGTCTATGGTGTCCATTCTCC e Ns_in4_Rl: GAGACATGGCAATACTGAATTTTCA
Combinação de Ns_in4_Fl: GAAAATTCAGTATTGCCATGTC e
Ns_in6_Rl: AGCCTACGTGAAGATTGATGAGAAG (NtREV, genoma T)
Combinação de Nt_inO_Fl: TTGGTTTGGGATTTTGAGGTTTGAGG e Nt_exl_Rl: TCCATCACTGATCTAACTAATCCAAG
Combinação de Nt_inl_Fl: TCGATTGGGTTGTATGAGTTAACCGT e Nt_in2_Rl: GTTACCATAAGCTGTGGAATATCAGG
Combinação de Nt_in2_Fl: AACCAATGGACAAGAAACGGATGGCA e Nt_in4_Rl: TTTAGCTATCCAGTCAAAGAGGCACG
Combinação de Nt_in4_Fl: AAAAAAATTCAGTATTGCCACGTGC e Nt_in6_Rl: AGCCTACGTGAAGATTGATGAGAAA (NtLS, genoma S)
Combinação de LS_F2_seq: ATTTCCCCTCCTCCATCATTG e LS1R1: CAACAACATTAGATGGTGTCAAG
Combinação de LS1-F2: CTTGACACCATCTAATGTTGTTG e NtLS_QPCR_RVl: ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT
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Combinação de LS1,2-F3: TTCGTAGAACCGGAGATCGT e
LS1,2_R3: GCAAAGTTGCTTCCAATGAAT
Combinação de LS1,2_F4: GTGGAGGCTTTGGATTATTATG e N·t_LS_TRV_R2: GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAG (NtLS, genoma T)
Combinação de LS_F2_seq: ATTTCCCCTCCTCCATCATTG e LS2R1: AACATTAGATGATGCATTAGGTGT
Combinação de LS2-F2: ACACCTAATGCATCATCTAATGTT e
NtLS_QPCR_RVl: ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT
Combinação de LS1,2-F3: TTCGTAGAACCGGAGATCGT e
LS1,2_R3: GCAAAGTTGCTTCCAATGAAT
Combinação de LS1,2_F4: GTGGAGGCTTTGGATTATTATG e N.t_LS_TRV_R2: GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAG.
[210] A sequência dos genes dentro dos quais a mutação foi introduzida, foi identificada por (i) clonagem dos fragmentos de amplificação de PCR obtidos a partir dos genomas dos mutantes da geração M2 e (ii) determinação da sequência de nucleotídeo dos fragmentos dos clones. As diferenças entre o polipeptideo, os quais foram expressos pelos genes dentro dos quais as mutações foram introduzidas e proteína de planta tipo selvagem (WT), são como segue.
[211] O polipeptideo (MT, mutante Nsl630, SEQ ID NO. 36) expresso por NtREV dentro do qual uma mutação em um genoma S foi introduzida apresentou a seguinte diferença da proteína de planta tipo selvagem.
- Mt: lllaa, Wt: 838aa [212] O comprimento completo foi reduzido em lllaa devido ao fato que a 112a glutamina (Q) foi alterada para um códon de parada.
[213] O polipeptideo (mutante Ntl605, SEQ ID NO. 37)
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88/135 expresso por NtREV dentro do qual uma mutação em um genoma T foi introduzida apresentou a seguinte diferença da proteína da planta tipo selvagem.
- Mt: 116aa, Wt: 839aa [214] 0 comprimento completo foi reduzido em 116aa devido ao fato que a 117a glutamina (Q) foi alterada para um códon de parada.
[215] 0 polipeptídeo (mutante Nt5850, SEQ ID NO. 38) expresso por NtREV dentro do qual uma mutação em um genoma T foi introduzida apresentou a seguinte diferença da proteína da planta tipo selvagem.
- Mt: 68aa, Wt: 839aa
| [216 | ] 0 comprimento | completo | foi reduzido | em 68aa |
| devido ao | fato que a 69a glutamina | (Q) foi alterada | para um | |
| códon de | parada. | |||
| [217 | ] 0 polipeptídeo | (mutante | Ntll45, SEQ ID | NO. 39) |
expresso por NtLS dentro do qual uma mutação em um genoma T foi introduzida apresentou a seguinte diferença da proteína da planta tipo selvagem.
- Mt: 398aa, Wt: 410aa [218] 0 comprimento completo foi reduzido em 398aa devido ao fato que a 399a glutamina (Q) foi alterada para um códon de parada.
[219] 0 polipeptídeo (mutante Ntl025, SEQ ID NO. 40) expresso por NtLS dentro do qual uma mutação em um genoma T foi introduzida apresentou a seguinte diferença da proteína da planta tipo selvagem.
- Mt: 145aa, Wt: 410aa [220] O comprimento completo foi reduzido em 145aa devido ao fato que a 146a glutamina (Q) foi alterada para um
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89/135 códon de parada.
[221] 0 polipeptideo (mutante Ns369, SEQ ID NO. 41) expresso por NtLS dentro do qual uma mutação em um genoma S foi introduzida apresentou a seguinte diferença da proteína da planta tipo selvagem.
- Mt: 163aa, Wt: 407aa [222] 0 comprimento completo foi reduzido em 163aa devido ao fato que a 164a glutamina (Q) foi alterada para um códon de parada.
Seleção do mutante desejado da população de mutante M2 (b) [324] A partir da população de mutante M2 prevista por apresentar mutações nos genes alvos, mutantes (T+S+) homozigóticos apresentando uma mutação em cada gene alvo em ambos um genoma T e um genoma S e mutantes (T~S~) não apresentando mutação em cada gene alvo em ambos um genoma T e um genoma S foram preparados de acordo com o seguinte procedimento.
[223] Primeiro, os 4 grupos a seguir foram selecionados dentre a população de mutante M2:
[224] mutantes M2 (T+) homozigoticamente apresentando mutações no gene alvo no genoma T [225] mutantes M2 (S+) homozigoticamente apresentando mutações no gene alvo no genoma S [226] mutantes M2 (T~) não apresentando mutação no gene alvo no genoma T [227] mutantes M2 (S~) não apresentando mutação no gene alvo no genoma S [228] Então, a linhagem El preparada pelo cruzamento T+ e S+ foi autofecundada, de modo que os mutantes F2 alvo
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90/135 (T+S+) foram preparados. T~S~ foi preparado da mesma maneira.
[229] No procedimento acima, Método PCR Cycleave foi realizado conforme descrito no próximo parágrafo a fim de determinar a presença / ausência de uma mutação em um genoma. O DNA genômico o qual foi extraído pelo uso de um método de extração simples foi usado como um modelo no PCR Cycleave para verificar uma mutação do gene NtREV. Fragmentos amplificados por PCR do DNA genômico (para cada genoma T e genoma S) foram diluídos de 300 vezes a 500 vezes e então usados como modelos no PCR Cycleave para verificar uma mutação de gene NtLS. O PCR foi realizado com o uso de Tks Gflex (marca) DNA polimerase (Takara-Bio Inc.) . As condições reacionais e iniciadores do PCR são como segue.
(Condições reacionais) segundos a 94°C ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98 °C, 15 segundos a 55°C e 90 segundos a 68 °C segundos a 68 °C (Iniciadores)
Genoma T
NtLS_prePCR_Ntom_Fl: CCCAGACCCCCTTTTCCTCT
NtLS_prePCR_Ntom_Rl: AATTTCCCTTATAATTTAACGCC Genoma S
NtLS_prePCR_Nsyl_Fl: CCCTAGAGAGACCCCTTTTTC NtLS_prePCR_Nsyl_Rl: GGGTTTTAAATTTAACGCCAA.
[230] Os iniciadores e sondas para o método PCR Cycleave (Tabela 1) foram projetados com o uso do Projetor de Ensaio de PCR (SNPs) Cycleave (marca registrada) o qual está disponível em uma página da web de Takara-Bio Inc. Junto com os iniciadores e sondas, a Mistura Reacional PCR Cycleave
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91/135 (Takara-Bio Inc.) foi usada de acordo com o manual fornecido por Takara-Bio Inc. para realizar o método PCR Cycleave. A reação de PCR foi realizada com o uso do sistema de PCR em tempo real(Thermo Fisher Scientific Inc.) Applied Biosystems (marca registrada) StepOnePlus (marca).
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Tabela 2
| Gene | Iniciador / nome da sonda | Sequência | Tipo do genoma |
| REV | Nt 5850 P2-lIniciador F | GTGAATGCCCTATTCTGTC | genoma T |
| Nt 5850 P2-lIniciador R | AT CAC T GAT C TAAC TAAT C CAAG | ||
| Nt 5850 P2-lProbe T-FAM | ctttgatct(A)ct 5'-Eclipse / 3'-FAM | ||
| Nt 5850 P2-lProbe C-HEX | tgatct(G)ctt 5'-Eclipse / 3'-HEX | ||
| Nt l605 P4-2Iniciador F | AT T GAT GGAGGAGAAT GAT | genoma T | |
| Nt l605 P4-2Iniciador R | GAGAAGATAC G T TAAG T GAAA | ||
| Nt 1605 P4-2Probe T-FAM | acaagct(A)cg 5'-Eclipse / 3'-FAM | ||
| Nt 1605 P4-2Probe C-HEX | caagct(G)cg 5'-Eclipse / 3'-HEX | ||
| Ns 1630 P3-lIniciador F | CCATTTCAGGTGTCGAG | genoma S | |
| Ns 1630 P3-lIniciador R | ACGTTACCATTCGTC TAGAG | ||
| Ns 1630 P3-lProbe T-FAM | tt(A)caagcga 5'-Eclipse / 3'-FAM | ||
| Ns 1630 P3-lProbeC-HEX | gC(a)aaaacag 5'-Eclipse / 3'-HEX | ||
| LS | 369 Ns-lIniciador F | TCCCTAAACCAAGTGACTCC | genoma S |
| 369 Ns-lIniciador R | GGTATCAAGGTCATTTCCAG | ||
| 369 Ns-lProbeT-FAM | tgT(a)agcacta 5'-Eclipse / 3'-FAM | ||
| 369 Ns-lProbeC-HEX | gC(a)agcact 5'-Eclipse / 3'-HEX | ||
| L6 1145-3Iniciador F | AGAGGAT GACAGT GGAGCAA | genoma T |
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| L6 1145-3Iniciador R | TAACGCCAAGAAGATATGGAA | ||
| L6 1145-3ProbeT-FAM | ggT(a)aaatcaac 5'-Eclipse / 3'-FAM | ||
| L6 1145-3ProbeC-HEX | ggC(a)aaatca 5'-Eclipse / 3'-HEX | ||
| 1025 T547-3Iniciador F | GTTGAAAGTTCAAATGATTCAG | ||
| 1025 T547-3Iniciador R | GAGGAGGGTAACGATCAG | ||
| 1025 T547-3Probe T-FAM | gcttgttA(g)tt 5'-Eclipse / 3'-FAM | genoma T | |
| 1025 T547-3Probe C-HEX | cttgttG(g)tta 5'-Eclipse / 3'-HEX |
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Avaliação dos brotos axilares em campo(c)
- Cultivo em campo [342] No campo da Tabacco Leaves Research Center, durante um período de cultivo normal (semeadura em março e plantação em abril), cada linhagem dos mutantes foi cultivada por um método de cultivo por adubação verde com grandes declives sob as seguintes condições. Comprimento do declive: 16 m, intervalo dos declives: 120 cm, distância da plantação: 43 cm, e o número de plantas por declive: 37. 1(Um) declive foi apontado para o cultivo de 1 linhagem, e, um mês após o transplante, de 10 a 15 indivíduos que mostraram crescimento aproximadamente idêntico foram determinados por aparência e foram preliminarmente selecionados. Então, 10 indivíduos a partir destes foram submetidos a um exame subsequente. Durante o exame, nenhum agroquímico para a supressão de brotos axilares (tal como Contact) foi usado.
- Determinação do tempo de floração [231] Durante o tempo de floração, o número de folhas acima do solo foi determinado. Imediatamente antes da poda, o tempo de floração previsto foi determinado. Pela realização da poda através do corte de 1 a 4 folhas abaixo do primeiro galho com flor, os números de folhas acima do solo foi o mesmo dentre as linhagens a serem comparadas e avaliadas.
- Avaliação do desenvolvimento de brotos axilares [232] Sob um total de 7 vezes em um dia de poda e cada semana após a poda, o número de brotos axilares com um broto apresentando um comprimento de aproximadamente 5 mm foi registrado. Os brotos axilares, então, registrados foram coletados a mão a partir da base dos mesmos e o peso fresco (FW) dos brotos axilares então coletados foi medido. Os
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95/135 brotos axilares primários, os brotos axilares secundários, e os brotos axilares terciários foram individualmente medidos e registrados. 0 registro das medidas foi, então, preparado.
[233] A figura 6 mostra os resultados da avaliação do desenvolvimento dos brotos axilares de mutantes nos quais mutações foram introduzidas no NtREV. A linhagem NtREV homo (T+S+) não produziu brotos axilares secundários ou brotos axilares terciários. A linhagem NtREV_Null (T~S~) produziu brotos axilares secundários e brotos axilares terciários (existe uma diferença estatisticamente significativa na comparação com T+S+) . Enquanto isso, não houve diferença estatisticamente significativa entre as duas linhagens em relação ao número e peso fresco de brotos axilares primários.
[234] A figura 7 mostra os resultados da avaliação do desenvolvimento dos brotos axilares de mutantes nos quais mutações foram introduzidas no NtLS. A linhagem NtLS homo (T+S+) mostrou que houve uma diminuição estatisticamente significativa no número e peso fresco de brotos axilares secundários em comparação com a linhagem NtLS_Null (T~S~) . Em adição, a linhagem NtLS homo (T+S+) não produziu brotos axilares terciários (existe uma diferença estatisticamente significativa em comparação com a linhagem NtLS_Null). Enquanto isso, não houve diferença estatisticamente significativa entre as duas linhagens em relação ao número e peso fresco de brotos axilares primários.
[235] Os resultados acima indicam que em mutantes de NtREV e NtLS também, o desenvolvimento de brotos axilares secundários (e brotos axilares terciários) foi seletivamente suprimido como no caso da supressão da expressão do gene.
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Mutante de NtBll produzido por sistema CRISPR / Cas9[33]
Preparo para a transformação(a) [347] Como um vetor para transformação do Agrobacteríum, um vetor binário pRI-201-AN (Takara-Bio Inc.) foi usado. Entre Ndel-Sall de pRI-201-AN, pcoCas9 (referência 2) o qual foi submetido à otimização de códon para plantas foi introduzido. Entre Kpnl-BamHI, um cassete de expressão de sgRNA foi introduzido. Como um promotor para a sequência guia GN20GG, AtU6-l (referência 3) foi usado. Como um promotor para a sequência guia AN20GG, AtU3B (referência 4) foi usado. Como uma sequência scaffold-polyT, a sequência reportada na referência 2 foi usada. Um diagrama do vetor construído é mostrado na figura 8. (Na figura 8, a sequência alvo é a sequência guia aqui descrita). Especificamente, o cassete de expressão sgRNA foi projetado de modo que a sequência guia que exclui a sequência PAM (NGG) na extremidade 3' é inserida entre o promotor e a sequência scaffold-polyT. Life Technologies Corporation foi encarregada da síntese, através dos fragmentos de DNA GeneArt (marca registrada) Strings (marca), do cassete de expressão sgRNA no qual o sítio Kpnl e o sítio BamHI são adicionados à extremidade 5' e 3', respectivamente (Chem. 1). Cas9, na qual o sítio Ndel e o sítio Sail são adicionados à extremidade 5' e 3', respectivamente, foram obtidos através de Takara-Bio Inc. encarregada pela síntese do Cas9 (Chems. 2 e 3) .
Chem. 1
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TAT®AGCMTMGATMGTG^3TirnAWTAATHMTGG^ATC8TCCATA0ATKACTAATA(XCATG0CC
AGTACCCATGUMmUTATMraaTAATHCTaaCATCG^aMTCTAAACAMTaTGTOTATAT
ATAA€ACTGAGGGAGCAACATFGGTCag^stggtetc.aa^aa;it&cGTTTTA3AGCTAGAMTAG€AAGHAAAATA
AWWTÜÇGTTÃTmCTTGMAA^TGÚCACCGàGTCGGTGCTTmTTg^giçcasit [236] A porção sublinhada indica a sequência guia. A porção à montante da porção sublinhada indica a sequência promotora AtU3B. A porção à jusante da porção sublinhada indica a sequência scaffold-polyT. As letras minúsculas no terminal indicam sequências da enzima de restrição de Kpnl e BamHI.
Chem. 2
- Sequência Cas9 çatATGGATTACAAGGATGATGATGATAAGGATTACAAGGATGATGATGATAAGATGGCTCCAAAGAAGAAGAGAAA GGTTGGAATCCACGGAGTTCCAGCTGCTGATAAGAAGTACTCTATCGGACTTGACATCGGAACCAACTCTGTTGGAT GGGCTGTTATCACCGATGAGTACAAGGTTCCATCTAAGAAGTTCAAGGTTCTTGGAAACACCGATAGACACTCTATC
AAGAAGAACCTTATCGGTGCTCTTCTTTTCGATTCTGGAGAGACCGCTGAGGCTACCAGATIGAAGAGAACCGCTAG AAGAAGATACACCAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTTCAGGAAATCTTCTCTAACGAGATGGCTAAGGTTGATG
ATTCTTTCTTCCACAGACTTGAGGAGTCTTTCCTTGTTGAGGAGGATMGAAGCACGAGâGACACCCAATCTTCGGA
AACATCGTTGATGAGGTTGCTTACCACGAGAAGTACCCAACCATCTACCACCTTAGAAAGAAGTTGGTTGAnCTAC
CGATAAGGCTGATCTTAGACTTATCTACCTTGCTCTTGCTCACATGATCAAGTTCAGAGGACACnCCTTATÇGAGG GAGACCTTAACCCAGATAACTCTGATGTTGATAAGTTGTTCATCCAGCTTGTTCAGACCTACAACCAGCTTTTCGAG GAGAACCCAATCAACGCTTCTGGAGTTGATGCTAAGGCTATCCTTTCTGCTAGACTTTCTAAGTCTCGTAGACTTGA GÂACCTTATCGCTCAGCTTCCAGGAGAGAAGAAGAACGGACTTTTCGGAAACCTTATGGCTCTTTCTCTTGGACITA
CCCCAAACnCAAGTCTAACTTCGATOTGCTGAGGATGCTAAGTTGCAGCTTTCTAAGGATACCTACGATGATGAT CTTGATAACCnCTTGCTCAGATCGGAGATCAGTACGCTGATCnTTCCTTGCTGCTAAGAACCnTCTGATGCTAT
CCTTCTTTCTGACATCCTTAGAGTTAACACCGAGATCACCAAGGCTCCACTTTCTGCTTCTATGATCAAGAGATACG ATGAGCACCACCAGGATCTTACCCTTTTGAAGGCTCTTGTTAGACAGCAGCTTCCAGAGAAGTACAAGGAAATCTTC
TTÇGATCAGTCTAAGAACGGATACGCTGGATACATCGATGGAGGAGCTTCTCAGGAGGAGTTCTACÀAGTTCATCAA
GCCAATCCTTGAGAAGATGGATGGAACCGAGGAGCTTCTTGTTAAGTTGAAÇAGAGAGGATCTTCTTAGAAAGCAGA GAACCnCGATAACGGATCTATCCCACACCAGATCCACCTTGGAGAGCTTCACGCTATCCTTCGTAGACAGGAGGAT CTCTACCCATTCTTGAAGGATAACAGAGAGAAGATCGAGAAGATCCTTACÇTTCAGAATCCCATACTACGTTGGACC
AGGTMGTnC^CnCTA€OTGATATATAIATMTMmTaHMmGWMT.«MTATnCAMTAT nnnmMmAMAATGiAGBnwwTGCTTTTciGiAGrmhwrcH’GmnTwnmA
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98/135 aTWMCGAGmÁCCMGQTTAAGãM^nAWG^»ASAMGCCÀGCTTTCCTTTCrGGÁSÂGCASAÁ (^SGÇWCGnWCnCTmmfôCCMCÂSÂAAfíGTlACCGTTAAGCWTG&^GAGGÃTWnCàAGÁ ÂGÃMGWnWÁTTCTGnm^CTCTGGiGnG/^TÁGAnCMC^TTÇTmWAACCWXACGAT ..CHHÇMGA^ATÍXTOATM^TnCCnGATMC^AaGÃa^ASGâCATCCTTGAGGAaTCCnaTW CCnACaTOOA^AWOAGATMT^Â^AGAGA^^GAOTÁCmCAOTTTKGATGÂTMGGTrA TGMGCAGnGàAGÁfíâAGMmACACCGGATSGGGTAGACnTCTGSTMGTTGATaA^GMTaGÁGATMG CAGTCTGGÃÁOQCATCGT^ÁTTTCTTGAAGTCTGÃWÃTTCGCTMCÂSAtóCTKAIGCàGCnATCaaM TGÀnGTaTACmCAÀGOAGGàaiUASMGGCT^GGmCTGGACAKGAGATTCTCTTCAGGÁCCAÇÁW ÇTAÁOmWGmüTÍXAmÃTQAÀGâAOAATCaTCAGACüGTTÁAGGTTGWGÃTGÁGCri^HÃÀGGTT [412] A sequência continua abaixo
Chem. 3
ATGGGTAGACACAAGCCAGAGAACATCGITATCGAGATGGCTAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAA CTCTCGTGAGAGAATGAAGAGAATCGAGGAGGGAATCAAGGAGCTTGGATCTCAAATCTIGAAGGAGCACCCAGTTG AGAACACCCAGCTTCAGAACGAGAAGTTGTACCTTTACTACCTTCAGAACGGAAGAGATATGTACGTTGATCAGGAG CTTGACATCAACAGACTTTCTGATTACGATGTTGATCACATCGTTCCACAGTCTTTCTTGAAGGATGATTCTATCGA TAACAAGGTTCTTACCCGTTCTGATAAGAACAGAGGAAAGTCTGATAACGnCCATCTGAGGAGGTTGTTAAGAAGA TGAAGAACTACTGGAGACAGCTTCTTAACGCTAAGTTGATCACCCAGAGAAAGTTCGATAACCTTACCAAGGCTGAG AGAGGAGGACTrTCTGAGCTTGATAAGGCTGGÁTTCATCAAGAGACAGCTTGTTGAGACCAGACAGATCACCAAGCA CGTTGCTCAGATCCTTGATTCTCGTATGAACACCAAGTACGATGAGAACGATAAGTTGATCAGAGAGGTTAAGGTTA TCACC.TTGAAGrCTAAGTTGGTTTCTGATTTCAGAAAGGATTTCCAGTTCTACAAGGTTAGAGÁGATCAACAACTAC caccacgctcacgatgcttaccttaacgctgttgttggaáccgctcttatcaagaagtacccaaagttggagtctga GTTCGTTTACGGAGATTACAAGGTTTACGATGTTAGAAAGATGATCGCTAAGTCTGAGCAGGAGATCGGAAAGGCTA CCGCTAAGTACTTCTTCTACTCTAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTTGCTAACGGAGAGATÇAGA AAGAGACCACTTATCGAGACCAACGGAGAGACCGGAGAGATCGnTGGGATAAGGGAAGAGATTTCGCTACCGTTAG AAAGGTTCTTTGTATGCCACAGGTTAACATCGTTAAGAAAA.CCGAGGTTCAGACCGGAGGATTCTCTAAGGAGTCTA TCCTTCCAAAGAGAAACTCTGATAAGTTGATCGCTAGAAAGAAGGATTGGGACCCAAAGAAGTACGGAGGATTCGAT TCTCCAACCGHGCTTACTCTGnCITGTTGTTGCTAAGGTTGAGAAGGGAAAGTCTAAGAAGHGAAGTCTGTTAA GOAGCncnGGAATCACCATCATGGAGCGTTCTTCTTTCGAGAAGAACCCAATCGATHCCnGAGGCTAAGGGAT ACAAGGAGGTTAAGAAGGATCTTATCATCAAGTTGCCAAAGTACTCTCTTTTCGAGCTTGAGAACGGAAGAAAGAGA ATGCTTGCnCTGCTGGAGAGCTTCAGAAGGGAAACGAGCTTGCTCTTCCATCTAAGTACGTTAACTTCCTTTACCT TGCTTCTCACTACGAGAAGTTGAAGGGATCTCCAGAGGATAACGAGCAGAAGCAGCTTTTCGTTGAGCAGCACAAGC
ACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATCTCTGAGnCTCTAAGAGAGTTATCCTTGCTGATGCTAACCTTGATAAG
GTTCTnCTGCTTACAACAAGCACAGAGATAAGCCAATCAGAGAGCAGGCTGAGAACATCATCCACCTTTTCACCCT TACCAÂCCTTGGTGCTCCAGCTGCTTTCAAGTACTTCGATACCACCATCGATAGAAAAAGATACACCTCTACCAAGG AGGnCTTGATGCTACCCTTATCCACCAGTCTATCACCGGACTTTACGAGACCAGAATCGATCTTTCTCAGCTTGGA GGAGATAAGAGACCAGCTGCTACCAAGAAGGCTGGACAGGCTAAGMGAAGAAGTGAstçgaç
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99/135 [237] Na sequência Cas9 nas duas páginas acima, as porções sublinhadas indicam a sequência Ndel e a sequência Sail.
[238] Com o uso de pRI201-AN em cada um dos cassetes de expressão, Cas9 e sgRNA foram introduzidos, Agrobacteríum LBA4404 foi transformada por eletroporação. 0 Agrobacteríum foi crescido em uma placa AB contendo canamicina a 25 pg / ml. Então, Agrobacteríum de uma única colônia foi isolada.
Transformação do tabaco e cultivo de um transformante(b) [239] Segmentos de um cotilédone coletado do tabaco (variedade: SR-1) 10 dias após a semeadura foram cocultivados por 3 dias com o Agrobacteríum transformado obtido como descrito acima. Então, o Agrobacteríum foi, então, removido dos segmentos do cotilédone pela lavagem dos segmentos com o uso de água destilada contendo um agente bactericida (cefotaxime). Então, o Agrobacteríum foi completamente removido por cultura, por 4 dias, os segmentos do cotilédone lavados em meio Linsmaier e Skoog contendo um agente antibacteriano. Então, os segmentos do cotilédone foram transferidos para e cultivados em meio Linsmaier e Skoog contendo antibióticos (canamicina), de modo que indivíduos re-diferenciados (brotos) apresentando resistência à Canamicina foram obtidos. Os brotos foram transferidos para meio Linsmaier e Skoog e então enraizados. A partir dos brotos enraizados, os indivíduos apresentando alto nível de expressão de RNAmi de Cas9 (apresentando um nível de expressão duas vezes ou mais em comparação com elfa eucariótica que é o controle) foram selecionados, e então
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100/135 transplantado e crescidos em um vaso de 9 cm contendo solo para transplante (composto: 40 L, solo selvagem: 30 L, solo Akadama (pequeno): 10 L, solo Akadama (médio): 10 L, vermiculite: 10 L, fertilizante (S625) : 1000 g) .
Confirmação da presença / ausência de mutação e sequência mutante(c) [240] O PCR foi realizado pelo uso de DNA polimerase (Takara-Bio Inc.) Tks Gflex (marca) com DNA genômico como um modelo, em que o DNA genômico foi extraído de uma folha de um transformante de tabaco. As condições reacionais e iniciadores do PCR são como segue.
(Condições reacionais) segundos a 94 °C ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98 °C, 15 segundos a 55 °C e 60 segundos a 68 °C.
segundos a 68 °C (Iniciadores)
Genoma T
Combinação de NtBll-l_2A_Fl:
AAG TAT TAC TAC TACAAAAT T C CAAC G e Nb_B11_2A_R1:
C CAT C T GAT GAAGAACAAC T T GC
Genoma S
Combinação de NtBll-2_lA_Fl:
TTAAACACTAGAGAGTGAGAGAGTGC e NtBll-2_2A_Fl:
CAGAT GTTTAATTAT TAAGACAAAG T T C C.
[241] Após as reações de PCR, desnaturação e anelamento foram realizados sob as seguintes condições. Desnaturação: 5 minutos a 95 °C, anelamento: 1 segundo a 85 °C / 1 segundo a 85 °C, 1 segundo a 60 °C, constante a 30 °C. A taxa de declive de 85 °C a 60°C foi de 5 % (taxa de queda de 0,1 °C
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101/135 / segundo), e a taxa de declive de 60 °C a 30 °C foi de 10 % (taxa de queda de 0,1 °C / segundo). Os produtos de PCR de 5 μΐ após a desnaturação e anelamento foram tratados em um sistema reacional de 10 μΐ com o uso de T7 endonuclease I (New England Biolabs) de 1 U, e então foram separados por eletroforese. Então, foi verificado se os produtos de PCR foram clivados ou não pela enzima. Separadamente, os produtos de PCR foram clonados com o uso do Kit de Clonagem de PCR Zero Blunt TOPO, e a sequência de nucleotideo do clone foi determinada.
Seleção de um transformante(d) [242] Indivíduos de geração T0 apresentando mutações (deleção ou inserção de 1 ou mais bases) em um genoma T e um genoma S foram autofecundados e coletados, de modo que uma linhagem TI foi obtida. A presença / ausência das mutações nos indivíduos da linhagem TI foi confirmada como em (c) acima. Com base nos resultados da confirmação, os indivíduos de uma linhagem TI (T+S+) apresentando mutações de homozigose em um genoma T e um genoma S foram selecionados. Os indivíduos da linhagem TI (T+S+) foram autofecundados de modo que os indivíduos de uma linhagem T2 (T+S+) foram obtidos. Os indivíduos de uma linhagem T2 (T+S+) foram usados para um teste.
[243] Polipeptídeo mutante em indivíduos de linhagem T2 obtidos
2A-1_121, 2A-1_126, 2A-133_1, 2A-161_17 (Bll-1 - genoma T: deleção 1b) [244] Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, polipeptídeos (SEQ ID NOs. 92, 94, 96, 106) são produzidos de modo que 12 aminoácidos não relacionados (TGILNSRKSLWD)
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102/135 são adicionados em adição a até 107 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
2A-1_121, 2A-1_126 (Bll-2 - genoma S: deleção 5b) [245] Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, polipeptideos (SEQ ID NOs. 91, 93) são produzidos de modo que 3 aminoácidos não relacionados (LEY) são adicionados em adição a até 106 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
2A-133_1 (Bll-2 - genoma S: deleção 3b) [246] Um polipeptideo (SEQ ID NO. 95) de 337 aminoácidos, no qual o 107° N (asparagina) é deletado de 337 aminoácidos que constituem o WT, é produzido.
2A-161_8, 2A-161_122 (Bll-1 - genoma T: deleção 22b) [247] Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, polipeptideos (SEQ ID NOs. 104, 108) são produzidos de modo que 11 aminoácidos não relacionados (EILNSRKSLWD) são adicionados em adição a até 101 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[248] 2A-161_8, 2A-161_17, 2A-161_122 (Bll-2 - genoma S: deleção 2b) [249] Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, polipeptideos (SEQ ID NOs. 103, 105, 107) são produzidos de modo que 4 aminoácidos não relacionados (KLEY) são adicionados em adição a até 106 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
Avaliação dos brotos axilares em estufas(e) [376] Os indivíduos da linhagem T2 (T+S+) obtidos em (d) acima foram cultivados em uma estufa e brotos axilares foram avaliados. Os detalhes da avaliação são descritos em 2 - 2. acima.
[250] As Figuras 9 e 10 mostram os resultados da
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103/135 avaliação do desenvolvimento dos brotos axilares de mutantes nos quais mutações foram introduzidas no NtBll. Como mostrado nas Figuras 9 e 10, nenhum dos indivíduos nos quais as mutações foram introduzidas no gene NtBLl mostrou diferença significativa de uma planta tipo selvagem em relação ao número e peso de brotos axilares primários, e os indivíduos mostraram uma diminuição estatisticamente significativa no número e peso dos brotos axilares secundários em comparação com a planta tipo selvagem.
[251] Os resultados acima indicam também que, nos mutantes de NtBll, o desenvolvimento dos brotos axilares secundários foi seletivamente suprimido nos casos de supressão da expressão do gene.
Confirmação do efeito da mutação introduzida no gene alvo em posição na qual os brotos axilares se desenvolvem[4] [252] Os mutantes NtBll preparados pelo sistema CRISPR / Cas9 foram cultivados em Koitotron como no caso do WT (SR1) . 1 (Uma) semana após a poda, as posições nas quais os brotos axilares primários se desenvolveram foi verificada (parte superior da figura 11). A seleção foi feita do panei mutante Tsukuba No. 1. Os mutantes NtLS (linhagem homo) então preparados foram cultivados no campo como no caso dos mutantes NtLS (linhagem nula) . 63 dias após o transplante, a posição na qual os brotos axilares primários se desenvolveram foi verificada (parte inferior da figura 11).
[253] Como mostrado na figura 11, os dois mutantes mostraram que os brotos axilares primários foram formados em posições trocadas da axila foliar. Sendo assim, é extremamente fácil coletar brotos axilares primários a partir destes mutantes. Isto é significativo porque a coleta
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104/135 dos brotos axilares levanta os seguintes problemas. Em um caso em que os brotos axilares a serem coletados são formados em uma axila foliar, existe uma possibilidade de que um galho em que a folha a ser colhida está localizada possa ser danificado. Tal dano pode se tornar uma via através da qual um patógeno invade. Isto pode apresentar um efeito adverso considerável no rendimento e na qualidade das folhas.
Confirmação do efeito da mutação introduzida no gene alvo no crescimento da planta de tabaco[5]
Alvo a ser testado(a) [380] Os efeitos de cada mutação do gene nas seguintes linhagens no crescimento de uma planta foram examinados como descrito abaixo: (i) a linhagem avaliada em (c) de 3 - 1 e (ii) a linhagem T3 a qual é uma progênie autofecundada de B11_2A-1_121 avaliada em (e) de 3 - 3. Como um grupo de comparação, as variedades usadas para a produção de cada mutante foram usadas.
Condições(b) [381] Em uma estufa (em uma temperatura fixa de 25 °C), cada indivíduo plantado em um vaso de 9 cm foi cultivado até o crescimento dos galhos. A composição do solo rico é idêntica àquela descrita em 2 - 2. No momento do crescimento dos galhos, a altura da planta, peso fresco e peso seco de cada indivíduo e o comprimento da folha e largura da folha em cada posição da folha foram medidos. Uma altura da planta é um comprimento a partir da superfície do solo rico em um vaso até a base do galho florido mais alto. Um peso fresco é um peso total das 16 folhas acima do solo (mutante NtLS, mutante NtREV) ou das 14 folhas acima do solo (mutante NtBll) imediatamente após as folhas terem sido colhidas. Um peso
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105/135 seco é um peso de folhas colhidas (cujo peso fresco foi medido) após serem secas por ar quente em uma temperatura de 70 °C e uma umidade relativa de 7 %. Um comprimento da folha é uma distância sensata do comprimento do peciolo até a ponta de uma folha. Uma largura da folha é a largura máxima de uma folha. A fim de determinar o comprimento da folha e largura da folha, os números para indicar as posições da folha foram designados da folha mais baixa (1) para a folha mais alta, em ordem.
Resultados(c) [254] Como fica claro a partir da figura 12 (mutante: n = 3, WT (Tsukuba No. 1) : n = 2) , da figura 13 (mutante e WT (Tsukuba No. 1): n = 3), e da figura 14 (mutante: n = 2, WT (Tsukuba No. 1) : n = 3), não houve diferença estatisticamente significativa entre o grupo mutante e o grupo controle em relação à altura da planta, peso fresco e peso seco. Em adição, como fica claro a partir destas figuras, não há também diferença notável entre o grupo mutante e o grupo controle em relação ao comprimento da folha e largura da folha.
[255] Os efeitos acima indicam que cada mutante mostra um crescimento e rendimento de folha os quais são substancialmente idênticos ao grupo controle. Foi, dessa forma, observado que, devido às seguintes razões (1) a (3), os mutantes de acordo com estes Exemplos são extremamente úteis como plantas de tabaco a partir das quais as folhas tem a intenção de serem colhidas: (1) é fácil controlar os brotos axilares, (2) não há diminuição no rendimento e (3) a planta é altamente provável de sobreviver.
Confirmação do efeito da mutação introduzida no gene
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106/135 alvo no desenvolvimento de brotos axilares (2) [6] [256] Mutantes apresentando os perfis abaixo foram preparados e os mutantes a seguir foram avaliados: (i) um estado de crescimento, (ii) desenvolvimento de brotos axilares e (iii) desenvolvimento de brotos axilares em um caso em que um agroquímico para a supressão dos brotos axilares foi usado.
[257] LS_21_Null: Um mutante (T+S+) o qual (i) é um indivíduo F3 obtido a partir de um indivíduo Fl, o qual foi obtido pelo cruzamento de um mutante Ns369 e mutante Ntl025, por autofecundação duas vezes, (ii) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ns369 (expressando um polipeptídeo de SEQ ID NO. 41) em um genoma S e (iii) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ntl025 (expressando um polipeptídeo de SEQ ID NO. 40) em um genoma T.
[258] LS19_WT: Um mutante (T~S~) o qual (i) é um indivíduo F3 obtido a partir de um indivíduo Fl, o qual foi obtido pelo cruzamento de um mutante Ns369 e mutante Ntl025, por autofecundação duas vezes e (ii) não apresenta mutação do gene LS um genoma T ou um genoma S.
[259] LS15_Null, LS85_Null: Mutantes (T+S+) cada um dos quais (i) são um indivíduo F3 obtido a partir de um indivíduo Fl, o qual foi obtido pelo cruzamento de um mutante Ns369 e mutante Ntll45, por autofecundação duas vezes, (ii) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ns369 (expressando um polipeptídeo de SEQ ID NO. 41) em um genoma S, e (iii) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ntll45 (expressando um polipeptídeo de SEQ ID NO. 39) em um genoma T.
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107/135 [260] LS_57_WT: Um mutante (T~S~) o qual (i) é um indivíduo F3 obtido a partir de um indivíduo Fl, o qual foi obtido pelo cruzamento de um mutante Ns369 e mutante Ntll45, por autofecundação duas vezes e (ii) não apresenta mutação do gene LS um genoma T ou um genoma S.
[261] REV_26_Nu-W e REV_89_Nu-W: Mutantes cada um dos quais são obtidos como segue. K326 foi cruzado com o seguinte mutante (T+S+) de modo a obter El: o mutante (T+S+) o qual (i) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ntl605 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 37) em um genoma Te (ii) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Nsl630 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 39) em um genoma S. K326 foi retrocruzado com El uma vez de modo a obter BC1F1. O BC1F1 foi autofecundado duas vezes de modo a obter indivíduos BC1F3. Dos indivíduos BC1F3, o seguinte mutante (T+S~) foi considerado como cada um de REV_2 6_Nu-W e REV_8 9_Nu-W: o mutante (T+S~) o qual (i) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ntl605 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 37) em um genoma Te (ii) não apresenta mutação do gene REV em um genoma S.
[262] REV_26_Nu-He e REV_89_Nu-He: Mutantes cada um dos quais são obtidos como segue. K326 foi cruzado com o seguinte mutante (T+S+) de modo a obter El: o mutante (T+S+) o qual (i) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ntl605 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 37) em um genoma Te (ii) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Nsl630 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 39) em um genoma S. K326 foi retrocruzado com El uma vez de modo a obter BC1F1. O BC1F1 foi autofecundado duas vezes de modo a obter indivíduos BC1F3. Dos indivíduos BC1F3, o
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108/135 seguinte mutante (T+S+/~) foi considerado como cada um de REV_26_Nu-He e REV_89_Nu-He: o mutante (T+S+/~) o qual (i) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ntl605 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 37) em um genoma T e (ii) heterozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Nsl630 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 39) em um genoma S.
[263] REV35_WT: Um mutante o qual foi obtido como segue. K326 foi cruzado com o seguinte mutante (T+S+) de modo a obter El: o mutante (T+S+) o qual (i) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ntl605 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 37) em um genoma T e (ii) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Nsl630 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 39) em um genoma S. K32 6 foi retrocruzado com El uma vez de modo a obter BC1F1. O BOIEI foi autofecundado duas vezes de modo a obter indivíduos BC1F3. Dos indivíduos BC1F3, o mutante (T+S~) o qual não apresenta mutação do gene REV em um genoma T ou um genoma S foi considerado como REV35_WT.
[264] REV_F3_Null: Um mutante (T+S+) o qual (i) é um indivíduo F3 obtido a partir de um indivíduo El, o qual foi obtido pelo cruzamento de um mutante Ntl605 e mutante Nsl630, por autofecundação duas vezes, (ii) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Ntl605 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 37) em um genoma T, e (iii) homozigoticamente apresenta uma mutação do mutante Nsl630 (expressando um polipeptideo de SEQ ID NO. 39) em um genoma S .
[265] REV_F3_WT: Um mutante (T~S~) o qual (i) é um indivíduo F3 obtido a partir de um indivíduo El, o qual foi
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109/135 obtido pelo cruzamento de um mutante Ntl605 e mutante Nsl630, por autofecundação duas vezes e (ii) não apresenta mutação do gene REV em um genoma T ou um genoma S.
Avaliação do crescimento[1] [266] O exame foi conduzido usando (i) 3 linhas de linhagens nulas de mutantes LS, (ii) 2 linhagens que atuam como controles de linhagens nulas mutantes, e (iii) Tsukuba No. 1, a qual é uma variedade parental do mutante. Como as linhagens nulas mutante, as seguintes foram usadas: LS_21l_Null, LS_15_Null, e LS_85_Null. Os controles das linhagens nulas do mutante foram os seguintes. LS_19_WT, a qual é uma linhagem segregada F2 e não apresenta mutação em LS, foi utilizada como controle da linhagem nula mutante LS_21l_Null. LS_57_WT, a qual é uma linhagem segregada F2 e não apresenta mutação em LS, foi utilizada como controle da linhagem nula mutante LS_15_Null e LS_85_Null.
[267] No campo do Tabacco Leaves Research Center, durante um período de cultivo um pouco mais tardio do que um período de cultivo normal (semeadura em março a abril e plantio em maio), os indivíduos de cada linhagem acima foram cultivados por um método de cultivo por adubação verde com grandes declives sob as seguintes condições. Distância do plantio: 43 cm e intervalos de declives: 120 cm. Como fertilizante, composto em uma quantidade de 2000 kg / 10 a e Agri 622 em uma quantidade de 120 kg / 10 a foram usados. A avaliação foi feita para os dias de floração, a altura da planta, o número de folhas acima do solo, o peso de folha fresca e o peso seco dos indivíduos de cada linhagem cultivada. Os dias de floração é, aqui, o número de dias contados da data na qual a semeadura foi realizada até a
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110/135 data na qual a primeira flor floresce. A altura da planta se refere à altura do solo até a base do galho com flor mais alto. O número de folhas acima do solo se refere a um número total de folhas localizadas a partir do solo até as folhas localizadas imediatamente abaixo do primeiro galho com flor. O peso da folha fresca foi o peso total de todas as folhas acima do solo antes da secagem. O peso seco foi o peso de todas as folhas acima do solo após a secagem. Avaliaram-se 6 indivíduos de cada linhagem, e uma média dos valores avaliados e um desvio padrão foram calculados. Examinou-se se houve ou não alguma diferença estatisticamente significativa em relação ao valor avaliado entre as linhagens nulas mutantes e os controles.
[268] Os resultados serão descritos abaixo com referência a figura 15. Não houve diferença significativa no valor avaliado entre os controles e as linhagens nulas mutantes, exceto que (i) a altura da planta de LS_15_Null foi significativamente maior do que a do controle (LS_57_WT), (ii) os dias de florescimento de LS_15_Null foram significativamente menores do que os do controle LS_57_WT, e (iii) o número de folhas acima do solo de LS_85_Null foi significativamente maior do que o do controle (LS_57_WT). O fato acima indica que as mutações dos genes LS não têm grandes efeitos sobre o crescimento.
Avaliação do desenvolvimento dos brotos axilares[2] [269] Cada indivíduo foi cultivado como em (1) acima.
Mutantes LS e os seus controles foram os seguintes. A linhagem nula mutante (LS_21) e o controle da mesma (LS_19_WT) e os mutantes nulos LS (LS_15, LS_85) e os controles do mesmo (LS57_WT) foram utilizados para um teste.
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LS_21 foi cultivada em dois desclives para realizar um teste replicado. Como REV_ mutantes, 4 linhagens (de REV_26_Nu-W, REV_26_Nu-He, REV89_Nu-W, REV_89_Nu-He) de linhagens segregadas BC2F3 foram submetidas a retro cruzamento (retro cruzamento parental: K326) . Quanto ao controle dos mutantes REV, utilizou-se o controle (REV_35_WT) das 4 plantas. Além disso, o mutante nulo REV (REV_F3_Null) não foi submetido a retro cruzamento e o controle do mesmo (REV_F3_WT) também foi utilizado como o mutante REV e o controle do mesmo. Além disso, o Tsukuba No. 1, que é uma variedade parental de cada mutante, e K326, que é um parental de retro cruzamento de linhagem segregada BC2F3, também foi usado para o teste.
[270] Durante o periodo de floração, a poda foi realizada imediatamente abaixo do primeiro galho com flor. Então, brotos axilares produzidos em folhas acima do solo foram examinados. O primeiro exame foi realizado no dia da poda e, nas semanas seguintes, foi realizado 1 exame por semana, totalizando 8 exames realizados. Os brotos axilares com comprimento de caule de 5 mm ou mais foram examinados para que, para cada indivíduo, fossem registradas as posições de brotos axilares coletadas e, após a coleta dos brotos axilares, fosse medido o peso dos brotos axilares. Brotos axilares primários, secundários e axilares, e brotos axilares terciários foram examinados separadamente e contados.
[271] Os resultados serão descritos abaixo com referência às Figuras 16 e 17. A figura 16 mostra os resultados da avaliação dos mutantes LS e a figura 17 mostra os resultados da avaliação dos mutantes REV.
[272] Como mostrado na figura 16, cada uma das 3
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112/135 linhagens nulas mutante LS exibiram uma tendência de que (i) o número dos brotos axilares primários é maior em comparação com o controle e (ii) o peso da folha fresca (FW) é menor em comparação com o controle. 0 número dos brotos axilares primários das linhagens nulas mutante LS é grande, possivelmente devido ao fato de que as linhagens nulas mutante LS tendem a apresentar um número de folhas acima do solo em comparação com os controles (a figura 15). Enquanto isso, os brotos axilares secundários e brotos axilares terciários foram amplamente reduzidos em comparação com os controles ou não foram formados. Os resultados acima confirmaram que a formação de brotos axilares secundários e subsequentes brotos axilares de mutantes apresentando diferentes mutações de LS é suprimido.
[273] Como mostrado na figura 17, o REV_F3, no qual mutações foram introduzidas em todos os alelos do gene REVs, mostrou que não foram formados brotos axiliares secundários ou brotos axilares terciários. Em adição, de acordo com 2 linhagens (REV_26_Nu-He, REV_89_Nu-He) em que 2 alelos em um genoma T têm mutações e 1 alelo em um genoma S tem uma mutação, brotos axilares secundários são formados, mas o número de brotos axilares secundários e o peso da folha fresca foram diminuídos a 1/2 ou menos em relação aos do controle (REV_35_WT). A diminuição é estatisticamente significativa.
[274] Enquanto isso, de acordo com 2 linhagens (REV_26_Nu-W, REV_89_Nu-W) nas quais dois alelos em um genoma T apresentam mutações e nenhuma mutação ocorreram em um genoma S, o número de brotos axilares secundários e o peso da folha fresca foram equivalentes em relação a aqueles do
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113/135 controle (REV_35_WT) . Sendo assim, em termos do gene REV, confirmou-se que a introdução de mutações no total de 3 alelos produz o efeito de suprimir os brotos axilares secundários mesmo que as mutações não sejam introduzidas em todos os alelos em um genoma T e um genoma S.
Desenvolvimento dos brotos axilares em um caso em que agroquímicos para a supressão dos brotos axilares é usado[3] [275] Com o uso de um vaso (diâmetro interno: 25 cm, altura: 24 cm) que foi preenchido com 5 L de solo rico, indivíduos foram cultivadas em uma tenda de rede. A composição do solo rico foi a seguinte. Composto: 40 L, solo selvagem: 10 L, areia Kiryu: 15 L, solo Akadama (pequeno) : 15 L, solo Akadama (médio): 15 L, vermiculite: 10 L, Burley S625 (fertilizante) : 1000 g. a semeadura foi realizada em maio, e, após aproximadamente 1,5 meses passados desde o transplante, 2 L de solo rico foi adicionado. Durante o tempo de floração, até 2 folhas abaixo do primeiro galho com flor foram cortados (poda), e, 3 dias depois, Contact (OAT Agrio Co., Ltd.) diluído 30 vezes foi aplicado em uma quantidade de 20 ml por indivíduo. 4 a 7 dias após a aplicação, foi verificado se o Contact entrou ou não em contato com os brotos axilares primários e os brotos axilares primários nos quais o Contact não entrou em contato foram registrados. Após o crescimento, os brotos axilares primários com os quais o Contact não estava em contato foram removidos. Em seguida, os brotos axilares secundários formados nos sítios em que o Contact não estava em contato com os brotos axilares primários foram excluídos e submetidos a exame. Um indivíduo tinha uma média de 1 a 2 sítios em que o Contact não estava em contato com os brotos axilares primários. Após a aplicação
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114/135 do Contact, a ocorrência de brotos axilares secundários foi examinada uma vez por semana, no total de 13 vezes. Como o número médio de folhas produzidas por linhagem variou entre 25 e 31, foram feitas comparações entre as proporções de brotos axilares secundários em relação ao número de folhas produzidas. LS_15_null e LS_85_null, que são mutantes nulos de LS, foram comparados com seu controle LS_77_wt em que nenhuma mutação ocorreu para LS. LS_14_null e LS24_null, que são mutantes nulos de LS, foram comparados com o seu controle LS_19_wt em que nenhuma mutação ocorreu para LS.
[276] Os resultados serão descritos abaixo com referência a Figura 18. Devido à mutação do gene LS, houve uma grande e estatisticamente significativa diminuição no número de brotos axilares secundários que ocorreram (em relação ao número de folhas produzidas) após a aplicação de Contact.
Confirmação do efeito da mutação introduzida no gene alvo no desenvolvimento de brotos axilares (3) [7]
Mutante REV e mutante #15360)[7-1] [277] Com o uso do sistema CRISPR / Cas9, novos mutantes foram preparados e o desenvolvimento de brotos axilares foi avaliado. Uma vez que o procedimento do preparo estava de acordo com a descrição de 3 - 3, apenas as diferenças de 3 - 3 serão descritas abaixo.
Preparo para a transformação(a) [278] Na construção dos vetores para a transformação do Agrobacterium, Life Technologies Corporation foi encarregado da síntese dos cassetes de expressão de sgRNA. A sequência de nucleotídeos dos cassetes de expressão sgRNA obtidos são como segue.
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Chem. 4
REVG2 aattggtaccAAGCTTCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTC
TTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAA
CTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATT
TGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCA
GGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACA
TCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTgagttcctttccaaggctacGT TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT
Tggatccaatt
Chem. 5
REVG5 aattggtaccAAGCITCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTC
TTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAA
CTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATT
TGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCA
GGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACA TCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTggagtggcagcccgagcatgGT
TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT
Tggatccaatt
Chem. 6
R0XG1 aattggtaccAAGCTTCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTC TTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAA
CTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATT
TGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCA
GGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCT.TATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACA
TCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTgtgtagcagctcgtgaaagaGT TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT
Tggatccaatt [279] Em cada um dos três cassetes de expressão de sgRNA acima, (i) a porção sublinhada indica a sequência guia, (ii) a porção à montante da porção sublinhada indica a sequência promotora AtU6-26, (iii) a porção à jusante da porção sublinhada indica a sequência scaffold-polyT e (iv) as letras minúsculas no terminal indicam sequências da enzima de restrição de Kpnl e BamHI.
Transformação do tabaco e cultivo do transformante(b) [280] A transformação de uma planta de tabaco e o
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116/135 cultivo do transformante foram como descritos em (b) de 3 3, exceto que a seleção de indivíduos com base no nível de RNAm Cas9 não foi realizada.
Confirmação da presença / ausência de mutação e sequência mutante(c) [281] Os seguintes foram avaliados como descrito em (c) de 3 - 3: (i) a presença / ausência de uma mutação nos transformantes cultivados e (ii) as sequências mutantes. Iniciadores para a amplificação específica de uma região contendo uma sequência guia no DNA genômico foram projetados. As sequências dos iniciadores são mostradas na Tabela que segue.
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117/135 [Tabela 3]
| Nome do iniciador | Sequência | Amiostra alvo | Genoma analisado |
| REV Nt in2 Fl | AACCAATGGACAAGAAACGGATGGCA | REVG2 | genoma T |
| REV Nt in4 Rl | TTTAGCTATCCAGTCAAAGAGGCACG | ||
| REV Ns in2 Fl | C CAATAAACAAGAAACAGAT GAT GG | genoma S | |
| REV Ns in4 Rl | GAGACAT GGCAATAC T GAAT T T T CA | ||
| REV Nt in4 Fl | AAAAAAATTCAGTATTGCCACGTGC | REVG5 | genoma T |
| REV Nt in6 Rl | AG C C TAC G T GAAGAT T GAT GAGAAA | ||
| REV Ns in4 Fl | GAAAAT T CAG TATTGCCATGTC | genoma S | |
| REV Ns in6 Rl | AG C C TAC G T GAAGAT T GAT GAGAAG | ||
| 1536O-1 F1 | TGCATGGACAATCTCCTCTT | ROXG1 | genoma T |
| 15360-l Rl-2 | CAACAG GAG T T GAG TTATTCTCAT | ||
| 1536O-2 F1 | GCATGGACAATCTCATCTTCTC | genoma S | |
| 1536O-2 R1 | CTGGGCAATATTCCACCATT |
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118/135 [282] As condições reacionais do PCR foram como segue.
- (REVG2) segundos a 94 °C ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98 °C, 15 segundos a 60 °C e 50 segundos a 68 °C
- (REVG5, ROXG1) segundos a 94 °C ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98 °C, 15 segundos a 62 °C e 50 segundos a 68 °C.
Seleção de transformantes(d) [412] Indivíduos da geração T0 apresentando mutações (deleção ou inserção de 1 ou mais bases) em um genoma T e um genoma S foram autofecundados e coletados, de modo que uma linhagem TI foi obtida. A presença / ausência da mutação nos indivíduos da linhagem TI e a sequência nos indivíduos da linhagem TI foram confirmados com o uso de iniciadores mostrados na Tabela 3. Indivíduos Tl, nos quais mutações ocorreram para todos os 4 alelos de um genoma S e um genoma T, foram selecionados e usados para o teste. Os detalhes para os indivíduos Tl obtidos são como segue.
- REV_G2-15 [413] Genoma T: 6 bases CAAGGC são deletadas. Enquanto WT consiste em 839 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 65) é produzido de modo que 2 aminoácidos (KA) (175° e 176° aminoácidos) são deletadas de modo a constituir 837 aminoácidos.
[414] Genoma S: 1 base A é inserida. Enquanto WT consiste em 838 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 64) é produzido de modo que 5 aminoácidos não relacionados (YRNCC) são adicionados em adição a uma sequência de
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119/135 aminoácido na qual até 176 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
- REV_G2_94 [415] Genoma T: 1 base T é inserida. Enquanto WT consiste em 839 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 67) é produzido de modo que 5 aminoácidos não relacionados (YRNCC) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 176 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
[416] Genoma S: 1 base T é inserida. Enquanto WT consiste em 838 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 66) é produzido de modo que 5 aminoácidos não relacionados (YRNCC) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 176 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
- REV_G5_18 [417] Genoma T: 1 base C é inserida. Enquanto WT consiste em 839 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 68) é produzido de modo que 4 aminoácidos não relacionados (MWSC) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 212 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
[418] Genoma S: 5 bases TCGAC são inseridas. Enquanto WT consiste em 838 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 69) é produzido de modo que 7 aminoácidos não relacionados (RHWLLV) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 212 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
- REV_G5_59 [419] Genoma T: 28 bases são deletadas. Enquanto WT consiste em 839 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 71)
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120/135 é produzido de modo que 54 aminoácidos não relacionados (QRLLRSSKIDLLGSEIAGTLKFSQCFLQEMEQLNFCTRRYMLLPPWLLHVIFGL) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 211 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
[420] Genoma S: 3 bases GCA são deletadas. Enquanto WT consiste em 838 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 70) é produzido de modo que 1 aminoácido (A) (212° aminoácido) é deletado de modo a constituir 837 aminoácidos.
- ROX_G1-1 (1536O_G1-1), RQXGl-30 (15360_Gl-30) [421] Genoma T: 1 base A é inserida. Enquanto WT consiste em 165 aminoácidos, polipeptideos (SEQ ID NOs. 123, 125) são produzidos de modo que 3 aminoácidos não relacionados (KKA) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 40 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
[422] Genoma S: 1 base A é deletada. Enquanto WT consiste em 168 aminoácidos, polipeptideos (SEQ ID NOs. 122, 124) são produzidos de modo que 14 aminoácidos não relacionados (EGIESVIVSRFCRV) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 40 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
- ROX_G1-131 (1536O_G1-131) [423] Genoma T: 1 base A é deletada. Enquanto WT consiste em 165 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 129) é produzido de modo que 14 aminoácidos não relacionados (EGIESVIVSRFCRV) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 40 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
[424] Genoma S: 39 bases e 13 bases são inseridas. Enquanto WT consiste em 168 aminoácidos, um polipeptideo
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121/135 (SEQ ID NO. 128) é produzido de modo que 4 aminoácidos não relacionados (FLCG) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 39 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
- ROX_Gl-46 (15360_Gl-46) [425] Genoma T: 20 bases são deletadas. Enquanto WT consiste em 165 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 127) é produzido de modo que 3 aminoácidos não relacionados (ENQ) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 36 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
[426] Genoma S: 1 base G é inserida. Enquanto WT consiste em 168 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 126) é produzido de modo que 3 aminoácidos não relacionados (EKA) são adicionados em adição a uma sequência de aminoácido na qual até 40 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
(e) Avaliação do desenvolvimento de brotos axilares em estufa [427] Os indivíduos da linhagem TI obtidos em (d) acima foram cultivados em uma estufa e avaliados de acordo com a descrição de 2 - 2. As Figuras 19 e 20 mostram os resultados da avaliação de mutantes REV e a figura 21 mostra os resultados da avaliação de mutantes#15360.
[428] Como mostrado nas Figuras 19 e 20, nenhuma das 4 linhagens nas quais as mutações foram introduzidas dentro de REV mostraram qualquer diferença significativa de uma planta tipo selvagem em relação ao número e peso fresco de brotos axilares primários e as 4 linhagens mostraram uma diminuição estatisticamente significativa no número e peso fresco de brotos axilares secundários em comparação com a planta tipo selvagem. Como mostrado na figura 21, nenhuma das 4 linhagens
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122/135 nas quais as mutações foram introduzidas em #15360 mostraram qualquer diferença significativa de uma planta tipo selvagem em relação ao número e peso fresco de brotos axilares primários, e as 4 linhagens mostraram uma diminuição estatisticamente significativa no número e peso fresco de brotos axilares secundários em comparação com a planta tipo selvagem. Em relação a REV, os resultados acima revelam que o desenvolvimento de brotos axilares secundários foi seletivamente suprimido não apenas nos mutantes selecionados dentre TUM preparados pelo tratamento com EMS porém também uma pluralidade de diferentes mutantes preparados pelo sistema CRISPR / Cas9. Em relação ao #15360, foi confirmado que o desenvolvimento de brotos axilares secundários foi seletivamente suprimido em uma pluralidade de diferentes mutantes preparados pelo sistema CRISPR / Cas9 como no caso da supressão da expressão do gene.
Mutante Bll e mutante LS)[7-2]
Preparo para a transformação[1] [429] Na construção dos vetores para a transformação do Agrobacterium, Life Technologies Corporation ficou encarregada da síntese, através de Faixas (marca) de Fragmentos de DNA GeneArt (marca registrada), do cassete de expressão sgRNA no qual o sítio Kpnl e o sítio BamHI foram adicionados na extremidade 5' e extremidade 3', respectivamente. As sequências de bases do cassete de expressão do sgRNA obtidas são como segue.
Chem. 7
2HU& 2HO, ãattoUeeAGÂAA.Tf?rCÀÁA.AncCGíX,.AGAACAÀnTTGÁÀTCTCGÁTCCGTAGÁAACGA6ACG6TCAHGHTTÀG TWaCGACGAIUTAtTTGAAATnACGTGAGTGTGASTGAGAGnGCATMGMAATAAAATCTTTAGTTGGGAAAAA
AnCUTAATATAtóTGfiGCnGAfiMGGAAÁGa«AGGGÂTAÇGCCnTTrCTAMAUGGCCCATTTAAGCTAITAACÁA
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123/135
TC I rCAM>âCCãCAG-CGLT T AM?! AAAGAAAGCáGL TgAG T TT AT A TA I CvTT AGAGACvftAG IAG .i GA11 ί.\§8 gt^gteg«'Ugag»6nTTAGAGCTAGAAATÁSCAA^TTÁAAÁTAÀGG€TAGTCC6TTÁTCMCTTGÁMAAGT^G€ÀCC G A6IWCmTnW tecaa U [444] Na sequência acima, (i) a porção sublinhada indica a sequência guia, (ii) a porção à montante da porção sublinhada indica a sequência promotora AtU6-l, (iii) a porção à jusante da porção sublinhada indica a sequência scaffold-polyT e (iv) as letras minúsculas no terminal indicam sequências da enzima de restrição de Kpnl e BamHI.
[412] Em adição, cassetes de expressão sgRNA, nos quais o sitio Kpnl e o sitio BamHI são adicionados à extremidade 5' e à extremidade 3', respectivamente, foram sintetizados pelo uso de serviços de síntese genética de Eurofins Genomics K.K. A sequência de nucleotídeos dos cassetes de expressão sgRNA obtidos são como segue. Note que a transformação subsequente do tabaco e o cultivo do transformante não são diferentes da descrição em 3-3 acima e, sendo assim, não serão descritos.
Chem. 8
LS_1A aattggtaccTTTACTTTAAATTTTTTCTTATGCAGCCTGTGATGGATAACTGAATCAAACAAATGGCGTCTGGGTTTAA GAAGATCTGTTTTGGCTATGTTGGACGAAACAAGTGAACTTTTAGGATCAACTTCAGTTTATATATGGAGCTTATATCGA GCAATAAGATAAGTGGGCTTTTTATGTAATTTAATGGGCTATCGTCCATAGATTCACTAATACCCATGCCCAGTACCCAT GTATGCGTTTCATATAAGCTCCTAATTTCTCCCACATCGCTCAAATCTAAACAAATCTTGTTGTATATATAACACTGAGG GAGCAACATTGGTCactgtgtattttatcttcacGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTAT
CAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTggatccaatt
Chem. 9
LS_3A aattggtaccTTTACTTTAAATTTTTTCTTATGCAGCCTGTGATGGATAACTGAATCAAACAAATGGCGTCTGGGTTTAA GAAGATCTGTTTTGGCTATGTTGGACGAAACAAGTGAACTTTTAGGATCAACTTCAGTTTATATATGGAGCTTATATCGA GCAATAAGATAAGTGGGCTTTTTATGTAATTTAATGGGCTATCGTCCATAGATTCACTAATACCCATGCCCAGTACCCAT GTATGCGTTTCATATAAGCTCCTAATTTCTCCCACATCGCTCAAATCTAAACAAATCTTGTTGTATATATAACACTGAGG GAGCAACATTGGTCacgagtaattctttcttcttGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTAT CAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTggatccaatt
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124/135
Chem. 10
B1„4A aattggtaccTTTACTTTAAATTTTTTCTTATGCAGCCTGTGATGGATAACTGAATCAAACAAATGGCGTCTGGGTTTAA GAAGATCTGTTTTGGCTATGTTGGACGAAACAAGTGAACTTTTAGGATCAACTTCAGTTTATATATGGAGCTTATATCGA
GCAATAAGATAAGTGGGCTTTTTATGTAATTTAATGGGCTATCGTCCATAGATTCACTAATACCCATGCCCAGTACCCAT GTATGCGTTTCATATAAGCTCCTAATTTCTCCCACATCGCTCAAATCTAAACAAATCTTGTTGTATATATAACACTGAGG GAGCAACATTGGTCagctaacaagttgtaccaaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATC .AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTggatccaatt [430] Em cada das três sequências acima, (i) a porção sublinhada indica a sequência guia, (ii) a porção à montante da porção sublinhada indica a sequência promotora AtU3B, (iii) a porção à jusante da porção sublinhada indica a sequência scaffold-polyT e (iv) as letras minúsculas no terminal indicam sequências da enzima de restrição de Kpnl e BamHI.
Confirmação da presença / ausência de mutação e sequência mutante (b) [412] Os seguintes foram avaliados como descrito em (c) de 3 - 3: (i) na presença / ausência de uma mutação nos transformantes cultivados e (ii) nas sequências mutantes. Iniciadores para amplificar especificamente uma região contendo uma sequência guia em DNA genômico foram projetadas. As sequências dos iniciadores são como segue. Em adição, como mostrado abaixo, o PCR foi realizado com apenas parte das condições alteradas.
- (2A-1_14, 2A-1_19, 2A-1_119, 2A-l_120, 2A_133_17,
2A_133_122, 2A_133_142: genoma T)
Combinação de NtBll-l_2A_Fl:
AAG TAT TAC TAC TACAAAAT T C CAAC G e Nb_B11_2A_R1:
C CAT C T GAT GAAGAACAAC T T GC
- (2A-1_14, 2A-1_19, 2A-1_119, 2A-l_120, 2A_133_17,
2A_133_122, 2A_133_142: genoma S)
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125/135
Combinação de NtBll-2_lA_Fl:
TTAAACACTAGAGAGTGAGAGAGTGC e NtBll-2_2A_Fl:
CAGAT GTTTAATTAT TAAGACAAAG T T C C
- (2G-35_10 2G-37_103, 2G-126_10, 2G-126_139: genoma T)
Combinação de NtBll-l_2G_Fl: ATATGTTTGAATATAGGGGGAGGG e NtBll-l_2G_Rl: TGGTTTACAAAAGGAAAAGTTTTC
- (2G-35_10, 2G-37_103, 2G-126_10, 2G-126_139: genoma S)
Combinação de NtBll-2_2G_Fl: ATATGTTTGAGTATAAAGGGAGGA e NtBll-2_2G_Rl: TTGGTTTACTAGAGAAAAAATTTCC
- (LS_lA-8_4, 13, LS_lA-9_32, 48: genoma T)
Combinação de LS_1A_F_T: TACCGGTACTGGAAATGACCTC e LS_1A_R_T: TCCTTAACATTTCGCGGTCT (LS_lA-8_4, 13, LS_lA-9_32, 48: genoma S)
Combinação de LS_1A_F_S: CCGGTACTGGAAATGACCTTG e LS_1,2_R3: GCAAAGTTGCTTCCAATGAAT
- (LS_3A-12, LS_3A-15, e LS_3A-30: genoma T)
Combinação de LS_3A_4G_F_T: GTTTGGTTCGGAAGAGAAATTATAG e LS_3A_4G_R_T: CTTTGTCCTTCACCATGCAG
- (LS_3A-12, LS_3A-15, e LS_3A-30: genoma S)
Combinação de LS_3A_4G_F_S: TTGGTTCGGGAGAGAAATAATTGA e LS_3A_4G_R_S: CGCCAAGAAGATATGGAAAA (B1_4A-11, B1_4A-13, B14A-16: genoma T)
Combinação de B1_3A_4A_F_T: ATTTCTTCTGCCCACCAGC e B1_3A_4A_R_ST: TCTCATCATTGAACACGAACA (B1_4A-11, B1_4A-13, B14A-16: genoma S)
Combinação de B1_3A_4A_F_S: CCTAATTTGGGTGCTACAAATAAT e B1_3A_4A_R_ST: TCTCATCATTGAACACGAACA (Mudanças nas condições do PCR)
Genoma T de LS IA
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126/135 segundos a 94 °C
| 40 | ciclos enquanto | cada | ciclo inclui | 10 | segundos | a | 98 |
| °C, 15 | segundos a 57 °C | e 50 | segundos a 68 | °C | |||
| - | Genoma S de : | LS_1A | |||||
| 60 | segundos a 94 °C | ||||||
| 45 | ciclos enquanto | cada | ciclo inclui | 10 | segundos | a | 98 |
| °C, 15 | segundos a 65 °C | e 50 | segundos a 68 | °C | |||
| - | Genoma T de : | LS_3A | |||||
| 60 | segundos a 94 °C | ||||||
| 45 | ciclos enquanto | cada | ciclo inclui | 10 | segundos | a | 98 |
| °C, 15 | segundos a 55 °C | e 35 | segundos a 68 | °C | |||
| - | Genoma S de : | LS_3A | |||||
| 60 | segundos a 94 °C | ||||||
| 40 | ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 | se | gundos a | 98 | °C, | ||
| 15 segundos a 60 °C e 50 | segundos a 68 °C | ||||||
| - | Genoma T e genoma | S de | B1_4A | ||||
| 60 | segundos a 94 °C | ||||||
| 40 | ciclos enquanto | cada | ciclo inclui | 10 | segundos | a | 98 |
| °C, 15 | segundos a 60 °C | e 50 | segundos a 68 | °C |
Seleção de transformantes(c) [413] De acordo com a descrição no 3 - 3 acima, linhagem T2 e linhagem TI abaixo foram selecionados. Primeiro, os polipeptídeos mutantes nos indivíduos da linhagem T2 obtidos são como segue.
- 2A-1_14 [431] Genoma T: Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 84) é produzido de modo que 12 aminoácidos não relacionados (TGILNSRKSLWD) são adicionados em adição a até 107 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
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127/135 [432] Genoma S: Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, um polipeptídeo idêntico ao WT é produzido, e um polipeptídeo (SEQ ID NO. 83) é produzido de modo que 3 aminoácidos não relacionados (LEY) são adicionados em adição a até 106 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
- 2A-1_19 [433] Genoma T: Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, um polipeptídeo idêntico ao WT é produzido, e um polipeptídeo (SEQ ID NO. 86) é produzido de modo que 12 aminoácidos não relacionados (TGILNSRKSLWD) são adicionados em adição a até 107 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[434] Genoma S: Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 85) é produzido de modo que 3 aminoácidos não relacionados (LEY) são adicionados em adição a até 106 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
- 2A_133_17 [435] Genoma T: Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 98) é produzido de modo que 12 aminoácidos não relacionados (TGILNSRKSLWD) são adicionados em adição a até 107 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
| [436] Genoma | S: Um polipeptídeo i | [SEQ ID | NO. | 97) |
| consistindo em 337 | aminoácidos idênticos | àqueles | do | WT é |
| produzido. | ||||
| - 2A_133_122 | ||||
| [437] Genoma | T: Enquanto WT consiste | em | 336 |
aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 100) é produzido de modo que 12 aminoácidos não relacionados (TGILNSRKSLWD) são adicionados em adição a até 107 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
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128/135 [438] Genoma S: Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, um polipeptídeo idêntico ao WT é produzido, e um polipeptídeo (SEQ ID NO. 99) é produzido de modo que 107° asparagina de WT é deletada de modo a constituir 336 aminoácidos.
- 2A_133_142 [439] Genoma T: Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 102) é produzido de modo que 12 aminoácidos não relacionados (TGILNSRKSLWD) são adicionados em adição a até 107 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[440] Genoma S: Enquanto WT consiste em 337
| aminoácidos, um | polipept | ideo | idêntico ao WT é produzido | , θ | |
| um polipeptídeo | (SEQ ID | NO. | 101) | é produzido de modo | que |
| 107° asparagina | de WT é | deletada | de modo a constituir | 336 | |
| aminoácidos. | |||||
| - 2A_1_119 | |||||
| [441] Genoma T: | Enquanto | WT consiste em | 336 | ||
| aminoácidos, um | polipeptídeo | (SEQ | ID NO. 88) é produzido | de |
modo que 12 aminoácidos não relacionados (TGILNSRKSLWD) são adicionados em adição a até 107 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
| [442] | Genoma | S: Um polipeptídeo i | [SEQ ID | NO. | 87) |
| consistindo | em 337 | aminoácidos idênticos | àqueles | do | WT é |
| produzido. | |||||
| - 2A_1 | _120 | ||||
| [443] | Genoma | T: Enquanto WT consiste | em | 336 |
aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 90) é produzido de modo que 12 aminoácidos não relacionados (TGILNSRKSLWD) são adicionados em adição a até 107 aminoácidos idênticos àqueles
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129/135 do WT.
| [444] | Genoma | S: Um polipeptídeo i | [SEQ ID | NO. | 89) |
| consistindo | em 337 | aminoácidos idênticos | àqueles | do | WT é |
| produzido. | |||||
| - 2G-3; | 5_10 | ||||
| [445] | Genoma | T: Enquanto WT consiste | em | 336 |
aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 110) é produzido de modo que 8 aminoácidos não relacionados (KMAKLSKA) são adicionados em adição a até 56 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[446] Genoma S: Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 109) é produzido de modo que até 56 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
- 2G-37_103 [447] Genoma T: Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 112) é produzido de modo que 2 aminoácidos (55° e 56° aminoácidos) são deletados de modo a constituir 334 aminoácidos.
[448] Genoma S: Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 111) é produzido de modo que 7 aminoácidos não relacionados (MAKLFKA) são adicionados em adição a até 54 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
- 2G-126_10 [449] Genoma T: Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 114) é produzido de modo que 2 aminoácidos não relacionados (DG) são adicionados em adição a até 56 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[450] Genoma S: Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 113) é produzido de
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130/135 modo que até 56 aminoácidos são idênticos àqueles do WT.
- 2G-126_139 [451] Genoma T: Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 118) é produzido de modo que 1 aminoácidos não relacionados (I) são adicionados em adição a até 54 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[452] Genoma S: Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 117) é produzido de
| modo | que | 6 aminoácidos | não | relacionados | (AKLFKA) | são |
| adicionados | em adição a até | 52 | aminoácidos idênticos àqueles | |||
| do WT | • | |||||
| [453] | Em seguida, | o | polipeptideo | mutante | nos |
indivíduos da linhagem TI obtidos são como segue.
- LS_lA-8 [454] Genoma T: Enquanto WT consiste em 410 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 73) é produzido de modo que 15 aminoácidos não relacionados (TQALKRPRNVKDFFA) são adicionados em adição a até 247 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[455] Genoma S: Enquanto WT consiste em 407 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 72) é produzido de modo que 15 aminoácidos não relacionados (PQALERPRKVKDFFA) são adicionados em adição a até 243 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
- LS_lA-9 [456] Genoma T: Enquanto WT consiste em 410 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 76) é produzido de modo que 3 aminoácidos não relacionados (TGS) são adicionados em adição a até 246 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[457] Genoma S: Enquanto WT consiste em 407
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131/135 aminoácidos, (i) um polipeptideo (SEQ ID NO. 75) é produzido de modo que 15 aminoácidos não relacionados (SQALERPRKVKDFFA) são adicionados em adição a até 244 aminoácidos idênticos àqueles do WT e (ii) um polipeptideo (SEQ ID NO. 74) é produzido de modo que 15 aminoácidos não relacionados (TQALERPRKVKDFFA) são adicionados em adição a até 244 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
- LS_3A-12 [458] Genoma T: Enquanto WT consiste em 410 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 78) é produzido de modo que 18 aminoácidos não relacionados (SWVGKINPFFPYLLGVKL) são adicionados em adição a até 394 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[459] Genoma S: Enquanto WT consiste em 407 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 77) é produzido de modo que 66 aminoácidos não relacionados (SWVGKINPFFPYLLGVKFKTLKNKIEIYLHGEGQRGLQSQVLFFFFYIYILFGFKVIG LMNVLILT) são adicionados em adição a até 391 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
- LS_3A-15 [460] Genoma T: Enquanto WT consiste em 410 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 80) é produzido de modo que 18 aminoácidos não relacionados (SWVGKINPFFPYLLGVKL) são adicionados em adição a até 394 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[461] Genoma S: Enquanto WT consiste em 407 aminoácidos, um polipeptideo (SEQ ID NO. 79) é produzido de modo que 66 aminoácidos não relacionados (SWVGKINPFFPYLLGVKFKTLKNKIEIYLHGEGQRGLQSQVLFFFFYIYILFGFKVIG LMNVLILT) são adicionados em adição a até 391 aminoácidos
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132/135 idênticos àqueles do WT.
- LS_3A-30 [462] Genoma T: Enquanto WT consiste em 410 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 82) é produzido de modo que 14 aminoácidos não relacionados (LAKSTPFFHIFLAL) são adicionados em adição a até 397 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[463] Genoma S: Enquanto WT consiste em 407 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 81) é produzido de modo que 18 aminoácidos não relacionados (LAKSTPFFHIFLALNLKP) são adicionados em adição a até 394 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
- B1_4A-11 [464] Genoma T: Enquanto WT consiste em 336 aminoácidos, um polipeptídeo (SEQ ID NO. 121) é produzido de modo que 29 aminoácidos não relacionados (MATMAVLLDVTTTTVCSCSMMRIITSQMR) são adicionados em adição a até 301 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
[465] Genoma S: Enquanto WT consiste em 337 aminoácidos, (i) um polipeptídeo (SEQ ID NO. 120) é produzido de modo que 5 aminoácidos não relacionados (QWQQW) são adicionados em adição a até 302 aminoácidos idênticos àqueles do WT e (ii) um polipeptídeo (SEQ ID NO. 119) é produzido de modo que 4 aminoácidos não relacionados (YYWM) são adicionados em adição a até 302 aminoácidos idênticos àqueles do WT.
Avaliação do desenvolvimento de brotos axilares em estufas(e) [412] Indivíduos de 7 linhagens T2 (2A-1_14, 2A133 122, 2A-133 142, 2A-1 19, 2A-133 17, 2A-1 119 e 2APetição 870190041236, de 02/05/2019, pág. 138/169
133/135 l_120), nos quais pelo menos um dos alelos do gene Bll não foi mutado, foram cultivados em uma estufa, e brotos axilares dos mesmos foram avaliados de acordo com a descrição do 3 3 acima. 2A-1_14, 2A-133_122 e 2A-133_142 não apresentam uma mutação de um dos alelos de Bll em um genoma S (T+/+S+/~) . 2A-1_19 não apresentou uma mutação de um dos alelos de Bll em um genoma T (T+/~S+/+) . 2A-133_17, 2A-1_119 e 2A-l_120 não apresentaram uma mutação de quaisquer dos alelos de Bll em um genoma S (T+/+S~/~) . Embora nenhuma das 7 linhagens avaliadas tenham mostrado qualquer diferença do controle WT (SR-1) em relação ao número e peso dos brotos axilares primários, houve uma diminuição significativa no número e peso dos brotos axilares secundários (a figura 22) . Sendo assim, foi observado que, a fim de suprimir brotos axilares secundários, é desnecessário introduzir mutações dentro de todos os (4) alelos do gene NtBll em um genoma S e um genoma T, porém é apenas necessário introduzir mutações dentro de 2 alelos do gene NtBll no genoma S e no genoma T.
[466] Brotos axilares de 5 das linhagens T2 (2G-35_10, 2G-37_103, 2G-126_10, 2G-126_139, B1_4A-11) foram avaliados. Embora estas linhagens apresentem mutações introduzidas em diferentes genes (LS ou Bll), estas linhagens são compartilhadas, de forma comum, uma vez que a mutação causa um deslocamento de fase, de modo que um polipeptídeo mais curto do que um polipeptídeo de tipo selvagem é produzido. A figura 23 mostra os resultados da avaliação de 2G-35_10, 2G-37_103, 2G-126_10 e 2G-126_139. A figura 24 mostra os resultados da avaliação de B1_4A-11. As figuras 23 e 24 sumarizam 3 avaliações de brotos axilares realizadas após a poda. Em 4 linhagens de 2G e 1 linhagem de B1_4A nas quais
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134/135 mutações foram introduzidas dentro do gene Bll, não houve diferença observada em relação ao número e peso dos brotos axilares primários, porém uma notável diminuição no número e peso dos brotos axilares secundários foi mostrada. Em particular, as 4 linhagens de 2G não exibiram desenvolvimento de brotos axilares secundários. Os resultados acima revelam que uma pluralidade de diferentes mutantes do gene Bll também mostraram supressão seletiva do desenvolvimento dos brotos axilares secundários.
[467] Em seguida, 5 das linhagens TI (LS_lA-8, LS_1A9, LS_3A-12, LS_3A-15, LS_3A-30) foram avaliadas da mesma forma. A figura 25 mostra os resultados da avaliação de LS_lA-8 e LS_lA-9. A figura 26 mostra os resultados da avaliação de LS_3A-12, LS_3A-15 e LS_3A-30. As Figs. 25 e 26 resumem 3 avaliações de brotos axilares realizados após a poda. Nenhuma das 2 linhagens de LS_1A e 3 linhagens de LS_3A exibiram qualquer diferença em relação ao número e peso dos brotos axilares primários e nenhuns desenvolvimentos dos brotos axilares secundários foram observados de qualquer forma. Também em relação ao gene LS, os resultados acima revelam que, como no caso do gene REV, o desenvolvimento dos brotos axilares secundários foi seletivamente suprimido não apenas pelos mutantes selecionados dentre TUM preparados pelo tratamento EMS porém por uma pluralidade de diferentes mutantes preparados pelo sistema CRISPR / Cas9.
REFERÊNCIAS
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135/135
807-813
2. Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang D,
| Bush J, | Church GM, | Sheen | J. ( | )2013) | Muitiplex | and |
| recombination-mediated | genome | edition in | Arabidopsis | and | ||
| Nicotiana | benthamiana | using | guide | RNA | and Cas9. | Nat |
Biotechnol. 31(8), 688-91.
3. Waibel F, Filipowicz W. (1990) U6 snRNA genes of Arabidopsis are transcribed by RNA polymerase III but contain the same two upstream promoter elements as RNA polymerase Il-transcribed U-snRNA genes. Nucleic Acids Res. 25; 18(12), 3451-8 .
4. Marshallsay Cl, Kiss T, Filipowicz W. (1990) Amplification of plant U3 e U6 snRNA sequence genes using primers specific for an upstream promoter element and conserved intragenic regions. Nucleic Acids Res. 25; 18(12), 3459-66.
APLICAÇÃO INDUSTRIAL [468] Com uma modalidade da presente invenção, é possível suprimir o desenvolvimento de brotos axilares desnecessários durante o cultivo da planta de tabaco. Isto permite uma redução no trabalho e nos custos durante o cultivo e leva a um aumento na qualidade das folhas a serem colhidas. Em adição, com uma modalidade da presente invenção, é possível seletivamente suprimir o desenvolvimento de brotos axilares secundários. Isto pode aumentar a possibilidade de prevenção da morte de uma planta causada pelo dano devido a um desastre ou similares.
Claims (9)
- (1) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 1 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 3;1. Método para a fabricação de uma planta de tabaco, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) introduzir uma mutação que causa a supressão funcional de um gene contendo, como uma região codante, um polinucleotídeo que codifica quaisquer dos seguintes polipeptídeos (1) a (5):
- 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de:(b) selecionar, a partir de indivíduos produzidos pela etapa (a), um indivíduo no qual o desenvolvimento de, de todos os brotos auxiliares, brotos auxiliares secundários que se desenvolvem após a remoção de brotos auxiliares primários é suprimida.2/3 pela SEQ ID NO. 15; e (5) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 17 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 19, a supressão funcional suprimindo o desenvolvimento de brotos auxiliares.(2) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 5 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 7;
- 3/3 (a) incluir a inserção, dentro de uma região externa na qual o gene está presente, de um polinucleotídeo que expressa um fator o qual promove a degradação de um RNAm transcrito do gene.3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de, na etapa (b), um indivíduo, no qual o número ou peso dos brotos auxiliares secundários é diminuído em comparação com aquele de uma planta do tipo selvagem, ser selecionado.(3) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 9 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 11;
- 4 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de a etapa (a) incluir a introdução da mutação no gene.(4) pelo menos um de um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO. 13 e um polipeptídeo apresentando uma identidade de sequência de 90 % ou mais com uma sequência de aminoácido representadaPetição 870180135827, de 28/09/2018, pág. 20/22
- 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a etapa (a) ser realizada por mutação espontânea, tratamento mutagênico, edição do genoma, ou nocaute do gene.
- 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de a etapaPetição 870180135827, de 28/09/2018, pág. 21/22
- 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o fator ser uma molécula de RNA antis sentido, uma molécula de RNAi, ou uma molécula de cossupressão.
- 8 . Descendentes ou uma progênie criada, caracterizados pelo fato de:os descendentes serem de uma planta de tabaco produzida por um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; e a progênie criada ser obtida pelo cruzamento de uma planta de tabaco produzida por um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
- 9. Folha de tabaco caracterizada pelo fato de ser colhida a partir de (i) uma planta de tabaco produzida por um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou (ii) descendentes ou uma progênie criada, conforme definida na reivindicação 8.
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