CN115820902A - 一种基于ssr标记鉴定和甜三号玉米种子纯度的方法 - Google Patents

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姚丹青
王刚
楼坚锋
张海兰
刘建
顾芹芹
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Abstract

本发明涉及一种用于鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的引物组合物以及使用该引物组合物鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的方法。本发明的鉴别方法直接分析目标物的遗传物质DNA，其结果不依赖于技术员对样品农艺性状的了解程度，也不受环境干扰，解决了以往技术带来的人为因素影响、环境因素干扰造成的数据不准，节约了鉴定成本，缩短了鉴定时间，对新品种的鉴定更精准、可靠。

Description

一种基于SSR标记鉴定和甜三号玉米种子纯度的方法
技术领域
本发明涉及植物品种检测领域，具体涉及到一种鉴定和甜三号玉米种子纯度的方法。
背景技术
近年来我国甜玉米产业发展迅速，国内科研单位相继培育出许多优良品种，主要集中在广东、云南、海南、长江中下游、华中及东北地区。2018年全国甜玉米种植面积已达40万hm2，超过美国成为世界上甜玉米种植面积最大的国家。根据国家对玉米种植区域的划分，将东南区列为发展鲜食玉米的重点区域，其中长三角地区居民对健康营养生活一直有较高追求，特别是近年来市民对甜玉米需求越来越大，甜玉米消费量逐年增加，活跃的市场需求拉动了长三角地区甜玉米生产的发展，以上海为首的长三角地区逐渐成为我国重要的甜玉米生产、加工和消费地区。围绕都市高效生态农业发展相关规划，具有特色、具有明显竞争优势的甜玉米产业成为重点开发扶持农业优势特色产业。
“和甜三号”是2020年通过国家审定的甜玉米品种，其籽粒排列整齐，外观漂亮，籽粒黄色，果穗封顶性佳、苞叶松紧适中且颜色翠绿，植株长势强健，适宜在东南鲜食玉米类型区的安徽和江苏两省淮河以南地区、上海市、浙江省、江西省、福建省、广东省、广西自治区以及海南省春播种植。近年来在上海郊区和都市现代农业生产中得到种植户青睐，经济效益十分显著。
杂交玉米种子纯度的高低严重影响其品质和产量，是鉴定杂交玉米种子质量的重要指标。以往鉴定杂交玉米品种纯度通常采用田间小区种植鉴定方法，这种方法虽然结果比较准确，但鉴定过程对操作人员的专业素质要求比较高，需要有丰富的田间生产经验，而且鉴定周期长、鉴定成本高、效率低，现在已很难满足杂交玉米种子市场化发展的要求。
SSR(Simple Sequence Repeats)是一类由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术。SSR标记技术以重复序列两侧相对保守的单拷贝序列设计的上下游引物，经PCR扩增以及凝胶电泳来呈现不同材料中重复序列的变异。SSR分子鉴定技术不依赖于对品种特征特性的了解，也不受种植影响，所以鉴定结果更可靠，目前该技术已得到了广泛应用。
针对有效鉴别玉米种子纯度的迫切性，以及现有鉴别玉米种子纯度方法的局限性，提出一种鉴定时间短、结果准确可靠的“和甜三号”玉米种子纯度鉴定方法成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明包括以下几个方面：
本发明的第一方面提供一种用于鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的引物组合物，其包含4对引物，所述引物的名称分别为bnlg439w1 、bnlg1940k7、bnlg2291k4和bnlg2305k4。
优选的，所述引物的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.7和SEQID NO.8，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，以及SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。
优选的，所述引物的信息如下表所示：
Figure BDA0003822323020000021
优选的，所述引物组合物进一步包含下述引物，所述引物的名称分别为umc2007y4、phi053k2、umc1705w1、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、phi065k9、umc1492y13、umc1506k12、phi96100y1、umc1536k9、bnlg1520K1、umc1999y3、umc2115k3、phi299852y2、umc2160k3、phi233376y1和umc2084w2。
本发明的第二方面提供一种用于鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的试剂盒，其包含上述4对引物。
本发明的第三方面提供一种用于鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的方法，其包括以下步骤：
(1)将待测玉米种子研磨，利用DNA磁珠法提取基因组DNA；
(2)用4对引物对提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物，所述引物的名称分别为bnlg439w1、bnlg1940k7、bnlg2291k4和bnlg2305k4；
(3)将扩增产物利用毛细管电泳进行检测；
(4)将所得电泳结果与使用上述引物对扩增“和甜三号”玉米种子所得的电泳结果进行比较，确定所述样品是否含有与“和甜三号”一致的指纹，从而鉴定玉米种子是否为“和甜三号”。
优选的，所述步骤(2)中PCR扩增体系为：
成分 单反应体积(μl)
HotStart Mix 2X 10
F-primer 0.1
R-primer 0.1
模板(浓度在20ng/μl) 2
水 7.8
合计 20
。
优选的，所述步骤(2)中PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物4℃保存。
优选的，所述步骤(3)中的电泳缓冲液为1×TAE，电压为100V。
本发明的第三方面提供上述引物组合物或上述试剂盒在鉴别“和甜三号”玉米种子纯度中的应用。
本发明的第四方面提供上述引物组合物在制备用于鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的试剂盒中的应用。
本发明产生的有益效果：
(1)本发明方法基于20个核心种质和20个扩展种质筛选出多态性高、重复性好的40对核心引物，这些引物适用于玉米自交系和单交种的SSR指纹数据采集以及品种鉴定。基于毛细管电泳的SSR分子标记检测技术具有高通量和低成本，以及高度灵活的优势，利用毛细管电泳检测技术平台，依据40对SSR标记引物进行相应的分析，首次建立玉米新品种“和甜三号”的DNA指纹(标记-基因型)，从DNA水平快速、准确地鉴定品种间差异，维护了品种权，为该新品种的推广种植提供了强有力的技术支撑。
(2)本发明利用40对SSR标准引物对杂交玉米品种“和甜三号”及其亲本(SC13035×SC13019)进行了基因型分析，40个SSR标记-基因型指纹图谱中含23个杂合位点。通过与其他品种比较分析实验和综合评估，筛选与其他品种相比较特异性更强的4对引物，且能够区分“和甜三号”与亲本的特异性标记，建立了杂交玉米“和甜三号”种子纯度分子鉴定技术方法，能够鉴定出自交苗、回交苗和异型株。
(3)本发明的鉴别方法直接分析目标物的遗传物质DNA，其结果不依赖于技术员对样品农艺性状的了解程度，也不受环境干扰，解决了以往技术带来的人为因素影响、环境因素干扰造成的数据不准，节约了鉴定成本，缩短了鉴定时间，对新品种的鉴定更精准、可靠。
附图说明
图1为本发明引物P01(bnlg439w1)的SSR标记毛细管电泳图；
图2为本发明引物P04(bnlg1940k7)的SSR标记毛细管电泳图；
图3为本发明引物P08(bnlg2291k4)的SSR标记毛细管电泳图；
图4为本发明引物P10(bnlg2305k4)的SSR标记毛细管电泳图；
图5为本发明引物P03(umc2007y4)在不同品种玉米中的SSR标记毛细管电泳图对比图。
具体实施方式
通过试验例方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下试验例。
试验例1、“和甜三号”玉米品种SSR标记-基因型指纹图谱的确定
1.玉米基因组DNA提取
每样本取20粒“和甜三号”玉米种子，置于2ml圆底离心管中，加入2颗钢珠，用QIAGEN研磨器，最大频率研磨20分钟，制备提取DNA。利用种子DNA磁珠法提取基因组DNA，提取试剂盒为长春市志昂生物科技有限公司生产，型号为GO-GPLF-FX96，使用仪器包括Thermo FLEX核酸提取仪、混匀小精灵、离心机和金属浴/水浴/空气浴。DNA提取后于1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳缓冲液为1×TAE，电压为100V；DNA纯度和浓度测量利用NanoDrop2000c紫外可见光谱仪(Thermo公司)进行测定，稀释至50ng/μL的工作液备用，4℃冰箱储藏。
2.引物
本试验例采用的玉米SSR核心引物P01-P40的序列信息如下表1所示。
表1玉米SSR核心引物名称和序列
Figure BDA0003822323020000051
Figure BDA0003822323020000061
Figure BDA0003822323020000071
Figure BDA0003822323020000081
3.PCR反应体系和程序
PCR体系标准配置：
Figure BDA0003822323020000082
Figure BDA0003822323020000091
PCR反应条件设置：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物4℃保存。
4.毛细管电泳分析
按说明书依次进行电泳，所有数据分析基于QIAxcelScreenGel1.4版软件，通过软件系统自动对指纹的原始数据进行分析，确定每个位点的等位基因，部分SSR标记毛细管电泳图如图1-4所示。
5.玉米品种DNA指纹
通过毛细管电泳的SSR分子标记分析技术平台，利用40个SSR标记分析了“和甜三号”和其他三个品种(糯玉米N1、糯玉米N2、甜玉米N3)，具体数据见表2-1和表2-2。通过差异位点的分析可以建立品种的DNA指纹，为品种权的保护打下坚实基础。
表2-1和甜三号及糯玉米N1的SSR标记的纹图谱
Figure BDA0003822323020000092
Figure BDA0003822323020000101
Figure BDA0003822323020000111
表2-2糯玉米N2和甜玉米N3的SSR标记的纹图谱
Figure BDA0003822323020000112
Figure BDA0003822323020000121
Figure BDA0003822323020000131
注:上表2-1和2-2中“--”表示数据缺失。
6.“和甜三号”玉米品种的DNA指纹
通过上述40对SSR标记的指纹图谱分析，确定了玉米品种“和甜三号”DNA指纹图谱(标记-基因型)，具体如下表3所示。
表3“和甜三号”玉米品种标记指纹图谱(标记-基因型)
编号 标记 基因型 编号 标记 基因型
P01 bnlg439w1 CD P21 umc1147y4 AA
P02 umc1335y5 AA P22 bnlg1671y17 AA
P03 umc2007y4 AC P23 phi96100y1 AB
P04 bnlg1940k7 BC P24 umc1536k9 CD
P05 umc2105k3 CC P25 bnlg1520K1 BC
P06 phi053k2 AB P26 umc1489y3 AA
P07 phi072k4 CC P27 bnlg490y4 BB
P08 bnlg2291k4 CD P28 umc1999y3 AC
P09 umc1705w1 AB P29 umc2115k3 BC
P10 bnlg2305k4 CD P30 umc1429y7 BB
P11 bnlg161k8 BC P31 bnlg249k2 BB
P12 bnlg1702k1 BC P32 phi299852y2 BC
P13 umc1545y2 AC P33 umc2160k3 AC
P14 umc1125y3 BC P34 umc1936k4 BB
P15 bnlg240k1 AA P35 bnlg2235y5 AA
P16 phi080k15 BB P36 phi233376y1 AB
P17 phi065k9 BC P37 umc2084w2 AB
P18 umc1492y13 AB P38 umc1231k4 AA
P19 umc1432y6 AA P39 phi041y6 AA
P20 umc1506k12 CD P40 umc2163w3 BB
从上表3信息可知，40个SSR标记-基因型指纹图谱中，含23个杂合位点(参见粗体标记的基因型)，再从杂合位点中挑选特异性较强的标记。以“和甜三号”编号P01分子标记为例，其基因型为CD，与其亲本和其他三个品种的基因型都不同，属于特异性较强的分子标记；而编号P21分子标记基因型为AA，其亲本和“糯玉米N1”分子标记基因型也同样为AA，所以该标记不具有特异性。在表2-1和2-2试验结果的基础上，通过与其他品种比较分析实验和综合评估，筛选出与其他品种相比较特异性更强的4对引物(见下表4)。与表4中的引物相比，其他引物在不同品种中的特异性不显著(例如图5所示的P03引物)，因此表4中所列的特异指纹可以用于“和甜三号”的品种鉴定分析，从DNA水平快速、准确地鉴定品种间差异，维护品种权。
表4用于鉴定“和甜三号”玉米品种的分子标记信息
编号 标记名称 和甜3号 备注
P01 bnlg439w1 CD C:351bp；D:331bp
P04 bnlg1940k7 BC B:364bp；C:377bp
P08 bnlg2291k4 CD C:383bp；D:374bp
P10 bnlg2305k4 CD C:255bp；D:282bp
试验例2、筛选引物对群体单粒种子检测结果
随机选取了196粒单粒种子，用所选取的群体单粒“和甜三号”种子验证筛选的SSR引物，SSR引物筛选试验与田间实验相同，观察筛选引物对群体单粒种子检测结果(见表5)。其中计算种子纯度(％)＝杂交种子样品数/实验样品数×100。
表5筛选引物对群体单粒种子检测结果
Figure BDA0003822323020000141
从上表5可知，田间纯度鉴定与分子鉴定的4对引物组合的平均值基本一致，表明利用筛选出的引物鉴定“和甜三号”种子纯度的结果是可信的。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims (8)

1.一种用于鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包含4对引物，所述引物的名称分别为bnlg439w1、bnlg1940k7、bnlg2291k4和bnlg2305k4。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物的序列分别为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，以及SEQID NO.19和SEQ ID NO.20。
3.一种用于鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的引物组合物。
4.一种用于鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测玉米种子研磨，利用DNA磁珠法提取基因组DNA；
(2)用4对引物对提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物，所述引物的名称分别为bnlg439w1、bnlg1940k7、bnlg2291k4和bnlg2305k4；
(3)将扩增产物利用毛细管电泳进行检测；
(4)将所得电泳结果与使用上述引物对扩增“和甜三号”玉米种子所得的电泳结果进行比较，确定所述样品是否含有与“和甜三号”一致的指纹，从而鉴定玉米种子是否为“和甜三号”。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增体系为：
成分 单反应体积(μl) HotStartMix2X 10 F-primer 0.1 R-primer 0.1 模板(浓度在20ng/μl) 2 水 7.8 合计 20
。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物4℃保存。
7.权利要求1或2所述的引物组合物或者权利要求3所述的试剂盒在鉴别“和甜三号”玉米种子纯度中的应用。
8.权利要求1或2所述的引物组合物在制备用于鉴别“和甜三号”玉米种子纯度的试剂盒中的应用。
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