MX2014012941A - Aceites altos en acido oleico. - Google Patents

Aceites altos en acido oleico.

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Abstract

La presente invención se relaciona con lípidos extraídos con altos niveles, por ejemplo 90% a 95% en peso de ácido oleico. La presente invención también proporciona plantas modificadas genéticamente, particularmente semillas oleosas, tales como de cártamo, las cuales pueden usarse para producir el lípido. Además, se proporcionan métodos para genotipificar y seleccionar plantas que pueden ser usadas para producir el lípido.

Description

ACEITES ALTOS EN ÁCIDO OLEICO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con lípidos extraídos con altos niveles, por ejemplo 90% a 95% en peso de ácido oleico. La presente invención también proporción plantas modificadas genéticamente, particularmente semillas oleaginosas, tales como cártamo, que pueden ser usadas para producir el lípido. Además, se proporcionan métodos para genotipificar y seleccionar plantas que pueden ser usadas para producir el lípido.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los aceites vegetales son una fuente importante de grasa dietética para humanos, representado aproximadamente 25% de la ingesta calórica en países desarrollados (Broun y colaboradores, 1999). La producción mundial de aceites vegetales es al menos de aproximadamente 110 millones de toneladas anuales, de los cuales 86% es usado para consumo humano. Casi todos estos aceites se obtienen de cultivos de semillas oleaginosas tales como frijol de soya, cañóla, cártamo, girasol, semilla de algodón y cacahuete, o árboles de plantaciones tales como palma, aceituna y coco (Gunstone, 2001: Oil World Annual, 2004); el reconocimiento comunitario y la comprensión científica creciente del impacto de los componentes ácidos grasos individuales de aceites comestibles sobre varios varios aspectos de la salud humana motiva el desarrollo de aceites vegetales modificados que han mejorado el valor nutricional, siempre que retengan la funcionalidad requerida para varias aplicaciones alimenticias. Estas modificaciones requieren saber acerca de las rutas metabólicas para la síntesis de ácidos grasos vegetales y de los genes que codifican a las enzimas para estas rutas (Liu y colaboradores, 2002a; Thelen y Ohlrogge, 2002).
Se esta dando considerable atención al impacto nutricional de varias grasas y aceites, en particular, la influencia de los constituyentes de grasas y aceites sobre enfermedades cardiovasculares, cáncer y varias condiciones inflamatorias. Se piensa que altos niveles de colesterol y ácidos grasos saturados en la dieta incrementa el riesgo de enfermedades cardíacas y esto ha conducido al aviso nutricional de reducir el consumo de grasas animales saturadas ricas en colesterol a favor de aceites vegetales insaturados libres de colesterol (Liu y colaboradores, 2002a).
Mientras que la ingesta dietética de colesterol presente en grasas animales puede incrementar significativamente los niveles de colesterol total en la sangre, se ha encontrado también que los ácidos grasos que comprenden las grasas y aceites pueden por si mismos tener efectos significativos sobre los niveles de colesterol del suero sanguíneo. Es de interés particular el efecto de los ácidos grasos dietéticos sobre las formas de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL, Low Density Lipoprotein) indeseables y de lipoproteínas de alta densidad (HDL, High Density Lipoprotein) deseables en la sangre. En general, ácidos grasos saturados, particularmente ácido mirístico (14:0) y ácido palmítico (16:0), los principales saturados presentes en aceites vegetales, tienen la propiedad indeseable de aumentar los niveles de colesterol de LDL del suero e incrementar consecuentemente el riego de enfermedades cardiovasculares (Zock y colaboradores, 1994; Hu y colaboradores, 1997). Sin embargo, se ha establecido bien que el ácido esteárico (18:0), el otro saturado importante presente en aceites vegetales, no incrementa el colesterol de LDL, y actualmente puede disminuir el colesterol total (Bonanone y Grundy, 1988; Dougherty y colaboradores, 1995). Por consiguiente, el ácido esteárico es considerado generalmente, al menos neutro con respecto al riesgo de enfermedades cardiovasculares (Tholstrup, y colaboradores, 1994). Por otro lado, ácidos grasos insaturados, tales como el ácido oleico monoinsaturado (18:1), tiene la propiedad benéfica de abatir el colesterol de LDL (Mensink y Katan, 1989; Roche y Gibncy, 2000), reduciendo asi el riesgo de enfermedades cardiovasculares.
El aceite alto en ácido oleico también tiene muchos usos industriales como, pero no se limitan a, lubricantes, a menudo en la forma de ésteres de ácido oleico, biocombustibles, materiales crudos para alcoholes grasos, plastificantes, ceras, estearatos metálicos, emulsificantes, productos para el cuidado personal, jabones y detergentes, tensoactivos, productos farmacéuticos, aditivos para trabajar metales, materiales crudos para suavizantes de telas, tintas, jabones transparentes, estabilizantes de PVC, resinas alquilicas, e intermediarios para muchos otros tipos de derivados oleoquimicos terminados.
Procesadores oleosos y fabricantes alimenticios dependen de la hidrogenación para reducir el nivel de ácidos grasos insaturados en aceites, incrementando así su estabilidad oxidativa en aplicaciones de frituras y proporcionar también grasas sólidas para uso en margarinas y mantecas. La hidrogenación es un proceso químico que reduce el grado de insaturación de aceites convirtiendo dobles enlaces carbono-carbono en enlaces simples carbono-carbono. La hidrogenación completa produce una grasa totalmente saturada. Sin embargo, el proceso de hidrogenación parcial da como resultado niveles crecientes tanto de ácidos grasos saturados como de ácidos grasos insaturados. Algunos de los insaturados formados durante la hidrogenación parcial están en la forma de isómeros trans (tal como ácido elaidico, un isómero trans de ácido oleico) preferiblemente al isómero cís que se encuentra de manera natural (Sebedio y colaboradores, 1994; Fernández San Juan, 1995). En contraste con ácidos grasos insaturados cis, los ácidos grasos trans son conocidos actualmente por ser tan potentes como el ácido palmitico al aumentar los niveles de colesterol LDL en suero (Mensink, y Katan, 1990; Noakes y Clifton, 1998) y abatir el colesterol de HDL en suero (Zock y Katan, 1992), y contribuir asi al riesgo creciente de enfermedades cardiovasculares (Ascherio y Willett, 1997). Como un resultado de la conciencia creciente de los efectos anti-nutricionales de los ácidos grasos trans, existe actualmente una tendencia creciente a alejarse del uso de aceites hidrogenados en la industria alimentaria, a favor de grasas y aceites que son tanto benéficos nutricionalmente como que pueden proporcionar la funcionalidad requerida sin hidrogenación, en particular aquellas que son ricas ya sea en ácido oleico donde se requieren aceites líquidos o bien donde se prefieren grasas sólidas o semi-sólidas.
Existe una necesidad por lípidos y aceites adicionales con alto contenido de ácido oleico y fuentes de éste .
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente han producido nuevas composiciones de lipidos y métodos de producir estos lipidos.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona lipidos extraídos de una semilla oleosa, el lípido que comprende triacilgliceroles (TAG) que consisten de ácidos grasos esterificados a glicerol, en donde, i) los ácidos grasos comprenden ácido palmitico y ácido oleico, ii) al menos 95% en peso del lipido es TAG, iii) aproximadamente 90% a aproximadamente 95% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es ácido oleico. iv) menos de aproximadamente 3.1% en peso del contenido de 'ácidos grasos totales del lipido es ácido plamitico, y v) el lipido tiene una proporción de desaturación oleica (ODP, Oleic Desaturation Proportion) de menos de aproximadamente 0.037 y/o un valor palmitico- linoleico-oleico (PLO, Palmitic-Linoleico-Oleico) de menos de aproximadamente 0.063.
En una modalidad, el lipido tiene una o más o todas de las siguientes características.
A )aproximadamente 90% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 92%, o aproximadamente 92%, o aproximadamente 93%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido oleico. b) menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.75%, o menos de aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.75%, o aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 2.3% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido palmítico. c) aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácidos grasos poli-insaturados (PUFA, PoliUnsaturated Fatty Acids), d) menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.5%, o menos de aproximadamente 2.25%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 2.25%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido linoleico. e) menos de aproximadamente 1%, o menos de aproximadamente 0.5%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es ácido alfa-linolénico (Alfa Linolénico Acid), f) aproximadamente 0.5% a aproximadamente 1% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es 18:1D, g) la ODP del contenido de ácidos grasos del lípido es de aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.016, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.023, o es de aproximadamente 0.03, o aproximadamente 0.02, o aproximadamente 0.01, h) el valor de PLO del contenido de ácidos grasos del lipido es de aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.063, o aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.055, o aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.050, o aproximadamente 0.050 a aproximadamente 0.055, aproximadamente 0.063, o aproximadamente 0.055, aproximadamente 0.050, o aproximadamente 0.040, aproximadamente 0.030, o aproximadamente 0.020. i) aproximadamente 90% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 92% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 93%, o aproximadamente 94%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es de ácidos grasos monoinsaturados, j) el lípido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de aproximadamente 0.02, o menos de aproximadamente 0.015, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.002, k) el lipido está en la forma de un aceite purificado, y 1) el lipido es no hidrogenado.
En una modalidad, 1) aproximadamente 91% a aproximadamente 94% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es ácido oleico, 2) menos de aproximadamente 2.75% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es ácido palmitico, 3) menos de aproximadamente 3% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es ácido linoleico, 4) el ácido a-linolénico es indetectable en el contenido de ácidos grasos del lipido, 5) la ODP del contenido de ácidos grasos totales del lipido es de aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.023, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.018, 6) el valor de PLO del contenido de ácidos grasos totales es de aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.063, 7) aproximadamente 96%, o aproximadamente 93%, o aproximadamente 94%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es de ácidos grasos monoinsaturados, y 8) el lípido tiene una proporción de monoinsaturación (OMP) de menos de aproximadamente 0.02, o menos de aproximadamente 0.015, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.02.
En una modalidad adicional, 1) aproximadamente 91% a aproximadamente 94% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido oleico, 2) menos de aproximadamente 2.75% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido palmitico, 3) menos de aproximadamente 3% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido linoleico, 4) el ácido a-linolénico es indetectable en el contenido de ácidos grasos del lipido, 5) aproximadamente 96%, o aproximadamente 93%, o aproximadamente 94%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es de ácidos grasos monoinsaturados, y 6) el lipido tiene una proporción de monoinsaturación (OMP) de menos de aproximadamente menos de aproximadamente 0.015, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.02.
En una modalidad, el PUFA es ácido linoleico.
En una modalidad, el ácido a-linolénico es indetectable en el contenido de ácidos grasos del lípido.
En una modalidad adicional, aproximadamente 55% a aproximadamente 80%, o aproximadamente 60% a aproximadamente 80%, o aproximadamente 70% a aproximadamente 80%, o al menos 60%, o al menos 70%, o aproximadamente 60%, o aproximadamente 70%, o aproximadamente 80%, del contenido de TAG del lipido es trioleina.
En otra modalidad, menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 2%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5%, del contenido de ácido oleico del lípido está en la forma de diacetil gliceroles (DAG).
En una modalidad adicional, el lípido está en la forma de un aceite, en el cual al menos 90%, o al menos 95%, al menos aproximadamente 98%, o aproximadamente 95% a aproximadamente 98%, en peso del aceite es el lípido.
En una modalidad preferida, la semilla oleosa es una semilla oleosa no fotosintética. Ejemplos de semillas oleaginosas no fotosintéticas incluyen, pero no necesariamente se limita a, semilla de cártamo, girasol, almidón o ricino. En una modalidad preferida, la semilla oleosa no fotosintética es semilla de cártamo.
En una modalidad, el lipido comprende adicionalmente uno o más esteróles.
En una modalidad adicional, el lipido está en la forma de un aceite, y el cual comprende menos de aproximadamente 5 mg de esteroles/g de aceite, o aproximadamente 1.5 mg de esteroles/g de aceite a aproximadamente 5 mg de esteroles/g de aceite.
En una modalidad, el lipido comprende uno o más o todos de a) aproximadamente 1.5% a aproximadamente 4.5%, o aproximadamente 2.3% a aproximadamente 4.5%, de 1 contenido total de esteróles es ergost-7-en-3p-ol, b) aproximadamente 0.5% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 1.5% a aproximadamente 3%, del contenido total de esteróles es alcohol triterpenoide, c) aproximadamente 8.9% a aproximadamente 20%, del contenido total de esteróles es A7-estigmaesterol/estigma-7-bh-3b-o1, y d) aproximadamente 1.7% a aproximadamente 6.1% del contenido total de esterol es A7-avenaesterol.
En una modalidad adicional, el lipido tiene un volumen de al menos 1 litro y/o un peso de al menos 1 kg, y/o el cual fue extraído de semillas oleosas obtenidas de plantas cultivadas en campo.
En una modalidad, el lipido ha sido extraído de una semilla oleosa por trituración y comprende menos de aproximadamente 7% en peso de agua. En otra modalidad, el lipido es lipido purificado (extraído por solvente y refinado) y comprende menos de aproximadamente 0.1%, o menos de aproximadamente 0.05% en peso de agua.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un primer componente que es lipido de la invención, y un segundo componente, preferiblemente donde la composición fue producida mezclando el lipido con el segundo componente.
Como apreciará el experto en la materia, el segundo componente puede ser seleccionado a partir de un amplio intervalo de diferentes composiciones/compuestos. En un ejemplo, el segundo componente es una sustancia no lipídica tal como una enzima, un catalizador no proteínico (no enzimático) o producto químico (por ejemplo, hidróxido de sodio, metanol o un metal), o uno o más ingredientes de un alimento.
La presente invención también proporciona un proceso para producir aceite, el proceso que comprende i) obtener una semilla oleosa que comprenda, y/o que sea capaz de producir un vegetal que produzca semilla oleosa, aceite, en donde el contenido de aceite de la semilla oleosa es un lipido como se definió en la presente, y ii) extraer aceite a partir de la semilla oleosa para así producir el aceite.
En una modalidad preferida, la semilla oleosa comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica a un primer ARN silenciador que es capaz o que reduce la expresión de un gen D12 desaturasa (FAD2) en una semilla oleosa en desarrollo en relación con una semilla oleosa correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el polinucleótido está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa en desarrollo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un proceso para producir aceite, el proceso que comprende i) obtener semilla de cártamo cuyo contenido de aceite comprenda, y/o que es capaz de producir una planta que produzca semillas cuyo contenido oleoso comprenda, triacilgliceroles (TAG) la cual consiste de ácidos grasos esterificados a glicerol, y en donde a) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico, b) al menos 95% en peso del contenido de aceite de la semilla es TAG, c) aproximadamente 75% a aproximadamente 95% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico, d) menos de aproximadamente 5.1% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmitico, y e) el contenido de aceite tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0.17 y/o un valor palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0.26, y ii) extraer el aceite de la semilla de cártamo para producir asi el aceite, en donde la semilla de cártamo comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica a un primer ARN silenciador que sea capaz o que reduce la expresión de un gen D12 desaturasa (FAD2) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carezca del polinucleótido exógeno, y en donde el polinucleótido está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo.
En una modalidad, la semilla oleosa o semilla de cártamo comprende un segundo polinucleótido exógeno que codifica a un segundo ARN silenciador, el cual es capaz o que reduce la expresión de un gen palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) en una semilla oleosa en desarrollo o semilla de cártamo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del segundo polinucleótido exógeno, y en donde el segundo polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa en desarrollo o semilla de cártamo.
En otra modalidad, la semilla oleosa o semilla de cártamo comprende un tercer polinucleótido exógeno que codifica a un tercer ARN silenciador que sea es capaz o que reduce la expresión de un gen de ácido graso wb plastidial desaturasa (FAD6) en una semilla oleosa en desarrollo o semilla de cártamo en relación con una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente que carezca del tercer polinucleótido exógeno, y en donde el tercer polinucleótido exógeno está unido operablemente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
En una modalidad, 1) el gen FAD2 es uno o más de cada uno de gen CtFAD2-l, gen CtFAD2-2, y un gen CtFAD2-10, preferiblemente un gen CtFADl y/o un gen CtFAD2-2, y/o 2) el gen FATB es un gen CtFATB-3, y/o 3) el gen FAD6 es un gen CtFADG.
En una modalidad, el contenido de aceite de la semilla de cártamo tiene uno o más o todos de las siguientes características, a) aproximadamente 80% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 85% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 90% a aproximadamente 84%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 92%, o aproximadamente 92%, o aproximadamente 93% en peso de los ácidos grasos totales del contenido oleoso de la semilla es ácido oleico, b) menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 4%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.75%, o menos de aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.755%, o aproximadamente 2.5% en peso de los ácidos grasos totales del contenido oleoso de la semilla es ácido palmitico, c) aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 7.5%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 2%, en peso de los ácidos grasos totales del contenido oleoso de la semilla son ácidos grasos poli- insaturados (PUFA).
En otro aspecto, la presente invención proporciona una semilla oleosa cuyo contenido de aceite comprende, y/o que es capaz de producir una planta que produce semillas oleosas cuyo contenido de aceite comprende, triacilgliceroles (TAG), los cuales consisten de ácidos grasos esterificados a glicerol, y en donde i) los ácidos grasos comprenden ácido palmitico y ácido oleico, ii) al menos 95% en peso del contenido oleoso de la semilla oleosa es TAG, iii) aproximadamente 90% a aproximadamente 90% a aproximadamente 95% en peso de los ácidos grasos totales del contenido oleoso de la semilla oleosa es ácido oleico, iv) menos de aproximadamente 3.1% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla oleosa es ácido palmitico, y v) el contenido de aceite de la semilla oleosa tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0.037 y/o un valor palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0.063.
En una modalidad, la semilla oleosa es una semilla oleosa no fotosintética, preferiblemente semilla de cártamo, girasol, algodón o ricino.
En otra modalidad, la semilla oleosa comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica a un primer ARN silenciador que es capaz o que reduce la expresión de un gen D12 desaturasa (FAD2) en una semilla oleosa en desarrollo en relación con una semilla oleosa correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el primer polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa en desarrollo.
En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona una semilla de cártamo cuyo contenido oleoso comprende, y/o que es capaz de producir una planta que produce semillas cuyo contenido oleoso comprende, triacilgliceroles (TAG) los cuales consisten de ácidos grasos esterificados a glicerol, y en donde i) los ácidos grasos comprenden ácido palmitico y ácido oleico, ii) al menos 95% en peso del contenido de aceite de la semilla es TAG, iii) aproximadamente 75% a aproximadamente 95% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico, iv) menos de aproximadamente 5.1% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico, y v) el contenido de aceite de la semilla tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0.17 y/o un valor palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0.26, y en donde la semilla de cártamo comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica a un primer ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de un gen D12 desaturasa (FAD2) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el primer polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo.
En una modalidad, el contenido de aceite de la semilla de cártamo tiene una o más de las características siguientes, a) aproximadamente 80% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 85% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 90% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 92%, o aproximadamente 92%, o aproximadamente 93% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico b) menos de aproximadamente 5% o menos de aproximadamente 4%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.75%, o menos de aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.75%, o aproximadamente 2.5% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico. c) aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 7.5%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2 % en peso del peso de ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla son ácidos grasos poli-insaturados (PUFA). d) menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.5%, o menos de aproximadamente 2.25%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 2.25%, en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido linoleico (L.A.), e) aproximadamente 80% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 90% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 92% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 93%, o aproximadamente 94%, en peso del contenido de ácidos grasos totales de lipido son ácidos grasos monoinsaturados, f) el lipido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de aproximadamente 0.05, o menos de aproximadamente 0.02, o menos de aproximadamente 0.015, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.05, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.02, g) el ODP del contenido de aceite de la semilla es aproximadamente de 0.17 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0,01, o aproximadamente 1 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.075 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.050 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.016, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.023, o es de aproximadamente 0.03, o aproximadamente 0.02, o aproximadamente 0.02, o aproximadamente 0.01, y h) el valor de PLO del contenido de aceite de la semilla es de aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.26, o aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.2, o aproximadamente 0.20 a aproximadamente 0.15, o aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.1, o aproximadamente 0.020 y aproximadamente 0.075, o aproximadamente 0.050 y aproximadamente 0.055, o es de aproximadamente 0.050, o aproximadamente 0.040, o aproximadamente 0.030, o aproximadamente 0.020.
En una modalidad adicional, el contenido de aceite de la semilla oleosa o semilla de cártamo es lipido, el cual se caracteriza adicionalmente por uno o más de los aspectos mencionados anteriormente.
En otra modalidad, la semilla oleosa o semilla de cártamo comprende, un segundo polinucleótido exógeno, el cual codifica a un segundo ARN silenciador, el cual es capaz de reducir la expresión de un gen palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) en una semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente que carece del segundo polinucleótido exógeno, y en donde el segundo polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
En una modalidad adicional, la semilla oleosa o semilla de cártamo comprende un tercer polinucleótido exógeno que es capaz de reducir la expresión de un gen de ácido graso co6 plastidial desaturasa (FAD6) en una semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente que carece del tercer polinucleótido exógeno, y en donde el tercer polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
En otra modalidad, el primer ARN silenciador reduce la expresión de más de un gen endógeno que codifica a FAD2 desarrollando semillas oleosas o semillas de cártamo y/o en donde el segundo ARN silenciador reduce la expresión de más de un gen endógeno que codifica a FATB desarrollando semillas oleosas o semillas de cártamo.
En aún una modalidad adicional, el tercer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno están unidos covalentemente sobre una molécula de ADN individual, opcionalmente con secuencias de ADN de enlace entre el primer, segundo y/o tercero de los polinucleótidos exógenos.
En otra modalidad, el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucléotido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno están bajo el control de un promotor individual de modo que, cuando el primer polinucléotido exógeno y el segundo polinucleótido exógeno y/o el tercer polinucleótido exógeno son transcritos en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo, el primer ARN silenciador y el segundo ARN silenciador y/o el tercer ARN silenciador están unidos covalentemente como partes de un transcrito de ARN individual.
En otra modalidad, la semilla oleosa o semilla de cártamo comprende un ADN de transferencia individual integrado en el genoma de la semilla oleosa o semilla de cártamo, y en donde el ADN de transferencia individual comprende el primer polinucléotido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucléotido exógeno y el tercer polinucléotido exógeno.
Preferiblemente, la semilla oleosa o semilla de cártamo es homocigótica por el ADN de transferencia.
En una modalidad, el primer ARN silenciador, el segundo ARN silenciador, y el tercer ARN silenciador son seleccionados cada uno, independientemente del grupo que consiste de: un polinucléotido antisentido, un polinucléotido en el sentido, un polinucléotido catalítico, un micro ARN y un ARN de doble hebra.
En una modalidad adicional, una cualquiera o más, preferiblemente todos de los promotores son semillas específicas, y preferiblemente expresadas en el embrión de semillas oleosas o de cártamo en desarrollo.
En otra modalidad, la semilla oleosa o de cártamo comprende una o más mutaciones en uno o más genes FAT2, en donde la(s) mutación(es) reduce(n) la actividad de uno o más genes FAD2 desarrollando semillas oleosas o semillas de cártamo en relación con una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente que carezcan de la(s) mutación(es).
En otra modalidad, las semillas oleosas o de semillas de cártamo comprenden una mutación de un gen FAD2 en con relación a un gen FAD2 de tipo salvaje en una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente, dicha mutación es una eliminación, una inserción, una inversión, un marco de desplazamiento, un codón de detención de translación prematura, o una o más sustituciones de aminoácidos no conservadoras.
En una modalidad adicional, la mutación es una mutación nula en el gen FAD2.
En otra modalidad, al menos una de las mutaciones es en un gen FAD2 que codifica más la actividad de FAD2 en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo que carece de la(s) mutación(es) que cualquier otro gen FAD2 en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
En otra modalidad, la semilla es semilla de cártamo y el gen FAD2 es el gen CtFAD2-l. En esta modalidad, se prefiere también que el primer ARN silenciador sea al menos capaz de reducir la expresión del gen CtFAD2-2.
En otra modalidad, la semilla es una semilla de cártamo que comprende un alelo ol del gen CtFAD2-l o un alelo olí del gen del gen CtFAD2-l, o ambos alelos. En una modalidad, el alelo ol o el alelo olí del gen CtFAD2-l está presente en el estado homocigótico.
En otra modalidad, la proteina de FAD2 es indetectable en la semilla oleosa o semilla de cártamo.
En otra modalidad, la semilla es una semilla de cártamo y el primer ARN silenciador reduce la expresión de ambos genes CtFAD2-l y CtFAD2-2.
En otra modalidad, la semilla es una semilla de cártamo donde 1) el gen FAD2 es uno o más de un gen CtFAD2-l, un gen CtFAD2, y un gen CtFAD2-10, preferiblemente un gen CtFAD2-l y/o un gen CtFAD2-2, y/o 2) el gen FATB es un gen CtFAB-3, y/o 3) el gen FAD6 es un gen CtFAD6.
También se proporcionan una planta de semilla oleosa o una planta de semilla de cártamo capaz de producir la semilla de la invención.
En una modalidad, la planta es transgénica y homocigótica para cada polinucleótido exógeno, y/o comprende el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucléotido exógeno o el tercer polinucleótido exógeno.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante y/o sustancialmente purificado que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en cualquiera de SEC ID NOs: 27 a 37, 44, 45 o 48, un fragmento activo biológicamente de éstas, o una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40% idéntica a cualquiera de una o más de las SEC ID NOs: 27 a 37, 44, 45 o 48.
En una modalidad, el polipéptido que es una enzima modificadora del ácido graso, preferiblemente una oleato D12 desaturasa, A12-acetilenasa, una palmitoleato D12 desaturasa o una palmitoil-ACP tioestearasa (FA.TB).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado y/o exógeno que comprende uno o más de i) nucleótidos que tienen una secuencia como se proporciona en cualquiera de las SEC ID NOs: 1 a 25, 40 a 43, 46 o 47. ii) nucleótidos que tengan una secuencia que codifica a un polipéptido de la invención, iii) nucléotidos que hibridizan a una secuencia como las proporcionadas en cualquiera de las SEC ID NOs: 1 a 25, 40 a 43, 46 o 47, y iv) nucléotidos que tengan una secuencia de modo que cuando sean expresados en una semilla de una planta de semillas oleosas reduzcan la expresión de un gen que codifica al menos a un polipéptido de la invención.
En una modalidad particularmente preferida, el polinucléotido comprende nucleótidos que tienen una secuencia de modo que cuando sean expresados en una semilla de una planta de semillas oleosas reduzca la expresión de un gen que codifica a al menos un polipéptido de la invención.
En una modalidad, el polinucléotido de la parte iv) comprende una secuencia de nucleótidos proporcionados en cualquiera de las SEC ID NOs: 49 a 51 (donde la ti ina (T) es uracilo (U)).
En una modalidad, el polinucleótidos de la parte iv) es seleccionado de: un polinucléotido antisentido, un polinucléotido en el sentido, un polinucléotido catalítico, un microARN, una molécula de ARN de doble hebra (ARNds)o un producto de ARN procesado de ésta.
En una modalidad adicional, el polinucléotido es una molécula de ARNds, o un producto de ARN procesado de ésta, que comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos los cuales son al menos 95% idénticos al complemento de cualquiera de una o más de SEC ID NOs: 1 a 25, 40 a 43, 46, 47 o 49 a 51 (donde la timina (T) es uracilo (U)).
En otra modalidad, la molécula de ARNds es un precursor de icroARN (ARNmi) y/o en donde el producto de ARN procesado de éste es un ARNmi.
En aún una modalidad adicional, el polinucleótido es transcrito en una semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo bajo el control de un promotor individual, en donde la molécula de ARNds comprende secuencias en el sentido y antisentido complementarias que son capaces de hibridizarse entre si, unidas por una región de ARN de una sola hebra.
En aún una modalidad adicional, el polinucleótido, cuando está presente en una semilla de cártamo en desarrollo, i) reduce la expresión de un gen endógeno que codifica a una oleato D12 desaturasa (FAD2) en la semilla en desarrollo, el FAD2 que tiene una secuencia de aminoácidos según la proporcionada en una cualquiera o más de las SEC ID NOs: 27, 28 o 36, preferiblemente al menos una o ambas de SEC ID NOs: 27 y 28; ii) reduce la expresión de un gen endógeno que codifica a palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) en la semilla en desarrollo, la FATB que tenga una secuencia de aminoácidos como la proporcionada en la SEC ID NO: 45; y/o iii)reduce la expresión de un gen que codifica a un ácido graso wb desaturasa (FAD6) en la semilla en desarrollo, la FAD6 que tenga una secuencia de aminoácidos según la proporcionada en la SEC ID NO: 48.
También se proporciona un vector quimérico que comprende el polinucleótido de la invención, operablemente unido a un promotor, En una modalidad, el promotor es funcional en una semilla oleosa, o es un promotor especifico de semilla, preferiblemente es expresado preferencialmente en un embrión de una semilla oleosa en desarrollo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula recombinante que comprende un polinucleótido exógeno de la invención, y/o un vector de la invención.
La célula puede ser cualquier tipo de célula tal como, pero no se limita a, célula bacteriana, célula de levadura o célula vegetal.
Preferiblemente, la célula es una célula vegetal, preferiblemente una célula de semilla vegetal. Más preferiblemente, la célula vegetal es una célula vegetal de semilla oleosa. Aún más preferiblemente, la célula vegetal es una célula de semilla no fotosintética, preferiblemente una célula de semilla de cártamo, girasol, algodón o ricino.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un organismo no humano transgénico que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención, un vector de la invención, y una célula de la invención.
Preferiblemente, el organismo no humano transgénico es una planta. Más preferiblemente, una planta de semilla oleosa.
En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método de producir la célula de la invención, el método que comprende la etapa de introducir el polinucleótido de la invención, y/o un vector de la invención, en una célula.
También se proporciona el uso del polinucleótido de la invención y/o un vector de la invención para producir una célula recombinante.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de producir una planta de semilla oleosa transgénica que produce una semilla de la invención, o semilla de ésta, el método que comprende i)introducir al menos un polinucleótido de la invención y/o al menos un vector de la invención, en una célula de una planta de semilla oleosa, ii)regenerar una planta transgénica a partir de la célula, y iii)opcionalmente, producir una o más plantas descendiente o semillas de éstas a partir de la planta transgénica, produciendo asi la planta de semilla oleosa transgénica o semillas de ésta.
En una modalidad, la semilla es semilla de cártamo de la invención.
En modalidad adicional, la una o más plantas descendiente s o semillas de éstas comprenden i)el primer polinucleótido exógeno, y/o ii)el segundo polinucleótido exógeno, y/o iii)el tercer polinucleótido exógeno, preferiblemente, los tres polinucleótidos exógenos.
En una modalidad adicional, la una o más plantas precursoras o semillas de éstas comprenden una o más mutaciones como se definieron anteriormente.
En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de obtener una planta de semilla oleosa, el método gue comprende i) cruzar una primera planta de semilla oleosa precursora gue comprende un primer polinucleótido de la invención, o un primer vector de la invención, con una segunda planta de semilla oleosa precursora que comprende un segundo polinucleótido de la invención, o un primer vector de la invención, ii) seleccionar plantas descendientes de la cruza por la presencia de ambos polinucleótidos o ambos vectores; y iii)seleccionar una planta descendiente que comprenda ambos (a) el primer polinucleótido o el primer vector y (b) el segundo polinucleótido o el segundo vector, y adicionalmente que tenga una proporción creciente de ácido oleico y una proporción decreciente de ácido palmitico en el contenido de aceite de la semilla de la planta.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de genotipificar una planta de cártamo, el método que comprende detectar una molécula de ácido nucleico de la planta, en donde la molécula de ácido nucleico está unida a, y/o comprende al menos parte de, uno o más de de los genes CtFAD2-l, CtFAD2-2 o CtFAD2-10, preferiblemente al menos uno o ambos de los genes CtFAD2-l y CtFAD2-2, o al menos el gen CtFAD2-l, de una planta de cártamo.
En una modalidad, el método comprende determinar el nivel de expresión, y/o secuencia, de uno o más de los genes CtFAD2-l, CtFAD2-2 o CtFAD2-10 de la planta.
En una modalidad, el método comprende: i) hibridizar una segunda molécula de ácido nucleico a dicha molécula de ácido nucleico de la planta. ii) opcionalmente, hibridizar al menos otra molécula de ácido nucleico a dicha molécula de ácido nucleico de la planta; y iii) detectar un producto de dichas etapas de hibridizar o la ausencia de un producto de dichas etapas de hibridizar.
En aún una modalidad adicional, la segunda molécula de ácido nucleico es usada como un cebador para transcripción inversa o para replicación de al menos una porción de la molécula de ácido nucleico de la planta.
El ácido nucleico puede ser detectado usando una variedad de téenicas conocidas tales como, pero no se limitan a, análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción, análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de amplificación, amplificación por microsatélite, secuenciar el ácido nucleico, y/o amplificación del ácido nucleico.
En una modalidad, el método detecta la ausencia o presencia de un alelo del gen CtFAD2-l, preferiblemente el alelo ol .
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de seleccionar una planta de cártamo a partir de una población de plantas de cártamo, el método que comprende: i) genotipificar dicha población de plantas usando un método de la invención, en donde dicha población de plantas fue obtenida a partir de una cruza entre dos plantas de las cuales al menos una planta comprende un alelo de un gen CtFAD2-l, CtFAD2-2 o CtFAD2-10, preferiblemente al menos uno o ambos de los genes CtFAD2-l y CtFAD2-2, o al menos el gen CtFAD2-l, el cual confiere a partir de la semilla en desarrollo de dicha planta un nivel reducido de actividad D12 desaturasa, en relación a una semilla de una planta de cártamo correspondiente que carezca de dicho alelo, y ii) seleccionar la planta de cártamo con base en la presencia o ausencia de dicho alelo.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de introducir un alelo del gen CtFAD2-1, CtFAD-2-2 o CtFAD2-10 en una planta de cártamo que carezca del alelo, el método que comprende; i) cruzar una primera planta de cártamo precursora con una segunda planta de cártamo precursora, en donde la segunda planta comprende dicho alelo de un gen CtFAD2-l, CtFAD2-2, o CtFAD2-10, y ii) retrocruzar la descendiente de la cruza de la etapa i) con plantas del mismo genotipo como la primera planta precursora por suficiente número de veces para producir una planta con la mayoría del genotipo de la primera precursora pero que comprenda dicho alelo, en donde el alelo confiera a partir de la semilla en desarrollo de dicha planta un nivel reducido de actividad D12 desaturasa, en relación con la semilla de una planta de cártamo correspondiente que carezca de dicho alelo, y en donde las descendientes de las plantas son gen tipificadas por la presencia o ausencia de dicho alelo usando un método de la invención.
También se proporciona una planta transgénica, o plantas descendientes de éstas, o semillas de éstas, producidas usando el método de la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de producir semillas, el método que comprende, a) desarrollar una planta de la invención, preferiblemente en un campo como parte de una población de al menos 1000 de dichas plantas, y b) cosechar la semillas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona aceite obtenido u obtenible mediante uno o más de los procesos de la invención, a partir de las semillas oleosas o semillas de cártamo de la invención, a partir de la planta o parte de ésta de la invención, a partir de las células de la invención, y/o de los organismos transgénicos no humanos o parte de éstos de la invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende uno o más de los lipidos de la invención, las semillas oleosas o semillas de cártamo de la invención, el polipéptido de la invención, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula huésped de la invención, o aceite de la invención, y uno o más portadores aceptables.
También se proporciona el uso de uno o más de los lipidos de la invención, la composición de la invención, el proceso de la invención, las semillas oleosas o semillas de cártamo de la invención, la planta o parte de ésta de la invención, la célula huésped de la invención, el organismo transgénico no humano o parte de éste de la invención, o aceite de la invención, para la fabricación de un producto industrial.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un proceso para producir un producto industrial, el proceso que comprende las etapas de: i) obtener uno o más de los lipidos de la invención, la composición de la invención, la semilla oleosa o semilla de cártamo de la invención, la planta o parte de ésta de la invención, la célula huésped de la invención, el organismo transgénico no humano o parte de éste de la invención, o aceite de la invención. ii) opcionalmente procesar físicamente el uno o más de los lipidos de la invención, la composición de la invención, la semilla oleosa o semilla de cártamo de la invención, la planta o parte de ésta de la invención, la célula huésped de la invención, el organismo transgénico no humano o parte de éste de la invención, o aceite de la invención, de la etapa i). iii) convertir al menos algunos de los lipidos de la invención, o lipido en una o más de las composiciones de la invención, la semilla oleosa o semilla de cártamo de la invención, la planta o parte de ésta de la invención, la célula huésped de la invención, el organismo transgénico no humano o parte de éste de la invención, o aceite de la invención, o el producto procesado físicamente de la etapa ii), al producto industrial aplicando calor, productos químicos, o medios enzimáticos, o cualquier combinación de éstos, al lipido, y iv) recuperar el producto industrial, produciendo así el producto industrial.
En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de producir combustible, el método que comprende i) hacer reaccionar uno o más de los lipidos de la invención, o el lipido en una o más de las composiciones de la invención, la semilla oleosa o semilla de cártamo de la invención, la planta o parte de ésta de la invención, la célula huésped de la invención, el organismo transgénico no humano de la invención o parte de éste de la invención, o 4 O aceite de la invención, con un alcohol, opcionalmente en la presencia de un catalizador, para producir ésteres de alquilo, y ii) opcionalmente, combinar los ésteres de alquilo con combustible basado en petróleo.
En una modalidad, los ésteres de alquilo son ésteres metílicos.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de producir un comestible, el método que comprende mezclar uno o más de los lípidos de la invención, la composición de la invención, semillas oleosas o semillas de cártamo de la invención, la planta o partes de ésta de la invención, la célula huésped de conformidad con la invención, el organismo transgénico no humano o partes de éste de la invención, o aceite de la invención con al menos otro ingrediente alimenticio.
También se proporcionan comestibles, cosméticos o productos químicos que comprenden uno o más de los lípidos de la invención, la composición de la invención, las semillas oleosas o semillas de cártamo de la invención, la planta o parte de éstas de la invención, la célula huésped de conformidad con la invención, el organismo transgénico no humano o parte de éste de la invención, o aceite de la invención.
En aún un aspecto adicional, se proporciona un producto producido a partir de o que usa uno o más de los lipidos de la invención, o lipido en una o más de las composiciones de la invención, el proceso de la invención, las semillas oleosas o semillas de cártamo de la invención, la planta o parte de ésta de la invención, la célula huésped de la invención, el organismo transgénico no humano o parte de éste de la invención, o aceite de la invención.
Cualquier modalidad en la presente se considerará para aplicar mutatis mutandis a cualquier otra modalidad a menos que específicamente se declare de otra manera.
La presente invención no está limitada en el alcance por las modalidades específicas descritas en la presente, la cual está prevista con el propósito solamente de ejemplificar. Productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes, están claramente en el alcance de la invención, como se describió en la presente.
En el transcurso de esta especificación, a menos que se declare de otra manera o el contexto lo requiera de otra manera, la referencia a una etapa individual, composición o materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia serán consideradas para abarcar una o una pluralidad (es decir, una o más) de las etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupo de composiciones de materia.
La invención en lo sucesivo se describirá a manera de los siguientes Ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras anexas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Descripción filogenética de secuencias de aminoácidos codificadas por la familia del gen similar a FAD2 de cártamo y enzimas similares a FAD2 divergentes de otras plantas. El árbol filogenético mostrado fue generado usando el Vector NTI (Invitrogen). Fueron incluidas en la alineación FAD2 desaturasas (DES), hidroxilasas (OH), epoxigenasas (EPOX) acetilenasas (ACET), y conjugasas (CONJ). Los números de acceso a GeneBank de las secuencias de aminoácidos representadas en el árbol filogenético son: coCONJ.
AAK26632.1; caACET. ABC00769.1; cpEPOX, CAA76156.1; haACET, ABC59684.1; dsACET, AAO38036.1; dcACET, AAO38033.1; hhACET, AAO38031.1; haDES-2, AAL68982.1; haDES-3, AAL68983.1; luDES, ACF49507; haDES-1, AAL68982.1; ntDES, AAT72296.2; oeDES, AAW63040; siDES, AAF80560.1; ghDES-1, CAA65744.1; rcOH, AAC49010.1; atDES, AAM61113.1; pfOH:DES, AAC32755.1; plOH, ABQ0158 .1; ghDES-4, AAQ16653.1; ghDES-2, CAA71199.1. (co, Cal ndula officinalis ca, Crepis alpine; cp, Crepis palaestina; ha, Helianthus annuus; ds, Dimorphotheca sinuate; de, Daucus carota; hh, Hederá helix; lu, Linum usitatissimum; nt, Nicotiana tabacum; oe, Olea europaea; si, Sesamum indicum; re, Ricinus communis; at, Arabidopsis thaliana; pf, Physaria fendleri; ml, Physaria lindheimeri .
Figura 2. Análisis de hibridización por tinción Southern de la estructura genómica similar a CtFAD2 en el genotipo SU de cártamo. ADN genómico fue digerido con ocho enzimas de restricción diferentes antes de separación sobre un gel de agarosa. Estas enzimas fueron Acel (banda 1), BglII (2), BamHI (3), EcoRI (4), EcoRV (5), HindIII (6), Xbal (7) y Xhol (8). La tinción fue sondeada con la región codificadora entera de CtFAD2-6 marcada con radio y fue lavada a condiciones de severidad bajas.
Figura 3. Análisis de ácidos grasos por GC-MS de la composición de ácidos grasos a partir de levadura que expresa a CtFAD2-2 (C), CtFAD2-9 (D), CtFAD2-10 (E) y CtFAD2-ll (F). Vector vacio (A) y trazas por GC de la mezcla de isómeros C18:2 (G).
Figura 4. Análisis de ácidos grasos por GC-MS de la composición de ácidos grasos después de que CtFAD2-ll fue expresado transitoriamente en hojas de N. benthamiana .
Figura 5. Análisis de expresión por RT-qPCR de genes CtFAD2 de cártamo.
Figura 6. Comparación del nucleótido de una región de los alelos de CtFAD2-l a partir de SU de tipo salvaje y tres genotipos altos en oleico, es decir S-317, CW99-OL, y Lesaf496, que mostró una eliminación en la parte media de la región codificadora de CtFAD2-l en los mutantes.
Figura 7. Comparación de la secuencia de ADN del intrón 5'UTR de CtFAD2-l en la variedad SU de tipo salvaje y el genotipo S-317 alto en oleico. Se usaron secuencias de ADN encuadradas para designar marcadores de PCR perfectos para productos específicos altos en oleico y de PCR específicos de tipo salvaje.
Figura 8. Análisis por q-PCR en tiempo real de niveles de ARNm de CtFAD2-l y CtFAD2-2 en embriones en desarrollo de tres etapas de desarrollo, precoz (t DPA), media (15 DPA) y tardía (20 DPA). Las variedades de cártamo incluyen SU de tipo salvaje, y tres variedades altas en oleico: S-317, CW99-OL y Lesaf496.
Figura 9. Análisis por q-PCR en tiempo real de genes CtFATB en hoja, raíz, y embriones en desarrollo de la variedad SU de cártamo. Em-1 (etapa precoz), Em-2 (etapa media), y Em-3 (etapa tardía).
Figura 10. Un dendrograma que muestra la relación filogenética entre las secuencias de FAD6 de cártamo y FAD6 plastidial D12 desaturasa identificada en vegetales superiores. Jatropha curcas (EU 106889); Olea europea (AY733075); Populus trichocarpa (EF147523); Arabidopsis thaliana (AY079039); Descuriana sophía (EF524189); Glycine max (AK243928); Brassica napus (L29214); Poriulaca oler cea (EU376530); Arachis hypogaea (FJ768730); Ginkgo biloba (HQ694563).
Figura 11. Composición de diacil glicerol (DAG) (% molar) en S317 versus S317 + 603.9 por análisis por LS-MS de la semilla individual.
Figura 12. Composición de triacil glicerol (TAG) (% molar) en S317 versus S317 + 603.9 por análisis por LC-MS de semilla individual.
Figura 13. Contenido de ácido oleico de variedades de cártamo bajo condiciones de campo en Narrabri en el verano Australiano de 2011/2012.
Figura 14. (A) estructura básica de fitoesterol con numeración de cadena lateral y anillo. (B) estructuras químicas de algunos de los fitoesteroles.
CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 1 - ADNc que codifica a FAD2-1 de cártamo.
SEC ID NO: 2 - ADNc que codifica a FAD2-2 de cártamo.
SEC ID NO: 3 ADNc que codifica a FAD2-3 de cártamo.
SEC ID NO: 4 - ADNc que codifica a FAD2-4 de cártamo.
SEC ID NO: 5 - ADNc que codifica a FAD2-5 de cártamo.
SEC ID NO: 6 - ADNc que codifica a FAD2-6 de cártamo.
SEC ID NO: 7 - ADNc que codifica a FAD2-7 de cártamo.
SEC ID NO: 8 - ADNc que codifica a FAD2-8 de cártamo.
SEC ID NO: 9 - ADNc que codifica a FAD2-9 de cártamo.
SEC ID NO: 10 - ADNc que codifica a FAD2-10 de cártamo.
SEC ID NO: 11 - ADNc que codifica a FAD2-11 de cártamo.
SEC ID NO: 12 - Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-1 de cártamo.
SEC ID NO: 13 - Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-2 de cártamo.
SEC ID NO: 14 - Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-3 de cártamo.
SEC ID NO: 15 Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-4 de cártamo.
SEC ID NO: 16 Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-5 de cártamo, SEC ID NO: 17 - Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-6 de cártamo.
SEC ID NO: 18 - Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-7 de cártamo.
SEC ID NO: 19 - Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-8 de cártamo.
SEC ID NO: 20 - Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-9 de cártamo.
SEC ID NO: 21 - Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-10 de cártamo.
SEC ID NO: 22 - Marco de lectura abierto que codifica a FAD2-11 de cártamo.
SEC ID NO: 23 - Secuencia de intrón del qen FAD2-1 de cártamo, SEC ID NO: 24 Secuencia de intrón del gen FAD2-2 de cártamo.
SEC ID NO: 25 - Secuencia de intrón del gen FAD2-3 de cártamo.
SEC ID NO: 26 - ADNc que codifica al FAD2-1 (mutante HO) truncado de cártamo.
SEC ID NO: 27 - FAD2-1 de cártamo SEC ID NO: 28 FAD2-2 de cártamo SEC ID NO: 29 - FAD2-3 de cártamo SEC ID NO: 30 - FAD2-4 de cártamo SEC ID NO: 31 - FAD2-5 de cártamo SEC ID NO: 32 - FAD2-6 de cártamo SEC ID NO: 33 - FAD2-7 de cártamo SEC ID NO: 34 - FAD2-8 de cártamo SEC ID NO: 35 - FAD2-9 de cártamo SEC ID NO: 36 - FAD2-10 de cártamo SEC ID NO: 37 - FAD2-11 de cártamo SEC ID NO: 38 - FAD2-1 (mutante HO) truncado de cártamo.
SEC ID NO: 39 - ADNc de FATB-1 de cártamo.
SEC ID NO: 40 - ADNc que codifica a FATB-2 de cártamo.
SEC ID NO: 41 - ADNc que codifica a FATB-3 de cártamo.
SEC ID NO: 42 - Marco de lectura abierto que codifica a FATB-2 de cártamo.
SEC ID NO: 43 - Marco de lectura abierto que codifica a FATB-3 de cártamo.
SEC ID NO: 44 - FATB-2 de cártamo.
SEC ID NO: 45 - FATB-3 de cártamo.
SEC ID NO: 46 - ADNc que codifica a FAD6 de cártamo.
SEC ID NO: 47 Marco de lectura abierto que codifica a FAD6 de cártamo.
SEC ID NO: 48 - FAD6 de cártamo.
SEC ID NO: 49 -Secuencia de CtFAD2-2 usada en el constructo silenciador de ARN.
SEC ID NO: 50 - Secuencia de CtFATB-3 usada en el constructo silenciador de ARN.
SEC ID NO: 51 - Secuencia de CtFAD6 usada en el constructo silenciador de ARN.
SEC ID NO: 52 - Promotor de oleosina de Arabidopsis thaliana .
SEC ID NO: 53 - promotor de Flax linin .
SEC ID NO.54 - Señal de poliadenilación de Nos.
SEC ID NO: 55 - Señal de poliadenilación de Oes.
SEC ID NO: 56 - Secuencia de CtFAD2-l de tipo salvaje correspondiente a la región del alelo ol .
SEC ID NO: 57 - Secuencia de CtFAD2-l del alelo ol con marco de desplazamiento (igual para S-317, CW99-OL y LeSaf496).
SEC ID NOs: 58 a 158 - cebadores oligonucleótidos. SEC ID NOs: 159 a 169 - Motivos de enzimas de CtFAD2.
SEC ID NO: 170 Intrón en 5'UTR de CtFAD2 de la variedad SU de cártamo de tipo salvaje.
SEC ID NO: 171 Intrón en 5'UTR de CtFAD2 de la variedad S-317 de cártamo alto en ácido oleico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE IA INVENCIÓN Definiciones y Teenicas Generales A menos que se defina específicamente de otra manera, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente se considerará que tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto ordinario en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genéticas moleculares, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas, y bioquímica).
A menos que se defina de otra manera, la proteína recombinante, cultivo celular, y técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándares, bien conocidos por el experto en el arte. Dichas técnicas son descritas y explicadas en toda la literatura en fuentes tales como J. Perbal; A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wilcy & Sons (1984), J. Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essencial Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores). DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL, Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel y colaboradores (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates & Wilcy-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones a la fecha), Ed Harlow & David Lañe (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbour Laboratory, (1988), & J. E. Coligan y colaboradores (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta la fecha).
El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" se comprenderá que significa ya sea "X e Y" o "X o Y" y se considerará que proporciona apoyo explícito para ambos significados o para uno u otro significado.
Como se usa en la presente, el término "aproximadamente", a menos que se declare lo contrario, se refiere a +/- 10%, más preferiblemente + /- 5%, más preferiblemente +/- 4%, más preferiblemente +/- 3%, más preferiblemente +/- 2%, más preferiblemente +/- 1.5%, más preferiblemente +/- 1%, aún más preferiblemente +/- 0.5%, del valor designado.
En el transcurso de esta especificación la palabra "comprende" o variaciones tales como "comprendido" o "que comprende", se comprenderá que implica la inclusión de un elemento declarado, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas.
Como se usa en la presente, el término "lípido extraído" se refiere a una composición lipídica que comprende al menos 60% (en peso) de lípido y el cual ha sido extraído, por ejemplo, por trituración, de un organismo transgénico o parte de éste. Además, como se usa en la presente, el término "aceite extraído" se refiere a una composición oleosa que comprende al menos 60% (en peso) de aceite y el cual ha sido extraído de un organismo transgénico o parte de éste.
Como se usa en la presente, el término "purificado" cuando se usa en conexión con lípido o aceite de la invención, típicamente significa que el lípido o aceite extraído ha sido sometido a una o más etapas de procesamiento de incrementar la pureza de componente oleoso /lipídico. Por ejemplo, una etapa de purificación puede comprender uno o más o todos los del grupo que consiste de desgomadores, desodorizantes, decolorantes, secado y/o fraccionamiento del aceite extraído. No obstante, como se usa en la presente, el término "purificado" no incluye un proceso de transesterificación u otro proceso que altere la composición de ácidos grasos del lípido o aceite de la invención para así incrementar el contenido de ácido oleico como un porcentaje del contenido de ácidos grasos totales. Expresado en otras palabras, la composición de ácidos grasos del lipido o aceite purificado es esencialmente la misma que la del aceite o lipido sin purificar. La composición de ácidos grasos del aceite o lipido extraído, tal como, por ejemplo los contenidos del ácido oleico, linoleico y palmítico, es esencialmente la misma que la composición de ácidos grasos del lipido o aceite en la semilla de la planta de la cual es obtenido. En este contexto, "esencialmente la misma" significa +/- 1%, o, preferiblemente, +/- 0.5%.
Como se usa en la presente, el término "proporción de desaturación oleica" u "ODP" se refiere a un cálculo que involucra dividir la cantidad relativa de ácido linoleico y ácido a-linolénico expresado como un porcentaje de la composición de ácidos grasos del lipido entre la suma de las cantidades relativas de ácido oleico, ácidos linoleico y a-linolénico, expresado cada uno como porcentajes. La fórmula es: ODP = (% de linoleico + % de a-linolénico). Por ejemplo, TG603.12(5) del Ejemplo 15 tiene un contenido de ácido linoleico total y ácido a-linolénico de 2.15% y un ácido linoleico, ácido a-linolénico, ácido oleico de 93.88% haciendo el ODP de 0.0229.
Como se usa en la presente, el término "valor palmítico-linoleico-oleico" o "PLO", se refiere a un cálculo que involucra dividir la cantidad relativa de ácido linoleico y ácido palmitico expresado como un porcentaje de la composición de ácidos grasos del lipido entre la cantidad relativa de ácido oleico expresada como un porcentaje. La Fórmula es: PLO = (% de palmitico + % de linoleico)/% de oleico Por ejemplo, TG603.12(5) del Ejemplo 15 tiene un contenido de ácido palmitico y ácido linoleico total de 4.71% y un contenido de ácido oleico de 91.73% haciendo el PLO de 0.0513.
Como se usa en la presente, el término "proporción de monoinsaturación oleica" u "OMP" se refiere a un cálculo que involucra dividir la cantidad relativa de ácidos grasos monoinsaturados no oleicos expresada como un porcentaje de la composición de ácidos grasos del lipido entre la cantidad relativa de ácido oleico expresado como un porcentaje. La fórmula es: OMP = (% de ácidos grasos monoinsaturados = % de oleico)/% de oleico Por ejemplo, TG603.12(5) del Ejemplo 15 tiene un contenido de ácidos grasos monoinsaturados total excluyendo ácido oleico (0.84% de 018:1D11 + 0.29% de C20:l) de 1.13% y un contenido de ácido oleico de 91.73% haciendo el OMP de 0.0123.
El término "correspondiente" se refiere a una célula, o planta o parte de éstas (tal como una semilla) que tiene el mismo o similar antecedente genético que una célula, o planta o parte de éstas (semilla) de la invención pero que no ha sido modificada como se describió en la presente (por ejemplo, la célula, o planta o parte de éstas carecen de un polinucleótido exógeno de la invención). Una célula o planta correspondiente o parte de éstas (semilla) pueden ser usadas como un control para comparar, por ejemplo, una o más de la cantidad de ácido oleico producido, actividad FAD2, actividad FATB o actividad FAD6 con una célula, o planta o parte de éstas (semilla) modificada como se describió en la presente. Un experto en el arte es capaz de determinar fácilmente una célula, planta o parte de éstas (semilla) "correspondiente" apropiada para una comparación tal.
Como se usa en la presente, el término "semilla oleosa" se refiere a una composición obtenida a partir de una planta que comprenda al menos 60% (en peso) de lipido, u obtenible a partir de la semilla si la semilla oleosa está aún presente en la semilla. Esto es, semilla oleosa de, u obtenida usando, la invención incluye la semilla oleosa que esta presente en la semilla o porción de ésta tal como cotiledones o embriones, a menos quesea mencionada como "semilla oleosa extraída" o términos similares en cuyo caso es aceite que ha sido extraído de la semilla. La semilla oleosa es preferiblemente semilla oleosa extraída. La semilla oleosa es típicamente un líquido a temperatura ambiente. Preferiblemente, el contenido de ácidos grasos totales (TFA, Total Fatty Acid) en la semilla oleosa es > 70% de ácidos grasos C18, preferiblemente >90% de ácido oleico (C18:1A9). Los ácidos grasos están típicamente en una forma esterificada tal como por ejemplo, TAG, DAG, acil-CoA o fosfolípidos. A menos que se declare de otra manera, los ácidos grasos pueden ser ácidos grasos libres y/o en una forma esterificada. En una modalidad, al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, más preferiblemente al menos 93%, más preferiblemente al menos 94%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, más preferiblemente al menos 99% de los ácidos grasos en la semilla oleosa de la invención se puede encontrar como TAG. En una modalidad, la semilla oleosa de la invención es aceite "sustancialmente purificado" o "purificado" que ha sido separado de uno o más lípidos, ácidos nucleicos, polipéptidos diferentes u otras moléculas contaminantes con las cuales está asociado en la semilla o en un extracto crudo. Se prefiere que la semilla oleosa sustancialmente purificada esté al menos 60% libre, más preferiblemente al menos 75% libre, y más preferiblemente, al menos 90% libre de otros componentes con los cuales está asociado en la semilla o extracto. La semilla oleosa de la invención puede comprender adicionalmente moléculas de ácidos no grasos tales como, pero no se limitan a, esteróles (ver el Ejemplo 17). En una modalidad, la semilla oleosa es aceite de cártamo (Carthamus tinctorius) , aceite de girasol (Helianthus annus) , aceite de algodón ( Gossypium hirsutum) , aceite de ricino ( Ricinus communis) , aceite de colza ( Brassica napus , Brassica rapa ssp. ) , aceite de mostaza ( Brassica j ncea), otros aceites de Brassica (por ejemplo, Brassica napobrassica , Brassica camelina) , aceite de semilla de linaza ( Linum usítatissimum ) , aceite de soya (Glycine max) , aceite de maíz ( Zea mays) , aceite de tabaco (Nicotiana tabacum), aceite de cacahuate (Arachis hypogaea), aceite de palma ( Elaeis guíneensís) , aceite de coco ( Cocos nucífera) , aceite de aguacate ( Persea americana ) , aceite de olivo ( Olea europea ) , aceite de anacardo ( Anacardium occidentale) , aceite de macadamia ( Macadamia intergri folia) , aceite de almendra ( Prunus amygdalus) , aceite de semilla de avena (Avena sa tiva) , aceite de arroz ( Oryza sa tiva u Oryza glaberrima ) , aceite de camelina ( Camelina sativa ) , aceite de cramba ( Crambe abyssinica) o aceite de semilla de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) . El aceite de semilla puede ser extraído de la semilla por cualquier método conocido en el ate. Esto involucra típicamente extracción con solventes no polares tales como hexano, éter dietílico, éter de petróleo, mezclas de cloroformo/metanol o butanol, generalmente asociados con primera trituración o aplanado de las semillas. Lípidos asociados co el almidón en el grano pueden ser extraídos con butanol saturado de agua. El aceite de la semilla puede ser "desgomado" por métodos conocidos en el arte para remover polisacáridos y/o fosfolípidos o tratado de otras maneras para remover contaminantes o mejorar pureza, estabilidad, o color. Los TAGs y otros ésteres en el aceite de semilla pueden ser hidrolizados para liberar ácidos grasos libres tal como por tratamiento ácido o alcalino o mediante la acción de lipasas, o el aceite de semilla hidrogenado, tratado químicamente, o enzimáticamente como se sabe en el arte. No obstante, una vez que el aceite de la semilla es procesado de modo que no comprenda más el TAG, no se considera más aceite de semilla como se mencionó en la presente.
Concentraciones de esterol esterificado y libre (por ejemplo, sitoesterol, campesterol, estigmaesterol, brassicasterol, A5-avenaesterol, silostanol, campestanol, y colesterol) en el aceite o lípido extraído y/o purificado pueden ser como se describieron en Phillips y colaboradores (2002) y/o como se proporcionó en el Ejemplo 17. Los esteróles en aceites vegetales están presentes como alcoholes libres, ásteres con ácidos grasos (esteróles esterificados), glicósidos y glicósidos ad iados de esteróles. Las concentraciones de esterol en aceites vegetales como se encuentran naturalmente (aceites de semillas) varían hasta un máximo de aproximadamente 1100 mg/100 g. El aceite de palma hidrogenado tiene una de las concentraciones mínimas de aceites vegetales que se encuentran de manera natural en aproximadamente 60 mg/100 g. Los aceites de semillas extraídos o recuperados de la invención preferiblemente tienen entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 mg de esterol total/100 g de aceite. Para uso como alimento o alimentación, se prefirió que los esteróles estén presentes primeramente como formas esterificadas o libres preferiblemente a formas glicosiladas.
En los aceites de semillas de la presente invención, preferiblemente al menos 50% de los esteróles en los aceites están presentes como esteróles esterificados , excepto para aceite de semilla de soya , el cual tiene aproximadamente 25% de los esteróles esterificados. El aceite de semilla de cártamo de la invención preferiblemente tiene entre aproximadamente 150 y aproximadamente 400 mg de esterol total/100 g, típicamente aproximadamente 300 mg de esterol total/100 g de aceite de semilla, con sitoesterol el principal esterol. El aceite de semilla cañóla y el aceite de semilla de colza de la invención, preferiblemente tienen entre aproximadamente 500 y aproximadamente 800 mg de esterol total / 100 g, con sitoesterol el principal esterol y campesterol el siguiente más abundante. El aceite de semilla de maiz de la invención preferiblemente tiene entre aproximadamente 600 y aproximadamente 800 mg de esterol total /100 g, con sitoesterol el principal esterol. El aceite de semilla de soya de la invención, preferiblemente tienen entre aproximadamente 150 y aproximadamente 350 mg de esterol total/100 g, con sitoesterol el principal esterol y estigmaesterol el siguiente más abundante, y con más esterol libre que esterol esterificado. El aceite de semilla de algodón de la invención preferiblemente tiene entre aproximadamente 200 y aproximadamente 350 mg de esterol total /100 g, con sitoesterol el principal esterol. El aceite de coco y el aceite de palma de la invención preferiblemente tienen entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 mg de esterol total/100 g, con sitoesterol el principal esterol. El aceite de semilla de cacahuate de la invención, preferiblemente tiene entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 mg de esterol total/100 g, con sitoesterol el principal esterol. El aceite de semilla de sésamo de la invención, preferiblemente tiene entre aproximadamente 400 y aproximadamente 600 mg de esterol total/100g, con sitoesterol el principal esterol. El aceite de semilla de girasol de la invención, preferiblemente tiene entre aproximadamente 200 y 400 mg de esterol total/100 g, con sitoesterol el principal esterol.
Como se usa en la presente, el término "ácido graso" se refiere a un ácido carboxilico con una cola alifática larga de al menos 8 átomos de carbono de extensión, ya sea saturada o insaturada. Típicamente, los ácidos grasos tienen una cadena enlazada carbono-carbono de al menos 12 carbonos de extensión. La mayoría de ácidos grasos que se encuentran de manera natural tienen un número igual de átomos de carbono, porque su biosíntesis involucra acetato que tiene dos átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden estar en un estado libre (no esterificado) o en una forma esterificada como parte de un TAG, DAG, MAG, acil-CoA (tio-éster) enlazado, u otra forma enlazada covalentemente. Cuando están enlazados covalentemente en una forma esterificada, el ácido graso es mencionado en la presente como un grupo "acilo". El ácido graso puede ser esterificado como un fosfolípido tal como un fosfatidil colina (PC, Phosphatidylcholine), fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidil glicerol, fosfatidilinositol, o difosfatidil glicerol. Los ácidos grasos saturados no contienen cualquier doble enlace u otros grupos funcionales a lo largo de la cadena. El término "saturado" se refiere a hidrógeno, en todos los carbonos (aparte del grupo ácido carboxilico [-COOH]) contiene tantos hidrógenos como sea posible. En otras palabras, el extremo omega (w) contiene 3 hidrógenos (CH3-) y cada carbono en la cadena contiene 2 hidrógenos (-CH2-). Los ácidos grasos insaturados son de forma similar a los ácidos grasos saturados, excepto que uno o más grupos funcionales alqueno existen a lo largo de la cadena, con cada alqueno que sustituye a una parte "-CH2-CH2-" enlazado simplemente, de la cadena con una porción "-CH=CH-" doblemente enlazado (esto es, un carbono enlazado doblemente a otro carbono). Los dos átomos de carbono próximos en la cadena que están enlazados a uno u otro lado del doble enlace pueden ocurrir en una configuración cis o trans.
Como se usa en la presente, los términos "ácido graso poli-insaturado" o "PUFA" se refiere a un ácido graso que comprende al menos 12 átomos de carbono en su cadena de carbono y al menos dos grupos alqueno (dobles enlace carbono-carbono).
Como se usa en la presente, el término "ácidos grasos monoinsaturados" se refiere a ácidos grasos que tienen un doble enlace individual en su cadena acilo, tal como ácido oleico (C18:1D9), C18:1D11 y C20:l.
"Triacilglicérido" o "TAG" es glicérido en el cual el glicerol está esterificado con tres ácidos grasos. En la ruta de Kennedy de síntesis de TAG, se formó DAG como se describió anteriormente, y luego un tercer grupo acil es esterificado a la estructura principal glicerol mediante la actividad de DGAT. Rutas alternativas para la formación de TAG incluyen uno catalizado por la enzima PDAT y la ruta de MGAT (PC /AU2011/000794).
"Diacilglicérido" o "DAG" es glicérido en el cual el glicerol está esterificado con dos ácidos grasos. Como se usa en la presente, DAG comprende un grupo hidroxilo en una posición sn-1,3 o sn-1,2/2,3, y por consiguiente DAG no incluye moléculas fosforiladas tales como PA o PC. DAG es así un componente de lípidos neutros en una célula. En la ruta de Kennedy de síntesis de DAG, elsn-glicerol-3- fosfato precursor (G-3-P) es esterificado a dos grupos acilo, cada uno procedente de un éster de coenzima A de ácido graso, en una primera reacción catalizada por un glicerol- 3- fosfato aciltransferasa (GPAT) en posición sn- 1 para formar LysoPA, seguido por una segunda acilación en posición sn- 2 catalizado por un ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT) para formar ácido fosfatídico (PA, Phosphatidic acid). Este intermediario es entonces fosforilado para formar DAG. En una ruta anabólica alternativa, se pude formar DAG por la acilación ya sea de sn-1 MAG o bien preferiblemente sn-2 MAG, catalizados por MGAT. DAG también se puede formar a partir de TAG por remoción de un grupo acilo mediante una lipasa, o a partir de PC, esencialmente por remoción de un grupo principal colina mediante cualguiera de las enzimas CPT, PDCT o PLC.
Como se usa en la presente, el término "desaturasa" se refiere a una enzima gue es capaz de introducir un doble enlace carbono-carbono en el grupo acilo de un sustrato de ácido graso, el cual está típicamente en una forma esterificada tal como, por ejemplo, ésteres de CoA de ácido graso. El grupo acilo puede ser esterificado a un fosfolipido tal como fosfatidil colina (PC), o a proteína portadora de acilo (ACP), a CoA, o en una modalidad preferida a PC. Las desaturasas, generalmente, pueden ser categorizadas en tres grupos, por consiguiente. En una modalidad, la desaturasa es una desaturasa de extremo frontal.
Como se usa en la presente, los términos "D12 desaturasa" y "FAD2" se refieren a un ácido graso D12 desaturasa enlazado a membrana gue efectúa una reacción desaturasa que convierte ácido oleico (18:1L9) a ácido linoleico (C18:2D912). Por consiguiente, el término "actividad D12 desaturasa" se refiere a la conversión de ácido oleico a ácido linoleico. Estos ácidos grasos pueden estar en una forma esterificada, tal como, por ejemplo, como parte de un fosfolipido, preferiblemente en la forma de PC. En una modalidad, una enzima de FAD2 como se define en la presente comprende tres motivos ricos en histidina (His encuadradas) (ver la Tabla 5 para ejemplos de His encuadradas de enzimas de la invención). Dichos motivos ricos en His son altamente conservados en enzimas de FAD2 y han sido implicados en la formación del complejo di-hierro-oxigeno usado en catálisis bioquímica (Shanklin y colaboradores, 1998).
Como se usa en la presente, los términos "FAD2-1" y "CtFAD2-l" y variaciones de éstos se refieren a un polipéptido de FAD2 de cártamo cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEC ID NO: 27, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEC ID NO: 12. Como se usa en la presente, un gen FAD2-1 es un gen que codifica a un polipéptido tal o a un alelo mutante de éste. Estos términos también incluyen variantes producidas o inducidas artificialmente o que se encuentran de manera natural de las secuencias proporcionadas. En una modalidad, FAD2-1 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos, la cual es al menos 95% idéntica, más preferiblemente al menos 99% idéntica, a la secuencia proporcionada como SEC ID NO: 27. Los genes CtFAD2- 1 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican a polipéptidos con actividad desaturasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican a polipéptidos funcionales (alelos nuil). Dichos alelos pueden encontrarse de manera natural o inducidos por mutagénesis artificial. Un ejemplo de un alelo tal es el alelo ol de FAD2-1 descrito en la presente.
Como se usa en la presente, los términos "FAD2-2" y CtFAD2-2" y variaciones de éstos se refieren a un polipéptido de FAD2 de cártamo cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEC ID NO: 28, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEC ID NO: 13. Como se usa en la presente, un gen FAD2-2 es un gen que codifica a un polipéptido tal o a un alelo mutante de éste. Estos términos también incluyen variantes producidas o inducidas artificialmente o que se encuentran de manera natural de las secuencias proporcionadas. En una modalidad, FAD2-2 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos, la cual es al menos 95% idéntica, más preferiblemente al menos 99% idéntica, a la secuencia proporcionada como SEC ID NO: 28. Los genes CtFAD2- 2 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican a polipéptidos con actividad desaturasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican a polipéptidos funcionales (alelos nuil). Dichos alelos pueden encontrarse de manera natural o ser inducidos por mutagénesis artificial.
Como se usa en la presente, los términos "FAD2-10" y CtFAD2-10" y variaciones de éstos se refieren a un polipéptido de FAD2 de cártamo cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEC ID NO: 36, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEC ID NO: 21. Como se usa en la presente, un gen FAD2-10 es un gen que codifica a un polipéptido tal o a un alelo mutante de éste. Estos términos también incluyen variantes producidas o inducidas artificialmente o que se encuentran de manera natural de las secuencias proporcionadas. En una modalidad, FAD2-10 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos, la cual es al menos 95% idéntica, más preferiblemente al menos 99% idéntica, a la secuencia proporcionada como SEC ID NO: 36. Los genes CtFAD2-10 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican a polipéptidos con actividad desaturasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican a polipéptidos funcionales (alelos nuil). Dichos alelos pueden encontrarse de manera natural o ser inducidos por mutagénesis artificial.
Como se usa en la presente, los términos "palmitoil-ACP tioestearasa" y "FATB" se refieren a una proteína que hidroliza a palmitoil-ACP para producir ácido palmítico libre. Por consiguiente, el término "actividad palmitoil-ACP tioestearasa" se refiere a la hidrólisis de palmitoil-ACP para producir ácido palmítico libre.
Como se usa en la presente, los términos "FATB-3" y CtFATB-3" y variaciones de éstos se refieren a un polipéptido de FATB de cártamo, cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEC ID NO: 45, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEC ID NO: 43. Como se usa en la presente, un gen FATB-3 es un gen que codifica a un polipéptido tal o a un alelo mutante de éste. Estos términos también incluyen variantes producidas o inducidas artificialmente o que se encuentran de manera natural, de las secuencias proporcionadas. En una modalidad, FATB-3 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos, la cual es al menos 95% idéntica, más preferiblemente al menos 99% idéntica, a la secuencia proporcionada como SEC ID NO: 45. Los genes CtFATB-3 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican a polipéptidos con actividad palmitoil-ACP tioestearasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican a polipéptidos funcionales (alelos nuil). Dichos alelos pueden encontrarse de manera natural o ser inducidos por mutagénesis artificial.
Como se usa en la presente "ácido graso <x>6 plastidial desaturasa", variaciones de éste, y "FAD6", se refiere a una enzima cloroplasto que desatura a ácidos grasos 16:1 y 18:1 a 16:2 y 18:2, respectivamente, sobre todo lipidos de membrana cloroplástica que contienen 16:1- o 18:1-incluyendo fosfatidil glicerol, monogalactosildiacil glicerol, digalactosildiacil glicerol, y sulfoguinosildiacil glicerol.
Como se usa en la presente, los términos "FAD6" y CtAD6" y variaciones de éstos se refieren a un polipéptido de FAD6 de cártamo cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEC ID NO: 48, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEC ID NO: 47. Como se usa en la presente, un gen FAD6 es un gen que codifica a un polipéptido tal o a un alelo mutante de éste. Estos términos también incluyen variantes producidas o inducidas artificialmente o que se encuentran de manera natural, de las secuencias proporcionadas. En una modalidad, FAD6 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos, la cual es al menos 95% idéntica, más preferiblemente al menos 99% idéntica, a la secuencia proporcionada como SEC ID NO: 48. Los genes CtFAD6 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican a polipéptidos con actividad desaturasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican a polipéptidos funcionales (alelos nuil). Dichos alelos pueden encontrarse de manera natural o ser inducidos por mutagénesis artificial.
Como se usa en la presente, el término "acetilenasa" o "ácido graso acetilenasa", se refiere a una enzima que introduce un triple enlace en un ácido graso, dando como resultado la producción de un ácido graso acetilénico.
El término "Ct" es usado en la presente antes de términos como FAD2, FATB y FATB6 para indicar que la enzima/gen es de cártamo.
Como se usa en la presente, el término "ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de" y variantes de éste, se refiere a un polinucleótido que codifica a una molécula de ARN que reduce (sub-regla) la producción y/o actividad (por ejemplo, que codifica a un ARNsi, hpARNi), o él mismo subregula la producción y/o actividad (por ejemplo, es un ARNsi que puede ser liberado directamente a, por ejemplo, una célula) de una enzima endógena, por ejemplo, una D12 desaturasa, una palmitoil-ACP tioestearasa, una ácido grasoco6 plastidial desaturasa, o una combinación de dos o más o las tres de éstas. En una modalidad, el ARN silenciador es un sARN exógeno que es producido a partir de un transgen en la célula y que reduce transcripcional y/o post-transcripcionalmente la cantidad de la enzima endógena que es producida en la célula, tal como reduciendo la cantidad de ARNm que codifica a una enzima endógena o reduciendo su translación. El ARN silenciador es típicamente un ARN de 21-24 nucleótidos de extensión, el cual es complementario al ARNm endógeno y el cual puede estar asociado con un complejo silenciador conocido como RISC en la célula.
Como se usa en la presente, el término "mutación (es) reduce(n) la actividad de", se refiere a mutantes hechos por el hombre o como se encuentran naturalmente (tales como los producidos por mutagénesis química o mutagénesis en sitio puntual) que tiene niveles más bajos de la actividad enzimática definida (por ejemplo, actividad enzimática de FAD2 en la semilla) en comparación con semillas fenotípicamente normales (por ejemplo, semillas que producen enzimas de FAD2 que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas como SEC ID NOs: 27, 28 y 36). Ejemplos de variedades de cártamo fenotípicamente normales incluyen, pero no se limitan a, Centenial Finch, Nutrasaff y Cardinal. El primer rasgo de oleico alto identificado en cártamo, encontrado en una introducción de cártamo procedente de la India, fue controlado mediante un alelo parcialmente recesivo designado ol en un locus individual OL, (Knowles & Hill, 1964). Como se describe en la presente, el locus OL corresponde al gen CtFAD2-l. El contenido de ácido oleico del aceite de la semilla en genotipos olol fue usualmente 71-75% para plantas cultivadas en invernadero (Knowles, 1989). Knowles (1968), incorporó el alelo ol en en un programa de reproducción de cártamo y liberó la primera variedad de cártamo de oleico alto (HO, High Oleic) "UC-1" en 1966 en los U.S., la cual fue seguida por la liberación de variedades mejoradas "Oleic Leed" y las series Saffola que incluyen Saffola 317 (S-317), S-517 y S-518. Los genotipos de oleico alto ( olol) fueron relativamente estables en el nivel de oleico cuando se cultivaron a diferentes temperaturas en el campo (Bartholomew, 1971). Además, Knowles (1972) también describió un alelo ol diferente; en el mismo locus, el cual produjo en condiciones homocigóticas entre 35 y 50% de ácido oleico. En contraste al genotipo ol, el genotipo olol mostró una fuerte respuesta a la temperatura (Knowles, 1972).Como se determina en la presente, el alelo de la mutación ol que confiere actividad FAD2-1 reducida (y actividad FAD2 total) en semilla de cártamo, es un gen FAD2-1 mutante que comprende la mutación de desplazamiento de marco (debida a la eliminación de un nucleótido individual) expuesto en la Figura 6 (ver también el Ejemplo 7 y las SEC ID NOs 26 y 38).
Como se usa en la presente, la frase "el cual es capaz de producir una planta que produce semillas cuyo contenido de aceite comprende" o "el cual es capaz de producir una planta que produce semillas oleosas cuyo contenido de aceite" o variaciones de estas significa que la planta producida a partir de la semilla, preferiblemente una planta de semilla oleosa y más preferiblemente una planta de cártamo, tiene la capacidad de producir el aceite con los componentes definidos cuando se cultivan bajo condiciones óptimas, por ejemplo en condiciones de invernadero tal como las mencionadas en los Ejemplos. Cuando se está en posesión de una semilla procedente de una planta, es rutina cultivar una planta descendiente a partir de al menos una de las semillas bajo condiciones de invernadero adecuadas y probar el contenido de aceite y composición de ácidos grasos en el aceite de la semilla procedente de la planta descendiente usando procedimientos estándares tal como los descritos en la presente. Por consiguiente como entenderá el experto mientras que el cultivo de semillas en un campo no puede satisfacer todos los requerimientos definidos en la presente debido a condiciones desfavorables en un año particular tal como el calor, frió, sequías, inundaciones, heladas, plagas, etc, no obstante, dichas semillas están abarcadas por la presente invención porque la semilla es capaz de producir una planta descendencia, que produzca el contenido de aceite el contenido de aceite o composición de ácidos grasos definidos cuando se cultivan bajo condiciones más favorables.
Como se usa en la presente, el término "en peso" se refiere al peso de una sustancia (por ejemplo, ácido oleico, ácido palmitico o PUFA tal como ácido linoleico o ácido linolénico) como un porcentaje del peso de la composición que comprende la sustancia o un componente en la composición. Por ejemplo, el peso de un ácido graso particular tal como ácido oleico puede ser determinado como un porcentaje del peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido o aceite de la semilla, o la semilla.
Como se usa en la presente, el término "biocombustible" se refiere a cualquier tipo de combustible, típicamente como se usa para maquinaria de energía tales como automóviles, camiones o motores energizados con petróleo, cuya energía se deriva de la fijación de carbón biológico preferiblemente a combustibles de fósiles. Los biocombustibles incluyen combustibles derivados de la conversión de biomasa, así como también biomasa sólida, combustibles líquidos y biogases. Ejemplos de biocombustibles incluyen bioalcoholes, biodiesel, diésel sintético, aceite vegetal, bioéteres, biogás, gas de síntesis, biocombustibles sólidos, combustible derivado de algas, biohidrógeno, biometanol, 2, 5- dimetíl furano (DMF), éter biometílico (bioDME), diésel de Fischer-Tropsch, diésel biohidrogenado, alcoholes mezclados y diésel de madera.
Como se usa en la presente, el término "producto industrial" se refiere a un producto hidrocarburo que es elaborado predominantemente de carbono e hidrógeno tal como metil-ácido graso y/o alcanos o ésteres etílicos tal como metano, mezclas de alcanos de cadena más larga, los cuales son típicamente líquidos a temperatura ambiente, un biocombustible, monóxido de carbono y/o hidrógeno o un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, o biocarbón. El término "producto industrial" está previsto para incluir productos intermediarios que pueden ser convertidos en otros productos industriales, por ejemplo, singas es en sí considerado un producto industrial que puede ser usado para sintetizar un producto hidrocarbonado que también es considerado un producto industrial. El 'término "producto industrial" como se usa en la presente incluye ambas, formas puras de los compuestos anteriores, o más comúnmente una mezcla de varios compuestos y componentes, por ejemplo el producto hidrocarbonado puede contener un intervalo de extensiones de cadenas de carbono, como se comprende bien en el arte.
Polinucleótidos Los términos "polinucleótido, y "ácido nucleico" se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier extensión, ya sea desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos. Un polinucleótido de la invención puede ser de origen genó ico ADNc, semisintético, o sintético, de doble hebra o de una sola hebra y en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido con el cual está asociado en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido diferente a aquel al cual está unido en la naturaleza. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos que codifican o no codifican a regiones de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definido a partir del análisis de enlaces, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) ARN ribosómico (ARNr), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado e cualquier secuencia, ADN quimérico de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Los polinucleótidos preferidos de la invención incluyen moléculas de ADN de doble hebra que son capaces de ser transcritos en células vegetales y moléculas de ADN silenciador.
Como se usa en la presente, el término "gen" es considerado en su contexto más amplio e incluye las secuencias de desoxiribonucleótido que comprenden la región transcrita y, si es transladado, la región codificadora de la proteina, de un gen estructural y que incluye secuencias localizadas adyacentes a la región codificadora en ambos extremos 5? Y 3' para una distancia de al menos aproximadamente 2 kb sobre un extremo u otro y los cuales están involucrados en la expresión del gen. A este respecto, el gen incluye señales control tal como señales de promotores, mejoradores, de terminación y/o de poliadenilación que naturalmente están asociadas con un gen dado, o señales control heterólogas, en cuyo caso, el gen es mencionado como un "gen quimérico". Las secuencias que están localizadas en 5' de la región codificadora de la proteina y las cuales están presentes sobre el ARNm son mencionadas como secuencias no traladadas 5'. Las secuencias que está localizadas en 3' o en la dirección de 5' a 3' de la región codificadora de la proteina y que están presentes sobre el ARNm son mencionadas como secuencias no trasladadas en 3'. El término "gen" abarca ambas formas ADNc y genómica de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificadora que puede estar interrumpida con secuencias no codificadoras denominadas "intrones", "regiones que intervienen". Los intrones son segmentos de un gen, los cuales son transcritos en ARN (ARNn) nuclear. Los intrones pueden contener elementos reguladores tales como mejoradores.
Los intrones son removidos o "empalmados hacia afuera" del trascripto primario o nuclear; Por consiguiente, los intrones están ausentes en el transcripto de ARN. Las funciones de ARNm durante la translación para especificar la secuencia u orden de aminoácidos en un polipéptido naciente. El término "gen" incluye una molécula sintética o de fusión que codifica todas o parte de las proteínas de la invención descritas en la presente y una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las anteriores.
Un "alelo" se refiere a una forma específica de una secuencia genética (tal como un gen) en una célula, una planta individual o en una población, la forma especifica que difiere de otras formas del mismo gen en la secuencia de al menos uno, y frecuentemente más de uno, sitios variantes en la secuencia del gen. Las secuencias de estos sitios variantes que difieren entre diferentes alelos se denominan "varianzas", "polimorfismos", o "mutaciones".
Como se usa en la presente, "ADN quimérico" se refiere a cualquier molécula de ADN que no se encuentra de manera natural en la naturaleza; también mencionado en la presente como un "constructo de ADN". Típicamente, ADN quimérico comprende secuencias reguladoras y transcritas o que codifican a proteína que de manera natural no se encuentran juntas. Por consiguiente, ADN quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que son derivadas de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero distribuidas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. El marco de lectura abierto puede estar o no unida a sus elementos reguladores en dirección de 3' a 5' o de 5' a 3' de manera natural. El marco de lectura abierto puede ser incorporado en, por ejemplo, el genoma vegetal, en una localización no natural, o en un replicón o vector donde no es encontrado de manera natural como un plásmido bacteriano o un vector viral. El término "ADN quimérico" no se limita a moléculas de ADN, que son replicables en un huésped, sino que incluye ADN capaz de ser ligado a un replicón por ejemplo, por secuencias adaptadores específicos.
Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. El transgen puede ser producido en una planta transformada inicial por regeneración de una célula vegetal transformada o en plantas descendientes producidas por autofertilización o cruzadas a partir del transformante inicial o en partes de planta tales como semillas. El término "modificado genéticamente" y variaciones de éste incluyen introducir un gen en una célula por transformación o transducción, mutando un gen en una célula y alterar genéticamente o modular la regulación de un gen en una célula, o la descendencia de cualquier célula modificada como se describió anteriormente.
Una "región genómica" como se usa en la presente se refiere a una posición en el genoma donde un transgen, o grupo de transgenes (también mencionados en la presente como un conglomerado) , ha sido insertado en una célula, o predecesor de ésta, de modo que son co-heredadas en células descendientes después de meiosis.
Un "polinucleótido recombinante" o "polinucleótido exógeno" de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido construida o modificada por métodos recombinantes artificiales. El polinucleótido recombinante puede estar presente en una célula en una cantidad alterada o expresada a una velocidad alterada (por ejemplo, en el caso de ARNm) en comparación con su estado nativo. Un polinucleótido exógeno es un polinucleótido que ha sido introducido en una célula que no comprende naturalmente el polinucleótido. Típicamente, un ADN exógeno es usado como una modelo para la transcripción de ARNm, el cual es entonces transladado en una secuencia continua de residuos de aminoácidos que codifican para un polipéptido de la invención en la célula transformada. En otra modalidad, parte del polinucleótido exógeno es endógeno a la célula y su expresión es alterada por medios recombinantes, por ejemplo, una secuencia control exógena es introducida en dirección de 5' a 3' de un polinucleótido endógeno para facilitar a la célula transformada expresar al polinucleótido codificado por el polinucleótido. Por ejemplo, un polinucleótido exógeno puede expresar a un ARN antisentido en un polinucleótido endógeno.
Un polinucleótido recombinante de la invención incluye polinucleótidos que no han sido separados de otros componentes del sistema de expresión libre de células o basado en células en el cual está presente, y polinucleótidos producidos en dichos sistemas libres de células o basados en células que son subsecuentemente purificados a partir de al menos algunos otros componentes. El polinucleótido puede ser un trecho de nucleótidos contiguos que existen en la naturaleza, o comprenden dos o más trechos de nucleótidos contiguos procedentes de diferentes fuentes (que se encuentran naturalmente y/o sintéticas) unidos para formar un polinucleótido individual. Típicamente, dichos polinucleótidos quiméricos comprenden al menos un marco de lectura abierto que codifica a un polipéptido de la invención unido operablemente a un promotor adecuado de activar la transcripción del marco de lectura abierto en una célula de interés.
Con respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que figuras de % de identidad más alta que los proporcionados anteriormente abarcaran modalidades preferidas. Por consiguiente, cuando sea aplicable, a la vista de figuras de % de identidad mínima, se prefirió que el polinucleótido comprenda una secuencia de polinucleótidos que sea al menos 59%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, más preferiblemente al menos 93%, más preferiblemente al menos 94%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, más preferiblemente al menos 99%, más preferiblemente al menos 99.1%, más preferiblemente al menos 99.2%, más preferiblemente al menos 99.3%, más preferiblemente al menos 99.4%, más preferiblemente al menos 99.5%, más preferiblemente al menos 99.6%, más preferiblemente al menos 99.7%, más preferiblemente al menos 99.8%, y aún más preferiblemente al menos 99.9% idéntica a la SEC ID NO: nominada relevante.
Un polinucleótido de, o útil para, la presente invención puede hibridizar selectivamente, bajo condiciones de severidad , a un polinucleótido definido en la presente. Como se usa en la presente, condiciones de severidad son aquellas que: (1)emplea durante la hibridización un agente desnaturalizador tal como formamida, por ejemplo, 50% (en volumen de formamida con 0.1% (en peso/volumen) de albúmina de suero bovino, 0.1% de Ficoll, 0.1% de polivinil pirrolidona, 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio a pH de 6.5 con 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de sodio a 42°C; o (2) emplea 50% de formamida, 5 x SSC (0.75 M de NaCl, 0.075 M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH de 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0.1% y sulfato de dextrano al 10% a 42°C en 0.2 x SSC y SDS al 0.1%, y/o (3) emplea baja fuerza iónica y alta temperatura para lavar., por ejemplo, NaCl 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/SDS al 0.1% a 50°C.
Los polinucleótidos de la invención pueden poseer, cuando se comparan con moleculas que se encuentran de manera natural, una o más mutaciones, las cuales son eliminaciones, inserciones, o sustituciones de residuos de nucleótidos Los polinucleótidos que tienen mutaciones en relación con una secuencia de referencia puede ser ya sea que se encuentra de manera natural (esto quiere decir, aislado de una fuente natural) o sintética (por ejemplo, efectuando mutagénesis en sitio puntual o confusión de ADN sobre el ácido nucleico como se describió en la presente.
Polinucleótidos para Reducir los Niveles de Expresión de Proteínas Endógenas En una modalidad, la célula/ semilla/ planta/ organismo de la invención comprende una mutación o un polinucleótido exógeno introducido, el cual subregula la producción y/o actividad de una enzima endógena, la cual, típicamente, da como resultado una producción creciente de ácido oleico, y preferiblemente una producción decreciente de ácido palmítico y PUFA tal como ácido linoleico, en comparación con una célula correspondiente gue carece de la mutación o polinucleótido exógeno introducido. Ejemplos de dichos polinucleótidos incluyen un polinucleótido antisentido, un polinucleótido en el sentido, un polinucleótido catalítico, un micro ARN, un polinucleótido que codifica a un polipéptido que enlaza a la enzima endógena y a un ARN de doble hebra.
Interferencia de ARN La interferencia de ARN (ARNi) es particularmente útil para inhibir específicamente la producción de una proteína particular. Esta teenología depende de la presencia de moléculas de ADNds que contienen una secuencia que es esencialmente idéntica al ARNm del gen de interés o parte de éste y una secuencia que es complementaria a ésta. Convenientemente, el ARNds puede ser producido a partir del promotor individual en un vector o célula huésped recombinantes, donde las secuencias en el sentido y antisentido están unidas covalentemente mediante una secuencia, preferiblemente una secuencia no relacionada, que facilita a la secuencia en el sentido y contrasentido en el transcripto correspondiente hibridizar para formar la molécula de ARNds con la secuencia de unión formando una estructura cíclica, aunque una secuencia con identidad en el ARN objetivo o su complemento pueden formar la estructura cíclica. Típicamente, el ARNds es codificado por un constructo de ARN de doble hebra que tiene secuencias en el sentido y contrasentido en una estructura de repetición invertida, distribuida como un palíndromo interrumpido, donde las secuencias de repetición son transcritas para producir las secuencias hibridizadoras en la molécula de ARNds, y la secuencia interrumpida es transcrita para formar e ciclo en la molécula de ARNds. El diseño y la producción de moléculas de ARNd adecuadas está en la capacidad de un experto en el arte, considerando particularmente a Waterhouse y colaboradores (1998), Smith y colaboradores (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, y WO 01/34815.
En un ejemplo, se introduce un ADN que dirige la síntesis de al menos un producto al menos parcialmente de doble hebra con homología, preferiblemente al menos 19 nucleótidos consecutivos complementarios a una región de, un ARN objetivo, para ser inactivado. Por consiguiente, el ADN comprende ambas secuencias en el sentido y antisentido gue, cuando son transcritas en el ARN, pueden hibridizar para formar la región de ARN de doble hebra. En una modalidad de la invención, las secuencias en el sentido y antisentido están separadas por una región espaciadora que comprende un intrón, el cual, cuando es transcrito en ARN, es desconectado. Se ha demostrado que esta distribución da como resultado una eficiencia más alta de gen silenciador. La región de ADN de doble hebra puede comprender una o dos moléculas de ARN, transcritas a partir de una o dos regiones de ADN. Se piensa que la presencia de la molécula d doble hebra activa una respuesta de un sistema endógeno que destruye ambos, la molécula de doble hebra y también el ARN homólogo transcrito a partir del gen objetivo, reduciendo eficientemente o eliminando la actividad del gen objetivo.
La extensión de las secuencias en el sentido y antisentido que híbridizan deberá ser cada una de al menos 19 nucleótidos contiguos, correspondientes a parte del ARNm objetivo. Se puede usar la secuencia de extensión total correspondiente al transcripto del gen entero. El grado de identidad de las secuencias en el sentido y antisentido con el transcrito destinado deberá ser de al menos 85%, al menos de 90%, o al menos de 95% a 100%. Por supuesto, la molécula de ARN puede comprender secuencias no relacionadas que pueden funcionar para estabilizar la molécula. La molécula de ARN puede ser expresada bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II o ARN polimerasa III. Ejemplos de los promotores ARNsn o ARNt anteriores.
Pequeñas moléculas de ARN de interferencia ("ARNsi") preferidas comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica a aproximadamente 19-21 nucleótidos contiguos del ARNm objetivo. Preferiblemente, la secuencia de ARNsi comienza con el dinucleótido AA, comprende un contenido de GC de aproximadamente 30-70% (preferiblemente, 30-60%, más preferiblemente 40-60% y más preferiblemente aproximadamente 45%-55%), y no tiene un alto porcentaje de identidad con cualquier secuencia de nucleótidos diferente de la objetivo en el genoma del organismo en el cual es introducida, por ejemplo, como se determina mediante la búsqueda por BLAST estándar.
Como un ejemplo, un ARNds de la invención comprende una secuencia de nucleótidos proporcionada como cualquiera de SEC ID NOs: 49 a 51 (donde cada T es un U).
Micro ARN Micro ARNs (abreviado miARNs) son generalmente 19 a 25 nucleótidos (comúnmente aproximadamente 20 a 24 nucleótidos en plantas) moléculas de ARN no codificadoras que se derivan de precursores más grandes que forman estructuras cíclicas germinales imperfectas. miARNs enlaza a secuencias complementarias sobre ARN mensajeros objetivo transcritos (mARNs), usualmente dan como resultado la represión translacional o degradación del objetivo y gen silenciador.
En células vegetales, moléculas precursoras de miARN se cree que inicialmente son procesadas en el núcleo. El promotor de ARN (que contiene una o más regiones "horquilla" o de doble hebra locales así como también el usual "capuchón" 5' y cola poliadenilada de un mARN) es procesado en una molécula precursora de miADN más corta que también incluye un ciclo germinal o estructura retro-plegada y es denominada el pre-miARN. En vegetales, los pre-miARNs son fragmentados por enzimas similares a DICER (DCL) diferentes, en particular DCL-I, que producen dupletos miARN:miARN*. Antes del transporte hacia afuera del núcleo, estos dupletos son metilados. En contraste, moléculas ARN horquilla que tienen regiones de dsARN más largas son procesadas en particular por DCL-3 y DCL-4.
En el citoplasma, la hebra de miARN del dupleto miARN:miARN es incorporado selectivamente en un complejo silenciador inducido por ARN activo (RISC, RNA_Induced Silencing Complex) para reconocimiento de objetivo. Los complejos RISC contienen un subgrupo particular de proteínas Argonauta que ejercen represión genética especifica de secuencia post-translacionalmente (ver, por ejemplo, Millar y Waterhouse, 2005; Pasquinelli y colaboradores, 2005; Almeida y Allshire, 2005).
Co-supresión Los genes pueden suprimir la expresión de genes endógenos relacionados y/o transgenes ya presentes en el genoma, un fenómeno denominado gen silenciador dependiente de homología. La mayoría de los casos de gen silenciador dependiente de homología cae en dos clases - aquellas que funcionan al nivel de transcripción del transgen, y aquella que opera post-transcripcionalmente.
El gen silenciador dependiente de homología post-transcripcionalmente describe la pérdida de expresión de un transgen y genes virales o endógenos relacionados en plantas transgénicas.
A menudo, pero no siempre, la co-supresión tiene lugar cuando transgenes transcriptos son abundantes, y generalmente, se piensa que es activado al nivel de procesamiento, localización, y/o degradación de mARN. Existen varios modelos para explicar cómo trabaja la co-supresión (ver en Taylor, 1997).
La co-supresión involucra introducir una copia extra de un gen o un fragmento de éste en una planta en la orientación en el sentido con respecto a un promotor para su expresión. Un experto deberá apreciar que el tamaño del fragmento en el sentido, su correspondencia con regiones genéticas objetivo, y su grado de identidad de secuencia con el gen objetivo puede variar. En algunos casos, la copia adicional de la secuencia del gen interfiere con la expresión del gen vegetal objetivo. Se hace referencia a WO 97/20936 y EP 0465572 para métodos de implementar procedimientos de co-supresión.
Vector de Expresión Como se usa en la presente, un "vector de expresión" es un ADN o ARN vector que es capaz de transformar una célula huésped y de efectuar la expresión de uno o más polinucleótidos específicos. Preferiblemente, el vector de expresión también es capaz de replicar en la célula huésped o de ser integrado en el genoma de la célula huésped. Típicamente, los vectores de expresión son virus o plásmidos. Los vectores de expresión de la presente invención incluyen cualquiera de los vectores que funcionan (es decir, expresión genética directa) en células huéspedes de la presente invención, incluyendo hongos, algas, y células vegetales.
"Operablemente unido" como se usa en la presente, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de 1 elemento regulador transcripcional (promotor) con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor está operablemente unido a una secuencia codificadora de un polinucleótido definido en la presente, si se estimula o modula la transcripción de la secuencia codificadora en una célula apropiada. Generalmente, elementos reguladores transcripcionales de promotores que están operablemente unidos a una secuencia transcrita son físicamente contiguos a la secuencia transcrita, es decir, son cis-activos. Sin embargo, algunos elementos reguladores transcripcionales tales como mejoradores, no necesitan ser físicamente contiguos o localizados en proximidad estrecha con las secuencias codificadoras cuy transcripción mejoran.
Vectores de expresión de la presente invención contienen secuencias reguladoras tales como secuencias de control de transcripción, secuencias de control de translación, orígenes de replicación, y otras secuencias reguladoras, que son compatibles con la célula huésped y que controlan la expresión de polinucleótidos de la presente invención. En particular, vectores de expresión de la presente invención incluyen secuencias de control de transcripción. Las secuencias de control de transcripción son secuencias que controlan el inicio, prolongación, y terminación de transcripción. Secuencias de control de transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripción tal como secuencias promotoras, mejoradoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de transcripción que puede funcionar en al menos una de las células recombinantes de la presente invención. La selección de las secuencias reguladoras usadas depende del organismo objetivo tal como una planta y/o tejido u órgano objetivo de interés. Dichas secuencias reguladoras pueden obtenerse de cualquier organismo eucariótico tal como plantas o virus de plantas, o pueden ser químicamente sintetizadas. Una variedad de dichas secuencias de control de transcripción son conocidas por el experto en el arte. Secuencias de control de transcripción particularmente preferidas son son promotoras activas dirigiendo la transcripción en plantas, ya sea constitutivamente, o por etapas y/o específica de tejido, dependiendo del uso de la planta o parte(s) de ésta.
Se han descrito numerosos vectores adecuados para transíección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas, en por ejemplo, Pouwels y colaboradores, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp.1987. Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, y Gelvin y colaboradores, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, vectores de expresión vegetales incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión vegetales también pueden contener una región reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora que controla la expresión inducible o constitutiva, regulada ambientalmente o desarrolladamente, o específica de célula o de tejido), un sitio de comienzo del inicio de la transcripción, un sitio de enlace de ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de transcripción, y/o una señal de poliadenilación.
Se han descrito numerosos promotores constitutivos que son activos en células vegetales. Promotores adecuados para expresión constitutiva en plantas incluyen, pero no se limitan a, el promotor 35S del virus mosaico de coliflor (CaMV), virus mosaico de la escrofularia (FMV) 35S, el promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar, promotor del virus jaspeado amarillo de camelina, el promotor inducible por la luz de la subunidad pequeña de la ribulosa-1, 5- bis fosfato carboxilasa, el promotor de triosafosfato citosólico isomerasa del arroz, el promotor de adenina fosforibosiltransferasa de Arabidopsis, el promotor del gen de catina I de arroz, los promotores de aminopina sintasa y octopina sintasa, el promotor de ADH, el promotor de sacarosa sintasa, el promotor del complejo del en R, y el promotor del gen de la proteína de enlace a/ de clorofila. Estos promotores han sido usados para crear vectores de ADN que han sido expresados en plantas, ver por ejemplo, WO 84/02913. Todos estos promotores han sido usados para crear varios tipos de vectores de ADN recombinantes expresables en vegetales.
Para el propósito de expresión en tejidos de origen de la planta tal como hojas, semillas, raíces o vástagos, se prefiere que los promotores utilizados en la presente invención tengan expresión relativamente alta en estos tejidos específicos. Para este propósito uno puede seleccionar numerosos promotores para genes con expresión específica de célula o de tejido, o mejorada. Ejemplos de dichos promotores reportados en la literatura incluyen, el promotor GS2 de glutamina sintasa del cloroplasto de chícharo, el promotor de fructosa- 1, 6- bifosfatasa de cloroplasto de trigo, el promotor ST-LSI nuclear fotosintético de papa, el promotor de serina/treonina quinasa y el promotor de glucoamilasa (CHS) de Arabidopsis thaliana.
Una variedad de promotores de genes vegetales, que son regulados en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas, y/o de desarrollo, también se pueden usar para expresión de genes de proteínas que enlazan a ARN en células vegetales, incluyendo promotores regulados por (1) calor, (2) luz, (por ejemplo, promotor RbcS-3a de chícharo, promotor RbcS de maíz), (3) hormonas tales como ácido abscísico, (4) heridas (por ejemplo, WunI), o (5) productos químicos como jasmonato de metilo, ácido salicílico, hormonas esteroides, alcohol, Safteners (WO 97/06269) o también puede ser ventajoso emplear (6)promotores específicos de órganos.
Como se usa en la presente, el término "promotor específico de órganos de almacenamiento vegetal" se refiere a un promotor que preferentemente, cuando se compara con otros tejidos vegetales, dirige la transcripción genética en un órgano de almacenamiento de una planta. El órgano de almacenamiento vegetal es preferiblemente una semilla. Preferiblemente, el promotor solamente dirige la expresión de un gen de interés en el órgano de almacenamiento, y/o expresión del gen de interés en otras partes de la planta tales como hojas no es detectable por análisis por tinción Northern y/o RT/PCR. Típicamente, el promotor activa la expresión de genes durante el cultivo y desarrollo del órgano de almacenamiento, en particular, durante la fase de síntesis y acumulación de compuestos almacenados en el órgano de almacenamiento. Dichos promotores pueden activar la expresión del gen en el órgano de almacenamiento de la planta entero o solamente parte de éste tal como el recubrimiento de la semilla, embrión, o cotiledón(es) en semillas de plantas dicotiledóneas o el endosperma o capa de aleurona de semillas de plantas monocotiledóneas.
También se pueden usar promotores para expresar una proteína en tejidos específicos como semillas o frutas. Puede usarse el promotor para b-conglicinina u otros promotores específicos de semilla tal como los promotores de napina, zeína, y linina. En una modalidad, el promotor dirige la expresión en tejidos y órganos en los cuales tiene lugar la biosíntesis lipídica. Dichos promotores actúan en el desarrollo de semillas en un momento adecuado para modificar la composición de lípidos en semillas. En una modalidad, el promotor específico del órgano de almacenamiento vegetal es un promotor específico de semillas. En una modalidad preferida, el promotor, preferentemente dirige la expresión en el embrión y/o cotiledones de una planta dicotiledónea o en el endosperma de una planta monocotíledónea, en relación con la expresión en otros órganos en la planta, como hojas.
Promotores preferidos para la expresión especifica en semillas incluyes: 1) promotores procedentes de genes que codifican a enzimas involucradas en la biosíntesis de lípidos y acumulación en semillas tal como desaturasas y elongasas, 2) promotores procedentes de genes que codifican a proteínas de almacenamiento de semillas, y 3) promotores procedentes de genes que codifican a enzimas involucradas en la biosíntesis y acumulación en semillas de carbohidratos. Promotores específicos de semillas que son adecuados para, un promotor de linina de lino (por ejemplo, promotores Cnll, Cnl2), el promotor del gen de napina de colza de semillas oleosas (US 5,609,152), el promotor USP de Vicia faba (Baumlein y colaboradores, 1991), el promotor oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), el promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980), o el promotor B4 de legumina (Baumlein y colaboradores, 1992), y promotores que conducen a la expresión específica de semillas en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y los similares. Promotores notables que son adecuados son los promotores de los genes lpt2 o lptl de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230), o los promotores descritos en WO 99/16890 (promotores procedentes del gen hordeina de cebada, el gen glutelina de arroz, el gen oxizina de arroz, el gen prolamina de arroz, el gen gliadina de trigo, el gen glutelina de trigo, el gen zeina de maíz, el gen glutelina de avena, el gen kasirina de sorgo, el gen secalina de centeno). Otros promotores incluyen aquellos descritos por Broun y colaboradores (1998). Potenza y colaboradores (2004), US 2007/0192802 y US 2003/ 0159173. En una modalidad, el promotor especifico de semilla es expresado preferentemente en partes definidas de la semilla como el embrión, cotiledón (es) o el endosperma. Ejemplos de promotores específicos de cotiledón incluyen, pero no se limitan a, el promotor FP1 (Ellerstrom y colaboradores, 1996), el promotor legumina de chícharo (Perrín y colaboradores, 2000), y el promotor fitohemaglutinina de frijol (Perrin y colaboradores, 2000). En una modalidad adicional, el promotor específico de semilla no es expresado, o es expresado solamente a un nivel bajo, en el embrión y/o después de los germinados de semillas.
Cuando hay múltiples promotores presentes, cada promotor puede ser independientemente el mismo o diferente.
La secuencia líder no transladada en 5' puede derivarse del promotor seleccionado para expresar a la secuencia del gen heterólogo del polinucleótido, o puede ser heterólogo con respecto a la región codificadora de la enzima a ser producida, y puede ser modificada específicamente si se desea para incrementar así la translación de ARNm.
La terminación de la transcripción se logra mediante una secuencia de ADn no transladado en 3' operablemente unida en el vector de expresión al polinucleótido de interés. La región o transladada en 3f de una molécula de ADN recombinante contiene una señal de poliadenilación que funciona en plantas para causar la adición de nucleótidos adenilados en el extremo 3' del ARN. La región no transladada en 3' puede ser obtenida a partir de varios genes que son expresados en, por ejemplo, células vegetales. La región no transladada en 3' de nopalina sintasa, la región no transladada en 3' del gen de la subunidad Rubisco small de chícharo, la región no transladada en 3' procedente del gen de la proteina de almacenamiento de semilla 7S de soya son usadas comúnmente en esta capacidad. También son adecuadas las regiones no trasladadas, transcritas en 3' que contienen la señal de poliadenilación de genes de plásmidos inducidos por tumor (Ti) de Agrobacterium.
Las teenologías de ADN recombinante se pueden usar para mejorar la expresión de un polinucleótido transformado, manipulando por ejemplo, el número de copias del polinucleótido en una célula huésped, , la eficiencia con la cual los polinucleótidos son transcritos, la eficiencia con la cual los transcritos resultantes son transladados, y la eficiencia de modificaciones post-translacionales.
Para facilitar la identificación de transformantes, el vector recombinante deseablemente comprende un gen seleccionable o cribable como, o en adición a, la secuencia de ácido nucleico de un polinucleótido definido en la presente. Por "gen marcador" se quiere decir, un gen que imparte un fenotipo distinto a células que expresan al gen marcador y por consiguiente, permite a dichas células transformadas diferenciarse de las células que no tienen el marcador. Un gen marcador seleccionable confiere una característica por la cual uno puede "seleccionar" con base en la resistencia a un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico, radiación, calor, u otro tratamiento que dañe a células no transformadas). Un gen marcador cribable (o gen informador) confiere una característica que uno puede identificar a través de la observación o pruebas, esto es, por "cribado" (por ejemplo, b-glucuronidasa, luciferasa, GFP u otra actividad enzimática no presente en células no transformadas. El gen marcador y la secuencia de nucleótidos de interés no ha sido ligada, ya que la co-transformación de genes no ligados como por ejemplo, descritos en US 4,399,216, es también un proceso eficiente en por ejemplo, transformación vegetal. La selección actual de un marcador no es crucial mientras que sea funcional (es decir, selectivo) en combinación con las células de selección tal como una célula vegetal.
Marcadores seleccionadles ejemplares para la selección de transformantes vegetales incluyen, pero no se limitan a, un gen hyg que codifica la resistencia higro icina B; un gen de neomicina fosfotransferasa (nptll) que confiere resistencia a kanamicina, paramomicina, G418; un gen de glutatión-S-transferasa procedente de hígado de rata que confiere resistencia a herbicidas derivados de glutatión como por ejemplo, descrito en EP 256223; un gen de glutamina sintetasa que confiere, después de sobre-expresión, resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa tal como fosfinotricina como por ejemplo, descrito en WO 87/05327; un gen de acetil transferasa de Streptomyces viridochromogenes que confiere resistencia al agente selectivo fosfinotricina como por ejemplo, se describe en EP 275957; un gen que codifica a 5-enolshikimate- 3- fosfato sintasa (EPSPS) que confiere tolerancia a N-fosfonometil glicina, como se describe, por ejemplo en Hinchee y colaboradores (1988); un gen bar que confiere resistencia contra bialafos, como se describe, por ejemplo, en WO 91/02071; un gen de nitrilasa tal como bxn procedente de Klebsíella ozaenae, que confiere resistencia a bromoxinil (Stalker y colaboradores, 1988); un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) que confiere resistencia a metotrexato (Thillet y colaboradores, 1988); un gen de acetolactato sintasa (ALS) mutante, que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea, u otros productos químicos inhibidores de ALS (EP 154,204); un gen de antranilato sintasa mutado que confiere resistencia a 5-metil triptófano; o un gen de dalapón deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida.
Marcadores cribables preferidos incluyen, pero no se limitan a, un gen uidA que codifica a la enzima b-glucuronidasa (GUS) por el cual se conocen varios sustratos cromogénicos; un gen de b-galactosidasa que codifica a una enzima por la cual se conocen sustratos cromogénicos; un gen de aequorin (Prasher y colaboradores, 1985) el cual puede ser empleado en la detección por bioluminiscencia sensible al calcio; un gen de proteína verde fluorescente (Niedz y colaboradores, 1995) o derivados de éste; o un gen de luciferasa (luc) (Ow y colaboradores, 1986) el cual permite la detección por bioluminiscencia. Por "molécula informadora" se quiere decir una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal identificable analíticamente que facilita la determinación de actividad promotora por referencia al producto proteínico.
Preferiblemente, el vector recombinante es incorporado establemente en el genoma de la célula tal como la célula vegetal. Por consiguiente, el vector recombinante puede comprender elementos apropiados gue permiten al vector ser incorporado en el geno a, o en un cromosoma de la célula. Ácidos Nucleicos de Transferencia Se pueden usar ácidos nucleicos de transferencia para liberar un polinucleótido exógeno en una célula y comprende uno, preferiblemente dos, secuencias limitantes y un polinucleótido de interés. El ácido nucleico de transferencia puede codificar o no un marcador seleccionable. Preferiblemente, el ácido nucleico de transferencia forma parte de un vector binario en una bacteria, donde el vector binario comprende adicionalmente elementos que permiten la replicación del vector en la selección de la bacteria, o en el mantenimiento de células bacterianas que contienen el vector binario. Después de transferencia a una célula eucariótica, el componente de ácido nucleico de transferencia del vector binario es capaz de integración en el genoma de la célula eucariótica.
Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico de transferencia extra cromosómico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de ser transferida desde una bacteria tal como Agrobacterium sp., a una célula eucariótica tal como una célula vegetal. Un ácido nucleico de transferencia extracromosómico es un elemento genético que es bien conocido como un elemento capaz de ser transferido, con la integración subsecuente de una secuencia de nucleótidos contenida en sus limites en el genoma de la célula receptora. Con respecto a esto, u ácido nucleico de transferencia es flanqueado, típicamente, por dos secuencias "limitantes", aunque en algunos casos se puede usar un solo limite en un extremo y el segundo extremo del ácido nucleico transferido es generado aleatoriamente en el proceso de transferencia. Un polinucleótido de interés es posicionado típicamente entre la secuencia limitante izquierda y la secuencia limitante derecha de un ácido nucleico de transferencia. El polinucleótido contenido en el ácido nucleico de transferencia puede ser unido operablemente a una variedad de elementos reguladores terminadores y promotores diferentes que facilitan su expresión, esto es, transcripción y/o translación del polinucleótido. ADNs de transferencia (T-ADNs) procedentes de Agrobacterium sp. tales como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes, y mutantes y variantes de éstas hechas por el hombre, son probablemente los mejores ejemplos caracterizados de ácidos nucleicos de transferencia. Otro ejemplo es P-ADN ("ADN de planta") el cual comprende secuencias limitantes de T-ADN de vegetales.
Como se usa en la presente, "T-ADN" se refiere a, por ejemplo, T-ADN de un plásmido Ti de Agrobacteríum turne faciens o de un plásmido Ri de Agrobacteríum rhizogenes , o variantes de éstas hechas por el hombre, las cuales funcionan como T-ADN. El T-ADN puede comprender un T-ADN entero que incluye ambas secuencias limitantes izquierda y derecha, pero necesitan comprende solamente las secuencias mínimas requeridas en cis, para transferencia, esto es, la secuencia limitante de T-ADN y derecha. Las T-ADNs de la invención tienen insertada en ellos en cualquier lado entre las secuencias limitantes derecha e izquierda (si están presentes), el polinucleótido de interés. Las secuencias que codifican factores requeridos en trans para transferencia del T-ADN en una célula vegetal tal como los genes vir, pueden ser insertados en el T-ADN, o puede estar presente sobre el mismo replicón que el T-ADN, o preferiblemente están en trans sobre un replicón compatible en el Agrobacteríum huésped. Dichos "sistemas vectoriales binarios" son bien conocidos en el arte.
Como se usa en la presente, "P-ADN" se refiere a un ácido nucleico de transferencia aislado a partir de un genoma vegetal, o variantes /mutantes de éste elaborado por el hombre, y comprende en cada extremo, o solamente en un extremo, una secuencia limitante de T-ADN. La secuencia limitante preferiblemente comparte al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95%, pero menos de 100% de identidad de secuencia, con una secuencia limitante de T-ADN procedente de un Agrobacterium sp. , tal como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes . Por consiguiente, P-ADNs pueden ser usados en vez de T-ADNs para transferir una secuencia de nucleótidos contenida en el P-ADN procedente, por ejemplo de Agrobacterium, a otra célula. El P-ADN, antes e inserción del polinucleótido exógeno el cual será transferido, puede ser modificado para facilitar la clonación y preferiblemente no deberá codificar a cualquiera délas proteínas. El P-ADN se caracteriza porque contiene, al menos una secuencia limitante derecha y preferiblemente también una secuencia limitante izquierda.
Como se usa en la presente, una secuencia "limitante" de un ácido nucleico de transferencia puede ser aislada partir de un organismo seleccionado tal como una bacteria o vegetal, o ser una variante/mutante de éstos, elaborada por el hombre. La secuencia limitante promueve y facilita la transferencia del polinucleótido al cual está ligado y puede facilitar su integración en el genoma de la célula receptora. En una modalidad, una secuencia limitante está entre 5 y 10 pares de bases (pb) de extensión, 10 a 80 pb de extensión, 15 a 75 pb de extensión, 15 a 60 pb de extensión, 15 a 50 pb de extensión, 15 a 40 pb de extensión, 15 a 30 pb de extensión, 16 a 30 pb de extensión, 20 a 30 pb de extensión, 21 a 30 b de extensión, 22 a 30 pb de extensión, 23 a 30 pb de extensión, 24 a 30 pb de extensión, 25 a 30 pb de extensión, o 26 a 30 pb de extensión, Secuencias limitantes procedentes de T-ADN de Agrobacterium sp. son bien conocidas en el arte e incluyen las descritas en Lacroix y colaboradores (2008), Tzfira y Citosky (2006) y Glevin (2003).
Aunque tradicionalmente solamente se ha usado Agrobacterium sp. para transferir genes a células vegetales, actualmente hay numerosos sistemas que han sido identificados/desarrollados que actúan de una manera similar a Agrobacterium sp. Varias especies diferentes de Agrobacterium han sido modificados genéticamente recientemente para ser competentes para transferencia genética (Chung y colaboradores, 2006; Broothaerts y colaboradores, 2005). Estas incluyen Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti y Mezorhizobium loti . Las bacterias son hechas competentes para transferencia genética proporcionando a las bacterias la maquinaria necesaria para el proceso transcripcional, esto es, un grupo de enes de virulencia codificados por un Ti-plásmido de Agrobacterium y el segmento de T-ADN que reside en un pequeño plásmido binario, separado. Las bacterias diseñadas de esta manera son capaces de transformar diferentes tejido vegetales (discos de hojas, callos y tejido oval), monocotiledóneas o dicotiledóneas, y varias especies vegetales diferentes (por ejemplo, tabaco, arroz).
Como se usa en la presente, el término "transfección", "transformación" y variaciones de éstos generalmente se usan indistintamente. Células "transfectadas" o "transformadas" pueden haber sido manipuladas para introducir el(los) polinucleótidos) de interés, o pueden ser células progenie derivadas de éstas.
Células Recombinantes La invención también proporciona una célula recombinante, por ejemplo, una célula vegetal recombinante, la cual es una célula huésped transformada con una o más polinucleótidos o vectores definidos en la presente, o combinaciones de éstas. El término "célula recombinante" es usado indistintamente con el término "célula transgénica" en la presente. Células adecuadas de la invención incluyen cualquier célula que pueda ser transformada con un polinucleótido o vector recombinante de la invención, que codifica por ejemplo, a un polipéptido o enzima descritos en la presente. La célula es preferiblemente una célula que es consecuentemente capaz de ser usada para producir lipidos. La célula recombinante puede ser una célula en cultivo, una célula in vitro, o en un organismo tal como por ejemplo, una planta, o en un órgano tal como, por ejemplo, una semilla o una hoja. Preferiblemente, la célula es un vegetal, más preferiblemente en la semilla de una planta, más preferiblemente en la semilla de una planta de semilla oleosa tal como cártamo. En una modalidad, la célula vegetal comprende lipido o aceite que tiene la composición de ácidos grasos como se describe en la presente.
Células huéspedes en las cuales son introducidos los polinucleótidos pueden ser ya sea células no transformadas o células que están ya transformadas con al menos un ácido nucleico. Dichos ácidos nucleicos pueden relacionarse o no con la síntesis de lípidos. Células huéspedes de la presente invención pueden ser capaces de producir ya sea endógenamente (es decir, naturalmente) polipéptidos definidos en la presente, en cuyo caso la célula recombinante derivada de éstos tiene una capacidad mejorada de producir (los) polipéptido(s), o puede ser capaz de producir dicho(s) polipéptido(s) solamente después de ser transformadas con al menos un polipéptido de la invención. En una modalidad, una célula recombinante de la invención tiene una capacidad mejorada para producir lípidos no polares. Las células pueden ser procarióticas o eucarióticas. Las células huéspedes preferidas son levaduras, algas y células vegetales. En una modalidad preferida, la célula vegetal es una célula de semilla, en particular un cotiledón o endosperma de una semilla. Ejemplos de células de algas útiles como células huéspedes de la presente invención incluyen, por ejemplo, Chlamydomonas sp. (por ejemplo, Chlamydomonas reinhardtii) , Dunaliella sp. , Haematococcus sp. , Chlorella sp. , Thraustochystrium sp. , Schizochytrium sp. y Volvox sp.
Las células huéspedes pueden ser de un organismo adecuado para un proceso de fermentación, tal como, por ejemplo, Yarrowia lipolytica u otras levaduras.
Plantas Transgenicas La invención también proporciona una planta que comprende un polinucleótido o polipéptido exógeno de la invención, una célula de la invención, un vector de la invención, o una combinación de éstos. El término "planta" se refiere a plantas enteras, aunque el término "parte de ésta" se refiere a órganos de plantas (por ejemplo, hojas, vástagos, raíces, flores, frutos), células individuales (por ejemplo, polen), semillas, partes de semillas como embrión, endosperma, escutelio, o recubrimiento de semilla, tejidos vegetales como tejidos vasculares, células vegetales y progenie de las mismas. Como se usa en la presente, partes de plantas comprenden células vegetales.
Como se usa en la presente, el término "planta" se usa en la presente en su sentido amplísimo. Incluye, pero no se limita a, cualquiera de las especies de céspedes, plantas ornamentales o decorativas, cultivos o cereales (por ejemplo, plantas de semillas oleosas, maíz, soya), o forraje, plantas de vegetales o frutales, plantas herbáceas, plantas boscosas; plantas de flores, o árboles. No se quiere limitar una planta a cualquier estructura particular. También se refiere a una planta unicelular (por ejemplo, microalga). El término "parte de ésta" con referencia a una planta, se refiere a una célula vegetal y a progenie de la misma, una pluralidad de células vegetales se diferencian ampliamente en una colonia (por ejemplo, volvox ) , una estructura que está presente en cualquier etapa de un desarrollo de planta, o un tejido vegetal. Dichas estructuras incluyen, pero no se limitan a, hojas, tallos, flores, frutas, nueces, raíces, recubrimiento de semillas, embriones. El término "tejido vegetal" incluye tejidos diferenciados y no diferenciados de plantas que incluyen las presentes en hojas, vástagos, flores, frutas, nueces, semillas, por ejemplo, tejido embriónico, endosperma, tejido dérmico (por ejemplo, epidermis, periderma), tejido vascular (por ejemplo, xile a, floem), o tejido grueso (que comprende células de parénquima, colénquima, y/o esclerénquima), así como también células en cultivo (por ejemplo, células individuales, cultivos tisulares, o cultivo celular.
Una "planta transgénica", "planta modificada genéticamente" o variaciones de éstas se refieren a una planta que contiene un transgen no encontrado en una planta de tipo salvaje de la misma especie, variedades o cultivares. Plantas transgénicas como se definen el el contexto de la presente invención incluye plantas y su progenie las cuales han sido modificadas genéticamente usando téenicas recombinantes para causar producción de la menos un polipéptido definido en la presente en la planta deseada o parte de ésta. "Partes de planta transgénica" tiene un significado correspondiente.
El término "semilla" y "grano" son términos relacionados que se usan en la presente, y tienen significados sobrepuestos. "Grano" se refiere a grano maduro tal como grano cosechado o grano que está aún en la planta pero ya por cosechar, pero también se puede referir a grano después de inhibición o germinación, de conformidad con el contexto. El grano maduro, comúnmente tiene un contenido de humedad de menos de aproximadamente 18 a 20%. "semilla" incluye "semilla en desarrollo" asi como también "grano", el cual es grano maduro, pero no grano después de inhibición o germinación . "Semilla en desarrollo" como se usa en la presente se refiere a una semilla antes de madurez, típicamente encontrada en las estructuras reproductivas de la planta después de fertilización o antesis., pero también se puede referir a dichas semillas antes de madurez, las cuales son aisladas de una planta. El desarrollo de la semilla in planta, típicamente se divide en fases precoz-, media, y tardía de desarrollo.
Como se usa en la presente, el término "órgano de almacenamiento de la planta" se refiere a una parte de una planta especializada en almacenar energía en la forma de, por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos. Ejemplos de órganos de almacenamiento de la planta son las semillas, frutas, raíces tuberosas, y tubérculos. Un órgano de almacenamiento de la planta preferido de la invención la semilla.
Como se usa en la presente, el término "tejido vegetativo" o "parte vegetativa de la planta" o variantes de éstos es cualquier tejido, órgano o parte de la planta que no incluye los órganos para reproducción sexual de plantas o los órganos que poseen semillas o los tejidos u órganos estrechamente asociados como flores, frutas y semillas. Tejidos y partes vegetativas incluyen al menos hojas de plantas, vástagos, (incluyendo troncos y tallos, pero excluyendo las cabezas), tubérculos y raíces, pero excluye flores, polen, semillas que incluyen el recubrimiento de la semilla, embrión y endosperma, fruta incluyendo el tejido del mesocarpo, vainas que poseen semillas y cabezas que poseen semillas. En una modalidad, la parte vegetativa de la planta es una parte aérea de la planta. En otra modalidad o modalidad adicional, la parte vegetativa de la planta es una parte verde como una hoja o tallo. Las partes vegetativas incluyen aquellas partes involucradas principalmente en proporcionar o apoyar la capacidad fotosintética de la planta o función relacionada, o de anclaje de la planta.
Como se usa en la presente, el término "fotosíntéticamente normal" se refiere a una planta o parte de ésta modificada genéticamente, particularmente un órgano de almacenamiento tal como una semilla de la invención que no tiene una habilidad significativamente reducida para crecer y reproducirse en comparación con una planta o planta de ésta no modificadas. En una modalidad, la planta o parte de ésta modificada genéticamente, la cual es fenotípicamente normal comprende al menos un polinucleótido exógeno como se define en la presente y tiene una habilidad para crecer o reproduciré, lo cual es esencialmente igual que una planta o parte de ésta correspondientes que no comprenden dicho polinucleótido (s). Preferiblemente, la biomasa, velocidad de crecimiento, velocidad de germinación, tamaño del órgano de almacenamiento, tamaño de la semilla y/o el número de semillas viables producidas no es de menos de 90% de la de una planta que carece de dicho polinucleótido exógeno cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. El término no abarca características de la planta que pueden ser diferentes a la planta de tipo salvaje pero que no afectan la utilidad de la planta para propósitos comerciales.
Plantas proporcionadas por o contempladas para uso en la práctica de la presente invención incluyen tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. En modalidades preferidas, las plantas de la presente invención con plantas cultivadas (por ejemplo, cereales y legumbres, maíz, trigo, papa, tapioca, arroz, sorgo, mijo, casava, cebada, o chícharo), u otras legumbres. Las plantas pueden ser cultivadas para producción de raíces, tubérculos, hojas, vástagos, flores o frutas comestibles. Las plantas pueden ser plantas vegetales u ornamentales. Las plantas de la invención pueden ser: cártamo ( Carthamus tinctorius) , maíz ( Zea mays) , cañóla ( Brassica napus, Brassica rapa ssp.), otras Brassicas tales como, por ejemplo, rutabaga ( Brassica napobrassica) , mostaza ( Brassica j ncea), mostaza Etíope ( Brassica car inata) , Cramba ( Crambe abyssinica) , camelina ( Camelina sativa) , remolacha (Beta vulgaris) , clavo ( Trifolium sp. ) , linaza ( Linum usitatibsimum) , alfalfa ( Medicago sativa) , arroz ( Oryza sativa) , centeno ( Secale cerale) , sorgo ( Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , girasol ( Helianthus annus) , trigo ( Tritium aestivum) , soya ( Glycine max) , tabaco ( Nicotiana tabacum) , papa ( Solanum tuberosum) , cacahuates ( Arachis hypogaea) , algodón ( Gossypium hirsutum) , camote ( Lopmoea batatus) , casava ( Manihot esculenta) , café ( Cofea spp.), coco ( Cocos nucífera) , piña ( Anana comosus) , árbol cítricos ( Cítrus spp.), cocoa ( Theobroma cacao) , té ( Camellia senensis) , plátano ( Musa spp.) aguacate ( Persea americana) , higo ( Ficus casica) , guayaba ( Psidíum guajava) , mango ( Mangifer indica) , aceituna ( Olea europaea) , papaya ( Carica papaya ) , anacardo ( Anacardium occidentale) , macadamia ( Macadamia intergri folia) , almendra ( Prunus amygdalus) , jatrofa ( Jatropha curcas ) , lupinas, Eucalipto, palma, nuez de sauce, pongamia, avena, o cebada.
Otras plantas preferidas incluyen céspedes C4 tales como especies de Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula , B. gracilís , Buchloe dactyloides , Panicum virgatum, Schizachyrium scoparium, Miscanthus por ejemplo, Míscanthus x giganteus y Miscanthus sínensis, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus , caña de azúcar ( Saccharum officinarum) , Brachyaria; zacates C3 tales como Elymus canadensis, las legumbres Lespedeza capitata y Petalostemum villosum; y plantas boscosas tales como Quercus ellipsoidalis y Q. macrocarpa .
En una modalidad preferida, la planta es una angiosper a.
En una modalidad preferida, la planta es una planta de semilla oleosa, preferiblemente una planta cultivada de semilla oleosa. Como se usa en la presente, una "planta de semilla oleosa" es una especie de planta usada para la producción comercial de lipidos procedentes de las semillas de la planta. "Producción comercial" en la presente significa la producción de lipidos, preferiblemente aceite, para vender a cambio de dinero. La planta de semilla oleosa puede ser de semilla oleosa (tal como cañóla), maíz, girasol, cártamo, soya, sorgo, lino (semilla de lino), o remolacha. Además, la planta de semilla oleosa puede ser diferente de Brassicas, algodón, cacahuate, poppy, rutabaga, mostaza, baya de castor, sésamo, cártamo, o plantas productoras de nueces. La planta puede producir altos niveles de lipidos en su fruto tal como aceituna, palma oleosa o coco. Las plantas de horticultura a las cuales se puede aplicar la presente invención son lechuga, endivia, o Brassicas vegetales incluyendo brócoli, o coliflor. La presente invención puede ser aplicada al tabaco, pepino, zanahoria, fresa, tomate, o pimienta. Plantas más preferidas son plantas de semilla oleosa cuyas semillas en desarrollo son no fotosintéticas, también mencionada como plantas de "semillas blancas", tales como cártamo, girasol, algodón y ricino.
En una modalidad preferida, la planta transgénica es homocigótica para cada uno y cada gen que ha sido introducido (transgen) de modo que su progenie no se segrega para el fenotipo deseado. La planta transgénica también puede ser heterocigótica para el transgen introducido, preferiblemente heterocigótica uniformemente para el transgen tal como por ejemplo, en la progenie Fl, la cual ha sido cultivado de semillas híbridas. Dichas plantas pueden proporcionar ventajas tales como vigor híbrido, bien conocido en el arte.
Transformación de plantas Las plantas transgénicas pueden ser producidas usando téenicas conocidas en el arte, tal como las descritas de manera general en Slater y colaboradores, Plant Biotechnology -- The Genetic Maipulation of Plants, Oxfor University Press (2003), y Christou y Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wilcy & Sons (2004).
Como se usa en la presente, los términos "que transforma establemente" y variaciones de éste se refieren a la integración del polinucleótido en el genoma de la célula de modo que ellos sean transferidos a células progenie durante la división celular sin la necesidad de seleccionar positivamente por su presencia. Transformantes estables, o progenie de éstos, pueden ser seleccionados y/o identificados por cualquier medio conocido en el arte tal como tinción Southern sobre ADN cromosómico, o hibridización in si tu de ADN genómico.
La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células de plantas porque el ADN puede ser introducido en células en cuyos tejidos vegetales, órganos vegetales, o explantas en cultivo tisular, ya sea para expresión transitoria, o bien para integración estable del ADN en el genoma de la célula vegetal. El uso de vectores que integran plantas mediadas por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es bien conocido en el arte (ver por ejemplo, US 5177010, US 5104310, US 5004863, o US 5159135). La región de ADN a ser transferida es definida por las secuencias limitantes, y el ADN que interviene (T-ADN) es usualmente insertado en el genoma vegetal. Adicionalmente, la integración del T-ADN es un proceso relativamente preciso que da como resultado pocas redistribuciones. En aquellas variedades vegetales donde la transformación mediada por Agrobacterium es eficiente, es el método de selección a causa de la naturaleza fácil y definida de la transferencia genética. Los vectores de transformación Agrobacterium preferidos son capaces de replicación en E. coli asi como también Agrobacterium, que permite manipulaciones convenientes como se describen (Klee y colaboradores, In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn y Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp.179-203 (1985)).
Los métodos de aceleración que pueden ser usados incluyen por ejemplo, bombardeo de microproyectil y los similares. Un ejemplo de un método para liberar moléculas de ácido nucleico transformantes a células vegetales es el bombardeo de microproyectil. Este método ha sido consultado por Yang y colaboradores, Particle Bo bardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994). Partículas no biológicas (microproyectiles) que pueden ser recubiertas con ácidos nucleicos y liberadas en células mediante una fuerza propelente. Dichos métodos son bien conocidos en el arte. En otra modalidad, los plástidos pueden ser transformados establemente. Los métodos descritos para transformación de plástidos en plantas superiores incluyen la pistola de liberación de partículas de ADN que contienen un marcador seleccionable y que se dirige del ADN hacia el genoma del plástido a través de recombinación homologa (US 5,451,513, US 5,545,818, US 5,877,402, US 5,932,479, y WO 99/05265).
Se puede lograr la transformación de protoplastos vegetales usando métodos basados en la precipitación de fosfato de calcio, tratamiento con polietilen glicol, electroporación, y combinaciones de estos tratamientos. La aplicación de estos sistemas a diferentes variedades vegetales depende de la habilidad para regenerar esa cepa vegetal particular procedente de protoplastos. Se describen métodos ilustrativos para la regeneración de cereales procedentes de protoplastos (Fujimura y colaboradores, 1985; Toriyama y colaboradores, 1986; Abdullah y colaboradores, 1986).
También se pueden usar otros métodos de transformación celular e incluyen pero no se limitan a la introducción de ADN en plantas por transferencia directa de ADN en polen, por inyección directa de ADN en órganos reproductores de una planta, o por inyección directa de ADN en las células de embriones inmaduros seguido por la rehidratación de embriones disecados.
La regeneración, desarrollo, y cultivo de plantas procedentes de transformantes de protoplastos de plantas individuales o de explantas transformadas son bien conocidas en el arte (Weissbach y colaboradores, In: Methods for Plant Molecular Biology, Acedemic Press, San Diego, Calif., (1988)). Esta regeneración y proceso de crecimiento incluye típicamente las etapas de selección de células transformadas, cultivar aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales de desarrollo embriónico a través de la etapa de plántulas radiculares. Los embriones y semillas transgénicas son regeneradas de manera similar. Los vástagos enraizados transgénicos resultantes, después de eso, son plantados en un medio de crecimiento de la planta apropiado tal como el suelo.
El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen exógeno, extraño es bien conocido en el arte. Preferiblemente, las plantas regeneradas son auto-polinizadas para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas. De otra manera, el polen obtenido de las plantas regeneradas es cruzado con plantas de desarrollo de semillas de líneas importantes agronómicamente. Contrariamente, polen de plantas de estas líneas importantes es usado para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polinucleótido deseado es cultivada usando métodos bien conocidos por el experto en el arte.
Métodos para transformar dicotiledóneas, primariamente mediante el uso de Agrobacterium turne faciens, y obteniendo plantas transgénicas se han publicado para algodón (US 5,004,863, US 5,159,135, US 5,518,908), soya (US 5,569,834, US 5,416,011), Brassica (US 5,463,174), cacahuate (Cheng y colaboradores, 1996), y chícharo (Grant y colaboradores, 1995).
Métodos para la transformación de plantas de cereales tales como trigo y cebada para introducir variaciones genéticas en la planta, por introducción de un ácido nucleico exógeno y por regeneración de plantas procedentes de protoplastos de embriones de plantas inmaduros son bien conocidos en el arte, ver por ejemplo, CA 2,092,588, AU 61781/94, AU 667939, US 6,100,447, PCT/US97/10621, US 5,589,617, US 6,541,257. Las células de trigo regenerables son preferiblemente procedentes del escutelo de embriones inmaduros, embriones maduros, calos derivados de éstos, o el tejido meristemático.
Para confirmar la presencia de los transgenes en células y plantas transgénicas, puede efectuarse una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction o análisis por tinción Southern, usando métodos conocidos por los expertos en el arte. Una vez que se han obtenido las plantas transgénicas, pueden ser desarrolladas para producir tejidos vegetales, o partes que tengan el fenotipo deseado. El tejido vegetal o partes de la planta, puede ser cosechado, y/o la semilla puede ser colectada. La semilla puede servir como una fuente para desarrollar plantas adicionales con tejidos o partes que tengan las características deseadas.
Una planta transgénica formada usando Agrobacterium u otros métodos de transformación típicamente contienen un solo locus transgénico sobre un cromosoma. Dichas plantas transgénicas pueden ser mencionadas como homocigótica por el gen añadido. Se prefiere más una planta transgénica que es homocigótica por el gen añadido, esto es, una planta transgénica que contiene dos genes añadidos, un gen en el mismo locus sobre cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta transgénica homocigótica puede ser obtenido autofertilizando una planta transgénica homocigótica, germinando algunas de las semillas producidas y analizando las plantas resultantes por el gen de interés.
También se entiende que dos plantas transgénicas diferentes que contienen dos loci o genes exógenos que segregan independientemente también se pueden cruzar (emparejados) para producir descendencia que contiene ambos grupos de genes o loci. Plantas de la descendencia F1 apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes o loci. Se contempla también retro-cruzar a una planta precursora y ex-cruzar con una planta no transgénica, cuando la propagación es vegetativa. La descripción de otros métodos de reproducción que son usados comúnmente para diferentes características y cultivos se puede encontrar en Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agrono y, Madison Wis. (1987).
Para la transformación de cártamo, se describen métodos particularmente útiles en Belide y colaboradores (2011).
TILLING En una modalidad, se puede usar el TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) para producir plantas en las cuales genes endógenos son agotados, por ejemplo, genes que codifican a una D12 desaturasa, una palmitoil-ACP tioestearasa, una actividad wb o D6 desaturasa, o una combinación de dos o más de éstas.
En una primera etapa, mutaciones introducidas, tales como nuevo par de bases individual induce cambios en una población de plantas tratando las semillas (o polen) con un mutágeno químico, y luego adelantar las plantas a una generación donde las mutaciones serán heredadas establemente, el ADN es extraído, y las semillas son almacenadas a partir de todos los miembros de la población para crear un recurso que puede ser accesada repetidamente con el tiempo.
Para un ensayo de TILLING, se diseñaron cebadores de PCR para amplificar específicamente un solo gen objetivo de interés. La especificidad es especialmente importante si un objetivo es un miembro de una familia de genes o parte de un genoma poliploide. Después, se pueden usar cebadores marcados con tinción para amplificar productos de PCR procedentes de ADN conjuntado de múltiples individuos. Estos productos de PCR son desnaturalizados y retemplados para permitir la formación de pares de bases disparejos. Los disparejos o heterodupletos, representa tanto polimorfismos de nucleótidos individuales que se encuentran de manera natural (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) (es decir, varias plantas de la población probablemente son portadores del mismo polimorfismo) como SNPs inducidos (es decir, solamente raras plantas individuales probablemente presentan la mutación). Después de la formación de heterodupletos, el uso de una endonucleasa, tal como Cell , que reconoce y fragmenta ADN disparejos es la clave para descubrir nuevos SNPs en una población de TILLING.
Usando este procedimiento, muchos miles de plantas pueden ser cribadas para identificar cualquier individuo con un solo cambio de base individual asi como también pequeñas inserciones o eliminaciones (1 a 30 pb) en cualquier gen o región especifica del genoma. Fragmentos genómicos que son ensayados pueden variar de tamaño donde sea desde 0.3 a 1.6 kb. En la octava vez de conjuntar, fragmentos de 1.4 kb (descontando los extremos de fragmentos donde la detección por SNP es problemática debido a interferencia) y 96 bandas por ensayo, esta combinación permite que hasta un millón de pares de bases de ADN genómico sean cribados por ensayo individual, haciendo TILLING una téenica de alta eficiencia.
Se describe adicionalmente TILLING en Slade and Knauf (2005), y Henikoff y colaboradores (2004).
Además de permitir la detección eficiente de mutaciones, la tecnología de TILLING de alta eficiencia es ideal para la detección de polimorfismos naturales. Por consiguiente, interrogara un ADN homólogo heterodupleteando a una secuencia conocida revela el número y posición de sitios polimorfismo. Tanto los cambios de nucleótidos como pequeñas inserciones y eliminaciones son identificados, incluyendo al menos algunos polimorfismos de número repetido. Esto se ha llamado Ecotilling (Comai y colaboradores, 2004).
Cada SNP es registrado por su posición aproximada en unos cuantos nucleótidos. Por consiguiente, cada haplotipo puede ser archivado con base en su movilidad. Los datos de secuencia se obtuvieron con esfuerzo creciente relativamente pequeño usando alícuotas del mismo ADN amplificado que el usado para el ensayo de fragmentación de disparejas. El cebador de secuenciación izquierda o derecha para una reacción individual es seleccionado por su proximidad al polimorfismo. El "software" Sequencher efectuó una alineación múltiple y descrubrió el cambio de base, el cual en cada caso confirmó la banda de gel.
El Ecotilling puede efectuarse de manera más barata que la secuenciación total, el método normalmente usado para la mayoría de los descubrimientos de SNP. Placas que contienen ADN ecotípico reticulado pueden ser cribadas en vez de conjuntos de ADN procedentes de plantas mutagenizadas. Porque la detección es sobre geles con escasa resolución de pares de bases y los patrones de fondo son uniformes a través de las bandas, bandas que son de idéntico tamaño pueden ser emparejadas, descubriendo y genotipificando asi SNPs en una etapa individual. De esta manera, la secuenciación final de SNP es simple y eficiente, tanto más, por el hecho de que las alícuotas de los mismos productos de PCR usados para cribar pueden ser sometidos a secuenciación de AD.
Procedimientos de Mutagénesis Se conocen en el arte, téenicas para generar lineas vegetales mutantes. Ejemplos de mutágenos que pueden ser usados para generar plantas mutantes incluyen irradiación y mutagénesis química. También se pueden producir mutantes mediante técnicas tales como mutagénesis inducida por transposón e inserción de T-ADN. Las mutaciones en cualquier gen deseado en na planta, puede ser introducido de manera específica puntual por nucleasa digital de zinc artificial (ZFN), efector TAL (TALEN) o teenologías de CRISPR (usando una nucleasa de tipo Cas9) como se sabe en el arte. El procedimiento de mutagénesis puede ser efectuado sobre cualquier célula precursora de una planta, por ejemplo una semilla o una célula precursora en cultivo de tejido.
Los mutágenos químicos son clasificados por sus propiedades químicas, por ejemplo, agentes alquilantes, agentes reticuladores, etc. Los mutágenos químicos útiles incluyen, pero no se limitan a, N- etil- N- nitrosourea (ENU); N- metil- N- nitrosourea (MNU); clorhidrato de procarbazina; clorambucil; ciclofosfamida; metansulfonato de metilo (MMS); metansulfonato de etilo (EMS), sulfato de etilo; monómero de acrilamida; trietilen melamina (TEM); melfalan; mostaza nitrogenada; vincrisina; dimetilnitrosamina; N- metil- N'- nitro- Nitrosoguanidina (MNNG); 7, 12- dimetilbenzantraceno (DMBA);óxido de etileno; hexa etil fosfora ida; y bisulfan.
Un ejemplo de irradiación adecuada para inducir mutaciones es por radiación gama, tal como la suministrada mediante una fuente de Cesio 137. La radiación gama, preferiblemente es suministrada a las células vegetales en una dosificación de aproximadamente 60 a 200 Krad., y más preferiblemente en una dosificación de aproximadamente 60 a 90 Krad.
Las plantas son expuestas típicamente a un mutágeno por una duración suficiente para lograr la modificación genética deseada pero insuficiente para destruir completamente la viabilidad de las células y su habilidad para ser regenerada en una planta.
Los procedimientos de mutagénesis descritos anteriormente típicamente dieron como resultado la generación de mutantes en un gen de interés a una frecuencia de al menos 1 en 1000 plantas, lo cual significa gue el cribado de poblaciones mutagenizadas de las plantas es un medio practicable para identificar mutantes en cualquier en de interés. La identificación de mutantes también puede ser lograda mediante teenologías de secuenciación de nucleótidos paralelas masivamente.
Selección Asistida por Marcadores La selección asistida por marcadores es un método bien reconocido de seleccionar para plantas heterocigóticas requerido cuando la retrocruza con un precursor recurrente en un programa de reproducción clásico. La población de plantas en cada generación retrocruzada será heterocigótica por el gen de interés normalmente presente en una proporción de 1:1 en una población retrocruzada, y el marcador molecular puede ser usado para distinguir los dos alelos del gen. Extrayendo el ADN de, por ejemplo, vástagos jóvenes y pruebas con un marcador especifico para el rasgo deseado ingresado, se hace la selección temprana de plantas por retrocruza adicional, aunque la energía y recursos se concentren sobre menos plantas. Para acelerar adicionalmente el programa de retrocruza, el embrión de semillas inmaduras (25 días post-antesis) puede ser excisado y desarrollado sobre medio nutriente bajo condiciones estériles, preferiblemente a permitir la madurez total. Este proceso, denominado "rescate del embrión", usado en combinación con extracción de ADN en la tercera etapa de la hoja y análisis para el genotipo deseado permite la rápida selección de plantas que portan el rasgo deseado el cual puede ser nurturado a madurez en el invernadero o campo para subsecuente retrocruza adicional con el precursor recurrente.
Se puede usar cualquier téenica biológica molecular conocida en el arte que sea capaz de detectar un gen FAD2, FATB o FAD6, en los métodos de la presente invención. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan al uso de amplificación de ácido nucleico, secuenciación de ácido nucleico, hibridización de ácido nucleico con sondas marcadas adecuadamente, análisis conformacional de una sola hebra (SSCA, Single-Strand Conformational Analysis), electroforesis sobre gel en gradiente desnaturalizador (DGGE, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), análisis de heterodupleto (HET), análisis por fragmentación química (CCM, Chemical Cleavage Analysis), fragmentación catalítica del ácido nucleico o una combinación de éstos (ver, por ejemplo, Lemieux, 2000; Langridge y colaboradores, 2001). La invención también incluye el uso de téenicas de marcador molecular para detectar polimorfismos vinculados a alelos de (por ejemplo) un gen FAD2, FATB o FAD6 que confiere el fenotipo deseado. Dichos métodos incluyen la detección o análisis polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), RAPD, polimorfismos de longitud del fragmento amplificado (AFLP) y polimorfismos de microsatélite (SSR, Simple Sequence Repeat). Los marcadores ligados estrechamente se pueden obtener fácilmente por métodos bien conocidos en el arte, tal como Bulked Segregant Analysis, según la consulta por Langridge y colaboradores, (2001).
La "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") es una reacción en la cual se hacen copias replicadas de un polinucleótido objetivo usando un "par de cebadores" o "grupo de cebadores" que consisten de un cebador de "3' a 5'" y uno de "5' a 3' ", y un catalizador de polimerización, tal como un ADN polimerasa, y típicamente, una enzima polimerasa térmicamente estable. Se conocen los métodos para PCR, y son expuestos, por ejemplo, en "PCR" (Ed. Mp. J. Me Pherson y S.G. Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd. Oxford)La PCR se puede efectuar sobre ADNc obtenido a partir de Transcribir de manera inversa (RT) de ARNm aislado de células vegetales. Sin embargo, generalmente, será más fácil si la PCR se efectúa sobre ADN genómico aislado de una planta.
Un cebador es una secuencia de oligonucleótido que es capaz de hibridizar en un estilo especifico de secuencia a la secuencia objetivo y que se extiende durante la PCR. Los amplicones o productos de PCR o fragmentos de PCR o productos de amplificación son productos de extensión que comprenden el cebador y las copias recientemente sintetizadas de las secuencias objetivo. Sistemas de PCR multipletos contienen múltiples grupos de cebadores que dan como resultado la producción simultánea de más de un amplicón. Los cebadores pueden ser emparejados perfectamente a la secuencia objetivo o pueden contener bases disparejas internas que pueden dar como resultado la introducción de enzimas de restricción o el reconocimiento del ácido nucleico catalítico/ sitios de fragmentación en secuencias objetivo específicas. Los cebadores también pueden contener secuencias adicionales y/o contienen nucleótidos marcados o modificados para facilitar la captura o detección de amplicones. Ciclos repetidos de desnaturalización térmica del ADN, temple de cebadores a sus secuencias complementarias y extensión de los cebadores templados con polimerasa dando como resultado la amplificación exponencial de la secuencia objetivo.
El término objetivo o secuencia objetivo o modelo se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que son amplificadas.
Los métodos para dirigir la secuenciación de secuencias de nucleótidos son bien conocidos por los expertos en el arte y se pueden encontrar por ejemplo en Ausubel y colaboradores ( supra ) y Sambrook y colaboradores ( supra). La secuenciación puede llevarse a cabo por cualquier método adecuado, por ejemplo, secuenciación de didesoxi, secuenciación química o variaciones de éstas. La secuenciación directa tiene la ventaja de determinar variaciones en cualquier par de bases de una secuencia particular.
Los sistemas de detección basados en hibridización incluyen, pero no se limitan a, el ensayo de TaqMan y ensayos de tamiz molecular (US 5,925,517). El ensayo de TaqMan (US 5,962,233) usa sondas específicas de alelo (ASO) con un donador teñido sobre un extremo y un receptor teñido sobre el otro extremo de modo que el par teñido interactúa vía transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET, Fluorecence Resonance Energy Transfer).
En una modalidad, el método descrito en el Ejemplo 7 es usado en los programas de selección y reproducción para identificar y seleccionar plantas de cártamo con la mutación ol . Por ejemplo, el método comprende efectuar una reacción de amplificación sobre el ADN genómico obtenido de la planta usando uno o ambos de los siguientes grupos de cebadores; i)5'- ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3' (SEC ID NO: 140) y 5'- GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3' (SEC ID NO: 141) Y ii)5'- AGTTATGGTTCGATGATCGACG- 3' (SEC ID NO: 142) y 5'- TTGCTATACATATTGAAGGCACT- 3' (SEC ID NO: 143).
Polipéptidos El término "polipéptido" y "proteína" generalmente, se usan indistintamente.
Un polipéptido o clase de polipéptidos puede definirse por la extensión de identidad (% de identidad) o por su secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia, o por tener un % de identidad mayor con una secuencia de aminoácidos de referencia que con otra. El % de identidad de un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de referencia es determinada típicamente por análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970; programa GCG) con parámetros de una penalización de creación de espacio = 5, y una penalización de extensión de espacio = 0.3. La secuencia de consulta es de al menos 100 aminoácidos de extensión y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos. Aún más preferiblemente, la secuencia de consulta es de al menos 250 aminoácidos de extensión y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 250 aminoácidos. Aún más preferiblemente, el análisis GAP alinea dos secuencias sobre su longitud total. El polipéptido o clase de polipéptido puede tener la misma actividad enzimática que, o una actividad diferente que, o carecer de actividad del polipéptido de referencia. Preferiblemente, el polipéptido tiene una actividad enzimática de al menos 10% de la actividad del polipéptido de referencia.
Como se usa en la presente, un "fragmento activo biológicamente" es una porción de un polipéptido de la invención que mantiene una actividad definida de un polipéptido de referencia de extensión total, por ejemplo, actividad D12 desaturasa, palmitoil-ACP tioestearasa o D6 desaturasa. Fragmentos biológicamente activos, como se usa en la presente, excluyen al polipéptido de extensión total. Fragmentos biológicamente activos pueden ser cualquier porción de tamaño siempre que mantenga la actividad definida. Preferiblemente, el fragmento activo biológicamente mantiene al menos 10% de la actividad del polipéptido de extensión total.
Con respecto a un polipéptido o enzima definido, se apreciará que figuras de % de identidad más alta que la proporcionada en la presente abarcaran modalidades preferidas. Por consiguiente, cuando sea aplicable, a la vista de las figuras de % de identidad mínimo, se prefiere que el polipéptido/enzima comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, más preferiblemente al menos 93%, más preferiblemente al menos 94%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, más preferiblemente al menos 99%, más preferiblemente al menos 99.1%, más preferiblemente al menos 99.2%, más preferiblemente al menos 99.3%, más preferiblemente al menos 99.4%, más preferiblemente al menos 99.5%, más preferiblemente al menos 99.6%, más preferiblemente al menos 99.7%, más preferiblemente al menos 99.8%, aún más preferiblemente al menos 99.9% idéntica a la SEC ID NO: nombrada relevada.
Se pueden preparar mutantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos definidos en la presente introduciendo cambios apropiados de nucleótidos en un ácido nucleico definido en la presente, o por síntesis in vitro del polipéptido deseado. Dichos mutantes incluyen por ejemplo, eliminaciones, inserciones, o sustituciones de residuos en la secuencia de aminoácidos. Una combinación de eliminaciones, inserciones y sustituciones se pueden hacer para llegar al constructo final, a condición de que el producto del polipéptido final posea las características deseadas.
Se pueden preparar polipéptidos mutantes (alterados) usando cualquier téenica conocida en el arte, por ejemplo, usando estrategias de evolución dirigida o de diseño racional (ver a continuación). Productos derivados de ADN mutado/alterado pueden fácilmente ser cribados usando técnicas descritas en la presente para determinar si poseen, o carecen de actividad 12 desaturasa, palmitoil-ACP tioestearasa u w6 D6 desaturasa.
Al diseñar mutantes de secuencias de aminoácidos, la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de las características a ser modificadas. Los sitios para mutación pueden ser modificados individualmente o en serie por ejemplo, por (1) sustituyendo primero con selecciones de aminoácidos conservadores y luego con selecciones más radicales dependiendo de los resultados logrados, (2) eliminando el residuo objetivo, o (3) insertando otros residuos adyacentes en el sitio localizado.
Como apreciará el experto en la materia, el uso de sustituciones no conservadoras se pueden usar cuando se produzca un mutante con actividad enzimática reducida.
Las eliminaciones de secuencias de aminoácidos generalmente varían desde aproximadamente 1 a 15 residuos, más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 residuos y típicamente aproximadamente 1 a 5 residuos contiguos, pero pueden ser mucho más largas. Particularmente cuando el mutante es diseñado para reducir la actividad enzimática.
Los mutantes por sustitución tienen al menos un residuo de aminoácidos en el polipéptido retirado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de máximo interés para utagénesis sustitucional para inactivar una enzima incluyen sitios identificados como el(los) sitio(s) activo (s). Otros sitios de interés son aquellos en los cuales residuos particulares obtenidos de varias cepas o especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para actividad biológica. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1, ya que sustituciones no conservadoras son sustituciones que no son sustituciones conservadoras.
En una modalidad, un polipéptido de la invención es una D12 desaturasa y el cual comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en cualquiera de las SEC ID NOs: 27 a 34, 36 o 37, un fragmento biológicamente activo de éstas, o una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40% idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID NOs: 27 a 34, 36 o 37.
En otra modalidad, un polipéptido de la invención es oleato de D12 desaturasa presente en la semilla (semilla oleosa) de una planta de semilla oleosa que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la proporcionad en una cualquiera de las SEC ID NOs: 27, 28 o 36, un fragmento de éstas activo biológicamente, o una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40% idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID NOs: 27, 28 o 36.
En otra modalidad, un polipéptido de la invención es una A12-acetilenasa que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la proporcionada en la SEC ID NO: 37, un fragmento de ésta activo biológicamente, o una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40% idéntica a la SEC ID NO: 37.
En otra modalidad, un polipéptido de la invención es un palmitoleato de D12 desaturasa que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la proporcionada en la SEC ID NO: 35, un fragmento activo biológicamente de ésta, o una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40% idéntica a la SEC ID NO: 35.
En otra modalidad, un polipéptido de la invención es una palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la proporcionada en una cualquiera de SEC ID NOs: 44 o 45, un fragmento activo biológicamente de ésta, o una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40% idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID NOs: 44 o 45.
Tabla 1. Sustituciones conservadoras.
Tabla 1 (Continuación) En otra modalidad, un polipéptido de la invención es una palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) presente en la semilla de una planta de semilla oleosa que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la proporcionada en la SEC ID NO: 45, un fragmento activo biológicamente de ésta, o una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40% idéntica a la SEC ID NO: 45.
En otra modalidad, un polipéptido de la invención es una D12 desaturasa, la cual comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la proporcionada en la SEC ID NO: 48, un fragmento activo biológicamente de ésta, o una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40% idéntica a la SEC ID NO: 48.
En la sección de Ejemplos se proporcionan características preferidas de las enzimas de la invención, en particular en el Ejemplo 2 en relación a FAD2's de cártamo. Polipéptidos como los descritos en la presente se pueden expresar como una fusión con al menos otro polipéptido. En una modalidad preferida, el al menos otro polipéptido es seleccionado del grupo que consiste de: un polipéptido que mejora la estabilidad de la proteina de fusión, y un polipéptido que auxilia en la purificación de la proteina de fusión.
Producción de Lípidos y/o Aceites Altos en Ácido Oleico Se pueden usar téenicas que se practican rutinariamente en el arte para extraer, procesar, purificar y analizar los lípidos producidos por las plantas, en particular, las semillas, de la presente invención. Dichas técnicas se describen y explican en toda la literatura en fuentes tales como, Fereidoon Shahidi, Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wilcy & Sons, Inc. (2001) DI.1.1-D1.1.11, y Pérez-Vich y colaboradores (1998).
Producción de Aceite de Semillas Típicamente, las semillas vegetales son cocidas, comprimidas, y/o extraídas para producir aceite de semilla crudo, el cual es entonces desgomado, refinado, blanqueado, y desodorizado. Generalmente, las técnicas para triturar la semilla son conocidas en el arte. Por ejemplo, semillas oleosas pueden ser templadas rociándolas con agua para aumentar el contenido de humedad a, por ejemplo, 8.5%, y laminadas usando un laminador de rodil]os lisos con un ajuste de espacio de 0.23 a 0.27 mn. Dependiendo del tipo de semilla, el agua puede no ser añadida antes del triturado. La aplicación de enzimas desactivadas térmicamente, facilita la ruptura celular adicional, coalesoencias de las gotitas de liquide, y partículas de proteínas aglutinadas, rodo lo cual facilita el proceso de extracción.
En una modalidad, la mayor parte del aceite de la semilla es liberada pasando a través de una prensa de gusano' sin fin. Las tortas expulsadas de la prensa de gusano sin fin son entonces extraídas por solvente, con hexano, usando una columna térmica. Alternativamente, el aceite de semilla crudo producido mediante la operación de compresión puede pasarse a través de un tanque de sedimentación con una linea de dren je superior para remover ios sólidos que son exprimidos con el aceite de semilla durante la operación de compres]ón. Eli residuo sólido procedente de la compresión y extracción, después de remoción dei hexano, es lo comestibie de la semilla que es típicamente usado como alimento animal. El aceite de la semilla ciarifícado puede ser pasado a través de una placa y marco filtrante para remover cualquier partícula sólida fina remanente. Si se desea, eí aceite recuperado de la semilla por el proceso de extracción puede combinarse con el aceite clarificado de la semilla para producir una mezcla de aceite crudo.
Una vez que el solvente es despojado del aceite de semilla crudo, las porciones comprimidas y extraídas son combinadas y sometidas a procedimientos de procesamiento de lípidos normales tales como, por ejemplo, desgomado, refinamiento cáustico, blanqueo y desodorización. Algunas o todas las etapas se pueden omitir, dependiendo de la naturaleza de la ruta del producto, por ejemplo, para aceite de grado alimenticio, puede ser necesario el tratamiento limitado siempre que para aplicaciones oleoquímicas, se requieran más etapas de purificación.
Desgomado El desgomado es una etapa previa en la refinación de aceites y su propósito primario es la remoción de la mayor parte de fosfolípidos del aceite, los cuales están presentes como aproximadamente 1 a 2 % del lípido total extraído. La adición de ~ 2% de agua, que contiene típicamente ácido fosfórico, a 70 a 80°C al aceite crudo da como resultado la separación de la mayor parte de fosfolípidos acompañados por metales en trazas y pigmentos. El material insoluble que es removido , principalmente, es una mezcla de fosfolípidos y triacetil gliceroles y es también conocido como lecitina. El desgomado se puede efectuar por adición de ácido fosfórico concentrado al aceite crudo de la semilla para convertir fosfátidos no hidratables a una forma hidratable, y a metales mínimos quelados que están presentes. La goma es separada del aceite de la semilla por centrifugación.
Refinación con Álcali La refinación con álcali es uno de los procesos de refinación para tratar aceite crudo, algunas veces mencionada como neutralización, üsualmente sigue al desgomado y precede al blanqueo. Después de desgomado, el aceite de la semilla puede ser tratado por la adición de una cantidad suficiente de una solución alcalina para titular todos los ácidos grasos y ácidos fosfóricos, y remover el jabón así formado. Los materiales alcalinos adecuados incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, hidróxido de litio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio e hidróxido de amonio. Este proceso se lleva a cabo típicamente a temperatura ambiente y remueve la fracción de ácidos grasos libres. El jabón es retirado por centrifugación o por extracción en un solvente para el jabón, y el aceite neutralizado es lavado con agua. Si se requiere, cualquier exceso de álcali en el aceite puede ser neutralizado con un ácido adecuado tal como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico.
Blanqueo El blanqueo es un proceso de refinación en el cual los aceites son calentados a 90 a 120°C por 10 a 30 minutos en la presencia de una tierra blanqueadora (0.2 a 2.0%) y en la ausencia de oxigeno operando con nitrógeno o vapor o al vacio. Esta etapa en el procesamiento de aceite es diseñada para remover también productos de oxidación, metales en trazas, compuestos de azufre y trazas de jabón.
Desodor i z ación La desodorización es un tratamiento de aceites y grasas a un alta temperatura (200 a 260°C) y baja presión (0.1 a 1 mm de Hg). Esto se logra, típicamente, introduciendo vapor en el aceite de la semilla a una velocidad de aproximadamente 0.1 mi(minuto/100 mi de aceite de semilla. Después de aproximadamente 30 minutos de aspersión, el aceite de la semilla se deja enfriar al vacío. El aceite de semilla es típicamente transferido a un contenedor de vidrio y derrame con argón antes de ser almacenado bajo refrigeración. Este tratamiento mejora el color del aceite de semilla y remueve una mayoría de sustancias volátiles o compuestos olorosos incluyendo cualquier ácido graso libre, monoacilgliceroles y productos de oxidación.
” N ínter i za cion " La "winterización" es un proceso usado algunas veces en la producción comercial de aceites para la separación de aceites y grasas en fracciones sólidas (estearina) y liquidas (oleína) por cristalización a temperaturas sub-ambientales . Se aplicó originalmente a aceite de semilla de algodón para producto libre de sólidos. Típicamente se usa para disminuir el contenido de ácidos grasos saturados de los aceites.
Trans-esterif icación La trans-esterificación es un proceso que intercambia los ácidos grasos en y entre TAGs, inicialmente liberando ácidos grasos de TAGs ya sea como ácidos grasos libres o bien como ésteres de ácidos grasos, usualmente ésteres etílicos de ácidos grasos. Cuando se combina con un proceso de fraccionamiento, la transesterificación puede ser usada para modificar la composición de ácidos grasos de lípidos (Marangoni y colaboradores, 1995). La transesterificación puede usar medios químicos o enzimáticos, el último que usa lipasas las cuales pueden ser específicos déla posición (específicos de sn-1/3 o sn-2) para el ácido graso sobre TAG, o tener una preferencia por algunos ácidos grasos sobre otros (Speranza y colaboradores, 2012). El fraccionamiento del ácido graso para incrementar la concentración de LC-PUFA en un aceite se puede lograr por cualquiera de los métodos conocidos en el arte, tal como, por ejemplo, cristalización por congelación, formación de complejos usando urea, destilación molecular, extracción fluida supercritica, complejación de iones plata. La formación del complejo con urea es un método preferido por su simplicidad y eficiencia al reducir el nivel de ácidos grasos monoinsaturados y saturados en el aceite (Gamez y colaboradores, 2003). Inicialmente, los TAGs del aceite son separados en sus ácidos grasos constituyentes, a menudo en la forma de ásteres de ácidos grasos, por hidrólisis o por lipasas y estos ácidos grasos libres o ásteres de ácidos grasos son entonces mezclados con una solución etanólica de urea para la formación del complejo. Los ácidos grasos saturados y monoinsaturados complejan fácilmente con urea y se separan por cristalización por enfriamiento y subsecuentemente pueden ser removidos por filtración. La fracción complejada sin urea es de ese modo enriquecida con LC-PUFA.
Hidrogenación La hidrogenación de ácidos grasos involucra el tratamiento con hidrógeno, típicamente en la presencia de un catalizador. La hidrogenación no catalítica tiene lugar solamente a muy altas temperaturas.
La hidrogenación se usa comúnmente en el procesamiento de aceites vegetales. La hidrogenación convierte ácidos grasos insaturados a ácidos grasos saturados, y en algunos casos, en grasas trans. La hidrogenación da como resultado la conversión de aceites vegetales líquidos a grasas sólidas o semi-sólidas, tal como aquellas presentes en la margarina. Cambiar el grado de saturación de la grasa cambia algunas propiedades físicas importantes tal como en intervalo de fusión, lo cual es porque aceites líquidos se vuelven semi-sólidos. Se prefieren grasas sólidas o semi-sólidas para hornear porque la manera como la grasa se mezcla con la harina produce una textura más deseable en el producto horneado. Porque aceites vegetales parcialmente hidrogenados son más baratos que grasas de origen animal, están disponibles en una amplio intervalo de consistencias, y tienen otras características deseables (por ejemplo, estabilidad oxidativa creciente/vida de anaquel más larga), son las grasas predominantes usadas como mantecas en la mayoría de artículos horneados comerciales.
En una modalidad, el lípido/aceite de la invención no ha sido hidrogenado. Un indicio de que el lípido o aceite no ha sido hidrogenado es la ausencia de cualquier ácido graso trans en su TAG.
Usos de Lípidos Los lípidos tales como el aceite de semillas, preferiblemente el aceite de semilla de cártamo, producido por los métodos descritos en la presente tienen una variedad de usos. En algunas modalidades, los lipidos son usados como aceites comestibles. En otras modalidades, los lipidos son refinados y usados como lubricantes o para otros usos industriales tal como la síntesis de plásticos. Se pueden usar en la fabricación de cosméticos, jabones, suavizantes de telas, aislamiento eléctrico o detergentes. Se pueden usar para producir productos químicos agrícolas tales como tensoactivos o emulsificantes. En algunas modalidades, los lipidos son refinados para producir biodiesel. El aceite de la invención puede ser usado ventajosamente en pinturas y barnices ya que la ausencia de ácido linolénico significa que no se decolora fácilmente.
Un producto industrial producido usando un método de la invención puede ser un producto hidrocarbonado tal como ésteres metílicos de ácidos grasos y/o unos ásteres etílicos de ácidos grasos, un alcano tal como metano, etano o alcano de cadena más larga, una mezcla de alcanos de cadena más larga, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o hidrógeno gas, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbono, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbono. El producto industrial puede ser una mezcla de cualquiera de estos componentes, tal como una mezcla de alcanos, o alcanos y alquenos, preferiblemente una mezcla que sea predominantemente (>50%) alcanos C4-C8, o predominantemente alcanos de C6 a CIO, o predominantemente alcanos de C6 a C8. El producto industrial no es dióxido de carbono y no agua, aunque estas moléculas pueden ser producidas en combinación con el producto industrial. El producto industrial puede ser un gas a temperatura ambiente/presión atmosférica, o preferiblemente, un liquido, o un sólido tal como biocarbono, o el proceso puede producir una combinación de un componente gas, un componente liquido y un componente sólido tal como monóxido de carbono, gas hidrógeno, alcanos y biocarbono, los cuales se pueden separar subsecuentemente. En una modalidad, el producto hidrocarburo es predominantemente ésteres metílicos de ácidos grasos. En una modalidad alternativa, el producto hidrocarburo es un producto diferente a ésteres metílicos de ácidos grasos.
Se puede aplicar calor en el proceso, tal como por pirólisis, combustión, gasificación, o junto con digestión enzimática (incluyendo digestión aeróbica, compostaje, fermentación). La gasificación a temperaturas más bajas tiene lugar a, por ejemplo, entre aproximadamente 700°C a aproximadamente 1000°C. La gasificación a temperatura más alta tiene lugar a, por ejemplo, entre aproximadamente 1200°C a aproximadamente 1600°C. La pirólisis a temperatura más baja (pirólisis inferior), tiene lugar a aproximadamente 400°C, mientras que pirólisis a temperatura más alta tiene lugar a aproximadamente 500°C. La digestión mesofilica tiene lugar entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 40°C. La digestión termofílica tiene lugar desde aproximadamente 50°C a aproximadamente 65°C.
Los medios químicos incluyen, pero no se limitan a, craqueo catalítico, digestión anaeróbica, fermentación, compostaje y trans-esterificación. En una modalidad, un medio químico usa un catalizador o mezcla de catalizadores, los cuales se pueden aplicar junto con calor. El proceso puede usar un catalizador homogéneo, un catalizador heterogéneo y/o un catalizador enzimático. En una modalidad, el catalizador es un catalizador de metal de transición, un catalizador del tipo tamiz molecular, un catalizador de alúmina activada o carbonato de sodio como un catalizador. El catalizador incluye catalizador ácido tal como ácido sulfúrico, o catalizador alcalino tal como hidróxido de sodio o potasio u otros hidróxidos. Los medios químicos pueden comprender trans-esterificación de ácidos grasos en el lípido, dicho proceso puede usar un catalizador homogéneo, un catalizador heterogéneo y/o un catalizador enzimático. La conversión puede comprender pirólisis, la cual aplica calor y puede aplicar medios químicos, y puede usar un catalizador de metal de transición, un catalizador del tipo tamiz molecular, un catalizador de alúmina activada y/o carbonato de sodio como un catalizador.
Los medios enzimáticos incluyen, pero no se limitan a, digestión por microorganismo en, por ejemplo, digestión anaeróbica, fermentación o compostaje, o por proteínas enzimáticas recombinantes.
Biocombus tibie Como se usa en la presente el término "bioco bustible" incluye biodiesel y bioalcohol. El biodiesel puede elaborarse a partir de aceites derivados de plantas, algas y hongos. El bioalcohol es producido a partir de la fermentación del azúcar. Este azúcar puede ser extraída directamente de plantas, (por ejemplo, caña de azúcar), derivado del almidón vegetal (por ejemplo, maíz o trigo) o elaborado a partir de celulosa (por ejemplo, madera, hojas o tallos).
Normalmente cuesta más producir biocombustibles que combustibles de petróleo. Además, délos costos de procesamiento, el cultivo de biocombustibles requiere plantar, fertilizar, aplicaciones de pesticidas y herbicidas, cosechar y transportar. Plantas, algas y hongos de la presente invención pueden reducir los costos de producción de biocombustibles.
Métodos generales, para la producción de biocombustible pueden encontrarse en, por ejemplo, Maher y Bressler (2006), aher y Bressler (2007), Karmakar y colaboradores (2010), Alonso y colaboradores (2010), Lee y Mohamed (2010), Liu y colaboradores (2010), Gong y Jiang (2011), Endalew y colaboradores (2011) y Semwal y colaboradores (2011).
Biodiesel La producción de biodiesel, o ásteres alguílicos, es bien conocida. Existen tres rutas básicas para la producción de áster a partir de lipidos: l)Trans-esterificación del lipido con alcohol, catalizada por base; 2) esterificación del lipido con metanol, catalizada por ácido directo; y 3)Conversión del lipido a ácidos grasos, y luego a ásteres de alquilo con catálisis ácida.
Se puede usar cualquier método para preparar ásteres de alquilo de ácidos grasos y éteres de glicerol (en el cual uno, dos o tres de los grupos hidroxi sobre glicerol son esterificados). Por ejemplo, 'se pueden preparar ácidos grasos, por ejemplo, hidrolizando o samponificando triglicéridos con catalizadores ácidos o bases, respectivamente, o usando una enzima tal como una lipasa o una estearasa. Se pueden preparar ásteres alquilicos de ácidos grasos haciendo reaccionar un ácido graso con un alcohol en la presencia de un catalizador ácido. También se pueden prepara ásteres alquilicos de ácidos grasos haciendo reaccionar un triglicérido con un alcohol en la presencia de un catalizador ácido o base. Se pueden preparar los éteres de glicerol, por ejemplo, haciendo reaccionar glicerol con un haluro de alquilo en la presencia de base, o con una olefina o alcohol en la presencia de un catalizador ácido.
En algunas modalidades preferidas, los lipidos son trans-esterificados para producir ésteres metílicos y glicerol. En algunas modalidades preferidas, los lipidos son hechos reaccionar con un alcohol (tal como metanol o etanol) en la presencia de un catalizador (por ejemplo, hidróxido de sodio o potasio) para producir ésteres de alquilo. Los ésteres de alquilo se pueden usar para biodiesel o mezclado con combustibles basados en petróleo.
Los ésteres de alquilo pueden ser mezclados directamente con combustible diésel, o lavados con agua u otras soluciones acuosas para remover varias impurezas, incluyendo el catalizador, antes de mezclar. Es posible neutralizar catalizadores ácidos con base. Sin embargo, este proceso produce sal. Para evitar corrosión al motor, es preferible minimizar la concentración de sal en la composición de aditivo de combustible. Las sales pueden ser removidas subsecuentemente de la composición, por ejemplo, lavando la composición con agua.
En otra modalidad, la composición es secada después de ser lavada, por ejemplo, pasando la composición a través de un agente secante tal como sulfato de calcio.
En aún otra modalidad, se obtiene un aditivo para combustible neutro sin producir sales o usando una etapa de lavado, usando un ácido polimérico, tal como Dowex 50™, el cual es una resina que contiene grupos ácido sulfónico. El catalizador es fácilmente removido por filtración después de las reacciones de esterificación y eterificación sean completas.
Triacilgliceroles vegetales como una fuente de biocombus tibie El uso de triacilgliceroles vegetales para la producción de bioco bustible es revisado en Durrett y colaboradores (2008). Resumiendo, aceites vegetales se componen primariamente de varios triacilgliceroles (TAGs), moléculas que consisten de tres cadenas de ácidos grasos (usualmente 18 o 16 carbonos de largo) esterificadas a glicerol. Las cadenas acilo grasas son químicamente similares a los hidrocarburos alifáticos que representan la mayor parte de las moléculas encontradas en petróleo y diésel. Los hidrocarburos en petróleo contienen entre 5 y 12 átomos de carbono por molécula, y este combustible volátil es mezclado con aire y encendido con una chispa en un motor convencional. En contraste, componentes de combustible diésel típicamente tiene 10 a 15 átomos de carbono por molécula y son encendidos por la muy alta compresión obtenida en un motor diésel. Sin embargo, la mayoría de los TAGs vegetales tienen un intervalo de viscosidad que es mucho mas alto que el del diésel convencional: 17.3 a 32.9 mm2s1 en comparación con 1.9 a 4.12S_1, respectivamente (ASTM D975; Knothe y Steidlcy, 2005). Esta viscosidad más alta da como resultado escasa atomización de combustible en motores diésel modernos, que provoca problemas derivados de combustión incompleta tal como depósitos de carbono y coquización (Ryan y colaboradores y colaboradores, 1984). Para superar este problema, TAGs son convertidos a ésteres de ácidos grasos menos viscosos por esterificación con un alcohol primario, más comúnmente metanol. Este combustible resultante es comúnmente mencionado como biodiesel y tiene un intervalo de viscosidad dinámica desde 1.9 a 6.0 mm2s1 (ASTM D6751).Los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs, Fatty Acid Methyl Esters) encontrados en biodiesel tienen una alta densidad energética que se refleja por su alto calor de combustión, el cual es similar, si no mayor, que el del diésel convencional (Knothe, 2005). Similarmente, el número de cetano (una medida de la calidad de encendido de diésel) de las FAMEs encontrados en biodiesel excede el del diésel convencional (Knothe, 2005).
Los aceites vegetales se componen mayormente de cinco ácidos grasos comunes, es decir palmitato (16:0), estearato (18:0), oleato (18:1), linoleato (18:2), y linoleato (18:3), aunque, dependiendo de la especie particular, ácidos grasos más cortos o más largos también pueden ser constituyentes importantes. Estos ácidos grasos difieren uno de otro en términos de longitud de cadena acilo y número de dobles enlaces, conduciendo a diferentes propiedades físicas. Consecuentemente, las propiedades del combustible de biodiésel derivado de una mezcla de ácidos grasos son dependientes de la composición. Alterar el perfil de ácidos grasos puede, por consiguiente, mejorar las propiedades combustibles del biodiesel tal como características de flujo a temperatura fría, estabilidad oxidativa y emisiones de NOx. Alterar la composición de ácidos grasos de TAGs puede reducir la viscosidad de los aceites vegetales, eliminando la necesidad para modificación química, mejorando así el costo-efectividad de biocombustibles.
Productos comestibles El lipido/aceite de la invención tiene ventajas en aplicaciones alimenticias a causa de su muy alto contenido de ácido oleico y los bajos niveles de ácido linoleico (<3.2%) y ácidos grasos saturados como ácido palmítico, y el nivel esencialmente de cero de ácido linolénico. Estos dotan al aceite con una alta estabilidad oxidativa, produciendo menos rancidez y haciéndolo ideal para aplicaciones alimenticias donde se requiere calor, tal como en aplicaciones de frituras, por ejemplo, friuras a la Francesa. El aceite tiene un OSI (Oxidative Stability Index) alto, el cual es medido como la duración del tiempo que un aceite puede ser mantenido a 110°C, tal como mayor que 20 o 25 horas, preferiblemente mayor que 30 horas o mayor que 50 horas. Los niveles bajos de ácidos grasos saturados en relación con otros aceites vegetales proporcionan beneficios para la salud ya que los ácidos grasos saturados se han asociado con efectos nocivos sobre la salud. Los aceites también tienen contenido de ácidos grasos trans esencialmente de cero, lo cual es deseable en algunos marcadores ya que ácidos grasos trans han sido también asociados con efectos negativos sobre la salud del corazón o la elevación de colesterol LDL. Además, debido a su muy bajo nivel de ácidos grasos poli-insaturados, el aceite no requiere hidrogenación a los niveles más bajos de PUFA - dicha hidrogenación produce ácidos grasos trans. Los aceites son también veniajosos para reducir la incidencia o severidad de la obesidad y de la diabetes- Son también deseables para aplicaciones alimenticias porque contienen solamente "ácidos grasos como se encuentran de manera natural (Searth y Tang, 2006).
Para propósitos de la presente invención, "producto alimenticio" incluye cualquier preparación o alimento para consumo animal o humano (incluyendo para consumo enteral o parenteral) el cual cuando se capta en el cuerpo: (1) sirve para nutrir o construir tejidos o suministrar energía, y/o (2) mantener, restaurar o apoyar el estado nutricional o función metabólica adecuados. Productos alimenticios incluyen composiciones nutricionales para bebés y/o niños jóvenes.
Los productos alimenticios de la invención comprenden por ejemplo, una célula de la invención, una planta de la invención, el producto de un método de la invención, o una composición junto con un(os) portador(es) adecuado (s). El término "portador" es usado en su sentido más amplio para abarcar cualquier componente que pueda tener o no valor nutricional. Como apreciará un experto en el arte, el portador puede ser adecuado para uso ( o usado en una concentración suficientemente baja) en un producto comestible, de modo que no tenga efecto perjudicial sobre un organismo que lo consuma.
El producto comestible de la presente invención comprende un lípido producido directa o indirectamente mediante el uso de métodos, células u organismos descritos en la presente. La composición puede estar ya sea en forma líquida o sólida. Adicionalmente, la composición puede incluir macronutrientes, vitaminas, y/o minerales comestibles en n deseadas para un uso particular. Las cantidades de éstos u otros ingredientes variará dependiendo de si la composición está prevista para uso con individuos normales o para uso con individuos que tengan necesidades especiales tales como individuos que sufren de trastornos metabólicos y los similares.
Los alimentos pueden ser producidos mezclando el aceite con uno o más ingredientes de modo que el alimento comprenda el aceite, o mezclado con uno o más ingredientes diferentes para elaborar un aditivo alimenticio tal como aderezos para ensaladas o mayonesas. El alimento o aditivo para alimentos puede comprender 1% a 10% en peso o más del aceite. El aceite puede ser mezclado con otros aceites vegetales para proporcionar composición óptima o con grasas sólidas o con aceite de palma para proporcionar grasas semi-sólidas. Los alimentos o aditivos alimenticios producidos a partir del aceite incluyen aderezos para ensaladas, mayonesa, margarina, pan, pasteles, bisquets, (galletas), cuernos, productos horneados, pancakes o mezclas de pancakes, costras, postres congelados, alimentos no lácteos.
Ejemplos de portadores deseados con valor nutricional incluyen, pero no se limitan a, macronutrientes tal como grasas comestibles, carbohidratos y proteínas.
Ejemplos de dichas grasas comestibles incluyen, pero no se limitan a, aceite de coco, aceite de aceite de hongos, aceite corriente negro, aceite de soya, y mono- y di-glicéridos. Ejemplos de dichos carbohidratos incluyen, pero no se limitan a, glucosa, lactosa comestible, y almidón hidrolizado. Adicionalmente, ejemplos de proteínas que pueden ser utilizadas en la composición nutricional de la invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas de soya, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, o los hidrolizados de estas proteínas.
Con respecto a vitaminas y minerales, los siguientes pueden ser añadidos a las composiciones de productos alimenticios de la presente invención, calcio, fósforo, potasio, sodio, cloruro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, iodo, y vitaminas A, E, D, C, y el complejo B. También se pueden añadir otras vitaminas y minerales.
Los componentes utilizados en las composiciones de productos comestibles de la presente invención pueden ser de origen purificado o semi-purificado. Por purificado o semi-purificado se quiere decir un material que ha sido preparado por purificación de un material natural.
Una composición de producto comestible de la presente invención también se puede añadir a los alimentos aún cuando no se requiera suplemento dietético. Por ejemplo, la composición puede se añadida al alimento de cualquier tipo, incluyendo, pero no limitándose a, margarina, mantequilla modificada, quesos, leche, yogurt, chocolate, dulces, bocadillos, aceites para ensaladas, acates de codina, grasas para cocina, carnes, pescados y bebidas.
Adicionalmente, también se pueden usar lipidos producidos de conformidad con la presente invención o células huéspedes transformadas para contener y expresar a los genes objetivo como suplementos para la alimentación animal para alterar un tejido de animal o composición de ácidos grasos de leche o composición de ácidos grasos de huevos, para uno o más consumos animal o humano deseables, o para el bienestar y salud animal. Ejemplos de dichos animales incluyen ovejas, vacas, caballos, aves de corral, mascotas como perros y gatos y los similares.
Además, productos comestibles de la invención pueden ser usados en acuacultura para incrementar los niveles de ácidos grasos en peces para consumo humano o animal.
Productos comestible preferidos de la invención son las plantas, semillas y otras partes vegetales como hojas, frutos y tallos que pueden ser usados directamente como alimento o alimentación para humanos u otros animales. Por ejemplo, los animales pueden pastar directamente sobre dichos cultivos vegetales en el ampo, o ser alimentados con más cantidades medidas en alimentación controlada.
Composiciones La presente invención también abarca composiciones, particularmente composiciones farmacéuticas, que comprenden uno o más lípidos o aceites producidos usando los métodos de la invención.
Una composición farmacéutica puede comprender uno o más de los lipidos, en combinación con un portador, adyuvante o vehículo estándar, bien conocido, no tóxico aceptable farmacéuticamente tal como solución salina amortiguada con fosfato, agua, etanol, polioles, aceites vegetales, un agente humectante o una emulsión tal como emulsión agua/aceite. La composición puede estar, ya sea en forma sólida o liquida. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de tableta, cápsula, liquido ingerible, polvo, ungüento o crema local. Se puede mantener la fluidez apropiada por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula en el caso de las dispersiones y por el uso de tensoactivos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio, y los similares.
Además de dichos diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes como agentes humectantes, emulsificantes y agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y agentes aromatizantes.
Además de los compuestos activos, las suspensiones pueden comprender agentes de suspensión tal como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y ásteres de sorbitan, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, y goma de tragacanto, o mezclas de estas sustancias.
Las formas de dosificación sólida como tabletas y cápsulas se pueden preparar usando téenicas bien conocidas en el arte. Por ejemplo, lípidos producidos de conformidad con la presente invención pueden ser tableteadas con bases para tabletas convencionales tales como lactosa, sacarosa, y almidón de maíz en combinación con aglutinantes como goma de acacia, almidón de maíz, o gelatina, agentes des integrantes como almidón de papa o ácido algínico, y un lubricante como ácido esteárico o estearato de magnesio. Se pueden preparar cápsulas incorporando estos excipientes en una cápsula de gelatina junto con antioxidantes y los lípidos relevantes.
Para administración intravenosa, los lípidos producidos de conformidad con la presente invención o derivados de éstos pueden ser incorporados en formulaciones comerciales.
Una dosificación típica de un ácido graso particular es desde 0.1 mg a 20 mg, tomados de una a cinco veces al dia (hasta 100 g diariamente) y está preferiblemente en el intervalo desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1, 2, 5, o 10 g diariamente (tomados en una o múltiples dosis). Como se sabe en el arte, es deseable un mínimo de aproximadamente 300 mg/día de ácidos grasos. Sin embargo, se apreciará que cualquier cantidad de ácidos grasos será benéfica para el sujeto.
Las rutas de administración posibles de las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen por ejemplo, enteral y parenteral. Por ejemplo, una preparación líquida puede ser administrada oralmente. Adicionalmente, una mezcla homogénea puede ser dispersa completamente en agua, mezclada por adición bajo condiciones estériles con diluyentes, conservadores, amortiguadores o propelentes aceptables fisiológicamente, para formar un rocío o inhalante.
La dosificación de la composición a ser administrada al sujeto puede ser determinada por un experto en el arte y depende de varios factores como peso, edad, salud general, historia pasada, estado inmunológico, etc., del sujeto.
Adicionalmente, la composición de la presente invención puede ser utilizada para propósitos cosméticos. Las composiciones pueden ser añadidas a composiciones cosméticas pre-existentes, de modo que se forme una mezcla, o un ácido graso producido de conformidad con la invención puede ser usada como el único ingrediente "activo" en una composición cosmética.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Materiales y Métodos Generales Materiales Vegetales y Condiciones de Cultivo Los genotipos SU, S-317, S-517, LeSaf496, CW99-OL, y Ciano-OL de plantas de cártamo ( Carthamus tinctorius) fueron cultivadas a partir de semillas en el invernadero en una mezcla para macetas arenosa limosa y perlita bajo un ciclo de dia/noche de 16 horas (26°C)/8 horas (22°C). La variedad SU de tipo salvaje, la cual es una variedad alta en linoleico, se obtuvo de Hefferman Seeds en NSW. Semillas de PI 603208 (LeSaf496, ATC 120562) y CW 99-OL (ATC 120561) fueron obtenidas del Australian Températe Field Crops Collection.
Los tejidos vegetales para extracción de ADN y ARN que incluyen hojas raíces, cotiledones e hipocotiledones fueron cosechados a partir de plántulas de cártamo de 10 días post-germinación. Se obtuvieron inflorescencias en el primer dia de abertura de la flor y los embriones desarrollados fueron cosechados en tres etapas de desarrollo a 7 (temprana), 15 (media)y 20 (tardía) días post antesis (DPA).
Las muestras fueron inmediatamente congeladas en nitrógeno liquido y almacenada a -80°C hasta que se lleve a cabo la extracción de ADN y ARN.
Los ramitos de cártamo son tubulares y ampliamente auto-polinizados generalmente, con menos de 10% de cruzamiento exogámico (Knowles 1969). Insectos, pero no el viento, pueden incrementar los niveles de cruzamiento exogámico en el campo. El estigma no polinizado puede permanecer receptivo durante varios dias. Cada capitel (cabeza de cártamo) contiene aproximadamente 15 a 30 aquenios. La masa de la semilla de la semilla en desarrollo en la planta incrementa rápidamente durante los primeros 15 dias después de floración. El contenido oleoso incrementa 5-a 10- veces durante el periodo de 10 a 15 DAP y alcanza un nivel máximo a aproximadamente 28 DPA (Hill y Knowles 1968).
Las plantas y semillas de cártamo son fisiológicamente maduros aproximadamente 5 semanas después de floración y la semilla lista para cosechar cuando la mayoría de las hojas se han vuelto cafés y solamente un tinte de verde permanece sobre las brácteas de las últimas infloraciones. Las semillas fueron cosechadas fácilmente frotando las cabezas con la mano.
Análisis de Lípidos Aislamiento de muestras de lípidos procedentes de semillas individuales para análisis rápido de la composición de ácidos grasos Después de ser cosechadas en la madurez de la planta, semillas de cártamo fueron secadas almacenando las semillas durante 3 días a 37°C y subsecuentemente a temperatura ambiente si no es analizada inmediatamente. Semillas individuales o semillas conjuntadas fueron trituradas entre pequeños papeles filtros y las muestras de aceite de las semillas exudadas que humedecieron en los papeles se analizaron para composición de ácidos grasos mediante métodos de GC que se describen posteriormente.
Aislamiento de lipidos totales de mi tades de cotiledones post-germinación Para propósitos de cribado, por ejemplo, para semillas descendientes de plantas transgénicas, las semillas de cártamo fueron germinadas sobre un papel filtro húmedo en una placa de Petri durante 1 día. Un cotiledón fue cuidadosamente retirado de cada una de las semillas germinadas para análisis de lipidos. Lo restante de cada plántula fue transferido al suelo y las plantas resultantes fueron cultivadas hasta madurez seguido por cosecha de semillas para mantener la línea transgénica.
Extracción del aceite de semillas usando el equipo Soxhlet Para extracción cuantitativa de aceite de las semillas, las semillas de cártamo cosechadas fueron secadas en un horno a 105°C toda la noche y luego se trituraron en un Molino Puck Mili durante 1 minuto. El material de la semilla triturada (~ 250 gramos) fue colectado en un cartucho de extracción prepesado y pesado antes de extracción del aceite. Después de añadir una capa de lana-algodón en la parte superior de la harina, se extrajo el aceite en un equipo de Extracción Soxhlet con solvente (Petroleum Spirit 40-60° C), inicialmente a 70 a 80°C. La mezcla se reflujo entonces toda la noche con el solvente sifoneando en el matraz de extracción cada 15 a 20 minutos. El aceite extraído, disuelto fue recuperado separando el solvente por evaporación usando un evaporador rotatorio al vacío. Se midió el peso del aceite extraído y se determinó el contenido de aceite. Para determinar la composición de ácidos grasos del aceite extraído, se diluyeron pequeñas alícuotas en cloroformo y se analizaron por cromatografía de gases.
Aislamiento de lípidos totales a partir del material de las hojas Se secaron por congelamiento muestras de tejido de hojas, se pesaron y se extrajeron los lípidos totales de las muestras de aproximadamente 10 g de peso seco como se describe en Bligh y Dyer (1959).
Fraccionamiento de lípidos Cuando se requirió, las fracciones de TAG fueron separadas de otros componentes lipidíeos usando un sistema de cromatografía en capa fina (TLC) de fase 2 sobre placas de gel de sílice pre-recubiertas (gel de sílice 60, Merck). Una muestra de lípido extraída equivalente a 10 mg de peso seco de tejido de hojas se cromatografió en una primera fase con hexano/éter dietílico (98/2 en volumen) para remover ceras no polares y luego en una segunda fase usando hexano/éter dietílico/ácido acético (70/30/1 en volumen). Cuando se requirió, los lípidos polares fueron separados de lípidos no polares en muestras de lípidos extraídas de un equivalente de 5 mg de peso seco de hojas usando TLC bi-dimensional (gel de sílice 60, Merck), usando cloroformo/metanol/agua (65/25/4 en volumen) para la primera dirección y cloroformo/metanol/NH4OH/etilpropilamina (130/70/10/1 en volumen) para la segunda dirección. Las manchas de lípido, y estándares apropiados corridos en las mismas placas de TLC, fueron visualizadas por breve exposición a vapor de iodo, colectadas en frasquitos y transmetiladas para producir FAME para análisis por GC como sigue.
Preparación de ásteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y análisis por cromatografía de gases (GC) Para análisis de la composición de ácidos grasos por GC, muestras de lípidos extraídos, preparados como se describió anteriormente fueron transferidas a un tubo de vidrio y se transmetilaron en 2 mL de HCl 1M en metanol (Supelco) a 80°C durante 3 horas. Despues de enfriamiento a temperatura ambiente, 1.3 mL de NaCl al 0.9% y 800 mL de hexano fueron añadidos a cada tubo y se extrajeron los FAMEs en la fase hexano. Para determinar la composición de ácidos grasos, los FAMEs fueron separados por cromatografía de gases (GC) usando un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 7890a (Palo Alto, California, USA) equipado con una columna BPX70 de 30-m esencialmente como se describe en Zhou y colaboradores (2011) excepto que el programa de variación gradual de temperatura fue cambiado a temperatura inicial a 150°C, reteniendo durante 1 min, la variación gradual fue de 3°C/ in a 210°C, luego 50°C/min a 240°C para una retención final de 2 min. Los picos fueron cuantificados con el "software" Agilent Technologies ChemStation (Rev B.03.01 (317), Palo Alto, California, USA). Los picos de respuesta fueron similares para los ácidos grasos del estándar 411 de Nu-Check GLC auténtico (Un-Check Prep Inc. MN, USA) el cual contuvo igual proporción de 31 ásteres metílicos de ácidos grasos diferentes, incluyendo 18:1, 18:0, 20:0 y 22:0 se usó para calibración. La proporción de cada ácido graso en las muestras fue calculada con base en las áreas individuales y la total de los picos para los ácidos grasos.
Análisis de FAMEs por cromatografía de gases espectrometría de masa La confirmación de las posiciones de los dobles enlaces en el FAME mediante la modificación de 2, 4-dimetiloxazolina (DMOX) y análisis por GC-MS se llevó a cabo como se describió previamente (Zhou y colaboradores, 2011), excepto con un Shimadzu GC-MS QP2010 Plus equipado con una columna BPX70 de 30-m. La temperatura de la columna fue programada para una temperatura inicial a 150°C durante 1 min, variando gradualmente a 5°C/min a 200°C luego 10°C/min a 240°C con retención durante 5 min. Se adquirieron los espectros de masa y se procesaron con el "software" solución GCMS (Shimadzu, Versión 2.61). Los ácidos grasos libres y los estándares de FAME fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Análisis de especies lipidícas por LC-MS Las semillas individuales de individuos maduros fueron sometidas a análisis lipidómico usando LC-MS en la School of Botany, University of Melbourne. Se extrajeron los lipidos totales como describió Bligh y Dyer (1959) y se disolvieron en CHCI3. Las alícuotas de 1 mg de lípido fueron secadas con N2, disueltas en 1 mL de 10 mM de hidroxitolueno butilado (1:1 en volumen), y se analizaron usando Agilent 1200 LC y ionización por electroaspersión 6410B de triple cuadrupolo LC-MS. Los lipidos fueron separados cromatográficamente usando un columna Ascentis Express RO Amida (5 cm x 2.1 mm, Supelco) y un gradiente binario con un gasto de 0.2 mL/min. Las fases móviles fueron: A, 10 mM de formiato de amonio en H2O:metanol:tatrahidrofurano (50:20:30, en volumen); B, 10 mM de formiato de amonio en H20:metanol:tetrahidrofurano (5:20:75, en volumen). Los lipidos neutros seleccionados (TAG y DAG) y fosfocolina (PC) con ácidos grasos 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3 fueron analizados monitoreando la reacción múltiple (MRN, Múltiple Reaction Monitoring) usando una energía de colisión de 25 V y fragmentador de 135 V. Se identificaron TAGs y DAGs por MRM individuales con base en el ión precursor amoniado y el ión producto de la pérdida neutra de ácidos grasos. Los TAGs y DAGs fueron cuantificados usando 10 mM del estándar externo de triestearina.
Análisis del contenido de esterol de muestras de aceites Se saponificaron muestras de aproximadamente 10 mg de aceite junto con una alícuota a la que se añadió C24:0 monol como un estándar interno, usando 4 mL de KOH al 5% en MeOH al 80% y se calentaron durante 2 h a 80°C en un tubo de vidrio cubierto con gusano sin fin revestido de teflón.
Después de que la mezcla de reacción enfrió, se añadieron 2 mL de agua Milli-Q y se extrajeron los esteróles en 2 mL de hexano:diclorometano (4:1 en volumen) por agitación y sometió a vórtice. La mezcla fue centrifugada y el extracto de esteróles fue removido y lavado con 2 mL de agua Milli-Q. El extracto de esterol fue entonces removido después de sacudida y centrifugación. El extracto fue evaporado usando una corriente de nitrógeno gas y los esteróles se sililaron usando 200 mL de BSTFA y se calentó durante 2 h a 80°C.
Para análisis por GC/GC-MS de los esteróles, derivados OTMSi de esterol fueron secados bajo una corriente de nitrógeno gas sobre un bloque térmico a 40°C y luego se redisolvieron en cloroformo o hexano inmediatamente antes e análisis por GC/GC-MS. Se analizaron los derivados OTMS de esterol por cromatografía de gases (GC) usando un Agiient Technologies 6890a GC (Palo Alto, California, USA) adaptado con una columna capilar (15 m x 0.1 mm i.d., espesor de película de 0.1 pm) de sílice fusionado Supelco Equity™-1, un FID, un inyector hendido/sin hendir y un auto-muestreador e inyector Agiient Technologies Serie 768B. El gas portador fue helio. Las muestras fueron inyectadas en modalidad sin hendidura a una temperatura de estufa de 120°C. Después de inyección, la temperatura de la estufa fue elevada a 270°C a 10°C/min y finalmente a 300°C a 5°C/min, Se cuantificaron los picos con el "software" Agilent Technologies ChemStation (Palo Alto, California, USA). Los resultados de GC a un error de ±5% de áreas de componentes individual.
Se efectuaron análisis espectrométricos de masa-GC (GC-MS) sobre un Finnigan Thermoquest GCQ GC-MS y un Finnigan Thermo Electron Corporation GC-MS; ambos sistemas fueron adaptados con un inyector sobre columna y el "software" Thermoquest Xcalibur (Austin, Texas, USA). Cada GC fue adaptado con una columna capilar de polaridad similar a la descrita anteriormente. Se identificaron los componentes individuales usando datos espectrales de masa y comparando los datos de tiempo de retención con los obtenidos para estándares de laboratorio y auténticos. Se efectuó un análisis del testigo del procedimiento total concurrentemente con el lote de muestra.
Cuantificación de TAG vía Iatroscan Se cargó un ml de cada extracto vegetal sobre un Chromarod-Sll para TLC-FID Iatroscan™ (Mitsubishi Chemical Medience Corporation, Japón). La rejilla de Chromarod se transfirió entonces en un tanque de desarrollos equilibrado que contenía 70 mi de un sistema solvente de Hexano/CHCl3/2-Propanol/Ácido fórmico (85/10.716/0.567/0.0567 en volumen) Después de 30 min de incubación, la rejilla de Chromarod es entonces secada durante 3 min a 100°C e inmediatamente se exploró en un analizador por TLC-FID MK-6s para Iatroscan (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Japón). Las áreas bajo los picos de un estándar interno de DAGE y el TAG se integraron usando el "software de integración SIC-48011 (Versión: 7.0-E SIC System Instruments Co., LTD - Japón).
La cuantificación de TAG se llevó a cabo en dos etapas. Primero, el estándar interno de DAGE es escaneado en todas las muestras para corregir el rendimiento de extracción después de lo cual se seleccionaron muestras de TAG concentradas y se diluyeron. Después, la cantidad de TAG es cuantificada en muestras diluidas con una segunda exploración de acuerdo con la calibración externo usando trilinoleato de glicerilo como estándar externo (Sigma-Aldrich).
Expresión de genes FAD2 candidatos en Sacharomyces cerevisiae Los fragmentos de ADN que contienen los marcos de lectura abiertos enteros de ADNs de FAD2 candidatos fueron excisados a partir del vector fácil pGEMT como fragmentos EcoRI y se insertaron en el sitio correspondiente del vector pENTRll (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Los insertos fueron entonces clonados en el vector de expresión de destino pYES2-DEST52, para colocar los marcos de lectura abiertos bajo el control del promotor GAL1 para expresión genética inducible en células de levaduras, usando la teenología de recombinación Gateway® Cloning (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Las secuencias del gen en los plásmidos resultantes fueron verificadas por secuenciación del ADN. Los plásmidos resultantes y el vector pYES2-DEST52 que carece de cualquier inserto de ADNc como un control fueron introducidos en células de levaduras cepa YPH499 de Sacharomyces cerevisiae por transformación mediada por acetato de litio. La expresión de estos genes FAD2 candidatos en células de levaduras con o sin alimentación de sustrato de ácido graso exógeno fue esencialmente como se describió previamente en Zhou y colaboradores (2006). Cada experimento fue llevado a cabo por triplicado.
Expresión de Genes en Células Vegetales en un Sistema de Expresión Transitorio Los genes fueron expresados en células de hojas de Nicotiana benthamíana usando un sistema de expresión transitorio esencialmente como se describió en Voinnet y colaboradores (2003) y Wood y colaboradores, (2009). Un vector para expresión constitutiva de la proteina supresora de silenciamiento viral P19, bajo el control del promotor CaMV 35S, fue obtenido del laboratorio de Peter Waterhouse, CSIRO Plant Industry, Canberra, Australia. El vector binario quimérico 35S:P19 fue introducido en cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens. Todos los otros vectores binarios que contienen una región codificadora a ser expresada en las células vegetales de un promotor, a menudo el promotor 35S, fueron también introducidos en cepa AGL1 de A. turne faciens . Las células recombinantes fueron desarrolladas hasta fase estacionaria a 28°C en 5 mL de caldo LB suplementado con 50 mg/L de rifampicina y ya sea 50 mg/L de kanamicina u 80 mg/L de espectimicina de acuerdo con el gen marcador seleccionable sobre el vector binario. Las bacterias de cada cultivo fueron compactadas por centrifugación a 3000 x g durante 5 min a temperatura ambiente antes de ser resuspendidas en 1.0 mi de amortiguador de infiltración que contenía 5 mM de MES, pH de 5.7, 5 mM de MgSO4 y 100 mM de acetosiringona. Los cultivos celulares resuspendidos fueron entonces incubados a 28°C con agitación durante otras 3 horas. Se mezcló entonces una dilución de 10 veces de cada cultivo en amortiguador de infiltración con un volumen igual del cultivo de 35S:P19, diluido en la misma manera, y las mezclas infiltradas en el lado inferior de las hojas de N. benthamiana totalmente expandidas. Cultivos mezclados que comprenden genes a ser expresados incluyeron el constructo 35S:P19 en Agrobacterium a menos que se declare de otro modo. El control de las infiltraciones incluyó solamente el constructo 35S:P19 en Agroba cterium.
Las hojas fueron infiltradas con mezclas de células de Agrobacterium y las plantas fueron desarrolladas típicamente por unos cinco dias adicionales después de infiltración antes de que discos de las hojas fueran recuperadas para aislamiento de lípidos totales y análisis de ácidos grasos. Plantas de N. benthamiana fueron cultivadas en cabinas de cultivo bajo una constante de 24°C con un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 con una intensidad de luz de aproximadamente 200 lux usando iluminación fluorescente Osram 'Blanco Tenue' colocada directamente sobre las plantas. Típicamente, se usaron plantas de 6 semanas de edad para experimentos y hojas verdaderas que fueron casi totalmente expandidas fueron infiltradas. Todas las hojas no infiltradas fueron removidas post-infiltración para evitar el sombreado.
PCR (RT-qPCR) en Tiempo Real El análisis de expresión genética se efectuó por RT-PCR cuantitativa usando un sistema de detección de PCR en Tiempo Real BIORAD CFX96™ y iQRM SYBR® Green Supermix (BioRad, Hercules, CA, USA). Cebadores de 19 a 23 nucléotidos de extensión y que tiene una temperatura de fusión ™ de aproximadamente 65°C y fue diseñado para amplificaciones específicas de gen que daría como resultado productos de amplificación de aproximadamente 100 a 200 pb. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en placas de 96 pocilios. Todas las reacciones de RT-PCR se efectuaron por triplicado. La mezcla de reacción contuvo 1 x iQRM SYBR® Green Supermix (BioRad, Hercules, CA, USA), se usaron 5 gg de cebadores directo e inversos y 400 ng de ADNc y se usó a un volumen de 10 gL por pocilio. Las condiciones de cielaje térmico fueron 95°C durante 3 min, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 10 s, 60°C durante 30 a y 68°C durante 30 s. La especificidad de la amplificación por PCR fue monitoreada por análisis de la curva de fusión después de la etapa final de la PCR desde 60°C hasta 95°C a 0.1°C/seg. Adicionalmente, los productos de PCR también fueron verificados para pureza por electroforesis sobre gel de agarosa y se confirmó por secuenciación. Se usó el gen KASH expresado constitutivamente como una referencia endógena a niveles de expresión normalizados. Los datos fueron calibrados en relación al nivel de expresión del gen correspondiente siguiendo el método de 2- ct para cuantificación relativa (Schmittgen, 2008). Los datos fueron presentados como la media ± DS de tres reacciones efectuadas sobre placas de 96 pocilios independientes.
Aislamiento de ADN y Análisis por Tinción Southern El ADN genómico de plántulas de cártamo, fenotipo SU, fue aislado de hojas totalmente expandidas usando amortiguador de CTAB y siguiendo el método descrito por Paterson y colaboradores (1993). Se llevó a cabo la purificación adicional usando gradientes de CsCl como se describió previamente (Liu y colaboradores, 1999). Alícuotas de 10 mg de ADN genómico de cártamo fueron digeridas separadamente con ocho enzimas de restricción diferentes, es decir, Accl, BglII, BamHI , EcoRI , FcoRV, HindIII, Xbal y Xhol . ADN genómico digerido con cada una de las enzimas de restricción fue electroforisado a través de geles de agarosa al 1%. El gel fue impregnado en NaOH 0.5 M, NaCl 1.5 M durante 30 minutos y el ADN fue teñido sobre una membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham, UK). Los filtros fueron sondeados con el fragmento de ADN marcado con CtFAD2-6 de cártamo correspondiente a la región codificadora entera del gen CtFAD2-6 de cártamo como uno representativo se la familia del gen CtFAD2 a condiciones de hibridización de baja severidad. La hibridización se efectuó toda la noche a 65°C en una solución que contenía 6x SSPE, solución de Denhardt al 10%, SDS al 0.5% y 100 mg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Después de la hibridización y después de un breve lavado en 2x SSC/SDS al 0.1% a 50 °C, los filtros fueron lavados tres veces, durante 20 minutos cada vez, en 0.2 x SSC/SDS al 0.1% a 50°C antes de autoradiografía.
Transformación de Cártamo y Arabidopsis thaliana Se introdujeron vectores quiméricos que comprenden genes a ser usados para transformar Arabidopsis en la cepa AGL1 de A. turne faciens y células de cultivos de Agrobacterium, transformadas usadas para tratar plantas de A. thaliana (ecotipo Columbra) usando el método de inmersión floral para transformación (Clough y Bent, 1998). Se produjeron plantas de cártamo transformadas como se describe en Belide y colaboradores (2011) usando los cultivos Agrobacterianos transformados.
Ejemplo 2. Aislamiento de ADNcs de Cártamo, los cuales son Candidatos para Codificar a FAD2 Extracción de ARN total y síntesis de ADNc A fin de producir ADNc de cártamo, se aisló el ARN total de muestras de 100 mg de tejidos de cártamo congelados incluyendo embriones en desarrollo, hojas, raíces e hipocotiledones. Esto se hizo separadamente para cada tejido usando un equipo para ARN total RNeasy® Plant (Qiagen, Hilden, Alemania) de conformidad con el protocolo del proveedor. La concentración de ARN en la preparación se determinó con el espectrofotómetro ND1000 de NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia) y se ecualizaron las concentraciones de ARN ates de análisis. La calidad y cantidades relativas del ARN en cada preparación fueron visualizadas por electroforesis sobre gel de muestras a través de geles de agarosa al 1% (peso en volumen) que contienen formaldehido. Las preparaciones de ARN fueron tratadas con ADNasa libre de RQ1 ARNasa (Qiagen, Hilden, Alemania) para remover ADN genómico contaminante. Se sintetizó ADNc de primera hebra a partir de 400 ng de cada preparación de ARN libre de ADN usando el SuperScript III First-Strand Synthesis System (Qiagen, Hilden, Alemania) con el cebador oligo(dT)20r siguiendo las instrucciones del fabricante.
Aislamiento de ADNcs de FAD2 Expresado en Semilla Procedente de una Biblioteca de ADNc de Semilla en Desarrollo Inicialmente, los ADNcs de FAD2 de cártamo expresado en semilla fueron obtenidos por cribado de una biblioteca de ADNc derivada de embriones en desarrollo del genotipo "SU" de cártamo (niveles de ácido linoleico alto, de tipo salvaje). La construcción de la biblioteca comenzó con la extracción de ARN a partir de una mezcla de embriones inmaduros de diferentes etapas de desarrollo, los cuales fueron cosechados y triturados para pulverizar en nitrógeno liquido y se llevó a cabo la extracción del ARN usando Trizol siguiendo las instrucciones de fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Se aisló ARN que contenia olí(A), usando un equipo de purificación Qiagen ARNm (Qiagen, Hilden, Alemania).
El ADNc cebado con oligo(dT) de primera hebra fue sintetizado y convertido a ADN de doble hebra usando un equipo para síntesis de ADNc Stratagene, de conformidad con las instrucciones del fabricante (Stratagen, La Jolla, CA, USA) . El ADNc de extremo romo fue ligado con adaptadores coRI, fosforilado, y fraccionado de tamaño por filtración sobre gel en una columna Chroma spin+TE-400 (Clontech, CA, USA). Los ADNc recombinantes fueron propagados en la cepa de E. coli, XL-1 Azul MRF+ usando un equipo de clonación Stratagene Predigested Lambda ZAP H/EcoRI/CIAP.
Para identificar los clones FAD2, la biblioteca fue cribada usando un fragmento de ADN que corresponde a la región codificadora de FAD2 de Arabidopsis (No. de Acceso de GenBank L26296), siguiendo el protocolo descrito previamente (Liu y colaboradores, 1999), Las placas positivas fueron purificadas a través de dos rondas sucesivas de cribado y los flagémidos purificados que contienen ADNcs de FAD2 putativo fueron excisados como se indicó en el manual de instrucciones del Equipo para Síntesis de ADNc de Stratagene AZAPII. Los análisis de secuencia de las secuencias de FAD2 se hicieron mediante el programa Blast de NCBI (www.nebí,nlm.gov/BLAST/). Se predijo el marco de lectura abierto usando el VectorNTI. Se aislaron dos diferentes ADNcs de extensión total a partir de la biblioteca de ADNcs de semillas en desarrollo y se denominaron CtFAD2-l y CtFAD2-2, respectivamente.
Identificación de ESTs para genes FAD2 candidatos Para identificar ADNcs de FAD2 candidatos adicionales, se interrogó a la base de datos (EST, Expressed Sequence Tag) que indica las secuencias expresadas, de cártamo de Compositae Genome Project (CGP) (cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2.) usando el BLAST para ESTs que codificaron a los polipéptidos que tienen similaridad con FAD2 de A. thaliana (No. de Acceso a GeneBank L26296). Se identificaron al menos siete secuencias de ADNc de FAD2 distintas contiguas, entre las cuales dos contiguas mostraron secuencias idénticas con CtFAD2-l y CtFAD2-2 aisladas de la biblioteca de ADNc de semilla de cártamo. Además, se identificaron nueve ADNcs diferentes y se designaron como CtFAD2-3 hasta CtFAD2-ll, respectivamente.
RACE 3'- y 5' Se seleccionó el clon de EST de máxima longitud de cada uno de los 9 contiguos (CtFAD2-3 hasta CtFAD2-ll) como el punto inicial para el aislamiento de las secuencias de ADNc de extensión total correspondientes. El proceso usó la Amplificación Rápida en 3' y 5' de Extremos de ADNc (RACE, Rapid Amplification of cDNA Ends), usando ADNc producidos a partir de ARNs obtenidos de varios tejidos de cártamo incluyendo embriones en desarrollo, hojas, raíces, hipocotiledones y flores. Se diseñaron cebadores específicos del gen (GSP, Gene Specific Primers) a partir del clon más largo de EST de cada contiguo. Se efectuó 3'-RACE, usando el equipo RT-PCR de una etapa siguiendo las instrucciones del fabricante (Bioline, Londres, UK). Se usó un cebador especifico del gen (GSP) en una primera ronda de amplificación por PCR para cada uno de los ESTs seleccionados en combinación con un cebador poli(dT) con un sitio Notl en su extremo 3'. Se efectuó una segunda ronda de PCR sobre el producto de la primera ronda usando un GSP agrupado en combinación con el cebador poli(dT). Los GSPs para 3'-RACE se enlistan en la Tabla 2.
Se efectuó la clonación del extremo 5' del ADNc de CtFAD2-6 con el equipo 5'-RACE System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Solamente el ARN de CtFAD2-6 fue transcrito en sentido contrario a ADNc usando un cebador especifico del gen (GSPl, 5'-ACCTAACGACAGTCATGAACAAG-3' (SEC ID NO: 76). Un cebador especifico del gen GSP2, 5'-GTGAGGAAAGCGGAGTGGACAAC- 3' (SEC ID NO: 77) se usó en la primera amplificación por PCR. Las condiciones de reacción usaron un calor inicial de 95°C durante 4 minutos antes de añadir la polimerasa, 33 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 45 seg, recocido a 55°C durante 1 min y extensión a 72°C durante 2 in.
Los fragmentos 3' y 5' amplificados fueron subclonados en el vector pGEM-Teasy y se secuenciaron desde ambas direcciones. Las comparaciones de las secuencias de los extremos 3' y 5' de los fragmentos clonados con los ESTs correspondientes mostraron regiones traslapadas que emparejaron entre si, proporcionando asi las secuencias 3' y 5' para cada gen y permitiendo el montaje de una secuencia de extensión total putativa para cada uno de los 11 ADNcs.
Aislamiento de Secuencias de ADNc de Extensión Total para los Genes de CtFAD2 Candidatos Para aislar las regiones codificadoras de la proteina de extensión total para los nueve genes de CtFAD2 , los ORFs fueron amplificados usando el equipo para RT-PCR en una etapa usando ADNs total derivados de varios tejidos de cártamo incluyendo embriones en desarrollo, hojas, raíces, hipocotiledones y flores (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Los cebadores (Tabla 3) usados para amplificar los ORFs se basaron en las secuencias de ADN localizadas en los 5' y 3' UTR de cada ADNc. Los productos de PCR amplificados fueron clonados en el vector pGEM-Teasy®, y se obtuvo su secuencia de nucleótidos mediante secuenciación del ADN.
Características de las Secuencias del FAD2 Candidato de Cártamo Las características de los 11 ADNcs se resumen en la Tabla 4 y de los polipéptidos en la Tabla 5.
Las secuencias de aminoácidos predichas de los polipéptidos CtFAD2-1 a CtFAD2-ll codificados compartieron identidad extensiva de secuencia, desde aproximadamente 44% a 86% de identidad entre si. Mostraron 53% a 62% de identidad de secuencia con FAD2 de Arabidopsís . Los tamaños de los polipéptidos predichos estuvieron en el intervalo desde 372 hasta 388 aminoácidos, esto es, fueron todos aproximadamente 380aa residuos de extensión. Los ADNcs tuvieron secuencias de regiones únicas 5' y 3' sin trasladar (UTR, Unique unTranslated Región), por consiguiente los genes endógenos pudieron ser reconocidos fácilmente por sus secuencias UTR. La amplificación de las regiones codificadoras de la proteina del ADN genómico de cártamo dio como resultado secuencias de ADN idénticas con el ADNc correspondiente para cada uno de los 11 genes, indicando que no hubo intrones que interrumpirán sus regiones codificadoras de proteina.
Tabla 2. Cebadores oligonucleótidos usados en el 3 'RACE de múltiples genes FAD2 en cártamo.
Gen Secuencia en el Secuencia antisentido cebador sentido Ct FAD2-3 5'- 5'- CTTCAGCGAGTACCAATGGCTC GGTTTCATCGTCCACTCCTTGA GAC-3' (SEC ID NO: 58) -3' (SEC ID NO: 59) Ct FAD2-4 5'- 5'- CTTCAGCGAGTACCAATGGCTC GGTTTCATCGTCCACTCCTTGA GAC-3' (SEC ID NO: 60) -3' (SEC ID NO: 61) Ct FAD2-5 5'- 5'- ATGACACCATTGGCTTCATCTG CTTTCTGCTCACTCCATACTTC CCA -3’ (SEC ID NO: -3' (SEC ID NO: 63) 62) CtFAD2-6 5'- 5'- AGCGAATATCAGTGGCTTGACG ACTCCGCTTTCCTCACTCCGTA ATG -3’ (SEC ID NO: C -3’ (SEC ID NO: 65) 64) CtFAD2-7 5'- 5'- CATGAATGTGGTCATCATGCCT CTTCTTCATCCATTCGGTTTGC TTAG -3' (SEC ID NO: -3' (SEC ID NO: 67) 66) CtFAD2-8 5'- 5'- CGTGGTTGAATGACACCATTGG ACCTTCTACACACCGGTATGCC TTAC -3’ (SEC ID NO: T -3’ (SEC ID NO: 69) 68) CtFAD2-9 5'- 5'- CATGGAAGATAAGCCACCGTCG AACACGGGTTCGCTTGAGCACG ACATO -3' (SEC ID NO: A -3' (SEC ID NO: 71) 70) CtFAD2-10 5'- 5'- TGCATACCCGCAAGCAAAACCG CCATCTCTCGAGAGTTCCTTAC -3' (SEC ID NO: 72) -3' (SEC ID NO: 73) CtFAD2-ll 5'- 5'- ATGTGGTCACCATGCCTTTAGT TGGAATGGTCCTCCATTCCGCT GAG -3' (SEC ID NO: C -3’ (SEC ID NO: 75) 74) Tabla 3. Cebadores oligonucleótidos usados para amplificación de la región codificadora entera de los genes FAD2 en cártamo .
Gen cebador Secuencia en el sentido Secuencia antisentido CtFAD2-l 5' - 5'- TGAAAGCAAGATGGGAGGAGG - TCACAACTTTACTTATTCTTGT 3’ (SEC ID NO: 78) 3' (SEC ID NO: 79) CtFAD2-2 5'- 5'-CATCATCTTCAAATCTTATTC ATTGAACAATGGGTGCAGGC -3' (SEC ID NO: 81) 3' (SEC ID NO: 80) CtFAD2-3 5'- AATCAGCAGCAGCACAAGC 5'- -3' (SEC ID NO: 82) CAAACATACCACCAAATGCTACT - 3’ (SEC ID NO: 83) CtFAD2-4 5'- 5'- CTCAGTAACCAGCCTCAAAACTT GCGGATTGATCAAATACTTGTG - G -3' (SEC ID NO: 84) 3’ (SEC ID NO: 85) CtFAD2-5 5'- 5'- GTAGGTTATGTAACAATCGTG ATCACAGGAAGCTCAAAGCATCT -3' (SEC ID NO: 87) -3' (SEC ID NO: 86) CtFAD2-6 5'- 5'- GTAGGTTATGTAACAATCGTG TGAAGACGTTAAGATGGGAGCTG -3' (SEC ID NO: 89) -3' (SEC ID NO: 88) CtFAD2-7 5'- 5'- CAGATCCAACACTTCACCACCAG AGATCTAAAGAATTTCCATGGTG - -3' (SEC ID NO: 90) 3’ (SEC ID NO: 91) CtFAD2-8 5'- 5'- CTGCTCTCTACGACACTAAATTC TCTATCTAATGAGTATCAAGGAAC AC -3' (SEC ID NO: 92) -3’ (SEC ID NO: 93) CtFAD2-9 5'- 5'- CTGAATTCACACCCACAGATAGC ACATCCCTTCTTAGCTTTAACTA- TAG -3' (SEC ID NO: 94) 3’ (SEC ID NO: 95) CtFAD2-10 5'- 5'- ACTTCGCCCTCTGTTATCTGG - CCATACACATACATCCTACACGAT 3' (SEC ID NO: 96) -3’ (SEC ID NO: 97) CtFAD2-l 1 5'- 5'- ACTCACAATAACTTCATCTCTCT CTACTAGCCATACAATGTCTTCG - _ Tabla 4. Características de los ADNcs de FAR2 candidatos de cártamo Designación Extensión Región Tamaño Tamaño Posición Tamaño SEC ID NO . del gen del cDNAc codificadora de de del del de (nt) de proteina 5 ' UTR 3 ' UTR intrón intrón nucleótido CtFAD2-l 1422 124-1266 123 156 -13 1144 12 CtFAD2-2 1486 81-1233 80 253 -12 3090 13 CtFAD2-3 1333 51-1197 50 136 -11 114 14 CtFAD2-4 1403 52-1227 51 176 -11 124 15 CtFAD2-5 1380 66-1194 65 186 -33 122 16 CtFAD2-6 1263 15-1146 14 117 * 17 CtFAD2-7 1375 66-1185 65 190 -29 253 18 CtFAD2-8 1345 58-1207 57 138 19 CtFAD2- 9 1326 108-1172 107 154 * 20 CtFAD2-10 1358 56-1199 55 159 -38 2247 21 CtFAD2- 11 1229 58-1092 57 137 -22 104 22 Tabla 5. Características de los polipeptidos de CtFAD2 candidatos Designación Longitud del Posición del Posición del Posición del SEC ID NO. del gen polipéptido primer His segundo His tercer His de {No. de encuadrado (y encuadrado (y encuadrado (y aminoácidos aminoácidos) secuencia) secuencia) secuencia) CtFAD2-l 380 105HECGH* 141HRRHH 315 HVVHH 27 CtFAD2-2 384 106HECGH 142 HRRHH 316HVTHH 28 CtFAD2-3 381 104HECGH 140HRTHH 314 HAVHH 29 CtFAD2-4 380 103HECGH 139HRTHH 313 HAVHH 30 CtFAD2-5 375 102HDCGH 138HRTHH 311 HVVHH 31 CtFAD2-6 376 101HDLGH 137HRSHH 310 HVVHH 32 CtFAD2-7 372 99 HECGH 135 HRTHH 308 HAVHH 33 CtFAD2-8 382 103HECGH 139HRTHH 313 HAVHH 34 CtFAD2-9 387 107HECGH 143HRTHH 318 HAVHH 35 CtFAD2-10 380 104HECGH 140HRRHH 314 HVVHH 36 CtFAD2-ll 377 100HECGH 136HRNHH 310 HVLHH 37 * HECGH (SEC ID NO:159), HDCGH (SEC ID NO: 160), HDLGH (SEC ID NO: 161), HRRHH (SEC ID NO: 162), HRTHH (SEC ID NO: 163), HRSHH (SEC ID NO: 164), HRNHH (SEC ID NO: 165), HVVHH (SEC ID NO: 166), HVTHH (SEC ID NO: 167), HAVHH (SEC ID NO: 168), y HVLHH (SEC ID NO: 169).
Para investigar la relación de los polipéptidos de FAD2 candidatos de cártamo con enzimas de FAD2 conocidas, se alinearon las 11 secuencias de polipéptidos deducidas con secuencias de FAD2 vegetales y se construyeron árboles de unión vecinos usando el vector NTI (Figura 1). Como se muestra en la Figura 1, las secuencias de aminoácidos de CtFAD2-l y CtFAD2-10 estuvieron estrechamente relacionadas, primero que todo entre ellas y luego a las FAD2s expresadas en semillas de otras especies. CtFAD2-2 estuvieron más estrechamente relacionadas con genes expresados constitutivamente de otras especies que a otros FAD2s candidatos en cártamo. CtFAD2-3, -4, -5, -6 y -7 formaron una nueva rama en el árbol de unión vecino, más probablemente como el resultado evolucionarlo de un gen divergido recientemente que se multiplicó en cártamo. De manera interesante, en relación con otras especies, estos estuvieron más estrechamente con una FAD2 conjugasa divergente funcionalmente de Cal ndula officinalis. FAD2-11 estuvo más estrechamente relacionada con acetilenasas de barias especies vegetales, incluyendo FAD2 de cártamo, el cual fue inducido por estimulantes fúngicos (Cahoon y colaboradores, 2003). Pareció que CtFAD2-8 y -9 fueron más divergentes que los otros FAD2s candidatos de cártamo. Sin embargo, estos análisis también mostraron que las comparaciones de secuencias, aunque dieron algunas ideas acerca de la posible función, no pudieron por si mismos proporcionar conclusiones confiables acerca de la función de los diferentes FAD2 candidatos. Por consiguiente, se requirió análisis funcional para hacer conclusiones acerca de la función de cada gen/polipéptido.
Las comparaciones de secuencias mostraron que los polipéptidos de FAD2 candidatos de cártamo compartieron aproximadamente 50% a 60% de identidad de secuencia y 52% a 65% de similaridad con enzimas de FAD2 conocidas de otras especies. El grado de divergencia de la secuencia de ADN entre los genes CtFAD2 de cártamo reflejó su relación filogenética, porque CtFAD2-3, -4, y -5 son todos más similares entre si que con CtFAD2-l, o CtFAD2-10, y viceversa . Estos números tienen paralelismo cercano en la matriz de identidad de aminoácidos (Tabla 6).
Tabla 6. Identidad de secuencia del ADN de la región codificadora y deduce aminoácidos en genes FAD2 de cártamo Identidad de aminoácidos deducida (% 2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6 2-7 2-8 2-9 2-10 2-11 CtFAD 2-1 - 70.3 53.2 52.5 53.5 50.9 54.1 59.7 59.5 80.1 56.4 CtFAD 2-2 70.0 - 54.5 55.0 54.2 51.7 57.8 60.6 62.5 69.5 58.6 CtFAD 2-3 62.0 62.0 - 97.1 62.0 61.8 63.1 52.7 50.9 51.2 56.8 CtFAD 2-4 62.7 63.3 95.1 - 61.4 61.4 63.3 53.1 50.9 50.9 56.9 Ct AD 2-5 61.9 60.3 69.7 70.6 - 63.2 62.0 51.4 51.3 51.7 53.9 CtFAD 2-6 60.6 59.9 68.8 69.6 72.0 - 63.1 49.3 50.8 50.1 56.2 Ct AD 2-7 62.2 65.8 69.4 69.3 66.6 68.2 - 51.7 49.2 51.4 60.7 CtFAD 2-8 65.2 66.2 63.1 62.8 60.8 61.7 61.2 - 58.8 58.1 56.40 CtFAD 2-9 64. 66.2 59.5 59.5 58.3 59.2 59.5 63.5 - 59.3 55.9 CtFAD 2-10 78.9 72.0 60.7 62.0 59.8 61.0 60.7 64.3 64.1 57.2 CtFAD 2-11 60.0 62.9 64.1 64.4 62.4 64.1 62.7 63.9 60.9 61.7 - Características de los Polipéptidos de CtFAD2 candidatos Los polipéptidos predichos de los 11 CtFAD2s candidatos contuvieron cada uno un motivo rico en aminoácidos aromáticos en el extremo del C-termino. Dichos motivos han sido identificados en otros polipéptidos de FAD2 vegetales, y se piensa que es necesario mantener la localización en el ER (McCartncy y colaboradores, 2004). Consistente con enzimas desaturasas de ácidos grasos enlazadas a membranas vegetales, los polipéptidos de CtFAD2 predichos contuvieron cada uno tres motivos ricos en histidina (His encuadrados). Dicho motivos ricos en histidina son altamente conservados en enzimas de FAD2 y han sido implicados en la formación del complejo oxigeno-dihierro usado en catálisis bioquímica (Shanklin y colaboradores, 1998). En la mayoría de las secuencias de polipéptidos del CtFAD2 candidato, el primer motivo histidina fue HECGHH, exceptuándose CtFAD2-5 y -6 los cuales tuvieron HDCGHH y HDLGHH, respectivamente. El último aminoácido del primer His encuadrado en CtFAD2-8 (HRCGHQ) fue una Q en vez de una H. Los inventores buscaron este motivo en 55 enzimas de FAD2 de plantas conocidas y la sustitución de H a Q está también presente en un homólogo de FAD2 divergido de Lesquerella lindheimeri predominantemente con actividad de ácido graso hidrolasa (No. de Acceso a Genebank EF432246; Dauk y colaboradores, 2007).El segundo motivo histidina fue altamente conservado, como la secuencia del aminoácido HRRHH, en varios FAD2s de cártamo candidatos, incluyendo CtFAD2-l, -2, -8, -9 y -10. Cabe destacar, que se encontró el aminoácido N en CtFAD2-ll en la posición +3 del motivo, el cual también se ha visto en numerosas enzimas de tipo FAD2 de funcionalidad divergente incluyendo CREP1 de Crepis alpina, CpaI2 de Crepis palaestina y VFAD2 de cártamo (AY166773.1), FAC2 de Calendula officinalís (AF343064.1), acetilenasa de Rudbeckia hirta (AY166776.1). El aminoácido en esta posición en CtFAD2-3, -4, -5, -6 y -7 fue ya sea un S o una T.
En cada uno de los polipéptidos de CtFAD2-l, -2, -9, y -10, el aminoácido que precede inmediatamente al la primera histidina encuadrada fue una alanina, la misma que para otras enzimas de ácido grasos D2 desaturasa vegetales. El aminoácido valina (V) en vez de alanina estuvo presente en esa posición en CtFAD2-5 , mientras que los otros seis polipéptidos tuvieron una glicina en esa posición. Cahoon y colaboradores (2003), propusieron que una sustitución glicina por alanina en esta posición se encontró en enzimas de FAD2 funcionalmente divergente, excepto el ácido graso D12-hidrolasa. Como se describe en los siguientes ejemplos, experimentos de expresión heteróloga subsecuentes que prueban la función de los candidatos demostraron que cada uno de los polipéptidos de CtFAD2-l, -2 y -10 fueron oleato D12 desaturasa, mientras que CtFAD2-9 mostró especificidad desaturasa a palmitoleato (16:1) en vez de oleato.
Se observó que de los 11 candidatos CtFAD2s, solamente el polipéptido de CtFAD2-ll tuvo una secuencia DVTH en las posiciones -5 a -2 de la tercera Histidina encuadrada, lo cual fue consistente con el motivo (D/N) VX (H/N) propuesto para encontrarse en todas las acetilenasas vegetales (Blacklock y colaboradores, 2010). Los cinco aminoácidos inmediatamente después de la tercera histidina encuadrada de los polipéptidos de CtFAD2-l, -2 y -10 fueron LFSTM, en cuanto a otras oleato desaturasas de FAD2 vegetales conocidas. En contraste, CtFAD2-9, el ácido graso desaturasa especifico de palmitoleato, tuvo un motivo LFSY1 en esta posición con dos sustituciones de aminoácidos en las posiciones +4 y +5. En los polipéptidos de CtFAD2-3, -4 y -5, el S en la posición +3 fue sustituido por P, el cual estaba también presente exclusivamente en otras conjugasas de ácido graso de FAD2 incluyendo aquellas de Cal ndula officinalis (FAC2, Acceso AAK26632) y Tríchosanthes kirilowii (acceso AA037751).
Se ha mostrado que la serina-185 de la enzima de FAD2-1 de soya es fosforilada durante el desarrollo de la semilla como un mecanismo regulador por su actividad enzimática (Tang y colaboradores, 2005). Entre los 11 polipéptidos de CtFAD2 candidatos, solamente CtFAD2-l tuvo una serina en la posición correspondiente (Serina-181) en relación a FAD2-1 de soya. Se concluyó que el mismo mecanismo regulador post-traslacional debe operar durante el desarrollo de la semilla de cártamo y acumulación de aceite a través de la fosforilación de la serina-185, para modular la desaturación de D12 oleato microsómico en la semilla en desarrollo.
Ejemplo 3. Aislamiento de Secuencias Genómicas para FAD2 Candidatos Aislamiento de intrones 5'UTR de los Genes CtFAD2 Las estructuras de genes FAD2 se conservaron en muchas plantas florecientes. Todos los genes FAD2 estudiados hasta ahora contienen solamente un intrón, el cual está localizado en el 5'UTR, con una excepción que es FAD2-1 de soya para el cual el intrón está localizado en la región codificadora inmediatamente después del primer ATG, el codón de iniciación traslacional Liu y colaboradores, 2001; Kim y colaboradores, 2006; Mroczka y colaboradores, 2010). La divergencia de la secuencia del intrón pudiera ser usada como una medida de distancia evolucionaría entre especies estrechamente relacionadas taxonómicamente (Liu y colaboradores, 2001).
A fin de aislar las secuencias de ADN de intrones posibles situados en los 5'UTRs de los genes CtFAD2 candidatos, los sitios de empalme de intrón típicos (AG:GT) fueron predichos en el 5'UTR de cada una de las secuencias de ADNc, y cebadores de PCR fueron diseñados con base en las secuencias de flanqueo de los sitios de empalme predichos. Los cebadores se enlistan en la Tabla 7. ADN genómico aislado a partir del genotipo SU de cártamo se usó como modelo en reacciones de PCR para amplificar las regiones genómicas correspondientes a los 5'UTR. Se lograron las amplificaciones en reacciones de 50 mL, reacciones con 100 ng de ADN genómico, 20 pmoles de cada cebador y un Hotstar (Qiagen, Hilden, Alemania) suministrado por el fabricante. El cielaje de la temperatura de PCR se efectuó como sigue: 94°C durante 15 minutos para un ciclo, 94°C durante 30 seg, 55°C durante 1 min, 72°C durante 2 min durante 10 min usando el superciclador de Kyratec SC200 (Kyratec, Queensland, Australia). Los productos de PCR fueron clonados en pGEM-T Easy y luego se secuenciaron.
Los inventores fueron capaces de obtener el intrón 5' predicho a partir de 8 de los 11 genes CtFAD2 candidatos, es decir CtFAD2-l, -2, -3, -5, -5, -7, -19 y -11. Las principales características de los intrones se dan en la Tabla 8. El intrón no fue amplificado exitosamente a partir de CtFAD2-6, -8 y -9, probablemente debido a una extensión insuficiente del 5'UTR en la cual estuvieron presentes los intrones. Parece que no se ha reportado un FAD2 sin intrón, aunque comúnmente se ha observado la pérdida de intrón desde genes nucleares en plantas superiores (Loguercio colaboradores, 1998; Small y colaboradores, 2000 a:b).
Tabla 7. Cebadores oligonucleótidos usados para la amplificación de regiones 5'UTR de genes FAD2 candidatos en cártamo Gen cebador Secuencia en el sentido Secuencia antisentido CtFAD2-l 5'- 5'- CTTTGGTCTCGGAGGCAGACATA GAGATTTTCAGAGAGCAAGCGCTT -3’ (SEC ID NO: 101) -3’ (SEC ID NO: 100) CtFAD2-2 5'- 5'- CAAAAGGAGTTTCAGAAAGCCTCC ACTCGTTGGATGCCTTCGAGTTC- 3' -3' (SEC ID NO: 102) (SEC ID NO: 103) CtFAD2-3 5'- AATCAGCAGCAGCACAAGC - 5'- AAGGCGGTGACAATTATGATATC 3' (SEC ID NO: 104) -3' (SEC ID NO: 105) CtFAD2-4 5'- 5'- AAGGCGGAGACGATTATGATATC CTCAGTAACCAGCCTCAAAACTTG -3' (SEC ID NO: 107) -3' (SEC ID NO: 106) CtFAD2-5 5'- 5'- ATCATCTCTTCGGTAGGTTATG ATCACAGGAAGCTCAAAGCATCT - -3' (SEC ID NO: 109) 3' (SEC ID NO: 108) CtFAD2-7 5'- 5'- CTAAAGAATTTCCATGGTGTTAC CAGATCCAACACTTCACCACCAG - -3’ (SEC ID NO: 111) 3' (SEC ID NO: 110) CtFAD2-10 5'- ACTTCGCCCTCTGTTATCTGG 5'- GAGAGACGGTGGAAGTAGGTG - -3' (SEC ID NO: 112) 3' (SEC ID NO: 113) CtFAD2-ll 5'- 5'- CTCACAATAACTTCATCTCTCTC - AAAGACATAGGCAACAACGAGATC 3' (SEC ID NO: 114) 3' (SEC ID NO: 115) Tabla 8. Las características de los intrones del gen FAD2 candidato Característica CtFAD2-l CtFAD2-2 CtFAD2-3 CtFAD2-4 Posición -13 -12 -11 -11 Extensión 1144 3090 114 124 Contenido de AT 64 . 5% 65.8% 73.7% 75.0% Contenido de CG 35 . 5% 34.2% 26.3% 25.0% Limites de 5?/I AG : GTGCAT AG:GTGAGA AG:GTATGA AG:GTAAGT Límite de 3'1/E TTGCAG : GT TTGCAG:GT ATGCAG:GT GCGCAG:GT Tabla 8 (Continuación) Característica CtFAD2-5 CtFAD2-7 CtFAD2-10 CtFAD2-ll Posición -33 -29 -38 -22 Extensión 122 253 2247 104 Contenido de AT 67.2 % 62.1% 68.91 75% Contenido de CG 32.8% 37.9% 31.1% 25% Limites de 5?/I AG:GTGAAG AG:GTATAC TG:GTTCGT AG:GTTTCT Límite de 3'1/E TTTCAG:GT TTGCAG:GT ATATAG:GT TTGCAG:GT La secuencia del intrón en cada uno de los ocho genes se localizó en el 5'UTR de cada gen, en posiciones que variaron desde 11 a 38 pb en la dirección de 3' a 5' del codón de inicio de translación putativo, el primer ATG en cada marco de lectura abierto. La extensión del intrón varió desde 104 pb (CtFAD2-l) a 3,000 pb (CtFAD2-2) (Tabla 8). Para CtFAD2-l, el tamaño del intrón fue de 1,144 pb, similar en tamaño a los intrones identificados en genes FAD2 procedentes de Arabidopsis (The Arabidopsis Information Resources, http://www.arabidopsis.orq), algodón (Liu y colaboradores, 2001) y sésamo ( Sesamun indicum) (Kim y colaboradores, 2006). Los dinucleótidos en los sitios de empalme putativo, AG y GT, fueron conservados en ocho de los genes CtFAD2, pero de otra manera las secuencias de intrón fueron rodas divergentes en secuencia sin cualquier homología significativa entre ellos. Las secuencias de intrón fueron todas ricas en A/T con un contenido de A/T de entre 61% y 75%, lo cual es consistente con muchas otras secuencias de intrones de plantas dicotiledóneas. En genes de otras plantas dicotiledóneas, el gen FDA2 de Arabidopsis tuvo un intrón de 1,134 pb exactamente 5 pb de 3' a 5' desde su codón de iniciación de translación de ATG. El tamaño del intrón 5'UTR del gen FAD2-1 de Gossypium fue de 1,133 pb, localizado 9 pb de 3' a 5' desde el codón de inicio de translación. En contraste, los genes FAD2-3 y FAD2-4 de algodón tuvo intrones 5'UTR más grandes de 2,780 pb y 2,967 pb, respectivamente, localizaos 12 pb de 3' a 5' desde el codón de inicio de traslación. Cada gen CtFAD2 candidato podía ser distinguido por las diferencias en la posición y tamaño del intrón 5'-UTR en cada gen. Las diferencias podían ser importantes proporcionando expresión diferencial de los genes. Se ha reportado que dichos intrones tienen efectos positivos sobre la expresión de genes informadores en sésamo (Kim y colaboradores). Se mostró que un intrón correspondiente es un objetivo efectivo para el gen silenciador post-transcripcional de FAD2 en soya (Mroczka y colaboradores, 2010).
Se sabe que los intrones pueden tener efectos dramáticos sobre los perfiles de expresión genética. El análisis de secuencias de intrones, mediante el programa PLACE (www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) identificó varios elementos cis-reguladores putativos. Por ejemplo, unos cuantos motivos tales como ABRE y SEF4, comúnmente presentes en promotores específicos de semilla han sido localizados en CtFAD2-l específico de semilla. Un motivo AG, el cual se encuentra normalmente en el promotor de genes relacionados con defensa inducidos por varios estreses tales como por heridas o tratamientos estimulantes fueron localizados en CtFAD2-3 que es específicamente expresado en los hipocotiledones y cotiledones de plántulas joven de cártamo.
Ejemplo 4. Análisis de Hibridización por Tinción Southern de los Genes FAD2 de Cártamo Candidatos Se examinó la complejidad de la familia del gen similar a FAD2 en cártamo mediante el análisis de hibridización por tinción Southern. El análisis de hibridización de baja severidad mostró que, en cártamo, FAD2 fue codificado por una familia multigen compleja (Figura 2). Contando los fragmentos de hibridización obtenidos usando varias enzimas de restricción para fragmentar el ADN genómico, se estimó que hubieron más de 10 genes FAD2 o similares a FAD2 en cártamo. Las diferencias vistas en la intensidad de hibridización para los diferentes fragmentos presumiblemente correlacionados con los niveles relativos de identidad de secuencia al ADN de la sonda que fue usada. El cártamo es una especie diploide y se piensa que tiene una especie progenitora salvaje individual, C. palaestinus (Chapman y Burke, 2007). Los inventores especulan que la familia del gen FAD2 inusualmente grande en cártamo es, tal vez derivado de algunas duplicaciones de gen antiguo, que conduce a actividad diferencial y a especialización de los diferentes miembros de la familia del gen.
Ejemplo 5. Análisis Funcional de Genes Candidatos en Células Vegetales y de Levaduras Expresión de Genes CtFAD2 Candidatos en Análisis Funcional de Levaduras Como una célula huésped conveniente, se usó la levadura S. cerevisiae para estudiar la expresión funcional de varias D12 oleato de ácido graso desaturasas vegetales (Covello y Reed 1996; Dyer y colaboradores, 2002; Hernández y colaboradores, 2005). S. cerevisiae tiene un perfil de ácidos grasos relativamente simple y contiene amplio ácido oleico en sus fosfolipidos que pueden ser usados como un sustrato para enzimas de FAD2. También carece de una actividad de FAD2 endógeno. Por consiguiente, se probaron los 11 genes CtFAD2 candidatos en cepas YPH499 usando constructos derivados de pYES, cada marco de lectura abierto bajo el control del promotor GAL1, como se describió en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 3, cuando la composición de ácidos grasos de células de levaduras que contienen un "vector vacio" se analizó pYES2, no se detectó ácido linoleico (18:2) o ácido hexadecadienoico (16:2), como se esperó, ya que la levadura carece de FAD2 endógeno. En contraste, el cromatograma de gases para ácidos grasos obtenidos a partir de células de levaduras que expresan al marco de lectura abierto de CtFAD2-l, CtFAD2-2 y CtFAD2-10 de cada uno mostró un pico de ácido graso con un tiempo de retención de 11.293 min, correspondientes a ácido linoleico (C18:2), y los cromatogramas de gases para CtFAD2-9 y CtFAD2-10 mostraron un pico de ácido graso con tiempo de retención de 8.513 min, correspondientes a C16:2. Estos datos indicaron que CtFAD2-l, CtFAD2-2 y CtFAD2-10 fueron capaces de convertir ácido oleico a ácido linoleico y por consiguiente fueron D12 desaturasas. Sin embargo, el nivel de 18:2 producido fue inferior que para el constructo AtFAD2 de Arabidopsis el cual fue usado como control positivo.
CtFAD2-10 produjo ambos ácido linoleico (C18:2) y ácido hexadecadienoico (C16:2) usndo ácido oleico (C18:2) y ácido palmitoleico (C16:l) como sustratos, respectivamente, mientras que CtFAD2-9 desnaturalizó ácido palmitoleico y por consiguiente fue una D12 palmitoleato desaturasa. Dos picos nuevos menores que aparecieron en los cromatogramas de FAMEs de células de levaduras que expresan a CtFAD2-ll fueron identificados como ácido linoleico (18:2A9(Z),12(z)) y su isómero trans (18:2 A9<z),i2<z)) por GC-MS de sus aductos de pirrolidina, y DMOX (Figura 3H). La Tabla 9 resume la composición de ácidos grasos de células de levaduras que expresan a regiones codificadoras de CtFAD2. No se detectaron picos nuevos en células de levaduras que expresan a CtFAD2-3, -4, -5, -6, -7 y -8.
Para examinar si cualquiera de los polipéptidos de CtFAD2 candidatos tuvieron actividad de ácido graso hidroxilasa, FAMEs preparados a partir de células de levaduras que expresan a cada uno de los marcos de lectura abiertos de CtFAD2 se hicieron reaccionar con un reactivo sililante que convierte residuos hidroxilo en derivados de TMS-éter cuyo espectro de masa pudiera ser examinado. Sin embargo, ninguno de los derivados hidroxilo, de los ácidos grasos comunes tal como ácido oleico fueron detectados en cualquiera de las líneas celulares de levaduras que expresan a marcos de lectura abiertos de CtFAD2 candidato. Estos indican que ninguno de los 11 genes CtFAD2 codificó a polipéptidos que tienen actividad de ácido graso hidroxilasa en levaduras.
Se llevaron a cabo experimentos adicionales para detectar actividad A12-epoxigenasa y A12-acetilenasa, ambas de las cuales usan ácido linoleico como el sustrato de ácido graso, suplementando el medio de crecimiento de las mismas lineas celulares de levaduras con ácido linoleico libre y analizando después la composición de ácidos grasos. Se hizo la suplementación después de la adición de galactosa a los cultivos para expresar a los constructos. No se detectaron picos nuevos de ácidos grasos en los cromatogramas de gases, incluyendo los que representan derivados de ácidos grasos epoxi y acetilénico. La expresión heteróloga de estos nuevos ácidos grasos en levaduras, con suplementación de ácidos grasos libres exógenos, ha encontrado algunas dificultades demostrando actividad (Lee y colaboradores, 1998; Cahoon y colaboradores, 2003). Por consiguiente, se llevaron a cabo análisis funcional en células vegetales, como sigue Tabla 9. Composición de ácidos grasos de celulas de levaduras que expresan a genes CtFAD2 seleccionados : : : i , . . . . . . . . . . . . . . . . : . . . 10 Expresión Transitoria de Genes CtFAD2 Candidatos en N. benthamiana Para expresar los genes en un estilo constitutivo en células vegetales, en particular en hojas de plantas de cada uno de los ORF de CtFAD2 se insertaron en la orientación en el sentido en un vector binario pORE04 entre el promotor CaMV-35S y el terminador 3' que contenga una secuencia de señal de poliadenilación (Coutu y colaboradores, 2007) (SEC ID NO: 54). La investigación previa indicó que la expresión de transgenes pudiera ser significativamente mejorada por la co-expresión de la proteina supresora silenciadora viral, P19, para reducir el transgen del huésped silenciador en un ensayo transitorio basado en hojas de N. benthamiana (Voinnet y colaboradores, 2003; Wood y colaboradores, 2009; Petrie y colaboradores, 2010). Estos experimentos se efectuaron como se describe en el Ejemplo 1.
Como se describió anteriormente, la función de CtFAD2-ll fue evaluada inicialmente por la expresión en S. cerevisiae y se identificaron dos nuevos ácidos grasos mediante GC-MS como 18:2D9<z>'12<2> y 18:2D9(z)'12(E>, respectivamente. Consistente con los resultados obtenidos de levaduras, la expresión de CtFAD2-ll en hojas de N. benthamiana produjo un nuevo isómero trans de 18:2. El éster metílico de este isómero presentó un tiempo de retención por GC que fue idéntico al de un metil 18:2D9(Z)12<E> (Figura 4B). El nuevo 18:2D9(Z),12(E) representado por 0.35% de los ácidos grasos en hojas después de expresar transitoriamente a CtFAD2-ll (Tabla 10). Además, se detectó otro nuevo pico que no fue observado en los cultivos de levaduras. El cromatograma de ión total y el espectro de masa de este nuevo ácido graso fue consistente con el del ácido crepenínico (18:2D9(Z!12(c) (Figura 4B y C), que demuestra que el polipéptido de CtFAD2-ll tuvo actividad A12-acetilenasa. Como se muestra en la Tabla 10, el ácido crepenínico representó 0.51% de los ácidos grasos totales.
Se observó que la expresión de CtFAD2-ll transitoriamente en las células de N. benthamiana dio como resultado la reducción en el contenido del 18:2D (Z),12(Z) en relación al control sin transformar (Tabla 10). Esto fue probablemente debido a la comparación de CtFAD2-ll con el cis-A12 oleato desaturasa endógeno en las células de N. benthamiana para el conjunto disponible de ácido oleico, el sustrato para ambas enzimas. Generalmente, los resultados de los experimentos de expresión de N. bentamiana y la levadura, indicaron que CtFAD2-ll funcionó primeramente como un oleato A12-desaturasa que carece de estéreo-especificidad, produciendo ambos ácido linoleico y sus isómeros trans-A12. Además, pudiera también desnaturalizar adicionalmente el doble enlace de D12 de ácido linoleico para formar el enlace acetilénico del ácido crepeninico.
Los otros 10 polipéptidos de CtFAD2 candidatos fueron también expresados transitoriamente en hojas de N. benthamiana en la misma manera, pero no se observaron ningunos ácidos grasos nuevos que no estuvieran presentes endógenamente en hojas de N. benthamiana, las cuales ya tenían altos niveles de FAD2.
Tabla 10. Composición de ácidos grasos de hojas de N. benthamiana que expresan transitoriamente a CtFAD2-ll. : : : , : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . b. 10 15 Discusión Los 11 genes e CtFAD2 candidatos descritos anteriormente que fueron identificados en cártamo representa la familia dei gen FAD2 más grande observada en cualquier especie vegetal que haya sido examinada a la fecha. Aunque solamente un gen FAD2 individual fue identificado en Arabidopsis (Okulcy y colaboradores, 1994). FAD2 parece ser codificada por múltiples genes en la mayoría de otras plantas estudiadas a la fecha. Se han descrito dos genes de FAD2 distintos en soya (Heppard y colaboradores, 1996), lino (Fofana y colaboradores, 2004; Khdake y colaboradores, 2009) y olivo (Hermanze y colaboradores, 2005); tres genes en cártamo (Martínez-Rivas y colaboradores, 2001) y Camelína sativa (Kang y colaboradores, 2011); y cinco genes en algodón (liu y colaboradores, 1998). En la especie anfitetraploide Brassica napus, 4-6 genes de FAD2 diferentes han sido identificados en cada sub-genoma diploide (Scheffler y colaboradores, 1997). Todos los genes CtFAD2 candidatos fueron expresados en plantas de cártamo, ya que las secuencias fueron aisladas a partir de ADNcs. Estas fueron examinadas adicionalmente como se describe en el Ejemplo 6.
Aunque han faltado estudios comparables, es claro que el cártamo es inusual con respecto a la evolución de la familia del gen FAD2. El cártamo es una especie vegetal diploide auto-polinizante, lo cual está más estrechamente relacionado con una especie diploide salvaje Carthamus palaestinas y no se sabe que tenga redistribución o duplicación extensiva del genoma (Chapman y Burke, 2007). El ADNcs de FAD2 múltiple que fueron identificados no pudieron atribuirse a empalme alternativo ya que los genes FAD2 candidatos no contuvieron intrones en la secuencia de la región codificadora. Más bien, la duplicación del gen fue más probablemente responsable de crear la complejidad de la familia de FAD2 en cártamo. La topología del árbol filogenético mostró que pueden haber ocurrido duplicaciones del gen a varios nieles jerárquicos. Por ejemplo, los polipéptidos de CtFAD2-3, -4 y -5 se relacionaron más estrechamente con los otros en ese grupo que con las otras secuencias de FAD2 de cártamo, , indicando que duplicaciones del gen más recientes pueden haber sido responsables de la emergencia en este grupo.
Ejemplo 6. Nivel de Expresión de Genes FAD2 Candidatos en Cártamo Perfil de Expresión de Genes FAD2 en Tejidos Diferentes Para determinar los patrones de expresión en tejido de los varios genes CtFAD2 candidatos, se llevaron a cabo análisis por RT-PCR como se describió en el Ejemplo 1. Se extrajo el ARN total de cotiledones, hipocotiledones, raíces y tejidos vegetales derivados de plántulas de cártamo en 10 DAG del genotipo SU alto en linoleico, y de tejidos de flor y embriones en desarrollo de plantas floridas, y se usaron en los ensayos. Los cebadores oligonucleótidos usados para los análisis se enlistan en la Tabla 11.
Tabla 11. Cebadores ollgonucleótidos usados para RT-qPCR en el estudio de perfil de expresión de genes FAD2 de cártamo .
Gen Secuencia en el Sentido Secuencia An ti sentido cebador CtFAD2-l 5'- GTGTATGTCTGCCTCCGAGA -3' (SEC ID NO: 116) 5'- GCAAGGTAGTAGAGGACGAAG -3' (SEC ID NO: 117) 5 CtFAD2-2 5'- GCCTCCAAAGATTCATTCAGGTC - 3’ (SEC ID NO: 118) 5'- CAAGATGGAT GCGAT GGTAAGG -3' (SEC ID NO: 119) CtFAD2-3 5'- ACGTGGCGGTCTCAGGTT -3’ (SEC ID NO: 120) 5'- AGGCGGTGACAATTATGATATC -3' (SEC ID NO: 121) CtFAD2-4 5'- AAGGCAGGCCGTGATGCCGAT -3' (SEC ID NO: 122) 5'- AGTATTTGATCAATCCGCTGG -3' (SEC ID NO: 123) CtFAD2-5 5'- CAATACGGTAGAGGCCACACAG -3’ (SEC ID NO: 124) 5'- ATCATCTCTTCGGTAGGTTATG -3' (SEC ID NO: 125) rv> CtFAD2-6 5'- GACATGTGCTCACGTGGTGCAT -3’ (SEC ID NO: 126) 5'- GTTGCTAATATCCACACCCTA -3' (SEC ID NO: 127) CD CtFAD2-7 5'- CGAATCACACCCACGGGATC -3' (SEC ID NO: 128) 5'- CTAAAGAATTTCCATGGTGTTAC -3’ (SEC ID NO: 129) CtFAD2-8 5'- GAGCAACGGAGAGAAGTAACC -3' (SEC ID NO: 130) 5'- GAGGGATGATAGAAAGAGGTCC -3' (SEC ID NO: 131) 10 CtFAD2-9 5'- CATGTGTGGCTGGAGGATTCGA -3' (SEC ID NO: 132) 5'- GCACCGAGTTTAGCCTTTGTCT -3’ (SEC ID NO: 133) CtFAD2-10 5'- CCAACAAACAAACCATCTCTCG -3' (SEC ID NO: 134) 5'- GAGAGACGGTGGAAGTAGGTG -3' (SEC ID NO: 135) CtFAD2-ll 5'- CCATTGATCCACCCTTCACCTTA -3' (SEC ID NO: 136) 5'- AAAGACATAGGCAACAACGAGATC -3’ (SEC ID NO: 137) KASII 5'- CTGAACTGCAATTATCTAGG -3' (SEC ID NO: 138) 5'- GGTATTGGTATTGGATGGGCG -31 (SEC ID NO: 139) 15 El patrón de expresión espacial y temporal de los 11 genes CtFAD2 se muestra en la Figura 5. Los ensayos por RT-qPCR mostraron que CtFAD2-l fue expresado exclusivamente en semillas en desarrollo. En contraste, CtFAD2-2 fue expresado a bajos niveles en semillas así como también otros tejidos examinados. Adicionalmente, no se observó ninguna expresión de CtFAD2-4, -5, -6, -7, -8, -9 en embriones en desarrollo. Bajos niveles de expresión, aún detectables de CtFAD2-10 y -11 fueron observados en semillas en desarrollo, tanto en la etapa de desarrollo tardío como en las semillas de cártamo próximas a la madurez. CtFAD2-4, -6, -7, -9 y -11 mostraron altos niveles de expresión en los tejidos de plántulas jóvenes incluyendo cotiledones e hipocotiledones. CtFAD2-5 y -8 pareció ser específico de raíz y CtFAD2-10 fue expresado preferentemente en tejidos de flores, con niveles relativamente más bajos que los detectados en otros varios tejidos examinados, incluyendo semillas en desarrollo, y tejidos de plántulas de diez días de edad.
No se detectaron productos de amplificación después de 40 ciclos de amplificación en reacciones de control con plantillas de ARN total pero sin transcriptasa inversa, indicando la ausencia de ADN genómico contaminante en las preparaciones de ARN.
Ejemplo 7. Demostración de la Mutación Genética en la Linea S317 de Cártamo El primer rasgo de alto oleico identificado en cártamo, encontrado en una introducción de cártamo procedente de India, fue controlado mediante un alelo parcialmente recesivo designado ol en un locus OL individual (Knowless y Hill, 1964). El contenido de ácido oleico de genotipos olol era usualmente 71- 75% para plantas cultivadas en invernadero (Knowless (1969) con el alelo ol incorporado en un programa de reproducción de cártamo y se liberó la primera variedad "UC-1" de cártamo alta en oleico (HO), en 1966 en los Estados Unidos, lo cual fue seguido por la liberación de variedades mejoradas "Oleico LEED y la serie Saffola que incluye Saffola 317 (S-317), S-517 y S-518, Los genotipos altos en oleico ( olol) fueron relativamente estables a diferentes temperaturas (Bartholomew, 1971). Además, Knowless (1972) también describió un alelo ol diferente, en el mismo locus el cual se produjo en condiciones homocigótico entre 35 y 50% de ácido oleico. En contraste al genotipo olol , el genotipo oliol mostró una fuerte respuesta a la temperatura (Knowles, 1972).
Se ha reportado germoplasma adicional con contenido de ácido oleico más alto (>85%) (Fernández Martínez y colaboradores, 1993; Bergman y colaboradores, 2006) .
Fernández-Martínez y colaboradores (1993) reportaron contenido de ácido oleico hasta de 89% en cártamo en el acceso de germoplasma P1401472 originalmente procedente de Bangladesh. La serie Montóla desarrollada por Bergman y colaboradores (2006) contiene más de 80% de ácido oleico, claramente más allá del nivel más alto de ácido oleico en la variedad "UC-1" que contiene el alelo olol como se describe en Knowles y Hill (1964). El análisis genético a través de las cruzas y análisis de segregación, las lineas altas y muy altas en ácido oleico sugirieron que estas dos lineas comparten los mismos alelos en el locus OL. El contenido muy alto en ácido oleico (85%) se generó por la combinación de los alelos "ol" y genes modificadores con un pequeño efecto positivo sobre el ácido oleico (Hamdam y colaboradores 2009).
Caracterización Bioquímica In vitro de la Linea Mutante de Ácido Oleico S-317 Microsomas de cártamo fueron recientemente preparados a partir de semillas en desarrollo de genotipo S-317 alto en ácido oleico a mediana etapa de madurez, aproximadamente 15 días post-antesis (DPA), como describió Styme y Appelqvist (1978).90 mL de una mezcla de reacción estándar contuvo 40 mg de proteína microsómica, 2 inmoles de [14C] oleil-CoA en 0.1 mmoles de amortiguador de fosfato de potasio a pH de 7.2. Luego, se añadieron 10 pL de 50 mM de NADH y la incubación continuó durante 5, 10 o 20 minutos adicionales. Las reacciones fueron detenidas añadiendo 90 pL de ácido acético 0.15 M y se extrajo el lipido con 500 mL de CHCl3:MeOH (1:1). Se recuperó la fase inferior de CHCl3 y se separaron de ésta los lipidos polares por cromatografía en capa fina (TLC) usando el sistema de solventes CHCl3/Me0H/HAc/H20) (90:15:10:3) en volumen. Se rasparon de la placa las manchas correspondientes a PC y se transmetilaron los grupos acilo grasos asociados en 2 mi de ácido sulfúrico al 2% en MeOH a 90°C durante 30 minutos. Las FAMEs resultantes fueron separadas sobre placas tratadas con AgN03 con hexano:DEE:HAc (85:15:1 en volumen). Estándares e oleato y linoleato de éster metílico fueron teñidos sobre la placa como referencias. Las placas fueron expuestas y analizadas por un fosforimagenólogo Fujifilm FLA-5000. La radioactividad de cada muestra fue cuantificada con el programa de cómputo Fujifilm Multi Gauge.
Después de la adición de NADH a las reacciones con los microsomas de tipo salvaje, se observó que el [14C]oleoil-CoA desapareció rápidamente en 10 minutos, al mismo tiempo que la aparición de [14C]linoleato, indicando la conversión eficiente de oleato a linoleato en los microsomas de cártamo de tipo salvaje. En contraste, para el genotipo S-317 alto en oleico, una proporción significativamente más alta de [14C]oleato a [14C]linoleato fue encontrada en las reacciones in vitro en todo el tiempo transcurrido (Tabla 12), indicando que la biosintesis de ácido linoleico vía desaturación de oleato por los microsomas fue reducida drásticamente en este genotipo.
Tabla 12. Porcentage de C18:2 producto derivado de C18:l en microsomas de cártamo Tiempo WT _ HO _ (min) C 18: 1 C18:2 C18:l C18:2 0 99.2±1.1 O.fcfcl.l 100.0±0.0 0.0±0.0 5 79.6±1.2 20.4±1.2 99.4±0.3 0.6±0.3 10 69.6±0.4 30.4±0.4 95.4±1.6 4.6±1.6 20 60.6±0.6 39.4±0.6 95.U1.5 4.9±1.5 n=2 Caracterización Molecular del Alelo ol Alto en Oleico Para entender la base molecular del genotipo ( olol ) de oleico alto en cártamo, los dos ADNcs de FAD2 expresado en semilla, es decir CtFAD2-l y CtFAD2-2, fueron amplificados por PCR a partir de tres variedades de oleico alto: S-317, LeSaf 496 y CW99-OL y se secuenciaron. Los ADNs que cubren las regiones codificadoras enteras de los genes CtFAD2-l de las tres variedades altas en oleico fueron idénticas entre si en la secuencia de nucleótidos, y compartieron aproximadamente 98% de identidad de secuencia con el ADNc de CtFAD2-l derivado de la variedad SU salvaje, incluyendo una eliminación de nucleólido y 22 sustituciones de nucleótidos en el genotipo HO en relación con el tipo salvaje. Se encontró la eliminación de un par de bases individual en el nucleótido 606 contando desde el primer ATG, en aproximadamente el medio de la región codificadora de CtFAD2-1. Esta eliminación causó un desplazamiento en el marco de lectura traslacional que creó un codón de detención inmediatamente después de la eliminación, de modo que el gen mutante en las tres variedades olol codificaron a un polipéptido truncado predicho sin la tercera histidina encuadrada presente en la proteina de tipo salvaje (Figura 6). Cabe destacar que habla un nivel relativamente alto de variación de secuencia en las secuencias de ADN cerca del sitio del nucleótido individual eliminado del alelo ol, sugiriendo que mutaciones adicionales se habían acumulado en el gen mutante.
Las regiones de ADN incluyendo los intrones 5'UTR de CtFAD2-l y CtFAD2-2 fueron también aisladas del mutante olol de S-317 y se compararon con los intrones de tipo salvaje. El intron de CtFAD2-l de S-317 fue de 1144 pb de extensión, 61 pb más largo que el intrón de Su de tipo salvaje el cual era de 1083 pb de extensión. La comparación de las secuencias de nucleótidos de los intrones de CtFAD2-l mostró una identidad de secuencia total de 76.8%, los intrones que difieren en 27 inserciones o eliminaciones (indel) y 95 sustituciones de nucleótidos individuales (Figura 7).
De manera interesante, las sustituciones de nucleótidos en el gen mutante no fueron distribuidas uniformemente en toda la región de 1142 pb de longitud correspondiendo a la región codificadora del CtFAD2-l defectuoso, porque 14 de los 22 (63.6%) sustituciones estuvieron presentes cerca de la eliminación del nucleótido, mayormente en 123 pb justamente de 3' a 5' de la eliminación del nucleótido individual. En contraste, los intrones de CtFAD2-2 en los genotipos de tipo salvaje y mutante compartieron una identidad de secuencia total de 99.5%, solamente con 12 sustituciones de nucleótidos y una segunda inserción o eliminación (indel). Esto indica que ya sea que hubiera ocurrido alguna presión de selección en el gen CtFAD2-l defectuoso en el mutante HO, o y tal vez, más probablemente, que la mutación de CtFAD2-l era de origen antiguo y se debió haber originado de una especie progenitora de cártamo tal como C. palaestinus.
Se ha descrito un mutante de EMS (S-901) derivado de la variedad comercial alta en oleico S-518 en US 5,912,416. Aunque estudios genéticos indicaron que el alelo denominado ol2 en este nuevo genotipo fue distinto de los alelos ol y olí en el locus OL, su naturaleza molecular no fue determinada por Weisker (US 5,912,416). El genotipo S-901 se caracterizó por un incremento del nivel de ácido oleico a 89.5-91.5% de ácidos grasos totales en semillas maduras. Hubo una reducción de ácidos grasos saturados, es decir, ácido palmitico disminuyó a aproximadamente 4% y el ácido esteárico disminuyó a aproximadamente 2.5%. Sin embargo, S-901 no presentó un fenotipo vegetal normal y padeció algún crecimiento y rendimiento compuesto. Morfológicamente fue más corto y las cabezas de flores fueron más pequeñas en comparación con su linea precursora S-518. También floreció tarde y contuvo menos aceites en las semillas.
Diseño de Marcadores para PCR Perfectos para Reproducción Alta en Oleico El polimorfismo de la secuencia de eliminación de nucleótido individual en el alelo de CtFAD2-l mutante, concluyó ser la mutación causativa responsable por el fenotipo HO, fue desarrollado como la base molecular de un marcador molecular altamente eficiente para rastrear el alelo ol mutante. Los inventores desarrollaron asi un ensayo de marcador molecular que permitió la identificación y selección del alelo ol mutante para propósitos de reproducción o propósitos de identificación varietal, aún cuando estaba presente en el estado heterocigótico. La selección asistida por el marcador molecular elimina asi la necesidad de producir una generación extra de plantas que deben ser cribadas para el fenotipo de ácido graso. La genetica simple combinada con ensayos de marcador molecular perfecto hará posible para reproductores de cártamo incorporar rápidamente el rasgo de oleico alto en su programa de reproducción.
Pareció que hubo insuficiente variación de secuencia en los exones de CtFAD2-l entre SU de tipo salvaje y el genotipo S-317 de oleico alto para facilitar la generación de un marcador diferencial basado en reacciones de PCR. Sin embargo, los inventores pudieron tener ventaja de la divergencia de secuencia relativamente alta en el intrón 5'UTR de CtFAD2-l entre los alelos OL, y ol . Hubo distenciones de secuencias altamente variables entre estos dos alelos que facilitaron el diseño de cebadores de PCR únicos. Los siguientes cebadores ilustrativos fueron diseñados para amplificar un producto especifico de 315 pb de longitud a partir de los genotipos de oleico alto, portando el alelo mutante olol, pero no el SU de tipo salvaje. HO- en el sentido: 5'-ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3' (SEC ID NO: 140); y HO-antisentido: 5'-GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3' (SEC ID NO: 141) (Figura 7). Otro par de cebadores ilustrativos específicos para el gen de tipo salvaje en la variedad SU el cual dio origen a un producto de PCR de 603 pb como sigue: HL en el sentido: 5'-AGTTATGGTTCGATGATCGACG-3' (SEC ID NO: 142); y HL-antisentido: 5'-TTGCTATACATATTGAAGGCACT -3' (SEC ID NO: 143) (Figura 7). Un par de cebadores derivados del gen KASH de cártamo, ctkasll- en el sentido: 5'- CTGAACTGCAATTATCTAGG-3' (SEC ID NO: 144) y ctkasll-antisentido 5'-GGTATTGGTATTGGATGGGCG -3' (SEC ID NO: 145) fueron usados como el control positivo para asegurarla carga igual y buen rendimiento de PCR de ADN plantilla.
Las condiciones de la reacción de PCR fueron 94°C durante 2 min, seguido por 40 ciclos de 94°C durante 30 seg, 58°C durante 30 seg y 72°C durante 30 seg. Los productos de reacción fueron separados por electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se visualizaron bajo rayos UV siguiendo la tinción con bromuro de etidio del gel. En las reacciones de amplificación se observó un fragmento de aproximadamente 300 pb en los cinco genotipos de oleico alto examinados, es decir S-317, S-517, CW99-OL, LeSaf496 y Ciano-OL, mientras que un fragmento tal estaba ausente para el genotipo SU de tipo salvaje. Contrariamente, un fragmento de aproximadamente 600 pb estaba presente en las amplificaciones para el SU de cártamo de tipo salvaje, pero no en cualquiera de las variedades de oleico alto probadas. Como un control positivo, una banda de 198 pb derivado del gen KASII fue amplificado en las reacciones para todas las lineas probadas. Las identidades del amplicon fueron verificadas por secuenciación de ADN.
La divergencia de secuencia en la región del intrón 5'UTR del gen CtFAD2-l entre los alelos de cártamo de tipo salvaje y de oleico alto, facilitó asi el desarrollo de un diagnóstico del marcador de PCR para la presencia o ausencia de la mutación CtFAD2-l. Estaba completamente ligado al alelo ol cualguiera de los antecedentes genéticos, esto es, fue un marcador perfectamente ligado. Sin embargo, el marcador molecular era un marcador dominante y consecuentemente el uso de ese marcador solo pudiera no permitir la distinción entre genotipos homocigótico y heterocigótico para el alelo ol . Para superar esto, otro par de cebadores de PCR fue diseñado, el cual amplificó solamente el alelo OL de tipo salvaje. Consecuentemente, el uso de dichos cebadores específicos de tipo salvaje en combinación con cebadores de PCR específicos de oleico alto permitió la distinción entre genotipos homocigóticos y heterocigóticos en el locus de CtFAD2-l.
La expresión de CtFAD2-l es Reducida Drásticamente en Genotipos de Oleico Alto En secciones anteriores, se mostró que CtFAD2-l fue expresado solamente en los embriones en desarrollo de las semillas en desarrollo y no detectablemente en otros varios tejidos examinados, incluyendo en hojas, raíces, flores, cotiledones e hipocotiledones derivados de plántulas jóvenes de cártamo. CtFAD2-l fue altamente expresado en semillas en desarrollo donde la velocidad del metabolismo de ácidos grasos fue alto, y condujo a acumulación de aceite activo que tenga mayormente C18:2 en un período de tiempo relativamente corto, CtFAD2-l tuvo su nivel de expresión más alto hasta aproximadamente el punto medio en el desarrollo de la semilla, con un nivel de expresión más moderado en ambas etapas temprana y tardía de desarrollo de la semilla.
Usando el método de ensayo de RT qPCR, el nivel de expresión del gen normalizada del gen CtFAD2-l fue medido en tres variedades de oleico alto, es decir S-317, Lesaff496-OL, y se comparó con la de semillas en desarrollo del genotipo SU de tipo salvaje. Como puede verse en la Figura 8, se detectó la expresión de CtFAD2-l en las tres etapas de embriones en desarrollo en el genotipo SU de tipo salvaje, con el nivel máximo de expresión observado en la etapa media de madurez, consistente con los resultados previos y verificando el patrón de transcripción temporal para este gen FAD2 clave. Sin embargo, Transcritos de CtFAD2-l fueron apenas detectables en las tres variedades S-317, Lesaff496 y CW99-OL, (Figura 8), indicando un nivel alto de inestabilidad de los transcritos de ARN procedentes de este gen en los embriones mutantes.
En contraste, los niveles de transcritos procedentes de CtFAD2-2 fueron similares a los genotipos de oleico alto y de tipo salvaje, que mostraron que la expresión de CtFAD2-2 no fue afectada en los embriones HO asi como también que demostraron que las preparaciones de ARN fueron adecuadamente puras para los ensayos. Por consiguiente, se concluyó que la expresión de CtFAD2-2 pudiera también contribuir a la desaturación D12 de ácidos grasos para almacenar lipidos en semillas de cártamo en desarrollo, pero a un nivel mucho más bajo que para CtFAD2-l en las semillas de tipo salvaje, asi como también estar involucrado en la desaturación D12 de ácidos grasos para lipidos de membrana en raíz, hoja y tallos. No hay evidencia de que la expresión de CtFAD2-2 era elevada en el mutante de oleico alto en respuesta a, o como compensación por, le pérdida de actividad de CtFAD2-l en las semillas en desarrollo de cártamo del mutante CtFAD2-l.
Los transcritos de CtFAD2-l Reducidos Drásticamente en Líneas de HO son causados por Degradación de ARN mediada Sin-Sentido (NMD, Non-Sense Mediated Deqradation) Los niveles reducidos drásticamente de transcritos de CtFAD2-1 en los embriones HO deben haber sido causados por degradación mediada por ARNm sin-sentido (NMD) de ARNms de CtFAD2-l, ya que se encontró un codón de detención prematuro en la parte media de la secuencia codificadora inmediatamente después de la eliminación del nucleótido individual. El sistema NMD se considera que es un mecanismo involucrado en la degradación de ARNms aberrantes que contienen un codón de terminación prematuro (PTC, Premature Termination Codon) que resulta de errores inesperados tales como mutaciones genómicas, errores transcripcionales, y desempalmes. Es un mecanismo que está presente universalmente en eucariotas y, en particular se ha estudiado extensivamente en levaduras y mamíferos. Es muy pobremente estudiado en plantas superiores, pero hay unos cuantos reportes que incluyen el gen inhibidor de tripsina Kunitz de soya (Kti3), gen de fitohe aglutinina (PHA, Phytohemagglutinin) de frijol común (Jofuku y colaboradores, 1989; Voelker y colaboradores, 1990), gen de ferredoxina de chícharo (FED1) (Dickey y colaboradores, 1994) y gen ceroso de arroz (Isshiki y colaboradores, 2001).
En estos experimentos de mostró que la mutación ol que activa el rasgo de ácido oleico alto en aceite de semilla de cártamo se correlacionó con bajos niveles de acumulación de ARNm de CtFAD2-l en las semillas en desarrollo. Las investigaciones previas indicaron que el alelo ol era semi recesivo, lo cual no fue consistente con un mecanismo silenciador del gen post-transcripcional mediado por ARNs pequeños. El gen silenciador involucra 21 a 24 ARNsi producido a partir de ARN de doble hebra, dando como resultado la transcripción de ARN horquilla o antisentido y puede actuar genéticamente como un locus dominante o semi dominante (Brodersen y Voinnet, 2006). Para confirmar que el mecanismo de la mutación ol fue distinta del gen silenciador relacionado con ARNi, se llevó a cabo una secuenciación de ARN pequeño, como sigue.
Se generaron dos bibliotecas de ARN pequeños, derivados de los genotipos S-317 de oleico alto y SU de tipo salvaje, usando ARN aislados conjuntados procedentes de embriones en desarrollo a media madurez. La secuenciación en volumen de las bibliotecas de ARN pequeños se efectuó con la teenología Solexa (Hafn y colaboradores, 2008). La secuenciación de estas dos bibliotecas se efectuó en el Secuenciador Illumina's Solexa y las muestras fueron corridas en paralelo. La secuenciación de bibliotecas de ARN pequeños de SU y S-317 generó un total de 23,160,261 y 21,696,852 lecturas crudas, respectivamente. El análisis de estas lecturas dio como resultado la identificación de 22,860,098 y 21,427392 secuencias que varían en longitud desde 18 a 30 nucleótidos (nt), respectivamente. Se determinaron presencia y distribución de ARN pequeños correspondientes a CtFAD2-l en las bibliotecas de SU y S-317. Solamente se detectaron niveles bajos, apenas detectables de ARNs pequeños correspondientes a CtFAD2-l a partir de ambas bibliotecas de ARN pequeños y se distribuyeron casi uniformemente sobre las regiones codificadoras de los genes CtFAD2-l. No hay diferencias claras entre las bibliotecas de oleico alto y de tipo salvaje.
A partir de estos datos, se concluyó que el gen silenciador post-transcripcional mediado por ARN pequeño no fue el principal mecanismo mediante el cual se evitó la acumulación de los transcritos de CtFAD2-l mutante.
Estudios de Expresión Transitoria en Hojas de N, Benthamiana Para investigar el fenómeno NMD adicional, los inventores efectuaron experimentos para la expresión transitoria de CtFAD2-l derivado de ambos genotipos de tipo salvaje y de oleico alto en hojas de N. Benthamiana.
Cada uno de los ORFs de CtFAD2-l fue insertado en orientación en el sentido en un vector binario pORE04 modificado bajo el control del promotor CaMV-35S. La cepa AGLl de Agrobacteriu tumefaciens que alberga ya sea al 35S:CtFAD2-l o su forma mutante 35S:CtFAD2-1A fue infiltrado en la parte inferior de las hojas totalmente expandidas e N. benthamiana junto con 35S:P19, como se describe en el Ejemplo 5. Después de un periodo de 5 dias de desarrollo adicional a 24°C, las regiones infiltradas fueron excisadas y se obtuvieron los ARNs totales a partir de las muestras usando un Mini Equipo NReasy (Qiagen). Para medir los niveles de ARN de FAD2-1, se llevaron a cabo ensayos de qPCR en Tiempo Real por triplicado usando el SuperMix-UDG para qPCR Platinum SYBR Green (Invitrogen) y se corrió el Sistema de Detección de Secuencia ABI 7900HT como se describió en el Ejemplo 1. Se llevó a cabo la PCR bajo las condiciones siguientes: un ciclo inicial a 48°C durante 30 min, luego 95°C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 seg y 60°C durante 60 seg. Los cebadores para el gen CtFAD2-l exógeno fueron: en el sentido: 5'- GTGTATGTCTGCCTCCGAGA -3' (SEC ID NO: 146); antisentido: 5'- GCAAGGTAGTAGAGGACGAAG - 3' (SEC ID NO: 147). Se usó un gen de referencia, CtKASII de cártamo, para normalizar los niveles de expresión; sus cebadores específicos fueron: en el sentido: 5'- CTGAACTGCAATTATCTAGG-3' (SEC ID NO: 144); y antisentido: 5'-GGTATTGGTATTGGATGGGCG-3' (SEC ID NO: 145). Se observaron altos niveles de expresión de CtFAD2-l en las hojas de N. benthamiana procedentes del gen 25S-CtFAD2-l derivado de la variedad SU de tipo salvaje. En comparación , se observaron niveles de expresión mucho más bajos para el gen 35S-CtFAD2-1D derivado del genotipo de ácido oleico alto.
Plantas del ecotipo Col-0 de A. Thaliana fueron transformadas con la cepa AGL1 de A. tumefaciens que porta un vector binario que aloja un promotor Fpl especifico de semilla que activa ya sea la región codificadora de CtFAD2-l o bien de CtFAD2-lA, de conformidad con el método de Clough y Bent (1998). Se aisló el ARN total de silicuas que contenían embriones en etapa de madurez media de progenie de las plantas transformadas resultantes usando un Equipo Mini RNeasy (Quiagen). Se hicieron estudios de expresión genética usando las preparaciones de ARN en los ensayos de RT-qPCR en Tiempo Real, se llevaron a cabo por triplicado como se describió anteriormente. Se observaron altos niveles de expresión de CtFAD2-l en las silicuas de Arabidopsis que expresan al Fpl-CTFAD2-1 derivado de SU, sin embargo, la expresión de Fpl-CtFAD2-lA derivado del genotipo de oleíco alto se redujo drásticamente en comparación.
Se demostró que ARNs pequeños específicos de CtFAD2-l no fueron producidos a niveles significativamente altos en semillas de cártamo de oleico alto en desarrollo en comparación con ARNs pequeños procedentes del gen de tipo salvaje, igualmente se piensa que el transcrito de CtFAD2-l mutante, se redujo drásticamente en cantidad. Por consiguiente, se concluyó que la reducción en el ARN de CtFAD2-l en el genotipo de oleico alto fue debido a NMD, distinto del mecanismo silenciador del gen post- transcripcional mediado por un ARN pequeño. El fenómeno NMD se observó también cuando la región codificadora del mutante fue expresada exógenamente en ya sea las hojas de N. benthamiana o bien las silicuas de Arabidopsis .
Ejemplo 8. Aislamiento de ADNcs de Cártamo, los cuales son Candidatos para Codificar a FATB Aislamiento de Secuencias de ADNc de FATB de Cártamo El aceite de semilla de cártamo contiene aproximadamente 7% de ácido palmitico. Este ácido graso es sintetizado en los plástidos de las células de la semilla en desarrollo, desde donde es exportado hacia el citosol de las células par su incorporación en triacilgliceroles. La enzima clave para exportar ácido palmitico es palmitoil-ACP tioestearasa, la cual hidroliza el enlace tioéster entre la porción palmitoilo y la proteina portadora de acilo (ACP) a la cual el grupo acilo está enlazado covalentemente mientras es sintetizado en el plástido. La enzima palmitoil-ACP tioestearasa pertenece a un grupo de enzimas dirigidas hacia el plástido soluble designado FATB.
En plantas de aceite de semillas, esta enzima presenta especificidad hacia ACP-acilo saturado de cadena corta como sustrato. Inicialmente se aisló un gen que codifica a la enzima FATB a partir de especies vegetales que acumulan ácidos grasos saturados de extensión media de cadena, tal como ácido táurico (C12:0) del árbol de la bahía de California ( Umbellularia califórnica) . Estudios subsecuentes demostraron que ortólogos de FATB estuvieron presentes en todos los tejidos vegetales, predominantemente en semillas, con especificidad de sustrato que varía desde C8:0-ACP a C18:0-ACP. En Arabidopsis y cultivos de semillas oleosas más templadas que incluyen cártamo, el ácido palmítico es el principal ácido graso saturado en el aceite de la semilla.
Para aislar ADNcs de cártamo que codifica a candidatos para FATB, la biblioteca de ADNc de semillas de cártamo en desarrollo fue cribada usando una sonda heteróloga que consiste de un fragmento de ADNc de FATB de algodón ( Gossypíum hirsutum) como se describió en el Ejemplo 1. Un ADNc de extensión total, denominado CtFATB-T12, fue aislado de la biblioteca de ADNs de semilla de cártamo. Este ADNc contuvo un marco de lectura abierto de 1029 nucleótidos de extensión, que codifica a un polipéptidos de 343 aminoácidos. Sus 5' y 3'UTRs fueron fueron de 236 nt y 336 nt de extensión, respectivamente. Se predijo que el polipéptido de CtFATB-T12 tuvo un péptido de tránsito predicho de aproximadamente 60 aminoácidos y un núcleo de 210 residuos de aminoácidos que contuvo dos repeticiones de una hélice y doblez de hoja de múltiples hebras común a las denominadas proteínas plegadas en perro caliente.
A partir del Compositae Genome Project (CGP)la base de datos de marca de secuencias expresadas (EST, Expressed Sequence Tag) para cártamo (cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2), se identificaron tres diferentes ESTs diferentes con homología con CtFATD-T12, es decir EL379517, EL389827, y EL396749. Cada uno de extensión parcial. Los genes correspondientes fueron designados CtFARB-A, CtFARB-B y CtFATB-C, respectivamente. El ADNc de CtFATB-T12 de extensión total aislado de la biblioteca de ADNc de semilla de cártamo fue idéntico en secuencia de nucleótidos al EST de CtFATB-C en su región sobrepuesta. Pareció que CtFATB-A fue más divergente en su secuencia de nucleótidos en comparación con las otras dos secuencias de CtFATB.
Perfil de Expresión de Genes CtFATB por Análisis por qPCR en Tiempo Real El perfil de expresión del gen de los tres genes CtFATB fue estudiado con qPCR en Tiempo Real como se indicó en el Ejemplo 1. Se diseñaron cebadores oligonucleótidos correspondientes a la única región de cada uno de los tres genes, incluyendo CtFATB-A, cebador en el sentido: 5'- AGAGATCATTGGAGACTAGAGTG-3' (SEC ID NO: 148); cebador antisentido: 5'-CCCATCAAGCACAATTCTTCTTAG-3' (SEC ID NO: 149); CtFATB-B, cebador en el sentido: 5'-CTACACAATCGGACTCTGGTGCT- 3' (SEC ID NO: 150); cebador antisentido: 5'-GCCATCCATGACACCTATTCTA-3 ' (SEC ID NO: 151); CtFATB-C , cebador en el sentido: 5' -CCTCACTCTGGGACCAAGAAAT-3' (SEC ID NO: 152); cebador antisentido: 5' -TTCTTGGGACATGTGACGTAGAA-3' (SEC ID NO: 153). Se efectuaron reacciones de PCR por triplicado como se describió en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 9, CtFATB mostró bajos niveles de expresión en hojas, raíces y en las tres etapas e embriones en desarrollo que fueron examinados. CtFATB-B fue activo en hojas y raíces, pero mostró expresión más baja en embriones en desarrollo que en hojas y raíces. Esto sugirió que este gen debe desempeñar solamente un papel menor, si desempeña alguno, en biosíntesis de ácidos grasos en semillas en desarrollo. En contraste, CtFATB-C demostró altos niveles de expresión a través de todos los tejidos examinados, particularmente en los embriones en desarrollo. Esto indica que CtFATB-C fue el gen clave que codifica a FATB para la producción de ácido palmítico en aceite de semilla de cártamo. Esto fue consistente con nuestra recuperación de solamente un clon de ADNc de FATB procedente de la biblioteca de embrión de semilla, es decir CtFATB-T12 el cual fue idéntico en secuencia a CtFATB-C. Con base en estos datos un fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb derivado de CtFATB-T12 (CtFATB-C) fue seleccionado como la secuencia del gen a ser usada en la preparación de constructos hpARN para sub-regulación de FATB en semillas de cártamo, como se describe en los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 9. Aislamiento y Expresión de FAD6 que Codifica a ADNc de Cártamo Aislamiento de la secuencia de ADNc de FAD6 de Cártamo Las composiciones de ácidos grasos distintos encontradas en lipidos de membrana cloroplástica y microsómica y aceites acumulados en semillas son el resultado de una intricada red metabólica que opera para controlar esta composición regulando la biosintesis de ácidos grasos y fluye a través de ambas rutas denominadas procariótica y eucariótica. Es claro que la enzima FAD2 microsómica tiene un papel importante convirtiendo oleato a linoleato en el ER siguiendo la exportación de ácido oleico procedente del plástido y conversión a CoA ésteres en el citoplasma. El cloroplasto omega-6-desaturasa (FAD6) es una enzima que desatura los ácidos grasos 16:1 y 18:1 a 16:2 y 18:2, respectivamente, sobre todo 16:1- o 18:1- que contiene lipidos de membrana de cloroplasto incluyendo fosfatidil glicerol, monogalactosildiacilglicerol, digalactosildiacilglicerol, y sulfoguinovosilglicerol. Se reportó que un mutante de Arabídopsis fado es deficiente en desaturación de 16:1 y 18:1 a 16:2 y 18:2, respectivamente, sobre todo lipidos de cloroplasto (Browse y colaboradores, 1989). Cuando el mutante fado fue desarrollado a baja temperatura (5°C), las hojas se volvieron cloróticas y la velocidad de crecimiento se redujo significativamente en comparación con el tipo salvaje (Hugly y Sommerville, 1992). Primero fue aislada una secuencia de ADNc codifica a FAD6 a partir de Arabídopsis por Falcone y colaboradores (1994). Desde entonces, ADNcs que codifican a FAD6 y genes FAD6 han sido aislados a partir de varias especies vegetales incluyendo Brassica napus , Portulaca olerácea, soya, y Ricinus communis.
A fin de aislar un clon de ADNc que codifica a la oc>6 desaturasa de cloroplasto codificada por el gen FAD6 de cártamo, la base de datos CPG fue investigada para secuencias homologas. Se identificaron ocho secuencias EST, es decir EL378905, EL380564, EL383438, EL385474, EL389341, EL392036, EL393518, EL411275, y se conjuntaron en una secuencia contigua individual de 808 nt. Esta secuencia tuvo un extremo 5' intacto pero estaba incompleta en el extremo 3'. El ADNc de extensión total fue obtenido subsecuentemente a través de amplificación por PCR de 3'RACE usando, como plantilla, ADN extraído de una biblioteca de ADNc lambda elaborada a partir de semillas de cártamo en desarrollo (SU). Las condiciones de PCR fueron como se describe en el Ejemplo 2. Se usó un oligocebador individual, designado CtFAD6-2 en la reacción de amplificación en combinación con el cebador Directo M13 ya que la secuencia para este cebador estaba presente en el vector de la biblioteca de ADNc. La secuencia del cebador de CtFAD6-2 fue: 5'-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG-3' (SEC ID NO: 154). Se obtuvo un ADNc de 1545 pb , el cual tuvo un marco de lectura abierto de 1305 pb que codificó a un polipéptido de FAD6 candidato de 435 aminoácidos. Este polipéptido compartió entre 60 y 74% la identidad de secuencia de aminoácido con otros polipéptidos de FAD6 de vegetales clonados. Se generó mediante el vector NTI (Figura 10), un dendograma que mostró la relación filogenética entre la secuencia de FAD6 de cártamo y la FAD6 plastidial D12 desaturasa identificados en vegetales superiores.
Perfil de Expresión de CtFAD6 mediante Análisis por qPCR en Tiempo Real Se estudió el perfil de expresó de CtFAD6 por RT-qPCR en Tiempo Real, el cual se levó a cabo usando Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG (Invitrogen) y se corrió en un Sistema de Detección de Secuencia ABI 7900HT con parámetros faltantes como se describe en el Ejemplo 1. Los cebadores usados fueron: ctFAD6-S2: 5'-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG -3' (SEC ID NO: 155) y ctFAD6-a2: 5' -GTTCCAACAATATCTTCCACCAGT- 3' (SEC ID NO: 156). Se efectuaron las reacciones por triplicado en volúmenes totales de 10 mL que contenían 20 ng de ARN plantilla total, 800 mM de cada cebador, 0.25 pL de trasncrítos inversos y 5 pL de reactivos de mezcla maestra para RT-PCR en una etapa. Las condiciones para RT y amplificaciones fueron 48°C durante 30 min, luego 95°C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 seg y 60°C durante 60 seg. Se usó la expresión de un gen CtkasII de cártamo de referencia para normalizar los niveles de expresión de de FAD6. Los cálculos se hicieron como se describe en el Ejemplo 1.
Los análisis mostraron que CtFAD6 fue expresado a niveles relativamente bajos en hojas, raíces y tres etapas consecutivas de embriones en desarrollo. Los niveles de expresión bajos observados en semillas en desarrollo fueron consistentes con la noción de que FAD6 debe tener un papel relativamente menor en la desnaturalización de oleato en semillas.
Ejemplo 10. Diseño y Preparación de Constructos Genéticos para Silenciar Genes de la Biosintesis de Acidos Grasos en Cártamo Los ARNs horquilla (ARNhp) son un tipo de molécula de ARN que ha sido usada extensivamente para reducir la expresión genética en plantas. Los ARNs horquillas son transcritos típicamente en células vegetales procedentes de un constructo que contiene una repetición invertida de una secuencia derivada de un gen a ser silenciado. El transcrito de ARNhp por consiguiente tiene secuencias en el sentido y antisentido complementarias que hibridizan para formar una región de ARN de doble hebra (ARNds) unida por una secuencia cíclica. Dichas estructuras de ARNds son procesadas mediante maquinarias silenciadoras endógenas en las células vegetales para formar moléculas de ARN pequeñas de aproximadamente 21 a 24 nucleótidos correspondientes en secuencia al gen a ser reducido en actividad. Estos ARNs pequeños pueden formar complejos con proteínas endógenas que silencian específicamente al gen de interés. Dicho silenciamiento puede tener lugar al nivel transcripcional, mediado por la metilación de ADN de partes del gen objetivo, al nivel post-transcripcional por degradación de ARNm objetivo, o por enlace al ARNms para inhibir su translación y reducir así la síntesis de la proteína codificada por el gen. Cuando el ARNhp incluye una secuencia que es común entre miembros de una familia genética, el ARNhp puede silenciar a cada uno de los genes que tiene la secuencia.
El cártamo tiene una gran familia de genes FAD2, con al menos 11 miembros identificados como se describe en la presente (Ejemplos 2 a 6). El cártamo también tiene múltiples genes que codifican a polipéptidos de FATB, con al menos tres miembros identificados (Ejemplo 8), y al menos un gen FAD6 (Ejemplo 9). Realmente, los experimentos descritos anteriormente pueden no haber identificado a todos los miembros de las familias de genes en cártamo. Para determinar cuales miembros de las familias del gen FAD2 y FATB fueron involucrados en la biosintesis de ácido linoleico o de los ácidos grasos saturados encontrados en aceite de semilla de cártamo, particularmente ácido palmítico, y si FAD6 también estaba, se elaboraron varios constructos genéticos para expresar a moléculas de ARNhp en semilla de cártamo, para silenciar Varias combinaciones de los genes FAD2, FATB y FAD6. Cada uno de estos constructos fue diseñado para ser expresado específicamente en semillas de cártamo en desarrollo durante el período de síntesis de aceite. Esto se hizo usando ya sea promotores extraños o promotores aislados de cártamo para expresar los constructos, los cuales fueron introducidos en cártamo mediante la transformación de la planta.
Construcción de pCW600 Se diseñó un vector de expresión binario vegetal para la expresión de transgenes en semillas usando el promotor de un gen Olesoinl de Arabidopsis (Anotación del gen del sitio web TAIR At4g25140) (SE ID NO: 52). El promotor aislado fue de 1192 pb de extensión iniciando desde el nucleótido 12899298 en No. de Acceso NC003075.7, excepto que en la secuencia de 1198 pb, se omitieron 6 pb para evitar secuencias de restricción de digestión común para ayudar a etapas de clonación posteriores. El promotor de AtOleosin ha sido usado previamente para expresión fuerte, especifica de transgenes de semilla de cártamo y especies Brassica (Nykiforuk y colaboradores, 1995; Vanrooijen y Moloncy, 1995). Este promotor será probablemente un promotor bidireccional, que dirige la expresión fuerte especifica de semilla de regiones codificadoras unidas a ambos extremos del fragmento promotor. El promotor de oleosina de Arabidopsis comparte características con el promotor oleosina de Brassica napus, caracterizado por tener una naturaleza bi-funcional (Sadanando y colaboradores, 1996). El promotor fue sintetizado químicamente, clonado en pGEMT-Easy y el fragmento EcoRI que contenía el promotor fue debilitado vía la reacción de relleno de la enzima del fragmento de Klenow, y ligado en el sitio HindIII debilitado de Klenow de pCW265 (Belide y colaboradores, 2011), generando pCW600 (AtOleosinP::vacío). Este vector tuvo un gen marcador seleccionable que codificó a una higromicina fosfotransferasa (HPT), permitiendo así la selección para tolerancia a higromicina en cultivo de tejido durante el proceso de transformación. El vector también incluyó un gen 35S::GFP que permitió la selección de células o tejidos transformados por fluorescencia bajo iluminación de rayos UV. Insertando el promotor AtOleosin, el vector fue diseñado para expresión de una región codificadora de interés que pudiera ser insertada en un sitio de clonación múltiple situado de 5' a 3' del promotor y de 3' a 5' de una señal de poliadenilación nos (nos3' ) . Este vector sirvió como el vector de estructura principal para los constructos pCW602 y pCW603 descritos posteriormente.
Construcción de pXZP410 Un promotor de linina de lino (US 7,642,346) (SEC ID NO: 53) fue insertado como un fragmento NotX-Xhol en el vector binario pT7-HELLSGATE12 (Weslcy y colaboradores, 2001), generando el vector binario silenciador de Gateway pXZP410. El vector pXZP410 tuvo un gen marcador seleccionable que confirió resistencia a kanamicina durante el cultivo de tejido y que permitió expresión especifica de semilla de constructos de ARN horquilla bajo el control del promotor de linina. El vector tuvo dos intrones, uno en la orientación en el sentido y el otro en la dirección antisentido con respecto al promotor, y tuvo los sitios recombinacionales AttLl y AttL2 que flanquean a los intrones.
Para elaborar un constructo silenciador de pXZP410, dos copias de una secuencia del gen objetivo en el vector de entrada Gateway a ser silenciado fueron insertados en el vector, uno insertado en 5' y el otro en 3' de los dos intrones en orientación invertida con respecto a cada uno de los otros para formar una repetición invertida. Los sitios recombinacionales permitieron fácilmente la inserción de las dos copias usando los sistemas de clonación de recombinasa de Gateway (Invitrogen, Carlsbad, USA), como se describió previamente (Weslcy y colaboradores, 2001). Este vector pXZP410 se usó como un vector de estructura principal para producir pCW631 y pCW632 que se describen posteriormente.
Construcción de pCW571 Una secuencia de 300 pb (SEC ID NO: 50) idéntica a una región del gen CtFATB-3 de cártamo correspondiente a los nucléotidos 485-784 del ADNc de CtFATB-3 fue sintetizado químicamente e insertado en pENTR/D topo (Invitrogen) de conformidad con las instrucciones del fabricante, generando un clon de entrada de Gateway designado pCW569. Un fragmento de 756 pb (SEC ID NO: 49) del ADNc para CtFAD2-2, que corresponde a los nucleótidos 427-1182, fue sintetizado y amplificado por RT-PCR de ARN aislado a partir de semillas de cártamo en desarrollo. Los cebadores fueron D28-PstI-5 (5'- CCTGCAGGTACCAATGGCTCGACGACACTG-3') (SEC ID NO: 157) y D28- AscI-3 (5'- CGGCGCGCCTTCACCTCCTCATCTTTATCC-3') (SEC ID NO: 158) respectivamente. Los cebadores incluyeron los sitios de las enzimas de restricción 5' PstI y 3'AscI, permitiendo asi la inserción del fragmento amplificado en los sitios correspondientes de pCW569, que generaron pCW570. Este vector contuvo las regiones fusionadas de los genes CtFATB y CtFAD2-2 como un fragmento de 1080 pb flanqueado por sitios recombinacionales de los genes CtFATB y CtFAD2-2 como un fragmento de 1080 pb flanqueado por los sitios recombinacionales, AttLl y AttL2. Dos copias de este fragmento FATB-FAD2-2 fueron entonces insertadas en pXZP410, la segunda copia invertida con respecto a la primera, usando LR clonase de conformidad con las instrucciones del proveedor (Invitrogen, Carlsbad, USA). El plásmido resultante pCW571 tuvo el promotor de linina de lino para transcribir la región de repetición invertida de manera especifica de semilla, a fin de producir un ARNhp para reducir la expresión de los genes CtFATB y CtFAD2-2 en semillas.
Construcción de pCW603 El fragmento de AND procedente de pCW571 que contenia la repetición invertida de los fragmentos CtFATB-CtFAD2-2 con los dos intrones que intervinieron fueron cortados por Spel, debilitados usando el fragmento de ADN polimerasa de Klenow I y fue ligado en el sitio RcoRV de pCW600, generando pCW603. Este constructo pCW603 fue capaz de expresar un ARNhp bajo el control del promotor AtOleosina en semillas de cártamo, para reducir la expresión de CtFATB y CtFAD2-2.
Construcción de pCW581 Un fragmento de 590 pb (SEC ID NO: 51) de ADN elaborado de un fragmento de CtFAD6 de 290 pb, correspondiendo a los nucleótidos 451 a 750 del ADNc para CtFAD6, y un fragmento de 300 pb de CtFATB, en cuanto a pCW571, fue sintetizado guimicamente e insertado en pENTR/D topo, generando pCW579. Un fragmento de CtFAD2-2 de 780 pb, como se describió anteriormente para pCW570, fue clonado en el sitio AscI de pCW579, generando pCW580. Este constructo fue un vector clon de entrada que contenía las secuencias de los genes CtFATB, CtFAD6 y CtFAD2-2 unidos en ese orden como un fragmento de ADN de 1370 pb con sitios recombinacionales de flanqueo, AttLl y AttL2. Dos copias de este fragmento de FATB-FAD6-FAD2-2 fueron entonces insertadas como una repetición invertida en pXZP410 usando LR clonasa, generando pCW581. Este constructo pCW581 era un vector binario que tenía un promotor de linina de lino operablemente unido a la repetición invertida, el cual después de transcripción en células de semilla de cártamo en desarrollo fue capaz de expresar un ARNhp para reducir la expresión de los genes CtFATB, CtFAD6 y CtFAD2-2.
Construcción de pCW602 El fragmento de ADN que contiene la repetición invertida de las regiones de CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2 unidas, con los dos intrones que intervinieron, fue cortado enzimátícamente de pCW571 con Notl, debilitado usando el fragmento de Klenow I y luego ligado en el sitio EcoRV de pCW600, generando pCW602. pCW602 tiene las secuencias de CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2 bajo el control del promotor de AtOleosin, en contraste con pCW581 el cual tuvo el mismo diseño y fragmentos de gen excepto con el promotor de linina.
Construcción de pCW631 y pCW632 Aunque el promotor de linina fue útil para expresar a ARNhp en semillas, ambas pCW571 y pCW581 tuvieron el marcador seleccionable que confirió tolerancia a kanamicina. En experimentos de transformación de cártamo preliminares, se observó que los explantes no fueron suficientemente susceptibles a kanamicina. Por consiguiente, el "cassette" de resistencia a kanamicina de pCW571 y pC 581 fue reemplazado con un "cassette" de resistencia a higromicina como el marcador seleccionable. El gen de resistencia a higromicina elaborado del promotor enCUP: higromicina:región de poliadenilación nos3' fue cortado de pCW265 con digestión de restricción Spel-Avrll y se usó para remplazar el "cassette" de resistencia a kanamicina en pCW571 y pCW581, generando asi pCW631 y 632, respectivamente.
En resumen, los constructos usados en el primer grupo de transformaciones de cártamo contuvieron los siguientes elementos principales: Vector Promotor Fragmentos de gen en la repetición invertida pCW631 linina CtFAD2-2 y CtFATB pCW632 linina CÍFAD2-2, CtFAD6 y CtFATB pCW602 AtOleosin CtFAD2-2, CtFADó y CtFATB pCW603 AtOleosin CtFAD2-2 y CtFATB Estos constructos fueron introducidos en la cepa AGL1 de Agrobacterium y usados para transformar cártamo como se describió en el Ejemplo 1, con los resultados que siguen.
Ejemplo 11. Transformación de Cártamo con Constructos Silenciadores de Gen Los constructos genéticos fueron usados para transformar cotiledones e hipocotiledones excisados de la variedad S317 de cártamo, usando el método mediado por Agrobacterium con rescate de los brotes regenerados usando injertos (Belide y colaboradores (2011). Más de 30 retoños transformados independientes que crecieron sobre reservas de raíces no transformadas (en lo sucesivo denominadas plantas To) fueron regeneradas por el vector pCW603 y desarrolladas hasta madurez como se describe en el Ejemplo 1. La integración de los T-ADNs en los vástagos de cártamo T0 fue verificada por PCR usando cebadores específicos del vector T-ADN como se describió en Belide y colaboradores (2011). La mayoría de las plantas encontradas que carecían del T-ADN usado en la transformación particular, se presumieron ser "exclusiones" de la selección de higromicina durante la regeneración en cultivo de tejido, fueron descartadas. Sin embargo, algunas fueron mantenidas como plantas "nulas" o controles negativos para comparación con las plantas transformadas. Estas plantas control fueron tratadas bajo las mismas condiciones que el material transformado en cultivo de tejido, injerto y condiciones de invernadero.
Ejemplo 12. Análisis de la Composición de Acidos Grasos de Aceite de Semillas de Cártamo Transgenico Se condujo el análisis de ácidos grasos sobre semillas Ti obtenidas de las plantas de cártamo transformadas, como sigue. 30 plantas T0 independientes transformadas con pCW603 en el respaldo genético de S317 fueron desarrolladas en invernadero y auto-fertilizadas para producir semillas. Hasta 10 semillas maduras procedentes de una cabeza de semilla individual de cada planta T0 fueron analizadas para la composición del lípido usando análisis por GC como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados del análisis de la composición de ácidos grasos de semillas de cártamo S317 transformadas con pCW603 se resumen en la Tabla 13. Como se esperó que cada planta de cártamo To transformada fuera heterocigótica por el T-ADN y por consiguiente, produzca una población segregadora de semillas Ti, se esperó que el análisis de 5 a 10 semillas de cada planta incluyera algunas semillas nulas (segregantes). Dichas semillas segregantes nulas fueron buenos controles negativos en este experimento ya que han crecido y se han desarrollado en la misma cabeza de semilla que las semillas transformadas procedentes de la misma planta. Como se puede observar de los datos de la Tabla 13, se observaron niveles de ácido oleico superiores a 87% (como un por ciento en peso del contenido de ácidos grasos totales) en 6 lineas independientes (Líneas 9, 12, 14, 20, 34 y 36) de las 30 líneas generadas. Muchas de las semillas transformadas tuvieron contenidos de ácido oleico en el intervalo de 87 a 91.7%, con niveles de ácido linoleico de 2.15 a 5.9% y niveles de ácido palmítico de 2.32 a 3.45%. Los niveles de otros ácidos grasos en las semillas no fueron significativamente diferentes a los controles no transformados. El contenido máximo de ácido oleico observado en la semilla de cártamo Ti transformada con pCW603 fue 91.7%, en comparación con aproximadamente 77% en semillas control S317 no transformadas y las semillas segregantes nulas. Notablemente, los lipidos de las semillas también se redujeron significativamente en los niveles de 16:0, disminuyendo desde 4.5% disminuyó hasta tan bajo como 2.3%. Los perfiles de ácidos grasos de las fracciones TAG de los aceites de las semillas que se purificaron sobre placas de TLC, no fueron significativamente diferentes a las del lipido total extraído de las semillas.
Se calcularon dos métricos con base en la composición de ácidos grasos totales de las semillas de cártamo, representado los ácidos grasos más importantes en el aceite de semilla. Estos fueron la proporción de desaturación de ácido oleico (OOP) y la proporción de palmítico+linoleico a oleico (PLO). Estos fueron calculados para cada semilla y los datos se muestran en la Tabla 13. Semillas de tipo salvaje (S317, no transformadas) y los segregantes nulos tuvieron una proporción de ODP de aproximadamente 0.1500 y un valor de PLO de aproximadamente 0.2830. Las semillas transformadas con T-ADN a partir de pCW603 exhibieron reducciones significativas en los valores de ODP y PLO. Trece semillas generadas a partir de 6 eventos independientes tuvieron un valor de PLO de menos de 0.1 y un ODP de menos de 0.06. Una línea transformada tuvo un ODP de 0.0229 y un PLO de 0.0514.
Semillas individuales de individuos maduros de una línea de élite, S317 transformada con pCW603, línea 9, y la S317 precursora no transformada fueron sometidas a análisis lipidómico de LC-MS. Estos análisis mostraron claramente que el aceite de las semillas transformadas con el constructo de ARNi horquilla de AtOleosinp:CtFATB-CtFAD2-2 tuvo composiciones de TAG y DAG dramáticamente alterado (Figuras 11 y 12). Hubo un claro incremento en el nivel de TAG (54:3) y un decremento de TAG (54:5), el cual fue predominantemente 18:1/18:1/18:1-TAG (trioleina) y 18:1/18:2/18:2-TAG, respectivamente. Entre las semillas analizadas por LC-MS, el contenido de trioleina (=54:3) en TAG fue tanto como 64.6% /% mol) a niveles máximos de ácido oleico (< 90%, Tabla 14) para semillas procedentes de la línea silenciadora de ARNi, en comparación con el precursor no transformado (S-317) que tuvo niveles de trioleina que varían entre 47% a 53%. El segundo TAG que contenía oleato, más abundante fue 18:0/18:1/18:1, seguido por 18:1/18:1/18:2. Las diferencias más claras entre estos aceites de cártamo pudieran también verse en la clase lipídica de DAG. El nivel de DAG (36:1) fue duplicado en el aceite de semilla procedente de la semilla transformada en comparación con la semilla precursora, mientras que DAG (36:4) se redujo hasta 10%. DAG (36:1) es predominantemente 18:0/18:1-DAG y DAG (36:4) es 18:2/18:2-DAG (di-linoleato). Los DAGs en los lípidos de la semilla fueron solamente un componente menor, como los niveles de TAGs totales fueron aproximadamente 100 veces más altos que DAGs totales (Tabla 15).
Desarrollo y morfología de plantas transgenicas Los transformantes de cártamo T0 que contenían el T-ADN procedente de pCW603 generaron semillas Tc que segregadas por el T-ADN produjeron un grupo de segregantes homocigotos, hemicigotos y nulos. La proporción de estas sub poblaciones dependió del número y ligaduras de eventos de inserción de T-ADN en las plantas To, como se esperó de conformidad con la genética Mendeliana. Por consiguiente semillas TI procedentes de cada una de las plantas T0 fueron analizadas individualmente. El análisis de los perfiles de lípidos procedentes de semillas individuales, mostraron claramente que unas cabezas de semillas individuales contuvieron ambos eventos, nulos y transgénicos.
Tabla 13. La composición de ácidos grasos del lipido de semillas de cártamo Ti individuales transformadas con el T-ADN de pCW603 en la S-317 original. El nivel de cada ácido graso (%) fue expresado como un porcentaje del contenido de ácidos grasos totales. 15 Tabla 13 (Continuación) 15 Tabla 13(Continuación) 15 Tabla 13 (Continuación) 15 Tabla 13 (Continuación) 15 Tabla 13 (Continuación) ^Muestras marcadas con esta convención: TS603.12(5) denota la planta transformada con el vector pCW603, evento 12, semilla 5. Muestras marcadas como 'nulas' son determinadas vía análisis por PCR como exclusiones no transformadas en la transformación de la planta.
**Métrico de PLO calculado como (16.0+18:2)/18:1 Oí 4 10 ***Métrico de ODP calculado como (18:2+18:3)/(18:1+19¿8:2+18:3).
Tabla 14. Composición de ácidos grasos en lipido total de semilla individual (% de ácidos grasos totales).
Muestra C16:O C18:O C18:l C18:ldll C18:2 C18:3 C20:O C20:l S317 Semilla 1 5.21 2.35 77.36 0.88 14.20 5.00 o.oo o.oo S317 Semilla 2 5.08 3.04 77.20 0.80 13.88 0.00 0.00 0.00 S317 Semilla 3 5.00 2.65 78.89 0.78 12.67 0.00 0.00 0.00 TS603.9 Semilla 1 3.76 3.07 87.93 0.91 4.34 0.00 0.00 0.00 TS603.9 Semilla 2 3.33 2.98 89.97 0.93 2.80 0.00 0.00 0.00 TS603.9 Semilla 4 3.61 4.28 88.20 0.87 3.05 0.00 0.00 0..00 TS603.9 Semilla 5 3.61 3.13 88.45 0.92 3.38 0.00 0.50 0.00 TS603.9 Semilla 6 4.45 3.04 85.50 0.90 5.62 0.00 0.51 0.00 Tabla 15. Cantidades de TAG y DAG relativas Muestra Proporción de TAG/DAG S317 Semilla 1 60.4 S317 Semilla 2 84.7 S317 Semilla 3 71.2 TS603.9 Semilla 1 117.5 TS603.9 Semilla 2 124.2 TS603.9 Semilla 4 97.8 TS603.9 Semilla 5 96.5 TS603.9 Semilla 6 95.9 Semillas procedentes de algunas de las lineas transgénicas fueron desarrolladas bajo condiciones controladas (temperatura, suelo, humectación óptima y fertilizante, pero bajo iluminación natural) en el invernadero para observar la morfología y velocidad de crecimiento de la planta. No se observaron diferencias fenotípicas entre las plantas TI transformadas y sus hermanos segregantes nulos. Las semillas transformadas germinaron a la misma velocidad que las semillas no transformadas y produjeron plántulas que tienen la misma velocidad de crecimiento precoz (vigor). Todas las semillas sembradas se establecieron y crecieron en plantas totalmente fértiles. Se preparó el ADN de las puntas de hojas verdaderas de plantas individuales de la generación TI y se condujo el análisis por PCR para determinar la proporción de plantas transgénicas y nulas. Como se esperó, se identificaron los segregantes nulos.
Este análisis fenotípico indicó que plantas de cártamo transformadas con el T-ADN de pCW603 y que expresan a los transgenes no sufrieron efectos perjudiciales en comparación con segregantes nulos.
Las semillas de cártamo de la generación T2 fueron probadas para composición del aceile. Las semillas de varias plantas que tienen altos niveles de ácido oleico (Tabla 13) se desarrollaron en plantas maduras que produjeron semillas de segunda generación (semillas T2). Estas semillas fueron cosechadas cuando maduraron y se analizaron para composición de ácidos grasos de su aceite. Los datos se dan en la Tabla 16. Aunque la semilla presentó hasta aproximadamente 92% de ácido oleico, la semilla T2 alcanzó 94.6% de ácido oleico. El incremento observado en la generación T2 en relación a la generación TI puede haber sido debido a la homocigotosidad del transgen, o simplemente al gran número de lineas analizadas. Se usó el análisis por tinción Southern en cada linea transformada, y se seleccionaron lineas con una inserción de T-ADN individual. El contenido de aceite de semillas T2 no es significativamente diferente a la del de semillas no transformadas control de los mismos antecedentes genéticos y crecieron bajo las mismas condiciones.
Análisis de semillas de cártamo transformadas con el T-ADN de pCW631 La semilla Ti de la variedad S-317 de cártamo transformada con pCW631 fue analizada de manera similar para su composición de ácidos grasos. La Tabla 17 muestra los datos y los métricos de PLO y ODP para estas semillas. El contenido de ácido oleico en el lipido de estas semillas era de hasta 94.19%. El contenido de ácido palmitico de la semilla TS631-01 TI (21) que tuvo el nivel máximo de ácido oleico fue 2.43%, el ODP fue de 0.0203 y el PLO fue de 0.0423. Estos análisis demostraron que el constructo de ARN horquilla en pCW631 generalmente produjo niveles de ácido oleico más altos que el constructo en pCW603 cuando se transformó en cártamo del antecedente genético S-317. Esta observación indicó que el promotor de linina usado en pCW631 expresó al ARN horquilla más fuertemente o con un mejor tiempo de expresión, o una combinación de ambos, en relación con el promotor de AtOleosin usado en pCW603.
Las semillas T2 de la variedad S-317 transformada de cártamo con el T-ADN procedente de pCW631 fueron analizadas por GC. Niveles de ácido oleico de hasta 94.95% fueron observados con un ODP de 0.01 y PLO de 0.035.
Semillas y plantas de cártamo transformadas con los T-ADNs procedentes de los constructos pCW632 y pCW602 se analizaron en la misma manera que para la semilla y plantas transformadas con pCW603 y pCW631. E análisis por GC de la semilla TI de la variedad S-317 transformada con pCW632 de cártamo mostró nivel de ácido oleico de hasta 94.88%, con ODP de 0.01012 y PLO de 0.0362. Sus semillas T2 mostraron hasta 93.14% de ácido oleico, con ODP de 0.0164 y PLO de 0.0452.
Extracción de volúmenes más grandes de aceite de semilla de algodón Se cosecharon semillas T4 procedentes de la linea transgénica homocigótica designada TS603-22.6, y se les extrajo el aceite total de la semilla usando el equipo de extracción Soxhlet como se describe en el Ejemplo 1. Se analizaron alícuotas del aceite extraído post GC (Tabla 18). Se recuperó un total de 643 gramos de aceite. Las extracciones de 2, 3, 5, y 6 fueron conjuntadas, mientras que las extracciones 4, 7 y 8 fueron conjuntadas en un lote separado. Las mezclas fueron analizadas adicionalmente para composición de ácidos grasos por GC. Los datos se muestran en la Tabla 18.
Ejemplo 13. Diseño y Preparación de Constructos Adicionales de Genes Silenciadores Con base en los resultados descritos en los Ejemplos 10 - 12, otros constructos de gen silenciados fueron preparados como sigue, para incrementar el contenido de ácido oleico del aceite de semilla de cártamo y disminuir las proporciones de ODP y PLO. Estos constructos de genes silenciadores incluyó combinar promotores diferentes, procedentes de fuentes diferentes a cártamo, así como también procedentes de cártamo, para lograr la máxima reducción en la expresión de los genes FAD2-2, FATB-3 y FAD6, y adicionalmente silenciar más de un gen FAD2 además del FAD2-2. Estos constructos son usados para transformar variedades de cártamo que han inactivado versiones del gen CtFAD2-l endógeno, tal como S-317, Ciano-OL y Lesaff496.
Construcción de pVW70Q Este vector de expresión binario vegetal tiene dos promotores extraños (no de cártamo) con diferentes pero sobrepuestos patrones de expresión en semilla de cártamo, en vez de un promotor, para producir ARN horquilla para reducir la expresión de los CtFATB y CtFAD2-2 endógenos. Los dos promotores son el promotor AtOleosin y el promotor de linina de lino y los dos "cassettes" de expresión de ARNhp son de la misma molécula de T-ADN. Este vector es construido por digestión de restricción del "cassette" de expresión de gen de ARNhp procedente de pCW631, que tiene el promotor de linina y la región codificadora de QRNhp para silenciar a CtFAD2-2 y CtFATB, e insertándolo en el T-ADN de pCW603, generando asi un constructo que codifica a un ARN horquilla contra estos dos genes de cártamo. Este constructo es usado para transformar variedades de cártamo tales como Lesaff496, Ciano-OL y S-317.
Tabla 16. Composición de ácidos grasos de lipidos de semillas T2 de cártamo individuales transformadas con T-ADN de pCW603 en el S-317 precursor. El nivel del ácido graso (%) fue expresado como un porcentaje del contenido de ácidos grasos totales.
Muestra C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO 5 TS603-22.3 T2 (4) 2.4 0.9 94 .6 1.7 0.0 0.2 0.0 0.0181 0.043956 TS603-22 .6(5) 2.5 1.0 94 .5 2.0 0.0 0.0 0.0 0.0214 0.048069 TS603-22 .6(2) 2.1 0.9 94 .4 2.5 0.0 0.0 0.0 0.0266 0.04934 TS603-22 .6(4) 2.4 1.0 94 .3 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0239 0.049028 (V TS603-22 .4 T2 (2) 2.2 1.5 94 .3 1.8 0.0 0.0 0.1 0.0200 0.042739 10 TS603-22 .6 T2 (20) 2.2 1.1 94 .2 2.4 0.0 0.0 0.0 0.0256 0.048622 TS603-22 .05(4) T2 2.2 1.4 94 .2 2.0 0.0 0.1 0.0 0.0212 0.044211 TS603-22 .8 T2 (1) 2.1 1.1 93 .9 2.5 0.2 0.1 0.0 0.0263 0.04839 TS603-22 .6 T2 (10) 2.8 1.o 93 .9 2.1 0.0 0.0 0.0 0.0223 0.052359 TS603-22 .6 T2 (6) 2.9 1.1 93 .9 2.0 0.0 0.0 0.0 0.0214 0.052318 TS603-22 .05(1) T2 2.2 1.3 93 .8 2.2 0.1 0.2 0.0 0.0240 0.04783 15 TS603-22. 6 T2 (13) 2.9 1.2 93 .8 1.7 0.0 0.2 0.0 0.0185 0.049564 Tabla 16 (Continuación) Muestra C16 : O C18 : 0 C18 : 1 C18 : 2 C18:3 C20 : 0 C20 : 1 ODP PLO TS603-22 .6 T2 (16) 2.9 0.9 93.8 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0249 0.055517 TS603-22 .4 T 2 ( 1 ) 2.5 1.5 93.7 1.9 0.1 0.1 0.0 0.0204 0.046933 5 TS603-22. 6 (1) 2.7 1.2 93.7 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0241 0.0524 97 TS603-22.3 T 2 (5) 2.5 1.1 93.6 2.6 0.0 0.0 0.0 0.0278 0.05449 TS603-08 .2 (4) 2.2 0.8 93.6 3.3 0.0 0.0 0.0 0.0355 0.05861 TS603-22 .6 T 2 ( 9 ) 2.9 1.2 93.5 2.2 0.0 0.2 0.0 0.0235 0.054815 TS603-22 .6 T 2 (19) 2.9 1.1 93.5 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0245 0.055483 TS603-22.4 T2 ( 3 ) 2.4 1.0 93.5 2.8 0.1 0.0 0.0 0.0299 0.056044 10 TS603-22.1 T 2 (2 ) 2.7 0.9 93.5 2.9 0.0 0.0 0.0 0.0306 0.05928 1 TS603-22 .6 T 2 ( 14 ) 3.1 1.5 93.4 2.1 0.0 0.0 0.0 0.0222 0.054943 TS603-08. 2 (3) 2.7 0.9 93.4 2.9 0.0 0.0 0.0 0.0306 0.059851 TS603-22 .05(5) T 2 2.3 1.6 93.4 2.5 0.2 0.0 0.0 0.0267 0.051234 TS603-22 .6 T 2 (15) 3.0 1.2 93.3 2.4 0.0 0.0 0.0 0.0261 0.057723 15 TS603-22 .5 T 2 (11) 2.2 1.2 93.3 2.3 0.0 0.3 0.4 0.0285 0.048123 Tabla 16 (Continuación) Muestra C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO TS603-22.6 T2 (16) 2.9 0.9 93.8 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0249 0.055517 TS603-22.4 T2 (1) 2.5 1.5 93.7 1.9 0.1 0.1 0.0 0.0204 0.046933 5 TS603-22.6 (1) 2.7 1.2 93.7 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0241 0.052497 TS603-22.3 T2 (5) 2.5 1.1 93.6 2.6 0.0 0.0 0.0 0.0278 0.05449 TS603-08.2 (4) 2.2 0.8 93.6 3.3 0.0 0.0 0.0 0.0355 0.05861 TS603-22 .6 T2 (9) 2.9 1.2 93.5 2.2 0.0 0.2 0.0 0.0235 0.054815 TS603-22.6 T2 (19) 2.9 1.1 93.5 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0245 0.055483 TS603-22.4 T2 (3) 2.4 1.0 93.5 2.8 0.1 0.0 0.0 0.0299 0.056044 10 TS603-22 .1 T2 (2) 2.7 0.9 93.5 2.9 0.0 0.0 0.0 0.0306 0.059281 TS603-22 .6 T2 (14) 3.1 1.5 93.4 2.1 0.0 0.0 0.0 0.0222 0.054943 TS603-08 .2(3) 2.7 0.9 93.4 2.9 0.0 0.0 0.0 0.0306 0.059851 TS603-22 .05(5) T2 2.3 1.6 93.4 2.5 0.2 0.0 0.0 0.0267 0.051234 TS603-22 .6 T2 (15) 3.0 1.2 93.3 2.4 0.0 0.0 0.0 0.0261 0.057723 15 TS603-22 .5 T2 (11) 2.2 1.2 93.3 2.3 0.0 0.3 0.4 0.0285 0.048123 Tabla 16(Continuación) Muestra C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO TS603-22.8 T2 (4) 2.6 1.2 92.9 3.3 0.0 0.0 0.0 0 .0358 0.063416 TS603-22.6 T2 (17) 2.7 0.8 92.9 3.5 0.0 0.0 0.0 0.0375 0.067028 TS603-22 .1 T2 (1) 2.7 1.1 92.8 3.1 0.2 0.0 0.0 0.0334 0.062312 5 TS603-22 .4 T2 (11) 2.2 1.4 92.6 2.7 0.0 0.3 0.4 0.0340 0.053189 TS603-22 .4 T2 (12) 2.1 1.4 92.6 2.9 0.0 0.3 0.4 0.0355 0.054077 TS603-22 .1 T2 (4) 2.4 0.9 92.6 4.0 0.0 0.0 0.0 0.0434 0 .069653 TS603-44 (2) T1 2.7 1.1 92.5 3.3 0.0 0.2 0.0 0.0358 0 .065506 TS603-22 .8 T2 (5) 2.9 1.1 92.4 3.5 0.0 0.0 0.0 0.0381 0.069194 10 TS603-22 .5 T2 (6) 2.1 2.0 92.4 2.4 0.0 0.3 0.4 0.0305 0.049301 TS603-22 .4 T2 (5) 2.8 1.7 92.4 2.9 0.0 0.0 0.0 0.0318 0.062593 TS603-22 .4 T2 (13) 2.3 1.1 92.3 3.3 0.0 0.2 0.4 0.0406 0 .060311 TS603-22.3 T2 (3) 2.7 1.4 92.3 3.4 0.1 0.1 0.0 0.0368 0.065979 TS603-34.3 T2 (1) 2.6 1.1 92.3 3.9 0.0 0.1 0.0 0.0421 0 .070162 15 TS603-34.3 T2 (13) 2.4 1.7 92.2 2.7 0.0 0.3 0.3 0.0332 0 .055508 Tabla 16(Continuación) Muestra C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO TS603-22 .5 T2 (10) 2.4 1.6 92.1 3.0 0.0 0.3 0.3 0.0366 0.058947 TS603-19.02 (3) T2 2.5 2.0 92.1 3.2 0.0 0.1 0.0 0.0345 0.061861 TS603-08.2 (1) 2.6 1.0 92.1 4.1 0.0 0.0 0.0 0.0444 0.073162 TS603-22. 1 T2 (3) 2.5 1.1 92.1 4.0 0.1 0.2 0.0 0.0435 0.070895 TS603-22 .5 T2 (8) 2.2 1.6 92.1 3.1 0.0 0.3 0.4 0.0381 0.058128 TS603-19 .2 T2 (11) 2.4 0.9 91.9 3.9 0.0 0.2 0.4 0.0463 0.067902 TS603-44 (1) TI 3.0 0.9 91.9 4.0 0.0 0.1 0.0 0.0439 0.076059 TS603-19 .02(1) T2 2.4 1.8 91.7 3.4 0.2 0.2 0.1 0.0384 0.063629 TS603-22.3 T2 (2) 3.0 1.1 91.7 4.0 0.0 0.0 0.0 0.0434 0.076459 TS603-22.5 T2 (7) 2.3 1.7 91.7 3.2 0.0 0.3 0.4 0.0392 0.060643 TS603-22.4 T2 (9) 2.3 1.3 91.7 3.6 0.0 0.3 0.5 0.0442 0.064255 TS603-22 .5 T2 (9) 2.4 1.6 91.6 3.4 0.0 0.3 0.4 0.0414 0.063679 TS603-22 .4 T2 (7) 2.4 1.3 91.5 3.9 0.0 0.3 0.4 0.0462 0.068489 TS603-22 .4 T2 (10) 2.4 1.4 91.5 3.7 0.0 0.3 0.5 0.0453 0.066056 Tabla 16 (Continuación) Muestra C16:O C18:0 C18:l C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO TS603-34.3 T2 (2) 2.7 1.6 91.4 3 .9 0 .0 0.1 0.1 0.0442 0.072984 5 TS603-22.4 T2 (4) 2.7 1.3 91.4 4 .2 0 .1 0.1 0.0 0.0461 0.076004 TS603-19.02 (5) T2 2.4 1.9 91.4 4 .1 0 .1 0.2 0.0 0.0445 0.070234 TS603-10.02 (2 ) T2 2.7 1.5 91.2 4 .4 0 .1 0.1 0.0 0.0480 0.077276 TS603-22.5 T 2 (13) 2.4 1.5 91.2 4 .1 0 .0 0.2 0.4 0.0489 0.071172 TS603-19.02 (4) 2.6 1.8 91.1 4 .3 0 .2 0.1 0.0 0.0471 0.075467 K) <3? TS603-22.4 T2 (6) 2.4 1.6 91.0 4 .1 0 .0 0.3 0.4 0 .0488 0.07045 10 TS603-34.4 T2 (2) 2.7 1.7 90.8 4 .4 0 .1 0.1 0.0 0.0487 0.078563 TS603-27.5 T2 (1) 2.7 1.3 90.7 4 .3 0 .0 0.3 0.3 0.0511 0.076932 TS603-19.02 (2) T2 2.7 1.7 90.6 4 .8 0 .0 0.2 0.0 0 .0532 0.083056 TS603-22.5 T2 (17) 2.7 1.7 90.5 4 .0 0 .0 0.4 0.4 0.0480 0.074387 TS603-08 .2(5) 3.0 1.1 90.5 5 .3 0 .0 0.0 0.0 0.0583 0.091395 15 TS603-19.2 T2 (17) 2.6 1.8 90.5 4 .2 0 .0 0.3 0.3 0 .0504 0.074894 TS603-19.2 T2 (10) 2.5 2.2 90.4 3 .9 0 .0 0.4 0.3 0.0464 0.070963 Tabla 16 (Continuación) Muestra C16:0 C18:O C18:1 C18:2 C18:3 C20 : O C20 : 1 ODP PLO TS603-34 .3 T2 (3) 2.8 1.5 90.2 5.2 0.1 0.1 0.0 0.0575 0.088097 TS 603-19.2 T2 (19) 2.5 2.3 90.2 4.0 0.0 0.3 0.3 0.0481 0.073009 5 TS 603-09.8 T2 (1) 2.8 1.3 90.0 5.0 0.0 0.3 0.3 0.0589 0.086178 S317 (1) 5.57 2.93 78.10 11.96 0.00 0.51 0.00 0.1531 0.224455 S317 (2) 4.77 2.10 78.07 13.82 0.00 0.38 0.00 0.1770 0.23815 S317 (3) 4.55 1.51 77.90 14.28 0.00 0.33 0.25 0.1865 0.241763 S317 (4) 4 .61 1.65 78.52 13.58 0.00 0.35 0.28 0.1764 0.231634 10 Tabla 17. Análisis de la composición de ácidos grasos de semillas T2 individuales de cártamo transformadas con el T-ADN de pCW631 en el precursor S-317. El nivel de cada ácido graso (%) fue expresado como un porcentaje del contenido de ácidos grasos totales # ID Muestra C16:0 C16:1 C18:0 C18:l C18:2 C20:0 C20:1 C22:0 ODP PLO 5 FAME 916 TS631-01 TI (21) 2.43 0.13 1.06 94.19 1.56 0.24 0.39 0.27 0.0203 0.0423 912 TS631-01 TI (17) 2.37 0.10 1.17 93.73 1.87 0.23 0.34 0.19 0.0230 0.0452 913 TS631-01 TI (18) 2.57 0.11 0.97 93.27 2.56 0.22 0.38 0.19 0.0305 0.0550 897 TS631-01 TI (16) 2.50 0.10 1.04 93.24 2.35 0.21 0.37 0.18 0.0247 0.0521 910 TS631-03 TI (1) 2.42 0.11 1.60 93.00 2.01 0.30 0.34 0.23 0.0250 0.0476 921 TS631-04 TI (1) 2.49 0.11 1.31 92.93 2.34 0.27 0.34 0.20 0.0275 0.0521 10 895 TS631-01 TI (14) 2.54 0.11 1.07 92.82 2.56 0.25 0.37 0.20 0.0316 0.0549 917 TS631-01 TI (22) 2.66 0.17 1.16 92.75 2.68 0.28 0.42 0.30 0.0334 0.0576 918 TS631-03 TI (2) 2.36 0.11 2.02 92.64 1.92 0.36 0.32 0.25 0.0242 0.0463 914 TS631-01 TI (19) 2.68 0.12 1.23 92.30 2.84 0.28 0.34 0.21 0.0345 0.0598 898 TS631-02 TI (1) 2.99 0.12 1.21 90.79 4.06 0.26 0.32 0.26 0.0483 0.0777 915 TS631-01 TI (20) 3.74 0.00 1.07 90.67 4.14 0.00 0.00 0.38 0.0456 0.0869 15 919 TS631-03 TI (3) 4.23 0.10 1.50 81.70 11.92 0.30 0.29 0.27 0.1494 0.1976 Tabla 17 (Continuación) Muestra C16:0 C16 : 1 C18 : 0 C18:1 C18:2 C20:0 C20:l C22:0 ODP PLO 899 TS631-02 TI (2) 4.54 0.08 1.61 80.87 12.07 0.31 0.26 0.25 0.1525 0.2054 900 TS631-02 TI (3) 4.47 0.08 2.07 80.64 11.90 0.37 0.24 0.23 0.1506 0.2030 901 TS631-02 TI (4) 4.60 0.09 1.83 80.24 12.51 0.29 0.22 0.22 0.1586 0.2132 906 TS631-02 TI (9) 4.44 0.09 1.74 80.20 12.76 0.31 0.23 0.24 0.1619 0.2144 903 TS631-02 TI (6) 4.47 0.10 1.60 79.99 13.06 0.30 0.25 0.24 0.1664 0.2191 907 TS631-02 TI (10) 4.39 0.09 1.82 79.90 12.98 0.33 0.24 0.24 0.1655 0.2174 909 TS631-02 TI (12) 4.31 0.09 1.52 79.87 13.48 0.27 0.26 0.19 0.1720 0.2227 905 TS631-02 TI (8) 4.46 0.09 1.57 79.58 13.47 0.30 0.30 0.23 0.1730 0.2254 902 TS631-02 TI (5) 4.72 0.08 1.45 79.05 13.87 0.32 0.27 0.24 0.1789 0.2351 Tabla 18. Extracción Soxhlet de aceite y perfil de ácidos grasos del aceite. 5 10 15 Construcción de pCW710 Se esperaba que promotores derivados de cártamo tuvieran actividad óptima en semillas de cártamo, son aislados usando teenologías de secuenciación de ADN que proporcionan información precisa de la secuencia para las regiones del ADN de 3' a 5' y de 5' a 3' de un gen expresado. Resultados previos, como se describen en los Ejemplos 2 a 6, han mostrado que el gen CtFAD2-l es altamente expresado durante el desarrollo de la semilla en cártamo. Por consiguiente, la región promotora de este gen es un excelente candidato para activar la expresión eficiente del transgen en semillas de cártamo. Como se muestra en el Ejemplo 6, CtFAD2-2 es activo en los precursores genéticos donde CtFAD2-l fue inactivado por mutación. Por consiguiente, el promotor de CtFAD2-2 es usado en cártamo para activar la expresión de ARNs horquillas que dirigen la actividad de CtFAD2-2, entre otros genes. Otros elementos promotores útiles para expresión de transgenes en semillas de cártamo incluyen elementos promotores endógenos (es decir cártamo) en las partes de 3' a 5' de genes para Oleosin (CtOleosin) y proteínas de acumulación en semillas, tal como las proteínas 2S y 11S (Ct2S y CtllS) . Los elementos promotores de CtFAD2-l, CtOleosin, Ct2S y CtllS son aislados usando técnicas estándares basadas en PCR, basadas en secuencias del genoma de cártamo, e incorporados en vectores de expresión binaria vegetales. Estos elementos promotores son usados para expresar moléculas de ARNhp silenciador en los constructos pCW701-pVW710 o conjuntamente con otros promotores diferentes a los de cártamo que expresan al mismo o a diferentes genes de ARNhp con promotores diferentes tales como en pCW602, pCW603, pCW631 o pCW632. Combinaciones de genes ARNhp con diferentes promotores se producen también mediante plantas transformadas por cruzas con los genes individuales, típicamente donde los genes de ARNhp no son ligados.
Para aislar el promotor de CtFAD2-l, un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 3000 pb de 3' a 5' de codón ATG de inicio de translación de CtFAD2-l es aislado usando téenicas basadas en PCR y usado para remplazar al promotor de AtOleosin de pCW603 y pCW602, generando así los constructos pCW701 y pCW702, respectivamente.
Para aislar el promotor de CtFAD2-2, un fragmento de ADN genómico de 3000 pb de 3' a 5' del codón ATG de inicio de translación de CtFAD2-2 es aislado usando técnicas basadas en PCR y es usado para remplazar al promotor AtOleosin de pCW603 y pCW602, generando asi los constructos pCW703 y pCW704, respectivamente.
Para aislar el promotor de CtOleosin-1, un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 1500 pares de base de 3' a 5' del codón ATG de inicio de translación de CtOleosin es aislado usando téenicas basadas en PCR y es usado para remplazar al promotor de AtOleosin de pCW603 y pCW602, generado asi los constructos pCW705 y pCW706, respectivamente.
Para aislar el promotor de Ct2S, un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 1500 pares de bases de codón ATG de inicio de translación de Ct2S es aislado y usado para remplazar al promotor de AtOleosin de pCW603 y pCW602, generando asi los vectores pCW707 y pCW708, respectivamente.
Para aislar el promotor de CtllS, un fragmento de ADN genómico de 1500 pares de bases de 3' a 5' del ATG de inicio de CtllS es aislado del ADN genómico de cártamo usando técnicas basadas y es usado para remplazar al promotor de AtOleosin de pCW603 y pCW602, generando asi los vectores pCW709 y pCW710, respectivamente.
Cada uno de estos vectores es transformado en variedades de cártamo descritas en el Ejemplo 1.
Ejemplo 14. Rendimiento en Campo de Variedades de Cártamo Una serie de accesos y variedades no transformadas de cártamo fueron cultivadas en el verano de 2011 - 2012 en una estación de campo localizada en Narrabri, New South Wales. Las semillas fueron cultivadas en puntos del campo de 5 m x 3 m en suelo de arcilla pesada encontrado comúnmente en región de Narrabri. Las plantas fueron expuestas a lluvia y luz natural excepto que fueron irrigadas una vez después de 4 semanas de crecimiento. La semilla madura fue cosechada y se analizaron muestras de aproximadamente 50 semillas para contenido de lipidos y composición de ácidos grasos en el aceite de la semilla. El contenido de ácido oleico en el aceite de la semilla de las varias variedades y accesos se expone en la Tabla 19 y en la Figura 13.
Los datos de los ensayos de campo indicaron que hubo un intervalo de contenidos de ácido oleico de la semilla de cártamo, sorprendente en la medida del intervalo observado. Más notablemente, varios accesos descritos como 'oleico alto' y reportados previamente por proporcionar aceite de semilla con al menos 70% de ácido oleico, tal como Ciano-OL, solamente produjeron aproximadamente 42-46% de ácido oleico. Los niveles de ácido linoleico fueron mucho más altos que lo esperado con base en reportes previos. En contraste, otros accesos que fueron reportados por dar contenidos altos de ácido oleico realmente produjeron altos niveles de ácido oleico (60%-76%) en aceites de semilla bajo condiciones de campo, tal como los accesos PI-5601698 y PI- 560169. La razón para los niveles de ácido oleico considerablemente más bajos a los esperados en algunos accesos, se cree que está relacionado con la presencia de alelos de CtFAD2-l diferentes del alelo ol, tal como por ejemplo, el alelo olí, el cual es sensible a la temperatura, y a las condiciones de cultivo que fueron menos que las ideales en la estación de 2011-2012. Análisis de ácidos grasos adicionales sobre la semilla obtenida del cártamo cultivado en campo se llevarán a cabo para confirmar la variación observada en el contenido de ácido oleico de algunos accesos.
Tabla 19. Composición de ácidos grasos de lipidos de variedades de cártamo cultivadas en campo.
ID C16:0 C16:l C18 : 0 C18 : 1 C18 : 2 C18 : 3 C20:0 C20:1 PI 613463 5.3 < 0.1 575 9.1 78.8 O 0.6 0.2 PI 537677 6.3 0.2 2.3 10.3 79.9 0.1 0.3 0.2 PI 537645 7.8 0.2 2.2 10.5 78.0 0.1 0.4 0.2 PI 572433 6.4 0.1 2.5 10.7 78.7 0.2 0.4 0.2 PI 572472 6.3 0.2 2.4 11.1 78.7 0.2 0.4 0.2 RC 1002 L 6.8 0.2 2.7 11.5 77.3 0.2 0.4 0.2 PI 537701 6.7 0.2 2.3 11.6 77.8 0.2 0.4 0.2 CC1435-3-1- 7.8 0.2 2.2 11.6 76.9 0.2 0.4 0.2 1-1-1 PI 560163 7.0 0.2 1.9 11.7 77.8 0.1 0.4 0.2 PI 451958 7.1 0.2 2.7 11.8 77.1 < 0.1 0.4 0.2 PI306609 6.6 0.2 2.5 12.0 77.3 0.2 0.4 0.2 PI 451950 6.6 0.1 2.2 12.4 77.5 0.1 0.4 0 .2 PI 537705 6.6 0.2 2.6 13.1 76.3 0.2 0.4 0 .2 PI 413718 7.1 0.2 2.9 13.4 74.9 0.2 0.6 0.2 Tabla 19 (Continuación) ID C16.-0 C16 : 1 C18 : O C18:l C18:2 C18:3 C20:0 C20 : 1 PI 560161 7.1 0.2 2.1 14.4 75.0 0.1 0.4 0.2 PI 560180 6.5 0.2 2.0 18.3 71.5 0.3 0.4 0.2 PI 401477 5.8 0.2 2.3 36.8 53.2 0.2 0.5 0.2 PI 537712 6.5 0.2 2.5 40.5 48.5 0.2 0.5 0.2 PI 537695 6. O 0.2 2.3 1.9 47.9 0.2 0.5 0.3 CIANO-OL 6.9 0.3 1.9 42.9 46.5 0.2 0.5 0.3 PI 538779 6.6 0.2 2.1 43.2 46.2 0.2 0.4 0.3 Sinonaria 6. O 0.2 2.1 43.5 46.6 0.2 0.4 0.2 PI 401479 5.9 0.2 2.1 48.2 41.7 0.3 0.5 0.4 PI 560166 5.7 0.2 2.3 55.0 35.0 0.1 0.5 0.3 PI 401474 5.5 0.3 1.9 59.3 30.6 0.4 0.6 0.6 PI 560177 5.1 0.2 1.9 60.7 30.3 0.2 0.4 0.3 PI 603207 5.6 0.2 2.0 65.2 25.0 0.2 0.5 0.3 PI 560167 5.8 0.2 1.6 65.9 24.8 0.2 0.4 0.3 PI 560174 5.9 0.3 1.8 67.6 22.6 0.3 0.5 0.3 PI 603208 5.4 0.2 2.3 68.3 21.7 0.2 0.6 0.3 PI 538025 5.3 0.2 2.3 68.5 21.6 0.3 0.4 0.3 PI 560168 5.9 0.2 1.8 68.5 21.8 0.3 0.5 0.3 PI 560169 5.6 0.2 1.9 71.8 18.6 0.2 0.5 0.3 PI 577808 5.3 0.2 2.0 75.0 15.5 0.3 0.5 0.3 PI 612967 5.4 0.2 1.8 76.3 14.5 0.2 0.4 0.3 Este experimento también mostró que el nivel de ácido oleico en el aceite de semillas, obtenido de plantas cultivadas en el campo fue típicamente de aproximadamente 5-10% más bajo que el de plantas cultivadas en invernadero aún para los accesos mejor efectuados en el campo. Se pensó que la razón para esto fue que las condiciones de cultivo del campo fueron menos ideales que en el invernadero.
En un experimento adicional, plantas del cultivar S317 de cártamo fueron cultivadas ya sea en el campo o el invernadero para comparar la composición de ácidos grasos del aceite de la semilla. Aunque las condiciones del campo fueron más favorables durante la estación de cultivo en comparación con la estación 2011-12, el peso de 20 semillas de plantas cultivadas en el campo fue de 0.977 g en vez de 1.202 g de plantas cultivadas en invernadero.18 a 20 semillas de cada grupo fueron analizadas para composición de ácidos grasos por análisis por GC. El nivel de ácido oleico en semillas cultivadas en campo varió desde 74.83 a 80.65 con una media de (+/1 d.s.) 78.52 ± 1.53, en comparación con un intervalo en semillas cultivadas en invernadero de 75.15-78.44 con una media de 76.33 ± 1.00. Estuvieron presentes otros ácidos grasos al nivel en la Tabla 20.
Tabla 20. Composición de ácidos grasos de aceite de semillas cultivadas ya sea en el campo o bien en invernadero.
Ejemplo 15. Cruza de Transgenes en Otras Variedades de Cártamo Se cruzaron manualmente variedades de cártamo usando métodos bien establecidos, por ejemplo, como se describe en Mündel y Begman (2009). La mejor de las lineas transformadas que contenían los constructos descritos anteriormente son seleccionados, particularmente líneas transformadas que contenían solamente una inserción de T-ADN individual, y se cruzaron con plantas e otras variedades de cártamo, no transformadas o ya transformadas con un constructo diferente, el cual tiene rendimiento agronómico óptimo. Usando rondas repetidas de retro-cruzas con el precursor recurrente, por ejemplo por 4 o 5 retrocruzas, y luego se autofecundó, se produjeron plantas que fueron homocigóticas para el constructo deseado en el precursor genético para rendimiento agronómico óptimo. Se puede usar la selección auxiliada por marcador en el proceso de reproducción, tal como, por ejemplo el uso de un marcador perfecto para el alelo ol como se describe en el Ejemplo 7.
Ejemplo 16. Modificación de la Composición mediante silenciamiento genético mediado por microARN Artificial Los microARNs (miARNs) son una clase de ARNs (sARN) pequeños reguladores endógenos de 20 a 24 nucleótidos (nt) tanto para plantas como para anímales, los cuales regulan la actividad del gen endógeno. La expresión transgénica de ARNs (precursor de miARN artificial) precursores de miARN modificados representa una estrategia específica de secuencia y basada en ARN desarrollada recientemente para silenciar genes endógenos. Se ha demostrado que la sustitución de varios nucleótidos en la secuencia precursora de miARN para hacer un precursor de miARN artificial no afecta la biogénesis del miARN, en cuanto a las posiciones de parejas y disparejas en el ciclo del tallo precursor, permanecen sin afectar.
El paquete de programa de cómputo CSIRO MatchPoint (www.pi.csiro.au/RNAi) (Horn y Waterhouse, 2010) se usó para identificar secuencias 21-mer específicas en los genes FAD2, FATB y FATB-1 de Arabidopsis los cuales fueron únicos en el genoma de Arabidopsis y, por consiguiente menos probablemente causen el silenciamiento de genes no objetivos (gene excluido como objetivo) cuando son expresados como miARNs artificiales. Una secuencia de 21-mer única fue seleccionada por cada uno de los 3 genes, el 21-mer en cada uno de los casos que es totalmente complementaria (antisentido) a una región del transcrito del gen correspondiente. Se diseñó una molécula del precursor de miARN artificial para cada uno, con base en la secuencia del precursor ara-miR159b de A. thaliana. En cada caso, la secuencia del precursor miR159b fue modificada en su tallo para acomodar la secuencia 21-mer antisentido. Se elaboraron tres constructos, cada uno que codifica a uno de los ARNs precursores, cada uno bajo el control del promotor FP1 especifico de semilla, y fueron clonados en un vector de expresión binario para generar los constructos designados pJP1106, pJP1109 y pJlllO.
Estos constructos fueron transformados separadamente en una cepa AGL1 de A tumefaciens y las cepas transformadas se usaron para introducir el constructo genético en A. thaliana (ecotipo Columbia) por el método de inmersión floral en una cepa AGL1 de A. tumefaciens (Ejemplo 1). Semillas (semillas TI) de las plantas tratadas fueron plaqueadas sobre medio MS suplementado con 3.5 mg/L de PPT para seleccionar plántulas transformadas, los cuales fueron transferidas al suelo para establecer platas transgénicas TI confirmadas. Se esperó que la mayoría de estas plantas fueran heterocigóticas para el constructo genético introducido. Semillas T2 de las plantas transgénicas fueron colectadas a madurez y analizadas para su composición de ácidos grasos. Estas plantas T2 incluyeron líneas que fueron homocigóticas para el constructo genético así como también unos que fueron heterocigóticos. Plantas T2 homocigóticas fueron autofertilizadas para producir semillas T3, y plantas progenie de T3 obtenidas a partir de estas semillas a su vez se usaron para obtener plantas progenie T4. Por consiguiente, éstas permitieron el análisis de la estabilidad del silenciamiento del gen durante tres generaciones de plantas progenie.
Los perfiles de ácidos grasos de aceite de semillas obtenido de los lotes de semillas T2, T3 y T4 fueron analizados por GC como se describió en el Ejemplo 1. Se observaron alteraciones en la actividad de D12 desaturasa causadas por la acción del transgen basado en FAD2 como un incremento en la cantidad de ácido oleico en los perfiles de aceite de semilla. Un método relacionado de evaluar los efectos acumulativos de la actividad de A12-desaturasa durante la síntesis de ácidos grasos de la semilla fue a través del cálculo del parámetro proporción de desaturación oleica (ODP) para cada aceite de semillas, obtenido usando la siguiente fórmula: ODP = [% de 18:2 + % de 18:3] / % de 18:1 + % de 18:2 + 18:3. El aceite de semilla de Arabidopsis de tipo salvaje típicamente tiene un valor de ODP de alrededor de 0.70 a 0.79, que significa que 70% a 79% de 18:1 formado durante la síntesis de ácidos grasos en la semilla fue convertido subsecuentemente a los ácidos grasos C18 poli-insaturados, primero de todo por la acción de A12-desaturasa para producir 18:2 y luego por desaturaación adicional a 18:3. Por consiguiente, el parámetro ODP fue útil al determinar el grado de silenciamiento del gen FAD2 sobre el nivel de actividad de A12-desaturasa endógena.
Los niveles de C18:1A9 (ácido oleico) en semillas T2 transformadas con el constructo pJP1106 (objetivo de FAD2) variaron desde 32.9% a 62.7% en 30 eventos transgénicos en comparación con un nivel de C18:1 de tipo salvaje promedio de 14% ± 0.2. Una línea altamente silenciada (planta ID-30)que tuvo una sola inserción de transgen, se determinó por proporciones de segregación (3:1) del marcador seleccionable de la planta (PPT), fue adelantada hacia la siguiente generación (T3). De manera similar altos niveles del 18:1D9 se observaron en semillas T3 que variaron desde 46.0% a 63.8% con un promedio de 57.3 ± 5.0%. En la siguiente generación, semillas T4 también mostraron similarmente altos niveles de 18:1D9 que variaron desde 61% a 65.8% con un promedio de 63.3 ± 1.06. El contenido de PUFA total (18:2 + 18:3) en aceite de semillas transgénicas T2 desde 6.1% a 38%, pero en el aceite de semilla de la linea homocigótica ID-30, el contenido de PUFA total se redujo adicionalmente y varió desde 4.3 a 5.7%. El aceite de semilla del ecotipo Columbia de Arabidopsis control tuvo un valor de ODP que varia desde 0.75 - 0.79, lo que significa que más de 75% del ácido oleico producido en la semilla en desarrollo fue convertido subsecuentemente a 18:2 o 18:3. En contraste, el aceite de la semilla del mutante fad2-l de Arabidopsis tuvo un valor de ODP de 0.17, indicando aproximadamente una reducción de 75% en la A12-desaturación debido a la mutación fad2-l . El valor de ODP varió desde 0.08 a 0.48 en el aceite de semilla transgénica T2, 0.07 - 0.32 en el aceite de semilla T3 y 0.06 - 0.08 en el aceite de semilla T4, en contraste al valor de 0.75 en el aceite de semilla de Arabidopsis control. La reducción drástica en los valores de ODP en las lineas transgénicas indicó claramente el silenciamiento eficiente del gen FAD2 endógeno usando el procedimiento del microARN artificial. Este experimento también mostró la estabilidad del silenciamiento del gen durante tres generaciones. Se observaron grados similares de silenciamiento del gen con los otros dos constructos para sub-regular sus genes correspondientes.
El grado de silenciamiento del gen FAD2 y la cantidad de 18:1D9 (63.3 ± 1.06%) observado en este estudio usando microARN artificial fue más alta que en el FAD2-2 mutante bien caracterizado (59.4%), la linea de FAD2 silenciado usando el procedimiento de ARN horquilla (56.9 ± 3.6%) y el procedimiento antisentido de horquilla (61.7 + 2.0%). El contenido medio de 18:2 + 18:3% en el aceite de semilla de FAD2 silenciado usando a miARN fue de 4.8 ± 0.37%, el cual fue más bajo que en el FAD2-2 mutante reportado previamente (7.5 ± 1.1%) y la linea de FAD2 silenciada usando el procedimiento antisentido de horquilla (7.2 ± 1.4%). Por consiguiente, estos datos mostraron las ventajas del microARN artificial al grado de silenciar, asi como también la estabilidad del silenciamiento durante las generaciones de progenie.
Ejemplo 17. Evaluación del Contenido de Esterol y Composición en Aceites Los fitoesteroles de 12 muestras de aceite vegetal adquirido de fuentes comerciales en Australia fueron caracterizados por análisis por GC y GC-MS como derivados de éter O-trimetil sililico (OTMSi-éter) como se describe en el Ejemplo 1. Se identificaron los esteróles por datos de retención, la interpretación del espectro de masa y comparación con literatura y datos espectrales de masa de estándares del laboratorio. Los esteróles fueron cuantificados por uso de un estándar interno de 5P(H)-Colan-24- ol. La estructura del fitoesterol básico y las estructuras químicas de algunos de los esteróles identificados se muestran en la Figura 14 y Tabla 21.
Tabla 21. Nombres sistemáticos/lUPAC de esteróles identificados.
Los aceites vegetales analizados fueron de: sésamo ( Sesamun indicum) , aceituna ( Olea europea) , girasol ( Helianthus annus) , ricino ( Ricinus communis) , cañóla ( Brassica napus) , cártamo ( Carthamus tinctorius) , cacahuate ( Arachis hypogaea) . Lino ( Línum usirarissimum) y soya ( Glycine max) . Al disminuir la relativa abundancia, a través de todas las muestras de aceite, los principales fitoesteroles fueron: b- sitoesterol (intervalo 28-55% de contenido total de esterol), D5- avenaesterol (isofucoesterol) (3-24%), campesterol (2-33%), D5-estigmaesterol (0.7-18%), A7-estigmaesterol(1-18%) y D7-avenaesterol (0.1-5%). Otros varios esteróles menores fueron identificados, estos fueron: colesterol, brassicaesterol, calinaesterol, campeATnol y eburicol. Cuatro C29:2 y dos C30:2 esteróles fueron también detectados, pero se requiere investigación adicional para identificación completa de estos componentes menores. Además, otros varios esteróles no identificados estuvieron presentes en algunos de los aceites, pero debido a su uy poca abundancia, el espectro de masa no fue suficientemente intenso para facilitar la identificación de sus estructuras.
Los contenidos de esterol expresados como mg/g de aceite en cantidades decrecientes fueron: aceite de cañóla (6.8 mg/g), aceite de sésamo (5.8 mg/g), aceite de lino (4.8- 5.2 mg/g), aceite de girasol (3.7-4.1 mg/g), aceite de cacahuate (3.2 mg/g), aceite de cártamo (3.0 mg/g), aceite de soya (3.0 mg/g), aceite de olivo (2.4 mg/g), aceite de ricino (1.9 mg/g). Las composiciones de % de esterol y el contenido de esterol total se presentan en la Tabla 22.
Entre todas las muestras de aceite de semillas, el principal fitoesterol, generalmente fue b-sitoesterol (intervalo de 30-57% del contenido de esterol total). Hubo un amplio intervalo ente los aceites en las proporciones de los otros esteróles importantes: campesterol (2-17%), D5-avenaesterol (4-23%), D7- estigmaesterol (1-18%). Los aceites de diferentes especies tuvieron un perfil de esterol diferente con algunos que tuvieron perfiles muy distintos. El aceite de cañóla tuvo la proporción máxima de campesterol (33.6%), mientras que muestras de otras especies generalmente tuvieron niveles más bajos, por ejemplo, hasta 17% en aceite de cacahuate. El aceite de cártamo tuvo una proporción relativamente alta de D7- estigmaesterol (18%), aunque este esterol fue usualmente bajo en los aceites de otras especies, hasta 9% en aceite de cártamo. Por consiguiente, porque fueron distintivos para cada especie, los perfiles de esterol pueden ser usados para ayudar en la identificación de aceites vegetales o de vegetales específicos y verificar su genuidad o adulteración con otros aceites.
Se compararon dos muestras de cada uno, de girasol y cártamo, en cada caso uno fue producido por prensado en frió de semillas y sin refinar, mientras que la otra no fue prensada en frió y refinada. Aunque se observaron algunas diferencias, los aceites de los dos orígenes tuvieron similar composición de esteróles y contenidos de esterol total, que sugieren que el procesamiento y la refinación tuvieron poco efecto sobre estos dos parámetros. El contenido de esterol entre las muestras varió tres veces y en el intervalo desde 1.9 mg/g a 6.8 mg/g. El aceite de cañóla tuvo el máximo y el aceite de castor el mínimo contenido de esterol.
Tabla 22. Composición y contenido de esterol de aceites vegetales evaluados No. de Lino Lino este- Nombre común del Caca- (semilla (semilla rol* eserol Sesamo Olivo Girasol Girasol Ricino Cañóla Girasol Cártamo huate de lino) de lino) Soya Prensado Prensado en frío en frió 1 colesterol 0.2 578 02 o!o oTi 0T3 02 (P 0.2 L ÓÍ4 02 5 2 brassicaesterol 0.1 0.0 0.0 0.0 0.3 0.1 0.0 0.0 0.0 0.2 0.2 0.0 calinaesterol /24- 3 metilen colesterol 1.5 0.1 0.3 0.1 1.1 2.4 0.2 0.1 0.9 1.5 1.4 0.8 campesterol /24- 4 metilcolesterol 16.2 2.4 7.4 7.9 8.4 33.6 12.1 8.5 17.4 15.7 14.4 16.9 campestanol /24- 10 5 metilcolestanol 0.7 0.3 0.3 0.1 0.9 0.2 0.8 0.8 0.3 0.2 0.2 0.7 6 C29:2* 0.0 0.0 0.1 0.2 0.0 0.1 0.5 0.5 0.0 1.2 1.3 0.1 7 A5-estigmaesterol 6.4 1.2 7.4 7.2 18.6 0.7 7.0 4.6 6.9 5.1 5.8 17.6 8 desconocido 0.5 1.3 0.7 0.6 0.8 0.7 0.7 1.3 0.4 0.7 0.6 1.3 15 Tabla 22 (Continuación) No. de Nombre Lino Lino este- común del Caca- (semilla (semilla rol* esterol Sésamo Olivo Girasol Girasol Ricino Cañóla Girasol Cártamo huate de lino) de lino) Soya Prensado Prensado en frío en frío ergost-7-en-3 - 5 9 ol 0.1 0.1 1.9 1.8 0.2 0.4 2.7 4.0 1.4 1.4 1.4 1.0 10 desconocido 0.0 1.3 0.9 0.8 1.2 0.9 1.8 0.7 1.2 0.7 0.5 0.7 11 eburicol 1.6 1.8 4.1 4.4 1.5 1.0 1.9 2.9 1.2 3.5 3.3 0.9 b-sitoesterol / 24- 12 etilcolesterol 55.3 45.6 43.9 43.6 37.7 50.8 40.2 35.1 57.2 29.9 28.4 40.2 A5-avenasterol 13 / isofucosterol 8.6 16.9 7.2 4.1 19.3 4.4 7.3 6.3 5.3 23.0 24.2 3.3 triterpenoide 14 alcohol 0.0 2.4 0.9 1.1 0.0 0.0 1.6 1.9 0.0 0.0 0.0 0.9 triterpenoid 15 alcohol 0.0 0.0 0.7 0.6 0.0 0.0 2.8 1.8 0.0 0.0 0.3 0.0 15 16 C29:2* 0.0 0.5 0.7 0.7 1.5 1.2 2.8 1.9 2.0 1.0 0.7 0.5 17 C29:2* 1.0 0.9 2.4 0.6 0.4 1.3 1.9 0.9 1.0 Tabla 22 (Continuación) No. de este Lino Lino Nombre común Sesa Gira Caca- (semilla (semilla rol* del esterol -ao Olivo -sol Girasol Ricino Cañóla Girasol Cártamo huate de lino) de lino) Soya Prensado Prensado en frió en frío 18 C30:2* 0.0 0.0 0.0 0.0 1.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 A7-estigmasterol / 19 estigmast-7-en-3P-ol 2.2 7.1 9.3 10.9 2.3 0.9 10.5 18.3 1.1 7.9 8.7 5.6 20 A7-avenaesterol 1.3 0.1 4.0 3.6 0.6 0.2 2.0 4.7 0.7 0.4 0.4 0.6 21 desconocido 0.7 7.1 0.9 0.8 0.0 0.4 0.3 0.4 0.0 3.0 3.6 0.0 22 desconocido 0.3 0.0 0.3 0.9 0.0 0.0 1.2 1.3 0.2 0.1 0.0 0.3 23 desconocido 0.2 0.2 0.3 0.3 0.2 0.1 0.3 0.2 0.2 0.1 0.2 0.5 24 desconocido 0.0 3.1 0.9 1.3 0.6 0.4 0.2 0.4 0.7 1.7 1.9 0.8 10 25 desconocido 0.9 0.4 0.3 0.5 0.3 0.1 0.5 0.7 0.3 0.1 0.1 0.6 26 C30:2 2.2 6.0 4.6 5.7 1.4 0.6 1.0 1.2 1.2 1.2 1.1 5.2 0. 27 desconocido 0.0 0.4 0.4 Z0.3 3 0.2 0.1 0.2 0.3 0.0 0 . 15 C29:2* y 030:2* denotan un esterol C29 con dos dobles enlaces y un esterol C30 con dos dobles enlaces, respectivamente .
Se efectuó un análisis separado de aceites de cártamo de semillas control derivadas de invernadero (serie S), semillas altas en oleico genéticamente modificadas (serie T) y dos aceites de cártamo comerciales. Se observaron varias características (Tabla 23). Primero, hay un alto grado de similaridad en el patrón de esterol entre el control y las semillas modificadas y en segundo término los aceites de cártamo comerciales están en un agrupa iento separado y, por consiguiente se mostró gue tienen un perfil de fitoesterol significativamente diferente. El examen adicional de los perfiles de fitoesterol también mostró la similaridad de los perfiles de fitoesterol de muestras de semilla de cártamo control y modificadas.
Los expertos en la materia apreciarán que se pueden hacer numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención como se expone en las modalidades específicas sin alejarse del espíritu o alcance de la invención como se describió ampliamente. Por consiguiente, las modalidades de la presente se consideran en todos aspectos como ilustrativas y no restrictivas.
La presente solicitud reclama la prioridad de US 61/638,447 presentada el 25 de Abril de 2012, y AU 2012903992 presentada el 11 de Septiembre de 2012, ambas incorporadas a la presente como referencia.
Todas las publicaciones discutidas y/o mencionadas en la presente se incorporan a la misma íntegramente.
Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, artículos o los similares que han sido incluidos en la presente especificación son solamente para propósitos de proporcionar un contexto para la presente invención. No se tomarán como una admisión de que cualquiera o todos estos temas forman parte del arte previo base o fueron conocimientos generales comunes en el campo relevante a la presente invención como existió antes de la fecha de prioridad de cada una de las reivindicaciones de esta solicitud.
Tabla 23. Composición de esteróles (% de esteróles totales) y contenido (mg/g) de muestras de aceite de semilla de cártamo No. de P2589 P2590 P2591 P2592 P2593 Nombre(s) TS603.9.2 TS603.9.4 TS603.9.5 Esterol común(es) IUPAC / Nombre sistemático S317(1) S317(2) T1 T1 T1 1 colesterol colest-5-en-3p-ol 0.5 0.6 0.5 3.0 1.1 2 brassica esterol 24-metilcolesta-5,22E-dien-3 -ol 0.0 0.0 0.1 0.0 0.1 calinaesterol / 24- 3 metilen colesterol 24-metllcolesta-5,24(28)E-dien-3p-ol 0.8 0.8 1.1 1.1 1.2 campesterol / 24- 4 metilcolesterol 24-metilcolest-5-en-3p-ol 10.5 11.6 11.0 11.8 11.8 w o campestanol / 24- 5 metilcolestanol 24-metilcolestan-3p-ol 0.0 0.1 0.2 0.0 0.3 10 6 C29:2** 0.9 0.8 0.2 7.2 0.4 D5- 7 estigmaesterol 24-etilcolesta-5,22E-dien-3p-o I 0.7 0.9 0.8 0.8 0.6 8 desconocido*** 1.8 2.1 2.3 2.1 2.0 9 ergost-7-en-3p-ol 24-metilcolest-7-en-3p-ol 2.8 3.3 2.6 2.3 2.6 10 desconocido*** 1.5 1.6 1.3 1.8 1.4 4,4,14-trimetilergosta-8,24(28)-dien-3p- 11 eburicol ol 1.7 2.2 5.0 2.8 2.6 p-sitoesterol / 24- 12 etilcolesterol 24-etilcolest-5-en-3p-ol 35.9 37.0 35.7 36.2 37.5 A5-avenaesterol / 15 13 isofucoesterol 24-ethylcholesta-5,24(28)Z-dien-3p-ol 10.4 8.2 10.0 7.9 9.3 alcohol 14 triterpenoide 1.6 1.9 1.4 1.2 1.4 Tabla 23 (Continuación) No. de P2589 P2590 P2591 P2592 P2593 Nombre(s) TS603.9.2 TS603.9.4 TS603.9.5 Esteral común(es) IUPAC / Nombre sistemático S317 (1) S317 (2) T1 T1 T1 15 alcohol triterpenoide 1.8 2.2 1.3 0.9 1.6 16 C29.2** 4.4 0.6 3.1 2.8 2.1 17 C29:2** 2.2 2.2 2.1 2.1 1.7 18 C30:2** 1.9 0.8 1.8 1.9 2.1 A7-estigmaesterol / 19 estigmast-7-en-3p-ol 24-etilcolest-7-en-3p-ol 11.4 13.6 10.3 8.9 10.7 24-etilcolesta 7,24(28)Z-dien-3p 20 A7-avenaesterol**** ol 6.1 5.7 5.3 3.4 4.9 21 desconocido*** 0.2 0.4 0.2 0.5 0.4 22 desconocido*** 0.9 1.0 1.1 1.1 0.9 23 desconocido*** 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 24 desconocido*** 0.2 10 0.6 0.9 1.5 0.9 25 desconocido*** 0.9 0.6 0.3 1.0 0.5 26 C30:2 0.9 1.0 0.5 2.9 1.4 27 desconocido*** 0.0 0.1 0.8 2.2 0.4 Suma 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 Esteróles totales (mg/g oil) 1.9 2.2 2.0 2.0 1.8 * Números de esteral se refiere a trazas por GC . ** C29:2 y C30:2 denota C29 con dos dobles enlaces y C30 esteral con dos dobles enlaces, respectivamente. *** desconocido **** identificación tentativa.
S317 las muestras son controles de precursores no modificados y TS las muestras son muestras de aceite de 15 cártamo modificado alto en ácido oleico Análisis de semillas de cártamo transformadas con el T-ADN de pCW631 La semilla TI de la variedad S-317 de cártamo transformada con pCW631 fue analizada de manera similar para su composición de ácidos grasos. La Tabla 17 muestra los datos y los métricos de PLO y ODP para estas semillas. El contenido de ácido oleico en el lípido de estas semillas era de hasta 94.19%. El contenido de ácido palmitico de la semilla TS631-01 TI (21) que tuvo el nivel máximo de ácido oleico fue 2.43%, el ODP fue de 0.0203 y el PLO fue de 0.0423. Estos análisis demostraron que el constructo de ARN horquilla en pCW631 generalmente produjo niveles de ácido oleico más altos que el constructo en pCW603 cuando se transformó en cártamo del antecedente genético S-317. Esta observación indicó que el promotor de linina usado en pCW631 expresó al ARN horquilla más fuertemente o con un mejor tiempo de expresión, o una combinación de ambos, en relación con el promotor de AtOleosin usado en pCW603.
Las semillas T2 de la variedad S-317 transformada de cártamo con el T-ADN procedente de pCW631 fueron analizadas por GC. Niveles de ácido oleico de hasta 94.95% fueron observados con un ODP de 0.01 y PLO de 0.035.
Semillas y plantas de cártamo transformadas con los T-ADNs procedentes de los constructos pCW632 y pCW602 se analizaron en la misma manera que para la semilla y plantas transformadas con pCW603 y pCW631. E análisis por GC de la semilla TI de la variedad S-317 transformada con pCW632 de cártamo mostró nivel de ácido oleico de hasta 94.88%, con ODP de 0.01012 y PLO de 0.0362. Sus semillas T2 mostraron hasta 93.14% de ácido oleico, con ODP de 0.0164 y PLO de 0.0452.
Extracción de volúmenes más grandes de acei te de semilla de algodón Se cosecharon semillas T4 procedentes de la linea transgénica homocigótica designada TS603-22.6, y se les extrajo el aceite total de la semilla usando el equipo de extracción Soxhlet como se describe en el Ejemplo 1. Se analizaron alícuotas del aceite extraído post GC (Tabla 18). Se recuperó un total de 643 gramos de aceite. Las extracciones de 2, 3, 5, y 6 fueron conjuntadas, mientras que las extracciones 4, 7 y 8 fueron conjuntadas en un lote separado. Las mezclas fueron analizadas adicionalmente para composición de ácidos grasos por GC. Los datos se muestran en la Tabla 18.
Ejemplo 13. Diseño y Preparación de Constructos Adicionales de Genes Silenciadores Con base en los resultados descritos en los Ejemplos 10 - 12, otros constructos de gen silenciados fueron preparados como sigue, para incrementar el contenido de ácido oleico del aceite de semilla de cártamo y disminuir las proporciones de ODP y PLO. Estos constructos de genes silenciadores incluyó combinar promotores diferentes, procedentes de fuentes diferentes a cártamo, asi como también procedentes de cártamo, para lograr la máxima reducción en la expresión de los genes FAD2-2, FATB-3 y FAD6, y adicionalmente silenciar más de un gen FAD2 además del FAD2-2. Estos constructos son usados para transformar variedades de cártamo que han inactivado versiones del gen CtFAD2-l endógeno, tal como S-317, Ciano-OL y Lesaff496.
Construcción de pVW700 Este vector de expresión binario vegetal tiene dos promotores extraños (no de cártamo) con diferentes pero sobrepuestos patrones de expresión en semilla de cártamo, en vez de un promotor, para producir ARN horquilla para reducir la expresión de los CtFATB y CtFAD2-2 endógenos. Los dos promotores son el promotor AtOleosin y el promotor de linina de lino y los dos "cassettes" de expresión de ARNhp son de la misma molécula de T-ADN. Este vector es construido por digestión de restricción del "cassette" de expresión de gen de ARNhp procedente de pCW631, que tiene el promotor de linina y la región codificadora de QRNhp para silenciar a CtFAD2-2 y CtFATB, e insertándolo en el T-ADN de pCW603, generando asi un constructo que codifica a un ARN horquilla contra estos dos genes de cártamo. Este constructo es usado para transformar variedades de cártamo tales como Lesaff496, Ciano-OL y S-317.
Tabla 16. Composición de ácidos grasos de lipidos de semillas T2 de cártamo individuales transformadas con T-ADN de pCW603 en el S-317 precursor . El nivel del ácido graso (%) fue expresado como un porcentaje del contenido de ácidos grasos totales .
Muestra C16: 0 C18 : 0 C18 : l C18 : 2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO 5 TS603-22.3 T2 (4) 2.4 0.9 94.6 1.7 0.0 0.2 0.0 0.0181 0.043956 TS603-22 .6(5) 2.5 1.0 94.5 2.0 0.0 0.0 0.0 0.0214 0.048069 TS603-22 .6(2) 2.1 0.9 94.4 2.5 0.0 0.0 0.0 0.0266 0.04934 TS603-22 .6(4) 2.4 1.0 94.3 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0239 0.049028 TS603-22.4 T2 (2) 2.2 1.5 94.3 1.8 0.0 0.0 0.1 0.0200 0.042739 10 TS603-22 .6 T2 (20) 2.2 1.1 94.2 2.4 0.0 0.0 0.0 0.0256 0.048622 TS603-22.05(4) T2 2.2 1.4 94.2 2.0 0.0 0.1 0.0 0.0212 0.044211 TS603-22 .8 T2 (1) 2.1 1.1 93.9 2.5 0.2 0.1 0.0 0.0263 0.04839 TS603-22.6 T2 (10) 2.8 1.0 93.9 2.1 0.0 0.0 0.0 0.0223 0.052359 TS603-22.6 T2 (6) 2.9 1.1 93.9 2.0 0.0 0.0 0.0 0.0214 0.052318 TS603-22.05 (1) T2 2.2 1.3 93.8 2.2 0.1 0.2 0.0 0.0240 0.04783 15 TS603-22 .6 T2 (13) 2.9 1.2 93.8 1.7 0.0 0.2 0.0 0.0185 .049564 Tabla 16 (Continuación) Muestra C16 : 0 C18 : 0 C18 : 1 C18 : 2 C18 : 3 C20 : 0 C20 : 1 ODP PLO TS603-22 .6 T2 (16) 2.9 0.9 93.8 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0249 0.055517 TS603-22.4 T2 (1) 2.5 1.5 93.7 1.9 0.1 0.1 0.0 0.0204 0.046933 5 TS603-22 .6 (1) 2.7 1.2 93.7 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0241 0.052497 TS603-22 .3 T2 ( 5 ) 2.5 1.1 93.6 2.6 0.0 0.0 0.0 0.0278 0.05449 TS603-08.2 (4) 2.2 0.8 93.6 3.3 0.0 0.0 0.0 0.0355 0.05861 TS603-22 .6 T 2 (9) 2.9 1.2 93.5 2.2 0.0 0.2 0.0 0.0235 0.054815 TS603-22. 6 T 2 (19) 2.9 1.1 93.5 2.3 0.0 0.0 0.0 0.0245 0.055483 TS603-22.4 T 2 (3) 2.4 1.0 93.5 2.8 0.1 0.0 0.0 0.0299 0.056044 10 TS603-22 .1 T2 (2 ) 2.7 0.9 93.5 2.9 0.0 0.0 0.0 0.0306 0.059281 TS603-22 .6 T 2 ( 14 ) 3.1 1.5 93.4 2.1 0.0 0.0 0.0 0.0222 0.054943 TS603-08 .2 (3) 2.7 0.9 93.4 2.9 0.0 0.0 0.0 0.0306 0.059851 TS603-22 .05 ( 5) T2 2.3 1.6 93.4 2.5 0.2 0.0 0.0 0.0267 0.051234 TS603-22 .6 T 2 (15) 3.0 1.2 93.3 2.4 0.0 0.0 0.0 0.0261 0.057723 15 TS603-22.5 T 2 (11) 2.2 1.2 93.3 2.3 0.0 0.3 0.4 0.0285 0.048123 Tabla 16 (Continuación) Muestra C16:O C18:O C18:1 C18:2 C18:3 C20 :0 C20:1 ODP PLO TS603-22 6 T 2 (8) 2.9 1.2 93.3 2.5 0.0 0.0 0.0 0.0265 0 .057514 TS603-22 5 T 2 (12) 2.2 1.3 93.3 2.3 0.0 0.3 0.4 0.0289 0.047835 5 TS603-22 6 T 2 (7) 3.1 1.3 93.2 2.5 0.0 0.0 0.0 0.0265 0 .059228 TS603-22 4 T 2 (8) 2.1 1.8 93.2 2.0 0.0 0.3 0.3 0.0254 0.044186 TS603-22 6 T 2 (11) 2.9 1.2 93.1 2.5 0.0 0.1 0.0 0.0271 0.057755 TS603-22 3 T 2 (1) 2.5 1.2 93.1 3.1 0.0 0.0 0.0 0.0335 0.060295 TS603-22 5 T 2 (14) 2.1 1.3 93.1 2.6 0.0 0.2 0.4 0.0318 0.050656 TS60 3-22 5 T 2 (16) 2.3 1.5 93.0 2.3 0.0 0.3 0.3 0.0283 0.049621 10 TS 603-22 5 T 2 (18) 2.3 1.0 93.0 2.8 0.0 0.2 0.4 0.0341 0.05407 TS 603-22 5 T 2 (15) 2.0 0.9 92.9 3.0 0.0 0.3 0.5 0 .0381 0.054149 TS 603-22 6 T 2 (12) 3.0 1.2 92.9 2.7 0.0 0.0 0.0 0.0294 0.061518 TS 603-22 05(3) T2 2.5 1.0 92.9 3.3 0.1 0.2 0.0 0.0350 0.061372 TS603-22 6 T 2 (18) 2.9 0.8 92.9 3.2 0.0 0.0 0.0 0.0349 0.06593 15 TS603-22 6 (3) 2.7 0.7 92.9 3.6 0.0 0.0 0.0 0.0383 0.067112 Tabla 16(Continuación) Muestra C16:O C18:O C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO TS603-22 .8 T2 (4) 2.6 1.2 92.9 3.3 0.00.0 0.0 0.0358 0.063416 TS603-22 .6 T2 (17) 2.7 0.8 92.9 3.5 0.00.0 0.0 0.0375 0.067028 TS603-22 .1 T2 (1) 2.7 1.1 92.8 3.1 0.20.0 0.0 0.0334 0.062312 5 TS603-22.4 T2 (11) 2.2 1.4 92.6 2.7 0.00.3 0.4 0.0340 0.053189 TS603-22 .4 T2 (12) 2.1 1.4 92.6 2.9 0.00.3 0.4 0.0355 0.054077 TS603-22 .1 T2 (4) 2.4 0.9 92.6 4.0 0.00.0 0.0 0.0434 0.069653 TS603-44 (2) T1 2.7 1.1 92.5 3.3 0.00.2 0.0 0 .0358 0.065506 ma» u> TS603-22 .8 T2 (5) 2.9 1.1 92.4 3.5 0.00.0 0.0 0 .0381 0.069194 10 TS603-22 .5 T2 (6) 2.1 2.0 92.4 2.4 0.00.3 0.4 0 .0305 0.049301 TS603-22 .4 T2 (5) 2.8 1.7 92.4 2.9 0.00.0 0.0 0.0318 0.062593 TS603-22.4 T2 (13) 2.3 1.1 92.3 3.3 0.00.2 0.4 0.0406 0.060311 TS603-22 .3 T2 (3) 2.7 1.4 92.3 3.4 0.10.1 0.0 0.0368 0.065979 TS603-34 .3 T2 (1) 2.6 1.1 92.3 3.9 0.00.1 0.0 0.0421 0.070162 15 TS603-34.3 T2 (13) 2.4 1.7 92.2 2.7 0.00.3 0.3 0.0332 0.055508 Tabla 16(Continuación) Muestra C16:0 C18:O C18:l C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO TS603-22 .5 T2 (10) 2.4 1.6 92.1 3.0 0.0 0.3 0.3 0.0366 0.058947 TS603-19.02 (3) T2 2.5 2.0 92.1 3.2 0.0 0.1 0.0 0.0345 0.061861 TS603-08.2(1) 2.6 1.0 92.1 4.1 0.0 0.0 0.0 0.0444 0.073162 TS603-22.1 T2 (3) 2.5 1.1 92.1 4.0 0.1 0.2 0.0 0.0435 0.070895 TS603-22.5 T2 (8) 2.2 1.6 92.1 3.1 0.0 0.3 0.4 0.0381 0.058128 TS603-19.2 T2 (11) 2.4 0.9 91.9 3.9 0.0 0.2 0.4 0.0463 0.067902 TS603-44(1) TI 3.0 0.9 91.9 4.0 0.0 0.1 0.0 0.0439 0.076059 10 TS603-19.02(1) T2 2.4 1.8 91.7 3.4 0.2 0.2 0.1 0.0384 0.063629 TS603-22.3 T2 (2) 3.0 1.1 91.7 4.0 0.0 0.0 0.0 0.0434 0.076459 TS603-22.5 T2 (7) 2.3 1.7 91.7 3.2 0.0 0.3 0.4 0.0392 0.060643 TS603-22.4 T2 (9) 2.3 1.3 91.7 3.6 0.0 0.3 0.5 0.0442 0.064255 TS603-22.5 T2 (9) 2.4 1.6 91.6 3.4 0.0 0.3 0.4 0.0414 0.063679 TS603-22.4 T2 (7) 2.4 1.3 91.5 3.9 0.0 0.3 0.4 0.0462 0.068489 15 TS603-22.4 T2 (10) 2.4 1.4 91.5 3.7 0.0 0.3 0.5 0.0453 0.066056 Tabla 16 (Continuación) Muestra C16 : 0 C18 : 0 C18 : 1 C18 : 2 C18 : 3 C20 : 0 C20 : 1 ODP PLO TS603-34 .3 T2 (2) 2.7 1.6 91. 4 3.9 0.0 0 .1 0.1 0.0442 0.072984 TS603-22 .4 T2 (4) 2.7 1.3 91. 4 4.2 0.1 0 .1 0.0 0.0461 0.076004 5 TS603-19 .02 (5) T2 2.4 1.9 91. 4 4.1 0.1 0 .2 0.0 0.0445 0.070234 TS603-10 .02(2) T2 2.7 1.5 91. 2 4.4 0.1 0 .1 0.0 0.0480 0.07727 6 TS603-22 .5 T2 (13) 2.4 1.5 91. 2 4.1 0.0 0 .2 0.4 0.0489 0.071172 TS603-19 .02 (4) 2.6 1.8 91. 1 ± 4.3 0.2 0 .1 0.0 0.0471 0.075467 TS 603-22.4 T2 (6) 2.4 1.6 · 91. 0 4.1 0.0 0.3 0.4 0.0488 0.07045 TS603-34 . T2 (2) 2.7 1.7 90. 8 4.4 0.1 0.1 0.0 0.0487 0.078563 10 T S6.03-27.5 T2 (1) 2.7 1.3 90. 7 4.3 0.0 0 .3 0.3 0.0511 0.076932 TS603-1 9.02(2) T2 2.7 1.7 90. 6 4.8 0.0 0.2 0.0 0.0532 0.083056 TS603-22.5 T2 (17) 2.7 1.7 90. 5 4.0 0.0 0 .4 0.4 0.0480 0.074387 TS603-08 .2(5) 3.0 1.1 90. 5 5.3 0.0 0 .0 0.0 0.0583 0.091395 TS603-19.2 T2 (17) 2.6 1.8 90. 5 4.2 0.0 0 .3 0.3 0.0504 0.074894 15 TS 603-19.2 T2 (10) 2.5 2.2 90. 4 3.9 0.0 0 .4 0.3 0.0464 0.070963 Tabla 16 (Continuación) Muestra C16 : 0 C18 : 0 C18 : 1 C18 : 2 C18 : 3 C20 : 0 C20: 1 ODP PLO TS603-34 .
T 2 (3) 2.8 1.5 90.2 5.2 0.1 0.1 0.0 0.0575 0.088097 TS603-1 9.
T 2 (19) 2.5 2.3 90.2 4.0 0.0 0.3 0.3 0.0481 0.073009 5 TS603-09.
T 2 ( 1 ) 2.8 1.3 90.0 5.0 0.0 0.3 0.3 0.0589 0.086178 S317 (1) 5.57 2.93 78.10 11.96 0.00 0.51 0.00 0.1531 0.224455 S317 (2) 4.77 2.10 78.07 13.82 0.00 0.38 0.00 0.1770 0.23815 S317 (3) 4.55 1.51 77.90 14.28 0.00 0.33 0.25 0.1865 0.241763 S317 (4) 4.61 1.65 78.52 13.58 0.00 0.35 0.28 0.1764 0.231634 10 Tabla 17. Análisis de la composición de ácidos grasos de semillas T2 individuales de cártamo transformadas con el T-ADN de pCW631 en el precursor S-317. El nivel de cada ácido graso (%) fue expresado como un porcentaje del contenido de ácidos grasos totales.
# ID Muestra C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C20:0 C20:1 C22:0 ODP PLO 5 FAME 916 TS631-01 TI (21) 2.43 0.13 1.06 94.19 1.56 0.24 0.39 0.27 0.0203 0.0423 912 TS631-01 TI (17) 2.37 0.10 1.17 93.73 1.87 0.23 0.34 0.19 0.0230 0.0452 913 TS631-01 TI (18) 2.57 0.11 0.97 93.27 2.56 0.22 0.38 0.19 0.0305 0.0550 897 TS631-01 TI (16) 2.50 0.10 1.04 93.24 2.35 0.21 0.37 0.18 0.0247 0.0521 910 TS631-03 TI (1) 2.42 0.11 1.60 93.00 2.01 0.30 0.34 0.23 0.0250 0.0476 921 TS631-04 TI (1) 2.49 0.11 1.31 92.93 2.34 0.27 0.34 0.20 0.0275 0.0521 10 895 TS631-01 TI (14) 2.54 0.11 1.07 92.82 2.56 0.25 0.37 0.20 0.0316 0.0549 917 TS631-01 TI (22) 2.66 0.17 1.16 92.75 2.68 0.28 0.42 0.30 0.0334 0.0576 918 TS631-03 TI (2) 2.36 0.11 2.02 92.64 1.92 0.36 0.32 0.25 0.0242 0.0463 914 TS631-01 TI (19) 2.68 0.12 1.23 92.30 2.84 0.28 0.34 0.21 0.0345 0.0598 898 TS631-02 TI (1) 2.99 0.12 1.21 90.79 4.06 0.26 0.32 0.26 0.0483 0.0777 915 TS631-01 TI (20) 3.74 0.00 1.07 90.67 4.14 0.00 0.00 0.38 0.0456 0.0869 15 919 TS631-03 TI (3) 4.23 0.10 1.50 81.70 11.92 0.30 0.29 0.27 0.1494 0.1976 Tabla 17 (Continuación) # ID Muestra C16:O C16:1 C18:O C18:1 C18:2 C20:O C20 : 1 C22 : O ODP PLO FAME 899 TS631-02 TI (2) 4.54 0.08 1.61 80.87 12.07 0.31 0.26 0.25 0.1525 0.2054 900 TS631-02 TI (3) 4.47 0.08 2.07 80.64 11.90 0.37 0.24 0.23 0.1506 0.2030 901 TS631-02 TI (4) 4.60 0.09 1.83 80.24 12.51 0.29 0.22 0.22 0.1586 0.2132 5 906 TS631-02 TI (9) 4.44 0.09 1.74 80.20 12.76 0.31 0.23 0.24 0.1619 0.2144 903 TS631-02 TI (6) 4.47 0.10 1.60 79.99 13.06 0.30 0.25 0.24 0.1664 0.2191 907 TS631-02 TI (10) 4.39 0.09 1.82 79.90 12.98 0.33 0.24 0.24 0.1655 0.2174 909 TS631-02 TI (12) 4.31 0.09 1.52 79.87 13.48 0.27 0.26 0.19 0.1720 0.2227 905 TS631-02 TI (8) 4.46 0.09 1.57 79.58 13.47 0.30 0.30 0.23 0.1730 0.2254 902 TS631-02 TI (5) 4.72 0.08 1.45 79.05 13.87 0.32 0.27 0.24 0.1789 0.2351 10 Tabla 18. Extracción Soxhlet de aceite y perfil de ácidos grasos del aceite 15 Construcción de pCW701-pCW710 Se esperaba que promotores derivados de cártamo tuvieran actividad óptima en semillas de cártamo, son aislados usando teenologías de secuenciación de ADN que proporcionan información precisa de la secuencia para las regiones del ADN de 3' a 5' y de 5' a 3' de un gen expresado. Resultados previos, como se describen en los Ejemplos 2 a 6, han mostrado que el gen CtFAD2-l es altamente expresado durante el desarrollo de la semilla en cártamo. Por consiguiente, la región promotora de este gen es un excelente candidato para activar la expresión eficiente del transgen en semillas de cártamo. Como se muestra en el Ejemplo 6, CtFAD2-2 es activo en los precursores genéticos donde CtFAD2-l fue inactivado por mutación. Por consiguiente, el promotor de CtFAD2-2 es usado en cártamo para activar la expresión de ARNs horquillas que dirigen la actividad de CtFAD2-2, entre otros genes. Otros elementos promotores útiles para expresión de transgenes en semillas de cártamo incluyen elementos promotores endógenos (es decir cártamo) en las partes de 3' a 5' de genes para Oleosin (CtOleosin) y proteínas de acumulación en semillas, tal como las proteínas 2S y 11S (Ct2S y CtllS). Los elementos promotores de CtFAD2-l, CtOleosin, Ct2S y CtllS son aislados usando técnicas estándares basadas en PCR, basadas en secuencias del genoma de cártamo, e incorporados en vectores de expresión binaria vegetales. Estos elementos promotores son usados para expresar moléculas de ARNhp silenciador en los constructos pCW701-pVW710 o conjuntamente con otros promotores diferentes a los de cártamo que expresan al mismo o a diferentes genes de ARNhp con promotores diferentes tales como en pCW602, pCW603, pCW631 o pCW632. Combinaciones de genes ARNhp con diferentes promotores se producen también mediante plantas transformadas por cruzas con los genes individuales, típicamente donde los genes de ARNhp no son ligados.
Para aislar el promotor de CtFAD2-l, un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 3000 pb de 3' a 5' de codón ATG de inicio de translación de CtFAD2-l es aislado usando téenicas basadas en PCR y usado para remplazar al promotor de AtOleosin de pCW603 y pCW602, generando así los constructos pCW701 y pCW702, respectivamente.
Para aislar el promotor de CtFAD2-2, un fragmento de ADN genómico de 3000 pb de 3' a 5' del codón ATG de inicio de translación de CtFAD2-2 es aislado usando técnicas basadas en PCR y es usado para remplazar al promotor AtOleosin de pCW603 y pCW602, generando así los constructos pCW703 y pCW704, respectivamente.
Para aislar el promotor de CtOleosin-1, un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 1500 pares de base de 3' a 5' del codón ATG de inicio de translación de CtOleosin es aislado usando téenicas basadas en PCR y es usado para remplazar al promotor de AtOleosin de pCW603 y pCW602, generado asi los constructos pCW705 y pCW706, respectivamente.
Para aislar el promotor de Ct2S, un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 1500 pares de bases de codón ATG de inicio de translación de Ct2S es aislado y usado para remplazar al promotor de AtOleosin de pCW603 y pCW602, generando asi los vectores pCW707 y pCW708, respectivamente.
Para aislar el promotor de CtllS, un fragmento de ADN genómico de 1500 pares de bases de 3' a 5' del ATG de inicio de CtllS es aislado del ADN genómico de cártamo usando técnicas basadas y es usado para remplazar al promotor de AtOleosin de pCW603 y pCW602, generando asi los vectores pCW709 y pCW710, respectivamente.
Cada uno de estos vectores es transformado en variedades de cártamo descritas en el Ejemplo 1.
Ejemplo 14. Rendimiento en Campo de Variedades de Cártamo Una serie de accesos y variedades no transformadas de cártamo fueron cultivadas en el verano de 2011 2012 en una estación de campo localizada en Narrabri, New South Wales. Las semillas fueron cultivadas en puntos del campo de 5 m x 3 m en suelo de arcilla pesada encontrado comúnmente en región de Narrabri. Las plantas fueron expuestas a lluvia y luz natural excepto que fueron irrigadas una vez después de 4 semanas de crecimiento. La semilla madura fue cosechada y se analizaron muestras de aproximadamente 50 semillas para contenido de lipidos y composición de ácidos grasos en el aceite de la semilla. El contenido de ácido oleico en el aceite de la semilla de las varias variedades y accesos se expone en la Tabla 19 y en la Figura 13.
Los datos de los ensayos de campo indicaron que hubo un intervalo de contenidos de ácido oleico de la semilla de cártamo, sorprendente en la medida del intervalo observado. Más notablemente, varios accesos descritos como 'oleico alto' y reportados previamente por proporcionar aceite de semilla con al menos 70% de ácido oleico, tal como Ciano-OL, solamente produjeron aproximadamente 42-46% de ácido oleico. Los niveles de ácido linoleico fueron mucho más altos que lo esperado con base en reportes previos. En contraste, otros accesos que fueron reportados por dar contenidos altos de ácido oleico realmente produjeron altos niveles de ácido oleico (60%-76%) en aceites de semilla bajo condiciones de campo, tal como los accesos PI-5601698 y PI- 560169. La razón para los niveles de ácido oleico considerablemente más bajos a los esperados en algunos accesos, se cree que está relacionado con la presencia de alelos de CtFAD2-l diferentes del alelo ol, tal como por ejemplo, el alelo olí, el cual es sensible a la temperatura, y a las condiciones de cultivo que fueron menos que las ideales en la estación de 2011-2012. Análisis de ácidos grasos adicionales sobre la semilla obtenida del cártamo cultivado en campo se llevarán a cabo para confirmar la variación observada en el contenido de ácido oleico de algunos accesos.
Tabla 19. Composición de ácidos grasos de lipidos de variedades de cártamo cultivadas en campo ID C16-.0 C16:l <718:0 C18 : 1 C18:2 <718:3 C20 : 0 C20:1 PI 613463 5.3 < 0.1 575 9.1 78.8 0? 0.6 0.2 PI 537677 6.3 0.2 2.3 10.3 79.9 0.1 0.3 0.2 PI 537645 7.8 0.2 2.2 10.5 78.0 0.1 0.4 0.2 PI 572433 6.4 0.1 2.5 10.7 78.7 0.2 0.4 0.2 PI 572472 6.3 0.2 2.4 11.1 78.7 0.2 0.4 0.2 RC 1002 L 6.8 0.2 2.7 11.5 77.3 0.2 0.4 0.2 PI 537701 6.7 0.2 2.3 11.6 77.8 0.2 0.4 0.2 CC1485-3-1- 7.8 0.2 2.2 11.6 76.9 0.2 0.4 0.2 1-1-1 PI 560163 7.0 0.2 1.9 11.7 77.8 0.1 0.4 0.2 PI 451958 7.1 0.2 2.7 11.8 77.1 < 0.1 0.4 0.2 PI306609 6.6 0.2 2.5 12.0 77.3 0.2 0.4 0 .2 PI 451950 6.6 0.1 2.2 12.4 77.5 0.1 0.4 0 .2 PI 537705 6.6 0.2 2.6 13.1 76.3 0.2 0.4 0.2 PI 413718 7.1 0.2 2.9 13.4 74.9 0.2 0.6 0.2 Tabla 19 (Continuación) ID C16 : 0 C16 : 1 C18 : O C18:l C18:2 C18:3 C20:0 C20 : 1 PI 560161 7.1 0.2 2.1 14.4 75.0 0.1 0.4 0.2 PI 560180 6.5 0.2 2.0 18.3 71.5 0.3 0.4 0.2 PI 401477 5.8 0.2 2.3 36.8 53.2 0.2 0.5 0.2 PI 537712 6.5 0.2 2.5 40.5 48.5 0.2 0.5 0.2 PI 537695 6. O 0.2 2.3 41.9 47.9 0.2 0.5 0.3 CIANO-OL 6.9 0.3 1.9 42.9 46.5 0.2 0.5 0.3 PI 538779 6.6 0.2 2.1 43.2 46.2 0.2 0.4 0.3 Sinonaria 6. O 0.2 2.1 43.5 46.6 0.2 0.4 O .2 PI 401479 5.9 0.2 2.1 48.2 41.7 0.3 0.5 0.4 PI 560166 5.7 0.2 2.3 55.0 35.0 0.1 0.5 0.3 PI 401474 5.5 0.3 1.9 59.3 30.6 0.4 0.6 0.6 PI 560177 5.1 0.2 1.9 60.7 30.3 0.2 0.4 0.3 PI 603207 5.6 0.2 2.0 65.2 25.0 0.2 0.5 0.3 PI 560167 5.8 0.2 1.6 65.9 24.8 0.2 0.4 0.3 PI 560174 5.9 0.3 1.8 67.6 22.6 0.3 0.5 0.3 PI 603208 5.4 0.2 2.3 68.3 21.7 0.2 0.6 O .3 PI 538025 5.3 0.2 2.3 68.5 21.6 0.3 0.4 O .3 PI 560168 5.9 0.2 1.8 68.5 21.8 0.3 0.5 0.3 PI 560169 5.6 0.2 1.9 71.8 18.6 0.2 0.5 0.3 PI 577808 5.3 0.2 2.0 75.0 15.5 0.3 0.5 0.3 PI 612967 5.4 0.2 1.8 76.3 14.5 0.2 0.4 0.3 Este experimento también mostró que el nivel de ácido oleico en el aceite de semillas, obtenido de plantas cultivadas en el campo fue típicamente de aproximadamente 5-10% más bajo que el de plantas cultivadas en invernadero aún para los accesos mejor efectuados en el campo. Se pensó que la razón para esto fue que las condiciones de cultivo del campo fueron menos ideales que en el invernadero.
En un experimento adicional, plantas del cultivar S317 de cártamo fueron cultivadas ya sea en el campo o el invernadero para comparar la composición de ácidos grasos del aceite de la semilla. Aunque las condiciones del campo fueron más favorables durante la estación de cultivo en comparación con la estación 2011-12, el peso de 20 semillas de plantas cultivadas en el campo fue de 0.977 g en vez de 1.202 g de plantas cultivadas en invernadero.18 a 20 semillas de cada grupo fueron analizadas para composición de ácidos grasos por análisis por GC. El nivel de ácido oleico en semillas cultivadas en campo varió desde 74.83 a 80.65 con una media de (+/1 d.s.) 78.52 ± 1.53, en comparación con un intervalo en semillas cultivadas en invernadero de 75.15-78.44 con una media de 76.33 ± 1.00. Estuvieron presentes otros ácidos grasos al nivel en la Tabla 20.
Tabla 20. Composición de ácidos grasos de aceite de semillas cultivadas ya sea en el campo o bien en invernadero.
Ejemplo 15. Cruza de Transgenes en Otras Variedades de Cártamo Se cruzaron manualmente variedades de cártamo usando métodos bien establecidos, por ejemplo, como se describe en Mündel y Begman (2009). La mejor de las lineas transformadas que contenían los constructos descritos anteriormente son seleccionados, particularmente líneas transformadas que contenían solamente una inserción de T-ADN individual, y se cruzaron con plantas e otras variedades de cártamo, no transformadas o ya transformadas con un constructo diferente, el cual tiene rendimiento agronómico óptimo. Usando rondas repetidas de retro-cruzas con el precursor recurrente, por ejemplo por 4 o 5 retrocruzas, y luego se autofecundó, se produjeron plantas que fueron homocigóticas para el constructo deseado en el precursor genético para rendimiento agronómico óptimo. Se puede usar la selección auxiliada por marcador en el proceso de reproducción, tal como, por ejemplo el uso de un marcador perfecto para el alelo ol como se describe en el Ejemplo 7.
Ejemplo 16. Modificación de la Composición mediante silenciamiento genético mediado por microARN Artificial Los microARNs (miARNs) son una clase de ARNs (sARN) pequeños reguladores endógenos de 20 a 24 nucleótidos (nt) tanto para plantas como para animales, los cuales regulan la actividad del gen endógeno. La expresión transgénica de ARNs (precursor de miARN artificial) precursores de miARN modificados representa una estrategia especifica de secuencia y basada en ARN desarrollada recientemente para silenciar genes endógenos. Se ha demostrado que la sustitución de varios nucleótidos en la secuencia precursora de miARN para hacer un precursor de miARN artificial no afecta la biogénesis del miARN, en cuanto a las posiciones de parejas y disparejas en el ciclo del tallo precursor, permanecen sin afectar.
El paquete de programa de cómputo CSIRO atchPoint (www._pi.csiro.au/RNAi) (Horn y Waterhouse, 2010) se usó para identificar secuencias 21-mer especificas en los genes FAD2, FATB y FATB-1 de Arabidopsis los cuales fueron únicos en el genoma de Arabidopsis y, por consiguiente menos probablemente causen el silenciamiento de genes no objetivos (gene excluido como objetivo) cuando son expresados como miARNs artificiales. Una secuencia de 21-mer única fue seleccionada por cada uno de los 3 genes, el 21-mer en cada uno de los casos que es totalmente complementaria (antisentido) a una región del transcrito del gen correspondiente. Se diseñó una molécula del precursor de miARN artificial para cada uno, con base en la secuencia del precursor ara-miRl59b de A. thaliana. En cada caso, la secuencia del precursor miR159b fue modificada en su tallo para acomodar la secuencia 21-mer antisentido. Se elaboraron tres constructos, cada uno que codifica a uno de los ARNs precursores, cada uno bajo el control del promotor FP1 especifico de semilla, y fueron clonados en un vector de expresión binario para generar los constructos designados pJPH 06, pJP1109 y pJlllO.
Estos constructos fueron transformados separadamente en una cepa AGL1 de A tumefaciens y las cepas transformadas se usaron para introducir el constructo genético en A. thaliana (ecotipo Columbia) por el método de inmersión floral en una cepa AGL1 de A. tumefaciens (Ejemplo 1). Semillas (semillas TI) de las plantas tratadas fueron plaqueadas sobre medio MS suplementado con 3.5 mg/L de PPT para seleccionar plántulas transformadas, los cuales fueron transferidas al suelo para establecer platas transgénicas TI confirmadas. Se esperó que la mayoría de estas plantas fueran heterocigóticas para el constructo genético introducido. Semillas T2 de las plantas transgénicas fueron colectadas a madurez y analizadas para su composición de ácidos grasos. Estas plantas T2 incluyeron líneas que fueron homocigóticas para el constructo genético así como también unos que fueron heterocigóticos. Plantas T2 homocigóticas fueron autofertilizadas para producir semillas T3, y plantas progenie de T3 obtenidas a partir de estas semillas a su vez se usaron para obtener plantas progenie T4. Por consiguiente, éstas permitieron el análisis de la estabilidad del silenciamiento del gen durante tres generaciones de plantas progenie.
Los perfiles de ácidos grasos de aceite de semillas obtenido de los lotes de semillas T2, T3 y T4 fueron analizados por GC como se describió en el Ejemplo 1. Se observaron alteraciones en la actividad de D12 desaturasa causadas por la acción del transgen basado en FAD2 como un incremento en la cantidad de ácido oleico en los perfiles de aceite de semilla. Un método relacionado de evaluar los efectos acumulativos de la actividad de A12-desaturasa durante la síntesis de ácidos grasos de la semilla fue a través del cálculo del parámetro proporción de desaturación oleica (ODP) para cada aceite de semillas, obtenido usando la siguiente fórmula: ODP = [% de 18:2 + % de 18:3] / % de 18:1 + % de 18:2 + 18:3. El aceite de semilla de Arabidopsis de tipo salvaje típicamente tiene un valor de ODP de alrededor de 0.70 a 0.79, que significa que 70% a 79% de 18:1 formado durante la síntesis de ácidos grasos en la semilla fue convertido subsecuentemente a los ácidos grasos C18 poli-insaturados, primero de todo por la acción de A12-desaturasa para producir 18:2 y luego por desaturaación adicional a 18:3. Por consiguiente, el parámetro ODP fue útil al determinar el grado de silenciamiento del gen FAD2 sobre el nivel de actividad de A12-desaturasa endógena.
Los niveles de C18:1A9 (ácido oleico) en semillas T2 transformadas con el constructo pJP1106 (objetivo de FAD2) variaron desde 32.9% a 62.7% en 30 eventos transgénicos en comparación con un nivel de C18:l de tipo salvaje promedio de 14% ± 0.2. Una línea altamente silenciada (planta ID-30)que tuvo una sola inserción de transgen, se determinó por proporciones de segregación (3:1) del marcador seleccionable de la planta (PPT), fue adelantada hacia la siguiente generación (T3). De manera similar altos niveles del 18:1D9 se observaron en semillas T3 que variaron desde 46.0% a 63.8% con un promedio de 57.3 ± 5.0%. En la siguiente generación, semillas T4 también mostraron similarmente altos niveles de 18:1D9 que variaron desde 61% a 65.8% con un promedio de 63.3 ± 1.06. El contenido de PUFA total (18:2 + 18:3) en aceite de semillas transgénicas T2 desde 6.1% a 38%, pero en el aceite de semilla de la linea homocigótica ID-30, el contenido de PUFA total se redujo adicionalmente y varió desde 4.3 a 5.7%. El aceite de semilla del ecotipo Columbra de Arabidopsis control tuvo un valor de ODP que varia desde 0.75 - 0.79, lo que significa que más de 75% del ácido oleico producido en la semilla en desarrollo fue convertido subsecuentemente a 18:2 o 18:3. En contraste, el aceite de la semilla del mutante fad2-l de Arabidopsis tuvo un valor de ODP de 0.17, indicando aproximadamente una reducción de 75% en la A12-desaturación debido a la mutación fad2-l . El valor de ODP varió desde 0.08 a 0.48 en el aceite de semilla transgénica T2, 0.07 - 0.32 en el aceite de semilla T3 y 0.06 - 0.08 en el aceite de semilla T4, en contraste al valor de 0.75 en el aceite de semilla de Arabidopsis control. La reducción drástica en los valores de ODP en las lineas transgénicas indicó claramente el silenciamiento eficiente del gen FAD2 endógeno usando el procedimiento del microARN artificial. Este experimento también mostró la estabilidad del silenciamiento del gen durante tres generaciones. Se observaron grados similares de silenciamiento del gen con los otros dos constructos para sub-regular sus genes correspondientes.
El grado de silenciamiento del gen FAD2 y la cantidad de 18:1D9 (63.3 + 1.06%) observado en este estudio usando microARN artificial fue más alta que en el FAD2-2 mutante bien caracterizado (59.4%), la linea de FAD2 silenciado usando el procedimiento de ARN horquilla (56.9 ± 3.6%) y el procedimiento antisentido de horquilla (61.7 + 2.0%). El contenido medio de 18:2 + 18:3% en el aceite de semilla de FAD2 silenciado usando a miARN fue de 4.8 ± 0.37%, el cual fue más bajo que en el FAD2-2 mutante reportado previamente (7.5 ± 1.1%) y la linea de FAD2 silenciada usando el procedimiento antisentido de horquilla (7.2 ± 1.4%). Por consiguiente, estos datos mostraron las ventajas del microARN artificial al grado de silenciar, asi como también la estabilidad del silenciamiento durante las generaciones de progenie.
Ejemplo 17. Evaluación del Contenido de Esterol y Composición en Aceites Los fitoesteroles de 12 muestras de aceite vegetal adquirido de fuentes comerciales en Australia fueron caracterizados por análisis por GC y GC-MS como derivados de éter O-trimetil sililico (OTMSi-éter) como se describe en el Ejemplo 1. Se identificaron los esteróles por datos de retención, la interpretación del espectro de masa y comparación con literatura y datos espectrales de masa de estándares del laboratorio. Los esteróles fueron cuantificados por uso de un estándar interno de 5b(H)-Colan-24- ol. La estructura del fitoesterol básico y las estructuras químicas de algunos de los esteróles identificados se muestran en la Figura 14 y Tabla 21.
Tabla 21. Nombres sistemáticos/IUPAC de esteróles identificados.
Los aceites vegetales analizados fueron de: sésamo ( Sesamun indícum) , aceituna ( Olea europea ) , girasol ( Helianthus annus) , ricino ( Ricinus communis) , cañóla ( Brassica napus) , cártamo ( Carthamus tinctorius) , cacahuate ( Arachis hypogaea) . Lino ( Linum usirarissimum) y soya ( Glycine max) . Al disminuir la relativa abundancia, a través de todas las muestras de aceite, los principales fitoesteroles fueron: b- sitoesterol (intervalo 28-55% de contenido total de esterol), D5- avenaesterol (isofucoesterol) (3-24%), campesterol (2-33%), D5-estigmaesterol (0.7-18%), A7-estigmaesterol(1-18%) y D7-avenaesterol (0.1-5%). Otros varios esteróles menores fueron identificados, estos fueron: colesterol, brassicaesterol, calinaesterol, campeATnol y eburicol. Cuatro C29:2 y dos C30:2 esteróles fueron también detectados, pero se requiere investigación adicional para identificación completa de estos componentes menores. Además, otros varios esteróles no identificados estuvieron presentes en algunos de los aceites, pero debido a su uy poca abundancia, el espectro de masa no fue suficientemente intenso para facilitar la identificación de sus estructuras.
Los contenidos de esterol expresados como mg/g de aceite en cantidades decrecientes fueron: aceite de cañóla (6.8 mg/g), aceite de sésamo (5.8 mg/g), aceite de lino (4.8- 5.2 mg/g), aceite de girasol (3.7-4.1 mg/g), aceite de cacahuate (3.2 mg/g), aceite de cártamo (3.0 mg/g), aceite de soya (3.0 mg/g), aceite de olivo (2.4 mg/g), aceite de ricino (1.9 mg/g). Las composiciones de % de esterol y el contenido de esterol total se presentan en la Tabla 22.
Entre todas las muestras de aceite de semillas, el principal fitoesterol, generalmente fue b-sitoesterol (intervalo de 30-57% del contenido de esterol total). Hubo un amplio intervalo ente los aceites en las proporciones de los otros esteróles importantes: campesterol (2-17%), D5-avenaesterol (4-23%), Al- estigmaesterol (1-18%). Los aceites de diferentes especies tuvieron un perfil de esterol diferente con algunos que tuvieron perfiles muy distintos. El aceite de cañóla tuvo la proporción máxima de campesterol (33.6%), mientras que muestras de otras especies generalmente tuvieron niveles más bajos, por ejemplo, hasta 17% en aceite de cacahuate. El aceite de cártamo tuvo una proporción relativamente alta de Al- estigmaesterol (18%), aunque este esterol fue usualmente bajo en los aceites de otras especies, hasta 9% en aceite de cártamo. Por consiguiente, porque fueron distintivos para cada especie, los perfiles de esterol pueden ser usados para ayudar en la identificación de aceites vegetales o de vegetales específicos y verificar su genuidad o adulteración con otros aceites.
Se compararon dos muestras de cada uno, de girasol y cártamo, en cada caso uno fue producido por prensado en frío de semillas y sin refinar, mientras que la otra no fue prensada en frió y refinada. Aunque se observaron algunas diferencias, los aceites de los dos orígenes tuvieron similar composición de esteróles y contenidos de esterol total, que sugieren que el procesamiento y la refinación tuvieron poco efecto sobre estos dos parámetros. El contenido de esterol entre las muestras varió tres veces y en el intervalo desde 1.9 mg/g a 6.8 mg/g. El aceite de cañóla tuvo el máximo y el aceite de castor el mínimo contenido de esterol.
Tabla 22. Composición y contenido de esterol de aceites vegetales evaluados No. de Lino Lino este- Nombre común Caca(semilla (semilla rol* del eserol Sésamo Olivo Girasol Girasol Ricino Cañóla Girasol Cártamo huate de lino) de lino) Soya Prensado Prensado en frío en frío 1 colesterol 0.2 0.8 0.2 o!o 0?¡ 03 0.2 0.1 0.2 04 04 02~~ 5 2 brassicaesterol 0.1 0.0 0.0 0.0 0.3 0.1 0.0 0.0 0.0 0.2 0.2 0.0 calinaesterol /24- 3 metilen colesterol 1.5 0.1 0.3 0.1 1.1 2.4 0.2 0.1 0.9 1.5 1.4 0.8 campesterol /24- 4 metilcolesterol 16.2 2.4 7.4 7.9 8.4 33.6 12.1 8.5 17.4 15.7 14.4 16.9 campestanol /24- 10 5 metilcolestanol 0.7 0.3 0.3 0.1 0.9 0.2 0.8 0.8 0.3 0.2 0.2 0.7 6 C29:2* 0.0 0.0 0.1 0.2 0.0 0.1 0.5 0.5 0.0 1.2 1.3 0.1 D5- 7 estigmaesterol 6.4 1.2 7.4 7.2 18.6 0.7 7.0 4.6 6.9 5.1 5.8 17.6 8 desconocido 0.5 1.3 0.7 0.6 0.8 0.7 0.7 1.3 0.4 0.7 0.6 1.3 15 Tabla 22 (Continuación) NO. de Nombre Lino Lino este- común del Caca- (semilla (semilla rol* esterol Sesamo Olivo Girasol Girasol Ricino Caóla Girasol Cártamo huate de lino) de lino) Soya Prensado Prensado en frío en frío ergost-7-en- 5 9 3b-o1 0.1 0.1 1.9 1.8 0.2 0.4 2.7 4.0 1.4 1.4 1.4 1.0 10 desconocido 0.0 1.3 0.9 0.8 1.2 0.9 1.8 0.7 1.2 0.7 0.5 0.7 11 eburicol 1.6 1.8 4.1 4.4 1.5 1.0 1.9 2.9 1.2 3.5 3.3 0.9 b-sitoesterol / 24- 12 etilcolesterol 55.3 45.6 43.9 43.6 37.7 50.8 40.2 35.1 57.2 29.9 28.4 40.2 10 D5- avenasterol / 13 isofucosterol 8.6 16.9 7.2 4.1 19.3 4.4 7.3 6.3 5.3 23.0 24.2 3.3 triterpenoide 14 alcohol 0.0 2.4 0.9 1.1 0.0 0.0 1.6 1.9 0.0 0.0 0.0 0.9 triterpenoid 15 15 alcohol 0.0 0.0 0.7 0.6 0.0 0.0 2.8 1.8 0.0 0.0 0.3 0.0 16 (229:2* 0.0 0.5 0.7 0.7 1.5 1.2 2.8 1.9 2.0 1.0 0.7 0.5 Tabla 22 (Continuación) No. de Lino Lino este- Nombre común Caca- (semilla (semilla rol* del esterol Sesamo Olivo Girasol Girasol Ricino Cañóla Girasol Cártamo huate de lino) de lino) Soya Prensado Prensado en frío en frío 18 C30:2* 0.0 0.0 0.0 0.0 1.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 A7-estigmasterol / estigmast-7-en- 19 3b-o1 2.2 7.1 9.3 10.9 2.3 0.9 10.5 18.3 1.1 7.9 8.7 5.6 20 A7-avenaesterol 1.3 0.1 4.0 3.6 0.6 0.2 2.0 4.7 0.7 0.4 0.4 0.6 21 desconocido 0.7 7.1 0.9 0.8 0.0 0.4 0.3 0.4 0.0 3.0 3.6 0.0 22 desconocido 0.3 0.0 0.3 0.9 0.0 0.0 1.2 1.3 0.2 0.1 0.0 0.3 23 desconocido 0.2 0.2 0.3 0.3 0.2 0.1 0.3 0.2 0.2 0.1 0.2 0.5 24 desconocido 0.0 3.1 0.9 1.3 0.6 0.4 0.2 0.4 0.7 1.7 1.9 0.8 25 desconocido 0.9 0.4 0.3 0.5 0.3 0.1 0.5 0.7 0.3 0.1 0.1 0.6 26 C30:2 2.2 6.0 4.6 5.7 1.4 0.6 1.0 1.2 1.2 1.2 1.1 5.2 27 desconocido 0.0 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.1 0.2 Suma de esteróles totales 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 10( 15 C29:2* y C30:2* denotan un esterol C29 con dos dobles enlaces y un esterol C30 con dos dobles enlaces, respectivamente .
Se efectuó un análisis separado de aceites de cártamo de semillas control derivadas de invernadero (serie S), semillas altas en oleico genéticamente modificadas (serie T) y dos aceites de cártamo comerciales. Se observaron varias características (Tabla 23). Primero, hay un alto grado de similaridad en el patrón de esterol entre el control y las semillas modificadas y en segundo término los aceites de cártamo comerciales están en un agrupamiento separado y, por consiguiente se mostró que tienen un perfil de fitoesterol significativamente diferente. El examen adicional de los perfiles de fitoesterol también mostró la similaridad de los perfiles de fitoesterol de muestras de semilla de cártamo control y modificadas.
Los expertos en la materia apreciarán que se pueden hacer numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención como se expone en las modalidades específicas sin alejarse del espíritu o alcance de la invención como se describió ampliamente. Por consiguiente, las modalidades de la presente se consideran en todos aspectos como ilustrativas y no restrictivas.
La presente solicitud reclama la prioridad de US 61/638,447 presentada el 25 de Abril de 2012, y AU 2012903992 presentada el 11 de Septiembre de 2012, ambas incorporadas a la presente como referencia.
Todas las publicaciones discutidas y/o mencionadas en la presente se incorporan a la misma integramente.
Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, artículos o los similares que han sido incluidos en la presente especificación son solamente para propósitos de proporcionar un contexto para la presente invención. No se tomarán como una admisión de que cualquiera o todos estos temas forman parte del arte previo base o fueron conocimientos generales comunes en el campo relevante a la presente invención como existió antes de la fecha de prioridad de cada una de las reivindicaciones de esta solicitud.
Tabla 23. Composición de esteróles (% de esteróles totales) y contenido (mg/g) de muestras de aceite de semilla de cártamo No. de P2589 P2590 P2591 P2592 P2593 Nombre(s) TS603.9.2 TS603.9.4 TS603.9.5 Esteral común(es) ILIPAC / Nombre sistemático S317(1) S317(2) T1 T1 T1 5 1 colesterol colest-5-en-33-ol 0.5 0.6 0.5 3.0 11 2 brassica esteral 24-metilcolesta-5,22E-dien-3p-ol 0.0 0.0 0.1 0.0 0.1 calinaesterol / 24- 3 metilen colesterol 24-metllcolesta-5,24(28)E-dien-3p-ol 0.8 0.8 1.1 1.1 1.2 campesterol / 24- 4 metilcolesterol 24-metilcolest-5-en-3p-ol 10.5 11.6 11.0 11.8 11.8 campestanol / 24- 5 metilcolestanol 24-metilcolestan-3p-ol 0.0 0.1 0.2 0.0 0.3 6 C29:2** 0.9 0.8 0.2 7.2 0.4 10 D5- 7 estigmaesterol 24-etilcolesta-5,22E-dien-3p-o I 0.7 0.9 0.8 0.8 0.6 8 desconocido*** 1.8 2.1 2.3 2.1 2.0 9 ergost-7-en-3p-ol 24-met¡lcolest-7-en-3p-ol 2.8 3.3 2.6 2.3 2.6 10 desconocido*** 1.5 1.6 1.3 1.8 1.4 4,4,14-trimet¡lergosta-8,24(28)-d¡en-3p- 11 eburicol ol 1.7 2.2 5.0 2.8 2.6 b-sitoesterol / 24- 12 etilcolesterol 24-etilcolest-5-en-3p-ol 35.9 37.0 35.7 36.2 37.5 A5-avenaesterol / 13 isofucoesterol 24-ethylcholesta-5,24(28)Z-dien-3p-ol 10.4 8.2 10.0 7.9 9.3 15 alcohol 14 triterpenoide 1.6 1.9 1.4 1.2 1.4 Tabla 23 (Continuación) No.de P2589 P2590 P2591 P2592 P2593 Nombre(s) TS603.9.2 TS603.9.4 TS603.9.5 Estero!común(es) IUPAC / Nombre sistemático S317 (1) S317 (2) T1 T1 T1 15 alcohol triterpenoide 1.8 2.2 1.3 0.9 1.6 16 C29:2** 4.4 0.6 3.1 2.8 2.1 17 C29:2** 2.2 2.2 2.1 2.1 1.7 18 C30:2** 1.9 0.8 1.8 1.9 2.1 A7-estigmaesterol / 19 estigmast-7-en-^-ol 24-etilcolest-7-en-3p-ol 11.4 13.6 10.3 8.9 10.7 24-etilcolesta 7,24(28)Z-dien-3p- 20 A7-avenaesterol**** ol 6.1 5.7 5.3 3.4 4.9 21 desconocido*** 0.2 0.4 0.2 0.5 0.4 22 desconocido*** 0.9 1.0 1.1 1.1 0.9 Gü Cü 23 desconocido*** 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 fe 24 desconocido*** 0.2 0.6 0.9 1.5 0.9 10 25 desconocido*** 0.9 0.6 0.3 1.0 0.5 26 C30:2 0.9 1.0 0.5 2.9 1.4 27 desconocido*** 0.0 0.1 0.8 2.2 0.4 Suma 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 Esteróles totales ( g/g o·1).. 1.9 2.2 2.0 2.0 1.8 * Números de estero! se refiere a trazas por GC . ** C29:2 y C30:2 denota C29 con dos dobles enlaces y C30 esteral con dos dobles enlaces, respectivamente. *** desconocido **** identificación tentativa.
S317 las muestras son controles de precursores no modificados y TS las muestras son muestras de aceite de 15 cártamo modificado alto en ácido oleico 335 REFERENCIAS Abdullah y colaboradores (1986) Biotech.4:1087.
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Claims (94)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1.- Lipido extraído de una semilla oleosa, el lípido que comprende triacilgliceroles (TAG) los cuales consisten de ácidos grasos esterificados a glicerol, caracterizado porque i) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico, ii) al menos 95% en peso del lipido es TAG, iii) aproximadamente 90% a aproximadamente 95% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido oleico, iv) menos de aproximadamente 3.1% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido palmítico, y v) el lípido tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0.037 y/o un valor palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0.063.
2.- El lípido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una o más o todas las características siguientes, a) aproximadamente 90% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91 % a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 92%, o aproximadamente 92% o aproximadamente 93%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido oleico. b) menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.75%, o menos de aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.75%, o aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 2.3% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido palmítico. c) aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3% o aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 2%, o aproximadamente 2%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido son ácidos grasos poli-insaturados (PUFA), d) menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.5%, o menos de aproximadamente 2.25%, o aproximadamente 3% o aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 2.25%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lípido es ácido linoleico, e) menos de aproximadamente 1%, o menos de aproximadamente 0.5%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es ácido a-linolénico (ALA), f) aproximadamente 0.5% a aproximadamente 1% en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido es 18:1D11, g) el ODP del contenido de ácidos grasos totales del lipido es aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.022 a aproximadamente 0.016, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.023, o es aproximadamente 0.03, o aproximadamente 0.02, o aproximadamente 0.01, h) el valor de PLO del contenido de ácidos grasos totales del lipido es de aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.063, aproximadamente 0.020 aproximadamente 0.055, o aproximadamente 0.020 aproximadamente 0.050, o aproximadamente 0.050 aproximadamente 0.055, o aproximadamente 0.063, o aproximadamente 0.055, o aproximadamente 0.050, o aproximadamente 0.040, o aproximadamente 0.030, aproximadamente 0.020, i) aproximadamente 90% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 92% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 93%, o aproximadamente 94%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido son ácidos grasos monoinsaturados, j) el lipido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de aproximadamente 0.02% o menos de aproximadamente 0.015, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.02, k) el lipido está en la forma de un aceite purificado, y l) el lipido es no hidrogenado.
3.- El lipido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el PÜFA es ácido linoleico.
4.- El lipido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el ácido a-linolénico es indetectable en el contenido de ácidos grasos del lipido.
5.- El lipido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque aproximadamente 55% a aproximadamente 80%, o aproximadamente 60% a aproximadamente 80%, o aproximadamente 70% a aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 60%, o al menos aproximadamente 70%, o aproximadamente 60%, o aproximadamente 70%, o aproximadamente 80%, del contenido de TAG del lipido es trioleina.
6.- El lipido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 2%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5%, del contenido de ácido oleico del lipido está en la forma de diacilgliceroles (DAG).
7.- El lipido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque está en la forma de un aceite, en donde al menos 90%, o al menos 95%, al menos aproximadamente 98%, o aproximadamente 95% a aproximadamente 98% en peso del aceite es el lipido.
8.- El lipido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la semilla oleosa es una semillaoleosa no fotosintética, preferiblemente semilla de cártamo, girasol, algodón o ricino.
9.- El lipido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque adicionalmente comprende uno o más esteróles.
10.- El lipido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque está en la forma de un aceite, y porque comprende menos de aproximadamente 5 mg de esteróles/g de aceite, o aproximadamente 1.5 mg de esteroles/g de aceite a aproximadamente 5 mg de esteroles/g de aceite.
11.- El lipido de conformidad con la reivindicación 10 caracterizado porque comprende uno o más o todos de a) aproximadamente 1.5% a aproximadamente 4.5%, o aproximadamente 2.3% a aproximadamente 4.5%, del contenido total de esterol es ergost- 7- en- 3b- ol. b) aproximadamente 0.5% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 1.5% a aproximadamente 3%, del contenido de esterol total es alcohol triterpenoide. c) aproximadamente 8.9% a aproximadamente 20%, del contenido de esterol total es D7- estigmaesterol/estigma- 7-en- 3b- ol, y d) aproximadamente 1.7% a aproximadamente 6.1% del contenido de esterol total es D7- avenaesterol.
12.- El lipido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque tiene un volumen de al menos 1 litro y/o un peso de al menos 1 kg, y/o porque fue extraído de aceite de semillas obtenidas de plantas cultivadas en campo.
13.- Una composición caracterizada porque comprende un primer componente que es lipido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un segundo componente, preferiblemente donde la composición fue producida por mezcla del lipido con el segundo componente.
14.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el segundo componente es una sustancia no lipídica tal como una enzima, un catalizador no proteínico o producto químico, o uno o más ingredientes de un alimento.
15.- Un proceso para producir aceite, el proceso se caracteriza porque comprende i)o btener un aceite de semillas que comprende, y/o que es capaz de producir una planta que produce semillas oleosas que comprende, aceite, en donde el contenido de aceite de la semilla oleosa es un lipido como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y ii) extraer aceite de la semilla oleosa a fin de producir el aceite.
16.- El proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la semilla oleosa comprende un primer polinucléotido exógeno que codifica a un primer ARN silenciador, el cual es capaz de reducir la expresión de una gen de A12-desaturasa ( FAD2 ) en una semilla oleosa en desarrollo en relación con una semilla oleosa correspondiente que carece del polinucléotido exógeno, y en donde el polinucléotido está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucléotido en la semilla oleosa en desarrollo.
17.- Un proceso para producir aceite, el proceso se caracteriza porque comprende i) obtener semillas de cártamo cuyo contenido de aceite comprenda, y/ola cual sea capaz de producir una planta que produzca semillas cuyo contenido de aceite comprenda, triacetilgliceroles (TAG) los cuales consisten de ácidos grasos esterificados a glicerol, y en donde a) los ácidos grasos comprenden ácido palmitico y ácido oleico, b) al menos 95% en peso del contenido de aceite de las semillas es TAG, c) aproximadamente 75% a aproximadamente 95% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de las semillas es ácido oleico, d) menos de aproximadamente 5.1% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de las semillas es ácido palmitico, y e) el contenido de aceite de las semillas tiene una proporción de desaturación (ODP de menos de aproximadamente 0.17 y/o un valor de palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente, 0.26 y ii) extraer aceite de las semillas de cártamo a fin de producir el aceite, en donde las semillas de cártamo comprenden un primer polinucleótido exógeno que codifica a un primer ARN silenciador, el cual es capaz de reducir la expresión de un gen de D12- desaturasa {FAD2) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el polinucleótido está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo.
18.- El proceso de conformidad con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, caracterizado porque la semilla oleosa o semilla de cártamo comprende un segundo polinucleótido exógeno que codifica a un segundo ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de un gen de palmitoil-ACP tioestearasa ( FATB ) en una semilla oleosa en desarrollo o semilla de cártamo en relación con una semilla oleosa o semilla de cártamo que carece del segundo polinucleótido exógeno, y en donde el segundo polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido exógeno en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
19.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque la semilla oleosa o semilla de cártamo comprende un tercer polinucleótido exógeno que codifica a un tercer ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de un gen de ácido graso w6 desaturasa plastidial ( FAD6) en una semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente que carece del tercer polinucleótido exógeno, y en donde el tercer polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
20.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque 1) el gen FAD2 es uno o más de un gen CtFAD2-l, un gen CtFAD2-2, y un gen CtFAD2-10, y/o 2) el gen FATB es un gen CtFATB-3 , y/o 3) el gen FAD6 es un gen CtFAD6.
21.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizado porque el contenido de aceite de la semilla de cártamo tiene uno o más o todas las características siguientes, a) aproximadamente 80% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 85% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 90% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 92%, o aproximadamente 92%, o aproximadamente 93% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico. b) menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 4%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.75%, o menos de aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.75%, o aproximadamente 2.5% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite es ácido palmitico. c) aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 7.5%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2%, en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácidos grasos poli-insaturados (PUFA), d) menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.5%, o menos de aproximadamente 2.25%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.5% o aproximadamente 2.25%, en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido linoleico (LA). e) aproximadamente 80% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 90% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 92% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 93% o aproximadamente 94%, en peso del contenido de ácidos graos totales del lipido es ácidos grasos monoinsaturados. f) el lipido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de aproximadamente 0.05, o menos de aproximadamente 0.02, o menos de aproximadamente 0.015, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.05, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.02, g) el ODP del contenido de aceite de la semilla es de aproximadamente 0.17 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.075 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.050 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.016, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.023, o es aproximadamente 0.03, o aproximadamente 0.02, o aproximadamente 0.01, y h) el valor de PLO del contenido de aceite de la semilla es de aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.26, o aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.20, o aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.15, o aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.1, o aproximadamente 0.020 y aproximadamente 0.075, o aproximadamente 0.050 y aproximadamente 0.055, o es aproximadamente 0.05, o aproximadamente 0.040, o aproximadamente 0.030, o aproximadamente 0.020.
22.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado porque el aceite es lipido, el cual se caracteriza adicionalmente por una o más de las características de las reivindicaciones 3 a 7 o 9 a 11.
23.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque la etapa de extraer el aceite comprende triturar la semilla oleosa o la semilla de cártamo.
24.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, caracterizado porque comprende una etapa de purificar el aceite extraído de la semilla oleosa o la semilla de cártamo, en donde la etapa de purificación comprende una o más o todas del grupo que consiste de desgomado, desodorización, decoloración, secado y/o fraccionamiento del aceite extraído, y/o remover al menos alguno, preferiblemente sustancialmente todas las, ceras y/o ésteres de ceras del aceite extraído.
25.-Una semilla oleosa cuyo contenido de aceite comprende, y/o la cual es capaz de producir una planta que produce semillas oleosas cuyo contenido de aceite comprende, triacilgliceroles (TAG) los cuales consisten de ácidos grasos esterificados a glicerol, y se caracteriza porque i) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico, ii) al menos 95% en peso del contenido de aceite de la semilla oleosa es TAG. iii) aproximadamente 90% a aproximadamente 95% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla oleosa es ácido oleico. iv) menos de aproximadamente 3.1% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla oleosa es ácido palmitico, y v) el contenido de aceite de la semilla oleosa tiene una proporción de insaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0.037 y/o valor de palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0.063.
26.- La semilla oleosa de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque es una semilla oleosa no fotosintética, preferiblemente cártamo, girasol, algodón o ricino.
27.- La semilla oleosa de conformidad con la reivindicación 25 o la reivindicación 26, caracterizada porque comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica a un primer ARN silenciador, el cual es capaz o que reduce la expresión de un gen de D12 desaturasa ( FAD2 ) en una semilla oleosa en desarrollo en relación con una semilla oleosa correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el primer polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa en desarrollo.
28.- Una semilla de cártamo cuyo contenido de aceite comprende, y/o la cual es capaz de producir una planta que produce semillas cuyo contenido de aceite comprende, triacilgliceroles (TAGs) los cuales consisten de ácidos grasos esterificados a glicerol, caracterizada porque i) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico, ii) aproximadamente 95% en peso del contenido de aceite de la semilla es TAG, iii) aproximadamente 75% a aproximadamente 95% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite d la semilla es ácido oleico. iv) menos de aproximadamente 5.1% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico, y v) el contenido de aceite de la semilla tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0.17 y/o un valor de palmiLico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0.26, y en donde la semilla de cártamo comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica a un primer ARN silenciador, que es capaz de reducir la expresión de un gen de A12-desaturasa (FAD2) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el primer polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo.
29.- La semilla de cártamo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el contenido de aceite de la semilla tiene una o más de las siguientes características, a) aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o aproximadamente 85% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 90% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 94%, o aproximadamente 91% a aproximadamente 92%, o aproximadamente 92%, o aproximadamente 93% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico. b) menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 4%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.75%, o menos de aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.75%, o aproximadamente 2.5% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico, c) aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 7.5% o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3% o aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, o aproximadamente 3% o aproximadamente 2% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácidos grasos poli-insaturados (PUFA), d) menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2.5%, o menos de aproximadamente 2.25%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2.5%, o aproximadamente 2.25% en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido linoleico (LA), e) aproximadamente 80% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 90% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 92% a aproximadamente 96%, o aproximadamente 93%, o aproximadamente 94%, en peso del contenido de ácidos grasos totales del lipido son ácidos grasos monoinsaturados, f) el lipido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de aproximadamente 0.05, o menos de aproximadamente 0.02, o menos de aproximadamente 0.015, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.05, o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.02, g) el ODP del contenido de aceite de la semilla es de aproximadamente 0.17 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.075 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.050 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.01, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.016, o aproximadamente 0.033 a aproximadamente 0.023, o es de aproximadamente 0.03, o aproximadamente 0.02, o aproximadamente 0.01, y h) el valor de PLO del contenido de aceite de la semilla es de aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.26, o de aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.2, o aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.15, o aproximadamente 0.020 a aproximadamente 0.1, o aproximadamente 0.020 y aproximadamente 0.075, o aproximadamente 0.050 y aproximadamente 0.055, o es de aproximadamente 0.05, o aproximadamente 0.040, o aproximadamente 0.030, o aproximadamente 0.020.
30.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, caracterizada porque el contenido de aceite de la semilla es lipido la cual se caracteriza adicionalmente por una o más de las características de conformidad con las reivindicaciones 3 a 7 o 9 a 11.
31.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, caracterizada porque comprende un sequndo polinucleótido exógeno que codifica a un segundo ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de un gen de palmitoil-ACP tioestearasa ( FATB) en una semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente que carece del segundo polinucleótido exógeno, y en donde el segundo polinucleótido exógeno está unido operablemente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
32.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, caracterizada porque comprende un tercer polinucleótido exógeno que es capaz de reducir la expresión de un gen de roe-ácido graso desaturasa plastidial ( FAD6) en una semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente que carece del tercer polinucleótido exógeno, y en donde el tercer polinucleótido exógeno está operablemente unido a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
33.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, caracterizada porque el primer ARN silenciador reduce la expresión de más de un gen endógeno que codifica a FAD2 en semillas oleosas o semillas de cártamo en desarrollo y/o en donde el segundo ARN silenciador reduce la expresión de más de un gen endógeno que codifica a FATB en semillas oleosas o semillas de cártamo en desarrollo.
34.- La semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, caracterizada porque el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno están unidos covalentemente sobre una molécula de ADN individual, opcionalmente secuencias de ADN de unión entre el primer, segundo y/o tercer polinucleótidos exógenos.
35.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno están bajo el control de un promotor individual de modo que, cuando el primer polinucleótido exógeno y el segundo polinucleótido exógeno y/o el tercer polinucleótido exógeno son transcritos en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo, el primer ARN silenciador y el segundo ARN silenciador y/o el tercer ARN silenciador están unidos covalentemente como partes de un transcrito de ARN individual.
36.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 35, caracterizada porque comprende un ADN de transferencia individual integrado en el genoma de la semilla oleosa o semilla de cártamo, y en donde el ADN de transferencia individual comprende el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno.
37.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque es homocigótica para el ADN de transferencia.
38.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 37, caracterizada porque el primer ARN silenciador, el segundo ARN silenciador y el tercer ARN silenciador, son cada uno seleccionados independientemente del grupo que consiste de: un polinucleótido antisentido, un polinucleótido en el sentido, un polinucleótido catalítico, un microARN y un ARN de doble hebra.
39.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 38, caracterizada porque una cualquiera o más, preferiblemente todos, los promotores son semillas especificas, y preferiblemente expresadas en el embrión de la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
40.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 39, caracterizada porque comprende una o más mutaciones en uno o mas genes FAD2, en donde la(s) mutación(es) reduce(n) la actividad de uno o más genes FAD2 en semillas oleosas o semillas de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente que carece de la(s) mutación(es).
41.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque comprende una mutación del gen FAD2 en relación con un gen FAD2 de tipo salvaje en una semilla oleosa o semilla de cártamo correspondiente, dicha mutación es una eliminación, una inserción, una inserción, un marco de desplazamiento, un codón de detención de translación prematura, o una o más sustituciones de aminoácidos no conservadoras.
42.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con la reivindicación 40 o la reivindicación 41, caracterizada porque la mutación es una mutación nula en el gen FAD2.
43.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, caracterizada porque al menos una de las mutaciones está en un gen FAD2 que codifica a más actividad de FAD2 en la semilla oleosa o semilla de cártamo que carece de la(s) mutación (s) que cualquier otro gen FAD2 en la semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo.
44.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, caracterizada porque es una semilla de cártamo, en donde el gen FAD2 es el gen CtFAD2-l .
45.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 44, caracterizada porque comprende un alelo ol del gen CtFAD2-l o un alelo olí del gen CtFAD2-l , o ambos alelos.
46.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el alelo ol o el alelo olí del gen CtFAD2-l está presente en el estado homocigótico.
47.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 46, caracterizada porque la proteina de FAD2 es indetectable en la semilla.
48.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 47, caracterizada porque es una semilla de cártamo, y en donde el primer ARN silenciador reduce la expresión de ambos genes, CtFAD2-l y CtFAD2-2.
49.- La semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 48, que es una semilla de cártamo, y se caracteriza porque 1) el gen FAD2 es uno o más de un gen CtFAD2 l, un gen CtFAD2-2, y un gen CtFAD2-10, y/o 2) el gen FATB es un gen CtFATB-3, y/o 3) el gen FAD6 es un gen CtFAD6.
50.- Una planta de semilla oleosa o planta de cártamo caracterizada porque capaz de producir la semilla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49.
51.- La planta de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque es transgénica y homocigótica para cada polinucleótido exógeno, y/o comprende el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno o el tercer polinucleótido exógeno.
52.- Un polipéptido recombinante y/o sustancialmente purificado caracterizado porque comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la proporcionada en cualquiera de las SEC ID NOs: 27 a 37, 44, 45 o 48, un fragmento biológicamente activo de éstas, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 40% idéntica a una cualquiera o más de las SEC ID NOs: 27 a 37, 44, 45 o 48.
53.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque es una enzima modificadora de ácidos grasos, preferiblemente una oleato D12 desaturasa, A12-acetilenasa, una palmitoleato D12 desaturasa o una palmitoil ACP tioestearasa (FATB).
54. Un polimucleótido exógeno y/o aislado caracterizado porque comprende uno o más de i) nucleótidos que tienen una secuencia como la proporcionada en cualquiera de las SEC ID NOs: 1 a 25, 40 a 43, 46 o 47, ii) nucleótidos que tienen una secuencia que codifica a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 52 o la reivindicación 53, iii) nucleótidos que hibridizan a una secuencia como la proporcionada en cualquiera de las SEC ID NOs: 1 a 25, 40 a 43, 46 o 47, y iv) nucleótidos que tienen una secuencia tal, que cuando son expresados en una semilla de una planta de semillas oleosas, reducen la expresión de un gen que codifica al menos aun polipéptido de conformidad con la reivindicación 52 o la reivindicación 53.
55.- El polinucleótido de conformidad con la parte iv) de la reivindicación 54, caracterizado porque es seleccionado de: un polinucleótido antisentido, un polinucleótido en el sentido, un polinucleótido catalítico, un microARN, una molécula de ARN de doble hebra (ARNds) o un producto de ARN procesado de éstos.
56.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque es una molécula de ARNds o un producto de ARN procesado de ésta, que comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos, que son al menos 95% idéntico al complemento de una cualquiera o más de las SEC ID NOs: 1 a 25, 40 a 43, 46, 47 o 49 a 51 (donde la timina (T) es uracilo (U)).
57.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 55 o la reivindicación 56, caracterizado porque la molécula de ARNds es un precursor de microARN (miARN) y/o en donde el producto de ARN procesado de éste es un miARN.
58.- El polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 57, caracterizado porque es transcrito en una semilla oleosa o semilla de cártamo en desarrollo bajo el control de un promotor individual, en donde la molécula de ARNds comprende secuencias complementarias en el sentido y antisentido, las cuales son capaces de hibridizarse entre si, unidas por una región de ADN de una sola hebra.
59.- El polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 58, caracterizado porque cuando está presente en una semilla de cártamo en desarrollo, i) reduce la expresión de un gen endógeno que codifica a oleato D12 desaturasa (FAD2) en la semilla en desarrollo, el FAD2 que tiene una secuencia de aminoácidos como la proporcionada en una cualquiera o más de las SEC ID NOs: 27, 28 o 36; ii) reduce la expresión de un gen endógeno que codifica a palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) en la semilla en desarrollo, el FATB que tiene una secuencia de aminoácidos como la proporcionada en la SEC ID NO: 45; y/o iii) reduce la expresión de un gen que codifica a un ácido graso co6 desaturasa (FAD6) que tiene una secuencia de aminoácidos como la proporcionada en la SEC ID NO: 48.
60.- Un vector quimérico caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 59, operablemente unido a un promotor.
61.- El vector de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el promotor es funcional en una semilla oleosa o es un promotor especifico de semilla, preferiblemente es expresado preferencialmente en el embridn de una semilla oleosa en desarrollo.
62.- Una célula recombinante caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 59, y/o un vector de conformidad con la reivindicación 60 o la reivindicación 61.
63.- La célula de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque es una célula vegetal, preferiblemente una célula de semilla vegetal.
64.- La célula de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque la célula vegetal es una célula vegetal de semilla oleosa.
65.- La célula de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque la célula vegetal es una célula de semilla no fotosintética, preferiblemente una célula de semilla de cártamo, girasol, algodón o ricino.
66.- Un organismo transgénico no humano caracterizado porque comprende uno o más de los polinucleótidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 59, un vector de conformidad con la reivindicación 60 o la reivindicación 61, y una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65.
67.- El organismo transgénico no humano de conformidad con la reivindicación 66 caracterizado porque es una planta.
68.- El organismo transgénico no humano de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque es una planta de semilla oleosa.
69.- Un método de producir la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, el método se caracteriza porque comprende la etapa de introducir el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 59, y/o un vector de conformidad con la reivindicación 60 o la reivindicación 61, en una célula.
70.- Uso del polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 59 y/o un vector de conformidad con la reivindicación 60 o la reivindicación 61 para producir una célula recombinante.
71.- Un método de producir una planta transgénica de semilla oleosa, que produce una semilla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 49, o semilla de ésta, el método se caracteriza porque comprende i) introducir al menos un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 (parte iv) a 59 y/o al menos un vector de conformidad con la reivindicación 60 o la reivindicación 61, en una célula de una planta de semilla oleosa, ii) regenerar una planta transgénica a partir de la célula, y iii) opcionalmente producir una o más plantas o semillas descendientes de éstas a partir de la planta transgénica, produciendo asi la planta de semilla oleosa transgénica o semillas de ésta.
72.- El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la semilla es semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49.
73.- El método de conformidad con la reivindicación 71 o la reivindicación 72, caracterizado porque la una o más plantas o semillas descendientes de éstas, comprenden i) un primer polinucleótido exógeno, y/o ii) el segundo polinucleótido exógeno, y/ iii) el tercer polinucleótido exógeno, preferiblemente los tres polinucleótidos exógenos.
74.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71 a 73, caracterizado porque la una o más plantas o semillas descendientes de éstas, que comprenden una o más mutaciones como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 40 a 46.
75.- Un método de obtener una planta de semilla oleosa, el método se caracteriza porque comprende i) cruzar una primera planta de semilla oleosa precursora que comprende un primer polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 (parte iv) a 59, o un primer vector de conformidad con la reivindicación 60 o la reivindicación 61, con una segunda planta de semilla oleosa precursora que comprende un segundo polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 (parte iv) a 59, o un primer vector de conformidad con la reivindicación 60 o la reivindicación 61, ii) las plantas descendientes de la cruza por la presencia de ambos polinucleótidos o ambos vectores; y iii) seleccionar una planta descendiente que comprenda ambos (a) el primer polinucleótido o el primer vector y (b) el segundo polinucleótido o el segundo vector, y que tenga adicionalmente una proporción creciente de ácido oleico y una proporción decreciente de ácido palmitico en el contenido de aceite de la semilla de la planta.
76.- Un método de genotipificar una planta de cártamo, el método se caracteriza porque comprende detectar una molécula de ácido nucleico de la planta, en donde la molécula de ácido nucleico está ligada a, y/o comprende al menos parte de, uno o más de los genes CtFAD2-l, CtFAD2-2 o CtFAD2-10 de una planta de cártamo.
77.- El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el método comprende determinar el nivel expresión, y/o la secuencia, de uno o más de los genes CtFAD2-l, CtFAD2-2 o CtFAD2-10 de la planta.
78.- El método de conformidad con la reivindicación 76 o la reivindicación 77 caracterizado porque comprende: i) hibridizar un segunda molécula de ácido nucleico a dicha molécula de ácido nucleico de la planta, ii) opcionalmente, hibridizar al menos otra molécula de ácido nucleico a dicha molécula de ácido nucleico de la planta; y iii) detectar un producto de dicha etapa de hibridización o la ausencia de un producto procedente de dicha etapa de hibridización.
79.- El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la segunda molécula de ácido nucleico es usada como un cebador para replicar o transcribir de manera inversa al menos una porción de la molécula de ácido nucleico de la planta.
80.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 76 a 79, caracterizado porque el ácido nucleico es detectado usando una téenica seleccionada del grupo que consiste de: análisis de polimorfismo de la extensión del fragmento de restricción, análisis del polimorfismo de la extensión del fragmento de amplificación, amplificación microsatélite, secuenciación del ácido nucleico, y/o amplificación del ácido nucleico.
81.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 76 a 80, caracterizado porque el método detecta la ausencia o presencia de un alelo del gen CtFAD2-l, preferiblemente el alelo ol .
82.- Un método de seleccionar una planta de cártamo procedente de una población de plantas de cártamo, el método se caracteriza porque comprende: i) genotipificar dicha población de plantas usando un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81, caracterizado porque dicha población de plantas fue obtenida a partir de una cruza entre dos plantas de las cuales al menos una planta comprende un alelo de un gen CtFAD2-l, CtFAD2-2 o CtFAD2-10, el cual confiere a la semilla en desarrollo de dicha planta un nivel reducido de actividad D12 desaturasa, en relación a una semilla correspondiente de una planta de cártamo que carece de dicho alelo, y ii) seleccionar la planta de cártamo con base en la presencia o ausencia de dicho alelo.
83.- Un método de introducir un alelo de un gen CtFAD2-l, CtFAD2-2 o CtFAD2-10 en una planta de cártamo que carezca del alelo, el método de caracteriza porque comprende; i) cruzar una primera planta de cártamo precursora con una segunda planta de cártamo precursora, en donde la segunda planta comprende dicho alelo de un gen CtFAD2-l, CtFAD2-2 o CtFAD2-10, y ii) retrocruzar la descendencia de la cruza de la etapa i) con plantas del mismo genotipo que la primera planta precursora por un número suficiente de veces para producir una planta con una mayoría del genotipo del primer precursor pero que comprenda dicho alelo, en donde el alelo confiere a la semilla en desarrollo de dicha planta un nivel reducido de actividad D12 reductasa, en relación con una semilla de una planta de cártamo correspondiente que carezca de dicho alelo, y en donde las plantas descendientes son genotipificadas por la presencia o ausencia de dicho alelo usando un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 76 a 81.
84.- Una planta transgénica, o plantas descendientes de ésta, o semillas de ésta, producida usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71 a 83.
85.- Un método de producir semillas, el método se caracteriza porque comprende, a) cultivar una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67, 68 u 84, preferiblemente en un campo como parte de una población de al menos 100 de dichas plantas, y b) cosechar la semilla.
86.- Aceite obtenido u obtenible mediante uno o mas de los procesos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, procedente de la semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49, procedente de plantas o parte de éstas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67, 68 u 84, procedentes de la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, y/o del organismo transgénico no humano o parte de éste de conformidad con la reivindicación 66.
87.- Una composición caracterizada porque comprende uno o más de los lipidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, la semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49, el polipéptido de conformidad con la reivindicación 52 a la reivindicación 53, el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 59, el vector de conformidad con la reivindicación 60 o la reivindicación 61, la célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, o el aceite de conformidad con la reivindicación 86, y uno o más portadores aceptables.
88.- Uso de uno o más de los lipidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, la composición de conformidad con las reivindicaciones 13, 14 u 87, el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, la semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49, la planta o parte de ésta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67, 68 u 84, la célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, el organismo transgénico no humano o parte de éste de conformidad con la reivindicación 66, o el aceite de conformidad con la reivindicación 86, para la fabricación de un producto industrial.
89.-Un proceso para producir un producto industrial, el proceso que comprende las etapas de: i)obtener uno o más de los lipidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, la composición de conformidad con las reivindicaciones 13, 14 u 87, la semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49, la planta o parte de ésta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67, 68 u 84, la célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, el organismo transgénico no humano o parte de éste de conformidad con la reivindicación 66 o el aceite de conformidad con la reivindicación 86. ii) opcionalmente, procesar físicamente uno o más de los lípidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, la composición de conformidad con las reivindicaciones 13, 14 u 87, la semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49, la planta o parte de ésta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67, 68 u 84, la célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, el organismo transgénico no humano o parte de éste de conformidad con la reivindicación 66 o el aceite de conformidad con la reivindicación 86, de etapa i). ii) convertir al menos alguno de los lípidos de \ conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o el lípido en una o más de las composiciones de conformidad con las reivindicaciones 13, 14 u 87, la semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de la reivindicaciones 25 a 49, la planta o parte de ésta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67, 68 u 84, la célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, el organismo transgénico no humano o parte de éste de conformidad con la reivindicación 66, o el aceite de conformidad con la reivindicación 86, o el producto procesado físicamente de la etapa ii), al producto industrial aplicando calor, productos químicos, o medios enzimáticos, o cualquier combinación de éstos, al lípido, y iii) recuperar el producto industrial, produciendo así el producto industrial
90.- Un método de producir combustible, el método se caracteriza porque comprende i) hacer reaccionar uno o más de los lípidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o el lípido en una o mas de las composiciones de conformidad con las reivindicaciones 13, 14 u 87, la semilla oleosa o la semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49, la planta o parte de ésta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67 68 u 84, la célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, el organismo transgénico no humano o parte de éste de conformidad con la reivindicación 66, o el aceite de conformidad con la reivindicación 86, con un alcohol, opcionalmente en la presencia de un catalizador, para producir ésteres alquílicos, y ii) opcionalmente, mezclar los ésteres alquílicos con combustible basado en petróleo.
91.- El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque los ésteres alquilicos son ásteres metílicos.
92.- Un método de producir un forraje, el método se caracteriza porque comprende mezclar por adición uno o más de los lípidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, la composición de conformidad con las reivindicaciones 13, 14 u 87, la semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49, la planta o parte de ésta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67, 68 u 84, la célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, el organismo transgénico no humano o parte de éste de conformidad con la reivindicación 66, o el aceite de conformidad con la reivindicación 86, con al menos otro ingrediente alimenticio.
93.- Forrajes, cosméticos o productos químicos que se caracterizan porque comprenden hacer reaccionar uno o más de los lípidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, la composición de conformidad con las reivindicaciones 13, 14 u 87, la semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49, la planta o parte de ésta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67, 68 u 84, la célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, el organismo transgénico no humano o parte de éste de conformidad con la reivindicación 66, o el aceite de conformidad con la reivindicación 86.
94.- Un producto producido a partir de o usando uno o más de los lipidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o el lipido en una o más de las composiciones de conformidad con las reivindicaciones 13, 14 u 87, el proceso de conformidad con las reivindicaciones 15 a 24, la semilla oleosa o semilla de cártamo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 49, la planta o parte de ésta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 51, 67, 68 u 84, la célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, el organismo transgénico no humano o parte de éste de conformidad con la reivindicación 66, o el aceite de conformidad con la reivindicación 86.
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