BRPI0708976A2 - célula de planta, planta, semente, molécula de ácido nucleico isolada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, proteìna relacionada com estresse isolada, métodos para produzir uma planta transgênica e para modificar a toleráncia a estresse de uma planta, e, usos de um ácido nucleico codificando srp e de toleráncia e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental e/ou um ácido nucleico codificando srp - Google Patents

célula de planta, planta, semente, molécula de ácido nucleico isolada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, proteìna relacionada com estresse isolada, métodos para produzir uma planta transgênica e para modificar a toleráncia a estresse de uma planta, e, usos de um ácido nucleico codificando srp e de toleráncia e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental e/ou um ácido nucleico codificando srp Download PDF

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Abstract

CéLULA DE PLANTA, PLANTA, SEMENTE, MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO ISOLADA, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, PROTEINA RELACIONADA COM ESTRESSE ISOLADA, MéTODOS PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGêNICA E PARA MODIFICAR A TOLERáNCIA A ESTRESSE DE UMA PLANTA, E, USOS DE UM áCIDO NUCLéICO CODIFICANDO SRP E DE TOLERáNCIA E/OU RESISTêNCIA AUMENTADAS A ESTRESSE AMBIENTAL E/OU UM áCIDO NUCLEICO CODIFICANDO SRP. Esta invenção refere-se geralmente a seqúências de ácido nucleico codificando proteínas e homólogos que são associados com respostas a estresse abiótico e tolerância a estresse abiático em plantas. Em particular, esta invenção refere-se a seqUências de ácido nucleico codificando proteínas que conferem tolerância a seca, calor, frio e/ou sal às plantas.

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CELULA DE PLANTA5 PLANTA, SEMENTE, MOLÉCULA DE ÁCIDONUCLEICO ISOLADA, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR,CÉLULA HOSPEDEIRA, PROTEÍNA RELACIONADA COM ESTRESSEISOLADA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PLANTATRANSGÊNICA E PARA MODIFICAR A TOLERÂNCIA A ESTRESSEDE UMA PLANTA, E, USOS DE UM ÁCIDO NUCLEICOCODIFICANDO SRP E DE TOLERÂNCIA E/OU RESISTÊNCIAAUMENTADAS A ESTRESSE AMBIENTAL E/OU UM ÁCIDONUCLEICO CODIFICANDO SRP"
Esta invenção refere-se geralmente a seqüências de ácidonucleico codificando proteínas que são associadas com respostas de estre' seabiótico e tolerância a estresse abiótico em plantas. Em particular, ( ;ainvenção refere-se a seqüências de ácido nucleico codificando proteínas ι ieconferem tolerância a seca, calor, frio, e/ou sal a plantas.
Em particular, esta invenção refere-se a seqüências de áci^nucleico codificando proteínas que conferem tolerância a seca, calor, frio,e/ou sal e/ou resistência a plantas, preferivelmente por alteração da atividademetabólica levando a tolerância a seca, calor, frio, e/ou sal e/ou resistência àsplantas. A invenção também trata com métodos de produzir, triar para ereproduzir tais células de planta ou plantas e método de detectar estresse emcélulas de plantas ou plantas.
Os estresses abióticos ambientais tal como estresse de seca,estresse de salinidade, estresse de calor e estresse de frio, são fatores delimitação principais do crescimento de plantes e produtividade (Boyer. 1982.Science 218, 443-448). As perdas de cultuas e perdas de rendimento deculturas das culturas principais como arroz, milho (maize) e trigo, causadospor estes estresses representam um fator econômico e político significante econtribuem para a escassez de alimentos em muitos países subdesenvolvidos.
As plantas são tipicamente expostas durante seu ciclo de vida acondições de teor de água ambiental reduzido. A maior parte das plantas temdesenvolvido estratégias para se proteger contra estas condições de baixo teorde água ou dessecação (seca). No entanto, se a severidade e duração dascondições de seca forem muito grandes, os efeitos sobre o desenvolvimentoda planta, crescimento e rendimento da maior parte das plantas de cultura sãoprofundos. A exposição contínua a seca causa alterações principais nometabolismo da planta. Estas grandes mudanças no metabolismo por fimlevam a morte da célula e conseqüentemente perdas do rendimento.
O desenvolvimento de plantas tolerantes a estresse é uma estratégia que tem o potencial de resolver ou mediar pelo menos alguns destesproblemas (McKersie e Leshem, 1994. Stress and estresse Coping inCultivated Plants, Kluwer Academic Publishers). No entanto, as estratégiasde criação de plantas tradicionais para desenvolver novas linhagens de plantasque demonstram resistência (tolerância) a estes tipos de estresses são relativamente lentas e requerem linhagens resistentes específicas para ocruzamento com a linhagem desejada. Os recursos de germplasma limitadospara tolerância a estresse e incompatibilidade em cruzamentos entre espéciesde plantas de parentesco distante representam significantes problemasencontrados na reprodução convencional. Adicionalmente, os processos celulares levando a tolerância a seca, frio e sal são complexos em natureza eenvolvem mecanismos múltiplos de adaptação celular e numerosas viasmetabólicas (McKersie e Leshem, 1994. Stress and stress Coping inCultivated Plants, Kluwer Academic Publishers). Esta natureza de multi-componentes de tolerância a estresse não somente levou a reprodução paratolerância a ser um grande fracasso, como também limitou a capacidade degeneticamente engenheirar as plantas tolerantes a estresse usando métodosbiotecnológicos.
Os estresses de seca, calor, frio e sal apresentam um temacomum importante para o crescimento das plantas e este é o dadisponibilidade de água. As plantas são expostas durante seu ciclo de vidacompleto a condições de reduzido teor de água ambiental. A maior parte dasplantas tem desenvolvido estratégias para se proteger contra estas condições.No entanto, se a severidade e duração das condições de seca forem muitograndes, os efeitos sobre o desenvolvimento da planta, crescimento erendimento da maior parte das plantas de cultura são profundos. Porque o teorde sal elevado em alguns solos resulta em uma menor disponibilidade de águapara a absorção pela célula, seu efeito é similar ao observado sob condiçõesde seca. Adicionalmente, sob temperaturas de congelamento, células de plantaperdem água como um resultado da formação de gelo que se inicia noapoplasto e retira água do simplasto (McKersie e Leshem, 1994. Stress andstress Coping in Cultivated Plants, Kluwer Academic Publishers).Comumente, os mecanismos de resposta molecular das plantas a cada umadestas condições de estresses são similares.
Os resultados da pesquisa atual indicam que a tolerância a secaé um traço quantitativo complexo e que nenhum marcador diagnóstico real édisponível ainda. As concentrações de sal elevadas ou desidratação podemcausar dano no nível celular durante o estresse de seca mas o dano precisoainda não é completamente claro (Bray, 1997. Trends Plant Sci. 2, 48-54).
Esta falta de uma compreensão mecanística torna difícil projetar umaabordagem transgênica para melhorar a tolerância à seca. No entanto, umaconseqüência importante do dano pode ser a produção de radicais de oxigênioreativos que causam dano celular, como a peroxidação de lipídeos oumodificação de proteína e ácido nucleico. Os detalhes da química de radicallivre de oxigênio e sua reação com componentes celulares, como asmembranas das células, foram descritos (McKersie e Leshem, 1994. Stressand stress Coping in Cultivated Plants, Kluwer Academic Publishers).
Existe a necessidade de identificar genes expressados emplantas tolerantes a estresse que tenham a capacidade de conferir resistênciaao estresse à sua planta hospedeira e a outras espécies de plantas. É um objetodesta invenção identificar novos métodos para detectar ou conferir tolerânciaa estresse e/ou resistência em plantas ou células de planta.
E o objeto desta invenção identificar novos genes singularescapazes de conferir tolerância a estresse a plantas quando da expressão ousuper-expressão.
r
E um outro objeto desta invenção identificar, produzir ereproduzir novas células de plantas tolerantes e/ou resistentes a estresse ouplantas e métodos de induzir e detectar a tolerância a estresse e/ou resistênciaem plantas ou células de planta.
F
E um outro objeto desta invenção identificar novos métodospara detectar tolerância a estresse e/ou resistência em plantas ou células deplanta.
Esta invenção atende em parte à necessidade de identificarnovos genes singulares capazes de conferir tolerância a estresse a plantasquando da expressão ou super-expressão de genes endógenos e/ou exógenos.
A presente invenção provê genes a partir de plantas utilizáveis.Estes genes são codificantes para proteínas relacionadas com estresse (SRP)capazes de conferir aumentada tolerância a estresse ambiental comocomparado com uma variedade de tipo selvagem da célula de planta ouplantas quando da super-expressão.
A presente invenção também provê métodos de modificar atolerância a estresse de uma planta compreendendo modificar a expressão deum ácido nucleico de SRP (proteína relacionada com estresse) na planta, emque a SRP é como descrita abaixo. A invenção provê que este método podeser realizado de modo que a tolerância a estresse é ou aumentada oudiminuída. Preferivelmente, a tolerância a estresse é aumentado em umaplanta via aumento da expressão de um ácido nucleico de SRP.
A expressão aumentada do gene endógeno codificando paraSRP pode ser alcançada, por exemplo, por aumento da potência do promotorusado para dirigir a transcrição do gene e/ou aumento do número de cópias dogene e seus elementos regulatórios. A expressão forte de genes e copiasmúltiplas do gene levam a níveis aumentados de mRNA e proteína alvo. Osmétodos atuais para a super-expressão de proteínas envolvem a clonagem dogene de interesse e sua colocação, em uma construção, próximo de umapropriado promotor/melhorador, sinal de poliadenilação, e sítio de emenda, eintrodução de uma construção em uma célula hospedeira apropriada.
A invenção é também dirigida a métodos para super-expressar um gene endógeno em uma célula, compreendendo introduzir um vetorcontendo uma seqüência regulatória transcripcional e um ou mais marcadoresamplificáveis dentro da célula, deixando o vetor integrar dentro do genoma dacélula por recombinação não homóloga, e permitindo a super-expressão dogene endógeno na célula.
A invenção é também dirigida a métodos para super-expressarum gene exógeno em uma célula, compreendendo introduzir um vetorcontendo uma seqüência regulatória transcripcional e um ou mais marcadoresamplificáveis dentro da célula, permitindo ao vetor integrar dentro do genomada célula por recombinação não homóloga, e permitindo a super-expressão dogene exógeno na célula. Em uma forma de realização preferida, a expressãoou super-expressão de um ácido nucleico de SRP de Zea mays conferetolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma célula de planta de tipo selvagem não transformada correspondenteem uma célula/planta de Glycine max e vice versa, ou um ácido nucleico deSRP de Zea mays confere tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma célula de planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em uma célula/planta de Glycine max, Brassicanapus ou Oryza sativa e vice versa, ou um ácido nucleico de SRP de Glycinemax confere tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma célula de planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em uma célula/planta de Zea mays, Brassica napus ou Oryzasativa e vice versa, ou um ácido nucleico de SRP de Brassica napus conferetolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma célula de planta de tipo selvagem não transformada correspondenteem uma célula/planta de Glyeine max, Zea mays ou Oryza sativa e vice versa,ou um ácido nucleico de SRP de Oryza sativa confere tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma célulade planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umacélula/planta de Glyeine max, Brassiea napus, Tritieum aestivum ou Zea mayse vice versa.
Em uma outra forma de realização preferida a expressão ousuper-expressão de um ácido nucleico de SRP de Oryza sativa conferetolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma célula de planta de tipo selvagem não transformada correspondenteem uma célula/planta de Glyeine max, Brassiea napus, Hordeum vulgare,Helianassim annuus, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare, Helianassimannuus, Linum usitatissimum, Tritieum aestivum ou Zea mays e vice versa.
A presente invenção provê uma célula de planta transgênica,em que expressão de referida seqüência de ácido nucleico na célula de plantaresulta em tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma célula de planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente.
A presente invenção provê uma célula de planta transgênicatransformada por ácido nucleico codificando proteína relacionada comestresse (SRP), selecionada dentre o grupo consistindo de:
a.) molécula de ácido nucleico codificando um dospolipeptídeos para, como mostrado na tabela II, colunas 4 e 5, ou umfragmento dos mesmos, que confere uma tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental em um organismo ou uma parte do mesmo;
b.) molécula de ácido nucleico compreendendo uma dasmoléculas de ácido nucleico como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5
c.) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode serdeduzida de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula deácido nucleico de (a) ou (b) como um resultado da degenerescência do códigogenético e conferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo;
d.) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeoque tem pelo menos 50% identidade com a seqüência de aminoácido dopolipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalem um organismo ou uma parte do mesmo;
e.) molécula de ácido nucleico que hibridiza com umamolécula de ácido nucleico de (a) a (c) sob condições de hibridizaçãoestringentes e conferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas aestresse ambiental em um organismo ou uma parte do mesmo;
f.) molécula de ácido nucleico que engloba uma molécula deácido nucleico que é obtida por amplificação de moléculas de ácido nucleicode uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando osiniciadores como mostrado na tabela III, coluna 5 e conferindo uma tolerânciae/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo;
g.) molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeoque é isolado com a ajuda de anticorpos monoclonais contra um polipeptídeocodificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (f) e conferindouma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo;
h.) molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeocompreendendo a seqüência de consenso mostrada na tabela IV, coluna 5 econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo e
i.) molécula de ácido nucleico que é obtenível por triagem deuma biblioteca de ácido nucleico apropriada sob condições de hibridizaçãoestringentes com uma sonda compreendendo uma das seqüências da moléculade ácido nucleico de (a) a (g) ou com um fragmento da mesma tendo pelomenos 15 nt, preferivelmente 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt ou 500 nt damolécula de ácido nucleico caracterizada em (a) a (i) e conferindo umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo,
ou compreendendo uma seqüência que é complementar àmesma.
A invenção provê que o estresse ambiental pode ser estresse desalinidade, seca, temperatura, metal, químico, patogênico e oxidativo, oucombinações dos mesmos.
Em uma forma de realização a presente invenção estárelacionada com um processo para aumentar a tolerância e/ou resistência aestresse ambiental como comparado com uma célula de planta de tiposelvagem não transformada correspondente, que compreende
a) aumentar ou gerar a atividade de uma proteína comomostrado na tabela II, coluna 2 codificado pelas seqüências de ácido nucleicocomo mostrado na tabela I, coluna 4 ou 5, em uma célula de planta e/ouplanta,eb) cultivar referida célula de planta e/ou planta sob condiçõesque permitem o cultivo e coleta da célula de planta e/ou planta.
Compreende/compreendendo e variações gramaticais dosmesmos quando usado neste relatório devem ser tomados para especificar apresença de aspectos, números inteiros, etapas ou componentes descritos ougrupos dos mesmos, mas não para excluir a presença ou adição de um ou maisde outro aspectos, números inteiros, etapas ou componentes descritos ougrupos dos mesmos. O termo "Tabela I" usado neste relatório deve sertomado para especificar o conteúdo de tabela IAe tabela I Β. O termo"Tabela II" usado neste relatório deve ser tomado para especificar o conteúdode tabela II A e tabela II Β. O termo "Tabela I A" usado neste relatório deveser tomado para especificar o conteúdo de tabela I A. O termo "Tabela I B"usado neste relatório deve ser tomado para especificar o conteúdo de tabela IΒ. O termo "Tabela II A" usado neste relatório deve ser tomado paraespecificar o conteúdo de tabela II A. O termo "Tabela II B" usado nesterelatório deve ser tomado para especificar o conteúdo de tabela II B.
Em uma forma de realização preferida, o termo "Tabela I"significa tabela I B. Em uma forma de realização preferida, o termo "TabelaII" significa tabela II B.
Na célula de planta transgênica da invenção, a expressão dereferido ácido nucleico resulta em aumentada tolerância a um estresseambiental como comparado com uma célula de planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente. Aqui o estresse ambiental é selecionado dentreo grupo consistindo de estresses de salinidade, seca, temperatura, metal,químico, patogênico e oxidativo, ou combinações dos mesmos.
Os termos "aumentado", "criado", "estendido", "melhorado","aperfeiçoado" ou "amplificado" referem-se a uma mudança correspondentede uma propriedade de um organismo, uma parte de um organismo tal comoum tecido, semente, raiz, folha, flor etc. ou em uma célula e sãointerpermutáveis. Preferivelmente, a atividade global no volume é aumentadaou melhorada nos casos se o aumento ou melhora estar relacionada com oaumento ou melhora de uma atividade de um produto de gene, independentede se a quantidade de produto de gene ou uma atividade específica do produtode gene ou ambos para aumentada ou melhorada ou se a quantidade,estabilidade ou eficácia de tradução da seqüência de ácido nucleico ou genecodificando para o produto de gene para aumentada ou melhorada. Os termos"redução", "diminuição" ou "deleção" referem-se a uma mudançacorrespondente de uma propriedade em um organismo, uma parte de umorganismo tal como um tecido, semente, raiz, folha, flor etc. ou em umacélula. Preferivelmente, a atividade global no volume é reduzida, diminuídaou deletada em casos se a redução, diminuição ou deleção estiver relacionadacom a redução, diminuição ou deleção de uma atividade de um produto degene, independente de se a quantidade de produto de gene ou a atividadeespecífica do produto de gene ou ambos for reduzida, diminuída ou deletadaou se a quantidade, estabilidade ou eficácia de tradução da seqüência de ácidonucleico ou gene codificando para o produto de gene for reduzida, diminuídaou deletada.
Os termos "aumento" ou "diminuição" referem-se a umamudança correspondente de uma propriedade em um organismo ou em umaparte de um organismo, tal como um tecido, semente, raiz, folha, flor etc. ouem uma célula. Preferivelmente, a atividade global no volume é aumentadaem casos em que o aumento refere-se ao aumento de uma atividade de umproduto de gene, independente de se a quantidade de produto de gene ou aatividade específica do produto de gene ou ambos para aumentada ou geradaou se a quantidade, estabilidade ou eficácia de tradução da seqüência de ácidonucleico ou gene codificando para o produto de gene para aumentada.
Sob "mudança de uma propriedade" entende-se que aatividade, nível de expressão ou quantidade de um produto de gene ou o teorde metabólitos é mudado em um volume específico relativo a umcorrespondente volume de um controle, referência ou tipo selvagem,incluindo a criação de novo de uma atividade ou expressão.
Os termos "aumento" ou "diminuição" incluem a mudança dereferida propriedade em somente partes do objetivo da presente invenção, porexemplo, a modificação pode ser encontrada em compartimento de umacélula, como um organelo, ou em uma parte de uma planta, como tecido,semente, raiz, folha, flor etc. mas não é detectável se o indivíduo global, istoé, a célula ou planta completa, for testado. Preferivelmente, o aumento oudiminuição é encontrada celular, assim o termo "aumento de uma atividade"ou "aumento de um teor de metabólitos" refere-se ao aumento celularcomparado com a célula de tipo selvagem.
Assim, o termo "aumento" ou "diminuição" significa que aatividade específica de uma enzima assim como a quantidade de umcomposto ou metabólito, por exemplo de um polipeptídeo, uma molécula deácido nucleico ou do produto químico fino da invenção ou um mRNA ouDNA de codificação, pode ser aumentada ou diminuída em um volume.
Os termos "tipo selvagem", "controle" ou "referência" sãopermutáveis e podem ser uma célula ou uma parte de organismos tal como umorganelo ou um tecido, ou um organismo, em particular um microorganismoou uma planta, que não foi modificado ou tratado de acordo com o processoaqui descrito de acordo com a invenção. Assim, a célula ou uma parte deorganismos tal como um organelo ou um tecido, ou um organismo, emparticular um microorganismo ou uma planta usado como um tipo selvagem,controle ou referência corresponde à célula, organismo ou parte do mesmo namedida do possível e ocorre em qualquer outra propriedade mas no resultadodo processo da invenção tão idêntico ao objetivo da invenção como possível.Assim, o tipo selvagem, controle ou referência é tratado identicamente ou tãoidêntico como possível, afirmando-se que somente as condições oupropriedades podem ser diferentes o que não influencia a qualidade dapropriedade testada.
Preferivelmente, qualquer comparação é realizada sobcondições análogas. O termo " condições análogas " significa que todas ascondições tal como, por exemplo, condições de cultura ou crescimento,condições de teste (tal como composição de tampão, temperatura, substratos,cepa do patógeno, concentrações e semelhantes) são mantidas idênticas entreas experiências a serem comparadas.
A "referência", "controle", ou "tipo selvagem" épreferivelmente um indivíduo, por exemplo um organelo, uma célula, umtecido, um organismo, em particular uma planta ou um microorganismo, quenão foi modificado ou tratado de acordo com o processo aqui descrito dainvenção e é em qualquer outra propriedade tão similar ao objetivo dainvenção como possível. A referência, controle ou tipo selvagem é em seugenoma, transcriptoma, proteoma ou metaboloma tão similar quanto possívelao objetivo da presente invenção. Preferivelmente, o termo organelo, célula,tecido ou organismo de "referência" "controle-" ou "tipo selvagem", emparticular planta ou microorganismo, refere-se a um organelo, célula, tecidoou organismo, em particular planta ou microorganismo, que é quasegeneticamente idêntico ao organelo, célula, tecido ou organismo, emparticular microorganismo ou planta, da presente invenção ou a parte domesmo preferivelmente 95%, mais preferido são 98%, ainda mais preferidosão 99,00%, em particular 99,10%, 99,30%, 99,50%, 99,70%, 99,90%,99,99%, 99, 999% ou mais. O mais preferível, a "referência", "controle", ou"tipo selvagem" é um indivíduo, por exemplo um organelo, uma célula, umtecido, um organismo, que é geneticamente idêntico ao organismo, célula ouorganelo usado de acordo com o processo da invenção exceto que moléculasde ácido nucleico responsáveis ou conferindo atividade ou o produto de genecodificado pelos mesmos são emendados, manipulados, trocados ouintroduzidos de acordo com o processo inventivo.
Preferivelmente, a referência, controle ou tipo selvagem diferedo individuo da presente invenção somente na atividade celular dopolipeptídeo da invenção, por exemplo como resultado de um aumento nonível da molécula de ácido nucleico da presente invenção ou um aumento daatividade específica do polipeptídeo da invenção, por exemplo por ou em umanível de expressão ou atividade de uma proteína tendo a atividade de umaproteína relacionada com estresse (SRP) ou seus homólogos, suas causasbioquímicas ou genéticas e a tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente.
No caso, em que um controle, referência ou tipo selvagemdiferindo do objetivo da presente invenção somente por não ser o objetivo doprocesso da invenção não pode ser provido, um controle, referência ou tipo selvagem pode ser um organismo em que a causa para a modulação de umaatividade conferindo a tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente ou expressão da molécula de ácido nucleico dainvenção como descrito aqui foi comutada de volta ou desligada, por exemplopor nocaute da expressão de produto de gene responsável, por exemplo porinibição anti-sentido, por inativação de um ativador ou agonista, por ativaçãode um inibidor ou antagonista, por inibição através de adição de anticorposinibitórios, por adição de compostos ativos, como, por exemplo, hormônios,por introdução de mutantes dominantes negativos, etc. Uma produção degenes pode por exemplo ser nocauteada por introdução de mutações de pontosinativantes, que leva a uma inibição da atividade enzimática ou umadesestabilização ou uma inibição da capacidade de se ligar a cofatores etc.
Assim, o objetivo de referência preferido é o objetivo departida do presente processo da invenção. Preferivelmente, a referência e oobjetivo da invenção são comparados após padronização e normalização, porexemplo com relação à quantidade de RNA, DNA, ou proteína total ouatividade ou expressão de genes de referência, como genes housekeeping, talcomo ubiquitina, actina ou proteínas ribossomais.
Uma série de mecanismos existe através dos quais amodificação da proteína, por exemplo o polipeptídeo da invenção pode afetardiretamente ou indiretamente o rendimento, produção e/ou eficiência deprodução do aminoácido.
Por exemplo, o número de molécula ou a atividade específicado polipeptídeo ou a molécula de ácido nucleico pode ser aumentado.Quantidades maiores do produto químico fino podem ser produzidas se opolipeptídeo ou o ácido nucleico da invenção for expressado de novo em umorganismo faltando a atividade da referida proteína. No entanto, também épossível aumentar a expressão do gene que está naturalmente presente osorganismos, por exemplo por modificação da regulação do gene, ou poraumenta da estabilidade do correspondente mRNA ou do correspondenteproduto de gene codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção, oupor introdução de genes homólogos de outros organismos que são reguladosdiferentemente, por exemplo não são sensível à retro-alimentação.
Isto também se aplica de modo análogo à expressão aumentadacombinada da molécula de ácido nucleico da presente invenção ou seuproduto de gene com a das outras enzimas das vias de biossíntese deaminoácido, por exemplo que são utilizáveis para a síntese dos produtosquímicos finos.
O aumento, diminuição ou modulação de acordo com estainvenção pode ser constitutivo, por exemplo devido a uma expressãotransgênica estável permanente ou a uma mutação estável no gene endógenocorrespondente codificando a molécula de ácido nucleico da invenção ou auma modulação de uma expressão ou do comportamento de um geneconferindo a expressão do polipeptídeo da invenção, ou transiente, porexemplo devido a uma transformação transiente ou adição temporária de ummodulador tal como um agonista ou antagonista ou indutível, por exemploapós transformação com uma construção indutível portando a molécula deácido nucleico da invenção sob controle de um promotor indutível eadicionando o indutor, por exemplo tetraciclina ou como descrito aqui abaixo.
O aumento na atividade do polipeptídeo chega em uma célula,um tecido, um organelo, um órgão ou um organismo ou a parte do mesmopreferivelmente a pelo menos 5%, preferivelmente a pelo menos 20% ou parapelo menos 50%, especialmente preferivelmente a pelo menos 70%, 80%,90% ou mais, muito especialmente preferivelmente são de pelo menos 200%,o mais preferivelmente são a pelo menos 500% ou mais em comparação como controle, referência ou tipo selvagem.
A atividade específica de um polipeptídeo codificado por umamolécula de ácido nucleico da presente invenção ou do polipeptídeo dapresente invenção pode ser testada como descrito nos exemplos. Emparticular, a expressão de uma proteína em questão em uma célula, porexemplo uma célula de planta ou um microorganismo e a detecção de umaumento no produto químico fino nível em comparação a um controle é umteste fácil e pode ser realizado como descrito no estado da técnica.
O termo "aumento" inclui, que um composto ou uma atividadeé introduzido dentro de uma célula de novo ou que o composto ou a atividadenão era detectável antes, em outras palavras ele é "gerado".
Assim, no seguinte, o termo "aumento " também compreendeo termo "gerar " ou "estimular ". A atividade aumentada se manifesta em umaumento do produto químico fino.
As células de planta transformadas são comparadas ao tiposelvagem não transformado correspondente do mesmo gênero e espécie sobcondições de outra forma idênticas (tal como, por exemplo, condições decultura, idade das plantas e semelhantes). Neste contexto, um aumento natolerância e/ou resistência a estresse ambiental de pelo menos 10%,vantajosamente de pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%,especialmente preferivelmente de pelo menos 40%, 50% ou 60%, muitoespecialmente preferivelmente de pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% oumesmo 100% ou mais, em comparação com o organismo não transformado évantajoso.
A presente invenção provê uma célula de planta transgênica,em que a expressão de referida seqüência de ácido nucleico na célula deplanta resulta em tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma célula de planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente. Uma célula de planta de tipo selvagempreferida é uma célula de planta não transformada de Arabidopsis. Umexemplo aqui é Arabidopsis tipo selvagem C24 (Nottingham ArabidopsisStock Centre, UK; NASC Stock N906).
Outras células de planta de tipo selvagem preferidas são as nãotransformadas de plantas selecionadas dentre o grupo consistindo de milho,trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, colza,canola, mandioca, pimentão, girassol, linho, borragem, cártamo, linhaça,prímula, colza, nabo selvagem, tagetes, plantas solanáceas, batata, tabaco,berinjela, tomate, espécies Vicia, ervilha, alfalfa, café, cacau, chá, espécieSalix, palma oleígena, coco, grama perene e culturas de forragem.
As células de planta de tipo selvagem mais preferidas são acélula de planta Linum não transformada, preferivelmente Linumusitatissimum, mais preferivelmente a variedade Brigitta, Golda, GoldMerchant, Helle, Juliel, Olpina, Livia, Marlin, Maedgold, Sporpion, Serenade,Linus, Taunus, Lifax ou Liviola, a célula de planta não transformadaHeliantus, preferivelmente Heliantus annuus, mais preferivelmente avariedade Aurasol, Capella, Flavia, Flores, Jazzy, Palulo, Pegasol, PIR64A54,Rigasol, Sariuca, Sideral, Sunny, Alenka, Candisol ou Floyd, ou a célula deplanta não transformada Brassica, preferivelmente Brassica napus, maispreferivelmente a variedade Dorothy, Evita, Heros, Hyola, Kimbar, Lambada,Licolly, Liconira, Licosmos, Lisonne, Mistral, Passat, Serator, Siapula,Sponsor, Star, Caviar, Hybridol, Baical, Olga, Lara, Doublol, Karola, Falcon,Spirit, Olymp, Zeus, Libero, Kyola, Licord, Lion, Lirajet, Lisbeth, Magnum,Maja, Mendel, Mica, Mohican, Olpop, Ontarion, Panthar, Prinoe, Pronio,Susanna, Talani, Titan, Transfer, Wiking, Woltan, Zeniah, Artus, Contact ouSmart.
A expressão de referida seqüência de ácido nucleico na célulade planta pode influenciar diretamente ou indiretamente a tolerância e/ouresistência a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente das células de plantatransformadas.
Preferivelmente tolerância e/ou resistência aumentadas aestresse ambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente pode ser alterada por transformação com um oumais ácido nucleico codificando proteína relacionada com estresse (SRP)selecionado dentre o grupo compreendendo o ácido nucleico de acordo, comomostrado na tabela I, colunas 4 e 5, ou homólogos das seqüências acimamencionadas,
Está no escopo da invenção identificar os genes codificadospor uma seqüência de ácido nucleico selecionada dentre o grupo consistindode ácido nucleico, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, e/ou homólogosdo mesmo em plantas alvos, especialmente plantas de cultura, e entãoexpressar o gene correspondente para alcançar a tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental. Conseqüentemente, a invenção não élimitada a uma planta específica.
A proteína tendo uma atividade conferindo uma tolerânciae/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente preferivelmente tema estrutura do polipeptídeo descrito aqui, do polipeptídeo, como mostrado natabela II, colunas 4 e 5, preferivelmente ou os homólogos funcionais dosmesmos como descrito aqui, ou é codificada pela molécula de ácido nucleicocaracterizada aqui ou a molécula de ácido nucleico como mostrado na tabelaII, coluna 2 de acordo com a invenção, por exemplo pela molécula de ácidonucleico, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, preferivelmente comomostrado na tabela I, coluna 2 ou os homólogos funcionais aqui descritos etendo a atividade aqui mencionada.
A seqüência de b0019 de Escherichia coli Kl2 foi publicadaem Blattner et al., Science 277(5331), 1453-1474, 1997, e sua atividade estásendo definida como proteína para o transporte; o transporte de moléculaspequenas, preferivelmente cátions. Em uma forma de realização maispreferida a proteína tem a atividade de um antiporter Na+/H+, responsivo aestresse, especialmente a alta salinidade e pH. Assim, em uma forma derealização, o processo da presente invenção compreende o uso de umaproteína para o transporte; preferivelmente um antiporter Na+/H+ responsivoa estresse de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, porexemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de b0730 de Escherichia coli Kl2 foi publicadaem Blattner et al., Science 277(5331), 1453-1474, 1997, e sua atividade estásendo definida como regulador transcripcional de succcinilCoA sintetaseoperon e regulador de resposta de acila graxa. Assim, em uma forma derealização, o processo da presente invenção compreende o uso de umregulado transcripcional de succinilCoA sintetase operon ou regulador deresposta de acila graxa de E. coli ou seu homólogo, por exemplo comomostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de b 1528 de Escherichia coli Kl2 foi publicadaem Blattner et al., Science 277(5331), 1453-1474, 1997, e sua atividade estásendo definida como proteína de exportação L-arabinose/isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo. Assim, em uma forma de realização, o processo dapresente invenção compreende o uso de uma proteína de exportação de L-arabinose/isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo, ou seus homólogos, porexemplo as proteínas da família MFS, por exemplo como indicado em tabelaII, de E. coli para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas aestresse ambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de bl829 de Escherichia coli Kl 2 foi publicadaem Blattner, Science 277(5331), 1453-1474, 1997, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína de choque térmico. Assim, em uma forma derealização, o processo da presente invenção compreende o uso de um"proteína de choque térmico" de E. coli ou seu homólogo, por exemplo comomostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de b3164 de Escherichia coli Kl 2 foi publicadaem Blattner, Science 277(5331), 1453-1474, 1997, e sua atividade está sendodefinida como uma polirribonucleotídeo nucleotidiltransferase. Assim, emuma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o usode um "polirribonucleotídeo nucleotidiltransferase" de E. coli ou seuhomólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado emtabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YBL002W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como histona H2A e H2B e/ou uma trehalase. Assim, em uma formade realização, o processo da presente invenção compreende o uso de umahistona H2A e H2B e/ou uma trehalase de E. coli ou seu homólogo, porexemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, paraconferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YBR002C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como Cis-preniltransferase envolvida em síntese de dolicol; e/ouuma proteína que participa em classificação de proteína de retículoendoplásmico (ER). Assim, em uma forma de realização, o processo dapresente invenção compreende o uso de um Cis-preniltransferase envolvidaem síntese de dolicol; e/ou uma proteína que participa em classificação deproteína de retículo endoplásmico (ER) de E. coli ou seu homólogo, porexemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, paraconferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YBROIOW de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma ou duas proteínas de histona H3 idênticas; ou uma histonade núcleo requerida para a montagem de cromatina, envolvida em teloméricomediado por heterocromatina e silenciamento de HM; regulado poracetilação, metilação, e fosforilação mitótica. Assim, em uma forma derealização, o processo da presente invenção compreende o uso de proteínas dehistona H3; ou uma histona de núcleo requerida para a montagem decromatina, envolvida em telomérico mediado por heterocromatina esilenciamento de HM; regulado por acetilação, metilação, e fosforilação mitótica; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, porexemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de YBR090C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína de membrana. Assim, em uma forma derealização, o processo da presente invenção compreende o uso de umaproteína de membrana; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo comomostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YBRl09C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína de ligação de Ca++ que regula processosindependentes de Ca++ (por exemplo mitose, crescimento de broto,organização de actina, endocitose, etc.) e processos dependentes de Ca++ (porexemplo vias ativadas por estresse). Assim, em uma forma de realização, oprocesso da presente invenção compreende o uso de um proteína de ligaçãode Ca++ que regula processos independentes de Ca++ (por exemplo mitose,crescimento de broto dependente, organização de actina, endocitose, etc.) eprocessos dependentes de Ca++ (por exemplo vias ativadas por estresse); deE. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplocomo indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo.
A seqüência de YBR288C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma subunidade de tipo Mu3 da complexo proteína associadacom clatrina (AP-3); que funciona em transporte de fosfatase alcalina para ovacúolo através da via alternada. Assim, em uma forma de realização, oprocesso da presente invenção compreende o uso de uma subunidade tipoMu3 de complexo proteína associada com clatrina do complexo proteínaassociada com clatrina (AP-3); que funciona em transporte de fosfatasealcalina para o vacúolo através da via alternada; de E. coli ou seu homólogo,por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II,para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YELOOIC de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína YELOO1C. Assim, em uma forma de realização,o processo da presente invenção compreende o uso de uma proteínaYELOO1C; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, porexemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de YER062c de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma de duas DL-glicerol-3-fosfatases redundantes(RHR2/GPP1 um codifica o outro) envolvida em biossíntese de glicerol;induzida em resposta um estresse hiperosmótico e estresse oxidativo, edurante a transição diáuxica. Assim, em uma forma de realização, o processoda presente invenção compreende o uso de uma de duas DL-glicerol-3-fosfatases redundantes (RHR2/GPP1 um codifica o outro) envolvida embiossíntese de glicerol; induzida em resposta a um estresse hiperosmótico eestresse oxidativo, e durante a transição diáuxica; de E. coli ou seu homólogo,por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II,para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YER145C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína com permease de ferro de alta afinidadeenvolvida no transporte de ferro através da membrana do plasma, que formacomplexo com Fet3p. Assim, em uma forma de realização, o processo dapresente invenção compreende o uso de uma proteína com permease de ferrode alta afinidade envolvida no transporte de ferro através da membrana doplasma, que forma complexo com Fet3p; de E. coli ou seu homólogo, porexemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, paraconferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YER146W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como um componente de complexos de ribonucleoproteína nuclearpequena envolvida em processamento de RNA, em emenda e decaimento.
Assim, em uma forma de realização, o processo da presente invençãocompreende o uso de um componente de complexos de ribonucleoproteínanuclear pequena envolvida em processamento de RNA, em emenda edecaimento; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui,por exemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de YGL151W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como um componente de uma proteína YGLl 51W. Assim, em umaforma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso deum YGL151W proteína; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo comomostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YGR046W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína YGR046W. Assim, em uma forma de realização,o processo da presente invenção compreende o uso de uma proteínaYGR046W; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui,por exemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de YGR060W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como um componente de uma C-4 metil sterol oxidase, que catalisa aprimeira de três etapas requeridas para remover dois Grupos C-4 metila de umintermediário em biossíntese ergosterol. Assim, em uma forma de realização,o processo da presente invenção compreende o uso de uma C-4 metil steroloxidase, que catalisa a primeira de três etapas requeridas para remover doisGrupos C-4 metila de um intermediário em biossíntese ergosterol; de E. coliou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo comoindicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo.
A seqüência de YGR141W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína YGRl41W. Assim, em uma forma de realização,o processo da presente invenção compreende o uso de uma proteínaYGRl41W; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui,por exemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de YIL002C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como um homólogo YIL002c de inositol-l,4,5-trisfosfato 5-fosfatase. Assim, em uma forma de realização, o processo da presenteinvenção compreende o uso de um homólogo YIL002c de inositol-1,4,5-trisfosfato 5-fosfatase; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo comomostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YIL031W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma peptidase que desconjuga peptídeos Smt3/SUMO-l de proteínas, e/ou desempenha um papel em coesão de cromossomos em regiõescentroméricas e recuperação de parada de ponto de verificação induzida pordano do DNA ou defeitos de replicação do DNA. Assim, em uma forma derealização, o processo da presente invenção compreende o uso de umapeptidase que desconjuga peptídeos Smt3/SUMO-l de proteínas, e/ou desempenha um papel em coesão de cromossomos em regiões centroméricase recuperação de parada de ponto de verificação induzida por dano do DNAou defeitos de replicação do DNA; de E. coli ou seu homólogo, por exemplocomo mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferiruma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YIL076W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma subunidade epsilon-COP do coatômero; que regula tráficode proteína Golgi para ER retrógrado; e/ou estabiliza Cop lp, o alfa-COP e ocomplexo coatômero. Assim, em uma forma de realização, o processo dapresente invenção compreende o uso de subunidade episolon-COP docoatômero; que regula tráfico de proteína Golgi para ER retrógrado; e/ouestabiliza Coplp, o alfa-COP e o complexo coatômero; de E. coli ou seuhomólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado emtabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YIL077C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína YIL077C. Assim, em uma forma de realização, oprocesso da presente invenção compreende o uso de uma proteína YIL077C;de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplocomo indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo.
A seqüência de YIL121W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como um transportador de múltiplos fármacos requerido pararesistência a quinidina, barban, cisplatina, e bleomicina; que é membro dasuperfamília de facilitador principal de transportadores conferindo resistênciaa drogas múltiplas (MFS-MDR). Assim, em uma forma de realização, oprocesso da presente invenção compreende o uso de transportador demúltiplos fármacos requerido para resistência a quinidina, barban, cisplatina,e bleomicina; que é membro da superfamília de facilitador principal detransportadores conferindo resistência a drogas múltiplas (MFS-MDR); de E.coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo comoindicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo.
A seqüência de YILl56W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína YILl 56W. Assim, em uma forma de realização,o processo da presente invenção compreende o uso de uma proteínaYILl56W; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, porexemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de YJR044C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína endossomal tardia envolvida em endossomatardio para tráfico de vacúolos. Assim, em uma forma de realização, oprocesso da presente invenção compreende o uso de uma proteína endossomaltardia envolvida em endossoma tardio para tráfico de vacúolos; de E. coli ouseu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicadoem tabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas aestresse ambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YKL057C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma nucleoporina NUP120 (proteína de poro nuclearNUP120). Assim, em uma forma de realização, o processo da presenteinvenção compreende o uso de uma nucleoporina NUP120 (proteína de poronuclear NUP120); de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostradoaqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerânciae/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo.
A seqüência de YKL150W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma NADH mitocondrial - citocromo b4 redutase, envolvidaem biossíntese de ergosterol. Assim, em uma forma de realização, o processoda presente invenção compreende o uso de um NADH mitocondrial -citocromo b4 redutase, envolvida em biossíntese de ergosterol; de E. coli ouseu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicadoem tabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas aestresse ambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YKR057W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína ribossomal, similar a proteínas ribossomais S21,envolvida em biogenese e tradução de ribossoma. Assim, em uma forma derealização, o processo da presente invenção compreende o uso de umaproteína ribossomal, similar a proteínas ribossomais S21, envolvida em biogenese e tradução de ribossoma; de E. coli ou seu homólogo, por exemplocomo mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferiruma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YLR062c de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína YLR062c. Assim, em uma forma de realização, oprocesso da presente invenção compreende o uso de uma proteína YLR062c; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplocomo indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo.
A seqüência de YLR142W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma prolina oxidase, e/ou uma proteína mitocondrialcodificada nuclear envolvida em utilização de prolina como única fonte denitrogênio. Assim, em uma forma de realização, o processo da presenteinvenção compreende o uso de uma prolina oxidase, e/ou uma proteínamitocondrial codificada nuclear envolvida em utilização de prolina comoúnica fonte de nitrogênio; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo comomostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YLRl 73W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína YLRl 73 W. Assim, em uma forma de realização,o processo da presente invenção compreende o uso de um YLRl 73Wproteína; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, porexemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de YLR274W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como um componente de complexo MCM hexamérico, que éimportante para iniciar as origens de replicação de DNA em Gl e se tornauma helicase dependente de ATP ativa que promove fusão de DNA ealongamento quando ativada por Cdc7p-Dbf4p em fase S. Assim, em umaforma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso deum componente de complexo MCM hexamérico, que é importante parainiciar as origens de replicação de DNA em Gl e se torna uma helicasedependente de ATP ativa que promove fusão de DNA e alongamento quandoativada por Cdc7p-Dbf4p em fase S; de E. coli ou seu homólogo, por exemplocomo mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferiruma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.A seqüência de YLR394W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et ai, Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína requerida para formação de complexosinaptonemal, que pode ter um papel em recombinação meiótica; e/ou quelocaliza para sítios de iniciação de sinapse em cromossomos meióticos.
Assim, em uma forma de realização, o processo da presenteinvenção compreende o uso de uma proteína requerida para formação decomplexo sinaptonemal, que pode ter um papel em recombinação meiótica;e/ou que localiza para sítios de iniciação de sinapse em cromossomosmeióticos; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, porexemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de YNL108C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína YNL108C. Assim, em uma forma de realização,o processo da presente invenção compreende o uso de uma proteínaYNL108C; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui,por exemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com uma plantade tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou umaparte do mesmo.
A seqüência de YNL141W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma adenina deaminase (adenina aminohidrolase), envolvidaem salvamento de purina e catabolismo de nitrogênio. Assim, em uma formade realização, o processo da presente invenção compreende o uso de umaadenina deaminase (adenina aminohidrolase), envolvida em salvamento depurina e catabolismo de nitrogênio; de E. coli ou seu homólogo, por exemplocomo mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferiruma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YNL282W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma subunidade de ambas RNAse MRPs, que clivam pre-rRNA, e RNase P nuclear, que cliva precursores de tRNApara gerarextremidades 5' maduras. Assim, em uma forma de realização, o processo dapresente invenção compreende o uso de uma subunidade de ambas RNAseMRPs, que clivam pre-rRNA, e RNase P nuclear, que cliva precursores detRNApara gerar extremidades 5' maduras; de E. coli ou seu homólogo, porexemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, paraconferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YNL283C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como um sensor-transdutor parcialmente redundante da via desinalização de PKC I-MPKl ativada por estresse envolvida em manutenção deintegridade da parede celular e recuperação de choque térmico. Assim, emuma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o usode um sensor-transdutor parcialmente redundante da via de sinalização dePKC I-MPKl ativada por estresse envolvida em manutenção de integridadeda parede celular e recuperação de choque térmico; de E. coli ou seuhomólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado emtabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YNL286W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína que liga a U2 snRNA e Prpl lp, e pode estarenvolvida em duplicação de US snRNA. Assim, em uma forma de realização,o processo da presente invenção compreende o uso de uma proteína que liga aU2 snRNA e Prpl lp, e pode estar envolvida em duplicação de US snRNA; deE. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplocomo indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo.
A seqüência de YOL056W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma homólogo de Gpmlp fosfoglicerato mutase que converte3-fosfoglicerato em 2-fosfoglicerato em glicólise. Assim, em uma forma derealização, o processo da presente invenção compreende o uso de umhomólogo de Gpmlp fosfoglicerato mutase que converte 3-fosfoglicerato em2-fosfoglicerato em glicólise; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo comomostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YOR154W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína de membrana com atividade de proteínaYORl54w. Assim, em uma forma de realização, o processo da presenteinvenção compreende o uso de proteína de membrana com atividade deproteína YORl 54w; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostradoaqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo.
A seqüência de YOR266W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) e Goffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína de membrana interna mitocondrial envolvida emexportação de proteínas da matriz mitocondrial. Assim, em uma forma derealização, o processo da presente invenção compreende o uso de proteína demembrana interna mitocondrial envolvida em exportação de proteínas damatriz mitocondrial; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostradoaqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerânciae/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo.
A seqüência de YOR298C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína com atividade de proteína YOR298C. Assim, emuma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o usode uma proteína com atividade de proteína YOR298C; de E. coli ou seuhomólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado emtabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YPL030W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et ai., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína com atividade de proteína YPL030W. Assim, emuma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o usode uma proteína com atividade de proteína YPL030W; de E. coli ou seuhomólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado emtabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YPLl03C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína com atividade de proteína YPL103C. Assim, emuma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o usode uma proteína com atividade de proteína YPL103C; de E. coli ou seuhomólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado emtabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YPL211W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína com YPL21IW atividade de proteína. Assim, emuma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o usode uma proteína com YPL211W atividade de proteína; de E. coli ou seuhomólogo, por exemplo como mostrado aqui, por exemplo como indicado emtabela II, para conferir uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YNR029C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína de membrana com YNR029C atividade deproteína. Assim, em uma forma de realização, o processo da presenteinvenção compreende o uso de proteína de membrana com YNR029Catividade de proteína; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo comomostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
A seqüência de YNL231C de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína de membrana com atividade de proteínaYNL231C. Assim, em uma forma de realização, o processo da presenteinvenção compreende o uso de proteína de membrana com atividade deproteína YNL231C; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo como mostradoaqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir uma tolerânciae/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo.
A seqüência de YLR210W de Saccharomyces cerevisiae foipublicada em Dietrich et al., Nature 387 (6632 Suppl), 78-81 (1997) eGoffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996, e sua atividade está sendodefinida como uma proteína de membrana com atividade de proteínaYLR210W. Assim, em uma forma de realização, o processo da presenteinvenção compreende o uso de proteína de membrana com atividade deproteína YLR210W; de E. coli ou seu homólogo, por exemplo comomostrado aqui, por exemplo como indicado em tabela II, para conferir umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
No caso em que a atividade de proteína b0019 de Escherichiacoli Kl2 ou a proteína para o transporte de cátions ou seus homólogos, porexemplo um antiporter Na+/H+, por exemplo como indicado em tabela II, éaumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
No caso em que a atividade de proteína b0730 de Escherichiacoli Kl2 ou a proteína com a atividade definida como reguladortranscripcional de operon succinilCoA sintetase e regulador de resposta deacila graxa ou seus homólogos, por exemplo regulador transcripcional, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, preferivelmente, em umaforma de realização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo éconferido.
No caso em que a atividade de proteína bl528 de Escherichiacoli K12 ou a proteína com a atividade definida como proteína de exportaçãoL-arabinose/isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo, ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, por exemplo as proteínas da famíliasMFS, é aumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumentoem tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína bl829 de Escherichia coli Kl 2 ou seus homólogos, por exemplocomo indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividade de umaprotease é aumentada, preferivelmente, a atividade de uma proteína de choquetérmico é aumentada, mais preferida a atividade de uma proteína htpX ou seuhomólogo é aumentada; preferivelmente, em uma forma de realização oaumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína b3164 de Escherichia coli Kl 2 ou seus homólogos, por exemplocomo indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividade de umpolirribonucleotídeo nucleotidiltransferase é aumentada, preferivelmente, emuma forma de realização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo éconferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YBL002W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um histona H2A e H2B e/ou uma trehalase é aumentada, preferivelmente,em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ou resistência aestresse ambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo éconferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YBR002C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividade de uma Cis-preniltransferase envolvida em síntese de dolicol; e/ou umaproteína que participa em classificação de proteína de retículo endoplásmico(ER) é aumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumentoem tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YBROIOW de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede proteínas de histona H3; ou uma histona de núcleo requerida para a montagem de cromatina, envolvida em silenciamento de HM e teloméricomediado por heterocromatina; regulado por acetilação, metilação, efosforilação mitótica é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YBR090c de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um proteína de membrana é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YBRl 09C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína de ligação de Ca++ que regula processos independentes deCa++ (por exemplo mitose, crescimento de broto, organização de actina,endocitose, etc.) e processos dependentes de Ca++ (por exemplo vias ativadaspor estresse) é aumentada, preferivelmente, em uma forma de realização oaumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YBR288C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma subunidade de tipo Mu3 do complexo de proteína associado comclatrina (AP-3); que funciona em transporte de fosfatase alcalina para ovacúolo através da via alternada é aumentada, preferivelmente, em uma formade realização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YEL001C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína YEL001C é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YER062c de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma de duas redundantes DL-glicerol-3-fosfatases (RHR2/GPP1 umcodifica o outro) envolvida em biossíntese de glicerol; induzida em resposta aum estresse hiperosmótico e estresse oxidativo, e durante a transição diáuxicaé aumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YERl45C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína com permease de ferro de alta afinidade envolvida notransporte de ferro através da membrana do plasma, que forma complexo comFet3p é aumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumentoem tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YER146W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um componente de complexos de ribonucleoproteína nuclear pequenaenvolvida em processamento de RNA, em emenda e decaimento é aumentada,preferivelmente, em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ouresistência a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YGL151W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína YGL151W é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YGR046W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína YGR046W é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YGR060W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma C-4 metil sterol oxidase, que catalisa a primeira de três etapasrequeridas para remover dois grupos C-4 metila de um intermediário embiossíntese de ergosterol é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YGR141W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína YGR141W é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YIL002Cor de Saccharomyces cerevisiae seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um homólogo YIL002c de inositol-l,4,5-trisfosfato 5-fosfatase éaumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade de proteína YIL031W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma peptidase que desconjuga peptídeos Smt3/SUM0-1 de proteínas, e/oudesempenha um papel em coesão de cromossomos em regiões centroméricase recuperação de parada de ponto de verificação induzida por dano do DNAou defeitos de replicação do DNA é aumentada, preferivelmente, em umaforma de realização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo éconferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YIL076W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um subunidade episolon-COP do coatômero; que regula tráfico de proteínaGolgi para ER retrógrado; e/ou estabiliza Cop lp, o alfa-COP e o complexocoatômero é aumentada, preferivelmente, em uma forma de realização oaumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade de proteína YIL077C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína YIL077C é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YIL121W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um transportador de múltiplos fármacos requerido para resistência aquinidina, barban, cisplatina, e bleomicina; que é membro da superfamília defacilitador principal de transportadores conferindo resistência a drogasmúltiplas (MFS-MDR) é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YILl 56W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína YILl56W é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YJR044C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um proteína endossomal tardia envolvida em endossoma tardio para tráficode vacúolos é aumentada, preferivelmente, em uma forma de realização oaumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YKL057C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um nucleoporina NUP120 (proteína de poro nuclear NUP120) éaumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YKL150W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um NADH mitocondrial - citocromo b4 redutase, envolvida em biossíntesede ergosterol é aumentada, preferivelmente, em uma forma de realização oaumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YKR057W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um proteína ribossomal, similar a proteínas ribossomais S21, envolvidabiogênese de ribossoma e tradução é aumentada, preferivelmente, em umaforma de realização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo éconferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YLR062c de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína YLR062c é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YLR142W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma prolina oxidase, e/ou uma proteína mitocondrial codificada nuclearenvolvida em utilização de prolina como única fonte de nitrogênio éaumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YLRl73W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína YLRl 73W é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YLR274W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um componente de complexo MCM hexamérico, que é importante parainiciar as origens de replicação de DNA em Gl e se torna uma helicasedependente de ATP ativa que promove fusão de DNA e alongamento quandoativada por Cdc7p-Dbf4p em fase S é aumentada, preferivelmente, em umaforma de realização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo éconferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YLR394W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína requerida para formação de complexo sinaptonemal, quepode ter um papel em recombinação meiótica; e/ou que localiza para sítios deiniciação de sinapse em cromossomos meióticos é aumentada,preferivelmente, em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ouresistência a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YNL108C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína YNL108C é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YNL141W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um adenina deaminase (adenina aminohidrolase), envolvida emsalvamento de purina e catabolismo de nitrogênio é aumentada,preferivelmente, em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ouresistência a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YNL282W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma subunidade de ambas RNAse MRPs, que clivam pre-rRNA, e RNaseP nuclear, que cliva precursores de tRNApara gerar extremidades 5' madurasé aumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YNL283C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um sensor-transdutor parcialmente redundante da via de sinalização dePKC I-MPKl ativada por estresse envolvida em manutenção de integridadeda parede celular e recuperação de choque térmico é aumentada,preferivelmente, em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ouresistência a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YNL286W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína que liga a U2 snRNA e Prpl lp, e pode estar envolvida emduplicação de US snRNA é aumentada, preferivelmente, em uma forma derealização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YOL056W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um homólogo de Gpmlp fosfoglicerato mutase que converte 3-fosfoglicerato em 2-fosfoglicerato em glicólise é aumentada, preferivelmente,em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ou resistência aestresse ambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo éconferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YORl 54W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um proteína de membrana com atividade de proteína YORl 54w éaumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YOR266W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um proteína de membrana interna mitocondrial envolvida em exportaçãode proteínas da matriz mitocondrial é aumentada, preferivelmente, em umaforma de realização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo éconferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YOR298C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína com atividade de proteína YOR298C é aumentada,preferivelmente, em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ouresistência a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YPL030W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína com atividade de proteína YPL030W é aumentada,preferivelmente, em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ouresistência a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YPL103C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína com atividade de proteína YPLl03C é aumentada,preferivelmente, em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ouresistência a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YPL211W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede uma proteína com atividade de proteína YPL211W é aumentada,preferivelmente, em uma forma de realização o aumento em tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem não transformada correspondente em um organismo ou uma partedo mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YNR029C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, por exemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um proteína de membrana com atividade de proteína YNR029C éaumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YNL231C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um proteína de membrana com atividade de proteína YNL231C éaumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Em uma forma de realização, no caso em que a atividade deproteína YLR210W de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos, porexemplo como indicado em tabela II, é aumentada, por exemplo a atividadede um proteína de membrana com atividade de proteína YLR210W éaumentada, preferivelmente, em uma forma de realização o aumento emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo é conferido.
Também está dentro do escopo da invenção triar as células deplanta ou plantas para tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental por triagem das células de planta sob condições de estresse paratolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom condições de não estresse. Isto permite a seleção de plantas comtolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental sem aidentificação de genes ou sintomas visuais.
Como a invenção é ainda possível reproduzir as células deplanta ou plantas para tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental por triagem das células de planta sob condições de estresse paratolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom condições não estresse e seleção das com tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental. A triagem para tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental é mais rápida e mais fácil do que, porexemplo, a triagem de genes.
A triagem é bem conhecida dos versados na técnica egeralmente refere-se à pesquisa para um atributo ou traço em particular. Nainvenção, este traço em uma planta ou célula de planta é a aparência geral,saúde, sintomas visuais de dano, como murchamento e amarronzamento dasfolhas ou a concentração de um metabólito. Os métodos e dispositivos para atriagem são conhecidos dos versados na técnica e incluem GC (cromatografiade gás), LC (cromatografia de líquido), HPLC (cromatografia de líquido dealto desempenho (pressão)) MS (espectrometria de massa), espectrometriaRMN (ressonância magnética nuclear), espectrometria IR (infravermelho)métodos fotométricos, etc e combinações destes métodos.
A reprodução é também um conhecimento comum para osversados na técnica. Ela é entendida como a incorporação dirigida e estável deum atributo ou traço particular em uma planta ou célula de planta.
As várias etapas de reprodução são caracterizadas porintervenção humana bem definida como a seleção e linhagens a seremcruzadas, dirigindo a polinização das linhas parentais, ou seleção de plantasde progênie apropriadas. As diferentes medidas de reprodução podem sertomadas, dependendo das propriedades desejadas. Todas as técnicas são bemconhecidas por um versado e incluem, por exemplo, mas não limitadas ahibridização, cruzamento endogâmico, cruzamento retro-cruzado, cruzamentode múltiplas linhagens, mistura de variedades, hibridização interespecífica,técnicas aneuplóides, etc. As técnicas de hibridização também podem incluir aesterilização de plantas para dar plantas estéreis machos ou fêmeas, por meiosmecânicos, químicos ou bioquímicos. A polinização cruzada de uma plantaestéril macho com pólen de uma linhagem diferente assegura que o genomada planta estéril macho mas fértil fêmea irá obter uniformemente propriedadesde ambas as linhagens parentais. As sementes transgênicas e plantas deacordo com a invenção pode ser assim usadas para a reprodução de linhagensde plantas melhoradas, que podem aumentar a eficácia de métodosconvencionais como tratamento de herbicidas ou pesticidas ou que permitemnão precisar de referidos métodos devido às suas propriedades genéticasmodificadas. Alternativamente, novas culturas com melhorada tolerância aestresse, preferivelmente seca e temperatura, podem ser obtidas, que, devidoao seu "equipamento" genético otimizado, dão produtos colhidos de melhorqualidade do que os produtos que não são capazes de tolerar condições dedesenvolvimento adverso comparáveis.
A invenção provê que o estresse ambiental pode ser estressesde salinidade, seca, temperatura, metal, químico, patogênico e oxidativo, oucombinações dos mesmos, preferivelmente seca e/ou temperatura.
O objeto da invenção é uma célula de planta transgênica, emque SRP (=proteína relacionada com estresse) é selecionada preferivelmentede levedura, preferivelmente Saccharomyces cerevisiae, ou E. coli ou umaplanta.
Em uma forma de realização o objeto da invenção é umacélula de planta transgênica, em que a SRP (=proteína relacionada comestresse) é selecionada preferivelmente de uma planta, preferivelmente deBrassica napus, Glycine max, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativaou levedura, preferivelmente Saecharomyces cerevisiae, ou E. coli, maispreferivelmente de Brassica napus, Glycine max, Zea mays, Triticumaestivum ou Oryza sativa.
Em uma outra forma de realização o objeto da invenção é umacélula de planta transgênica, em que a SRP (=proteína relacionada comestresse) é selecionada preferivelmente de uma planta, preferivelmenteBrassica napus, Glycine max, Zea mays, Hordeum vulgare, Helianassimannuus, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare, Helianassim annuus, Linumusitatissimum, Triticum aestivum ou Oryza sativa ou levedura,preferivelmente Saccharomyces eerevisiae, ou E. eoli, mais preferivelmentede Brassiea napus, Glyeine max, Zea mays, Hordeum vulgare, Helianassimannuus, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare, Helianassim annuus, Linum usitatissimum, Tritieum aestivum ou Oryza sativa.
O objeto da invenção é também uma célula de plantatransgênica, em que o ácido nucleico codificando SRP é pelo menos cerca de50 % homólogo a um dos ácido nucleico como mostrado na tabela I, colunas4 e 5. Na célula de planta transgênica da invenção, a expressão de referido ácido nucleico resulta em aumentada tolerância a um estresse ambiental comocomparado com uma célula de planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente. Aqui, o estresse ambiental é selecionado dentre o grupoconsistindo de estresses de salinidade, seca, temperatura, metal, químico,patogênico e oxidativo, ou combinações dos mesmos, preferivelmente seca e/ou temperatura.
O termo "expressão" refere-se à transcrição e/ou tradução deum segmento de gene codogênico ou gene. Como regra, o produto resultante éum mRNA ou uma proteína. No entanto, produtos de expressão tambémpodem incluir RNAs funcionais, tal como, por exemplo, anti-sentido, ácidos nucleicos, tRNAs, snRNAs, rRNAs, RNAi, siRNA, ribozimas, etc..Expressão pode estar sistêmica, local ou temporal, por exemplo limitada aalguns tipos de células, tecidos, órgãos ou períodos de tempo.
Alvo especificado em contrário, os termos "polinucleotídeos","ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" são interpermutáveis nopresente contexto. Salvo especificado em contrário, os termos "peptídeo","polipeptídeo" e "proteína" são interpermutáveis no presente contexto. Otermo "seqüência" pode ser referir a polinucleotídeos, ácidos nucleicos,moléculas de ácido nucleico, peptídeos, polipeptídeos e proteínas,dependendo do contexto em que o termo "seqüência" é usado. Os termos"gene(s)", "polinucleotídeo", " seqüência de ácido nucleico", " seqüência denucleotídeo", ou "molécula de ácido nucleico(s)" como usados aqui referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ouribonucleotídeos ou deoxirribonucleotídeos. Os termos referem-se somente àestrutura primária da molécula.
Assim, os termos "gene(s)", "polinucleotídeo", "seqüência deácido nucleico", "seqüência de nucleotídeo", ou "molécula de ácidonucleico(s)" como usados aqui incluem DNA e RNA de filamento duplo ouúnico. Eles também incluem tipos conhecidos de modificações, por exemplo,metilação, "caps", substituições de um ou mais nucleotídeos de ocorrêncianatural com um análogo. Preferivelmente, a seqüência de DNA ou RNA dainvenção compreende uma seqüência de codificação codificando opolipeptídeo aqui definido.
Uma "seqüência de codificação" é uma seqüência denucleotídeos, que é transcrita em mRNA e/ou traduzida em um polipeptídeoquando colocado sob o controle de seqüências regulatórias apropriadas. Oslimites da seqüência de codificação são determinados por um códon de iníciode tradução no término 5' e um códon de parada de tradução no término 3'.
Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não é limitada a mRNA,cDNA, seqüências de nucleotídeo recombinantes ou DNA genômico,enquanto os íntrons podem estar presentes também sob algumascircunstâncias.
Para os fins da invenção, como uma regra o plural é destinadoa englobar o singular e vice-versa.
Além disso, a célula de planta transgênica é derivada de umaplanta monocotiledônea. Alternativamente, a célula de planta transgênica éderivada de uma planta dicotiledônea. Preferivelmente, a célula de plantatransgênica é selecionada dentre o grupo consistindo de milho, trigo, centeio,aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, colza, canola,mandioca, pimentão, girassol, linho, borragem, cártamo, linhaça, prímula,colza, nabo selvagem, tagetes, plantas solanáceas, batata, tabaco, berinjela,tomate, espécies Vicia, ervilha, alfalfa, café, cacau, chá, espécie Salix, palmaoleígena, coco, grama perene, culturas de forragem e Arabidopsis thaliana.
Além disso, a célula de planta transgênica da presente invenção pode serderivada de uma planta gimnosperma. Preferivelmente, a planta é selecionadadentre o grupo de abeto, pinheiro e pinheiro silvestre.
A invenção ainda provê a semente produzida por uma plantatransgênica transformada por um ácido nucleico codificando SRP, em que aplanta é uma reprodução verdadeira para aumentada tolerância a estresseambiental como comparado com uma célula de planta de tipo selvagem. Aplanta transgênica pode ser uma monocotiledônea, uma dicotiledônea ou umaplanta gimnosperma. A invenção ainda provê a semente produzida por umaplanta transgênica expressando uma SRP em que a planta é reproduçãoverdadeira para aumentada tolerância a estresse ambiental como comparadocom uma célula s de planta de tipo selvagem. A invenção pertence a umasemente produzida por uma planta transgênica, em que a semente égeneticamente homozigótica para um transgene conferindo uma aumentadatolerância a estresse ambiental como comparado com uma planta de tiposelvagem.
A invenção ainda provê um produto agrícola produzido porqualquer uma das plantas transgênicas abaixo-descritas, partes de plantascomo folhas, pétalas, anteros, raízes, tubérculos, caules, brotos, flores ousementes. A invenção ainda provê um vetor de expressão recombinanteisolado compreendendo um ácido nucleico codificando SRP.
A invenção ainda provê um método de produzir a plantatransgênica com um ácido nucleico codificando SRP, em que expressão doácido nucleico em uma planta resulta em tolerância e/ou resistênciaaumentadas a um estresse ambiental como comparado com uma célula deplanta de tipo selvagem não transformada correspondente, compreendendotransformar uma célula de planta com um vetor de expressão incluindo umácido nucleico codificando SRP selecionado dentre o grupo compreendendoos homólogos de ácido nucleico ou partes dos mesmos e gerar a partir de uma célula de planta a planta transgênica com uma aumentada tolerância a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente.
Com relação à invenção descrita aqui, "transformadas outransgene" significa todas as plantas ou partes dos mesmos que foram produzidas através de métodos de manipulação genética e em que ou
al) um ou mais genes, preferivelmente codificados por uma oumais seqüências de ácido nucleico, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5,e/ou um homólogo das mesmas, ou
a2) um elemento regulatório genético, por exemplo umpromotor, que é ligado funcionalmente por exemplo à seqüência de ácidonucleico, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, e/ou um homólogo damesma, ou
eb) não está /não estão presente(s) em seu meio genéticonatural ou foi / foram modificados por meios de métodos de manipulaçãogenética, sendo possível para a modificação ser, a título de exemplo, umasubstituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais radicais denucleotídeo.
"Meio genético natural" significa o locus cromossômiconatural no organismo de origem ou a presença na biblioteca genômica. Nocaso de uma biblioteca genômica, o meio natural, genético, da seqüência deácido nucleico é preferivelmente pelo menos parcialmente ainda conservado,O meio flanqueia a seqüência de ácido nucleico pelo menos em um lado e temo comprimento de seqüência de pelo menos 50 bp, preferivelmente pelomenos 500 bp, particularmente preferivelmente pelo menos 1000 bp, muitoparticularmente preferivelmente pelo menos 5000 bp.
No referido método para produzir uma planta transgênicacompreendendo uma SRP5 o ácido nucleico codificando a SRP é selecionadodentre o grupo compreendendo o ácido nucleico mostrado na tabela I, colunas4 e 5 e/ou homólogos das seqüências acima mencionadas. Além disso, o ácidonucleico codificando SRP usado no referido método é pelo menos cerca de50% homólogo a um dos ácidos nucleicos mostrados na tabela I, colunas 4 e 5.
A planta ou célula de planta é considerada como uma"reprodução verdadeira" para um traço particular se ela for geneticamentehomozigótica para este tração na extensão de que, quando a planta dereprodução verdadeira é auto-polinizada, uma significante quantidade desegregação independente do traço dentre a progênie não é observada. Napresente invenção, o traço surge da expressão transgênica de uma ou maisseqüências de DNA introduzidas em uma célula de planta ou planta.
A presente invenção também provê métodos de modificartolerância a estresse de uma planta compreendendo, modificar o nível deexpressão de um ácido nucleico de SRP na planta. A invenção provê ummétodo de produzir a planta transgênica com um fator de transcrição sintético,novo, ou modificado que atua por aumento da transcrição de um gene de SRP.Teoricamente é também possível obter uma diminuição na expressão do gene.
Um método de detectar estresse ambiental em células de plantaou plantas compreendendo triar as células de planta para tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com condiçõesde não estresse também está no escopo da invenção.
Ainda um método de triar células de planta ou plantas paratolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental compreendendotriar as células de planta sob condições de estresse como comparado comcondições não estresse está englobado na invenção.
A presente invenção também encerra um método de reproduzircélulas de planta ou plantas para tolerância e/ou resistência aumentadas aestresse ambiental compreendendo triar as células de planta sob condições deestresse para tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com condições de não estresse e selecionar as comtolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental.
A presente invenção também engloba o uso de tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental e/ou de um ácido nucleicocodificando SRP selecionado dentre o grupo compreendendo o ácido nucleicomostrado em tabela I, colunas 4 e 5 e/ou homólogos das seqüências acimamencionadas ou partes dos mesmos como marcadores para seleção de plantasou células de planta com aumentada tolerância a estresse ambiental.
A presente invenção ainda engloba o uso de tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental e/ou um ácido nucleicocodificando SRP selecionado dentre o grupo compreendendo o ácido nucleicomostrado em tabela I, colunas 4 e 5 e/ou homólogos das seqüências acimamencionadas ou partes dos mesmos como marcadores para detecção deestresse em plantas ou células de planta.
A presente invenção também provê métodos de modificar atolerância a estresse de uma planta de cultura compreendendo utilizar umaseqüência de ácido nucleico codificando SRP para identificar plantasindividuais em populações segregando para tolerância a estresse ambientalaumentada ou diminuída (marcador de DNA).
No referido método de modificar a tolerância a estresse deuma planta, o ácido nucleico codificando SRP pode ser selecionado dentre ogrupo compreendendo o ácido nucleico mostrado em tabela I, colunas 4 e 5e/ou homólogos das seqüências acima mencionadas. Ainda o ácido nucleicocodificando SRP usado aqui pode ser pelo menos cerca de 50% homólogo aum dos ácidos nucleicos mostrados em tabela I, colunas 4 e 5. Também umvetor de expressão como descrito na presente invenção pode ser usado noreferido método.
Em um método variante do referido método de modificar atolerância a estresse, a planta é transformada com um promotor indutível quedirige expressão do SRP. Por exemplo, o promotor é específico de tecido. Emum método variante, o promotor usado é regulado em desenvolvimento.
Em uma outra forma de realização, o método de modificar atolerância a estresse compreende uma ou mais das seguintes etapas:
a) estabilizar uma proteína conferindo a expressão aumentadade uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção oudo polipeptídeo da invenção tendo a atividade acima mencionada de aumentara tolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umacélula de planta de tipo selvagem não transformada correspondente;
b) estabilizar um mRNA conferindo a expressão aumentada deuma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou seushomólogos ou de um mRNA codificando o polipeptídeo da presente invençãotendo a atividade acima mencionada de aumentar a tolerância e/ou resistênciaa estresse ambiental como comparado com uma célula de planta de tiposelvagem não transformada correspondente;
c) aumentar a atividade específica de uma proteína conferindoa expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácidonucleico da invenção ou do polipeptídeo da presente invenção ou diminuir aregulação inibitória do polipeptídeo da invenção;
d) gerar ou aumentar a expressão de um fator transcrição deendógeno ou artificial mediando a expressão de uma proteína conferindo aexpressão aumentada de uma proteína codificado pela molécula de ácidonucleico da invenção ou do polipeptídeo da invenção tendo a atividade acimamencionada de aumentar a tolerância e/ou resistência a estresse ambientalcomo comparado com uma célula de planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente;
e) estimular a atividade de uma proteína conferindo aexpressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácidonucleico da presente invenção ou um polipeptídeo da presente invenção tendoa atividade acima mencionada de aumentar a tolerância e/ou resistência aestresse ambiental por adição de um ou mais fatores indutores exógenos paraos organismos ou partes dos mesmos;
f) expressar um gene transgênico codificando a proteínaconferindo a expressão aumentada de um polipeptídeo codificado pelamolécula de ácido nucleico da presente invenção ou um polipeptídeo dapresente invenção, tendo a atividade acima mencionada de aumentar atolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umacélula de planta de tipo selvagem não transformada correspondente; e/ou
g) aumentar o número de cópias de um gene conferindo aexpressão aumentada de uma molécula de ácido nucleico codificando umpolipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção ou opolipeptídeo da invenção tendo a atividade acima mencionada de aumentar atolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umacélula de planta de tipo selvagem não transformada correspondente;
h) aumentar a expressão do gene endógeno codificando opolipeptídeo da invenção ou seus homólogos por adição de elementos deexpressão positiva ou remoção de elementos de expressão negativa, porexemplo recombinação homóloga pode ser usada para introduzir elementosregulatórios positivos como para as plantas o melhorador 35S no promotor oupara remover elementos repressores das regiões regulatórias. Ainda métodosde conversão de gene podem ser usados ara romper os elementos repressoresou para melhorar a atividade dos elementos positivos, os elementos positivospodem ser aleatoriamente introduzidos em plantas por T-DNA ou mutagenesede transposon e linhagens podem ser identificadas em que os elementospositivos foram integrados próximos de um gene da invenção, cuja expressãoé assim melhorada; e/ou
i) modular as condições de crescimento de planta em tal modoque a expressão ou atividade do gene codificando a proteína da invenção ou aprópria proteína é melhorada,
j) selecionar os organismos com uma atividade especialmenteelevada das proteínas da invenção a partir de recursos naturais ou demutageneizados e reproduzir os mesmos nos organismos alvos, por exemploas culturas de elite.
Preferivelmente, referido mRNA é uma molécula de ácidonucleico da presente invenção e/ou a proteína conferindo a expressãoaumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico dapresente invenção ou o polipeptídeo tendo a atividade aqui mencionada é opolipeptídeo da presente invenção, por exemplo conferindo aumentadatolerância a estresse ambiental.
Em geral, a quantidade de mRNA, polinucleotídeo oumolécula de ácido nucleico em uma célula ou um compartimento de umorganismo correlaciona-se com a quantidade de proteína codificada e assimcom a atividade global da proteína codificada em referido volume. Referidacorrelação não é sempre linear, a atividade no volume é dependente daestabilidade das moléculas, a degradação das moléculas ou a presença de co-fatores ativantes ou inibidores. Além disso, as inibições de produtos e dutossão bem conhecidas, por exemplo Zinser et al. "Enzyminhibitoren / Enzymeinhibitors".
A atividade dos acima mencionados proteínas e/oupolipeptídeos codificados pela molécula de ácido nucleico da presenteinvenção pode ser aumentada em vários modos. Por exemplo, a atividade emum organismo ou em uma parte do mesmo, como uma célula, é aumentadavia aumento do número de produto de gene, por exemplo por aumento da taxade expressão, como introdução de um promotor mais forte, ou por aumento daestabilidade do mRNA expressado, assim aumento da taxa de tradução, e/ouaumento da estabilidade do produto de gene, assim reduzindo o decaimentodas proteínas. Além disso, a atividade ou rotação de enzimas pode serinfluenciada de modo que uma redução ou aumento na taxa de reação ou umamodificação (redução ou aumento) da afinidade dos resultados do substrato, éalcançada. Uma mutação no centro catalítico de um polipeptídeo da invenção,por exemplo, uma enzima, pode modular a taxa de rotação da enzima, porexemplo, um nocaute de um aminoácido essencial pode levar a uma atividadereduzida ou completamente nocauteada da enzima, ou a deleção ou mutaçãode sítios de ligação do regulador pode reduzir uma regulação negativa comouma inibição de retro- alimentação (ou uma inibição de substrato, se o níveldo substrato também for aumentado). A atividade específica de uma enzimada presente invenção pode ser aumentada de modo que a taxa de rotação éaumentada ou a ligação de um co-fator é melhorada. A melhora daestabilidade do mRNA de codificação ou a proteína também pode aumentar aatividade de um produto de gene. O estímulo da atividade também está sob oescopo do termo "atividade aumentada".
Além disso, a regulação das seqüências de ácido nucleicoacima mencionadas pode ser modificada de modo que a expressão do gene éaumentada. Isto pode ser obtido vantajosamente por meio de seqüênciasregulatórias heterólogas ou por modificação, por exemplomutação, das seqüências regulatórias naturais que estão presentes. Osmétodos vantajosos podem ser também combinados entre si.
Em geral, uma atividade de um produto de gene em umorganismo ou parte do mesmo, em particular em uma célula de planta, umaplanta, ou um tecido de planta ou uma parte do mesmo ou em ummicroorganismo pode ser aumentada por aumento da quantidade do mRNAde codificação específico ou a proteína correspondente em referido organismoou parte do mesmo. "Quantidade de proteína ou mRNA" é entendido comosignificando o número de moléculas de polipeptídeos ou moléculas de mRNAem um organismo, um tecido, uma célula ou um compartimento de célula.
"Aumento" na quantidade de uma proteína significa o aumento quantitativodo número de moléculas de referida proteína em um organismo, um tecido,uma célula ou um compartimento de célula ou parte do mesmo - por exemplopor um dos métodos descritos aqui abaixo - em comparação a um tiposelvagem, controle ou referência.
O aumento em quantidades de número de moléculas,preferivelmente a pelo menos 1%, preferivelmente a mais do que 10%, maispreferivelmente a 30% ou mais, especialmente preferivelmente a 50%, 70%ou mais, muito especialmente preferivelmente a 100%, o maispreferivelmente a 500% ou mais. No entanto, a expressão de novo é tambémconsiderada como um assunto da presente invenção.
Uma modificação, isto é um aumento ou diminuição, pode sercausada por fatores endógenos ou exógenos. Por exemplo, um aumento ematividade em um organismo ou uma parte do mesmo pode ser causado poradição de um produto de gene ou um precursor ou um ativator ou um agonistaao meio ou nutrição ou pode ser causado por introdução dos referidosindivíduos em um organismo, transiente ou estável.
Em uma forma de realização o aumento ou diminuição emtolerância e/ou resistência a estresse ambiental como comparado com umacélula de planta de tipo selvagem não transformada correspondente na plantaou uma parte da mesma, por exemplo em uma célula, um tecido, um órgão,um organelo etc., é alcançado por aumento do nível endógeno do polipeptídeoda invenção. Assim, em uma forma de realização da presente invenção, apresente invenção refere-se a um processo em que o número de cópias degenes de um gene codificando o polinucleotídeo ou a molécula de ácidonucleico da invenção é aumentado. Além disso, o nível endógeno dopolipeptídeo da invenção pode ser, por exemplo, aumentado por modificaçãoda regulação transcripcional ou translacional do polipeptídeo.
Em uma forma de realização a tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental em uma planta ou parte do mesmo pode seralterada por mutagenese marcada ou aleatória dos genes endógenos dainvenção. Por exemplo recombinação homóloga pode ser usada para ouintroduzir elementos regulatórios positivos, como para as plantas omelhorador 35S no promotor ou para remover elementos repressores das regiões regulatórias. Além disso, os métodos de tipo de conversão de genes,descritos por Kochevenko e Willmitzer (Plant Physiol. 2003 May;132(l):174-84) e citações nos mesmos, podem ser usados para romper os elementosrepressores ou para melhorar a atividade dos elementos regulatórios positivos.
Além disso, os elementos positivos podem ser introduzidosaleatoriamente em genomas (plantas) por mutagenese de T-DNA outransposon e linhagens podem ser tríadas para, em que os elementos positivosforam integrados em uma gene da invenção, cuja expressão é assimmelhorada. A ativação genes de plantas por integrações aleatórias deelementos melhoradores foi descrita por Hayashi et al., 1992 (Science258:1350-1353) ou Weigel et al., 2000 (Plant Physiol. 122, 1003-1013) eoutros citados nos mesmos.
As estratégias genéticas reversas para identificar inserções(que eventualmente transportam os elementos de ativação) próximo em genesde interesse foram descritas para vários casos, por exemplo Krysan et al.,1999 (Plant Cell 1999, 11, 2283-2290); Sessions et al., 2002 (Plant Cell 2002,14, 2985-2994); Young et al., 2001, (Plant Physiol. 2001, 125, 513-518);Koprek et al., 2000 (Plant J. 2000, 24, 253-263); Jeon et al., 2000 (Plant J.2000, 22, 561-570); Tissier et al., 1999 (Plant Cell 1999, 11, 1841-1852);Speulmann et al., 1999 (Plant Cell 1999,11, 1853-1866). Brevemente,material de todas as plantas de uma grande população de plantasmutageneizada por T-DNA ou transposon é coletada e o DNA genômicopreparado. Então, o DNA genômico é reunido seguindo arquiteturasespecíficas como descrito por exemplo em Krysan et al., 1999 (Plant Cell1999, 11, 2283-2290). Os conjuntos de DNA genômicos são então feriados porreações de PCR multiplex específicas detectando a combinação de mutageneinsercional (por exemplo, T-DNA ou Transposon) e o gene de interesse.Assim reações PCR são cicladas nos conjuntos de DNA com específicascombinações de iniciadores de borda de T-DNA ou transposon e iniciadoresespecíficos de gene. As regras gerais para o projeto de iniciador podem sernovamente tomadas de Krysan et al., 1999 (Plant Cell 1999, 11, 2283-2290)A retriagem de conjuntos de DNA de níveis menores leva à identificação deplantas individuais em que o gene de interesse é ativado pelo mutageneinsercional.
A melhora de elementos regulatórios positivos ou a ruptura oenfraquecimento de elementos regulatórios negativos também pode seralcançada através de técnicas de mutagenese comuns. A produção depopulações mudadas quimicamente ou por radiação é uma técnica comum ebem conhecida do versado. Os métodos para plantas são descritos porKoomeef et al, 1982, e as citações ai e por Lightner e Caspar em "Methods inMolecular Biology, vol. 82. Estas técnicas geralmente induzem mutações depontos que podem ser identificadas por qualquer gene conhecido usandométodos como TILLING (Colbert et al. 2001).
Assim, um nível de expressão pode ser aumentado se os genesendógenos codificando um polipeptídeo conferindo uma aumentada expressãodo polipeptídeo da presente invenção, em particular genes compreendendo amolécula de ácido nucleico da presente invenção, são modificados viarecombinação homóloga, abordagens de tipo Tilling ou conversão de genes.
Seqüências regulatórias podem ser ligadas operativamente àregião de codificação de proteínas endógenos e controlar sua transcrição etradução ou a estabilidade ou decaimento do mRNA de codificação ou aproteína expressada. A fim de modificar e controlar a expressão, promotor,UTRs, sítios de emenda, sinais de processamento, sítios de poliadenilação,terminadores, melhoradores, repressores, sítios de modificação pós-transcripcional ou pos- translacional podem ser mudados, adicionados ouemendados. Por exemplo, a ativação de genes de planta por integraçõesaleatórias de elementos melhoradores foi descrita por Hayashi et al., 1992(Science 258:1350-1353) ou Weigel et al., 2000 (Plant Physiol. 122, 1003-1013) e outros citados ai. Por exemplo, um nível de expressão da proteínaendógena pode ser modulado por substituição do promotor endógeno com umpromotor transgênico mais forte ou por substituição do 3'UTR endógeno comum 3'UTR, que provê mais estabilidade sem eméndar a região de codificação.Além disso, a regulação e transcripcional pode ser modulada por introduçãode um fator de transcrição artificial como descrito nos exemplos. Promotoresalternativos, terminadores e UTRs são descritos abaixo.
A ativação de um polipeptídeo endógeno tendo atividadeacima mencionada, por exemplo conferindo uma aumentada tolerância aestresse ambiental também pode ser aumentada por introdução de um fator detranscrição sintético, que liga próximo à região de codificação da proteína dainvenção codificando o gene e ativa sua transcrição. Uma proteína de dedo dezinco quimérica pode ser construída, que compreende um domínio de ligaçãode DNA específico e um domínio de ativação como por exemplo o domínioVP16 de vírus Herpes Simplex. O domínio específico de ligação pode ligar aregião regulatória da região de codificação da proteína. A expressão do fatorde transcrição quimérico em uma planta leva a uma expressão específica daproteína da invenção, ver por exemplo em WOO1/52620, Oriz, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 2002, Vol. 99, 13290 ou Guan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA,2002, Vol. 99, 13296.Em uma outra forma de realização do método de acordo com ainvenção, plantas são usadas em que um dos genes acima mencionados, ouum dos ácidos nucleicos acima mencionados, é mudado em um modo em quea atividade de produtos de gene codificados é menos influenciada por fatorescelulares, ou não é de todo, em comparação com as proteínas não mudadas.Por exemplo, mecanismo de regulação bem conhecido de atividadeenzimática são mecanismos de inibição do substrato ou de regulação de retro-alimentação. Os modos e técnicas para a introdução de substituições, deleçõese adições de uma ou mais bases, nucleotídeos ou aminoácidos de umaseqüência correspondente são descritos aqui abaixo nos parágrafoscorrespondentes e as referências listados ai, por exemplo em Sambrook et al.,Molecular Cloning, Cold Spring Habour, NY, 1989. O versado na técnica serácapaz de identificar domínios de regulação e sítios de ligação de reguladorespor comparação da seqüência da molécula de ácido nucleico da presenteinvenção ou um produto de expressão da mesma, com o estado da técnica pormeio de software de computador que compreende algoritmos para aidentificação de sítios de ligação e domínios de regulação ou por introduçãoem uma molécula de ácido nucleico ou em uma proteína sistematicamente demutações e testes para estas mutações que irão levar a uma atividadeespecífica aumentada ou uma atividade por volume aumentada, em particularpor célula.
Assim, é vantajoso expressar em uma planta a molécula deácido nucleico da invenção ou um polipeptídeo da invenção derivado de umorganismo de parentesco distante evolucionário, como por exemplo usandoum gene procariótica em um hospedeiro eucariótico, como nestes casos omecanismo de regulação de uma célula hospedeira pode não enfraquecer aatividade (celular ou específica) do gene ou seu produto de expressão.
A mutação é introduzida de tal modo que a produção doaminoácido não é afetada de modo adverso.Uma menor influência sobre a regulação de um gene ou seuproduto de gene é entendida como significando uma reduzida regulação daatividade enzimática levando a uma atividade aumentada específica ouatividade celular do gene ou seu produto. Um aumento da atividade enzimática é entendido como significando uma atividade enzimática, que éaumentada por pelo menos 10%, vantajosamente pelo menos 20, 30 ou 40%,especialmente vantajosamente por pelo menos 50, 60 ou 70% em comparaçãocom o organismo de partida.
A invenção provê que os métodos acima podem ser realizados de modo que a tolerância a estresse é aumentada. Também é possível obteruma diminuição na tolerância a estresse.
A invenção não é limitada a ácidos nucleicos específicos,polipeptídeos específicos, tipos de células específicos, células hospedeirasespecíficas, condições específicas ou métodos específicos etc. como tal, mas podem ocorrer numerosas modificações e variações nas mesma, comoevidente para o versado na técnica. Também, deve-se entender que aterminologia usada aqui tem por finalidade descrever formas de realização dainvenção apenas e não pretende ser limitativa.
A presente invenção também refere-se em uma forma de realização a proteínas isoladas relacionadas com estresse (SRP) que sãoselecionadas dentre o grupo compreendendo as proteínas, como mostrado natabela II, colunas 4 e 5, e/ou homólogos das mesmas. Preferivelmente, asproteínas isoladas relacionadas com estresse (SRP) da presente invenção sãoselecionadas dentre o grupo compreendendo os polipeptídeos como mostradona tabela II B, coluna 5. Além disso, a presente invenção está relacionada aácidos nucleicos codificando proteína relacionada com estresse isolada (SRP)selecionados dentre o grupo compreendendo o ácido nucleico, como mostradona tabela I, colunas 4 e 5, e/ou homólogos do mesmo. Aqui, preferivelmente,um ácido nucleico codificando proteína relacionada com estresse isolada(SRP) codifica uma SRP que é selecionada dentre levedura ou E. coli e/ouBrassica napus, Glycine max, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa,mais preferivelmente como mostrado na tabela II B, coluna 5.
A presente invenção também refere-se em uma outra forma derealização a proteínas relacionadas com estresse (SRP) isoladas que sãoselecionadas dentre o grupo compreendendo as proteínas, como mostrado natabela II, colunas 4 e 5, e/ou homólogos das mesmas. Preferivelmente, asproteínas relacionadas com estresse (SRP) isoladas da presente invenção sãoselecionadas dentre o grupo compreendendo os polipeptídeos como mostradona tabela IIB, coluna 5. Além disso, a presente invenção está relacionada comácidos nucleicos codificando proteína relacionada com estresse (SRP) isoladaselecionados dentre o grupo compreendendo o ácido nucleico, como mostradona tabela I, colunas 4 e 5, e/ou homólogos do mesmo. Aqui, preferivelmente,um ácido nucleico codificando uma proteína relacionada com estresse (SRP)isolada codifica uma SRP que é selecionada dentre levedura ou E. coli e/ouBrassica napus, Glyeine max, Zea mays, Hordeum vulgare, Helianassimannuus, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare, Helianassim annuus, Linumusitatissimum, Triticum aestivum ou Oryza sativa, mais preferivelmente comomostrado na tabela IIB, coluna 5.
Em uma forma de realização a presente invenção provêseqüências de genes relacionados com estresse selecionados dentre o grupoconsistindo de ácido nucleico, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, delevedura, preferivelmente de Saccharomyees eerevisiae ou E. coli e/ou comomostrado na tabela I B, coluna 5 e/ou homólogos dos mesmos,preferivelmente de Brassica napus, Glyeine max, Zea mays, Tritieumaestivum ou Oryza sativa.
Em uma outra forma de realização a presente invenção provêseqüências de genes relacionados com estresse selecionados dentre o grupoconsistindo de ácido nucleico, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, delevedura, preferivelmente de Saccharomyces eerevisiae ou E. eolie/ou como mostrado na tabela I B, coluna 5 e/ou homólogos dos mesmos,preferivelmente de Brassiea napus, Glyeine max, Zea mays, Hordeumvulgare, Helianassim annuus, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare,Helianassim annuus, Linum usitatissimum, Triticum aestivum ou Oryzasativa.
Homólogos das seqüências acima mencionadas podem serisolados vantajosamente de levedura, fungos, vírus, algas, bactérias, tal comoAcetobacter (subgen. Acetobacter) aceti; Aciditiobacillus ferrooxidans;Acinetobacter sp.; Actinobacillus sp; Aeromonas salmonicida; Agrobacteriumtumefaciens; Aquifex aeolicus; Arcanobacterium pyogenes; Aster yellowsphytoplasma; Bacillus sp.; Bifidobacterium sp.; Borrelia burgdorferi;Brevibacterium linens; Brucella melitensis; Buchnera sp.; Butyrivibriofibrisolvens; Campylobacter jejuni; Caulobacter crescentus; Chlamydia sp.;Chlamydophila sp.; Chlorobium limicola; Citrobacter rodentium; Clostridiumsp.; Comamonas testosteroni; Corynebaeterium sp.; Coxiella burnetii;Deinococcus radiodurans; Diehelobaeter nodosus; Edwardsiella ictaluri;Enterobaeter sp.; Erysipelothrix rhusiopathiae; Eseheriehia eoli;Flavobacterium sp.; Franeisella tularensis; Frankia sp. CpI 1; Fusobacteriumnucleatum; Geobacillus stearothermophilus; Gluconobacter oxydans;Haemophilus sp.; Helieobaeter pylori; Klebsiella pneumoniae; Lactobacillussp.; Lactococcus lactis; Listeria sp.; Mannheimia haemolytica;Mesorhizobium loti; Metilophaga thalassica; Microeystis aeruginosa;Microscilla sp. PRE1; Moraxella sp. TA144; Mycobaeterium sp.;Myeoplasma sp.; Neisseria sp.; Nitrosomonas sp.; Nostoe sp. PCC 7120;Novosphingobium aromaticivorans; Oenococcus oeni; Pantoea citrea;Pasteurella multocida; Pediococcus pentosaceus; Phormidium foveolarum;Phytoplasma sp.; Pleetonema boryanum; Prevotella ruminicola;Propionibacterium sp.; Proteus vulgaris; Pseudomonas sp.; Ralstonia sp.;Rhizobium sp.; Rhodococcus equi; Rhodothermus marinus; Riekettsia sp.;Riemerella anatipestifer; Ruminococcus flavefaciens; Salmonella sp.;Selenomonas ruminantium; Serratia entomophila; Shigella sp.; Sinorhizobiummeliloti; Staphylococcus sp.; Streptococcus sp.; Streptomyees sp.;Synechococcus sp.; Synechoeystis sp. PCC 6803; Thermotoga marítima;Treponema sp.; Ureaplasma urealyticum; Vibrio cholerae; Vibrioparahaemolyticus; Xylella fastidiosa; Yersinia sp.; Zymomonas mobilis,preferivelmente Salmonella sp. ou Eseheriehia coli ou plantas,preferivelmente de leveduras tal como dos gêneros Saccharomyces, Piehia5Candida, Hansenula, Torulopsis ou Schizosaccharomyces ou plantas tal comoArabidopsis thaliana, milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, soja,amendoim, algodão, borragem, cártamo, linhaça, prímula, colza, canola enabo selvagem, mandioca, pimentão, girassol, tagetes, plantas solanáceas talcomo batata, tabaco, berinjela e tomate, espécies Vicia, ervilha, alfalfa,plantas de arbustos tal como café, cacau, chá, espécie Salix, árvores tal comopalma oleígena, coco, grama perene, tal como azévem e festuca, e culturas deforragem, tal como alfalfa e trevo e de abeto, pinheiro ou pinheiro americano,por exemplo. Mais preferivelmente homólogos de seqüências acimamencionadas podem ser isolados de Saccharomyces cerevisiae, E. coli ouplantas, preferivelmente Brassica napus, Glycine max, Zea mays, Triticumaestivum ou Oryza sativa ou preferivelmente Brassica napus, Glyeine max,Zea mays, Hordeum vulgare, Helianassim annuus, Linum usitatissimum,Hordeum vulgare, Helianassim annuus, Linum usitatissimum, Tritieumaestivum ou Oryza sativa..
As proteínas relacionadas com estresse da presente invençãosão preferivelmente produzidas por técnicas de DNA recombinante. Porexemplo, a molécula de ácido nucleico codificando a proteína é clonada emum vetor de expressão, por exemplo em vetor binário, cuja expressão éintroduzida em uma célula hospedeira, por exemplo NASC N906 de tiposelvagem de Arabidopsis thaliana ou qualquer outra célula de planta comodescrito nos exemplos ver abaixo, e a proteína relacionada com estresse éexpressada em referida célula hospedeira. Exemplos para vetores binários sãopBIN19, pBIlOl, pBinAR, pGPTV, pCAMBIA, pBIB-HYG, pBecks, pGreenou pPZP (Hajukiewicz, P. et al., 1994, Plant Mol. Biol., 25: 989-994 eHellens et al, Trends in plant Science (2000) 5,446-451.).
Com vantagem, as seqüências de ácido nucleico de acordocom a invenção ou a construção de genes junto com pelo menos um generepórter são clonados em um cassete de expressão, que é introduzido noorganismo via um vetor ou diretamente no genoma. Este gene repórter
Permite a fácil detecção via um teste de crescimento,fluorescência, químico, bioluminescência ou de resistência ou via umamedida fotométrica. Os exemplos de genes repórter que podem sermencionados são genes de resistência a antibiótico ou herbicidas, geneshidrolase, gentes de proteína fluorescente, genes de bioluminescência, ougenes metabólicos de nucleotídeo ou açúcar, genes de biossíntese tal como ogene Ura3, o gene Ilv2, o gene luciferase, o gene β-galactosidase, o gene gfp,o gene 2-desoxiglucose-6-fosfato fosfatase, o gene β-glucuronidase, gene β-lactamase, o gene neomicina fosfotransferase, o gene higromicinafosfotransferase ou o gene BASTA (resistência a glufosinato). Estes genespermitem uma medição e quantificação fáceis da atividade de transcrição eassim de uma expressão dos genes. Deste modo, as posições no genomapodem ser identificadas que demonstram produtividade diferente.
Em uma forma de realização preferida uma construção deácido nucleico, por exemplo um cassete de expressão, compreende amontante, isto é na extremidade 5' da seqüência de codificação, um promotore a jusante, isto é na extremidade 3', um sinal de poliadenilação eopcionalmente outros elementos regulatórios que são ligados operativamenteà seqüência de codificação interveniente com o ácido nucleico de, comomostrado na tabela X, colunas 4 e 5. Por uma ligação operável, significa-se adisposição seqüencial do promotor, seqüência de codificação, terminador eopcionalmente outros elementos regulatórios em um modo em que cada umdos elementos regulatórios pode preencher sua função em uma expressão daseqüência de codificação em um modo devido. As seqüências preferidas paraa ligação operável são seqüências de marcação para assegurar a localizaçãosubcelular em plastídeos. No entanto, seqüências de marcação para assegurara localização subcelular no mitocôndrio, no reticulo endoplásmico (= ER), nonúcleo, em corpúsculos de óleo ou outros compartimentos também podem serempregados, assim como promotores de tradução, tal como a seqüência deguia 5' em vírus do mosaico do tabaco (Gallie et al„ Nucl. Acids Res. 15
(1987), 8693 -8711).
Uma construção de ácido nucleico, por exemplo um cassete deexpressão pode, por exemplo, conter um promotor constitutivo ou umpromotor específico de tecido- (preferivelmente o promotor USP ou napina)do gene a ser expressado e o sinal de retenção do ER. Para o sinal de retençãodo ER, a seqüência de KDEL de aminoácido (lisina, ácido aspártico, ácidoglutâmico, leucina) ou a seqüência KKX de aminoácido (lisina-lisina-X-parada, em que X significa cada outro aminoácido conhecido) épreferivelmente empregada.
Para expressão em um organismo hospedeiro procariótico oueucariótico, por exemplo um microorganismo tal como um fungo ou umaplanta, um cassete de expressão é vantajosamente inserido em um vetor talcomo a título de exemplo um plasmídeo, um fago ou outro DNA que permitea expressão ótima dos genes no organismo hospedeiro. Exemplos deplasmídeos apropriados são :em E. coli série PLG338, PACYC184, pBR talcomo por exemplo pBR322, serie PUC tal como PUC18 ou pUC19, seneM113mp, pKC30, PReP4, pHSl, PHS2, PPLc236, pMBL24, pLG200,pUR290, pIN-IIl"3-Bl, Xgtll ou pBdCI; em Streptomyces pUlOl, pIJ364,pIJ702 ou pIJ361; em Bacillus pUBllO, pC194 ou pBD214; emCorynebacterium pSA77 ou pAJ667; em fungos pALSl, pIL2 ou pBBlló;outros vetores fungicos vantajosos são descritos por Romanos, M.A. et al.,[(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] e porvan den Hondel5 C.A.M.JJ. et al. [(1991) "Heterologous gene expression infilamentous fungi" assim como em More Gene Manipulations in Fungi [J.W.Bennet & L.L. Lasure, eds., pp. 396-428: Academic Press: San Diego] e in"Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [vanden Hondel, C.A.M.JJ. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Geneticsof Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., pp. 1-28, Cambridge University Press:Cambridge]. Exemplos de promotores de levedura vantajosos são 2μΜ, pAG-1, YEp6, YEp 13 ou pEMBLYe23. Exemplos de promotores de algas ouplantas são pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, pVKH ou pDH51 (verSchmidt, R. e Willmitzer, L., 1988). Os vetores identificados acima ouderivados dos vetores identificados acima são uma seleção pequena deplasmídeos possíveis. Outros plasmídeos são bem conhecidos na técnica epodem ser encontrados, por exemplo, no livro Cloning Vetores (Eds. PouwelsP.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985,ISBN O 444 904018). Apropriados vetores de plantas são descritos inter aliaem " Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press),Ch. 6/7, pp. 71-119. Os vetores vantajosos são conhecidos como os vetoresshuttle ou vetores binários que replicam em E. coli e Agrobacterium.
Por vetores, significam-se, com a exceção de plasmídeos,todos os outros vetores bem conhecidos na técnica, como a título deexemplos, fagos, vírus como SV40, CMV, baculovírus, adenovírus,transposons, elementos IS, fasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, DNA linear oucircular. Estes vetores podem ser replicados autonomamente no organismohospedeiro, ou ser replicados cromossomicamente, a replicaçãocromossômica sendo preferida.Em uma outra forma de realização do vetor o cassete deexpressão de acordo com a invenção também pode vantajosamente serintroduzido nos organismos na forma de um linear DNA e ser integradodentro do genoma do organismo hospedeiro por meio de recombinação homóloga ou heteróloga. Este DNA linear pode ser composto de umplasmídeo linearizado ou somente de um cassete de expressão como vetor ouas seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção.
Em ainda uma forma de realização vantajosa, a seqüência deácido nucleico de acordo com a invenção também pode ser introduzida em um organismo sozinha.
Se além da seqüência de ácido nucleico de acordo com a
invenção outros genes devem ser introduzidos no organismo, todos juntoscom um gene repórter em um único vetor ou cada gene único com um generepórter em um vetor, em cada caso, podem ser introduzidos no organismo, assim os diferentes vetores pode ser introduzidos simultaneamente ousucessivamente.
O vetor vantajosamente contém pelo menos uma cópia das
seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção e/ou o cassete deexpressão (=construção de gene) de acordo com a invenção.
A invenção ainda provê um vetor de expressão isoladorecombinante compreendendo um ácido nucleico de SRP como descritoacima, em que expressão do vetor em uma célula hospedeira resulta emaumentada tolerância a estresse ambiental como comparado com umavariedade de tipo selvagem de uma célula hospedeira. Como usado aqui, otermo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportaroutro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um"plasmídeo," que refere-se a um laço de DNA de filamento duplo circular nossegmentos de DNA adicionais pode ser ligado. Outro tipo de vetor é um vetorviral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genomaviral. Alguns vetores são capazes de replicação autônoma em uma célulahospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianostendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais demamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissomais demamíferos) são integrados dentro do genoma de uma célula hospedeiraquando da introdução dentro da célula hospedeira, e assim são replicadosjunto com o genoma do hospedeiro. Além disso, alguns vetores são capazesde dirigir a expressão de genes aos quais eles são ligados operativamente.
Estes vetores são referidos aqui como "vetores de expressão." Em geral,vetores de expressão de utilidade em técnicas recombinantes de DNA estãocom freqüência na forma de plasmídeos. No presente relatório, "plasmídeo" e"vetor" podem ser usados de modo interpermutável como o plasmídeo é aforma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção é destinada aincluir tais outras formas de vetores de expressão, tal como vetores virais (porexemplo, replicação defeituosa de retrovírus, adenovírus, e adenovírus -associados), que servem a uma função equivalente.
Os vetores de expressão recombinantes da invençãocompreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma apropriada paraexpressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, que significa que osvetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüênciasregulatórias, selecionadas com base em células hospedeiras a serem usadaspara expressão, que é ligado operativamente à seqüência de ácido nucleico aser expressada. Como usado aqui com respeito a um vetor de expressãorecombinante, "ligado operativamente" é destinado a significar que aseqüência de nucleotídeo de interesse é ligada a uma seqüência(s)regulatória(s) em um modo que permite a expressão da seqüência denucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcrição/translação in vitro ouem uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido dentro da célulahospedeira). O termo "seqüência regulatória" é destinado a incluirpromotores, melhoradores, e outros elementos de controle de expressão (porexemplo, sinal de poliadenilação). Estas seqüências regulatórias são descritas,por exemplo, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) e Gruber e Crosby,in: Methods in plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick eThompson, Cap. 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluindo asreferências. Seqüências regulatórias incluem as que dirigem a expressãoconstitutiva de uma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de célulashospedeiras e as que dirigem a expressão da seqüência de nucleotídeosomente em algumas células hospedeiras ou sob algumas condições. Seránotado por versado na técnica que o projeto de um vetor de expressão podedepender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a sertransformada, o nível de expressão de polipeptídeo desejado, etc. Os vetoresde expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras paraassim produzir polipeptídeos ou peptídeos, incluindo polipeptídeos oupeptídeos de fusão, codificados por ácidos nucleicos como descrito aqui (porexemplo, SRPs, forma mutante de SRPs, polipeptídeos de fusão, etc.).
Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem serprojetados para expressão de SRPs em células procarióticas ou eucarióticas.Por exemplo, genes SRP podem ser expressados em células bacterianas, talcomo C. glutamicum, células de insetos (usando vetores de expressão debaculovirus), levedura e outras células de fungos (Ver Romanos, M.A. et al.,1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van denHondel, C.A.M.J.J. et al., 1991, Heterologous gene expression in filamentousfungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure,eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; e van den Hondel, C.A.M.J.J.& Punt, P.J., 1991, Gene transfer systems and vector development forfilamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. etal., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatoreet al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251), ciliatos dos tipos:Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium,Colpidium, Glaueoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus,Euplotes, Engelmaniella, e Stylonychia, especialmente do gênero Stylonychialemnae com vetores seguindo um método de transformação como descrito emPedido PCT No. WO 98/01572, e células de planta multicelulares (verSchmidt, R. e Willmitzer, L., 1988, High efficiency Agrobacteriumtumefaciens-meâiated transformation of Arabidopsis thaliana Ieaf andcotyledon explants, Plant Cell Rep.583-586; Plant Molecular Biology andBiotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, cap. 6/7, S.71-119 (1993); F.F.White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: transgenic plants,Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, AcademicPress: 1993; Potrykus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol.42:205-225 e referências citadas) ou células de mamíferos. As apropriadascélulas hospedeiras são discutidas ainda em Goeddel, Gene ExpressionTechnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA(1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode sertranscrito e traduzido in vitro, por exemplo usando seqüências regulatórias depromotor T7 e polimerase T7.
Expressão de polipeptídeos em procarióticos é com freqüênciamaior realizada com vetores contendo promotores constitutivos ou indutíveisdirigindo a expressão de polipeptídeos de fusão ou não fusão. Os vetores defusão adicionam um número de aminoácidos para um polipeptídeo codificadoal, geralmente para o término amino do polipeptídeo recombinante mastambém para o término C ou fundido com as regiões apropriadas nospolipeptídeos. Estes vetores de fusão tipicamente servem a três fins: 1)aumentar expressão de um polipeptídeo recombinante; 2) aumentar asolubilidade de um polipeptídeo recombinante; e 3) auxiliar na purificação deum polipeptídeo recombinante por ação como um ligando em purificação porafinidade. Com freqüência, em vetores de expressão de fusão, um sítio declivagem proteolítico é introduzido na junção da porção de fusão e opolipeptídeo recombinante para permitir a separação do polipeptídeorecombinante da porção de fusão subseqüente à purificação do polipeptídeode fusão. Estas enzimas, e suas seqüências de reconhecimento cognatasincluem Fator Xa5 trombina, e enteroquinase.
Por meio de exemplo, o cassete de expressão de plantas podeser instalado em um vetor de transformação pRT ((a) Toepfer et al., 1993,Methods Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al. 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 5890 ff.).
Alternativamente, um vetor recombinante (=vetor deexpressão) também pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplousando promotor T7 e T7 RNA polimerase.
Vetores de expressão empregados em procarióticos comfreqüência fazem uso de sistemas indutíveis com e sem proteínas de fusão ouoligopeptídeos de fusão, em que estas fusões podem seguir em um modo N-terminal e C-terminal ou em outros domínios utilizáveis de uma proteína.
Estes vetores de fusão geralmente têm os seguintes fins : i.) aumentar a taxade expressão de RNA; ii.) aumentar a taxa de síntese de proteína obtenível;iii.) aumentar a solubilidade da proteína; iv.) ou simplificar a purificação pormeio de seqüência de ligação utilizável para cromatografia por afinidade. Ospontos de clivagem proteolítica são também introduzidos com freqüência viaproteínas de fusão, que permitem a clivagem de uma porção da proteína defusão e purificação. Estas seqüências de reconhecimento para proteases sãoreconhecidas, por exemplo fator Xa, trombina e enteroquinase.
Os vetores de fusão de expressão típicos e vantajosos sãopGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. e Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia,Piscataway, NJ) que contém glutationa S-transferase (GST), proteína deligação de maltose ou proteína A.
Em uma forma de realização, a seqüência de codificação doSRP é clonada em um vetor pGEX de expressão para criar um vetorcodificando um polipeptídeo de fusão compreendendo, a partir do N-término para o C-término, GST-sítio de clivagem de trombina -X polipeptídeo. Opolipeptídeo de fusão pode ser purificado por cromatografia de afinidadeusando glutationa- resina agarose. PKSRP recombinante não fusionado a GSTpode ser recuperado por clivagem da polipeptídeo de fusão com trombina.
Outros exemplos de vetores de expressão de E. coli são pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] e vetores pET [Studier et al., GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, Califórnia (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Holanda ].
A expressão de gene alvo do vetor pTrc baseia-se emtranscrição de RNA polimerase do hospedeiro de um promotor de fusão trp-lac. A expressão de gene alvo do vetor pET Ild baseia-se em uma transcriçãode um promotor de fusão T7 gnlO-Iac mediada por uma c polimerase RNAviral co-expressada (T7 gnl). Esta polimerase viral é fornecida por cepashospedeiras BL21(DE3) ou HMS174(DE3) de um profago λ abrigando umgene T7 gnl sob o controle transcripcional do promotor IacUV 5.
Uma estratégia para maximizar a expressão recombinante dopolipeptídeo consiste em expressar o polipeptídeo em uma bactériahospedeira com uma capacidade afetada para clivar proteoliticamente opolipeptídeo recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 119-128). Outra estratégia consiste em alterar a seqüência do ácido nucleico aser inserido em um vetor de expressão de modo que os códons individuaispara cada aminoácido são os preferivelmente utilizados na bactériaselecionada para expressão, tal como C. glutamicum (Wada et al., 1992,Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Esta alteração de seqüências de ácidonucleico da invenção pode ser realizada por técnicas de síntese de DNApadrões.
Outros vetores vantajosos para uso em levedura são pYepSecl(Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kuqan e Herskowitz,(1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), ederivados de pYES (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vetores parauso em fungos filamentosos são descritos in: van den Hondel, C.A.MJJ. &Punt, PJ. (1991) "Gene transfer systems and vector development forfilamentous fungi", in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, etal., eds., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativamente, vetores de expressão de células de insetostambém podem ser também vantajosamente utilizados, por exemplo paraexpressão em células Sf 9. Estes são por exemplo os vetores da série pAc(Smith et al. (1983) Mol Cell Biol 3:2156-2165) e a série pVL (Lucklow e
Summers (1989) Virology 170:31-39).
Além disso, células de planta ou células de algas podem servantajosamente usadas para expressão de genes. Os exemplos de vetores deexpressão de plantas podem ser encontrados em Becker, D., et al. (1992)"New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the Ieftborder", Plant Mol Biol 20: 1195-1197 ou in Bevan, M.W. (1984) "BinaryAgrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
Além disso, as seqüências de ácido nucleico também podemser expressadas células de mamíferos, vantajosamente em células demamíferos não humanos. Os exemplos de vetores correspondentes deexpressão são pCDM8 e pMT2PC referidos em: Seed, B. (1987) Nature329:840 ou Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Ao mesmo tempo,os promotores preferidos para uso são de origem viral, tal como por meio deexemplo promotores de polioma, adenovírus 2, citomegalovírus ou vírus 40simiano. Outros sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos sãoreferidos em capítulos 16 e 17 de Sambrook et al„ Molecular Cloning: ALaboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Em uma forma de realização preferida da presente invenção,as SRPs são expressadas em plantas e células de plantas tal como células deplanta unicelulares (por exemplo algas) (ver Falciatore et al„ 1999, MarineBiotechnology 1(3):239-251 e referências citadas) e células de plantas deplantas superiores (por exemplo, os espermatofitos, tal como plantas decultura). Uma SRP pode ser "introduzida" em uma célula de planta porqualquer meio, incluindo transfecção, transformação ou transdução,electroporação, bombardeio de partículas, agroinfecção, e semelhantes. Ummétodo de transformação bem conhecido do versado na técnica consiste emimergir uma planta em florescência em uma solução de agrobactérias, em queas agrobactérias contêm o ácido nucleico de SRP, seguido por reprodução emgametas transformados.
Outros métodos apropriados para transformar ou transfectarcélulas hospedeiras incluindo células de planta podem ser encontrados emSambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed., ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 1989, e outros manuais de laboratório tal como Methods inMolecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland eDavey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Como a tolerância a estressebiótico e abiótico é traço geral desejado a ser herdado em uma amplavariedade de plantas como milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada,soja, amendoim, algodão, colza e canola, mandioca, pimentão, girassol etagetes, plantas solanáceas como batata, tabaco, berinjela, e tomate, espéciesVicia, ervilha, alfalfa, plantas de arbustos (café, cacau, chá), espécie Salix,árvores (palma oleígena, coco), gramas perenes, e culturas de forragem, estasplantas de cultura são também preferidas plantas alvos para uma engenhariagenética como ainda outra forma de realização da presente invenção. Asculturas de forragem incluem, mas não são limitadas a, grama do trigo,alpiste, bromo, grama de centeio selvagem, capim do campo, capim depomares, alfalfa, Salfoina, trevo pé-de-pássaro, trevo Alsike, trevo vermelho,e trevo doce.
Em uma forma de realização da presente invenção, transfecçãode uma SRP em uma planta é alcançada por transferência de gene mediadapor agrobactérias. A transformação de planta mediada por agrobactérias podeser realizado usando por exemplo a cepa de Agrobacterium tumefaciensGV3101 (pMP90) (Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) ouLBA4404 (Clontech). Transformação pode ser realizada por técnicas detransformação e regeneração padrões (Deblaere et al„ 1994, Nucl. Acids Res.13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. e Schilperoort, Robert A, Plant MolecularBiology Manual, 2a Ed. - Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995. - inSect., Ringbuc Zentrale Signatur: BTll-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick,Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).Por exemplo, colza pode ser transformada via transformação cotilédones ouhipocótiles (Moloney et al., 1989, Cell Plant Report 8:238-242; De Block etal., 1989, Plant Physiol. 91:694-701). Uso de antibióticos para agrobactérias eseleção de plantas depende do vetor binário e da cepa de Agrobacteriumusada for transformação. A seleção de colza é normalmente realizada usandocanamicina como marcador de planta selecionável. A transferência de genesmediada por agrobactérias para linho pode ser realizada usando por exemplo,uma técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Cell Plant Report 13:282-285. Adicionalmente, transformação de soja pode ser realizada usando porexemplo uma técnica descrita em Patente Européia No. 0424 047, patente USno. 5.322.783, Patente Européia No. 0397 687, patente US no. 5.376.543, oupatente US no. 5.169.770. Transformação de milho pode ser alcançada porbombardeio de partículas, absorção de DNA mediada por polietileno glicol ouvia a técnica de fibra de carbeto de silício. (Ver, por exemplo, Freeling eWalbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Um exemplo específico de transformação de milho éencontrado em patente US no. 5.990.387, e um exemplo específico detransformação de trigo pode ser encontrado em Pedido PCT No. WO93/07256.
De acordo com a presente invenção, a SRP introduzida podeser mantida na célula de planta estavelmente se ela for incorporada em umreplicon autônomo não cromossômico ou integrada em um cromossomo deplanta. Alternativamente, a SRP introduzida pode estar presente em um vetornão replicante extra- cromossômico e ser transientemente expressada outransientemente ativa.
Em uma forma de realização, um microorganismorecombinante homólogo pode criado em que a SRP é integrada em umcromossomo, um vetor é preparado que contém pelo menos uma porção deum gene de SRP em que a deleção, adição, ou substituição foi introduzidapara assim alterar, por exemplo, funcionalmente romper, o gene de SRP.
Preferivelmente, o gene de SRP é uma levedura, gene de SRP d E.coli, maspode ser um homólogo de uma planta relacionado ou mesmo de uma fonte demamífero ou inseto. Em uma forma de realização, o vetor é projetado demodo que, quando da recombinação homóloga, o gene endógeno de SRP éfuncionalmente rompido (isto é, não codifica mais um polipeptídeo funcional;também referido como vetor de nocaute). Alternativamente, o vetor pode serprojetado de modo que, quando da recombinação homóloga, o gene endógenode SRP é mudado ou de outra forma alterado mas ainda codifica umpolipeptídeo funcional (por exemplo, a região regulatória a montante pode seralterada para assim alterar a expressão da SRP endógena). Para criar umamutação por pontos via recombinação homóloga, híbridos DNA-RNA podemser usados em um técnica conhecida como "chimeraplasty" (Cole-Strauss etal., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 e Kmiec, 1999 Genetherapy American Scientist. 87(3):240-247). Os procedimentos derecombinação homóloga em Physcomitrella patens são também bemconhecidos na técnica e são contemplados para uso aqui.
Enquanto que no vetor de recombinação homólogo, a porçãoalterada do gene de SRP é flanqueada em suas extremidades 5' e 3' por umamolécula de ácido nucleico adicional do gene de SRP para permitir aocorrência da recombinação homóloga to entre o gene de SRP exógenotransportado pelo vetor e um gene de SRP endógeno, em um microorganismoou planta. A molécula de ácido nucleico de SRP de flanco adicional é decomprimento suficiente para uma recombinação homóloga com sucesso como gene endógeno. Tipicamente, várias centenas de pares de base até kilobasesde DNA de flanco (ambos nas extremidades 5' e 3') são incluídas no vetor.Ver, por exemplo, Thomas, K.R., e Capecchi, M.R., 1987, Cell 51:503 parauma descrição de vetores de recombinação homóloga ou Strepp et al., 1998,PNAS, 95 (8):4368-4373 recombinação com base em cDNA emPhyscomitrella patens). O vetor é introduzido em um microorganismo oucélula de planta (por exemplo, via DNA mediado por polietileno glicol), ecélulas em que o gene introduzido de SRP foi recombinado de modohomólogo com o gene endógeno de SRP são selecionadas usando técnicasbem conhecidas.
Em outra forma de realização, microorganismosrecombinantes podem ser produzidos que contém sistemas selecionados quepermitem a expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, inclusão deum gene de SRP em um vetor colocando o mesmo sob controle do operon Iacpermite a expressão do gene de SRP somente na presença de IPTG. Estessistemas regulatórios são bem conhecidos na técnica.Sempre que presentes em um vetor não replicante extra-cromossômico ou um vetor que é integrado em um cromossomo, opolinucleotídeo de SRP preferivelmente reside em um cassete de expressão deplanta. Um cassete de expressão de planta preferivelmente contém seqüênciasregulatórias capazes de dirigir a expressão do gene em células de planta quesão ligadas operativamente de modo que cada seqüência pode preencher suafunção, por exemplo, terminação de transcrição por sinais de poliadenilação.Preferidos sinais de poliadenilação são os se originando de Agrobacteriumtumefaciens t-DNA tal como o gene 3 conhecido as octopina sintase do Ti-plasmídeo pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) ou equivalentesfuncionais dos mesmos, mas também todos os outros terminadoresfuncionalmente ativos em plantas são apropriados. Como a expressão degenes de plantas é com muita freqüência não limitada aos níveistranscripcionais, um cassete de expressão de plantas preferivelmente contémoutras seqüências ligadas operativamente como melhoradores translacionais,como a seqüência " overdrive" contendo a seqüência de líder 5 'não traduzida,de vírus do mosaico do tabaco, melhorando a relação de polipeptídeo porRNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711). Exemplos devetores de expressão de plantas incluem os detalhados em: Becker, D. et al.,1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal tothe Ieft border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; e Bevan, M.W., 1984, BinaryAgrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; e Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em: Transgenic Plants,Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung e R. Wu, Academic Press,1993, S. 15-38.
"Transformação" é definida aqui como um processo paraintroduzir DNA heterólogo em uma célula de planta, tecido de planta, ouplanta. Ela pode ocorrer sob condições natural ou artificial usando váriosmétodos bem conhecidos na técnica. Transformação pode se basear emqualquer método conhecido para a inserção de seqüências estranhas de ac.donucleico em uma célula hospedeira aprocariótica ou eucariótica. O método eselecionado com base em uma célula hospedeira sendo transformada e podeincluir mas não é limitado a infecção viral, electroporação, l.pofecçao, ebombardeio de partículas. Estas células "transformadas" incluem célulasestavelmente transformadas em que o DNA inserido é capaz de replicação oucomo um plasmídeo autonomamente replicante ou como uma parte docromossomo hospedeiro. Eles também incluem células que expressamtransientemente o DNA ou RNA inserido durante períodos linutados detempo As células de planta, tecido de plantas, ou plantas transformados saoentendidos como englobando não apenas o produto final de um processo de
transformação, mas também a progênie transgênica do mesmo.
Os termos "transformado," "transgênico," e "recombmante
referem-se a um organismo hospedeiro tal como uma bactéria ou uma planteem que a molécula heteróloga de ácido nucleico foi introduzida. A moléculade ácido nucleico pode ser estavelmente integrada dentro do genoma dohospedeiro ou a molécula de ácido nucleico também pode estar presentescomo uma molécula extracromossômica. Esta molécula extracromossômrcapode ser auto-replican.es. As céhüas, tecidos, ou plantas são entendidas comoenglobando não somente o produto final de um processo de transformaçao,mas também a progênie transgênica do mesmo. Um hospede.ro "naotransformado," "não .ransgênico" ou "não recombinante" refere-se aorganismo de tipo selvagem, por exemplo, uma bactéria ou planta, que nao
contém a molécula heteróloga de ácido nucleico.
Uma "planta transgênica", como usado aqui, refere-se a uma
planta que contém uma seqüência de nucleotídeo estranha inserida em ou emseu genoma nuclear ou genoma organelar. Engloba ainda as gerações deproles isto é the TI-, T2- e consecutivamente gerações ou BC1-, BC2- econsecutivamente geração assim como suas reproduções cruzadas complantas não transgênicas ou outras transgênicas.
O organismo hospedeiro (=organismo transgênico)vantajosamente contém pelo menos uma cópia do ácido nucleico de acordocom a invenção e/ou de uma construção de ácido nucleico de acordo com ainvenção.
Em princípio todas as plantas podem ser usadas comoorganismo hospedeiro. As plantas transgênicas preferidas são, por exemplo,selecionadas dentre as famílias Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae,
Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae,Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae,Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae,Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae,Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae,Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae ou Poaceae e preferivelmente de umaplanta selecionada dentre o grupo das famílias Apiaceae, Asteraceae,Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae,
Liliaceae ou Poaceae. Preferidas são as plantas de cultura, tal como plantasvantajosamente selecionadas dentre o grupo do gênero amendoim, colza desemente oleígena, canola, girassol, cártamo, azeitona, sésamo, avelãs,amêndoas, abacate, louro, abóbora/jerimum, linhaça, soja, pistachio,borragem, milho, trigo, centeio, aveias, sorgo, e milhete, triticale, arroz,cevada, mandioca, batata, beterraba, berinjela, alfalfa, e gramas perenes eplantas de forragem, palma oleígena, legumes (brassicas, legumes de raiz,legumes de tubérculos, legumes de vagens, legumes de frutas, legumes decebola, legumes de folhas e legumes de hastes), trigo-mouro, alcachofra de
Jerusalém, feijão largo, ervilhacas, lentinha, feijão anão, tremoços, trevos ealfafa para mencionar apenas alguns dos mesmos.
Em uma forma de realização preferida, a planta hospedeira éselecionada dentre as famílias Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae,Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae,Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae,Solanaceae5 Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae,Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae,Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae,Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae ou Poaeeae e preferivelmente de umaplanta selecionada dentre o grupo das famílias Apiaceae, Asteraceae,Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae,Liliaceae ou Poaceae. Preferidas são as plantas de cultura e em particularplantas mencionadas aqui acima como as plantas hospedeiras como asfamílias e os gêneros mencionados acima, por exemplo são as espéciespreferidas Anacardium occidentale, Calendula officinalis, Carthamustinctorius, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Helianassim annus, Tageteslúcida, Tagetes erecta, Tagetes tenuifolia; Daucus carota; Corylus avellana,Corylus eolurna, Borago officinalis; Brassica napus, Brassiea rapa ssp.,Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassicajuncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassicasinapioides, Melanosinapis communis, Brassica oleracea, Arabidopsisthaliana, Anana comosus, Ananas ananas, Bromelia comosa, Carica papaya,Cannabis sative, Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas,Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliaeea, Ipomoea triloba,Convolvulus panduratus, Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altíssima, Betavulgaris var. vulgaris, Beta marítima, Beta vulgaris var. perennis, Betavulgaris var. conditiva, Beta vulgaris var. esculenta, Cucurbita maxima,Cucurbita mixta, Cucurbita pepo, Cucurbita moschata, Olea europaea,Manihot utilissima, Janipha mandioca, Jatropha mandioca., Manihot aipil,Manihot dulcis, Manihot mandioca, Manihot melanobasis, Manihotesculenta, Ricinus communis, Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile,Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia, Glycine max Dolichossoja, Glycine graeilis, Glyeine hispida, Phaseolus max, Soja hispida, Sojamax, Cocos nueifera, Pelargonium grossularioides, Oleum cocoas, Laurusnobilis, Persea americana, Arachis hypogaea, Linum usitatissimum, Linumhumile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linumcatharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum,Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var.lewisii, Linum pratense, Linum trigynum, Punica granatum, Gossypiumhirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypiumherbaeeum, Gossypium thurberi, Musa nana, Musa aeuminata, Musaparadisíaca, Musa spp., Elaeis guineensis, Papaver orientale, Papaverrhoeas, Papaver dubium, Sesamum indicum, Piper aduncum, Piper amalago,Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betei, Piper cubeba, Piper longum,Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata,Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata, Hordeum vulgare,Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeumdistichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum,Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum, Avena sativa,Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida,Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghumvulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghumaetiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum,Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense,Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghumsubglabrescens, Sorghum verticiUiflorum, Sorghum vulgare, Holcushalepensis, Sorghum miliaceum millet, Panicum militaceum, Zea mays,Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum,Triticum macha, Triticum sativum ou Tritieum vulgare, Cofea spp., Coffeaarabiea, Coffea eanephora, Coffea liberiea, Capsieum annuum, Capsieumannuum var. glabriuseulum, Capsicum fruteseens, Capsicum annuum,Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Lycopersiconesculentum, Lyeopersieon lyeopersieum., Lyeopersieon pyriforme, Solanumintegrifolium, Solanum lyeopersieum Theobroma cacau ou Camellia sinensisou Hordeum vulgare, Helianassim annuus, Linum usitatissimum.Anacardiaceae tal como o gênero Pistacia, Mangifera,Anaeardium por exemplo as espécies Pistacia vera [pistachios, Pistazie],Mangifer indica [Manga] ou Anacardium occidentale [cajú]; Asteraceae talcomo os gêneros Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara,Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana por exemplo as espéciesCalendula officinalis [cravo de defunto], Carthamus tinctorius [cártamo],Centaurea cyanus [centáurea-azul], Cichorium intybus [margarida azul],Cynara scolymus [alcachofra], Helianassim annus [girassol], Lactuca sativa,Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactucascariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativasubsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [alface], Tageteslúcida, Tagetes erecta ou Tagetes tenuifolia [cravo-de-defunto]; Apiaceae talcomo os gêneros Daucus por exemplo as espécies Daucus carota [cenoura];Betulaceae tal como os gêneros Corylus por exemplo as espécies Corylusavellana ou Corylus colurna [avelãs]; Boraginaceae tal como os gênerosBorago por exemplo as espécies Borago officinalis [borragem]; Brassicaceaetal como os gêneros Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis porexemplo as espécies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza desemente oleígena, nabo selvagem], Sinapis arvensis Brassica juncea,Brassica juncea var. juncea, Brassicajuncea var. crispifolia, Brassicajunceavar. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis[mostarda], Brassica oleracea [beterraba de foragem] ou Arabidopsisthaliana; Bromeliaceae tal como os gêneros Anana, Bromelia por exemplo asespécies Anana comosus, Ananas ananas ou Bromelia comosa [abacazi];Caricaceae tal como os gêneros Carica por exemplo as espécies Caricapapaya [papaia]; Cannabaceae tal como os gêneros Cannabis por exemplo asespécies Cannabis sative [cânhamo], Convolvulaceae tal como os gênerosIpomea, Convolvulus por exemplo as espécies Ipomoea batatus, Ipomoeapandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata,Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba ou Convolvulus panduratus [batata doce,Man of Earth, batata silvestre], Chenopodiaceae tal como os gêneros Beta,isto é as espécies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altíssima, Beta vulgarisvar. Vulgaris, Beta marítima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var.conditiva ou Beta vulgaris var. esculenta [beterraba de açúcar]; Cucurbitaceaetal como os gêneros Cucubita por exemplo as espécies Cucurbita maxima,Cucurbita mixta, Cucurbita pepo ou Cucurbita moschata [abóbora, jerimum];Elaeagnaceae tal como os gêneros Elaeagnus por exemplo as espécies Oleaeuropaea [azeitona]; Ericaceae tal como os gêneros Kalmia por exemplo asespécies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmiapolifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros ou Kalmia lúcida[louro americano, louro de folhas largas, arbusto calico, esponja vegetal,angustifolia, louro alpino, louro kalmia, louro kalmia do ocidente, louronarcótico]; Euphorbiaceae tal como os gêneros Manihot, Janipha, Jatropha,Ricinus por exemplo as espécies Manihot utilissima, Janipha mandioca,Jatropha mandioca., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot mandioca,Manihot melanobasis, Manihot esculenta [mandioca, araruta, tapioca,mandioca ] ou Ricinus communis [rícino, arbusto de rícino, planta de rícino,Palma Christi, Wonder Tree]; Fabaceae tal como os gêneros Pisum, Albizia,Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo,Glycina, Dolichos, Phaseolus, Soja por exemplo as espécies Pisum sativum,Pisum arvense, Pisum humile [ervilha], Albizia berteriana, Albizia julibrissin,Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana,Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Ingafragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans,Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin,Aeacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosaspeeiosa, Sericanrda julibrissin, Aeaeia lebbeek, Aeaeia maerophylla, Albizialebbek, Feuilleea lebbeek, Mimosa lebbeek, Mimosa speeiosa [mimosa,árvore da seda, amêndoas da índia], Medieago sativa, Medieago faleata,Medieago varia [alfalfa] Glyeine max Doliehos soja, Glyeine graeilis,Glyeine hispida, Phaseolus max, Soja hispida ou Soja max [soja];Geraniaceae tal como os gêneros Pelargonium, Cocos, Oleum por exemplo asespécies Cocos nueifera, Pelargonium grossularioides ou Oleum eoeois [coco]; Gramineae tal como os gêneros Saccharum por exemplo as espéciesSaeeharum offieinarum; Juglandaceae tal como os gêneros Juglans, Walliapor exemplo as espécies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglanssieboldiana, Juglans einerea, Wallia einerea, Juglans bixbyi, Juglanscaliforniea, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaieensis, Juglans major, Juglans mierocarpa, Juglans nigra ou Wallia nigra [nozes, nozespretas, nozes comuns, nozes persas, nozes brancas, noz de nogueira branca,nozes escuras]; Lauraceae tal como os gêneros Persea, Laurus por exemplo asespécies de louro Laurus nobilis [louro, bay, laurel, louro doce], Perseaamericana Persea americana, Persea gratíssima ou Persea persea [abacate]; Leguminosae tal como os gêneros Arachis por exemplo as espécies Arachishypogaea [amendoim]; Linaceae tal como os gêneros Linum, Adenolinum porexemplo as espécies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum,Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum,Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense ouLinum trigynum [linho, linhaça]; Lythrarieae tal como os gêneros Punica porexemplo as espécies Punica granatum [romã]; Malvaceae tal como os gênerosGossypium por exemplo as espécies Gossypium hirsutum, Gossypiumarboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum ou Gossypiumthurberi [algodão]; Musaceae tal como os gêneros Musa por exemplo asespécies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisíaca, Musa spp.[banana]; Onagraceae tal como os gêneros Camissonia, Oenothera porexemplo as espécies Oenothera biennis ou Camissonia brevipes [prímula,prímula da primavera]; Palmae tal como os gêneros Elacis por exemplo asespécies Elaeis guineensis [palma oleígena]; Papaveraceae tal como osgêneros Papaver por exemplo as espécies Papaver orientale, Papaver rhoeas,Papaver dubium [papoula, papoula oriental, papoula do milho, papoula doscampos, papoulas shirley, papoula do campo, papoula longa, papoula devagem longa]; Pedaliaceae tal como os gêneros Sesamum por exemplo asespécies Sesamum indicum [sésamo]; Piperaceae tal como os gêneros Piper,Artanthe, Peperomia, Steffensia por exemplo as espécies Piper aduncum,Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betei, Pipercubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca,Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensiaelongata. [pimentão Cayenne, pimentão silvestre]; Poaceae tal como osgêneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum,Oryza, Zea, Triticum por exemplo as espécies Hordeum vulgare, Hordeumjubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichonHordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeumirregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cevada, cevada pérola,cevada de rabo-de-raposa, cevada de parede, cevada dos prados], Secalecereale [centeio], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avenafatuavar. sativa, Avena hybrida [aveia], Sorghum bicolor, Sorghum halepense,Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcusbicolor, Holcus sorghum, Sorghum aetiopicum, Sorghum arundinaceum,Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghumdrummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum,Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens,Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghummiliaceum milhete, Panicum militaceum [Sorghum, millet], Oryza sativa,Oryza latifolia [arroz], Zea mays [milho, maize] Triticum aestivum, Tritieumdurum, Tritieum turgidum, Tritieum hybernum, Tritieum maeha, Tritieumsativum ou Tritieum vulgare [trigo, trigo de pão, trigo comum], Proteaceae talcomo os gêneros Macadamia por exemplo as espécies Maeadamiaintergrifolia [macadamia]; Rubiaceae tal como os gêneros Coffea porexemplo as espécies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea eanephora ou Coffealiberiea [café]; Scrophulariaceae tal como os gêneros Verbascum porexemplo as espécies Verbaseum blattaria, Verbaseum ehaixii, Verbaseumdensiflorum, Verbaseum lagurus, Verbaseum longifolium, Verbaseumlychnitis, Verbaseum nigrum, Verbaseum olympieum, Verbaseum phlomoides,Verbaseum phoenieum, Verbaseum pulverulentum ou Verbaseum thapsus[verbasco, verbasco de traça branca, verbasco de urtiga, verbasco de floresdensas, verbasco prata, verbasco de folhas longas, verbasco branco, verbascoescuro, verbasco verde, verbasco laranja, verbasco púrpura, verbasco grisalho,verbasco grande]; Solanaceae tal como os gêneros Capsicum, Nicotiana,Solanum, Lycopersicon por exemplo as espécies Capsicum annuum,Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pimentão],Capsicum annuum [paprica], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotianaattenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia,Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rústica, Nicotianasylvestris [tabaco], Solanum tuberosum [batata], Solanum melongena[berinjela] (Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum.,Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum[tomate]; Sterculiaceae tal como os gêneros Theobroma por exemplo asespécies Theobroma cacau [cacau]; Theaceae tal como os gêneros Camelliapor exemplo as espécies Camellia sinensis) [chá] ou Hordeum vulgare,Helianassim annuus, Linum usitatissimum.A introdução dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção,o cassete de expressão ou o vetor em organismos, plantas por exemplo, podeem princípio ser feita por todos os métodos conhecidos dos versados natécnica. A introdução da seqüências de ácido nucleico dá surgimento aorganismos recombinantes ou transgênicos.
No caso de microorganismos, os versados na técnica podemencontrar métodos apropriados nos livros de texto por Sambrook, J. et ai.(1989) Molecular cloning: Alaboratory manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, por F.M. Ausubel et ai. (1994) Current protocols inmolecular biology, John Wiley e Sons, por D.M. Glover et al., DNA CloningVol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), por Kaiser et al. (1994)Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press ou Guthrieet al. Guide to Yeast Genetics e Molecular Biology, Methods in Enzymology,1994, Academic Press.
A transferência de genes estranhos dentro do genoma de umaplanta é chamada transformação. Ao fazer isto, os métodos descritos para atransformação e regeneração de plantas a partir dos tecidos de plantas oucélulas de planta são usados para a transformação transiente ou estável.
Apropriados métodos são transformação de protoplastos por absorção deDNA induzida por poli(etileno glicol), método "biolístico" usando o genecannon - referido como o método de bombardeio de partículas, eletroporação,a incubação de embriões secos em solução de DNA, microinjeção etransferência de genes mediada por agrobactérias. Os referidos métodos sãodescritos por meio de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for GeneTransfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D.Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev.Plant PhysioL Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos ouuma construção a ser expressada são preferivelmente clonados em um vetorque é apropriado para a transformação de Agrobacterium tumefaciens, porexemplo pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).Agrobactérias transformadas por tal vetor podem ser então usadas em ummodo conhecido para a transformação de plantas, em particular de plantas decultura tal como por meio de exemplo plantas de tabaco, por exemplo porbanho das folhas pisadas ou folhas esmagadas em uma solução agrobacterianae então cultivo das mesmas em meios apropriados. A transformação deplantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, porHõfgen e Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida interalia de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; emTransgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung eR. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
Agrobactérias transformadas por um vetor de expressão deacordo com a invenção podem do mesmo modo ser usadas em um modoconhecido para a transformação de plantas tal como plantas de teste comoArabidopsis ou plantas de cultura, tal como culturas de cereais, milho, aveias,centeio, cevada, trigo, soja, arroz, algodão, beterraba de açúcar, canola,girassol, linho, cânhamo, batatas, tabaco, tomates, cenouras, páprica, colza desemente oleígena, tapioca, mandioca, araruta, tagetes, alfalfa, alface e asvárias espécies de árvores, nozes e chás em particular de plantas de culturacontendo óleo, tal como soja, amendoim, planta de rícino, girassol, milho,algodão, linho, colza de semente oleígena, coco, palma oleígena, cártamo(Carthamus tinctorius) ou bago de cacau, por exemplo por banho das folhaspisadas ou folhas esmagadas em uma solução agrobacteriana e então cultivodas mesmas em meios apropriados.
As células de planta geneticamente modificadas podem serregeneradas por todos os métodos conhecidos dos versados na técnica. Osmétodos apropriados podem ser encontrados nas publicações referidas acimapor S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hõfgen e Willmitzer.
Assim, um outro aspecto da invenção refere-se a organismostransgênicos transformados por pelo menos uma seqüência de ácido nucleico,cassete de expressão ou vetor de acordo com a invenção assim como células,culturas de células, tecido, partes - tal como, por exemplo, folhas, raízes, etc.no caso de organismos de plantas - ou material reprodutivo derivado de taisorganismos. Os termos "organismo hospedeiro", "célula hospedeira","organismo recombinante (hospedeiro) " e "célula transgênica (hospedeira) "são usados aqui de modo interpermutável. Como evidente estes termos não sereferem apenas ao organismo hospedeiro particular ou a célula alvo particularmas também aos descendentes ou descendentes em potencial destesorganismos ou células. Assim, devido à mutação ou efeitos ambientais,algumas modificações podem surgir em gerações sucessivas, estesdescendentes não precisam necessariamente ser idênticos com a célulaparental mas mesmo assim ainda são englobados pelo termo, como usadoaqui.
Para os fins da invenção "transgênico" ou "recombinante"significa com relação por exemplo a uma seqüência de ácido nucleico, umcassete de expressão (= construção de gene, construção de ácido nucleico) ouum vetor contendo a seqüência de ácido nucleico de acordo com a invençãoou um organismo transformado pelas seqüências de ácido nucleico, cassete deexpressão ou vetor de acordo com a invenção sendo todas estas construçõesproduzidas por métodos de engenharia genética em que ou
a) a seqüência de ácido nucleico, como mostrado na tabela I,colunas 4 e 5, ou seus derivados ou partes dos mesmos ou
b) uma seqüência de controle genético funcionalmente ligada auma seqüência de ácido nucleico descrita sob (a), por exemplo uma seqüênciade controle genético a 3'- e/ou 5'- tal como um promotor ou terminador, ou(a) e (b)
não são encontradas em seu meio genético natural ou forammodificadas por métodos de engenharia genética, em que a modificação podea título de exemplo ser uma substituição, adição, deleção, inversão ouinserção de um ou mais resíduos de nucleotídeos. O ambiente genético naturalsignifica o locus cromossômico no organismo de origem ou dentro doorganismo hospedeiro ou presente em uma biblioteca genômica. No caso deuma biblioteca genômica, o meio genético natural da seqüência de ácidonucleico é preferivelmente retido pelo menos em parte. O meio bordeja umaseqüência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimentode seqüência de pelo menos 50 bp, preferivelmente pelo menos 500 bp,particularmente preferivelmente pelo menos 1,000 bp, o mais particularmentepreferivelmente pelo menos 5,000 bp. Um cassete de expressão de ocorrêncianatural - por exemplo a combinação de oco natural do promotor natural daseqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção com o correspondentegene Δ-8-desaturase, Δ-9-elongase e/ou Δ-5-desaturase- se transforma em umcassete de expressão transgênico quando o último é modificado por métodosnão naturais, sintéticos ("artificiais" tal como por meio de exemplo umamutagenese. Os métodos apropriados são descritos por meio de exemplo emUS 5.565.350 ou WO 00/15815.
Os organismos ou organismos hospedeiros apropriados para oácido nucleico, cassete de expressão ou vetor de acordo com a invenção sãovantajosamente em princípio todos os organismos, que são apropriados para aexpressão de genes recombinantes como descrito acima. Outros exemplos quepodem ser mencionados são plantas tal como Arabidopsis, Asteraceae talcomo Calendula ou plantas de cultura tal como soja, amendoim, planta derícino, girassol, linho, milho, algodão, linho, colza de semente oleígena, coco,palma oleígena, cártamo (Carthamus tinctorius) ou bago de cacau.
Um outro objeto da invenção refere-se ao uso de umaconstrução de ácido nucleico, por exemplo um cassete de expressão, contendoseqüências de DNA codificando, como mostrado na tabela II, colunas 4 e 5,ou seqüências de DNA hibridizando com as mesmas para a transformação decélulas de planta, tecidos ou partes de plantas.
Assim, dependendo da escolha de promotor, as seqüências,como mostrado na tabela II, colunas 4 e 5, podem ser expressadasespecificamente nas folhas, nas sementes, nos nódulos, nas raízes, no caule ououtras partes da planta. As plantas transgênicas superproduzindo seqüência,como mostrado na tabela II, colunas 4 e 5, material reprodutivo das mesmas,junto com as células de planta, tecidos ou partes dos mesmos são outro objetoda presente invenção.
O cassete de expressão ou as seqüências de ácido nucleico ouconstrução de acordo com a invenção contendo seqüências, como mostradona tabela I, colunas 4 e 5, pode, além disso, também ser empregado para atransformação dos organismos identificados por meio de exemplo acima, talcomo bactérias, leveduras, fungos filamentosos e plantas.
Dentro da estrutura da presente invenção, tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental significa, por exemplo, o traçoartificialmente adquirido do desempenho biossintético aumentado devido àsuper-expressão funcional de seqüências, como mostrado na tabela II, colunas4 e 5, codificada por seqüências, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5,e/ou homólogos nos organismos de acordo com a invenção, vantajosamentenas plantas transgênicas de acordo com a invenção, por comparação com asplantas iniciais não geneticamente modificadas, pelo menos pela duração depelo menos uma geração de plantas.
A expressão constitutiva das seqüências exógenas, comomostrado na tabela II, colunas 4 e 5, codificada por seqüências, comomostrado na tabela I, colunas 4 e 5, e/ou homólogos é, além disso, vantajosa.Por outro lado, no entanto, uma expressão indutível também pode parecerdesejável.
A eficiência de uma expressão das seqüências, como mostradona tabela II, colunas 4 e 5, codificada por seqüências, como mostrado natabela I, colunas 4 e 5, e/ou homólogos pode ser determinada, por exemplo, invitro por propagação de meristema do broto. Além disso, uma expressão dasseqüências, como mostrado na tabela II, colunas 4 e 5, codificada porseqüências, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, e/ou homólogosmodificados em natureza e nível e seu efeito sobre o desempenho das viasmetabólicas pode ser testado em plantas de teste em experiências na estufa.
Um objeto adicional da invenção compreende organismostransgênicos tal como plantas transgênicas transformadas por cassete deexpressão contendo seqüências, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, deacordo com a invenção ou seqüências de DNA hibridizando com as mesmas,assim como células transgênicas, tecidos, partes e material de reproduçãodestas plantas. Particular preferência é dada neste caso a plantas transgênicasde cultura, tal como por meio de exemplo cevada, trigo, centeio, aveias,milho, soja, arroz, algodão, beterraba de açúcar, colza de semente oleígena ecanola, girassol, linho, cânhamo, cardo, batatas, tabaco, tomates, tapioca,mandioca, araruta, alfalfa, alface e as várias espécies de árvores, nozes e
vinhedos.
Para os fins da invenção as plantas são plantas mono- e
dicotiledôneas, musgos e algas.
Um outro aperfeiçoamento de acordo com a invenção são as
plantas transgênicas como descritas acima que contém uma seqüência de
ácido nucleico ou construção de acordo com a invenção ou o cassete de
expressão de acordo com a invenção.
Além disso, por derivados significam-se os homólogos das
seqüências, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, por exemplo
homólogos eucarióticos, seqüências trancadas, DNA de filamento único da
seqüência de DNA de codificação e não de codificação ou RNA da seqüência
de DNA de codificação e não de codificação.
Além disso, por homólogos das seqüências como mostrado natabela I, colunas 4 e 5, significam-se derivados tal como por meio de exemplovariantes de promotor. Estas variantes podem ser modificadas por uma oumais trocas de nucleotídeo, por inserção (ões) e/ou deleção(s) sem, noentanto, afetar adversamente a funcionalidade ou eficiência dos promotores.Além disso, os promotores podem ter sua eficiência aumentada por alteraçãode sua seqüência ou ser completamente substituídos por promotores maisefetivos mesmo de organismos estranhos.
Por derivados significam-se também vantajosamente asvariantes cuja seqüência de nucleotídeo foi alterada na região de -1 a -2000acima do códon de partida em tal modo que a expressão do gene e/ou aexpressão da proteína é modificada, preferivelmente aumentada. Além disso,por derivados significam-se também variantes que foram modificadas naextremidade 3'.
Os promotores apropriados em um cassete de expressão sãoem princípio todos os promotores que pode controlar a expressão de genesestranhos em organismos tal como microorganismos de tipo protozoános, talcomo ciliatos, algas tal como algas verdes, marrom, vermelha ou azul, talcomo Euglenia, bactérias tal como bactérias gram-positiva ou gram-negativa,leveduras tal como Saccharomyces, Pichia ou Schizosaccharomyces oufungos tal como Mortierella, Thraustochytrium ou Schizochytrium ou plantas,vantajosamente em plantas ou fungos. O uso é preferivelmente feito emparticular de promotores de plantas ou promotores derivados de um vírus deplanta. Vantajosas seqüências de regulação para o método de acordo com ainvenção são encontradas por exemplo em promotores tal como cos, tac, trp,tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR ou empromotores λ-PL que são empregados vantajosamente em bactérias gram-negativas. Outras seqüências de regulação vantajosas são encontradas, porexemplo, em promotores gram-positivos amy e SP02, em promotores delevedura ou fungicos ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28,ADH ou em a promotores de planta CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980)285-294], SSU, OCS5 lib4, STLS1, B33, nos (=Promotor de NopalinaSintase) ou em promotor de ubiquitina ou faseolina. O cassete de expressãotambém pode conter um promotor quimicamente indutível por meio do qual aexpressão das seqüências exógenas, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5,nos organismos pode ser controlada vantajosamente nas plantas em um tempoparticular. Os promotores de plantas vantajosos deste tipo são por meio deexemplo o promotor PRPl [Ward et al., Plant. Mol. Biol.22(1993), 361-366],um promotor indutível por benzenossulfonamida (EP 388 186), um promotorindutível por tetraciclina [Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404], um promotorindutível por ácido salicílico (WO 95/19443), um promotor indutível porácido abscísico (EP 335 528) e um promotor indutível por etanol ouciclohexanona (W093/21334). Outros exemplos de promotores de plantasque podem ser vantajosamente usados são o promotor de FBPase citosólicode batata, o promotor ST-LSI de batata (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989)2445-245), o promotor of fosforibosil pirofosfato amidotransferase deGlycine max (ver também número de acesso do GeneBank U87999) ou umpromotor específico nodieno como descrito em EP 249 676. Particularmentevantajosos são os promotores de plantas que asseguram expressão em tecidosou partes de plantas/órgãos em que a biossíntese de ácido graxo ou os seusestágios de precursor ocorrem, como em endosperma ou no embrião emdesenvolvimento por exemplo. Particularmente notáveis são os promotoresvantajosos que asseguram expressão específica de tecido, tal como por meiode exemplo o promotor USP ou derivados do mesmo, o promotor LEB4, opromotor faseolina ou o promotor napina. O promotor USP particularmentevantajoso, citado de acordo com a invenção, ou seus derivados mediam aexpressão de genes muito prematura em desenvolvimento de semente[Baeumleem et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67]. Outrospromotores vantajosos específicos de sementes, que podem ser usados paraplantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas são os promotores apropriadospara dicotilódones como promotores do gene napina, do mesmo modo citadopor meio de exemplo, de colza de semente oleígena (US 5.608.152), opromotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor faseolinade Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), o promotor Bce4 de Brassica(WO 91/13980) ou o promotor B4 leguminoso (LeB4, Baeumleem et al.,Plant J., 2, 2, 1992: 233 - 239) ou promotores apropriados paramonocotiledôneas tal como os promotores de lpt2 ou Iptl gene em cevada(WO 95/15389 e WO 95/23230) ou os promotores hordeina de cevada, o geneglutelina de arroz, o gene orizina de arroz, o gene prolamina arroz, o genegliadina de trigo, o gene de glutelina branca, o gene zeina de milho, o geneglutelina de aveias, o gene kasirem de sorgo ou o gene secalina de centeio quesão descritos em W099/16890.
Além disso, particularmente preferidos são os promotores, queasseguram a expressão em tecidos, ou partes de plantas em que, por exemplo,a biossíntese de ácidos graxos, óleos e lipídeos, ou os estágios do precursorocorrem. São particularmente notáveis os promotores, que asseguram umaexpressão específica de semente. È notável o promotor do gene napina decolza de semente oleígena (US 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba(USP = proteína de semente não conhecida, Baeumleem et al., Mol GenGenet, 1991, 225 (3): 459-67), o promotor do gene oleosina de Arabidopsis(W098/45461), o promotor faseolina (US 5.504.200) ou o promotor do genelegumina B4 (LeB4; Baeumleem et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9).
Outros promotores a serem mencionados são os dos genes lpt2 ou Iptl decevada (W095/15389 e W095/23230) que mediam a expressão específica desementes em plantas monocotiledôneas. Outros promotores vantajososespecíficos de semente são promotores tal como os promotores de arroz,milho ou trigo descritos em WO 99/16890 ou Amy32b, Amy6-6 ou aleuraina(US 5,677,474), Bce4 (colza, US 5,530,149), glicinina (feijão de soja,EP 571 741), fosfoenol piruvato carboxilase (feijão de soja, JP 06/62870),ADRl2-2 (feijão de soja, WO 98/08962), isocitratliase (colza, US 5,689,040)ou β-amilase (cevada, EP 781 849).
Como descrito acima, a construção de expressão (= construçãode gene, construção de ácido nucleico) pode conter ainda outros genes, quedevem ser introduzidos nos organismos. Estes genes podem ser submetidospara separar a regulação ser submetidos à mesma região de regulação como asseqüências como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5. Estes genes são pormeio de exemplo outros genes de biossíntese, vantajosamente para biossíntesede ácido graxo, biossíntese de vitamina etc. que permitem uma sínteseaumentada.
Em princípio todos os promotores naturais com suasseqüências de regulação podem ser usados como os nomeados acima para ocassete de expressão de acordo com a invenção e o método de acordo com ainvenção. Sobre e acima disto, os promotores sintéticos também podem serusados vantajosamente.
Na preparação de um cassete de expressão, vários fragmentosde DNA podem ser manipulados a fim de obter uma seqüência denucleotídeo, que geralmente é lida na direção correta, e é equipada com umrastreador de leitura correta. Para conectar os fragmentos de DNA (= ácidosnucleicos de acordo com a invenção) um ao outro, adaptadores ou ligadorespodem ser fixados aos fragmentos.
O promotor e as regiões do terminador podem ser providos demodo utilizável na direção de transcrição com a ligador ou poliligador contendo um ou pontos de restrição para a inserção desta seqüência.Geralmente, o ligador tem 1 a 10, principalmente 1 a 8, preferivelmente 2 a 6,pontos de restrição. Em geral o tamanho do ligador dentro da regiãoregulatória é menor do que 100 bp, com freqüência menor do que 60 bp, maspelo menos 5 bp. O promotor pode ser tanto nativo como homólogo, assimcomo estranho ou heterólogo para o organismo hospedeiro, por exemplo paraa planta hospedeira. Na direção de transcrição 5'-3' o cassete de expressãocontém o promotor, um gene da seqüência de DNA, como mostrado na tabelaI, colunas 4 e 5, e uma região para a terminação de transcrição. Diferentesregiões de terminação podem ser trocados uma pela outra em qualquer mododesejado.
Além disso, manipulações que provêem interfaces apropriadasde restrição ou que removem interfaces de restrição ou DNA em excessopodem ser empregadas. Onde as inserções, deleções ou substituições, talcomo transições e transversões, entram em consideração, mutagenese in vitro,reparo de iniciadores, restrição ou ligação podem ser usados. Emmanipulações apropriadas, tal como restrição, retro-mastigação ouenchimento de ganchos para extremidades cegadas, as extremidadescomplementares dos fragmentos podem ser providas para a ligação.
Para uma expressão elevada vantajosa, a fixação do sinal deretenção de ER específico, SEKDEL inter alia pode ser importante (Schouten,A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792). Deste modo, o nível deexpressão médio é triplicado ou mesmo quadruplicado. Outros sinais deretenção que ocorrem naturalmente em proteínas de planta e animallocalizados no ER também podem ser empregados para uma construção docassete. Em uma outra forma de realização preferida, uma seqüência demarcação plastidial é usada como descrito por Napier J.A. [Targeting offoreign proteins to the chloroplast, Methods Mol. Biol., 49, 1995: 369 - 376],Um vetor usado preferido compreendendo referida seqüência de marcaçãoplastidial é descrito por Colin Lazarus [Guerineau F., Woolston S., Brooks L.,Mullineaux P. "An cassete of expression for targeting foreign proteins inchloroplast; Nucleic. Acids Res., Dec 9, 16 (23), 1988: 11380].
Os sinais de poliadenilação preferidos são sinais depoliadenilação de plantas, preferivelmente os que substancialmentecorrespondem aos sinais de poliadenilação T-DNA de Agrobacteriumtumefaciens, em particular gene 3 do T-DNA (octopina sintase) do plasmídeoTi pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J.3 (1984), 835 et seq.) ou equivalentesfuncionais correspondentes.
Um cassete de expressão é produzido por fusão de umpromotor apropriado com seqüências apropriadas, como mostrado na tabela I,colunas 4 e 5 junto com um sinal de poliadenilação por técnicas comuns derecombinação e clonagem, como descrito, por exemplo, em T. Maniatis,E.F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold10 Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) assim como emTJ. Silhavy, M.L. Berman e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e emAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Assoc. e Wiley-Interscience (1987).
Na preparação de um cassete de expressão, vários fragmentosde DNA podem ser manipulados para produzir uma seqüência de nucleotídeoque é lida de modo útil na direção corrente e é equipada com um rastreador deleitura correta. Os adaptadores ou ligadores podem ser fixados aos fragmentospara unir os fragmentos de DNA.
O promotor e as regiões de terminador podem ser providas demodo útil na direção de transcrição com um ligador ou poliligador contendoum ou mais pontos de restrição para a inserção desta seqüência. Geralmente, oligador tem 1 a 10, principalmente 1 a 8, preferivelmente 2 a 6, pontos derestrição. Em geral o tamanho do ligador dentro da região regulatória é menordo que 100 bp, com freqüência menor do que 60 bp, mas pelo menos 5 bp. Opromotor pode ser tanto nativo ou homólogo, assim como estranho ouheterólogo para o organismo hospedeiro, por exemplo para a plantahospedeira. Na direção de transcrição 5'-3', o cassete de expressão contém opromotor, a seqüência de DNA que ou codifica o gene como mostrado natabela I, colunas 4 e 5, e uma região para a terminação da transcrição.Diferentes regiões de terminação podem ser trocadas uma pela outra emqualquer modo desejado.
Na preparação de um cassete de expressão vários fragmentosde DNA podem ser manipulados para produzir uma seqüência de nucleotídeoque geralmente é lida na direção correta e é equipada com um rastreador deleitura correta. Os adaptadores ou ligadores podem ser fixados aos fragmentospara unir os fragmentos de DNA.
As seqüências de DNA codificando as seqüências de ácidonucleico usadas no processo inventivo tal como as seqüências como mostradona tabela I5 colunas 4 e 5, contém todas as características de seqüêncianecessárias para obter uma localização correta da biossíntese respectiva.Assim, não são necessárias per se outras seqüências de marcação. No entanto,esta localização pode ser desejável e vantajosa e assim as artificialmentemodificadas ou reforçadas como construções de fusão são também uma formade realização preferida vantajosa da invenção.
São particularmente preferidas as seqüências que assegurammarcação em plastídeos. Sob alguns circunstancias, a marcação em outroscompartimentos (registrado em: Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996),285-423) também pode ser desejável, por exemplo em vacúolos, nomitocôndrio, o retículo endoplásmico (ER), peroxisomas, estruturas delipídeos ou devido a falta de correspondentes seqüências operativas, aretenção no compartimento de origem, o citosol.
Como usado aqui, o termo "estresse ambiental" refere-se aqualquer condição sub-ótima de cultivo e inclui, mas não é limitada acondições sub-ótimas associadas com salinidade, seca, temperatura, metal,produto químico, patogênicos, e estresses oxidativos, ou suas combinações.Em formas de realização preferidas, o estresse ambiental pode ser salinidade,seca, calor ou temperatura baixa, ou suas combinações, e em particular, podeser baixo teor de água, ou baixa temperatura. Sempre que o estresse de secasignifica qualquer estresse ambiental que leva a uma falta de água em plantasou redução do suprimento de água para as plantas, em que o estresse de baixatemperatura significa congelamento de plantas abaixo de + 4 0C, assim comoo resfriamento das plantas abaixo de 15 0C, e em que estresse de altatemperatura significa por exemplo uma temperatura acima de 35 0C. A faixade estresse ou resposta a estresse depende de plantas diferentes que são usadaspara a invenção, isto é, difere por exemplo entre uma planta como trigo e umaplanta como Arabidopsis. Uma resposta comum de plantas a estresseambiental é a perda de rendimento ou a perda de qualidade. Deve-se entendertambém que como usado no relatório e nas reivindicações "um" ou "uma"podem significar um ou mais, dependendo do contexto em que é usado.
Assim, por exemplo, referência a "uma célula" pode significar que pelomenos uma célula pode ser utilizada.
Como também usado aqui, o termo "ácido nucleico" emolécula de ácido nucleico" se destinam a incluir moléculas de DNA (porexemplo cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplomRNA) e análogos de DNA ou RNA gerados usando análogos denucleotídeos. Estes termos também englobam seqüência não traduzidalocalizada em ambas as extremidades 3' e 5' da região de codificação dogene: pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos de seqüência a montante daextremidade 5' da região de codificação e pelo menos cerca de 200nucleotídeos de seqüência a jusante da extremidade 3' da região decodificação do gene. A molécula de ácido nucleico pode ser de filamentoúnico ou filamento duplo, mas preferivelmente é DNA de filamento duplo.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma que ésubstancialmente separada de outras moléculas de ácido nucleico, que estãopresentes na fonte natural do ácido nucleico. Isto significa que outrasmoléculas de ácido nucleico estão presentes em uma quantidade menor doque 5 % com base no peso da quantidade do ácido nucleico desejado,preferivelmente menos que 2 % em peso, mais preferivelmente menos que 1% em peso, mais preferivelmente menos que 0,5 % em peso. Preferivelmente,um ácido nucleico "isolado" é livre de algumas das seqüências, quenaturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é seqüências localizadas nasextremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo doqual o ácido nucleico é derivado. Por exemplo, em várias formas derealização, a molécula de ácido nucleico codificando a proteína relacionadacom estresse isolada contém menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1kb, 0,5 kb, ou 0, 1 kb de seqüências de nucleotídeos que naturalmenteflanqueiam a molécula de ácido nucleico em DNA genômico da célula emque o ácido nucleico é derivado. Além disso, uma molécula de ácido nucleico"isolada", como molécula de cDNA, pode ser livre de algum outro materialcelular com que é naturalmente associada, ou meio de cultura quandoproduzida por técnicas recombinantes, ou precursores químicos ou outrosprodutos químicos quando quimicamente sintetizada.
A molécula de ácido nucleico da presente invenção, porexemplo, a molécula de ácido nucleico codificando uma SRP ou uma porçãoda mesma que confere tolerância e/ou resistência a estresse ambiental emplantas, pode ser isolada usando técnicas de biologia molecular padrões e ainformação de seqüência aqui fornecida. Por exemplo, um cDNA codificandoa proteína relacionada com estresse de Arabidopsis thaliana pode ser isoladode uma biblioteca cDNA de A. thaliana ou um cDNA codificando proteínarelacionada com estresse de Brassica napus, Glycine max, Zea mays ou Oryzasativa pode ser isolado de uma biblioteca de c-DNA de Brassiea napus,Glyeine max, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeumvulgare, Helianassim annuus, Linum usitatissimum, respectivamente, usandotoda ou uma porção de uma das seqüências como mostrado na tabela I,colunas 4 e 5, e respectivamente. Além disso, a molécula de ácido nucleicoenglobando toda ou uma porção de uma das seqüências, como mostrado natabela I, colunas 4 e 5, pode ser isolada pela reação de cadeia polimeraseusando iniciadores de oligonucleotídeo projetados com base nesta seqüência.Por exemplo, mRNA pode ser isolado de células de planta (por exemplo, porprocedimento de extração de tiocianato de guanidínio de Chirgwin et al.,1979, Biochemistry 18:5294-5299), e cDNA pode ser preparado usandotranscriptase reversa (por exemplo, Moloney MLV reverse transcriptase,disponível de Gibco/BRL, Bethesda, MD; ou transcriptase AMV reversa,disponível de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Os iniciadores deoligonucleotídeos sintéticos para amplificação de reação de cadeia polimerasepodem ser projetados com base em uma das seqüências de nucleotídeosmostradas em tabela I, colunas 4 e 5. A molécula de ácido nucleico dainvenção pode ser amplificada usando cDNA ou, alternativamente, DNAgenômico, como um gabarito e iniciadores de oligonucleotídeos padrões deacordo com técnicas de amplificação de PCR padrões. A molécula de ácidonucleico assim amplificada pode ser clonada em um vetor apropriado ecaracterizada por análise da seqüência de DNA. Além disso,oligonucleotídeos correspondendo a uma seqüência de nucleotídeocodificando SRP podem ser preparados por técnicas sintéticas padrões, porexemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado.
Em uma forma de realização preferida, uma molécula de ácidonucleico isolada da invenção compreende uma das seqüências de nucleotídeomostradas em seqüências como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5codificando o SRP (isto é, as "a região de codificação"), assim comoseqüências 5' não traduzidas e seqüências 3' não traduzidas.
Além disso, a molécula de ácido nucleico da invenção podecompreender somente uma porção da região de codificação de uma dasseqüências do ácido nucleico como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, porexemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ouum fragmento codificando uma porção biologicamente ativa de uma SRP.
As porções de proteínas codificadas pelas moléculas de ácidonucleico codificando SRP da invenção são preferivelmente porçõesbiologicamente ativas descritas aqui. Como usado aqui, o termo "porçãobiologicamente ativa de" uma SRP destina a incluir uma porção, por exemplo,um domínio/motivo, de uma proteína relacionada com estresse que participaem resposta de tolerância ao estresse e/ou resistência em uma planta. Paradeterminar se uma SRP, ou uma porção biologicamente ativa da mesma,resulta em tolerância aumentada a estresse em uma planta, uma análise doestresse de uma planta compreendendo a SRP pode ser realizada. Estesprocessos de análise são bem conhecidos na técnica, como detalhado nosexemplos. Mais especificamente, os fragmentos de ácido nucleico codificandoporções biologicamente ativas de uma SRP podem ser preparadas porisolamento de uma porção de uma das seqüências do ácido nucleico comomostrado na tabela I, coluna 4 e 5, expressando a porção codificada da SRPou peptídeo (por exemplo, por expressão recombinante in vitro) e avaliando aatividade da porção codificada da SRP ou peptídeo.
As porções biologicamente ativas de uma SRP são englobadaspela presente invenção e incluem peptídeos compreendendo seqüências deaminoácidos derivados da seqüência de aminoácido de um gene codificandoSRP, ou a seqüência de aminoácido de uma proteína homóloga a SRP, queincluem menos aminoácidos do que uma SRP de comprimento completo ou aproteína de comprimento completo que é homóloga a uma SRP e demonstra,pelo menos, alguma atividade enzimática de uma SRP. Tipicamente, porçõesbiologicamente ativas (por exemplo, peptídeos que são, por exemplo, 5, 10,15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, ou mais aminoácidos emcomprimento) compreendem um domínio ou motivo com pelo menos umaatividade de uma SRP. Além disso, outras porções biologicamente ativas, emque outras regiões da proteína são deletadas, podem ser preparadas portécnicas recombinantes e avaliadas por uma ou mais das atividades aquidescritas. Preferivelmente, uma porção biologicamente ativa de uma SRPinclui um ou mais domínios/motivos selecionados, ou suas porções, tendoatividade biológica.
O termo "porção biológica ativa " ou " atividade biológica"significa uma SRP ou uma porção de uma SRP que ainda tem pelo menos 10% ou 20 %, preferivelmente 20 %, 30 %, 40 % ou 50 %, especialmentepreferivelmente 60 %, 70 % ou 80 % da atividade enzimática da enzimanatural ou de partida.
A molécula de ácido nucleico englobando uma seqüênciacompleta das moléculas de ácido nucleico usadas no processo, por exemplo opolinucleotídeo da invenção, ou uma parte do mesmo pode ser adicionalmenteisolada por reação de cadeia polimerase, iniciadores de oligonucleotídeos combase nesta seqüência ou em partes das mesmas sendo usados. Por exemplo, amolécula de ácido nucleico compreendendo a seqüência completa ou parte damesma pode ser isolada por reação de cadeia polimerase usando iniciadoresde oligonucleotídeo que foram gerados com base nesta seqüência. Porexemplo, mRNA pode ser isolado de células (por exemplo por meio dométodo de extração de tiocianato de guanidínio de Chirgwin et al., 1979,Biochemistry 18:5294-5299), e cDNA pode ser gerado usando transcriptasereversa (por exemplo, Moloney MLV reverse transcriptase, disponível deGibco/BRL, Bethesda, MD; ou transcriptase AMV reversa, disponível deSeikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL).
Os iniciadores de oligonucleotídeo para a amplificação, porexemplo como mostrado na tabela 2, por meio de reação de cadeia polimerasepodem ser gerados com base em uma seqüência mostrada aqui, por exemplo aseqüência como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5 ou as seqüênciasderivadas de polipeptídeos como mostrado na tabela II, colunas 4 e 5.
Além disso, é possível identificar regiões conservadas dosvários organismos realizando os alinhamentos de seqüência de proteína comos polipeptídeos usados no processo da invenção, em particular comseqüências do polipeptídeo da invenção, a partir das regiões conservadas, epor sua vez, iniciadores degenerados podem ser derivados. A regiãoconservada do polipeptídeo da invenção é indicada no alinhamento mostradona figura ALIGNEMENT. As regiões conservadas são as que mostram umavariação muito pequena no aminoácido em uma posição particular de várioshomólogos de origem diferente. As seqüências de consenso mostradas emFig. 2 são derivadas de referidos alinhamentos.
Os iniciadores degenerados podem então ser utilizados porPCR para a amplificação de fragmentos de novas proteínas tendo a atividadeacima mencionada, por exemplo tendo uma atividade de SPR ou outroshomólogos funcionais do polipeptídeo da invenção a partir de outrosorganismos.
Estes fragmentos podem então ser usados como uma sonda dehibridização para o isolamento da seqüência completa de genes. Como umaalternativa, as seqüências faltando 5' e 3' podem ser isoladas por meio de umRACE-PCR (amplificação rápida das extremidades do cDNA). A molécula deácido nucleico de acordo com a invenção pode ser amplificada usando cDNA ou, como uma alternativa, DNA genômico como um gabarito e apropriadosiniciadores de oligonucleotídeos, após as técnicas de amplificação de PCRpadrões. A molécula de ácido nucleico amplificado assim pode ser clonadaem um vetor apropriado e caracterizada por meio de uma análise da seqüênciade DNA. Oligonucleotídeos, que correspondem a uma das moléculas de ácido nucleico usadas no processo podem ser gerados por métodos de síntesepadrões, por exemplo usando um sintetizador de DNA automatizado.
As moléculas de ácido nucleico que são vantajosas para oprocesso de acordo com a invenção podem ser isoladas com base em suahomologia para as moléculas de ácido nucleico descritas aqui usando asseqüências ou parte das mesmas como uma sonda de hibridização e seguindotécnicas padrões de hibridização sob condições estringentes de hibridização.Neste contexto, é possível usar, por exemplo, moléculas de ácido nucleicoisoladas de pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ou mais nucleotídeos,preferivelmente de pelo menos 15, 20 ou 25 nucleotídeos em comprimentoque hibridizam sob condições estringentes com as moléculas de ácidonucleico acima mencionadas, em particular com as que englobam umaseqüência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico usada no processo dainvenção ou codificando uma proteína usada na invenção ou da molécula deácido nucleico da invenção. As moléculas de ácido nucleico com 30, 50,100, 250 ou mais nucleotídeos também podem ser usadas.
Além dos fragmentos, da SRP descrita aqui, a presenteinvenção inclui homólogos e análogos de SRP e ácidos nucleicos codificandoSRP de ocorrência natural em uma planta.
"Homólogos" são definidos aqui como dois ácidos nucleicosou proteínas que tem seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos, similaresou "homólogas", respectivamente. Homólogos incluem variantes alélicos,ortólogos, parálogos, agonistas, e antagonistas de SRP como definidos abaixo.O termo "homólogo" ainda engloba moléculas de ácido nucleicos que diferemde uma das seqüências de nucleotídeos mostrada em tabela I, coluna 4 e 5 (esuas porções) devido à degenerescência do código genético e assim codificama mesma SRP como a codificada pelas seqüências de aminoácidos mostradasna tabela II, coluna 4 e 5. Como usado aqui, uma SRP "de ocorrência natural"refere-se a uma seqüência de aminoácido de SRP que ocorre na natureza.
O termo "homologia" significa que as respectivas moléculas deácido nucleico ou proteína codificadas são funcionalmente e/ouestruturalmente equivalentes. As moléculas de ácido nucleico que sãohomólogas às moléculas de ácido nucleico descritas acima e que sãoderivadas de referidas moléculas de ácido nucleico são, por exemplo,variações de referidas moléculas de ácido nucleico que representammodificações tendo a mesma função biológica, em particular codificandoproteínas com a mesma ou substancialmente a mesma função biológica. Elaspode ser variações de ocorrência natural, tal como seqüências de outrasvariedades de plantas, ou espécies, ou mutações. Estas mutações podemocorrer naturalmente ou podem ser obtidas por técnicas de mutagenese. Asvariações alélicas podem ser variantes alélicas naturalmente ocorrendo, assimcomo variantes sinteticamente produzidas ou geneticamente engenheiradas.Os equivalentes estruturais podem, por exemplo, ser identificados por teste daligação do referido polipeptídeo a anticorpos ou previsões com base emcomputador. O equivalente estrutural tem as características imunológicassimilares, por exemplo compreendem epítopos similares.
Os equivalentes funcionais derivados de um dos polipeptídeoscomo mostrado na tabela II, colunas 4 e 5 de acordo com a invenção porsubstituição, inserção ou deleção tem pelo menos 30%, 35%, 40%, 45% ou50%, preferivelmente pelo menos 55%, 60%, 65% ou 70% por preferênciapelo menos 80%, especialmente preferivelmente pelo menos 85% ou 90%,91%, 92%, 93% ou 94%, muito especialmente preferivelmente pelo menos95%, 97%, 98%) ou 99% de homologia com um dos polipeptídeos, comomostrado na tabela II, colunas 4 e 5, de acordo com a invenção e são distintospor essencialmente as mesmas propriedades como o polipeptídeo comomostrado na tabela II, colunas 4 e 5.
Os equivalentes funcionais derivados de uma seqüência deácido nucleico, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, de acordo com ainvenção por substituição, inserção ou deleção tem pelo menos 30%, 35%,40%, 45% ou 50%, preferivelmente pelo menos 55%, 60%, 65% ou 70% porpreferência pelo menos 80%, especialmente preferivelmente pelo menos 85%ou 90%, 91%, 92%, 93% ou 94%, muito especialmente preferivelmente pelomenos 95%, 97%, 98% ou 99% de homologia com um dos polipeptídeos,como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, de acordo com a invenção ecodificam polipeptídeos tendo essencialmente as mesmas propriedades que ospolipeptídeos, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5.
Entende-se "essencialmente as mesmas propriedades" de umequivalente funcional acima como significando que o equivalente funcionaltem a atividade acima mencionada, por exemplo conferindo um aumento naquantidade de produto químico fino enquanto aumentando a quantidade deproteína, atividade ou função de referido equivalente funcional em umorganismo, por exemplo um microorganismo, uma planta ou tecido de plantaou animal, células de planta ou animal ou uma parte das mesmas.
Por "hibridização" significa-se que estas moléculas de ácidonucleico hibridizam sob condições de hibridização convencionais,preferivelmente sob condições estringentes tal como descrito por, porexemplo, Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2a ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) ou emCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ν. Y. (1989),6.3.1-6.3.6.
De acordo com a invenção, moléculas de DNA assim como deRNA do ácido nucleico da invenção podem ser usadas como sondas. Alémdisso, como gabarito para a identificação de homólogos funcionais, testes deNorthern blot assim como testes de Southern blot podem ser realizados. Oteste de Northern blot vantajosamente provê ainda informações cerca doproduto de gene expressado: por exemplo padrão de expressão, ocorrência deetapas de processamento como emenda e terminação, etc. O teste de Southernblot provê informação adicional a cerca de localização cromossômica eorganização do gene codificando uma molécula de ácido nucleico dainvenção.
Um exemplo preferido não limitativo de condições dehibridização é a hibridização em 6 χ cloreto de sódio/ citrato de sódio (= SSC)a aproximadamente 45°C, seguido por uma ou mais etapas de lavagem em 0,2χ SSC, 0, 1% SDS a 50 a 65°C, por exemplo a 50°C, 55°C ou 60°C. Oversado sabe que estas condições de hibridização diferem como uma funçãodo tipo de ácido nucleico e, por exemplo quando solventes orgânicos estãopresentes com relação à temperatura e concentração do tampão. Atemperatura sob "condições de hibridização padrões" diferem por exemplocomo uma função do tipo de ácido nucleico entre 42°C e 58°C,preferivelmente entre 450C e 50°C em um tampão aquoso com umaconcentração de 0,1 χ 0,5 χ, 1 χ, 2x, 3x, 4x ou 5 χ SSC (pH 7.2). Se solvente(s) orgânico(s) estiver/ estiverem presente(s) no tampão mencionado, porexemplo 50% formamida, a temperatura sob condições padrões é deaproximadamente 40°C, 42°C ou 45°C. As condições de hibridização para oshíbridos de DNA:DNA são preferivelmente por exemplo 0,1 χ SSC e 20°C,25°C, 30°C, 35°C, 40°C ou 45°C, preferivelmente entre 30°C e 45°C. Ascondições de hibridização para os híbridos DNA:RNA são preferivelmentepor exemplo 0,1 χ SSC e 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C ou 55°C,preferivelmente entre 45°C e 55°C. As temperaturas de hibridização acimamencionadas são determinadas por exemplo para um ácido nucleico deaproximadamente 100 bp (= pares de base) em comprimento e um teor de G +C de 50% na ausência de formamida. O versado sabe como determinar ascondições de hibridização requeridas com a ajuda de textos, por exemplo osmencionados acima, ou dos seguintes livros de texto Sambrook et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames eHiggins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach",IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, "EssentialMolecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford UniversityPress, Oxford.
Um outro exemplo de tal condição de hibridização estringenteé a hibridização a 4XSSC a 65°C, seguido por uma lavagem em O5IXSSC a65°C durante uma hora. Alternativamente, uma condição estringente dehibridização é 50 % formamida, 4XSSC a 42°C. Além disso, as condiçõesdurante a lavagem podem ser selecionadas dentre a faixa de condiçõesdelimitadas por condições de baixa estringência (aproximadamente 2X SSC a50°C) e condições de alta estringência (aproximadamente 0.2X SSC a 50°C,preferivelmente a 65°C) (20X SSC: 0.3M citrato de sódio, 3M NaCl, pH 7.0).Além disso, a temperatura durante a etapa de lavagem pode ser elevada decondições de baixa estringência em temperatura ambiente, aproximadamente22°C, condições de maior estringência a aproximadamente 65°C. Ambos osparâmetros de concentração de sal e temperatura podem ser variadossimultaneamente ou também um dos dois parâmetros pode ser mantidoconstante enquanto somente o outro é variado. Os desnaturantes, por exemploformamida ou SDS, também podem ser empregados durante a hibridização.Na presença de 50% formamida, hibridização é preferivelmente efetuada a42°C. Os fatores relevantes como i) extensão do tratamento, ii) condições desal, iii) condições detergentes, iv) DNAs de competidor, v) temperatura e vi)seleção de sondas podem ser combinados caso a caso de modo que nem todasas possibilidades podem ser mencionadas aqui.
Assim, em uma forma de realização preferida, Northern blotssão pré-hibridizados com tampão Rothi-Hybri-Quick (Roth, Karlsruhe) a68°C durante 2h. Hibridização com sonda rotulada radioativa é conduzidadurante a noite a 68°C. As etapas de lavagem subseqüentes são realizadas a68°C com lxSSC.
Para testes de Southern blot, a membrana é pré-hibridizadacom tampão Rothi-Hybri-Quick (Roth, Karlsruhe) a 68°C durante 2h.Hibridização com sonda rotulada radioativa é conduzida durante a noite a68°C Subseqüentemente, o tampão de hibridização é descartado e o filtro logolavado usando 2xSSC; 0,1% SDS. Após descartar o tampão de lavagem, novotampão 2xSSC; 0,1% SDS é adicionado e incubado a 68°C durante 15minutos Esta etapa de lavagem é realizada duas vezes seguido por uma etapaadicional usando lxSSC; 0,1% SDS a 68°C durante 10 min.
Polipeptídeos tendo atividade acima mencionada, isto éconferindo a atividade metabólica alterada, derivada de outros organismos,podem ser codificados por outras seqüências de DNA que hibridizam comopara as seqüências como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5 sob condições dehibridização relaxadas e que codificam em expressão para peptídeosconferindo uma atividade metabólica alterada.
Além disso, algumas aplicações precisam ser realizadas emcondições de hibridização de baixa estringência, sem quaisquer conseqüênciaspara a especificidade da hibridização. Por exemplo, a análise de Southern blotde DNA total pode ser sondada com a molécula de ácido nucleico da presenteinvenção e lavada em baixa estringência (55°C em 2xSSPE0,l% SDS). Aanálise de hibridização pode revelar um padrão simples de apenas genescodificando polipeptídeos da presente invenção ou usada em um processo dainvenção, por exemplo tendo a atividade de aumentar o produto químico finoaqui -mencionada. Um outro exemplo de tais condições de hibridização poucoestringentes é 4XSSC a 50°C ou hibridização com 30 a 40% formamida a42°C. Estas moléculas compreendem as que são fragmentos, análogos ouderivados do polipeptídeo da invenção ou usados no processo da invenção ediferem, por exemplo, por meio de deleção(s), inserção(s), substituição (s),adição (s) e/ou recombinação (s) de aminoácidos e/ou nucleotídeos ouquaisquer outras modificação(ões) conhecidas na técnica ou sozinhas ou emcombinação das η seqüências de aminoácido acima descritas ou de suasseqüência(s) de nucleotídeo subjacente(s). No entanto, prefere-se usarcondições de hibridização de alta estringência.
A hibridização vantajosamente pode ser realizada comfragmentos de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 bp, vantajosamentepelo menos 50, 60, 70 ou 80 bp, preferivelmente pelo menos 90, 100 ou 110bp. O mais preferivelmente são fragmentos de pelo menos 15, 20, 25 ou 30bp. Preferivelmente são também hibridizações com pelo menos 100 bp ou200, muito especialmente preferivelmente pelo menos 400 bp emcomprimento. Em uma forma de realização especialmente preferida, ahibridização deve ser realizada com a seqüência de ácido nucleico completacom as condições descritas acima.
Os termos "fragmento", "fragmento de uma seqüência" ou"parte de uma seqüência" significam uma seqüência trancada da seqüênciaoriginal referida aqui. A seqüência trancada (seqüência de ácido nucleico ouproteína) pode variar amplamente em comprimento, o tamanho mínimo sendouma seqüência de tamanho suficiente para prover a seqüência com pelomenos uma função e/ou atividade comparável da seqüência original referidaou hibridizando com a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada noprocesso da invenção sob condições estringentes, enquanto o tamanhomáximo não é crítico. Em algumas aplicações, o tamanho máximo geralmentenão é substancialmente maior do que o requerido para prover a atividade e/oufunção(ões) desejada(s) da seqüência original.
Além dos fragmentos e polipeptídeos de fusão dos SRPsdescritos aqui, a presente invenção inclui homólogos e análogos de SRPs deocorrência natural e ácidos nucleicos codificando SRP em uma planta."Homólogos" são definidos aqui como dois ácidos nucleicos ou polipeptídeosque tem seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos, similares ousubstancialmente idênticas, respectivamente. Homólogos incluem variantesalélicos, ortólogos, parálogos, agonistas, e antagonistas de SRPs comodefinidos abaixo. O termo "homólogo" ainda engloba moléculas de ácidonucleicos que diferem de uma das seqüências de nucleotídeos mostrada emtabela I, coluna 4 e 5 (e suas porções) devido à degenerescência do códigogenético e assim codificam a mesma SRP como a codificado por umaseqüência de nucleotídeos mostrada em tabela I, coluna 4 e 5. Como usadoaqui, uma SRP "de ocorrência natural" refere-se a uma seqüência deaminoácido de SRP que ocorre na natureza. Preferivelmente, uma SRP deocorrência natural compreende uma seqüência de aminoácido selecionadadentre o grupo consistindo de polipeptídeos como mostrados em tabela II,coluna 4 e 5.
Um agonista da SRP pode reter substancialmente as mesmas,ou um sub-conjunto das atividades biológicas da SRP. Um antagonista daSRP pode inibir um ou mais atividades da forma de ocorrência natural daSRP. Por exemplo, o antagonista de SRP pode ligar competitivamente a um membro a montante ou a jusante da cascata metabólica do componente demembrana de célula que inclui a SRP, ou liga a uma SRP que media otransporte de compostos através de tais membranas, assim evitando aocorrência da translocação.
Moléculas de ácido nucleico correspondendo a variantes15 alélicos naturais e análogos, ortólogos, e parálogos de um cDNA de SRPpodem ser isoladas com base em sua identidade para os ácidos nucleicos deSRP de Saccharomyces eerevisiae, E.eoli ou com base em sua identidade paraBrassiea napus, Glyeine max, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativaou Hordeum vulgare, Helianassim annuus, Linum usitatissimum, descritos20 aqui usando cDNAs de SRP, ou uma sua porção, como uma sonda dehibridização de acordo com técnicas padrões de hibridização sob condiçõesestringentes de hibridização. Em uma forma de realização alternativa,homólogos da SRP podem ser identificados por triagem de bibliotecascombinatoriais de mutantes, por exemplo mutantes de truncagem, da SRP25 para atividade de agonista ou antagonista de SRP. Em uma forma derealização, uma biblioteca variegada de variantes de SRP é gerada pormutagenese combinatorial no nível de ácido nucleico e é codificado por umabiblioteca de gene variegada. A biblioteca variegada de variantes de SRPpode ser produzida por, por exemplo, ligação enzimática de uma mistura deoligonucleotídeos sintéticos em seqüências de gene de modo que um conjuntodegenerado de seqüências de SRP em potencial é expressível comopolipeptídeos individuais, ou alternativamente como um conjunto depolipeptídeos de fusão maiores (por exemplo, para exibição de fagos)contendo o conjunto de seqüências de SRP. Existe uma variedade de métodosque podem ser usados para produzir bibliotecas de homólogos de SRP empotencial de uma seqüência de oligonucleotídeos degenerados. A síntesequímica de uma seqüência de gene degenerada pode ser realizada em umsintetizador de DNA automatizado, e o gene sintético é então ligado em umvetor de expressão apropriado. O uso de um conjunto degenerado de genespermite a provisão, em uma mistura, de todas as seqüências codificando oconjunto desejado de seqüências de SRP em potencial. Métodos parasintetizar os oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica. Ver,por exemplo, Narang, S.A., 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984,Annu. Rev. Biochem 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198:1056; Ike etal., 1983, Nucleic Acid Res 11:477.
Além disso, bibliotecas de fragmentos das regiões decodificação de SRP podem ser usadas para gerar uma população variegada defragmento de SRP para triagem e subseqüente seleção de homólogos de umaSRP. Em uma forma de realização, uma biblioteca de fragmentos deseqüência de codificação podem ser gerados por tratamento de um fragmentode PCR de filamento duplo de uma seqüência de codificação de SRP comuma nuclease sob condições em que ocorre nicking somente cerca de uma vezpor molécula, desnaturando o DNA de filamento duplo, renaturando o DNApara formar DNA de filamento duplo, que podem incluir pares sentido/anti-sentido de diferentes produtos nicked, removendo as porções de filamentoúnico de duplexes reformados por tratamento com Sl nuclease, e ligando abiblioteca de fragmentos resultante em um vetor de expressão. Por estemétodo, uma biblioteca de expressão pode ser derivada que codificafragmentos N-terminal, C-terminal, e internos de vários tamanhos da SRP.
Várias técnicas são conhecidas na técnica para triagem deprodutos de genes de bibliotecas combinatoriais feitas por mutações porpontos ou truncagem, e para triagem de bibliotecas de cDNA para produtos degenes tendo uma propriedade selecionada. Estas técnicas são adaptáveis paraa triagem rápida das bibliotecas de genes geradas pela mutagenesecombinatorial de homólogos de SRP. As técnicas mais amplamente usadas,que podem conduzir a análises de produção elevada, para triagem debibliotecas de genes grandes tipicamente incluem clonagem da biblioteca degenes em vetores de expressão replicáveis, transformação das célulasapropriadas com a biblioteca de vetores resultantes, e expressão de genescombinatoriais sob condições em que detecção da atividade desejada facilita oisolamento do vetor codificando o gene cujo produto foi detectado. Amutagenese ensemble recursiva (REM), uma técnica nova que melhora afreqüência de mutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada emcombinação com os testes de triagem para identificar homólogos de SRP(Arkin e Yourvan, 1992, PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993,Polypeptide Engineering 6(3): 327-331). Em outra forma de realização, testescom base em células podem ser explorados para analisar uma biblioteca deSRP variegada, usando métodos bem conhecidos na técnica. A presenteinvenção ainda provê um método de identificar uma nova SRP,compreendendo (a) criar uma resposta de anticorpo específica a uma SRP, ouum fragmento da mesma, como descrito aqui; (b) triar material de SRPputativo com o anticorpo, em que a ligação específica do anticorpo para omaterial indica a presença de SRP potencialmente nova; e (c) analisar omaterial ligado em comparação com a SRP conhecida, para determinar suanovidade.
Como descrito acima, a presente invenção inclui SRPs ehomólogos das mesmas. Para determinar a identidade percentual de seqüênciade duas seqüências de aminoácidos (por exemplo, uma das seqüências comomostrado em tabela II, coluna 4 e 5 e a forma mutante do mesmo), asseqüências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo,espaços podem ser introduzidos na seqüência de um polipeptídeo paraalinhamento ótimo com os outros polipeptídeo ou ácido nucleico). Osresíduos de aminoácido em posições de aminoácidos correspondentes sãoentão comparados.. Quando a posição em uma seqüência (por exemplo, umadas seqüências como mostrado em tabela II, coluna 4 e 5) é ocupada pelomesmo resíduo de aminoácido como a posição correspondente na outraseqüência (por exemplo, uma forma mutante da seqüência selecionada dentreo polipeptídeo como mostrado em tabela II, coluna 4 e 5), então as moléculassão idênticas nesta posição. O mesmo tipo de comparação pode ser feito entreduas seqüências de ácido nucleico.
A identidade percentual de seqüência entre as duas seqüênciasé uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelasseqüências (isto é, identidade percentual de seqüência = números de posiçõesidênticas / números totais de posições χ 100). Preferivelmente, os homólogosisolados de aminoácido incluídos na presente invenção são pelo menos cercade 50-60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60-70%, e maispreferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou90-95%, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%,ou mais idênticos a uma seqüência completa de aminoácido como mostradoem tabela II, coluna 4 e 5. Em ainda outra forma de realização, os homólogosisolados de aminoácido incluídos na presente invenção são pelo menos cercade 50-60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60-70%, e maispreferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou90-95%, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%,ou mais idênticos a uma completa seqüência de aminoácidos codificada poruma seqüência de ácido nucleico mostrado em tabela II, coluna 4 e 5. Emoutras formas de realização, os homólogos de aminoácidos de SRP tem umaidentidade de seqüência sobre pelo menos 15 resíduos de aminoácidoscontíguos, mais preferivelmente pelo menos 25 resíduos de aminoácidoscontíguos, e mais preferivelmente pelo menos 35 resíduos de aminoácidoscontíguos como mostrado na tabela II, coluna 4 e 5.
Em outra forma de realização preferida, um homólogo deácido nucleico isolado da invenção compreende uma seqüência denucleotídeo que é pelo menos cerca de 50-60%, preferivelmente pelo menoscerca de 60-70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% ou 90-95%, e ainda mais preferivelmente pelo menoscerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma seqüência denucleotídeo como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, ou a uma porçãocompreendendo pelo menos 20, 30, 40, 50, 60 nucleotídeos consecutivas dasmesmas. O comprimento preferível de comparação de seqüência para ácidosnucleicos é pelo menos 75 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos100 nucleotídeos e o mais preferivelmente o comprimento completo da regiãode codificação.
Prefere-se ainda que o homólogo de ácido nucleico isolado dainvenção codifica uma SRP, ou porção da mesma, que é pelo menos 85%idêntica a um seqüência de aminoácido como mostrado na tabela II, colunas 4e 5a e que funciona como um modulador de uma resposta a estresse ambientalem uma planta. Em uma forma de realização mais preferida, super-expressãodo ácido nucleico homólogo em uma planta aumenta a tolerância de umaplanta a um estresse ambiental.
Para fins da invenção, a identidade porcentual de seqüênciaentre duas seqüências de ácido nucleico ou polipeptídeo é determinada usandoo pacote de software Vector NTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave.,Bethesda, MD 20814). A penalidade de abertura de espaço de 15 e apenalidade de extensão de espaço de 6.66 são usadas para a determinação daidentidade percentual de dois ácidos nucleicos. A penalidade de abertura deespaço de IOea penalidade de extensão de espaço de 0,1 são usadas para adeterminação da identidade percentual de dois polipeptídeos. Todos outrosparâmetros são fixados como "default". Para fins de alinhamento múltiplo(algoritmo Clustal W), a penalidade de abertura de espaço é 10, e apenalidade de extensão de espaço é 0,05 com matriz blosum62. Deve-seentender que para a fins de determinação da identidade de seqüência quandocomparando uma seqüência de DNA com uma seqüência de um RNA, umnucleotídeo timidina é equivalente a um nucleotídeo uracila.
Em outro aspecto, a invenção provê um ácido nucleico isoladocompreendendo um polinucleotídeo que hibridiza no polinucleotídeo comomostrado na tabela 1, coluna 4 e 5, sob condições estringentes. Maisparticularmente, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção tempelo menos 15 nucleotídeos de comprimento e hibridiza sob condiçõesestringentes na molécula de ácido nucleico compreendendo a seqüência denucleotídeos como mostrado na tabela 1, coluna 4 e 5. Em outras formas derealização, o ácido nucleico é pelo menos 30, 50, 100, 250, ou maisnucleotídeos em comprimento. Preferivelmente, um homólogo de ácidonucleico isolado da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeos quehibridiza sob condições altamente estringentes para uma seqüência denucleotídeos como mostrado na tabela 1, coluna 4 e 5, e funciona como ummodulador de tolerância a estresse em uma planta. Em uma outra forma derealização preferida, a super-expressão do homólogo de ácido nucleicoisolado em uma planta aumenta a tolerância de uma planta a um estresseambiental.
Como usado aqui com relação à hibridização para DNA emum DNA blot, o termo "condições estringentes " refere-se, em uma forma derealização, à hibridização durante a noite a 60°C em 10X solução Denhart's,6X SSC, 0,5% SDS, e 100μg/ml DNA de esperma de salmão desnaturado.Blots são lavados seqüencialmente a 62°C durante 30 minutos cada vez em3X SSC/0,1% SDS, seguido por IX SSC/0,1% SDS5 e finalmente 0,1 XSSC/0,1% SDS. Como também usado aqui, "condições altamente estringentes" refere-se a hibridização durante a noite a 65 0C em 10X solução Denharts,6X SSC, 0,5% SDS, e 100μg/ml DNA de esperma de salmão desnaturado.Blots são lavados seqüencialmente a 65°C durante 30 minutos cada vez em3X SSC/0,1% SDS, seguido por IX SSC/0,1% SDS, e finalmente 0,1XSSC/0,1% SDS. Métodos para hibridização de ácido nucleico são descritosem Meinkoth e Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138:267-284; Current Protocolsin Molecular Biology, Cap. 2, Ausubel et al. Eds., Greene Publishing andWiley-Interscience, New York, 1995; e Tijssen, 1993, Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Acid NucleicProbes, Parte I, Cap. 2, Elsevier, New York, 1993. Preferivelmente, umamolécula de ácido nucleico isolada da invenção que hibridiza sob condiçõesestringentes ou altamente estringentes para uma seqüência como mostrado natabela 1, coluna 4 e 5, corresponde a uma molécula naturalmente ocorrendomolécula de ácido nucleico. Como usado aqui, uma molécula "ocorrendonaturalmente" de ácido nucleico refere-se a uma molécula de RNA ou DNAtendo uma seqüência de nucleotídeos que ocorre na natureza (por exemplo,codifica um polipeptídeo natural). Em uma forma de realização, o ácidonucleico codifica uma SRP de Saccharomyces eerevisiae, E.eoli ou uma SRPde ocorrência natural de Brassiea napus, Glyeine max, Zea mays, Tritieumaestivum ou Oryza sativa ou Hordeum vulgare, Helianassim annuus, Linumusitatissimum.
Usando os métodos acima descritos, e outros conhecidos dosversados, um versado na técnica pode isolar homólogos das SRPs decompreendendo uma seqüência de aminoácido, como mostrado em tabela II,coluna 4 e 5. Um subconjunto destes homólogos é de variantes alélicos. Comousado aqui, o termo "variante alélica " refere-se a uma seqüência denucleotídeos contendo polimorfismos que levam a mudanças nas seqüênciasde aminoácido de uma SRP e que existem dentro de uma população natural(por exemplo, uma espécie de planta ou variedade). Estas variações alélicasnaturais podem tipicamente resultar em 1-5% variância em uma SRP de ácidonucleico. Variantes alélicas podem ser identificadas por sequenciamento deuma seqüência de ácido nucleico de interesse em um número de diferentesplantas, que podem ser prontamente realizadas usando sondas de hibridizaçãopara identificar o mesmo Iocus genético de SRP nestas plantas. Qualquer umae todas estas variações de ácido nucleico e polimorfismos de aminoácidosresultantes ou variações em uma SRP que são o resultado de variação alélicanatural e que não alteram a atividade funcional de uma SRP, são destinados aestar no escopo da invenção.
Uma molécula de ácido nucleico isolada codificando uma SRPtendo identidade de seqüência com um polipeptídeo seqüência comomostrado em tabela II, coluna 4 e 5, pode ser criada por introdução de uma oumais substituições, adições, ou deleções de aminoácidos em uma seqüência denucleotídeos, como mostrado em tabela I, coluna 4 e 5, respectivamente, demodo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de ou maisaminoácido são introduzidas no polipeptídeo codificado. Mutações podemser introduzidas nas seqüências, como mostrado em tabela I, coluna 4 e 5 portécnicas padrões, como mutagenese dirigida ao sítio de mutagenese mediadapor PCR. Preferivelmente, as substituições conservativas de aminoácido sãofeitas em um ou mais dos resíduos de aminoácidos não essenciais previstos.Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que o resíduo deaminoácido é substituído com um resíduo aminoácido tendo a cadeia lateralsimilar.
Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias lateraissimilares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos comcadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeiaslaterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeiaslaterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina,serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo,alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina,triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina,isoleucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina,triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial previstoem uma SRP é preferivelmente substituído com outro resíduo de aminoácidoda mesma família de cadeia lateral. Alternativamente, em outra forma derealização, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de todaou parte de uma seqüência codificando SRP, como por mutagenese desaturação, e os resultantes mutantes podem ser triados para uma atividade deSRP descrita aqui para identificar mutantes que retém a atividade de SRP.Após mutagenese de uma das seqüências como mostrado em tabela I, colunas4 e 5, o polipeptídeo codificado pode ser expressado recombinantemente e aatividade do polipeptídeo pode ser determinada por análise da tolerância aestresse de uma planta expressando o polipeptídeo como descrito aqui.
Adicionalmente, ácidos nucleicos de SRP otimizados podemser criados. Como usado aqui, "otimizado" refere-se a um ácido nucleico queé geneticamente engenheirado para aumentar sua expressão em uma dadaplanta ou animal. Para prover ácidos nucleicos de SRP otimizados na planta, aseqüência de DNA do gene pode ser modificada para 1) compreender codonspreferidos para expressar altamente genes de planta; 2) compreender um teorde A+T em uma composição de base de nucleotídeo ao substancialmenteencontrado em plantas; 3) formar uma seqüência de iniciação na planta; ou 4)eliminar as seqüências que causam a desestabilização, poliadenilaçãoinapropriada, degradação e terminação de RNA, ou que formam estruturas degrampos de cabelo secundárias ou sítios de emenda de RNA. A expressãoaumentada de ácidos nucleicos de SRP em plantas pode ser obtida porutilização da freqüência de distribuição de uso de códons em plantas em geralou em uma planta particular. Métodos para otimizar a expressão de ácidonucleico em plantas podem ser encontrados em EPA 0359472; EPA 0385962;Pedido PCT No. WO 91/16432; patente US No. 5.380.831; patente US No.5.436.391; Perlack et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:3324-3328; eMurray et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:477-498.
Como usado aqui, "freqüência de uso de códons preferido"refere-se a preferência exibida por uma célula hospedeira específica em usode códons de nucleotídeo para especificar um dado aminoácido. Paradeterminar a freqüência de uso do códon particular em um gene, o número deocorrências em que o códon no gene é dividido pelo número total deocorrência de todos os codons especificando o mesmo aminoácido no gene.Similarmente, a freqüência de uso preferido de códons demonstrada pelacélula hospedeira pode ser calculada tirando a média da freqüência depreferido uso de códons em um número grande de genes expressados pelacélula hospedeira. É preferível que esta análise seja limitada a genes que sãoaltamente expressados pela célula hospedeira. O desvio percentual dafreqüência de uso preferido de códons para um gene sintético do queempregado pela célula hospedeira é calculado primeiro por determinação dodesvio percentual da freqüência de uso de um códon único do que da célulahospedeira seguido por obtenção do desvio médio de todos os outros codons.Como definido aqui, este cálculo inclui codons únicos (isto é, ATG e TGG).Em termos gerais, o desvio médio global do uso de códons de um geneotimizado do da célula hospedeira é calculado usando a equação IA = η = 1 ZXn - Yn Xn vezes 100 Z onde Xn = freqüência de uso para o códon η em umacélula hospedeira; Yn = freqüência de uso para o códon η no gene sintético; ηrepresenta um códon individual que especifica um aminoácido; e o númerototal de codons é Ζ. O desvio global da freqüência de uso de códons, A, paratodos os aminoácidos deve ser preferivelmente menor do que cerca de 25%, emais preferivelmente menor do que cerca de 10%.
Assim, um ácido nucleico de SRP pode ser otimizado de modoque sua freqüência de distribuição de uso de códons se desvia,preferivelmente, em não mais do que 25% dos genes de plantas altamenteexpressados e, mais preferivelmente, não mais do que cerca de 10%. Alémdisso, consideração é dada à porcentagem do teor de G+C para degenerar aterceira base (monocotilédones parecem favorecer G+C nesta posição, ondedicotilédones não parecem). Também é reconhecido que o nucleotídeo XCG(onde X é A, T, C, ou G) é o códon menos preferido em dicotiledôneasenquanto o códon XTA é evitado em tanto as monocotiledôneas como asdicotiledôneas. Os ácidos nucleicos de SRP otimizados desta invençãotambém preferivelmente tem índices de evitar dupleto CG e TA seaproximando intimamente dos da planta hospedeira selecionada. Maispreferivelmente, estes índices se desviam do hospedeiro em não mais do quecerca de 10-15%.
Além das moléculas de ácido nucleico codificando as SRPsdescritas acima, outro aspecto da invenção pertence a moléculas de ácidonucleico isoladas que são anti-sentido para o mesmo. Pensa-se que ospolinucleotídeos anti-sentido inibem a expressão de genes do polinucleotídeode marcação por ligação específica ao polinucleotídeo de marcação einterferência com a transcrição, emendas, transporte, tradução, e/ouestabilidade do polinucleotídeo de marcação. Métodos são descritos natécnica anterior para a marcação de polinucleotídeo anti-sentido para o DNAcromossômico, para um transcrito de RNA primário ou para um mRNAprocessado. Preferivelmente, as regiões de marcação incluem sítios deemenda, códons de iniciação de tradução, códons de terminação de tradução,e outras seqüências dentro da matriz de leitura aberta.
O termo "anti-sentido, " para os fins da invenção, refere-se aácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que é suficientementecomplementar a toda ou a uma porção de um gene, transcrito primário, oumRNA processado, de modo a interferir com a expressão do gene endógeno.Os polinucleotídeos "complementares" são os que são capazes de formarpares de bases de acordo com regras de complementaridade padrões deWatson-Crick. Especificamente, purinas irão formar pares de bases compirimidinas para formar um combinação de guanina em par com citosina(G:C) e adenina em par com ou timina (A:T) no caso de DNA, ou adenina empar com uracila (A:U) no case de RNA. Deve-se entender que dospolinucleotídeos podem hibridizar um no outro mesmo se eles não foremcompletamente complementares um a cada outro, desde que cada tenha pelomenos uma região que é substancialmente complementar à outra. O termo "ácido nucleico anti-sentido " inclui cassetes de expressão de RNA defilamento único assim como DNA de filamento duplo que pode ser transcritopara produzir um RNA anti-sentido. Os ácidos nucleicos anti-sentido "ativos"são moléculas RNA anti-sentido que são capazes de hibridizar seletivamenteum transcrito primário ou mRNA codificando um polipeptídeo tendo pelomenos 80% de identidade de seqüência com o polipeptídeo como mostrado natabela II, coluna 4 e 5.
O ácido nucleico anti-sentido pode ser complementar a umfilamento completo codificando SRP, ou somente uma porção do mesmo. Emuma forma de realização, uma molécula anti-sentido de ácido nucleico é anti-sentido para uma "região de codificação" do filamento de codificação daseqüência de nucleotídeos codificando uma SRP. O termo "região decodificação" refere-se a uma região da seqüência de nucleotídeoscompreendendo codons que são traduzidos em resíduos de aminoácido. Emoutra forma de realização, a molécula anti-sentido de ácido nucleico é anti-sentido para uma "região de não codificação" do filamento de codificação daseqüência de nucleotídeos codificando uma SRP. O termo "região de nãocodificação" refere-se a seqüências 5' e 3' que flanqueiam a região decodificação que não são traduzidas em aminoácidos (isto é, também referidascomo as regiões não traduzidas 5' e 3')· A molécula anti-sentido de ácidonucleico pode ser complementar à região completa de codificação de mRNAde SRPj mas mais preferivelmente é um oligonucleotídeo que é anti-sentido a somente uma porção de região de codificação ou de não codificação demRNA de SRP. Por exemplo, o oligonucleotídeo anti-sentido pode sercomplementar a uma região circundando o sítio de início de tradução demRNA de SRP. Um oligonucleotídeo anti-sentido pode ter, por exemplo,cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 nucleotídeos emcomprimento. Tipicamente, as moléculas anti-sentido da presente invençãocompreendem um RNA tendo 60-100% de identidade de seqüência com pelomenos 14 nucleotídeos consecutivos de um dentre os ácidos nucleicos comomostrado na tabela I, coluna 4. e 5. Preferivelmente, a identidade de seqüênciaserá de pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%,90%, 95%, ou 98%, e o mais preferivelmente 99%.
Um ácido nucleico anti-sentido da invenção pode serconstruído usando síntese química e reações de ligação enzimática usandoprocedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, um ácido nucleico anti-sentido (por exemplo, um oligonucleotídeo anti-sentido) pode serquimicamente sintetizado usando nucleotídeos de ocorrência natural ounucleotídeos modificados de vários modos projetado para aumentar aestabilidade biológica das moléculas ou para aumentar a estabilidade física doduplex formado entre os ácidos nucleicos anti-sentido e sentido, por exemplo,nucleotídeos substituídos por derivados de fosforotioato e acridina podem ser usados. Exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser usado paragerar o ácido nucleico anti-sentido incluem 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidróxilmetil) uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-D-galactosilqueosina,inosina, N6-isopenteniladenina, 1 -metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina,ácido uracil-5-oxiacetico (v), wibutoxosina, pseudouracil, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, éstermetílico de ácido uracil-5- oxiacético, uracil-5-ácido oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracil, (acp3)w, e 2,6-diaminopurina. Alternativamente, o ácido nucleico anti-sentido pode serproduzido biologicamente usando um vetor de expressão em que um ácidonucleico foi subclonado em uma orientação anti-sentido (isto é, RNAtranscrito do ácido nucleico inserido será de uma orientação anti-sentido paraum ácido nucleico alvo de interesse, descrito ainda na seguinte subseção).
Em ainda outra forma de realização, a molécula anti-sentido deácido nucleico da invenção é uma molécula α-anomérica de ácido nucleico.Uma molécula α-anomérica de ácido nucleico forma híbridos de filamentoduplo específicos com RNA complementar em que, contrário às unidades β-comuns, os filamentos correm em paralelo uns aos outros (Gaultier et al.,1987, Acid Nucleic Res. 15:6625-6641). A molécula anti-sentido de ácidonucleico pode também compreender um 2'-o-metilribonucleotídeo (Inoue etal., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) ou análogos de RNA-DNAquiméricos (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).
As moléculas de ácido nucleico anti-sentido da invenção sãotipicamente administradas a uma célula ou geradas in situ de modo que elashibridizam com ou ligam a mRNA celular e/ou DNA genômico codificandouma SRP para assim inibir a expressão do polipeptídeo, por exemplo, porinibição. da transcrição e/ou tradução. A hibridização pode ser porcomplementaridade de nucleotídeos convencional para formar um duplexestável ou, por exemplo, no caso de uma molécula de ácido nucleico anti-sentido que liga a duplexes de DNA, através de interações específicas naranhura principal da hélice dupla. A molécula anti-sentido pode sermodificada de modo que ela especificamente liga a um receptor ou umantígeno expressado em uma superfície de célula selecionada por exemplo,por ligação da molécula anti-sentido de ácido nucleico a um peptídeo ou umanticorpo que liga a um receptor de superfície de célula ou antígeno. Amolécula anti-sentido de ácido nucleico também pode ser distribuída para ascélulas usando os vetores descritos aqui. Para obter concentraçõesintracelulares suficientes das moléculas anti-sentido, construções de vetor emque a molécula anti-sentido de ácido nucleico é colocada sob o controle dopromotor forte procariótico, viral, ou eucariótico (incluindo planta) sãopreferidas.
Como uma alternativa a polinucleotídeo anti-sentido,ribozimas, polinucleotídeos sentido, ou RNA de filamento duplo (dsRNA)podem ser usados para reduzir a expressão de um polipeptídeo de SRP. Por"ribozima" significa-se uma enzima com base em RNA catalítico comatividade ribonuclease que é capaz de clivar um ácido nucleico de filamentoúnico, como um mRNA, ao qual ele tem uma região complementar.Ribozimas (por exemplo, ribozimas hammerhead descritas em Haselhoff eGerlach, 1988, Nature 334:585-591) podem ser usadas para clivarcataliticamente transcritos de mRNA de SRP para assim inibir a tradução demRNA de SRP. Uma ribozima tendo especificidade para um ácido nucleicocodificando SRP pode ser projetada com base em uma seqüência denucleotídeos de um cDNA de SRP como relatado aqui ou com base emseqüência heteróloga a ser isolada de acordo com métodos ensinados nainvenção. Por exemplo, um derivado de RNA de Tetrahymena L-19 IVS podeser construído em que a seqüência de nucleotídeos do sítio ativo écomplementar a uma seqüência de nucleotídeos a ser clivada em um mRNAcodificando SRP. Ver, por exemplo, patente US Nos. 4.987.071 e 5.116.742para Cech et al. Alternativamente, mRNA de SRP pode ser usado paraselecionar um RNA catalítico tendo uma atividade de ribonuclease específicade um conjunto de moléculas de RNA. Ver, por exemplo, Bartel, D. eSzostak, J.W., 1993, Science 261:1411-1418. Em formas de realizaçãopreferidas, a ribozima irá conter uma porção tendo pelo menos 7, 8, 9, 10, 12,14, 16, 18, ou 20 nucleotídeos, e mais preferivelmente 7 ou 8 nucleotídeos,que tem 100% de complementaridade para uma porção do RNA de marcação.Métodos para fabricar ribozimas são conhecidos dos versados na técnica. Ver,por exemplo, patente US Nos. 6.025.167; 5.773.260; e 5.496.698.
O termo "dsRNA," como usado aqui, refere-se a híbridos deRNA compreendendo dois filamentos de RNA. Os dsRNAs podem serlineares ou circulares em estrutura. Em uma forma de realização preferida,dsRNA é específico para um polinucleotídeo codificando ou o polipeptídeocomo mostrado na tabela II, coluna 4 e 5, ou um polipeptídeo tendo pelomenos 70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo como mostradona tabela II, coluna 4 e 5. Os RNAs de hibridização podem sersubstancialmente ou completamente complementares. Por "substancialmentecomplementar," significa-se que quando os dois RNAs de hibridização sãootimamente alinhados usando o programa BLAST como descrito acima, asporções de hibridização são pelo menos 95% complementares.Preferivelmente, os dsRNA terão pelo menos 100 pares de base emcomprimento. Tipicamente, os RNAs de hibridização são de comprimentoidêntico sem as extremidades de ganchos 5' ou 3' e sem espaços. No entanto,dsRNAs tendo ganchos 5' ou 3' de até 100 nucleotídeos podem ser usadosnos métodos da invenção.
O dsRNA pode compreender ribonucleotídeos, análogos deribonucleotídeo como resíduos de 2'-0-metil ribosil, ou suas combinações.Ver, por exemplo, patentes US Nos. 4.130.641 e 4.024.222. Um dsRNA ácidopoliriboinosínico : ácido poliribocitidílico é descrito em patente U.S.4.283.393. Métodos para fazer e usar dsRNA são conhecidos na técnica. Ummétodo compreende a transcrição simultânea de dois filamentoscomplementares de DNA, ou in vivo, ou em uma mistura de reação in vitroúnica. Ver, por exemplo, patente US No. 5.795.715. Em uma forma derealização, dsRNA pode ser introduzido em uma planta ou célula de plantadiretamente por procedimentos de transformação padrões. Alternativamente,dsRNA pode ser expressado em uma célula de planta por transcrição de doisRNAs complementares.
Outros métodos para a inibição de expressão de geneendógeno, como formação de hélice tripla (Moser et al., 1987, Science238:645-650 e Cooney et al., 1988, Science 241:456-459) e co-supressão(Napoli et al., 1990, The Plant Cell 2:279-289) são conhecidos na técnica.cDNAs de comprimento parcial e total tem sido usados para a co-supressão degenes de plantas endógenos. Ver, por exemplo, patentes US Nos. 4.801.340.5.034.323. 5.231.020. e 5.283.184; Van der Kroll et al., 1990, The Plant Cell2:291-299; Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genetics 224:477-481; e Napoli etal., 1990, The Cell Plant 2:279-289.
Para a supressão de sentido, acredita-se que a introdução dopolinucleotídeo sentido bloqueia a transcrição do gene de marcaçãocorrespondente. O polinucleotídeo sentido terá pelo menos 65% de identidadede seqüência com o gene de planta de marcação ou RNA. Preferivelmente, aidentidade percentual é pelo menos 80%, 90%, 95%, ou mais. Opolinucleotídeo sentido introduzido não precisa ser de comprimento completocom relação ao gene de marcação ou transcrito. Preferivelmente, opolinucleotídeo sentido terá pelo menos 65% de identidade de seqüência compelo menos 100 nucleotídeos consecutivos de um ou mais dos ácidosnucleicos, como mostrado na tabela I, coluna 4 e 5. As regiões de identidadepodem compreender íntrons e/ou éxons e regiões não traduzidas. Opolinucleotídeo sentido introduzido pode estar presente em uma célula deplanta transientemente, ou pode ser estavelmente integrado em umcromossomo ou replicon extracromossômico de uma planta.
Além disso, molécula de ácido nucleicos codificando SRPs damesma ou de outras espécies como análogos, ortólogos, e parálogos de SRPs5são destinadas a estar no escopo da presente invenção. Como usado aqui, otermo "análogos" refere-se a dois ácidos nucleicos que tem a mesma ousimilar função, mas que evoluíram separadamente em organismos nãorelacionados. Como usado aqui, o termo "ortólogos" refere-se a dois ácidosnucleicos de diferentes espécies, mas que evoluíram de um gene ancestralcomum por especialização. Normalmente, ortólogos codificam polipeptídeostendo a mesma ou similares funções. Como também usado aqui, o termo"parálogos" refere-se a dois ácidos nucleicos que são relacionados porduplicação dentro de um genoma. Os parálogos geralmente têm funçõesdiferentes mas estas funções podem estar relacionadas (Tatusov, R.L. et al.,1997, Science 278(5338): 631-637). Análogos, ortólogos, e parálogos de umaproteína relacionada com estresse ocorrendo naturalmente podem diferir daproteína relacionada com estresse ocorrendo naturalmente por modificaçõespós translacionais, por diferenças de seqüência de aminoácidos, ou porambos. As modificações pós-translacionais incluem derivação química in vivoe in vitro de polipeptídeos, por exemplo, acetilação, carboxilação,fosforilação, ou glicosilação, e estas modificações podem ocorrer durante asíntese ou processamento de polipeptídeos ou após tratamento com enzimasde modificação isoladas. Em particular, ortólogos da invenção geralmentedemonstram pelo menos 80-85%, mais preferivelmente, 90%, 91%, 92%,93%, 94% e o mais preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98% ou mesmo 99% deidentidade ou homologia, com toda ou parte da seqüência de aminoácido deproteína relacionada com estresse, naturalmente ocorrendo, e irão demonstraruma função similar a uma proteína relacionada com estresse. Ortólogos dapresente invenção são também preferivelmente capazes de participar naresposta a estresse em plantas.
Além de variantes de ocorrência natural de uma seqüência deproteína relacionada com estresse que pode existir na população, o versado iránotar que mudanças podem ser introduzidas por mutação em uma seqüênciade nucleotídeos, como mostrado em tabela I, colunas 4 e 5, assim levando àsmudanças na seqüência de aminoácido da proteína relacionada com estressecodificada, sem alterar a atividade funcional da proteína relacionada comestresse. Por exemplo, substituições de nucleotídeo levando a substituições deaminoácidos para resíduos de aminoácidos "não essenciais" podem ser feitasem uma seqüência como mostrada em tabela II, coluna 4 e 5. Um resíduo deaminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado da seqüênciade tipo selvagem de uma das proteínas relacionadas com estresse sem alterar aatividade das mesmas, enquanto um resíduo de aminoácido "essencial" érequerido para atividade de proteína relacionada com estresse. Outrosresíduos de aminoácido, no entanto, (por exemplo, os que não sãoconservados ou somente semi-conservados no domínio tendo atividade deSRP) podem não ser essenciais para atividade e assim são provavelmentecondutores a uma alteração sem alterar a atividade de SRP.
Assim, outro aspecto da invenção pertence a moléculas deácido nucleico codificando proteínas relacionadas com estresse que contémmudanças em resíduos de aminoácidos que não são essenciais para a atividadede proteína relacionada com estresse. Estas SRPs diferem em seqüência deaminoácido de uma seqüência como mostrado na tabela II, colunas 4 e 5,ainda retém pelo menos uma das atividades de proteína relacionada comestresse descritas aqui. Em uma forma de realização, a molécula de ácidonucleico isolada compreende uma seqüência de nucleotídeo codificando umaproteína, em que a proteína compreende uma seqüência de aminoácido pelomenos cerca de 50% homóloga a uma seqüência de aminoácido comomostrado na tabela II, colunas 4 e 5. Preferivelmente, a proteína codificadapela molécula de ácido nucleico é pelo menos cerca de 50-60% homóloga auma das seqüências como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, maispreferivelmente pelo menos cerca de 60 - 70% homóloga a uma dasseqüências como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, ainda maispreferivelmente pelo menos cerca de 70 - 80%, 80 - 90%, maispreferivelmente 90%, 91%, 92%, 93%, 94% homóloga a uma das seqüências,como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, e o mais preferivelmente pelomenos cerca de 96%, 97%, 98%, ou 99% homóloga a uma das seqüências,como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5. Os homólogos da proteínarelacionada com estresse preferidos da presente invenção são preferivelmentecapazes de participar em uma resposta de uma tolerância a estresse em umaplanta. A homologia (= identidade) foi calculada sobre a faixa completa deaminoácido. O programa usado foi PileUp (J. Mol. Evolution., 25 (1987),351-360, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153).
Homólogos das seqüências, como mostrado na tabela I,colunas 4 e 5, devem ser ainda entendidos como significando, por exemplo,homólogos, análogos, ortólogos, e parálogos, que tem pelo menos 30%homologia (= identidade) no nível de aminoácido derivado, preferivelmentepelo menos 50 %, 60 %, 70 % ou 80 % homologia, especialmentepreferivelmente pelo menos 85 % homologia, muito especialmentepreferivelmente 90 % 91%, 92%, 93%, 94% de homologia, o maispreferivelmente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de homologia. Ahomologia (= identidade) foi calculada sobre toda a faixa de aminoácido. O programa usado foi PileUp (J. Mol. Evolution., 25 (1987), 351 - 360,Higgens et al., CABIOS, 5 1989: 151 - 153) ou o programa Gap e BestFit[Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443 - 453 (1970) e Smith eWaterman respectivamente (Adv. Appl. Math. 2; 482 - 489 (1981)] que sãoparte do pacote de software GCG [Genetics Computer Group, 575 ScienceDrive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]. As percentagens acimamencionadas de homologia de seqüência são calculadas com o programaBestFit ou Gap, preferivelmente Gap, sobre o comprimento total da seqüênciacom os seguintes parâmetros usados: Peso do Espaço: 8, Peso docomprimento : 2.
Para a determinação da homologia percentual (^identidade) deduas ou mais seqüências de aminoácidos ou de duas ou mais seqüências denucleotídeos vários programas de computador foram desenvolvidos. Ahomologia de duas ou mais seqüências pode ser calculada com por exemplo osoftware fasta, que atualmente tem sido usado na versão fasta 3 (W. R.Pearson e D. J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological SequenceComparison. PNAS 85:2444- 2448; W. R. Pearson (1990) Rapid andSensitive Sequence Comparison with FASTP e FASTA, Methods inEnzymology 183:63 - 98; W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988) ImprovedTools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85:2444- 2448; W. R.Pearson (1990); Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP eFASTA Methods in Enzymology 183:63 - 98). Outro programa útil para ocálculo de homologia em diferentes seqüências é o programa padrão blast,que é incluído no software Biomax pedant (Biomax, Munich, RepúblicaFederal da Alemanha). Isto leva infelizmente às vezes a resultados subótimosporque blast sem sempre inclui as seqüências completas do assunto e aconsulta. Mesmo assim este programa é muito eficiente e ele pode ser usadopara a comparação de um número enorme de seqüências. As seguintesconfigurações são tipicamente usadas para estas comparações de seqüências:-p Nome Programa [Cadeia]; -d Base de dados [Cadeia]; "default" = nr; -iQuery File [Arquivo de Entrada]; "default" = stdin; -e Valor de Expectativa(E) [Real]; "default" = 10.0; -m opções de vista do alinhamento: O = em pares;1 = identidades mostradas ancoradas em consulta; 2 = identidades nãoancoradas em consulta; 3 = ancoradas em consulta sem contraste, mostraridentidades; 4 = ancoradas em consulta sem contraste, sem identidades; 5 =identidades não ancoradas em consulta e extremidades obtusas; 6 = ancoradasem consulta sem contraste, sem identidades e extremidades obtusas; 7 = XMLSaída Blast; 8 = tabular; 9 tabular com linhas de comentário [Número inteiro];"default" = 0; -o Arquivo de Saída Relatório BLAST [Arquivo de Saída]Opcional; "default" = stdout; -F Filtrar consulta de seqüência (DUST comblastn, SEG com outros) [Cadeia]; "default" = T; -G Valor para abrir umespaço (zero executa comportamento de "default") [Número inteiro];"default" = 0; -E Valor para estender um espaço (zero executa comportamentode "default") [Número inteiro]; "default" = 0; -X X valor de queda acentuadapara alinhamento em espaços (em bits) (zero executa comportamento de"default"); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, todos os outros 15 [Númerointeiro]; "default" = 0; -I Mostrar GI's em linhas de definição [T/F]; "default"= F; -q Penalidade para o desalinhamento do nucleotídeo (blastn apenas)[Número inteiro]; "default" = -3; -r Recompensa para a correspondênciaalinhada de nucleotídeos (blastn apenas) [Número inteiro]; "default" = 1; -vNúmero de seqüências de bases de dados para mostrar descrições de umalinha para (V) [Número inteiro]; "default" = 500; -b Número de seqüência debase de dados para mostrar alinhamentos para (B) [Número inteiro]; "default"= 250; -f Limiar para sucessos estendidos, "default" se zero; blastp 11, blastn0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [Número inteiro]; "default" =0; -g alinhamento em espaços Perfom (não disponível com tblastx) [T/F];"default" = T; -Q Consulta para usar código genético [Número inteiro];"default" = 1; -D DB Código genético (para tblast[nx] apenas) [Númerointeiro]; "default" = 1; -a Número de processadores a usar [Número inteiro];"default" = 1; -O Arquivo SeqAlign [Arquivo de Saída] Opcional; -JAcreditar na linha de definição de consulta [T/F]; "default" = F; -M Matrix[Cadeia]; "default" = BLOSUM62; -W Tamanho da palavra, "default" se zero(blastn 11, megablast 28, todos os outros 3) [Número inteiro]; "default" = 0; -z Extensão efetiva para base de dados (usar zero para o tamanho real) [Real];"default" = 0; -K Número de melhores acertos de uma região a manter(desligado por "default", se usado, um valor de 100 é recomendado) [Númerointeiro]; "default" = 0; -P 0 para acerto múltiplo, 1 para acerto único [Númerointeiro]; "default" = 0; -Y Extensão efetiva do espaço de busca (usar zero parao tamanho real) [Real]; "default" = 0; -S Cordões de consulta para pesquisarcontra a base de dados (para blast[nx], e tblastx); 3 é de ambos, 1 é topo, 2 éfundo [Número inteiro]; "default" = 3; -T Produzir saída de HTML [T/F];"default" = F; -1 Limitar pesquisa de base de dados para lista de GI's [Cadeia]Opcional; -U Usar filtro de letra minúscula de seqüência FASTA [T/F]Opcional; "default" = F; -y X valor de queda acentuada para extensões semespaços em bits (0.0 executa comportamento de "default"); blastn 20,megablast 10, todos os outros 7 [Real]; "default" = 0.0; -Z X valor de quedaacentuada para alinhamento com espaços final em bits (0.0 executacomportamento de "default"); blastn/megablast 50, tblastx 0, todos os outros25 [Número inteiro]; "default" = 0; -R arquivo de verificação PSI-TBLASTN[Arquivo de Entrada] Opcional; -n Busca MegaBlast [T/F]; "default" = F; -LLocação em seqüência de consulta [Cadeia] Opcional; -A Tamanho da janelade acertos múltiplos, "default" se zero (blastn/megablast 0, todos os outros 40[Número inteiro]; "default" = 0; -w Penalidade de deslocamento da armação(algoritmo OOF para blastx) [Número inteiro]; "default" = 0; -t Comprimentodo maior íntron permitido em tblastn para ligação de HSPs (0 incapacita aligação) [Número inteiro]; "default" = 0.
Resultados de alta qualidade são pesquisados usando oalgoritmo de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman. Assim programas àbase dos referidos algoritmos são preferidos. Com vantagem, as comparaçõesde seqüências podem ser feitas com o programa PileUp (J. Mol. Evolution.,25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) oupreferivelmente com os programas Gap e BestFit, que são respectivamentebaseados nos algoritmos de Needleman e Wunsch [J. Mol. Biol. 48; 443-453(1970)] e Smith e Waterman [Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)]. Ambosos programas são parte do pacote de software GCG [Genetics ComputerGroup, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschulet al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 et seq.]. Assim preferivelmente oscálculos para determinar as porcentagens de homologia de seqüência sãofeitos com o programa Gap em toda a faixa de seqüências. Os seguintesajustes padrões para a comparação de seqüências de ácido nucleico foramusados : peso do espaço: 50, peso do comprimento: 3, alinhamento médio:10.000, desalinhamento médio: 0.000.
Para a comparação de seqüências de aminoácido, os mesmosalgoritmos como descritos acima ou seqüências de ácido nucleico podem serusados. Os resultados de alta qualidade são alcançados por uso do algoritmode Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman. Assim programas baseadosnos referido algoritmos são preferidos. Com vantagem as comparações deseqüências podem ser feitas com o programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25,351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou preferivelmentecom os programas Gap e BestFit, que são respectivamente baseados nosalgoritmos de Needleman e Wunsch [J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)] e Smith e Waterman [Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)]. Ambos osprogramas fazem parte do pacote de software GCG - [Genetics ComputerGroup, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschulet al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 et seq.]. Assim preferivelmente oscálculos para determinar as porcentagens de homologia de seqüência sãofeitos com o programa Gap em toda a faixa das seqüências. Os seguintesajustes padrões para a comparação de seqüências de aminoácidos foramusados : peso do espaço: 8, peso do comprimento: 2, alinhamento médio:2.912, desalinhamento médio: -2.003.
Variantes também podem ser englobadas, particularmentevariantes funcionais que podem ser obtidas da seqüência como mostrada natabela I, colunas 4 e 5, por meio de deleção, inserção ou substituição denucleotídeos, a atividade enzimática das proteínas sintéticas derivadas sendoretida ou melhorada.
Uma molécula de ácido nucleico isolada codificando aproteína relacionada com estresse homóloga a uma seqüência de proteínacomo mostrado na tabela II, colunas 4 e 5 pode ser criada por introdução deuma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo em umaseqüência de nucleotídeos, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5 de modoque uma ou mais substituições, adições ou deleções são introduzidas naproteína codificada. Mutações podem ser introduzidos em uma dosseqüências, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, por técnicas padrões,como mutagenese dirigida ao sítio e mutagenese mediada por PCR. Outra viapara a mutagenese de enzimas, descrita na Publicação Européia EP-A-O 909821, é um método usando a cepa de Escherichia coli específica XLl-Red paragerar mutantes e alterar a atividade da enzima.
Preferivelmente, as substituições conservativas de aminoácidosão feitas em um ou mais dos resíduos de aminoácidos não essenciaisprevistos. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que oresíduo de aminoácido é substituído com um resíduo aminoácido tendo acadeia lateral similar.
Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias lateraissimilares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos comcadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeiaslaterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeiaslaterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina,serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo,alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina,triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina,isoleucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina,triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial previstoem uma proteína relacionada com estresse é preferivelmente substituído comoutro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral.
Alternativamente, em outra forma de realização, mutações pode serintroduzidos aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüênciacodificando proteína relacionada com estresse, como por mutagenese desaturação, e os resultantes mutantes podem ser triados para uma atividade deproteína relacionada com estresse descrita aqui para identificar mutantes que retém a atividade de proteína relacionada com estresse ou mostram melhoradaatividade de proteína relacionada com estresse. Após mutagenese de uma dasseqüências de ácido nucleico como mostrado na tabela 1, colunas 4 e 5, opolipeptídeo codificado pode ser expressado recombinantemente e a atividadeda proteína pode ser determinada por análise da tolerância ao estresse de uma planta expressando a proteína, como descrito Exemplos abaixo.
Um método utilizável para verificar o nível de transcrição dogene (um indicado da quantidade de mRNA disponível para tradução noproduto de gene) é realizar um Northern blot (Para referência, Ver, porexemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology,Wiley: New York). Esta informação pelo menos parcialmente demonstra ograu de transcrição do gene transformado. O RNA celular RNA total pode serpreparado de células, tecidos, ou órgãos por vários métodos, todos bemconhecidos na técnica, como que descrito em Bormann, E.R. et al., 1992,Mol. Microbiol. 6:317-326. Para avaliar a presença ou quantidade relativa deproteína traduzida deste mRNA, técnicas padrões, como Western blot, podemsem empregadas. Estas técnicas são bem conhecidas do versado na técnica,(ver, por exemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols in MolecularBiology, Wiley: New York).
A presente invenção também refere-se a um cassete deexpressão de plantas compreendendo um ácido nucleico codificando SRPselecionado dentre o grupo compreendendo, como mostrado na tabela I,colunas 4 e 5, e/ou homólogos ou partes dos mesmos ligados operativamentea seqüências regulatórias e/ou seqüências de marcação.
Outro objeto da invenção é um vetor de expressãocompreendendo um ácido nucleico codificando SRP selecionado dentre ogrupo compreendendo seqüências do ácido nucleico como mostrado na tabelaI, colunas 4 e 5 e/ou homólogos ou partes dos mesmos ou uma cassete deexpressão de plantas como descrito acima, pelo que a expressão do ácidonucleico codificando SRP em uma célula hospedeira resulta em tolerânciaaumentada a estresse ambiental como comparado com uma célula hospedeirade tipo selvagem não transformada correspondente.
A invenção ainda provê um vetor de expressão isoladorecombinante compreendendo um ácido nucleico codificando uma proteínarelacionada com estresse como descrito acima, em que expressão do vetor ouácido nucleico codificando uma proteína relacionada com estresse,respectivamente em uma célula hospedeira, resulta em tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com o tiposelvagem correspondente não transformado de uma célula hospedeira. Comousado aqui, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capazde transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor éum "plasmídeo", que refere-se a um laço de DNA de filamento duplo circularem que os segmentos de DNA adicionais pode ser ligados. Outro tipo de vetoré um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados nogenoma viral. Outros tipos de vetores podem ser seqüências de ácido nucleicolinearizadas, tal como transposons, que são pedaços de DNA que podemcopiar e se inserir sozinhos. Existem 2 tipos de transposons encontrados: ostransposons simples, conhecidos como Seqüências de inserção e transposonscompósitos, que podem ter vários genes assim como os genes que sãorequeridos para a transposição.
Alguns vetores são capazes de replicação autônoma em umacélula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetoresbacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores demamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferosnão epissomais são integrados no genoma da célula hospedeira quando daintrodução em uma célula hospedeira, e assim são replicados junto com ogenoma hospedeiro. Além disso, alguns vetores são capazes de dirigir aexpressão de genes aos quais eles são ligados operativamente. Estes vetoressão referidos aqui como "vetor de expressão". Geralmente, vetores deexpressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão comfreqüência na forma de plasmídeos. No presente relatório, "plasmídeo " e"vetor" podem ser usados de modo interpermutável como o plasmídeo é aforma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção se destina aincluir estas outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (porexemplo, retrovírus defeituosos na replicação, adenovírus, e vírus adeno-associado), que servem a funções equivalentes.
Um cassete de expressão de plantas preferivelmente contémseqüências regulatórias capazes de dirigir a expressão de genes em células deplantas e ligadas operativamente de modo que cada seqüência pode preenchersua função, por exemplo, terminação de transcrição por sinais depoliadenilação. Os preferidos sinais de poliadenilação são os se originando det-DNA de Agrobacterium tumefaciens como o gene 3 conhecido comooctopina sintase do Ti-plasmídeo pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J.3:835) ou equivalentes funcionais do mesmo, mas também todos os outrosterminadores funcionalmente ativos em plantas são apropriados.
Como a expressão do gene de planta é com muita freqüêncianão limitada em níveis de transcrição, um cassete de expressão de plantapreferivelmente contém outras seqüências ligadas operativamente comomelhoradores de tradução como a seqüência over-drive contendo a seqüênciade líder 5'-não traduzida de vírus do mosaico do tabaco melhorando aproteína por relação de RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research15:8693-8711).
A expressão de gene de planta precisa ser ligadaoperativamente a um promotor apropriado conferindo expressão de gene emum modo específica de tempo, célula ou tecido. São preferidos os promotoresdirigindo a expressão constitutiva (Benfey et al., 1989 EMBO J. 8:2195-2202)como os derivados de vírus de plantas como o 35S CaMV (Franck et al., 1980Cell 21:285-294), o 19S CaMV (ver também patente US no. 5352605 ePedido PCT No. WO 8402913) ou promotores de plantas como os dasubunidade pequena Rubisco descrito em patente US no. 4.962.028.
As seqüências regulatórias vantajosas adicionais são, porexemplo, incluídas em promotores de plantas como CaMV/35S [Franck et al.,Cell 21 (1980) 285 - 294], PRPl [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)],SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos ou no promotor de ubiquitina,napina ou faseolina. Também vantajosos nesta conexão são os promotoresindutíveis, tal como os promotores descritos em EP-A-O 388 186 (indutívelpor benzil sulfonamida), Plant J. 2, 1992: 397 - 404 (Gatz et al., indutível porTetraciclina), EP-A-O 335 528 (indutível por ácido abscísico) ou WO93/21334 (indutível por etanol ou ciclohexenol). Os promotores adicionaisutilizáveis de plantas são o promotor FBPase citosólico ou promotor ST-LSIda batata (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), o promotor fosforibosilpirofosfato amido transferase de Glycine max (GeneBank acesso no. U87999)ou o promotor específico como descrito em EP-A-O 249 676. Os promotoresadicionais particularmente vantajosos são promotores específicos de sementeque podem ser usado for monocotilédones ou dicotilédones e são descritos emUS 5.608.152 (promotor napina de colza), WO 98/45461 (promotor faseolinade Arabidopsis), US 5.504.200 (promotor faseolina de Phaseolus vulgaris),WO 91/13980 (promotor Bce4 de Brassica) e Baeumlein et al., Plant J., 2, 2,1992: 233-239 (promotor LEB4 de leguminosa). Os referidos promotores sãoutilizáveis em dicotilédones. Os seguintes promotores são utilizáveis porexemplo em monocotilédones promotor lpt-2- ou lpt-1- de cevada (WO95/15389 e WO 95/23230) ou promotor hordeina de cevada. Outrospromotores utilizáveis são descritos em WO 99/16890.
É possível em princípio usar todos os promotores naturais comsuas seqüências regulatórias como os mencionados acima para o novoprocesso. Também é possível e vantajoso usar, além disso, promotoressintéticos.
A construção de gene pode também compreender outros genesque devem ser inseridos nos organismos e que estão, por exemplo, envolvidosem resistência ao estresse. É possível e vantajoso inserir e expressar emorganismos hospedeiros, genes regulatórios como genes para indutores,repressores ou enzimas que intervém em sua atividade enzimática naregulação, ou um ou mais ou todos os genes de uma via biossintética. Estesgenes podem ser de origem heteróloga ou homóloga. Os genes inseridospodem ter seu próprio promotor ou também sob o controle do mesmopromotor como as seqüências de ácido nucleico, como mostrado na tabela I,colunas 4 e 5 ou seus homólogos.
A construção de gene com vantagem compreende, paraexpressão dos outros genes presentes, adicionalmente as seqüênciasregulatórias 31 e/ou 5' terminais para melhorar a expressão, que sãoselecionadas para expressão ótima dependendo do organismo hospedeiroselecionado e gene ou genes.
Estas seqüências regulatórias são destinadas a fazer aexpressão específica dos genes e a expressão de proteína possível como acimamencionado. Isto pode significar, dependendo do organismo hospedeiro, porexemplo que o gene é expressado ou super-expressado somente após indução,ou que é imediatamente expressado e/ou super-expressado.
As seqüências regulatórias ou fatores podem além dissopreferivelmente ter um efeito benéfico sobre expressão dos genesintroduzidos, e assim aumentar a mesma. É possível, deste modo, para oselementos regulatórios serem melhorados com vantagem no nível detranscrição por uso de sinais de transcrição fortes como promotores e/oumelhoradores. No entanto, além disso, é também possível melhorar a traduçãopor, por exemplo, melhora da estabilidade do mRNA.
Outras seqüências preferidas para uso em cassetes deexpressão de genes de plantas serem seqüências de marcação necessárias paradirigir o produto de gene em seu compartimento de célula apropriado (paraum estudo ver Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sei. 15(4):285-423 ereferências citadas no mesmo), como o vacúolo, o núcleo, todos os tipos deplastídeos como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, o espaçoextracelular, mitocondria, o retículo endoplásmico, corpos de óleo,peroxisomas e outros compartimentos de células de planta.
A expressão do gene de plantas também pode ser facilitada viaum promotor indutível (para estudo, ver Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Biol. 48:89-108). Os promotores quimicamente indutíveis sãoespecialmente apropriados se a expressão dos genes for desejada ocorrer emum modo específico de tempo.
Tabela 1 relaciona vários exemplos de promotores que podemser usados para regular a transcrição das seqüências codificando ácidonucleico de proteína relacionada com estresse.
Tabela 1: Exemplos de promotores específicos de tecido eindutíveis de estresse em plantas
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Outros promotores, por exemplo super-promotor (Ni et al,.,Plant Journal 7, 1995: 661-676), promotor de ubiquitina (Callis et al., J. Biol.Chem., 1990, 265: 12486-12493; US 5,510,474; US 6.020.190; Kawalleck etal., Plant. Molecular Biology, 1993, 21: 673-684) ou promotor 34S (númerosde acesso GenBankM59930 e Xl 6673) são similarmente utilizáveis para apresente invenção e são conhecidos do versado na técnica.
Os promotores preferidos no estágio de desenvolvimento sãopreferivelmente expressados em alguns estágios de desenvolvimento. Ospromotores preferidos de tecido e órgãos incluem os que são preferivelmenteexpressados em alguns tecidos ou órgãos, como folhas, raízes, sementes, ouxilemo. Exemplos de promotores preferidos de tecido e preferidos de órgãosincluem, mas não são limitados a promotores a preferidos de frutas, preferidosde óvulos, preferidos de tecido masculino, preferidos de semente, preferidosde integumentos, preferidos de tubérculos, preferido de talos, preferidos depericarpo, preferidos de folha, preferidos de estigma, preferidos de pólen,preferidos de antero, preferidos de pétalas, preferidos de sépalas, preferidosde pedicelos, preferidos de sílicas, preferidos de hastes, preferidos de raízes eoutros. Promotores preferidos de semente são preferivelmente expressadosdurante o desenvolvimento da semente e/ou germinação. Por exemplo, promotores preferidos de semente podem ser preferidos de embrião,preferidos de endosperma, e preferidos da capa da semente Ver Thompson etal., 1989, BioEssays 10:108. Exemplos de promotores preferidos de sementeincluem, mas não são limitadas a, celulose sintase (celA), Ciml, gama-zeina,globulina-1, zeína de milho de 19 kD (cZ19Bl), e outros.
Outros promotores utilizáveis nos cassetes de expressão dainvenção incluem, mas não são limitadas a, promotor de proteína de ligaçãode clorofila a/b, promotores de histona, o promotor Ap3, o promotor β-conglicina, o promotor de napina, o promotor de lectina de soja, o promotorde zeína de milho 15kD, o promotor de zeína 22kD, o promotor de zeína27kD, o promotor de g-zeína, os promotores cerosos, shrunken 1, shrunken 2,e bronze, o promotor Zml3 (patente US No. 5.086.169), o promotor depoligalacturonase de milho (PG) (patente US Nos. 5.412.085 e 5.545.546), e opromotor SGB6 (patente US No. 5.470.359), assim como outros promotoressintéticos e naturais.
A flexibilidade adicional no controle de expressão de genesheterólogos em plantas pode ser obtida por uso de domínios de ligação deDNA e elementos de resposta de fontes heterólogas (isto é, domínios deligação de DNA de fontes não de planta). Um exemplo deste domínio deligação de DNA heterólogo é o domínio de ligação de DNA LexA (Brent ePtashne, 1985, Cell 43:729-736).
A invenção ainda provê um vetor de expressão recombinantecompreendendo uma molécula de DNA de SRP da invenção clonada em vetorde expressão em uma orientação anti-sentido. Isto é, a molécula de DNA éligada operativamente a uma seqüência regulatória em um modo que permitea expressão (por transcrição da molécula de DNA) de uma molécula de RNAque é anti-sentido a um mRNA de SRP. As seqüências regulatórias ligadasoperativamente a uma molécula de ácido nucleico clonada na orientação anti-sentido podem ser selecionadas que dirigem a expressão contínua de moléculade RNA anti-sentido em uma variedade de tipos de célula. Por exemplo,promotores e/ou melhoradores virais ou seqüências regulatórias podem serselecionadas que dirigem uma expressão constitutiva direta, específica paratecido, ou de tipo de célula de RNA anti-sentido. O vetor de expressão anti-sentido pode estar na forma de plasmídeo recombinante, fagemídeo ou vírusatenuado em que os ácidos nucleicos anti-sentido são produzidos sob ocontrole de região regulatória de eficiência elevada. A atividade da regiãoregulatória pode ser determinada pelo tipo de célula, em que o vetor éintroduzido. Para uma discussão da regulação de expressão de gene usandogenes anti-sentido, ver Weintraub, H. et al., 1986, Anti-sense RNA as amolecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1), eMol et al., 1990, FEBS Letters 268:427-430.
Outro aspecto da invenção pertence a células hospedeiras emque o vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Ostermos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados demodo interpermutável aqui. Entende-se que estes termos não se referemsomente à célula em questão particular mas que também se aplicam àprogênie ou progênie potencial desta célula. Porque algumas modificaçõespodem ocorrer em gerações sucessivas devido ou a mutação ou influênciasambientais, esta progênie pode, de fato, ser idêntica à célula parental, masainda estão incluídos dentro do escopo do termo como usado aqui. A célulahospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo,uma SRP pode ser expressada em células bacterianas como C. glutamicum,levedura, E. coli, células de insetos, células de fungos, ou células demamíferos (como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou célulasCOS), algas, ciliatos, células de planta, fungos, ou outros microorganismoscomo C. glutamicum. Outras células hospedeiras apropriadas são conhecidasdo versado na técnica.
Uma célula hospedeira da invenção, como uma célulahospedeira procariótica ou eucariótica em cultura, pode ser usada paraproduzir (isto é, expressar) uma SRP. Assim, a invenção ainda provê métodospara produzir SRPs usando as células hospedeiras da invenção. Em umaforma de realização, o método compreende cultivar a célula hospedeira deinvenção (em que um vetor de expressão recombinante codificando um SRPfoi introduzido, ou em cujo genoma foi introduzido um gene codificando umaSRP de tipo selvagem ou alterada) em um meio apropriado até SRP serproduzida. Em outra forma de realização, o método ainda compreende isolarSRPs do meio ou da célula hospedeira.
Outro aspecto da invenção pertence aos isolados de SRP, esuas porções biologicamente ativas. Um polipeptídeo "isolado" ou"purificado" ou porção biologicamente ativa porção do mesmo é livre dealgum do material celular quando produzido por técnicas de DNArecombinantes, ou precursores químicos ou outros produtos químicos quandoquimicamente sintetizados. A expressão "substancialmente livre de materialcelular" inclui preparações de SRP em que o polipeptídeo é separado dealguns dos componentes celulares das células em que ele é produzidonaturalmente ou recombinantemente. Em uma forma de realização, aexpressão "substancialmente livre de material celular" inclui preparações deuma SRP tendo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de material nãoSRP (também referido aqui as a "polipeptídeo contaminante"), maispreferivelmente menos do que cerca de 20% de material não SRP, ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 10% de material não SRP, e o maispreferivelmente menos do que cerca de 5% material não SRP.
Quando SRP ou porção biologicamente ativa da mesma éproduzida recombinantemente, ela é também preferivelmentesubstancialmente livre de meio de cultura, isto é, meio de cultura representamenos do que cerca de 20%, mais preferivelmente menos do que cerca de10%, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5% do volume dapreparação de polipeptídeo. A expressão "substancialmente livre deprecursores químicos ou outros químicos" inclui preparações de SRP em queo polipeptídeo é separado de precursores químicos ou outros químicos queestão envolvidos na síntese do polipeptídeo. Em uma forma de realização, aexpressão "substancialmente livre de precursores químicos ou outrosquímicos" inclui preparações de uma SRP tendo menos do que cerca de 30%(em peso seco) de precursores químicos ou químicos não SRP, maispreferivelmente menos do que cerca de 20% de precursores químicos ouquímicos não SRP, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10%de precursores químicos ou químicos não SRP, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5% precursores químicos ou químicos não SRP. Emformas de realização preferidas, polipeptídeos isolados, ou suas porçõesbiologicamente ativas, faltam polipeptídeos contaminantes do mesmoorganismo do qual a SRP é derivada. Tipicamente, estes polipeptídeos sãoproduzidos por expressão recombinante de, por exemplo, uma SRP deSaccharomyces eerevisiae, E.coli ou Brassiea napus, Glyeine max, Zea mays,Tritieum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeum vulgare, Helianassim annuus,Linum usitatissimum em plantas diferentes de Saccharomyees eerevisiae, E.coli ou microorganismos como C. glutamieum, ciliatos, algas, ou fungos.
As moléculas de ácido nucleicos, polipeptídeos, homólogos depolipeptídeo, polipeptídeos de fusão, iniciadores, vetores, e célulashospedeiras descritas aqui podem ser usadas em um ou mais dos seguintesmétodos: identificação de Saccharomyees eerevisiae, E.coli ou Brassieanapus, Glyeine max, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa ouHordeum vulgare, Helianassim annuus, Linum usitatissimum e organismosrelacionados; mapeamento de genomas de organismos relacionados comSaccharomyces eerevisiae, E.eoli, identificação e localização de seqüênciasde interesse de Saccharomyees eerevisiae, E.eoli ou Brassiea napus, Glyeinemax, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeum vulgare,Helianassim annuus, Linum usitatissimum; estudos evolucionários;determinação de regiões de SRP requeridas para função; modulação de umaatividade de SRP; modulação do metabolismo de uma ou mais funções decélula; modulação de transporte de transmembrana de um ou mais compostos;modulação de resistência ao estresse; e modulação de expressão de ácidosnucleicos de SRP.
As moléculas de ácido nucleico de SRP da invenção sãotambém utilizáveis para estudos estruturais evolucionários e de polipeptídeos.Os processos metabólicos e de transporte em que as moléculas da invençãoparticipam são utilizados por uma ampla variedade de células procarióticas eeucarióticas; por comparação das seqüências das moléculas de ácido nucleicoda presente invenção para as codificando enzimas similares de outrosorganismos, o parentesco evolucionário dos organismos pode ser avaliado.Similarmente, esta comparação permite uma avaliação de quais regiões daseqüência são conservadas e quais não são, que pode ajudar na determinaçãodas regiões do polipeptídeo que são essenciais para o funcionamento daenzima. Este tipo de determinação é de valor para os estudos de engenharia depolipeptídeos e pode dar uma indicação de qual polipeptídeo pode tolerar emtermos de mutagenese sem perder a função.
A manipulação das moléculas de ácido nucleico de SRP dainvenção pode resultar na produção de SRPs tendo diferenças funcionais dasSRPs de tipo selvagem. Estes polipeptídeos podem ser melhorados emeficiência ou atividade, podem estar presentes em maiores números na célulado que é comum ou podem ser diminuídos em eficiência ou atividade.
Existem vários mecanismo s em que a alteração de uma SRPda invenção pode diretamente afetar a resposta a estresse e/ou tolerância aestresse. No caso de plantas expressando SRPs, transporte aumentado podelevar a melhorada divisão de sal e/ou soluto dentro do tecido e órgãos dasplantas. Ou aumentando o número ou a atividade das moléculas detransportador que exportam moléculas iônicas da célula, pode ser possívelafetar a tolerância a sal da célula.
O efeito da modificação genética em plantas, C. glutamicum,fungos, algas, ou ciliatos sobre a tolerância ao estresse pode ser avaliado porcultivo do microorganismo ou planta modificada sob condições menores doque as apropriadas e então analisando as características de e crescimento e/oumetabolismo da planta. Estas técnicas de análise são bem conhecidas de umversado na técnica, e incluem peso seco, peso úmido, síntese de polipeptídeo,síntese de carboidrato, síntese de lipídeos, taxas de evapotranspiração,rendimento geral da planta e/ou cultura, florescência, reprodução, fixação dassementes, crescimento da raiz, taxas de respiração, taxas de fotossíntese, etc.(Applications of HPLC in Biochemistry em: Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al., 1993Biotechnology, vol. 3, Cap. III: Product recovery and purification, página469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al., 1988, Bioseparation: upstreamprocessing for biotechnology, John Wiley e Sons; Kennedy, J.F. e Cabral,J.M.S., 1992, Recovery processes for biological materiais, John Wiley e Sons;Shaeiwitz, J.A. e Henry, J.D., 1988, Biochemical separations, em: Ulmann'sEncyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Cap. 11, página 1-27, VCH:Weinheim; e Dechow, F.J., 1989, Separation and purification techniques inbiotechnology, Noyes Publications).
Por exemplo, vetores de expressão de leveduracompreendendo os ácidos nucleicos relatados aqui, ou seus fragmentos,podem ser construídos e transformados em Saccharomyces eerevisiae usandoprotocolos padrões. As células transgênicas resultantes podem ser entãotestadas para falha ou alteração de sua tolerância a estresses de seca, sal, etemperatura. Similarmente, vetores de expressão de planta compreendendo osácidos nucleicos relatados aqui, ou seus fragmentos, podem ser construídos etransformados em uma célula de planta apropriada, como Arabidopsis, soja, colza, milho, trigo, Medicago truncatula, etc., usando protocolos padrões. Ascélulas transgênicas resultantes e/ou plantas derivadas das mesmas podem serentão testadas para falha ou alteração de sua tolerância a estresses de seca, sal,e temperatura e alojamento.
A engenharia de um ou mais genes de SRP da invenção pode também resultar em SRPs tendo atividades alteradas, que indiretamenteimpactam a resposta ao estresse e/ou tolerância ao estresse de algas, plantas,ciliatos, ou fungos, ou outros microorganismos como C. glutamicum. Porexemplo, os processos bioquímicos normais de metabolismo resultam naprodução de uma variedade de produtos (por exemplo, peróxido de hidrogênio e outras espécies de oxigênio reativas), que podem interferirativamente com estes mesmos processos metabólicos. Por exemplo,peroxinitrita é conhecida para cadeias laterais de nitrato tirosina, assiminativando algumas enzimas tendo tirosina no sítio ativo (Groves, J.T., 1999,Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2):226-235). Apesar destes produtos serem tipicamente excretados, as células pode ser geneticamente alteradas paratransportar mais produtos do que é típico para uma célula de tipo selvagem.Por otimização da atividade de uma ou mais SRPs da invenção que estãoenvolvidas na exportação de moléculas específicas, como moléculas de sal,pode ser possível melhorar a tolerância ao estresse da célula.
Adicionalmente, as seqüências relatadas aqui, ou seusfragmentos, podem ser usadas para gerar mutações de nocaute nos genomasde vários organismos, como bactérias, células de mamíferos, células delevedura, e células de planta (Girke, T., 1998, A plant Journal 15:39-48). Asresultantes células de nocaute podem ser então avaliadas por sua capacidadeou habilidade de tolerar as condições de estresse, sua resposta a váriascondições de estresse e seu efeito sobre o fenótipo e/ou genótipo da mutação.Para outros métodos de inativação de genes, ver patente US No. 6.004.804"Non-Chimeric Mutational Vectors " e Puttaraju et al., 1999, Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, NatureBiotechnology 17:246-252.
As estratégias de mutagenese acima mencionadas para SRPsresultando tolerância aumentada ao estresse não significam ser limitativas;variações nestas estratégias são prontamente evidentes para o versado.Usando estas estratégias e incorporando os mecanismos relatados aqui, asmoléculas de ácido nucleico e polipeptídeo da invenção podem ser usadaspara gerar algas, ciliatos, plantas, fungos ou outros microorganismos como C.glutamicum expressando moléculas de polipeptídeo e ácido nucleico dePKSRP mudadas, de modo que a tolerância ao estresse é melhorada.
A presente invenção também provê anticorpos queespecificamente ligam a uma SRP, ou uma porção da mesma, comocodificada pelo ácido nucleico descrito aqui. Anticorpos podem ser feitos pormuitos métodos bem conhecidas (ver, por exemplo, Harlow e Lane,"Antibodies; A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, New York, (1988)). Brevemente, o antígeno purificado podeser injetado em um animal em uma quantidade e em intervalos suficientespara elicitar uma resposta imune. Anticorpos podem ser ou purificadosdiretamente, ou células de baço podem ser obtidas do animal. As célulaspodem então ser fusionadas com uma linhagem de célula imortal e tríadaspara secreção do anticorpo. Os anticorpos podem ser usados para triarbibliotecas de clones de ácido nucleico para as células secretarem o antígeno.Estes clones positivos podem ser então sequenciados (ver, por exemplo, Kellyet al., 1992, Bio/Technology 10:163-167; Bebbington et al., 1992,Bio/Technology 10:169-175).As expressões "liga seletivamente" e "liga especificamente"com o polipeptídeo referem-se a uma reação de ligação que é determinativada presença do polipeptídeo em uma população heterogênea de polipeptídeose outros biológicos. Assim, sob condições de imunotestes projetadas, osanticorpos especificados ligados a um polipeptídeo particular não ligam emuma quantidade significante para outros polipeptídeos presentes na amostra.A ligação seletiva de um anticorpo sob estas condições pode requerer umanticorpo que é selecionado por sua especificidade para um polipeptídeoparticular. Vários formatos de imunoteste podem ser usados para selecionaranticorpos que seletivamente ligam com um polipeptídeo particular. Porexemplo, os imunotestes ELISA em fase sólida são usados como rotina paraselecionar anticorpos seletivamente imunorreativos com um polipeptídeo. VerHarlow e Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring HarborPublications, New York3 (1988), para uma descrição de formâtos d.eimunoteste e condições que podem ser usadas para determinar a ligaçãoseletiva.
Em alguns casos, é desejável preparar os anticorposmonoclonais de vários hospedeiros. Uma descrição de técnicas para prepararestes anticorpos monoclonais pode ser encontrada em Stites et al., eds., "Basicand Clinicai Immunology," (Lange Medicai Publications, Los Altos, Calif.,4a. Ed.) e referências citadas no mesmo, e em Harlow e Lane "Antibodies, ALaboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988.
A expressão de genes em plantas é regulada pela interação defatores de transcrição de proteína com seqüências de nucleotídeos específicasdentro da região regulatória de um gene. Um tipo comum de fator detranscrição contém motivos de dedo de zinco (ZF). Cada módulo ZF temaproximadamente 30 aminoácidos de comprimento duplicados em torno doíon zinco. O domínio de reconhecimento de DNA de uma proteína ZF é umaestrutura α-hélice que insere na ranhura principal da hélice dupla de DNA. Omódulo contém três aminoácidos que ligam ao DNA com cada aminoácidocontatando um único par de bases na seqüência de DNA de marcação. Osmotivos de ZF são dispostos em um modo de repetição modular para formarum conjunto de dedos que reconhecem uma seqüência de NA contígua. Porexemplo, um motivo de ZF de três dedos irá reconhecer 9 bp de DNA.Centenas de proteínas foram demonstradas como contendo motivos de ZFcom entre 9 e 37 módulos de ZF em cada proteína (Isalan M5 et al., 1998Biochemistry 37(35): 12026-33; Moore M, et al., 2001 Proc. Natl. Acad. Sei.USA 98(4): 1432-1436 e 1437-1441; patentes US 6007988 e US 6013453).
A região regulatória de um gene de planta contém muitasseqüências curtas de DNA (elementos cis-atuantes) que servem comodomínios de reconhecimento para fatores de transcrição, incluindo proteínasZF. Os domínios de reconhecimento similares em genes diferentes permitema expressão coordenada de vários genes codificando enzimas em uma via metabólica por fatores de transcrição comuns. A variação nos domínios dereconhecimento dentre os membros de uma família de genes facilita asdiferenças em expressão de genes dentro da mesma família de genes, porexemplo, dentre tecidos e estágios de desenvolvimento e em resposta acondições ambientais.
As proteínas de ZF típicas contém não apenas um domínio dereconhecimento de DNA mas também um domínio funcional que permite quea proteína ZF ative ou reprima a transcrição de um gene específico.Experimentalmente, um domínio de ativação foi usado para ativar atranscrição do gene alvo de marcação (patente US 5789538 e pedido depatente W09519431), mas é também possível ligar um domínio de repressorde transcrição para o ZF e assim inibir a transcrição (pedidos de patentesWOOO/47754 e W02001002019). Foi também relatado que uma funçãoenzimática, como clivagem de ácido nucleico, pode ser ligada ao ZF (pedidode patente WO00/20622)A invenção provê um método que permite ao versado natécnica isolar a região regulatória de um ou mais genes codificando umaproteína relacionada com estresse do genoma de uma célula de planta eprojetar fatores de transcrição de dedo de zinco ligados a um domíniofuncional que irá interagir com a região regulatória do gene. A interação daproteína de dedo de zinco com o gene de planta pode ser projetada em talmodo para alterar a expressão do gene e preferivelmente assim alterar aatividade metabólica para conferir uma tolerância aumentada (ou diminuída)de estresse abiótico tal como seca. A invenção provê um método de produziruma planta transgênica com um transgene codificando este fator detranscrição projetado, ou alternativamente um fator de transcrição natural, quemodifica a transcrição da proteína relacionada com estresse, particularmentegene da proteína relacionada com estresse para proporcionar uma tolerânciaaumentada ao estresse ambiental. Esta regulação de genes de planta por dedosde zinco polidactil artificiais foi demonstrada por Ordiz et al.(Regulagion oftransgene Expression in plants with polidactyl zinc finger transcriptionfactors, Ordiz et ai., PNAS, 99 (20) 13290-13295, 2002) ou Guan et al.(Hertiable engogenous gene regulation in plants with designed polidactyl zincfinger transcription factos, PNAS, Vol. 99 (20), 13296-13301 (2002)).
Em particular, a invenção provê um método de produzir aplanta transgênica com um ácido nucleico codificando uma proteínarelacionada com estresse, em que a expressão do(s) ácido(s) nucleico(s) emuma planta resulta em tolerância a estresse ambiental aumentada comocomparado com uma planta de tipo selvagem compreendendo: (a) transformaruma célula de planta com um vetor de expressão compreendendo um ácidonucleico codificando uma proteína relacionada com estresse, e (b) gerar apartir da célula de planta, uma planta transgênica com uma tolerância aestresse ambiental aumentada como comparado com uma planta de tiposelvagem Para esta transformação da planta, vetores binários, tal comopBinAR, podem ser usados (Hõfgen e Willmitzer, 1990 Plant Science 66:221-230). Além disso vetores binários apropriados são por exemplo pBIN19,pBIlOl, pGPTV ou pPZP (Hajukiewicz, P. et al., 1994, Plant Mol. BioL5 25:989-994).
A construção dos vetores binários pode ser realizada porligação do cDNA no T-DNA. 5' para o cDNA, um promotor de planta ativa atranscrição do cDNA. Uma seqüência de poliadenilação está localizada 3'para o cDNA. A expressão específica de tecido pode ser alcançada por uso deum promotor específico de tecido como descrito acima. Também, qualqueroutro elemento de promotor pode ser usado. Para a expressão constitutivadentro da planta completa, o promotor de CaMV 35S pode ser usado. Aproteína expressada pode ser marcada para um compartimento celular usandoum peptídeo de sinal, por exemplo para plastídeos, mitocondrias ou retículoendoplásmico (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sei. 4(15):285-423). Opeptídeo de sinal é clonado 5' em quadro para o cDNA para armazenar alocalização subcelular da proteína de fusão. Adicionalmente, promotores quesão responsivos a estresses abióticos podem ser usados com, tal como opromotor de Arabidopsis RD29A. Um versado na técnica irá reconhecer que opromotor usado deve ser ligado operativamente ao ácido nucleico de modoque o promotor provoque a transcrição do ácido nucleico que resulta emsíntese de um mRNA que codifica um polipeptídeo.
Os métodos alternativos de transfecção incluem a transferênciadireta de DNA em flores em desenvolvimento via eletroporação outransferência de genes mediada por Agrobactérias. A transformação da plantamediada por agrobactérias pode ser realizada usando por exemploGV3101 (pMP90) (Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) oucepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (OOms et al, Plamid, 1982, 7,15-29; Hoekema et al, Nature, 1983, 303: 179-180). Transformação pode serrealizada por técnicas padrões de transformação e regeneração (Deblaere etal., 1994, Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton Β. e Schilperoort,Robert A, Plant Biology molecular Manual, 2a Ed. - Dordrecht: KluwerAcademic Publ., 1995. - em Seet., Ringbue Zentrale Signatur: BTll-P ISBN0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plantmolecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993 360 S.,ISBN 0-8493-5164-2). Por exemplo, semente de colza pode ser transformadavia transformação de cotilédone ou hipocótile (Moloney et al., 1989, PlantCell Reports 8:238-242; De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91:694-701).Uso de antibióticos para agrobactérias e seleção de plantas depende do vetorbinário e a cepa de Agrobacterium usada para transformação. A seleção desemente de colza é normalmente realizada usando canamicina como marcadorde planta apropriado. A transferência de genes mediada por agrobactérias emlinhn pode ser realizada usando, por exemplo, uma técnica descrita porMlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente,transformação de soja pode ser realizada usando por exemplo uma técnicadescrita em patente européia No. 0424 047, patente US No. 5.322.783,patente européia No. 0397 687, patente US No. 5.376.543, ou patente US No.5.169.770. Transformação de milho pode ser obtida por bombardeio departículas, absorção de DNA mediada por polietileno glicol, ou via técnica defibra de carboneto de silício, (ver, por exemplo, Freeling e Walbot "Themaize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7).Um exemplo específico de transformação de milho é encontrado em patenteUS No. 5.990.387, e um exemplo específico de transformação de trigo podeser encontrado em Pedido PCT No. WO 93/07256.
As moléculas de ácido nucleico codificando proteínarelacionada com estresse da invenção tem vários usos. Mais importante, asseqüências de ácido nucleico e de aminoácido da presente invenção podemser usadas para transformar células de planta ou plantas, assim induzindotolerância a estresses, tal como seca, salinidade elevada e frio. A presenteinvenção assim provê uma planta transgênica transformada por um ácidonucleico codificando uma proteína relacionada com estresse (codificando ouanti-sentido), em que a expressão da seqüência de ácido nucleico em umaplanta resulta em tolerância aumentada a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem. A tolerância aumentada a estresse éevidente como um aumento no rendimento ou qualidade da planta. A plantatransgênica pode ser uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea ou umaplanta gimnosperma. A invenção ainda provê que a planta transgênica podeser selecionada dentre milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, borragem, cártamo, linhaça, prímula, colza, canolae nabo selvagem, mandioca, pimentão, girassol, tagetes, plantas solanáceas,tal como batata, tabaco, berinjela e tomate, espécies Vicia, ervilha, alfalfa,plantas de arbustos tal como café, cacau, chá, espécie Salix, árvores tal comopalma oleígena, coco, grama perene, tal como azévem e festuca, e culturas de forragem, tal como alfalfa e trevo e Arabidopsis thaliana. Ainda a plantatransgênica pode ser selecionada dentre abeto, pinheiro ou pinheiroamericano, por exemplo.
Em particular, a presente invenção descreve o uso daexpressão de proteínas relacionadas com estresse para engenheirar plantastolerantes a seca, tolerantes a sal e/ou tolerantes ao frio. Esta estratégia foiaqui demonstrada para Arabidopsis thaliana, azévem, alfalfa, Colza/Canola,soja, milho e trigo, mas sua aplicação não é limitada a estas plantas. Assim, ainvenção provê uma planta transgênica contendo um gene codificando umaproteína relacionada com estresse selecionada dentre o ácido nucleico, como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5, e/ou homólogos das seqüências acimamencionadas, em que o estresse ambiental é seca, sal aumentado outemperatura diminuída ou aumentada, mas sua aplicação não é limitada aestes meios ambientes adversos. A proteção contra outras condições adversastal como calor, poluição do ar, metais pesados, e agentes tóxicos químicos,por exemplo, pode ser obtida. Em formas de realização preferidas, o estresseambiental é seca.
A presente invenção também provê métodos de modificar atolerância a estresse de uma planta compreendendo modificar a expressão deum gene codificando uma proteína relacionada com estresse na planta. Ainvenção provê que este método pode ser realizado de modo que a tolerânciaa estresse é aumentada. Isto pode ser feito, por exemplo, pelo uso de fatoresde transcrição. Em particular, a presente invenção provê métodos de produzira planta transgênica tendo uma tolerância a estresse ambiental aumentadacomo comparado com uma planta de tipo selvagem devido à expressãoaumentada de uma proteína relacionada com estresse na planta.
O crescimento das plantas modificadas sob condições deestresse e então triagem e análise das características de crescimento e/ouatividade metabólica avaliam o efeito da modificação genética em plantassobre a tolerância e/ou resistência a estresse. Estas técnicas de análise sãobem conhecidas de um versado na técnica. Elas incluem após a triagem(Rõmpp Lexikon Biotechnologie, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag1992, "screening" p. 701) peso seco, peso úmido, síntese de polipeptídeo,síntese de carboidrato, síntese de lipídeos, taxas de evapotranspiração,rendimento geral da planta e/ou cultura, florescência, reprodução, fixação dassementes, crescimento da raiz, taxas de respiração, taxas de fotossíntese, etc.(Applications of HPLC in Biochemistry em: Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al., 1993Biotechnology, vol. 3, Cap. III: Product recovery and purification, página469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al., 1988, Bioseparation:downstream processing for biotechnology, John Wiley e Sons; Kennedy, J.F.e Cabral, J.M.S., 1992, Recovery processes for biological materiais, JohnWiley e Sons; Shaeiwitz, J.A. e Henry, J.D., 1988, Biochemical separations,em: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Cap. 11, página1-27, VCH: Weinheim; e Dechow, FJ., 1989, Separation and purificationtechniques in biotechnology, Noyes Publications).
A engenharia de um ou mais dos genes codificando proteínarelacionada com estresse da invenção também pode resultar em proteínasrelacionadas com estresse tendo atividades alteradas que indiretamenteimpactam a resposta ao estresse e/ou tolerância a estresse de plantas. Porexemplo, os processos bioquímicos normais de metabolismo resultam naprodução de uma variedade de produtos (por exemplo, peróxido dehidrogênio e outras espécies de oxigênio reativas), que podem interferirativamente com estes mesmos processos metabólicos (por exemplo,peroxinitrita é conhecida para reagir com cadeias laterais de tirosina, assiminativando algumas enzimas tendo tirosina no sítio ativo (Groves, J.T., 1999,Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2):226-235). Por otimização da atividade de umaou mais proteínas relacionadas com estresse (enzimas) da invenção pode serpossível melhorar a tolerância ao estresse da célula.
Em todo este pedido, várias publicações são mencionadas. Asdescrições de todas estas publicações e as referências citadas nestaspublicações em suas totalidades são aqui incorporadas por referência nestepedido a fim de descrever mais completamente o estado da técnica à qual estainvenção pertence.
Deve-se entender também que o acima refere-se às formas derealização preferidas da presente invenção e que numerosas mudanças podemser feitas sem sair do escopo da invenção. A invenção é ainda ilustrada pelosseguintes exemplos, que não devem ser construídos em qualquer modo comolimitativo. Ao contrário, será claramente entendido que várias outras formasde realização, modificações, e seus equivalentes, que, após leitura dadescrição aqui, podem se apresentar para os versados na técnica sem sair doespírito da presente invenção e/ou o escopo das reivindicações anexas.
A invenção também pertence ao uso de ácido nucleicocodificando SRP selecionado dentre o grupo compreendendo o ácido nucleicocomo mostrado na tabela I, colunas 4 e 5 e/ou homólogos das seqüênciasacima mencionadas para preparar uma célula de planta com aumentadatolerância a estresse ambiental. As referidas seqüências também podem serusadas para preparar uma planta com tolerância a estresse ambientalaumentada.
O objeto da invenção é ainda o uso de tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental e/ou um ácido nucleicocodificando SRP selecionado dentre o grupo de seqüências do ácido nucleico como mostrado na tabela 1, colunas 4 e 5 e/ou homólogos das seqüênciasacima mencionadas ou partes das mesmas como marcadores para seleção deplantas com aumentada tolerância a estresse ambiental ou como marcadorespara detecção de estresse em plantas ou células de plantas.
Exemplo 1
Engenharia de plantas Arabidopsis tolerantes a estresse por super-expressão de genes de proteína relacionados com estresse.Clonagem de gene e transformação de Arabidopsis thaliana
Ampliflcação
O protocolo padrão de extração de RNA (Qiagen) e produçãode cDNA (Invitrogen) é usado para o procedimento de isolamento de RNA detecidos diferentes de Brassica napus, Glycine max, Zea mays ou Oryza sativae síntese de seu respectivo cDNA.
O protocolo padrão de polimerase de Pfu DNA ou umamistura de polimerase de Píu/Taq DNA (Herculase) foi usado para o procedimento de amplificação. Fragmentos de ORF amplificados foramanalisador por eletroforese de gel. Cada iniciador consiste de umaextremidade 5 ^ universal e extremidade 3Λ específica de ORF por meio doqual as seqüências universais diferem dos iniciadores dianteiro e reverso(seqüência de iniciador dianteiro contém um EcoRI de levedura ou SmaI deE.coli e a seqüência de iniciador reverso um SmaI de levedura ou SacI de sítiode restrição de E.coli) permitindo geralmente um sucesso de clonagemunidirecional.
Amplificação usando o protocolo de polimerase de DNA Pfuou Herculase (Stratagene). Condições: tampão Ix PCR, 0,2 mM dNTP, 100ng de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae (S288C) ou 60 ng de Κ-12 de DNA genômico de Escherichia coli (MG 1655), 25 pmol de iniciadordianteiro, 25 pmol de iniciador reverso, 2,5 u de Polimerase de DNA Pfu ouHerculase. 1° ciclo de 3" para levedura de T para E.coli a 94 °C, seguido por25 ciclos de 30" a 94 °C, 30" 55°C para levedura ou 60°C para E.coli e 5-6'72 °C, seguido por 1 ciclo de 61 O^ a 72 °C, final de 4 0C a oo.
Seqüências de iniciador dianteiro e reverso usadas paraamplificação de ORF são mostradas na tabela III
Preparação de Vetor
O vetor binário preferido IbxbigResgen para levedura eIbxSuperCoLic para E.coli, que é baseado na estrutura dorsal principal devetor binário de pPZP modificado (compreendendo o gene de canamicinapara seleção bacteriana; Hajukiewicz, P. et al., 1994, Plant Mol. Biol., 25:989-994) transportou o gene bar de marcador de seleção (De Block et al.,1987, EMBO J. 6, 2513-2518) dirigido pelo promotor de mas 1' (Velten et al.,1984, EMBO J. 3, 2723-2730; Mengiste, Amedeo e Paszkowski, 1997, PlantJ., 12, 945-948) em seu T- DNA. Além disso, o T- DNA continha o 35Sduplo forte (Kay et al., 1987, Science 236, 1299-1302) para levedura ou Superpromotor (Ni et al., 1995, Plant Journal 7, 661-676) de E.coli na borda de umcassete de clonagem seguido pelo terminador nos (Depicker A. Stachel S.Dhaese P. Zambryski P. Goodman HM. Nopaline synthase: transcriptmapping and DNA sequence. Journal of Molecular & Applied Genetics.
l(6):561-73, 1982.). O cassete de clonagem consiste da seguinte seqüência:
5'-TTG CTC TTC CAT GGC AAT GAT TAA TTA ACG AAGAGC ΑΑ-3'.
"Levedura: 5'- GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCAATTCCCGGGGATC-3 ou
E.coli: 5"-TTG CTC TTC CAT GGC AAT GAT TAA TTA ACGAAG AGC AA-3', respectivamente.
Outros sistemas marcadores de seleção, como o marcador deAHAS ou outros promotores, por exemplo superpromotor (ver acima),promotor de 35S (ver acima), Promotor de ubiquitina(Callis et al., J. Biol.Chem., 1990, 265: 12486-12493; US 5,510,474; US 6,020,190; Kawalleck etal., Plant. Molecular Biology, 1993, 21: 673-684) ou promotor de 34S(números de acesso GenBankM59930 e Xl 6673) foram similares úteis para apresente invenção e são conhecidos do versado na técnica. O vetor foilinearizado com EcoR e SmaI de levedura ou SmaI e SacI de E.coli usando oprotocolo padrão fornecido pelo fabricante (MBI Fermentas, Alemanha) epurificado usando colunas de Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemanha).
Ligação e transformação
Fragmentos de ORF presentes 100 ng) foram digeridos porEcoRI e SmaI para levedura e SmaI e SacI para E.coli usando o protocolopadrão fornecido pelo fabricante (MBI Fermentas, Alemanha), purificadosusando Colunas de Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemanha) e foram ligados nocassete de clonagem dos sistemas de vetor binário (~ 30 ng) usandoprocedimentos padrões (Maniatis et al.).
No caso de sítios de restrição de EcoRI, SmaI e SacI internosum procedimento de clonagem de extremidade obtusa foi aplicado. Osfragmentos de ORF não digeridos foram diretamente purificados e ligados nocassete de clonagem do vetor binário. Nesse caso o sítio de EcoRI foireabastecido por reação de Klenow e a polimerase de Pfu DNA obtusa de sítiode Saci.
Produtos de ligação foram transformados no E.coli(DH5alpha) usando um protocolo de choque térmico padrão (Maniatis et al.).Colônias transformadas foram cultivadas em meio de LB e selecionadas porrespectiva "antibiótica" (Km) durante 16h a 37 °C. Clones positivos foramidentificados por reações de PCR de controle usando uma combinação de umvetor específico e os respectivos iniciadores específicos de ORF.Preparação de plasmídeo
DNA plasmídeo foi preparado de clones positivos usandoprotocolos padrões (Qiagen Hilden, Alemanha).Transformação de Agrobacteria
Plasmídeos foram transformados em Agrobacteriumtumefaciens (GV3101pMP90; Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) usando protocolos choque térmico ou eletroporação. Colôniastransformadas foram cultivadas em meios de cultura de YEP e selecionadaspor respectivos antibióticos (Rif/Gent/Km) durante 2d a 28 °C. Estas culturas de Agrobacterium foram usadas para a transformação da planta.
Arabidopsis thaliana foi cultivada e transformada de acordocom condições padrões Bechtold 1993 (Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G.1993. A transferência de genes mediada por Agrobacterium in planta porinfiltração de plantas de Arabidopsis thaliana C.R. Acad.Sci.Paris. 316:1194-1199); Bent et al. 1994 (Bent, A., Kunkel, B.N., Dahlbeck, D., Brown, K.L.,Schmidt5 R., Giraudat, J., Leung, J., e Staskawicz, B.J. 1994; PPCS2 ofArabidopsis thaliana: A leucin-rich repeat class of plant disease resistantgenes; Science 265: 1856-1860).
Plantas transgênicas de A. thaliana foram cultivadas individualmente em vasos contendo uma mistura de 4:1 (v/v) de solo e areiade quartzo em uma câmara de crescimento de York. Condições decrescimento padrão foram: fotoperíodo de 16 h em luz e 8 h em escuro, 20°C,60% de umidade relativa, e uma densidade de fluxo de fóton de 150 μΕ. Parainduzir a germinação, as sementes semeadas foram mantidas a 4 °C, noescuro, por 3 dias. Plantas foram regadas diariamente até elas teremaproximadamente 3 semanas de idade quando então a seca foi imposta pelaretenção de água. Paralelamente, a umidade relativa foi reduzida em aumentosde 10% a cada segundo dia a 20%. Após aproximadamente 12 dias deretenção de água, a maioria das plantas mostraram sintomas visuais de dano,tal como murchamento e amarronzamento das folhas, enquanto as plantastolerantes foram identificadas como sendo visualmente túrgidas e de cor verdesaudável. Plantas foram classificadas para sintomas de danos de seca emcomparação a plantas vizinhas durante 3 dias em sucessão.
Três experiências sucessivas foram conduzidas. Na primeiraexperiência, 10 linhagens T2 independentes foram semeadas para cada genesendo testado. A porcentagem de plantas não mostrando sintomas visuais deferimento foi determinada. Na segunda experiência, as linhagens que tinham sidoclassificadas como tolerantes na primeira experiência foram colocadas através deuma triagem de confirmação de acordo com os mesmo procedimentosexperimentais. Nesta experiência, plantas de cada linhagem tolerante foramcultivadas e tratadas como antes. Na terceira experiência, pelo menos 7 réplicas dalinhagem mais tolerante foram cultivadas e tratadas como antes. O número médioe máximo de dias de sobrevivência à seca após o controle de tipo selvagemvisualmente ter morrido foram determinados. Adicionalmente medições defluorescência de clorofila foram feitas em plantas estressadas e não estressadasusando um Mini-PAM (Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Alemanha).
Na primeira experiência, após 12 dias de seca, o controle,Arabidopsis thaliana não transgênica e a maioria de linhagens transgênicasexpressando outros transgenes no teste mostraram sintomas visuais extremosde estresse incluindo necrose e morte celular. Várias plantas expressando osgenes retiveram viabilidade como mostrado por sua aparência túrgida emanutenção da cor verde.
A segunda experiência comparou um número menor delinhagens transgênicas independentes para cada gene mas um maior númerode progênie dentro de cada evento de transformação independente. Estaexperiência confirmou os resultados prévios. Aquelas linhagens contendo osgenes de levedura codificando SRP específica sobreviveram mais tempo doque os controles. Em alguns casos a linhagem transgênica sobreviveu mais doque 3 dias após os controles terem morrido.
De acordo com os resultados da primeira e segundaexperiências algumas linhagens principais contendo os genes de leveduracodificando SRP específica foram identificadas, que mostraram os melhoresresultados com relação à média de dias de sobrevivência após tipo selvageme/ou a porcentagem de acerto.
Em uma terceira experiência, essas linhagens principais foramtestadas com repetições múltiplas (4-80 plantas por linhagem). O númeromédio de dias em que as plantas da linhagem principal sobreviveram mais doque tipo selvagem foi medido. Isto é, o número T significa que, em média, asplantas super-expressando ORF, em média, sobreviveram 1 dia a mais do queo tipo selvagem. O valor de WT nessa coluna é Ό'. Os resultados estãoresumidos em tabela 3.
Tabela 2: Tolerância a seca de Arabidopsis thalianatransgênica expressando os vários genes codificando SRP de Saccharomyceseerevisiae ou E. coli após imposição de estresse de seca em plantas de 3semanas de idade em uma terceira experiência usando várias plantas de umalinhagem transgênica (experiência 3). Tolerância a seca é medida para onúmero indicado de plantas transgênicas (Plantas testadas) como um númeromédio de dias (Média de dias de sobrevivência após WT) que as plantastransgênicas sobreviveram após o controle (tipo selvagem não transformado).Para WT, esta coluna tem o valor '0'
<table>table see original document page 178</column></row><table>Em uma outra experiência, para linhagens principaisindividuais, outras linhagens contendo a mesmas construção de gene, masresultando de um evento de transformação diferente foram testadas. Nessaslinhagens, os genes de levedura codificando SRP específica são incorporadosem um sítio diferente no genoma da planta. Os resultados estão resumidos natabela 3 de acordo com a tabela 3. Os resultados demonstram a dependênciade uma tolerância a estresse e/ou resistência em plantas na expressão do SRP,em vez do evento de inserção.
Tabela 3: Tolerância a seca de Arabidopsis thalianatransgênica expressando genes codificando SRP selecionada deSaccharomyces cerevisiae ou E. coli após imposição de estresse de seca emplantas de 3 semanas de idade em uma terceira experiência usando uma plantade várias linhagens transgênicas independentes cada (experiência 3).Tolerância a seca é medida para o número indicado de plantas transgênicas(Plantas testadas) como um número médio de dias (Média de dias desobrevivência após WT) em que as plantas transgênicas sobreviveramapós o controle (tipo selvagem não transformado). Para WT, esta coluna temo valor '0'.
<table>table see original document page 179</column></row><table>
Medições de fluorescência de clorofila de rendimentofotossintético confirmaram que estresse a seca severo inibiu completamente afotossíntese nas plantas de controle, mas as linhagens transgênicas principaismantiveram a função fotossintética durante mais tempo (Tabela 5).
Tabela 4: Tolerância a seca de Arabidopsis thalianatransgênica expressando os vários genes codificando SRP de Saccharomycescerevisiae ou E. coli após imposição de estresse de seca em plantas de 3semanas de idade em uma terceira experiência usando várias plantas de umalinhagem transgênica (experiência 3). Tolerância a seca é relatada comorendimento fotossintético medida por medida da fluorescência de clorofila emtrês pontos de tempo diferentes durante a experiência de estresse de seca, ecomparando com o controle de tipo selvagem não transformado. Para cadalinhagem transgênica, a média de 5 plantas em réplica é indicada, o valor deTipo selvagem e a media de 20-25 plantas medidas na mesma experiencia. <table>table see original document page 180</column></row><table>
Exemplo 2
Engenharia de plantas Arabidopsis tolerantes a estresse por super-expressão de genes codificando proteína relacionada com estresse deSaccharomyces cerevisiae ou E. coli usando promotores indutíveis porestresse e específicos de tecido.
Plantas de Arabidopsis transgênicas foram criadas como noexemplo 1 para expressar os transgenes codificando a proteína relacionadacom estresse sob o controle de ou um promotor específico de tecido ouindutível por estresse. Expressão constitutiva de um transgene pode causarefeitos colaterais deletérios. Expressão indutível por estresse foi alcançadausando promotores selecionados dentre os listados acima na tabela 1.
Plantas de geração T2 foram produzidas e tratadas comestresse de seca em duas experiências. Para a primeira experiência de seca, asplantas foram privadas de água até a planta e solo estarem dessecadas. Emvários tempos após retenção de água, um cronograma de irrigação normal foiiniciado e as plantas foram cultivadas até maturidade. Rendimento desementes foi determinado como sementes por planta. A um grau equivalentede estresse de seca, plantas tolerantes foram capazes de iniciar o crescimentonormal e produziram mais sementes do que as plantas de controle nãotransgênicas. Teor de prolina das folhas e abertura estomatal também forammedidos em vários tempos durante o estresse de seca. Plantas tolerantesmantiveram um menor teor de prolina e uma maior abertura estomatal do queas plantas de controle não transgênicas.
Um método alternativo para impor estresse a água nas plantastransgênicas foi por tratamento com água contendo um osmólito tal comopolietileno glicol (PEG) a potencial de água específico. Uma vez que PEGpode ser tóxico, as plantas receberam somente uma exposição a curto prazo eentão irrigação normal foi retomada. Como acima, rendimentos de sementeforam medidos das plantas maduras. A resposta foi medida durante o períodode estresse por medidas físicas, tal como abertura estomatal ou potencialosmótico, ou medidas bioquímicas, tal como acúmulo de prolina. Plantastolerantes tinham maiores rendimentos de semente, mantiveram sua aberturaestomatal e mostraram somente mudanças leves em níveis de prolina epotencial osmótico, enquanto as plantas de controle não transgênicassuscetíveis fecharam seus estomatas e demonstraram aumentados níveis deprolina e potencial osmótico.
As plantas transgênicas com um promotor constitutivocontrolando a transcrição do transgene foram comparadas com as plantas comum promotor indutível de seca na ausência de estresse. Os resultadosindicaram que as mudanças de metabólitos e expressão de genes nãoocorreram quando plantas com o promotor indutível por estresse foramcultivadas na ausência de estresse. Essas plantas também tiveram maioresrendimentos de semente do que as com o promotor constitutivo.
Exemplo 3
Super-expressão de genes relacionados com estresse de Saccharomycescerevisiae ou E. coli prove tolerância a estresses abióticos múltiplos.
Plantas que demonstram tolerância a um estresse abiótico comfreqüência demonstram tolerância a outro estresse ambiental ou um herbicidagerando radical livre de oxigênio. Esse fenômeno de tolerância cruzada não éentendido em um nível mecanístico (McKersie e Leshem, 1994). Entretanto, érazoável esperar que plantas demonstrando tolerância a seca melhoradadevido à expressão de um transgene poderiam também demonstrar tolerânciade temperaturas baixas, congelamento, sal, poluentes do ar tal como ozônio, eoutros estresses abióticos. Em apoio a esta hipótese, a expressão de váriosgenes é regulada de modo positivo ou negativo por fatores de estresse abióticomúltiplo incluindo frio, sal, osmótico, ABA, etc (por exemplo Hong et al.(1992) Developmental and organ-specific expression of an ABA- e stress-induced protein in barley. Plant Mol Biol 18: 663-674; Jagendorf e Takabe(2001) Inducers of glycinebetaine synthesis in barley. Plant Physiol 127:1827-1835); Mizoguchi et al. (1996) Um gene codificando uma proteínaquinase ativada por mitogênio é induzido simultaneamente com genes parauma proteína quinase ativada por mitogênio e uma proteína quinaseribossomal S6 por toque, frio e estresse hídrido em Arabidopsis thaliana. ProcNatl Acad Sci U S A 93: 765-769; Zhu (2001) Cell signaling under salt, waterand cold stresses. Curr Opin plant Biol 4: 401-406).
Para determinar a tolerância a sal, sementes de Arabidopsisthaliana foram esterilizadas (100% de alvejante, 0,1% de TritonX por cincominutos duas vezes e enxaguadas cinco vezes com ddH20). Sementes foramcolocadas em placas em meio de não seleção (1/2 MS, 0,6% phytagar, 0,5g/LMES, 1% de sacarose, 2 μg/ml de benamil). Sementes são deixadas germinarpor aproximadamente dez dias. No estágio de 4-5 folhas, plantas transgênicasforam plantadas em vasos de 5,5cm de diâmetro e deixadas crescer (22 °C,luz contínua) por aproximadamente sete dias, aguando quando necessário.Para começar o teste, dois litros de 100 mM de NaCl e 1/8 MS foramadicionados à bandeja sob os vasos. Para a bandeja contendo as plantas decontrole, três litros de 1/8 MS foram adicionados. As concentrações desuplementação de NaCl foram aumentadas em etapas por 50 mM cada 4 diasaté 200 mM. Após o tratamento com sal com 200 mM, pesos no estado frescoe seco das plantas assim como os rendimentos de semente foramdeterminados.
Para determinar tolerância a frio, sementes das linhagenstransgênicas e de frio foram germinadas e cultivadas duranteaproximadamente 10 dias para o estágio de 4-5 folhas como acima. As plantasforam então transferidas para temperaturas frias (5 °C) e cultivadas atravésdos estágios de florescência e de formação de semente em desenvolvimento.Fotossíntese foi medida usando fluorescência de clorofila como um indicadorde ajuste fotossintético e integridade dos fotossistemas. Rendimento desemente e peso no estado seco da planta foram medidos como um indicadorde produção de biomassa de planta.
Plantas que tinham tolerância a salinidade ou frioapresentaram maiores rendimentos de semente, fotossíntese e produção dematerial seco do que as plantas suscetíveis.
Exemplo 4
Engenharia de plantas de alfafa tolerantes a estresse por super-expressãode genes relacionados com estresse de Saccharomyces cerevisiae ou E.coli
Um clone regenerado de alfafa (Medicago sativa) foitransformado usando o método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119:839-847). Regeneração e transformação de alfafa é dependente de genótipo econseqüentemente uma planta regenerada é requerida. Métodos para obterplantas regeneradas foram descritos. Por exemplo, essas podem serselecionados dentre o cultivar Rangelander (Agriculture Canada) ou qualqueroutra variedade de alfafa comercial como descrito por Brown DCW e AAtanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112).Alternativamente, a variedade de RA3 (Universidade de Wisconsin) foiselecionada para uso na cultura de tecido (Walker et al., 1978 Am J Bot65:654-659).
Explantes de pecíolo foram co-cultivados com uma culturanoturna de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et ai, 1999Plant Physiol 119: 839-847) ou LBA4404 contendo um vetor binário. Muitossistemas de vetor binário diferentes foram descritos para transformação deplanta (por exemplo An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods inMolecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA e MR Davey eds.Humana Press, Totowa, New Jersey). Muitos são baseados no vetor pBIN19descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721) que inclui um cassete de expressão de gene de planta flanqueado por seqüências deborda esquerda e direita do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Umcassete de expressão de gene de planta consiste de pelo menos dois genes -um gene de marcador de seleção e um promotor de planta regulando atranscrição do cDNA ou DNA genômico do gene de traço. Vários genes de marcador de seleção podem ser usados incluindo o gene de Arabidopsiscodificando uma acetohidroxi ácido sintase mudada (AHAS) (patentes US57673666 e 6225105). Similarmente, vários promotores podem ser usadospara regular o gene de traço que provê regulação constitutiva,desenvolvimental, de tecido ou ambiental de transcrição de gene. Nesteexemplo, o promotor 34S (números de acesso GenBankM59930 e Xl6673)foi usado para prover a expressão constitutiva do gene de traço.
Os explantes foram co-cultivados durante 3 d no escuro emmeio de indução de SH contendo 288 mg/ L Pro, 53 mg/ L tioprolina, 4,35 g/L K2S04, e 100 μηι acetosiringinona. Os explantes foram lavados em meio de Murashige-Skoog de potência média (Murashige e Skoog, 1962) ecolocados em placas no mesmo meio de indução de SH sem acetosiringinonamas com um agente de seleção apropriado e antibióticos apropriados parainibir o crescimento de agrobactérias. Após várias semanas, embriõessomáticos foram transferidos ao meio de desenvolvimento de BOÍ2Y nãocontendo reguladores de crescimento, antibióticos, e 50 g/ L sacarose.Embriões somáticos foram subseqüentemente germinados no meio deMurashige-Skoog de potência média. Mudas enraizadas foram transferidasem vasos e cultivadas em uma estufa para plantas.
As plantas transgênicas TO foram propagadas por mudastalhadas de nódulos e enraizadas em meio de crescimento Turface. As plantasforam desfolhadas e cultivadas para uma altura de cerca de 10 cm(aproximadamente 2 semanas após desfolhação). As plantas foram entãosubmetidas ao estresse de seca em duas experiências.
Para a primeira experiência de seca, as mudas não receberamágua por um período de até 3 semanas quando então a planta e solo ficaramdessecadas. Em vários tempos após retenção de água, um cronograma deirrigação normal foi iniciado. Em uma semana após iniciar a irrigação, ospesos no estado fresco e seco dos brotos foram determinados. Em um grauequivalente de estresse de seca, plantas tolerantes foram capazes de iniciar ocrescimento normal enquanto as plantas suscetíveis tinham morrido ousofrido de dano significante resultando em menos material seco. Teor deprolina das folhas e abertura estomatal também foram medidos em váriostempos durante o estresse de seca. Plantas tolerantes mantiveram um menorteor de prolina e uma maior abertura estomatal do que as plantas de controlenão transgênicas.
Um método alternativo para impor o estresse de água nasplantas transgênicas foi por tratamento com uma solução em potencial deágua específico, contendo um osmólito tal como polietileno glicol (PEG). Otratamento com PEG foi dado ou às folhas soltas (por exemplo Djilianov etal., 1997 Plant Science 129: 147-156) ou às raízes (Wakabayashi et al., 1997Plant Physiol 113: 967-973). Uma vez que PEG pode ser tóxico, as plantasreceberam somente uma exposição a curto prazo. A resposta foi medida comomedições físicas tal como abertura estomatal ou potencial osmótico, oumedidas bioquímicas tal como acúmulo de prolina. Plantas tolerantesmantiveram sua abertura estomatal e mostraram somente mudanças leves empotencial osmótico, enquanto as plantas de controle não transgênicassuscetíveis fecharam seus estomatas e demonstraram aumentado potencialosmótico. Além disso, as mudanças em prolina e outros metabólitos forammenores nas plantas transgênicas tolerantes do que nas plantas de controlenão transgênicas.
Tolerância a salinidade e frio foram medidas usando métodoscomo descrito no exemplo 3. Plantas que tinham tolerância a salinidade oufrio apresentaram maiores rendimentos de semente, fotossíntese e produçãode material seco do que as plantas suscetíveis.
Exemplo 5
Engenharia de plantas de centeio tolerantes a estresse por super-expressão de genes relacionados com estresse de Saccharomycescerevisiae ou E. coli
Sementes de várias variedades de azévem diferentes podem serusadas como fontes de explantes para transformação, incluindo a variedadecomercial Gunne disponível da empresa de sementes Svalof Weibull ou avariedade Affinity. Sementes foram esterilizadas na superfícieseqüencialmente com 1% de Tween-20 durante 1 minuto, 100 % de alvejantepor 60 minutos, 3 enxágües com 5 minutos cada com H20 desionizado edestilado, e então germinadas por 3-4 dias em papel de filtro estéril, úmido,no escuro. Mudas foram ainda esterilizadas durante 1 minuto com 1% deTween-20, 5 minutos com alvejante a 75%, e enxaguadas 3 vezes comddH20, 5 min cada.
Sementes esterilizadas na superfície foram colocadas no meiode indução de calo contendo sais de base de Murashige e Skoog e vitaminas,20 g/l de sacarose, 150 mg/l de asparagina, 500 mg/l de hidrolisado decaseína, 3 g/l de Fitagel, 10 mg/l de BAP, e 5 mg/l de dicamba. Placas foramincubadas no escuro a 25 0C por 4 semanas para germinação de semente eindução de calo embriogênico.
Após 4 semanas no meio de indução do calo, os brotos e raízesdas mudas foram cortados fora, o calo foi transferido para meio novo,mantido em cultura por outras 4 semanas, e então transferido para meio deMSO em luz durante 2 semanas. Vários pedaços de calos (11-17 semanas deidade) foram ou forçados através de peneira malha 10 e colocados sobre omeio de indução de calo, ou cultivados em 100 ml de meio líquido de induçãode calo de azévem (mesmo meio como para indução do calo com agar) em umfrasco de 250 ml. O frasco foi embrulhado em papel laminado e agitado a 175rpm no escuro a 23 0C durante 1 semana. Peneirando a cultura líquida compeneira de malha 40, foram coletadas as células. A fração coletada na peneirafoi colocada em placa e cultivada em meio sólido de indução de calo deazévem durante 1 semana no escuro a 25 0C. O calo foi então transferido parae cultivado em meio MS contendo 1% de sacarose durante 2 semanas.
Transformação pode ser realizada com ou Agrobacterium oucom métodos de bombardeio de partículas. Uma vetor de expressão é criadocontendo um promotor de planta constitutivo e o cDNA do gene em umavetor de pUC. O DNA de plasmídeo foi preparado de células de E. coliusando com kit Qiagen de acordo com instrução do fabricante.Aproximadamente 2 g de calo embriogênico foram repartidos no centro deum papel de filtro estéril em um placa de Petri. Uma alíquota de MSO líquidocom 10 g/l de sacarose foi adicionada ao papel de filtro. Partículas de ouro(1,0 μηι em tamanho) foram revestidas com DNA plasmídeo de acordo commétodo de Sanford et al., 1993 e distribuídas no calo embriogênico com osseguintes parâmetros: 500 μg de partículas e 2 μg de DNA por tiro, 91,3kg/cm2 e uma distância de alvo de 8,5 cm de placa de parada para placa decalo e 1 tiro por placa de calo.
Após o bombardeio, calos foram transferidos de volta para omeio de desenvolvimento de calo fresco e mantidos no escuro a temperaturaambiente por um período de 1 semana. O calo foi então transferido paracondições de cultura em luz a 25 0C para iniciar a diferenciação de embriãocom o agente de seleção apropriado, por exemplo 250 nM Arsenal, 5 mg/l dePPT ou 50 mg/L de canamicina. Brotos resistentes ao agente de seleçãoapareceram e uma vez apodrecidos foram transferidos para o solo.
Amostras das plantas transgênicas primárias (TO) foramanalisadas por PCR para confirmar a presença de T- DNA. Estes resultadossão confirmados por hibridização Southern em que DNA é submetido aeletroforese em um 1% gel de agarose e transferido para uma membrana denáilon carregada positivamente (Roche Diagnostics). O Kit de síntese desonda DIG PCR (Roche Diagnostics) é usado para preparar uma sondarotulada com digoxigenina por PCR, e usado como recomendado pelofabricante.
Plantas de azévem TO transgênicas foram propagadasvegetativamente por excisão dos rebentos. Os rebentos transplantados forammantidos na estufa para plantas durante 2 meses até estarem bemestabilizados. Os brotos foram desfolhados e deixados crescer durante 2semanas.
A primeira experiência de seca foi conduzida em uma maneirasimilar àquela descrita no exemplo 3. As mudas não receberam água por umperíodo de até 3 semanas em que a planta e solo foram dessecados. Em váriostempos após retenção de água, um cronograma de irrigação normal foiiniciado. Em uma semana após iniciar a irrigação, os comprimentos daslâminas das folhas, e os pesos no estado fresco e seco dos brotos foramdeterminados. Em um grau equivalente de estresse de seca, plantas tolerantesforam capazes de iniciar o crescimento normal enquanto as plantas suscetíveistinham morrido ou sofrido dano significante resultando em folhas mais curtase menos material seco. Teor de prolina das folhas e abertura estomatal foramtambém medidos em vários tempos durante o estresse de seca. Plantastolerantes mantiveram um menor teor de prolina e uma maior aberturaestomatal do que as plantas de controle não transgênicas.
Uma segunda experiência impondo estresse de seca naslantas transgênicas foi por tratamento com uma solução de PEG comodescrito no exemplos anteriores. Tolerância a salinidade e frio foi medidausando métodos como descrito no exemplo 3. Plantas que tinham tolerância asalinidade ou frio apresentaram maiores rendimentos de semente, fotossíntesee produção de material seco do que as plantas suscetíveis.
Exemplo 6
Engenharia de plantas de soja tolerantes a estresse por super-expressãode genes relacionados com estresse de Saccharomyces cerevisiae ou E. coli
Soja foi transformada de acordo com a seguinte modificaçãodo método descrito na patente de Texas A&M US 5.164.310. Váriasvariedades comerciais de soja são responsáveis para transformação por essemétodo. O cultivar Jack (disponível da Illinois Seed Foundation) é umcomumente usado para transformação. Sementes foram esterilizadas porimersão em 70% (v/v) de etanol por 6 min e em alvejante a 25% comercial(NaOCl) suplementado com 0,1% (v/v) de Tween durante 20 min, seguidopor enxágue 4 vezes com água destilada duplamente estéril. Mudas de setedias foram propagadas removendo a radícula, hipocótile e uma cotilédone decada muda. Então, o epicótile com um cotilédone foi transferido para meio degerminação fresco em placas de Petri e incubados a 25 0C sob um fotoperíodode 16 h (aproximadamente 100 μΕ-πι-28-1) por três semanas. Nódulosaxilares (aproximadamente 4 mm em comprimento) foram cortados de plantasde 3 - 4 semanas de idade. Nódulos axilares foram excisados e incubados emcultura de Agrobacterium LBA4404.
Muitos sistemas de vetor binário diferentes foram descritospara transformação de planta (por exemplo An, G. in AgrobacteriumProtocols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA eMR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Muitos são baseados novetor pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721) que inclui um cassete de expressão de gene de planta flanqueado porseqüências de borda esquerda e direita do plasmídeo Ti de Agrobacteriumtumefaciens. Um cassete de expressão de gene de planta consiste de pelomenos dois genes - um gene de marcador de seleção e um promotor de plantaregulando a transcrição do cDNA ou DNA genômico do gene de traço. Váriosgenes de marcador de seleção podem ser usados incluindo o gene deArabidopsis codificando uma enzima acetohidroxi ácido sintase mudada(AHAS) (US patentes 57673666 e 6225105). Similarmente, váriospromotores podem ser usados para regular o gene de traço para proverregulação constitutiva, desenvolvimental, de tecido ou ambiental detranscrição de gene. Neste exemplo, o promotor 34S (números de acessoGenBankM59930 e Xl6673) foi usado para prover expressão constitutiva dogene de traço.
Após o tratamento de co-cultivo, os explantes foram lavados etransferidos para meios de seleção suplementados com 500 mg/L detimentina. Brotos foram excisados e colocados em um meio de alongamentode broto. Brotos maiores do que 1 cm foram colocados em meio de cultura deraiz por duas a quatro semanas antes de transplantar para o solo.
As plantas transgênicas primárias (TO) foram analisadas porPCR para confirmar a presença de T DNA. Estes resultados foramconfirmados por Hibridização Southern em que DNA é submetido aeletroforese em um gel agarose a 1% e transferido para uma membrana denáilon carregada positivamente (Roche Diagnostics). O Kit de síntese desonda DIG de PCR (Roche Diagnostics) é usado para preparar uma sondarotulada com digoxigenina por PCR, e usado como recomendado pelofabricante.Plantas tolerantes tinham maiores rendimentos de semente,mantiveram sua abertura estomatal e mostraram somente mudanças leves emníveis de prolina e potencial osmótico, enquanto as plantas de controle nãotransgênicas suscetíveis fecharam seus estomatas e demonstraram aumentadosníveis de prolina e potencial osmótico.
Tolerância a seca, a salinidade e frio foi medida usandométodos como descrito no exemplo 3. Plantas que tinham tolerância asalinidade ou frio apresentaram maiores rendimentos de semente, fotossíntesee produção de material seco do que as plantas suscetíveis. Exemplo 7
Engenharia de plantas de colza/canola tolerantes a estresse por super-expressão de genes relacionados com estresse de Saccharomyces cerevisiaeou E. coli
Pecíolos cotiledonários e hipocótiles de mudinhas jovens de 5-6 dias de idade foram usados como explantes de cultura de tecido etransformados de acordo com Babic et al.(1998, Plant Cell Rep 17: 183-188).O cultivar Westar comercial (Agriculture Canada) é a variedade padrão usadapara transformação, mas outras variedades podem ser usadas.
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 contendo um vetor binário foi usado para transformação de canola. Muitos sistemas de vetorbinário diferentes foram descritos para transformação de planta (por exemploAn, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp47-62, Gartland KMA e MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey).Muitos são baseados no vetor pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721) que inclui um cassete de expressão de gene deplanta flanqueado por seqüências de borda esquerda e direita do plasmídeo Tide Agrobacterium tumefaciens. Um cassete de expressão de gene de plantaconsiste de pelo menos dois genes - um gene de marcador de seleção e umpromotor de planta regulando a transcrição do cDNA ou DNA genômico dogene de traço. Vários genes de marcador de seleção podem ser usadosincluindo o gene de Arabidopsis codificando uma enzima acetohidroxi ácidosintase mudada (AHAS) (US patentes 57673666 e 6225105). Similarmente,vários promotores podem ser usados para regular o gene de traço para proverregulação constitutiva, desenvolvimental, de tecido ou ambiental detranscrição de gene. Neste exemplo, o promotor 34S (números de acessoGenBankM59930 e Xl6673) foi usado para prover expressão constitutiva dogene de traço.
Sementes de canola foram esterilizadas na superfície em 70%de etanol durante 2 min., e então em 30% de Clorox com uma gota de Tween-20 durante 10 min, seguido por três enxágües com água destilada esterilizada.Sementes foram então germinadas in vitro 5 dias em meio de MS meio fortesem hormônios, 1% de sacarose, 0,7% de Phytagar a 23°C, 16 hr. em luz. Osexplantes de pecíolo de cotilédone com o cotilédone presos foram excisadosdas mudas in vitro, e inoculados com agrobactérias por imersão daextremidade cortada do explante do pecíolo na suspensão bacteriana. Osexplantes foram então cultivados durante 2 dias em meio de MSBAP-3contendo 3 mg/l de BAP, 3 % de sacarose, 0,7 % de Phytagar a 23 °C, 16 hem luz. Após dois dias de co-cultivo com agrobactérias, os explantes dopecíolo foram transferidos para meio MSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP,cefotaxima, carbenicilina, ou timentina (300 mg/l) durante 7 dias, e entãocultivados em meio MSBAP-3 com cefotaxima, carbenicilina, ou timentina eagente de seleção até regeneração de broto. Quando os brotos tinham 5-10mm de comprimento, eles foram cortados e transferidos para meio dealongamento de broto (MSBAP-0,5, contendo 0,5 mg/l de BAP). Brotos decerca de 2 cm em comprimento foram transferidos para o meio de cultura deraiz (MSO) para indução de raiz.
Amostras das plantas transgênicas primárias (TO) foramanalisadas por PCR para confirmar a presença de T DNA. Estes resultadosforam confirmados por hibridização Southern em que DNA é submetido aeletroforese em 1 % de gel de agarose e transferido para uma membrana denáilon carregada positivamente (Roche Diagnostics). O kit de síntese desonda DIG PCR (Roche Diagnostics) é usado para preparar uma sondarotulada com digoxigenina por PCR, e usado como recomendado pelofabricante.
As plantas transgênicas foram então avaliadas por suatolerância a estresse melhorada de acordo com o método descrito no exemplo3. Plantas tolerantes tinham maiores rendimentos de semente, mantiveram suaabertura estomatal e mostraram somente mudanças leves em níveis de prolinae potencial osmótico, enquanto as plantas de controle não transgênicassuscetíveis fecharam seus estomatas e demonstraram aumentados níveis deprolina e potencial osmótico.
Tolerância a seca, a salinidade e frio foi medida usandométodos como descrito no exemplo anterior 3. Plantas que tinham tolerância asalinidade ou frio apresentaram maiores rendimentos de semente, fotossíntesee produção de material seco do que as plantas suscetíveis.
Exemplo 8
Engenharia de plantas de milho tolerantes a estresse por super-expressãodos genes relacionados com estresse de Saccharomyces cerevisiae ou E.coli
Transformação de milho (Zea Mays L.) é realizada com umamodificação do método descrito por Ishida et al. (1996. Nature Biotech14745-50). Transformação é dependente de genótipo em milho e apenasgenótipos específicos são responsáveis para transformação e regeneração. Alinhagem pura Al88 (Universidade de Minnesota) ou híbridos com Al88como um parental são boas fontes de material doador de transformação(Fromm et al. 1990 Biotech 8:833-839), mas outros genótipos podem serusados também com sucesso. Espigas são colhidas de plantas de milho aaproximadamente 11 dias após polinização (DAP) quando o comprimento deembriões imaturos é cerca de 1 a 1,2 mm. Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens que dirige vetores "superbinários" e plantas transgênicas são recuperadas através de organogenese. Osistema de vetor super binário de Japan Tabaco está descrito em WO patentesW094/00977 e W095/06722. Vetores foram construídos como descrito.Vários genes de marcador de seleção podem ser usados incluindo o gene demilho codificando uma enzima mudada acetohidroxi ácido sintase (AHAS)(patente US 6025541). Similarmente, vários promotores podem ser usadospara regular o gene de traço para prover regulação constitutiva,desenvolvimental, de tecido ou ambiental de transcrição de gene. Nesteexemplo, o promotor 34S (números de acesso GenBankM59930 e Xl6673)foi usado para prover expressão constitutiva do gene de traço.
Embriões excisados são cultivados no meio de indução docalo, então meio de regeneração de milho, contendo imidazolinona como umagente de seleção. As placas de Petri são incubadas na luz a 25 0C durante 2-3semanas, ou até os brotos se desenvolverem. Os brotos verdes são transferidosde cada embrião para meio de cultura de raiz de milho e incubados a 25 0Cdurante 2-3 semanas, até raízes desenvolverem. Os brotos com raízes sãotransferidos para o solo na estufa para plantas. Sementes de Tl são produzidasa partir de plantas que demonstram tolerância à herbicidas imidazolinona eque são PCR positivas para os transgenes.
As plantas transgênicas Tl foram então avaliadas por suatolerância a estresse melhorada de acordo com o método descrito no exemplo3. A geração Tl de inserções de local simples do T- DNA irá segregar dotransgene em uma relação de 3:1. Aquelas progênies contendo uma ou duascópias do transgene são tolerantes à herbicida imidazolinona, e demonstrammaior tolerância a estresse de seca do que as de progênie faltando ostransgenes. Plantas tolerantes tinham maiores rendimentos de semente,mantiveram sua abertura estomatal e mostraram somente mudanças leves emníveis de prolina e potencial osmótico, enquanto as plantas de controle nãotransgênicas suscetíveis fecharam seus estomatas e demonstraram aumentadosníveis de prolina e potencial osmótico. Plantas T2 homozigóticasdemonstraram fenótipos similares. Plantas híbridas (progênie Fl) de plantastransgênicas homozigóticas e plantas não transgênicas também demonstraramaumentado tolerância de estresse ambiental.
Tolerância a salinidade e frio foi medida usando métodoscomo descrito no exemplo anterior 3. Plantas que tinham tolerância a seca,salinidade ou frio apresentaram maiores rendimentos de semente, fotossíntesee produção de material seco do que as plantas suscetíveis.
Exemplo 9
Engenharia plantas de trigo tolerantes a estresse por super-expressão dosgenes relacionados com estresse de Saccharomyces cerevisiae ou E. coli
Transformação de trigo é realizada com o método descrito porIshida et al. (1996 Nature Biotech. 14745-50). O cultivar Bobwhite(disponível da CYMMIT, México) é comumente usado em transformação.Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens quetransportam vetores "super binários", e plantas transgênicas são recuperadasatravés de organogenese. O sistema de vetor super binário de Japan Tabacoestá descrito em patentes WO W094/00977 e W095/06722. Vetores foramconstruídos como descrito. Vários genes de marcador de seleção podem serusados incluindo o gene de milho codificando uma enzima mudadaacetohidroxi ácido sintase (AHAS) (patente US 6025541). Similarmente, vários promotores podem ser usados para regular o gene de traço para proverregulação constitutiva, desenvolvimental, de tecido ou ambiental detranscrição de gene. Neste exemplo, o promotor 34S (números de acessoGenBankM59930 e Xl 6673) foi usado para prover expressão constitutiva dogene de traço.Após incubação com agrobactérias, os embriões são cultivadosno meio de indução do calo, então meio de regeneração, contendoimidazolinona como um agente de seleção. As placas de Petri são incubadasna luz a 25 0C durante 2-3 semanas, ou até os brotos se desenvolverem. Obrotos verdes são transferidos de cada embrião para meio de cultura de raiz eincubados a 25 0C durante 2-3 semanas, até as raízes se desenvolverem. Osbrotos com raízes são transferidos para o solo na estufa para plantas.Sementes Tl são produzidas a partir de plantas que demonstram tolerância àherbicidas imidazolinona e que são PCR positivas para os transgenes.
As plantas transgênicas Tl foram então avaliadas por suatolerância a estresse melhorada de acordo com o método descrito no exemploanterior 3. A geração Tl de inserções de local simples do T- DNA irásegregar do transgene em uma relação de 3:1. Aquelas progênies contendouma ou duas cópias do transgene são tolerantes à herbicida imidazolinona, e demonstram maior tolerância a estresse de seca do que as de progêniefaltando o transgenes. Plantas tolerantes tinham maiores rendimentos desemente, mantiveram sua abertura estomatal e mostraram somente mudançasleves em níveis de prolina e potencial osmótico, enquanto as plantas decontrole não transgênicas suscetíveis fecharam seus estomatas edemonstraram aumentados níveis de prolina e potencial osmótico. Plantas T2homozigóticas demonstraram fenótipos similares. Tolerância a salinidade efrio foi medida usando métodos como descrito nos exemplos anteriores.Plantas que tinham tolerância a seca, salinidade ou frio apresentaram maioresrendimentos de semente, fotossíntese e produção de material seco do que asplantas suscetíveis.
Exemplo 10
Identificação de Genes idênticos e heterólogos
Seqüências de gene podem ser usadas para identificar genesidênticos ou heterólogos de bibliotecas de cDNA ou genômicas. Genesidênticos (por exemplo clones de cDNA de comprimento completo) podemser isolados via hibridização de ácido nucleico usando por exemplobibliotecas de cDNA. Dependendo da abundância do gene de interesse,100.000 até 1.000.000 de bacteriófagos recombinantes são colocados emplacas e transferidos à membranas de náilon. Após desnaturação com álcali,DNA é imobilizado na membrana por, por exemplo, reticulação por UV.Hibridização é efetuada em condições de alta estringência. Em soluçãoaquosa, hibridização e lavagem são realizadas a uma potência iônica de 1 Mde NaCl e uma temperatura de 68°C. Sondas de hibridização são geradas por,por exemplo, rotulação de transcrição "nick" radioativa (32P) (High Prime,Roche, Mannheim, Alemanha). Sinais são detectados por autoradiografia.
Genes parcialmente idênticos ou heterólogos que sãorelacionados mas não idênticos podem ser identificados em uma maneiraanáloga ao procedimento acima descrito usando hibridização de estringênciabaixa e condições de lavagem. Para hibridização aquosa, a potência iônica énormalmente mantida a 1 M de NaCl enquanto a temperatura éprogressivamente abaixado de 68 a 42°C.
Isolamento de seqüências de gene com homologia (ouidentidade/similaridade de seqüência) apenas em um domínio distinto de (porexemplo 10-20 aminoácidos) pode ser efetuado usando sondas deoligonucleotídeo radio-rotuladas sintéticas. Oligonucleotídeos radio-rotuladossão preparados por fosforilação da extremidade inicial 5 de doisoligonucleotídeos complementares com polinucleotídeo Quinase T4. Osoligonucleotídeos complementares são anelados e ligados para formarconcatêmeros. Os concatêmeros de filamento duplo são então radio -rotuladospor, por exemplo, transcrição "nick". Hibridização é normalmente realizadaem condições de estringência baixa usando altas concentrações deoligonucleotídeo.
Solução de hibridização de oligonucleotídeo:6 χ SSCM de Fosfato de sódiomM de EDTA (pH 8)0,5 % SDS100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado% de leite em pó desnatado
Durante hibridização, temperatura é abaixada em etapas para5-10°C abaixo da Tm de oligonucleotídeo estimada ou abaixo à temperaturaambiente seguido por etapas de lavagem e auto-radiografia. Lavagem érealizada com estringência baixa tal como 3 etapas de lavagem usando 4 χSSC. Outros detalhes são descritos por Sambrook, J. et al., 1989, "MolecularCloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press ouAusubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology," JohnWiley & Sons.
Exemplo 11
Identificação de genes idênticos por triagem de bibliotecas de expressãocom anticorpos
Clones de c-DNA podem ser usados para produzirpolipeptídeos recombinantes, por exemplo em E. coli (por exemplo sistemaQiagen QIAexpress pQE). Polipeptídeos recombinantes são entãonormalmente purificados por afinidade via cromatografia de afinidade de Ni-NTA (Qiagen). Polipeptídeos recombinantes são então usados para produziranticorpos específicos por exemplo usando técnicas padrões para imunizaçãode coelhos. Anticorpos são purificados por afinidade usando uma coluna deNi-NTA saturada com o antígeno recombinante como descrito por Gu et al.,1994, BioTechniques 17:257-262. O anticorpo pode então ser usado para triaras bibliotecas de cDNA de expressão para identificar genes idênticos ouheterólogos via uma triagem imunológica (Sambrook, J. et al., 1989,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor LaboratoryPress ou Ausubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols in MolecularBiology", John Wiley & Sons).Exemplo 12Mutagenese In vivo
Mutagenese in vivo de microorganismos pode ser realizadapor passagem de DNA plasmídeo (ou outro vetor) através de E. coli ou outrosmicroorganismos (por exemplo Bacillus spp. ou leveduras tal comoSaccharomyces eerevisiae) que são afetadas em suas capacidades para mantera integridade de sua informação genética. Cepas mutator típicas têm mutaçõesnos genes para o sistema de reparo de DNA (por exemplo, mutHLS, mutD,mutT, etc.; por referência, ver Rupp, W.D., 1996, DNA repair mechanisms,in: Eseheriehia coli e Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington.) Taiscepas são bem conhecidas do versado. O uso de tais cepas é ilustrado, porexemplo, em Greener5 A. e Callahan, M., 1994, Strategies 7: 32-34.
Transferência de moléculas de DNA mudadas em plantas é preferivelmentefeita após a seleção e teste em microorganismos. Plantas transgênicas sãogeradas de acordo com vários exemplos dentro da exemplificação destedocumento.
Exemplo 13
Engenharia de plantas de Arabidopsis tolerantes a estresse por super-expressão dos genes codificando proteína relacionada com estresse deBrassica napus, Glycine max, Zea mays, Triticum aestivum ou Oryza sativaou Hordeum vulgare, Helianthus annuus, Linum usitatissimum, usandopromotores indutíveis por estresse e específicos de tecido.
Plantas transgênicas Arabidopsis super-expressando genescodificando proteínas relacionadas com estresse de Brassica napus, Glyeinemax, Zea mays, Tritieum aestivum e Oryza sativa e Hordeum vulgare,Helianthus annuus, Linum usitatissimum, são criadas como descrito noexemplo 1 para expressar os transgenes codificando a proteína relacionadacom estresse sob o controle de ou de promotor específico de tecido ouindutível por estresse. Expressão constitutiva de um transgene pode causarefeitos colaterais deletérios, que podem ser evitados pelo uso dessespromotores. Expressão indutível de estresse é alcançada usando promotoresselecionados dentre os listados acima na tabela 1.
Plantas de geração T2 são produzidas e tratadas com estressede seca em duas experiências. Para a primeira experiência de seca, as plantassão privadas de água até a planta e solo ficarem dessecados. Em váriostempos após a retenção de água, um cronograma de irrigação normal éiniciado e as plantas são cultivadas até maturidade. Rendimento de sementes édeterminado como sementes por planta. Em um grau equivalente de estressede seca, plantas tolerantes são capazes de iniciar o crescimento normal eproduziram mais sementes que plantas de controle não transgênicas. Teor deprolina das folhas e abertura estomatal é também medido em vários temposdurante o estresse de seca. Plantas tolerantes mantêm um teor de prolinamenor e uma maior abertura estomatal do que as plantas de controle nãotransgênicas.
Um método alternativo para impor o estresse a água nasplantas transgênicas é por tratamento com água contendo um osmólito talcomo polietileno glicol (PEG) em potencial de água específico. Uma vez quePEG pode ser tóxico, as plantas recebem apenas uma exposição de termocurto e então irrigação normal foi iniciado. Como acima, rendimentos desemente são medidos das plantas maduras. A resposta é medida durante operíodo de estresse por medidas físicas, tal como abertura estomatal oupotencial osmótico, ou medidas bioquímicas, tal como acúmulo de prolina.Plantas tolerantes têm maiores rendimentos de semente, mantêm sua aberturaestomatal e mostram apenas mudanças leves em níveis de prolina e potencialosmótico, enquanto as plantas de controle não transgênicas suscetíveis fechamseus estornas e exibem níveis de prolina e potencial osmótico melhorados.As plantas transgênicas com um promotor constitutivocontrolando transcrição do transgene são comparadas com as plantas com umpromotor indutível de seca na ausência de estresse. Os resultados indicam queo metabólito e mudanças de expressão de gene não ocorrem quando plantascom o promotor indutível por estresse foram cultivadas na ausência deestresse. Essas plantas também têm maiores rendimentos de semente do queas com o promotor constitutivo.
Exemplo 14
Super-expressão de genes relacionados com estresse de Brassica napus,Glycine max, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa ou HordeumVulgarey Helianthus annuus, Linum usitatissimum prove tolerância deestresses abióticos múltiplos.
Plantas que demonstram tolerância a um estresse abiótico comfreqüência demonstram tolerância a outro estresse ambiental ou um herbicidagerando radical livre de oxigênio. Esse fenômeno de tolerância cruzada não éentendido em um nível mecanístico (McKersie e Leshem, 1994). Entretanto, érazoável esperar que plantas exibindo tolerância a seca melhorada devido àexpressão de um transgene poderiam também demonstrar tolerância a baixastemperaturas, congelamento, sal, poluentes do ar tal como ozônio, e outrosestresses abióticos. Em apoio a essa hipótese, a expressão de vários genes sãoregulados de modo positivo ou negativo por fatores de estresse abióticomúltiplo incluindo frio, sal, osmótico, ABA, etc (por exemplo Hong et al.(1992) Developmental and organ-specific expression of an ABA- ad stress-induced protein in barley. Plant Mol Biol 18: 663-674; Jagendorf e Takabe(2001) Inducers of glycinebetaine sythesis in barley. Plant Physiol 127: 1827-1835); Mizoguchi et al. (1996) Um gene codificando uma proteína quinaseativada de mitogênio é induzido simultaneamente com genes de uma proteínaquinase ativada de mitogênio e uma proteína quinase ribossomal S6 porestresse de toque, frio e hídrico em Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad SciU S A 93: 765-769; Zhu (2001) Cell signaling uder salt, water and coldstresses. Curr Opi plant Biol 4: 401-406).
Plantas Arabidopsis transgênicas super-expressando genescodificando proteína relacionada com estresse de Brassica napus, Glycinemax, Zea mays, Tritieum aestivum e Oryza sativa e Hordeum vulgare,Helianthus annuus, Linum usitatissimum, são criadas como descrito noexemplo 1 e testadas para tolerância a sal e estresse de frio.
Para determinar tolerância a sal, sementes de Arabidopsisthaliana são esterilizadas (incubadas em 100% de alvejante, 0,1% deTritonX100 por cinco minutos (duas vezes) e enxaguadas cinco vezes comddH20). Sementes são colocadas em placas em meio não seletivo (1/2 MS,0,6% phytagar, 0,5g/L de MES, 1% de sacarose, 2 μg/ml de benamil).Sementes são deixadas germinar por aproximadamente dez dias. No estágiode 4-5 folhas, plantas transgênicas são plantadas em vasos de diâmetro de5,5cm e deixadas crescer (22 °C, luz contínua) por aproximadamente setedias, irrigando quando necessário. Para começar o teste, dois litros de 100iriM de NaCl e 1/8 MS são adicionados à bandeja sob os vasos. Para a bandejacontendo as plantas de controle, três litros de 1/8 MS são adicionados. Asconcentrações de Suplementação de NaCl são aumentadas em etapas por 50mM todos 4 dias até 200 mM. Após o tratamento de sal com 200 mM, pesosno estado fresco e seco das plantas assim como rendimentos de semente sãodeterminados. Genes codificando proteína relacionada com estresse de super-expressão de plantas transgênicas de Brassica napus, Glyeine max, Zea mays,Tritieum aestivum e Oryza sativa e Hordeum vulgare, Helianthus annuus,Linum usitatissimum mostram maiores pesos no estado fresco e seco e maisrendimento de semente em comparação a plantas transformadas tipo selvagemou imitadas.
Para determinar tolerância a frio, sementes das linhagenstransgênicas e de frio são germinadas e cultivadas durante aproximadamente10 dias para o estágio de 4-5 folhas como acima. As plantas são entãotransferidas a temperaturas frias (5 °C) e cultivadas através dos estágios deflorescência e de formação de semente desenvolvimental. Fotossíntese émedida usando fluorescência de clorofila como um indicador de ajustefotossintético e integridade de fotossistemas. Rendimento de sementes e pesono estado seco da planta são medidos como um indicador de produção debiomassa de planta.
Verifica-se que a super-expressão de genes relacionados comestresse de Brassica napus, Glycine max, Zea mays, Tritieum aestivum ouOryza sativa ou Hordeum vulgare, Helianthus annuus, Linum usitatissimumproveu tolerância a sal e frio assim como seca. Plantas que têm tolerância asalinidade ou frio também têm maiores rendimentos de semente, fotossíntesee produção de material seco do que as plantas suscetíveis.
Exemplo 15
Engenharia de plantas de alfafa tolerantes a estresse por super-expressãodos genes relacionados com estresse de Brassica napus, Glycine max, Zeamays ou Oryza sativa
Um clone regenerado de alfafa (Medicago sativa) étransformado usando o método de McKersie et al., 1999 (Plant Physiol 119:839-847). Regeneração e transformação de alfafa são dependentes dogenótipo e por essa razão uma planta regenerada é requerida. Métodos paraobter plantas regeneradas foram descritos. Por exemplo, essas podem serselecionadas do cultivar Rangelander (Agriculture Canada) ou qualquer outravariedade de alfafa comercial como descrito por Brown e Atanassov (1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, a variedadede RA3 (University of Wisconsin) foi selecionada para uso na cultura detecido (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659).
Explantes de pecíolo são co-cultivados com uma culturanoturna de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999Plant Physiol 119: 839-847) ou LBA4404 contendo um vetor binário. Muitossistemas de vetor binário diferentes foram descritos para transformação deplanta (por exemplo An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods inMolecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA e MR Davey eds.
Humana Press, Totowa, New Jersey). Muitos são baseados no vetor pBIN19descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721) que incluium cassete de expressão de gene de planta flanqueado por seqüências deborda esquerda e direita do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Umcassete de expressão de gene de planta consiste de pelo menos dois genes - um gene de marcador de seleção e um promotor de planta regulando atranscrição do cDNA ou DNA genômico do gene de traço. Vários genes demarcador de seleção podem ser usados incluindo o Gene de Arabidopsiscodificando uma enzima mudada acetohidroxi ácido sintase (AHAS) (USpatentes 57673666 e 6225105). Similarmente, vários promotores podem ser15 usados para regular o gene de traço que provê regulação constitutiva,desenvolvimental, de tecido ou ambiental de transcrição de gene. Nesteexemplo, o promotor 34S (números de acesso GenBankM59930 e Xl6673)foi usado para prover expressão constitutiva do gene de traço.
Os explantes são co-cultivados durante 3 d no escuro em Meio20 de indução de SH contendo 288 mg/ L de Pro, 53 mg/ L de tioprolina, 4,35 g/L de K2S04, e 100 μιη de acetosiringinona. Os explantes foram lavados emmeio de Murashige-Skoog de potência média (Murashige e Skoog, 1962) ecolocados em placas no mesmo meio de indução de SH sem acetosiringinonamas com agente de seleção apropriado e antibiótico apropriado para inibir25 crescimento de agrobactérias. Após várias semanas, embriões somáticos sãotransferidos para meio desenvolvimental de BOÍ2Y não contendo reguladoresde crescimento, antibióticos, e 50 g/ L de sacarose. Embriões somáticos sãosubseqüentemente germinados no meio de Murashige-Skoog de potênciamédia. Mudas enraizadas são transferidas em vasos e cultivadas em umaestufa para plantas.
As plantas transgênicas TO são propagadas por mudas denódulo e enraizadas em meio de cultura Turface. As plantas são desfolhadas ecultivadas até uma altura de cerca de 10 cm (aproximadamente 2 semanasapós desfolhar). As plantas são então submetidas a estresse de seca em duasexperiências.
Para a primeira experiência de seca, as mudas não recebemágua por um período de até 3 semanas em que a planta e solo ficamdessecados. Em vários tempos após a retenção de água, um cronograma deirrigação normal é iniciado. Em uma semana após iniciar a irrigação, os pesosno estado fresco e seco dos brotos são determinados. Em um grau equivalentede estresse de seca, as plantas transgênicas tolerantes são capazes de iniciar ocrescimento normal considerando plantas de tipo selvagem suscetíveis têmmorrido ou sofrido dano significante resultando em menos material seco. Teorde prolina das folhas e abertura estomatal são também medidos em váriostempos durante o estresse de seca.Plantas transgênicas tolerantes mantêm ummenor teor de prolina e uma maior abertura estomatal do que as plantas decontrole não transgênicas.
Um método alternativo para impor estresse a água nas plantastransgênicas é por tratamento com uma solução em potencial de águaespecífico, contendo um osmólito tal como polietileno glicol (PEG). Otratamento de PEG é dado a ou folhas separadas (por exemplo Djilianov et al.,1997 Plant Science 129: 147-156) ou à raízes (Wakabayashi et al., 1997 PlantPhysiol 113: 967-973). Uma vez que PEG pode ser tóxico, as plantas recebemapenas uma exposição de termo curto. A resposta é medida como medidasfísicas tal como abertura estomatal ou potencial osmótico, ou medidasbioquímicas tal como acúmulo de prolina. Plantas tolerantes mantém suaabertura estomatal e mostram apenas mudanças leves em potencial osmótico,enquanto as plantas de controle não transgênicas suscetíveis fecham seusestornas demonstram aumentado potencial osmótico. Além das mudanças emprolina e outros metabólitos são menores nas plantas transgênicas tolerantesdo que nas plantas de controle não transgênicas.
Tolerância a salinidade e frio é medida usando métodos comodescrito no exemplo 3. Verifica-se que plantas de alfafa super-expressandogenes relacionados com estresse de Brassica napus, Glycine max, Zea mays,Tritieum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeum vulgare, Helianthus annuus,Linum usitatissimum, são mais resistentes a estresse de frio e salinidade doque plantas de controle não transgênicas. Plantas que têm tolerância asalinidade ou frio também têm maiores rendimentos de semente, fotossíntesee produção de material seco do que as plantas suscetíveis.Exemplo 16
Engenharia de plantas de centeio tolerantes a estresse por super-expressão de genes relacionados com estresse de Brassica napus, Glycinemax, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa ouHordeum vulgare, Helianthus annuus, Linum usitatissimum
Sementes de várias variedades de azévem diferentes podem serusadas como fontes de explantes para transformação, incluindo uma variedadecomercial Gunne disponível da empresa de sementes Svalof Weibull ou avariedade Affinity. Sementes são esterilizadas na superfície seqüencialmentecom 1% de Tween-20 durante 1 minuto, 100 % de alvejante por 60 minutos, 3enxágües com 5 minutos cada com H20 desionizado e destilado, e entãogerminadas por 3-4 dias em papel de filtro estéril, úmido, no escuro. Mudassão ainda esterilizadas durante 1 minuto com 1% de Tween-20, 5 minutoscom alvejante a 75%, e enxaguadas 3 vezes com ddH20, 5 min cada.
Sementes esterilizadas na superfície são colocadas no meio deindução de calo contendo sais de base de Murashige e Skoog e vitaminas, 20g/l de sacarose, 150 mg/l de asparagina, 500 mg/l de hidrolisado de caseína, 3g/l de Fitagel, 10 mg/l de BAP, e 5 mg/l dicamba. Placas são incubadas noescuro a 25 0C por 4 semanas para germinação de semente e indução de caloembriogênico.
Após 4 semanas no meio de indução do calo, os brotos e raízesdas mudas são cortados fora, o calo é transferido para meio novo, mantidosem cultura por outras 4 semanas, e então transferidos para Meio de MSO emluz durante 2 semanas. Vários pedaços de calos (11-17 semanas de idade) sãoou forçados através de uma 10 peneira de malha e colocados no meio deindução do calo, ou cultivados em 100 ml de meio de indução do calo líquidode azévem (mesmo meio como para indução do calo com agar) em um frascode 250 ml. O frasco é embalado em folha metálica e agitado a 175 rpm noescuro a 23 0C durante 1 semana. Peneirar a cultura líquida com uma peneirade malha 40 coletar as células. A fração coletada na peneira é colocada emplacas e cultivada em meio de indução do calo sólido de azévem durante 1semana no escuro a 25 °C. O calo é então transferido e cultivado no meio deMS contendo 1% de sacarose durante 2 semanas.
Transformação pode ser realizada com ou Agrobacterium oucom métodos de bombardeio de partículas. Um vetor de expressão é criadocontendo uma promotor de planta constitutivo e o cDNA do gene em umvetor de pUC. O DNA plasmídeo é preparado de células de E. coli usandocom kit Qiagen de acordo com instrução do fabricante. Aproximadamente 2 gde calo embriogênico é difundido no centro de um papel de filtro estéril emuma placa de petri. Uma alíquota de MSO líquido com 10 g/l de sacarose éadicionada ao papel de filtro. Partículas de ouro (1,0 μιη em tamanho) sãorevestidas com DNA plasmídeo de acordo com método de Sanford et al.,1993 e distribuídas no calo embriogênico com os seguintes parâmetros:partículas de 500 μg e DNA 2 μg por tiro, 91,3 kg/cm2 e uma distância dealvo de 8,5 cm de placa de parada para placa de calo e 1 tiro por placa de calo.
Após o bombardeio, calos são transferidos de volta ao meiodesenvolvimental de calo fresco e mantido no escuro a temperatura ambientefor um período de 1 semana. O calo é então transferido para condições decrescimento na luz a 25 0C para iniciar a diferenciação de embrião com oagente de seleção apropriado, por exemplo 250 nM Arsenal, 5 mg/l de PPT ou50 mg/L de canamicina. Brotos resistentes ao agente de seleção apareceram euma vez enraizados ?? são transferidos ao solo.
Amostras das plantas transgênicas primárias (TO) sãoanalisadas por PCR para confirmar a presença de T DNA. Estes resultadossão confirmados por hibridização Southern em que DNA é submetido aeletroforese em um gel agarose 1% e transferido para um membrana de náiloncarregada positivamente (Roche Diagnostics). O kit de síntese de sonda DIGPCR (Roche Diagnostics) é usado para preparar a sonda rotulada comdigoxigenina por PCR, e usado como recomendado pelo fabricante.
Plantas de azévem TO transgênicas são propagadasvegetativãmente por excisão dos rebentos. Os rebentos transplantados forammantidos na estufa para plantas durante 2 meses até estarem bemestabilizados. Os brotos são desfolhados e deixados crescer durante 2semanas.
A primeira experiência de seca é conduzida em uma maneirasimilar a que descrita no exemplo 3. As mudas não recebem água por umperíodo de até 3 semanas em que a planta e solo ficam dessecados. Em váriostempos após retenção de água, um cronograma de irrigação normal é iniciado.
Em uma semana após iniciar a irrigação, os comprimentos de lâminas defolhas, e os pesos no estado fresco e seco dos brotos é determinado. Em umgrau equivalente de estresse de seca, plantas tolerantes são capazes de iniciaro crescimento normal considerando que e plantas suscetíveis têm morrido ousofrido dano significante resultando em folhas menores e menos materialseco. Teor de prolina das folhas e abertura estomatal são também medidas emvários tempos durante o estresse de seca. Plantas tolerantes mantêm ummenor teor de prolina e uma maior abertura estomatal do que as plantas decontrole não transgênicas.
Uma segunda experiência impondo estresse de seca nasplantas transgênicas foi por tratamento com uma solução PEG como descritonos exemplos anteriores. Tolerância a salinidade e frio foi medida usandométodos como descrito no exemplo 3. Verifica-se que plantas de azévemsuper-expressando genes relacionados com estresse de Brassica napus,Glycine max, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeumvulgare, Helianthus annuus, Linum usitatissimum, são mais resistentes asalinidade e estresse de frio que plantas de controle não transgênicas. Plantasque têm tolerância a salinidade ou frio também têm maiores rendimentos desemente, fotossíntese e produção de material seco do que as plantassuscetíveis.
Exemplo 17
Engenharia de plantas de soja tolerantes a estresse por super-expressãode genes relacionados com estresse de Brassica napus, Glycine max, Zeamays, Triticum aestivum ou Oryza sativa ouHordeum vulgare, Helianthus annuus, Linum usitatissimum,
Soja é transformada de acordo com a seguinte modificação dométodo descrito na patente de Texas A&M US 5.164.310. Várias variedadesde soja comerciais podem levar à transformação por esse método. O cultivarJack (disponível da Illinois Seed Foundation) é um comumente usado paratransformação. Sementes são esterilizadas por imersão em 70% (v/v) deetanol por 6 min e em alvejante a 25% comercial (NaOCl) suplementado com0,1% (v/v) de Tween durante 20 min, seguido por enxágue 4 vezes com águadestilada duplamente estéril. Mudas de sete dias de idade são propagadasremovendo a radícula, hipocótile e um cotilédone de cada muda. Então, oepicótile com um cotilédone é transferido para meio de germinação fresco emplacas de Petri e incubados a 25 0C sob um fotoperíodo de 16 h(aproximadamente 100 μΕ-πι-28-1) por três semanas. Nódulos axilares(aproximadamente 4 mm de comprimento) são cortados de plantas de 3 - 4semanas de idade. Nódulos axilares são excisados e incubados em cultura deAgrobacterium LBA4404.
Muitos sistemas de vetores binários diferentes foram descritospara transformação de planta (por exemplo An, G. in AgrobacteriumProtocols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA eMR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Muitos são baseados novetor pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721) que inclui um cassete de expressão de gene de planta flanqueado porseqüências de borda esquerda e direita do plasmídeo Ti de Agrobacteriumtumefaciens. Um cassete de expressão de gene de planta consiste de pelomenos dois genes - um gene de marcador de seleção e um promotor de plantaregulando a transcrição do cDNA ou DNA genômico do gene de traço. Váriosgenes de marcador de seleção podem ser usados incluindo o gene deArabidopsis codificando uma enzima acetohidroxi ácido sintase mudada(AHAS) (patentes US 57673666 e 6225105). Similarmente, váriospromotores podem ser usados para regular o gene de traço para proverregulação constitutiva, desenvolvimental, de tecido ou ambiental detranscrição de gene. Neste exemplo, o promotor 34S (números de acessoGenBankM59930 e Xl6673) é usado para prover expressão constitutiva dogene de traço.
Após o tratamento de co-cultivo, os explantes são lavados etransferidos para meios de seleção suplementados com 500 mg/L detimentina. Brotos são excisados e colocados em um meio de alongamento debroto. Brotos maiores do que 1 cm são colocados no meio de cultura de raizpor duas a quatro semanas antes de transplantar ao solo.
As plantas transgênicas primárias (TO) são analisadas por PCRpara confirmar a presença de T DNA. Estes resultados são confirmados porhibridização Southern em que DNA é submetido a eletroforese em um gelagarose a l%e transferido para uma membrana de náilon carregadapositivamente (Roche Diagnostics). O kit de síntese de sonda DIG de PCR(Roche Diagnostics) é usado para preparar a sonda rotulada com digoxigeninapor PCR5 e usado como recomendado pelo fabricante.
Plantas de soja tolerantes a estresse super-expressando genesrelacionados com estresse de Brassica napus, Glycine max, Zea mays,Triticum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeum vulgare, Helianthus annuus,Linum usitatissimum têm maiores rendimentos de semente, mantêm suaabertura estomatal e mostram apenas mudanças leves em níveis de prolina epotencial osmótico, enquanto as plantas de controle não transgênicassuscetíveis fecham seus estornas e demonstram aumentados níveis de prolinae potencial osmótico.
Tolerância a seca, salinidade e frio é medida usando métodoscomo descrito no exemplo 3. Plantas que demonstraram tolerância asalinidade ou frio têm maiores rendimentos de semente, fotossíntese eprodução de material seco do que as plantas suscetíveis.Exemplo 18
Engenharia de plantas de colza/canola tolerantes a estresse por super-expressão de genes relacionados com estresse de Brassica napus, Glycinemax, Zea mays,, Triticum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeum vulgare,Helianthus annuus, Linum usitatissimum
Pecíolos cotiledonários e hipocótiles de mudinhas jovens de 5-6 dias de idade são usados como explantes para cultura de tecido etransformada de acordo com Babic et ai. (1998, Cell Plant Rep 17: 183-188).O cultivar Westar comercial (Agriculture Canada) é a variedade padrão usadapara transformação, mas outras variedades podem ser usadas.
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 contendo um vetorbinário é usado para transformação de canola. Muitos sistemas de vetorbinário diferentes foram descritos para transformação de planta (por exemploAn, G. in Agrobacterium Protoeols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp47-62, Gartland KMA e MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey).Muitos são baseados no vetor pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic AcidResearch. 1984. 12:8711-8721) que inclui um cassete de expressão de gene deplanta flanqueado por seqüências de borda esquerda e direita do plasmídeo Tide Agrobacterium tumefaciens. Um cassete de expressão de gene de plantaconsiste de pelo menos dois genes - um gene de marcador de seleção e umpromotor de planta regulando a transcrição do cDNA ou DNA genômico dogene de traço. Vários genes de marcador de seleção podem ser usadosincluindo o gene de Arabidopsis codificando uma enzima acetohidroxi ácidosintase mudada (AHAS) (US patentes 57673666 e 6225105). Similarmente,vários promotores podem ser usados para regular o gene de traço para proverregulação constitutiva, desenvolvimental, de tecido ou ambiental detranscrição de gene. Neste exemplo, o promotor 34S (números de acessoGenBankM59930 e Xl6673) é usado para prover a expressão constitutiva dogene de traço.
Sementes de canola são esterilizadas na superfície em etanol a70% durante 2 min., e então em Clorox a 30%com uma gota de Tween-20durante 10 min, seguido por três enxágües com água destilada esterilizada.Sementes são então germinadas in vitro 5 dias no meio de MS de potênciamédia, sem hormônios, 1% de sacarose, 0,7% Phytagar a 23oC, 16 h em luz.Os explantes de pecíolo de cotilédone com o cotilédone preso são excisadosdas mudas in vitro, e inoculados com agrobactérias por imersão daextremidade cortada do explante do pecíolo na suspensão bacteriana. Osexplantes são então cultivados durante 2 dias no meio de MSBAP-3 contendo3 mg/l de BAP, 3 % de sacarose, 0,7 % de Phytagar a 23 0C, 16 h em luz.Após dois dias de co-cultivo com Agrobacterium, os explantes do pecíolo sãotransplantados para meio MSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, cefotaxima,carbenicilina, ou timentina (300 mg/l) por 7 dias, e então cultivados no meiode MSBAP-3 com cefotaxima, carbenicilina, ou timentina e agente de seleçãoaté regeneração de broto. Quando os brotos tem 5-10 mm de comprimento,eles são cortados e transferidos para meio de alongamento de broto (MSBAP-0,5, contendo 0,5 mg/l de BAP). Brotos de cerca de 2 cm em comprimentosão transferidos para o meio de cultura de raiz (MSO) para indução de raiz.
Amostras das plantas transgênicas primárias (TO) sãoanalisadas por PCR para confirmar a presença de T DNA. Estes resultadossão confirmados por hibridização Southern em que DNA é submetido aeletroforese em 1 % de gel de agarose e transferido para a membrana denáilon carregada positivamente (Roche Diagnostics). O kit de síntese desonda DIG PCR (Roche Diagnostics) é usado para preparar a sonda rotuladacom digoxigenina por PCR, e usado como recomendado pelo fabricante.
As plantas transgênicas são então avaliadas por sua tolerânciaa estresse melhorada de acordo com o método descrito no exemplo 3.Verifica-se que com colza/canola transgênica super-expressando genesrelacionados com estresse de Brassica napus, Glycine max, Zeamays,Triticum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeum vulgare, Helianthusannuus, Linum usitatíssimum são mais tolerantes a estresse ambiental que asplantas de controle não transgênicas. Plantas tolerantes têm maioresrendimentos de semente, mantêm sua abertura estomatal e mostram apenasmudanças leves em níveis de prolina e potencial osmótico, enquanto asplantas de controle não transgênicas suscetíveis fecham seus estornas edemonstraram aumentados níveis de prolina e potencial osmótico. Plantas quetêm tolerância a salinidade ou frio têm maiores rendimentos de semente,fotossíntese e produção de material seco do que as plantas suscetíveis.
Exemplo 19
Engenharia de plantas de milho tolerantes a estresse por super-expressãode genes relacionados com estresse de Brassica napus, Glycine max, Zeamays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa ouHordeum vulgare, Helianthus annuus, Linum usitatissimum,
Transformação de milho (Zea mays L.) é realizada com umamodificação do método descrito por Ishida et al. (1996. Nature Biotech14745-50). Transformação é dependente de genótipo em milho e apenasgenótipos específicos são responsáveis para transformação e regeneração. Alinhagem pura Al88 (University of Minnesota) ou híbridos com Al 88 comoum parental são boas fontes de material doador para transformação (Fromm etal. 1990 Biotech 8:833-839), mas outros genótipos podem ser usados comsucesso bem como. Espigas são colhidas de plantas de milho aaproximadamente 11 dias após polinização (DAP) quando o comprimento deembriões imaturos é de cerca de 1 a 1,2 mm. Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens que transporta vetor "superbinários" e plantas transgênicas são recuperadas através de organogenese. Osistema de vetor super binário de Japan Tabaco é descrito e nas patentes WOW094/00977 e W095/06722. Vetores são construídos como descrito. Váriosgenes de marcador de seleção podem ser usados incluindo o gene de milhocodificando uma enzima mudada acetohidroxi ácido sintase (AHAS) (patenteUS 6025541). Similarmente, vários promotores podem ser usados pararegular o gene de traço para prover regulação constitutiva, desenvolvimental,de tecido ou ambiental de transcrição de gene. Neste exemplo, o promotor34S (números de acesso GenBank M59930 e Xl6673) é usado para proverexpressão constitutiva do gene de traço.
Embriões excisados são cultivados no meio de indução docalo, então meio de regeneração de milho, contendo imidazolinona como umagente de seleção. As placas de Petri foram incubadas na luz a 25 0C durante2-3 semanas, ou até os brotos se desenvolverem. Os brotos verdes de cadaembrião são transferidos para meio de cultura de raiz de milho e incubados adurante 2-3 semanas, até as raízes se desenvolverem. Os brotos comraízes são transferidos para o solo na estufa para plantas. Sementes de Tl sãoproduzidas de plantas que demonstram tolerância aos herbicidasimidazolinona e são PCR positivas para os transgenes.
As plantas transgênicas Tl são então avaliadas por suatolerância a estresse melhorada de acordo com os métodos descrito noexemplo 3. A Geração Tl de inserções de local simples do T- DNA irásegregar do transgene em uma relação de 1:2:1. As progênies contendo umaou duas cópias do transgene (3/4 da progênie) são tolerantes ao herbicidaimidazolinona, e demonstram maior tolerância a estresse de seca do que as deprogênie faltando os transgenes. Plantas tolerantes têm maiores rendimentosde semente, mantiveram sua abertura estomatal e mostraram somentemudanças leves em níveis de prolina e potencial osmótico, enquanto asplantas de controle não transgênicas suscetíveis fecharam seus estomatas edemonstraram aumentados níveis de prolina e potencial osmótico. Plantas T2homozigóticas demonstraram fenótipos similares. Plantas híbridas (progênieFl) de plantas transgênicas homozigóticas e plantas não transgênicas tambémdemonstraram aumentada tolerância de estresse ambiental.
Tolerância a salinidade e frio é medida usando métodos comodescrito no exemplo anterior 3. Novamente, plantas de milho transgênicassuper-expressando genes relacionados com estresse de Brassica napus,Glycine max, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeumvulgare, Helianthus annuus, Linum usitatissimum são verificadas como sendotolerantes a estresse ambiental. Plantas que têm tolerância a seca, salinidadeou frio têm maiores rendimentos de semente, fotossíntese e produção dematerial seco do que as plantas suscetíveis.
Exemplo 20
Engenharia de plantas de trigo tolerantes a estresse por super-expressãode genes relacionados com estresse de Brassica napus, Glycine max, Zeamays, Triticum aestivum ou Oryza sativa ouHordeum vulgare, Helianthus annuus, Linum usitatissimumTransformação de trigo é realizada com o método descrito porIshida et al. (1996 Nature Biotech. 14745-50). O cultivar Bobwhite(disponível da CYMMIT, México) é comumente usado em transformação.Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens quetransportam vetor "super binários", e plantas transgênicas são recuperadasatravés de organogenese. O sistema de vetor super binário de Japan Tabaco édescrito em patentes WO W094/00977 e W095/06722. Vetores sãoconstruídos como descrito. Vários genes de marcador de seleção podem serusados incluindo o gene de milho codificando uma enzima acetohidroxi ácidosintase mudada (AHAS) (US patente 6025541). Similarmente, váriospromotores podem ser usados para regular o gene de traço para proverregulação constitutiva, desenvolvimental, de tecido ou ambiental detranscrição de gene. Neste exemplo, o promotor 34S (números de acessoGenBank M59930 e Xl6673) é usado para prover expressão constitutiva dogene de traço.
Após incubação com agrobactérias, os embriões são cultivadosno meio de indução do calo, então meio de regeneração, contendoimidazolinona como um agente de seleção. As placas de Petri são incubadasna luz a 25 °C durante 2-3 semanas, ou até brotos desenvolverem. Os brotosverdes são transferidos de cada embrião para meio de cultura de raiz eincubados a 25 °C durante 2-3 semanas, até raízes desenvolverem. Os brotoscom raízes são transferidos para solo na estufa para plantas. Sementes de Tlsão produzidas a partir de plantas que demonstram tolerância aos herbicidasimidazolinona e que são PCR positivas para os transgenes.
As plantas transgênicas Tl são então avaliadas por suatolerância melhorada a estresse de acordo com o método descrito no exemploanterior 3. A geração Tl de inserções de local simples do T- DNA irásegregar do transgene em uma relação de 1:2:1. As progênies contendo umaou duas cópias do transgene (3/4 da progênie) são tolerantes ao herbicidaimidazolinona, e demonstram maior tolerância a estresse de seca do que as deprogênie faltando os transgenes. Plantas tolerantes têm maiores rendimentosde semente, mantiveram sua abertura estomatal e mostraram somentemudanças leves em níveis de prolina e potencial osmótico, enquanto asplantas de controle não transgênicas suscetíveis fecharam seus estomatas edemonstraram aumentados níveis de prolina e potencial osmótico. Plantas T2homozigóticas demonstraram fenótipos similares. A tolerância a salinidade efrio é medida usando métodos como descrito nos exemplos anteriores. Plantasque super-expressaram genes relacionados com estresse de Brassica napus,Glycine max, Zea mays, Tritieum aestivum ou Oryza sativa ou Hordeumvulgare, Helianthus annuus, Linum usitatissimum, têm tolerância a seca,salinidade ou frio e demonstraram maiores rendimentos de semente,fotossíntese e produção de material seco que plantas não transgênicassuscetíveis.
Exemplo21
Identificação de genes idênticos e heterólogos
Seqüências de gene podem ser usadas para identificar genesidênticos ou heterólogos de bibliotecas de cDNA ou genômicas. Genesidênticos (por exemplo clones de cDNA de comprimento completo) podemser isolados via hibridização de ácido nucleico usando por exemplobibliotecas de cDNA. Dependendo da abundância do gene de interesse,100.000 até 1.000.000 bacteriófagos recombinantes são colocados emplacas etransferidos para membranas de náilon. Após desnaturação com álcali, DNA éimobilizado na membrana por, por exemplo, reticulação por UY. Hibridizaçãoé efetuada em condições de alta estringência. Em solução aquosa,hibridização e lavagem são realizadas em um potência iônica de NaCl 1 M euma temperatura de 68°C. Sondas de hibridização são geradas por, porexemplo, rotulação de transcrição "nick" radioativa (32P) (High Prime, Roche,Mannheim, Alemanha). Sinais são detectados por autoradiografia.Genes parcialmente idênticos ou heterólogos que são similaresmas não idênticos podem ser identificados em uma maneira análoga aoprocedimento acima descrito usando condições de hibridização deestringência baixa e lavagem. Para hibridização aquosa, a potência iônica énormalmente mantida a NaCl 1 M enquanto a temperatura é progressivamenteabaixada de 68 a 42°C.
Isolamento de seqüências de gene com homologia (ouidentidade/similaridade de seqüência) em apenas um domínio distinto de porexemplo 10-20 aminoácidos pode ser efetuado usando sondas deoligonucleotídeo radio- rotulados sintéticos. Oligonucleotídeos radio-rotulados são preparados por fosforilação da extremidade inicial 5 de doisoligonucleotídeos complementares com T4 polinucleotídeo quinase. Osoligonucleotídeos complementares são anelados e ligados para formarconcatêmeros. Os concatêmeros de filamentos duplos são então radio-rotulados por, por exemplo, transcrição "nick". Hibridização é normalmenterealizada em condições de estringência baixa usando altas concentrações deoligonucleotídeo.
Solução de hibridização de oligonucleotídeo:
6 χ SSCFosfato de sódio MmM de EDTA (pH 8)0,5 % de SDS100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado% leite em pó desengordurado
Durante hibridização, temperatura é abaixada em etapas para5-10°C abaixo do Tm estimado de oligonucleotídeo ou abaixo de temperaturaambiente seguido por etapas de lavagem e auto-radiografia. Lavagem érealizada com estringência baixa tal como 3 etapas de lavagem usando 4 χSSC. Outros detalhes são descritos por Sambrook, J. et al., 1989, "MolecularCloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press ouAusubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology," JohnWiley & Sons.
Exemplo 22
Identificação de genes idênticos ou homólogos por triagem de bibliotecasde expressão de anticorpos
Clones de c-DNA podem ser usados para produzirpolipeptídeo recombinante por exemplo em E. coli (por exemplo sistemasQiagen QIAexpress pQE). Polipeptídeos recombinantes são entãonormalmente purificados por afinidade via cromatografia de afinidade de Ni-NTA (Qiagen). Polipeptídeos recombinantes são então usados para produziranticorpos específicos por exemplo usando técnicas padrões de imunização decoelho. Anticorpos são purificados por afinidade usando uma coluna Ni-NTAsaturada com o antígeno recombinante como descrito por Gu et al., 1994,BioTechniques 17:257-262. O anticorpo pode então ser usado para triarbibliotecas de cDNA de expressão para identificar genes idênticos ouheterólogos via uma triagem imunológica (Sambrook, J. et al., 1989,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor LaboratoryPress ou Ausubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols in MolecularBiology", John Wiley & Sons).
Exemplo 23
Mutagenese in vivo
Mutagenese in vivo de microorganismos pode ser realizada porpassagem de DNA plasmídeo (ou outro vetor) através de E. coli ou outrosmicroorganismos (por exemplo Bacillus spp. ou leveduras tal comoSaccharomyces cerevisiae), que são afetadas em suas capacidades paramanter a integridade de sua informação genética. Cepas mutator típicas têmmutações nos genes do sistema de reparo de DNA (por exemplo, mutHLS,mutD, mutT, etc.; por referência, ver Rupp, W.D., 1996, DNA repairmechanisms, in: Escherichia eoli e Salmonella, ρ. 2277-2294, ASM:Washington.) Tais cepas são bem conhecidas do versado. O uso de tais cepasé ilustrado, por exemplo, em Greener, A. e Callahan, M., 1994, Strategies 7:32-34. Transferência de moléculas de DNA mudadas em plantas épreferivelmente feita após a seleção e o teste em microorganismos. Plantastransgênicas são geradas de acordo com vários exemplos dento daexemplificação deste documento.<table>table see original document page 221</column></row><table><table>table see original document page 222</column></row><table><table>table see original document page 223</column></row><table><table>table see original document page 224</column></row><table><table>table see original document page 225</column></row><table><table>table see original document page 226</column></row><table><table>table see original document page 227</column></row><table><table>table see original document page 228</column></row><table><table>table see original document page 229</column></row><table><table>table see original document page 230</column></row><table><table>table see original document page 231</column></row><table><table>table see original document page 232</column></row><table><table>table see original document page 233</column></row><table><table>table see original document page 234</column></row><table><table>table see original document page 235</column></row><table><table>table see original document page 236</column></row><table><table>table see original document page 237</column></row><table><table>table see original document page 238</column></row><table><table>table see original document page 239</column></row><table><table>table see original document page 240</column></row><table><table>table see original document page 241</column></row><table><table>table see original document page 242</column></row><table><table>table see original document page 243</column></row><table><table>table see original document page 244</column></row><table><table>table see original document page 245</column></row><table><table>table see original document page 246</column></row><table><table>table see original document page 247</column></row><table><table>table see original document page 248</column></row><table><table>table see original document page 249</column></row><table><table>table see original document page 250</column></row><table><table>table see original document page 251</column></row><table><table>table see original document page 252</column></row><table><table>table see original document page 253</column></row><table><table>table see original document page 254</column></row><table><table>table see original document page 255</column></row><table><table>table see original document page 256</column></row><table><table>table see original document page 257</column></row><table>

Claims (27)

1. Célula de planta transgênica, caracterizada pelo fato de quea tolerância e/ou resistência a estresse ambiental é aumentada comocomparada a uma célula de planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente por transformação com um ácido nucleico codificando umaproteína relacionada com estresse (SRP) selecionado dentre o grupoconsistindo de:a) molécula de ácido nucleico codificando um dospolipeptídeos como mostrado na tabela II, colunas 4 e 5 ou um fragmento dosmesmos, que confere uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental em um organismo ou uma parte do mesmo;b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma dasmoléculas de ácido nucleico como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5,c) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode serdeduzida de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula deácido nucleico de (a) ou (b) como um resultado da degenerescência do códigogenético e conferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo;d) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeoque tem pelo menos 50% identidade com a seqüência de aminoácido dopolipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalem um organismo ou uma parte do mesmo;e) molécula de ácido nucleico que hibridiza com a molécula deácido nucleico de (a) a (c) sob condições de hibridização estringentes econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalem um organismo ou uma parte do mesmo;f) molécula de ácido nucleico que engloba uma molécula deácido nucleico que é obtida por amplificação de moléculas de ácido nucleicode uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando osiniciadores como mostrado na tabela III, coluna 5 e conferindo uma tolerânciae/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo;g) molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeoque é isolado com a ajuda de anticorpos monoclonais contra um polipeptídeocodificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (f) e conferindouma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo;h) molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeocompreendendo a seqüência de consenso mostrada na tabela IV, coluna 5 econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo ei) molécula de ácido nucleico que é obtenível por triagem deuma biblioteca de ácido nucleico apropriada sob condições de hibridizaçãoestringentes com uma sonda compreendendo uma das seqüências da moléculade ácido nucleico de (a) a (g) ou com um fragmento da mesma tendo pelomenos 15 nt, preferivelmente 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt ou 500 nt damolécula de ácido nucleico caracterizada em (a) a (i) e conferindo umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo,ou compreendendo uma seqüência que é complementar àmesma.
2. Célula de planta transgênica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de ser derivada de uma planta monocotiledônea.
3. Célula de planta transgênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 ou 2 caracterizada pelo fato de ser derivada de umaplanta dicotiledônea.
4. Célula de planta transgênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-3, caracterizada pelo fato que a planta é selecionadadentre o grupo consistindo de milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz,cevada, soja, amendoim, algodão, colza, canola, mandioca, pimentão,girassol, linho, borragem, cártamo, linhaça, prímula, colza, nabo selvagem,tagetes, plantas solanáceas, batata, tabaco, berinjela, tomate, espécies Vicia,ervilha, alfalfa, café, cacau, chá, espécie Salix, palma oleígena, coco, gramaperene, culturas de forragem e Arabidopsis thaliana.
5. Célula de planta transgênica de acordo com a reivindicação1, caracterizada pelo fato de ser derivada de uma planta gimnosperma.
6. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser gerada deuma célula de planta como definida em qualquer uma das reivindicações 1-4e que é uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea.
7. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de ser selecionada dentre o grupo consistindo demilho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão,colza, canola, mandioca, pimentão, girassol, linho, borragem, cártamo,linhaça, prímula, colza, nabo selvagem, tagetes, plantas solanáceas, batata,tabaco, berinjela, tomate, espécies Vicia, ervilha, alfalfa, café, cacau, chá,espécie Salix, palma oleígena, coco, grama perene, culturas de forragem eArabidopsis thaliana.
8. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser gerada deuma célula de planta como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5e que é uma planta gimnosperma.
9. Semente, caracterizada pelo fato de ser produzida por umaplanta transgênica como definida em qualquer uma das reivindicações 5-8, emque em que a semente é geneticamente homozigótica para um transgeneconferindo tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma célula de planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente resultando em uma aumentada tolerância a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente.
10. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fatode compreender uma molécula de ácido nucleico selecionada dentre o grupoconsistindo de :a) molécula de ácido nucleico codificando um dospolipeptídeos para como mostrado na tabela II, colunas 4 e 5 ou umfragmento dos mesmos, que confere uma tolerância e/ou resistênciaaumentadas a estresse ambiental em um organismo ou uma parte do mesmo;b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma dasmoléculas de ácido nucleico como mostrado na tabela I, colunas 4 e 5;c) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode serdeduzida de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula deácido nucleico de (a) ou (b) como um resultado da degenerescência do códigogenético e conferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo;d) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeoque tem pelo menos 50% identidade com a seqüência de aminoácido dopolipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalem um organismo ou uma parte do mesmo;e) molécula de ácido nucleico que hibridiza com a molécula deácido nucleico de (a) a (c) sob condições de hibridização estringentes econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalem um organismo ou uma parte do mesmo;f) molécula de ácido nucleico que engloba uma molécula deácido nucleico que é obtida por amplificação de moléculas de ácido nucleicode uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando osiniciadores como mostrado na tabela III, coluna 5 e conferindo uma tolerânciae/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo;g) molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeoque é isolado com a ajuda de anticorpos monoclonais contra um polipeptídeocodificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (f) e conferindouma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo;h) molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeocompreendendo a seqüência de consenso mostrada na tabela IV, coluna 5 econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo ei) molécula de ácido nucleico que é obtenível por triagem deuma biblioteca de ácido nucleico apropriada sob condições de hibridizaçãoestringentes com uma sonda compreendendo uma das seqüências da moléculade ácido nucleico de (a) a (g) ou com um fragmento da mesma tendo pelomenos 15 nt, preferivelmente 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt ou 500 nt damolécula de ácido nucleico caracterizada em (a) a (i) e conferindo umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo,em que a molécula de ácido nucleico se distingue sobre aseqüência como mostrado na tabela I A e/ou tabela I B, colunas 4 e 5 por umou mais nucleotídeos.
11. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fatode compreender a molécula de ácido nucleico selecionada dentre o grupoconsistindo de:a) molécula de ácido nucleico codificando um dospolipeptídeos para como mostrado na tabela II, preferivelmente tabela II B,colunas 4 e 5 ou um fragmento dos mesmos, que confere uma tolerância e/ouresistência aumentadas a estresse ambiental em um organismo ou uma partedo mesmo;b) molécula de ácido nucleico compreendendo uma dasmoléculas de ácido nucleico como mostrado na tabela I, preferivelmentetabela IB, coluna 4 e/ou 5c) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode serdeduzida de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula deácido nucleico de (a) ou (b) como um resultado da degenerescência do códigogenético e conferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental como comparado com uma planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente em um organismo ou uma parte do mesmo;d) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeoque tem pelo menos 50% identidade com a seqüência de aminoácido dopolipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalem um organismo ou uma parte do mesmo;e) molécula de ácido nucleico que hibridiza com a molécula deácido nucleico de (a) a (c) sob condições de hibridização estringentes econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalem um organismo ou uma parte do mesmo;f) molécula de ácido nucleico que engloba uma molécula deácido nucleico que é obtida por amplificação de moléculas de ácido nucleicode uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando osiniciadores como mostrado na tabela III, coluna 5 e conferindo uma tolerânciae/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparado com umaplanta de tipo selvagem não transformada correspondente em um organismoou uma parte do mesmo;g) molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeoque é isolado com a ajuda de anticorpos monoclonais contra um polipeptídeocodificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (f) e conferindouma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo;h) molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeocompreendendo a seqüência de consenso mostrada na tabela IV, coluna 5 econferindo uma tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambientalcomo comparado com uma planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente em um organismo ou uma parte do mesmo ei) molécula de ácido nucleico que é obtenível por triagem deuma biblioteca de ácido nucleico apropriada sob condições de hibridizaçãoestringentes com uma sonda compreendendo uma das seqüências da moléculade ácido nucleico de (a) a (g) ou com um fragmento da mesma tendo pelomenos 15 nt, preferivelmente 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt ou 500 nt damolécula de ácido nucleico caracterizada em (a) a (i) e conferindo umatolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma planta de tipo selvagem não transformada correspondente em umorganismo ou uma parte do mesmo.
12. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque confere a expressão da molécula de ácido nucleico da reivindicação 10 ou-11, compreendendo um ou mais elementos regulatórios, pelo que a expressãodo ácido nucleico codificando SRP em uma célula hospedeira resulta emtolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental como comparadocom uma célula de planta de tipo selvagem não transformada correspondente.
13. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender a moléculade ácido nucleico como definido na reivindicação 10 ou 11 ou umaconstrução de ácido nucleico como definida na reivindicação 12, pelo que aexpressão do ácido nucleico codificando SRP em uma célula hospedeiraresulta em tolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comocomparado com uma célula de planta de tipo selvagem não transformadacorrespondente.
14. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que foitransformada estavelmente ou transientemente com o vetor como definido nareivindicação 13 ou a molécula de ácido nucleico como definida nareivindicação 10 ou 11 ou um construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 12.
15. Proteína relacionada com estresse isolada (SRP)caracterizada pelo fato de que é selecionada dentre o grupo compreendendo asseqüências como mostradas na tabela II, preferivelmente tabela II B, coluna 4e/ou 5 e/ou homólogos das mesmas.
16. Proteína relacionada com estresse isolada (SRP) de acordocom a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que é selecionada dentrelevedura, preferivelmente Saccharomyces eerevisiae, ou E.eoli ou Brassieanapus, Glyeine max, Zea mays, Hordeum vulgare, Helianthus annuus, Linumusitatissimum, Tritieum aestivum ou Oryza sativa.
17. Método para produzir uma planta transgênica comtolerância e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental comparada comuma célula de planta de tipo selvagem não transformada correspondente, emque a tolerância e/ou resistência a estresse ambiental é alterada por expressãode um ácido nucleico codificando uma proteína relacionada com estresse(SRP) e resulta em tolerância e/ou resistência aumentadas a um estresseambiental como comparado com uma célula de planta de tipo selvagem nãotransformada correspondente, caracterizado pelo fato de compreendera) transformar uma célula de planta com um vetor deexpressão como definido na reivindicação 16 eb) gerar a partir da célula de planta uma planta transgênicacom uma aumentada tolerância a estresse ambiental como comparado comuma planta de tipo selvagem não transformada correspondente.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o ácido nucleico codificando SRP é selecionado dentre ogrupo compreendendo os ácidos nucleicos como definidos nas reivindicações-10 e 11.
19. Método para modificar a tolerância a estresse de umaplanta caracterizado pelo fato de compreender modificar o nível de expressãode uma SRP na planta.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-17-19, caracterizado pelo fato de que um vetor de expressão é usado deacordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-17-20, caracterizado pelo fato de que a tolerância a estresse é diminuída.
22. Uso de um ácido nucleico codificando SRP selecionadodentre o grupo compreendendo o ácido nucleico como definido nasreivindicações IOe 11, caracterizado pelo fato de ser para preparar uma célulade planta com aumentada tolerância a estresse ambiental.
23. Uso de tolerância e/ou resistência aumentadas a estresseambiental e/ou um ácido nucleico codificando SRP selecionado dentre ogrupo compreendendo o ácido nucleico de acordo com as reivindicações IOe-11 ou partes do mesmo, caracterizado pelo fato de ser como marcadores paradetecção de estresse em plantas ou células de planta.
24. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque confere a expressão da molécula de ácido nucleico como definida nareivindicação 10 ou 11, compreendendo um ou mais elementos regulatórios,pelo que a expressão do ácido nucleico codificando SRP em uma célulahospedeira resulta em aumentada tolerância a estresse ambiental comocomparado com uma célula hospedeira de tipo selvagem não transformadacorrespondente.
25. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender a moléculade ácido nucleico como definida na reivindicação 10 ou 11 ou uma construçãode ácido nucleico como definida na reivindicação 25, pelo que a expressão doácido nucleico codificando SRP em uma célula hospedeira resulta emaumentada tolerância a estresse ambiental como comparado com uma célulahospedeira de tipo selvagem não transformada correspondente.
26. Célula de planta caracterizada pelo fato de compreenderuma construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 24 ou umvetor como definido na reivindicação 25.
27. Planta, caracterizada pelo fato de compreender uma célulacomo definida na reivindicação 26.
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