KR20110139743A - 모균증 및 다른 진균 질환의 치료를 위한 백신 조성물 및 방법 - Google Patents

모균증 및 다른 진균 질환의 치료를 위한 백신 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모균증을 포함한 진균 질병 또는 병의 치료 및 예방을 위한 치료 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 치료 방법 및 조성물은 고 친화성 철 투과효소(FTR) 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드의 항원 단편; FTR 서열의 18 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터; 안티센스; 작은 간섭 RNA 또는 FTR의 항체 억제제를 갖는 백신 조성물을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 항원보강제를 추가로 포함할 수 있다.

Description

모균증 및 다른 진균 질환의 치료를 위한 백신 조성물 및 방법{VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF MUCORMYCOSIS AND OTHER FUNGAL DISEASES}
본 발명은 부분적으로 NIAID에 의해 지급된 NIH 출연 011671 하에 미국 정부 지원으로 수행되었다.
본 발명은 일반적으로 감염성 질병에 대해 개체를 백신접종하는 조성물 및 방법에 관한 것이며, 보다 특히 기회감염진균 질병에 대해 개체를 백신접종하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
250,000의 공지된 진균 종들 중 약 180 종이 인간 및 동물에게서 질병(진균증)을 유발하는 것으로 인식되고 있다. 진균 중 일부, 예를 들어 전신성 병원체 히스토플라스마 캅슐라튬(Histoplasma capsulatum) 및 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 는 모든 노출된 개체들에게서 감염을 확립시킬 수 있다. 다른 것들, 예를 들어 칸디다(Candida), 아스퍼질러스(Aspergillus) 종 및 지고마이세테스(Zygomycetes)는 통상적으로 타협 숙주에서만 질병을 유발할 수 있는 기회감염 병원체들이다. 지고마이세테스 강, 뮤코랄레스(Mucorales) 목의 진균들이 인간에게서 잠재적으로 치명적인 진균 감염인 모균증을 유발할 수 있다. 상기 뮤코랄레스 목에 속하는 진균들은 6 개 이상의 과로 분류되며, 이들은 모두 모균증을 유발할 수 있다(Ibrahim et al., Zygomycosis, p. 241-251, In W.E. Dismukes, P.G. Pappas, and J.D. Sobel(ed.), Clinical Mycology, Oxford University Press, New York(2003); Kwon-Chung, K.J., and J.E. Bennett, Mucormycosis, p. 524-559, Medical Mycology, Lea & Febiger, Philadelphia(1992), and Ribes et al., Zygomycetes in Human Disease, Clin Microbiol Rev 13:236-301(2000)). 그러나, 뮤코라세아에(Mucoraceae) 과에 속하는 진균, 및 특히 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae)(리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus)) 종이 단연 가장 통상적인 감염 원인이다(상기 Ribes et al.). 컨닝하멜라세아에(Cunninghamellaceae) 과 중 컨닝하멜라 종에 의한 감염으로 인한 모균증의 증가 사례가 또한 보고되었다(Cohen-Abbo et al., Clinical Infectious Diseases 17:173-77(1993); Kontoyianis et al., Clinical Infectious Diseases 18:925-28(1994); Kwon-Chung et al., American Journal of Clinical Pathology 64:544-48(1975); and Ventura et al., Cancer 58:1534-36(1986)). 상기 뮤코랄레스 목의 나머지 4 개 과는 덜 빈번한 질병 원인이다(Bearer et al., Journal of Clinical Microbiology 32:1823-24(1994); Kamalam and Thambiah, Sabouraudia 18:19-20(1980); Kemna et al., Journal of Clincal Microbiology 32:843-45(1994); Lye et al., Pathology 28:364-65(1996), and Ribes et al., (상기)).
모균증의 병원체들은 면역타협된 숙주들을 거의 균일하게 감염시킨다(Spellberg et al., Clin. Microbiol. Rev. 18:556-69(2005)). 모균증에 대한 주요 위험 인자들로는 당뇨병성 케톤산증(DKA)으로서 공지된 케톤산증에서 억제되지 않는 당뇨병, 다른 형태의 대사성 산증, 코르티코스테로이드에 의한 치료, 기관 또는 골수 이식, 백혈구 감소증, 외상 및 화상, 악성 혈액 질환, 및 혈액투석을 받는 개체의 데페록사민 킬레이트화-요법이 있다.
최근의 보고서들은 최근 20년간에 걸쳐 모균증의 보고 사례 수가 현저하게 증가하였음을 증명하였다(Gleissner et al., Leuk. Lymphoma 45(7):1351-60(2004)). 또한 주요 이식 센터들에서 모균증 발병률이 놀랍게 상승하였다. 예를 들어, 프레드 허친슨 암 센터(the Fred Hutchinson Cancer Center)에서, 마르(Marr) 등은 1985-1989년에서부터 1995-1999년까지 상기 사례 수가 배 이상 증가하였음을 개시하였다(Marr et al., Clin. Infect. Dis. 34(7):909-17(2002)). 유사하게, 콘토이야니스(Kontoyiannis) 등은 유사한 기간에 걸쳐 이식 개체들에게서 모균증의 발병률이 배 이상 증가하였음을 개시하였다(Kontoyiannis et al, Clin. Infect. Dis. 30(6):851-6(2000)). 미국의 노령 집단에서 당뇨병, 암 및 기관 이식이 점점 더 우세해짐에 따라, 모균증 발병률의 상승이 가까운 장래에 계속해서 줄어들지 않을 것이라 예상된다.
침습성 모균증에 이용 가능한 요법은 근원적인 선행요인을 역전시키고자 하는 시도, 감염된 부위의 응급의, 널리 퍼진 외과적 표면 절제술, 및 보조 항진균 요법을 포함한다(Edwards, J., Jr., Zygomycosis, p.1192-1199, In P. Hoeprich and M. Jordan(ed.), Infectious Disease, 4th ed. J.B. Lippincott Co., Philadelphia(1989); Ibrahim et al.,(2003), 상기; Kwon-Chung and Bennett, 상기; Sugar, A.M., Agent of Mucomycosis and Related Species, p. 2311-2321. In G. Mandell, J. Bennett, and R. Dolin(ed.), Principles and Practices of Infectious Disease, 4th ed. Churchill Livingstone, New York(1995)).
현재, 암포테리신 B(AmB)가 침습성 모균증의 치료에 승인된 유일한 항진균제로 남아 있다(Id.). 상기 진균은 AmB에 대해 비교적 내성이므로, 고 용량이 필요한데, 이는 신독성 및 다른 부작용들을 빈번히 유발한다(Sugar, 상기). 또한, 상기 감염된 병소의 외과적 제거(예를 들어 비대뇌 모균증 개체에서 눈의 절제)의 부재 하에서 항진균 요법만으로는 좀처럼 치유되지 않는다(Edwards, J. (1989), 상기; Ibrahim et al., (2003), 상기). 외과적 표면 절제를 고 용량 AmB와 병행한다 하더라도, 모균증과 관련된 사망률은 50%를 초과한다(Sugar, 상기). 전신 감염 개체에서, 사망률은 100%에 근접한다(Husain et al., Clin Infect Dis 37:221-29(2003)). 이러한 허용할 수 없이 높은 사망률, 및 고도로 미관을 손상시키는 외과적 요법의 극단의 사망률로 인해, 침습성 모균증의 치료 및 예방을 위한 신규 전략의 개발이 절실하였다.
진균 감염 소인의 근원적인 인자들 중 하나는 상승된 혈청 철 수준이다. 상승된 유효 혈청 철을 갖는 개체들은 모균증에 걸리기 매우 쉽다. 철은 실질적으로 모든 미생물 병원체의 생육 및 독성에 필요하다. 포유동물 숙주에서, 매우 적은 혈청 철이 미생물에게 이용 가능한데, 그 이유는 상기 철이 트랜스페린과 같은 담체 단백질에 고도로 결합하기 때문이다. 혈청 철의 격리가 병원성 진균에 대한 주요 숙주 방어 기전이지만, 외래 철 킬레이터, 예를 들어 데페록사민으로 치료된 개체들은 침습성 모균증의 발병률이 현저하게 증가하였으며, 이는 >80%의 사망률과 관련된다. 데페록사민이 인간 숙주의 시각에서는 킬레이터이지만, 상기 화합물은 철운반체(siderophore)로서 작용하여, 전에는 이용할 수 없었던 철을 병원성 진균에 공급함으로써 상기 개체를 모균증에 걸리기 쉽게 한다.
모균증 병인의 위험을 감소시키고 부작용없이 유효한 요법을 제공할 수 있는 화합물 및 방법이 필요하다. 본 발명은 상기 필요성을 만족시키고 관련된 이점들을 또한 제공한다.
본 내용에 개략된 실시태양들에 따라서, 본 발명은 고 친화성 철 투과효소(FTR) 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드의 항원 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은, FTR 서열의 18 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 전사 프로모터, 및 전사 종결자(terminator)를 포함하는 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신 조성물로서, 여기에서 상기 프로모터가 상기 FTR 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결되고, 상기 FTR 뉴클레오타이드 서열이 상기 전사 종결자에 작동 가능하게 연결되어 있는 벡신 조성물을 제공한다. 본 발명의 백신 조성물은 항원보강제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 FTR 서열의 일부에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, FTR 서열의 12 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, FTR 서열의 18 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 RNAi 서열, 및 FTR 폴리펩타이드 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 FTR의 안티센스, 작은 간섭 RNA 또는 항체 억제제; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 상기 진균 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진균 질환을 앓는 개체 또는 진균 질환을 앓기 쉬운 개체에게 면역원성 양의 FTR 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 단편을 투여함을 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 진균을 FTR의 안티센스, 작은 간섭 RNA 또는 항체 억제제에 노출시킴을 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 상기 진균 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
도 1은 진뱅크(Genbank) cDNA 수납 번호 AY344587을 갖는, 리조푸스 오리자에 고 친화성 철 투과효소 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 1)을 나타낸다.
도 2는 진뱅크 단백질 ID 번호 AAQ24109.1을 갖는, 리조푸스 오리자에 고 친화성 철 투과효소 폴리펩타이드 서열(서열번호: 2)을 나타낸다.
도 3은 칸디다 알비칸스 및 사카로마이세스 세레비지아에와 각각 46% 및 44% 일치성을 갖는 리조푸스 오리자에의 FTR에 대한 아미노산 서열 정렬(a)과 계통도(b)를 나타낸다. 아미노산 서열 정렬 상의 박스는 철과의 직접적인 상호작용에 관련된 보존된 REGLE 동기를 가리킨다.
도 4는 상승된 유효 혈청 철의 조건에서 지고마이세테스에 의한 철 흡수의 기전을 나타낸다.
도 5는 변하는 철 농도를 갖는 배지 중에서 생육된 리조푸스 오리자에에서의 FTR 발현을 나타낸다.
도 6은 FTR을 발현하는 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 돌연변이체의 생육을 나타낸다.
도 7은 야생형 사카로마이세스 세레비지아에 및 빈 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 돌연변이체에 의한 철 흡수와 비교된, FTR을 발현하는 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 돌연변이체에 의한 고 친화성 철 흡수를 나타낸다. *P<0.05.
도 8은 비-당뇨병성 감염 마우스 및 당뇨병성 비 감염 마우스와 비교된, 리조푸스 오리자에로 감염된 당뇨병성 마우스(n=10)의 생존 퍼센트를 나타낸다.
도 9는 TaqMan 분석에 의해 측정된 바와 같은, 리조푸스 오리자에(5 x 104 포자)의 생존 퍼센트와 신장 부담 간의 일시적인 연계 또는 역 상관성을 나타낸다.
도 10은 5 x 103 리조푸스 오리자에 포자에 의해 감염되고 1) 데페라시록스(경구 제공됨); 2) 데페라시록스 + 포화 FeCl3(ip 제공됨); 3) 4일간 정맥 내 LAmB; 및 4) 위약으로 처리된 DKA 마우스(n=20)의 생존 퍼센트(A) 및 조직 진균 부담(n=11)을 나타낸다. 비 감염 DKA 마우스 및 FeCl3로 처리된 비 감염 마우스를 음성 대조군들로서 포함시켰다. *p<0.05 대 위약 또는 데페라시록스 + 철.
도 11은 DKA 마우스를 사용한 혈행에 의해 파종 모균증 모델에서 FTR의 발현을 나타낸다. 마우스를 꼬리 정맥을 통해 리조푸스 오리자에 99-880의 105 포자로 감염시켰다. 지시된 시점들에서 감염된 뇌를 제거하고 이어서 전체 RNA를 실시간-RT-PCR 분석에 사용하였다(시점당 n=4 마우스). 비 감염 마우스로부터의 뇌를 음성 대조군으로서 사용하였다. 값들을 평균±SD로서 나타낸다.
도 12는 FTR 프로모터의 조절 하에서 GFP를 발현하는 리조푸스 오리자에로 감염된 DKA 마우스의 뇌에서의 FTR의 발현을 나타낸다. (a) 리조푸스 오리자에로 감염된 뇌의 H&E 염색; (b) GFP에 대한 토끼 다클론 항체로 염색되고 이어서 FITC 접합된 항-토끼 항체로 대조 염색된 뇌 절편; 및 (c) 감염 시에 비-형광 리조푸스 오리자에를 나타내는 DIC 공 초점 영상. 화살표는 감염된 뇌 중의 진균 요소들을 나타낸다. 배율, X400.
도 13은 빈 플라스미드로 형질전환된 리조푸스 오리자에(C)와 비교된, RNA-간섭 플라스미드(T1 및 T3-T5)로 형질전환된 리조푸스 오리자에 중의 FTR의 발현 부재를 나타내는 RT-PCR 분석의 아가로스 젤 전기영동 결과를 나타낸다. 18s rDNA를 증폭하는 프라이머들은 FTR 표적화에서 RNA 간섭의 특이성을 입증하기 위한 대조군으로서 작용하였다.
도 14는 빈 플라스미드(대조용 균주, 2.9 x 103 포자) 또는 FTR의 발현을 표적화하는 RNAi 플라스미드(FTR-i, 4.1x103 포자)로 형질전환된 리조푸스 오리자에에 의해 iv 감염된 DKA 마우스(n=8)의 생존 퍼센트를 나타낸다. *, 로그 순위 검정에 의한 P<0.001.
도 15는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 고 친화성 철 투과효소 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 16은 칸디다 귈리에르몬디이(Candida guilliermondii) 고 친화성 철 투과효소 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 17은 아스퍼질러스 플라부스(spergillus flavus) 고 친화성 철 투과효소 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 18은 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 고 친화성 철 투과효소 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 19는 리조푸스 rFtr1p 나선 다발 단백질, 및 철이 세포외에서 리조푸스 종의 세포질 내로 삽입되는 전좌의 개념상 모델을 나타낸다.
도 20은 정제된 합성/재조합 rFtrlp를 입증하는 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 이 콜라이는 6X-His 표지된 합성 rFTR1을 발현하는 플라스미드 또는 빈 플라스미드로 형질전환되었다. rFtr1p는 Ni-아가로스 컬럼에 의해 정제되었으며 상기 rFtrlp 클론에서 28 kD의 예상된 크기에서 검출되었으나 이 콜라이가 빈 플라스미드로 형질전환되었을 때는 검출되지 않았다.
도 21은 리조푸스 오리자에(2.5 x 107 포자)로 감염되고 rFtr1p 또는 빈 플라스미드로 면역시킨 마우스로부터 수집한 혈청으로 처리된 DKA 마우스(n=8)의 생존을 나타낸다. *, 로그 순위 검정에 의한 P<0.007.
도 22는 FTR1이 리조푸스 오리자에로 정맥 내 감염된 DKA 마우스에서 발현됨을 나타낸다. 도 22a는 상기 FTR1 프로모터 또는 구성적으로 발현된 ACT1 프로모터에 의해 구동된 정보제공 유전자 GFP를 함유하는 플라스미드로 형질전환되고 철-풍부 또는 철-고갈된 조건 하에서 생육된 리조푸스 오리자에의 FACS 분석을 나타낸다. 빈 플라스미드로 형질전환된 리조푸스 오리자에 M16을 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 22b는 FTR1이 FTR1p의 조절 하에서 GFP를 발현하는 리조푸스 오리자에로 감염된 DKA 마우스의 뇌에서 발현됨을 나타낸다. 항-GFP Ab 염색을 위해서, 조직 절편을 GFP에 대한 토끼 다클론 항체로 염색하고, 이어서 FITC 접합된 항-토끼 항체로 대조 염색하였다. DIC의 경우, 공초점 영상은 감염 시에 비-형광성 리조푸스 오리자에를 나타낸다. 화살표는 감염된 뇌에서 진균 요소들을 나타낸다. 배율, X400.
도 23은 파괴 카세트가 FTR1 유전자 좌에 통합되지만 FTR1의 완전한 제거는 성취될 수 없었음을 나타낸다. 도 23a는 우리가 FTR1 파괴를 성취하기 위해 사용한 전략을 요약하는 다이어그램이다. PyrF(998 bp)를 각각 FTR1-5' UTR 및 FTR1-3' UTR의 606 및 710 bp 단편들이 측면에 접해 있는 선택성 마커로서 사용하였다. 도 23b는 전형적인 추정 ftr1 삭제 돌연변이체(KO) 중의, 그러나 야생형(WT)에서는 아닌(5'UTR 및 3'UTR 참조) 파괴 카세트의 통합을 나타내는 젤 전기영동이다. 프라이머 FTR1 P11 및 FTR1 P12를 사용하여 오직 야생형으로부터만, 그러나 추정 ftr1 삭제 돌연변이체로부터는 아닌(FTR1 참조) FTR1 ORF로부터의 503 pb를 증폭시켰다. 2094 bp의 예상된 밴드를 갖는 형질전환된 플라스미드의 가능한 재환화를 시험하기 위해서 프라이머 PyrF P9 및 PyrF P18을 또한 사용하였다(자가 연결 참조). 도 23c는 철-제한된 또는 철-풍부 배지 상의 상이한 철 공급원들 상에서 생육된 리조푸스 오리자에 야생형, 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된, 또는 추정 ftr1 삭제 돌연변이체의 증식 속도의 비교이다. 증식을 10 또는 1000 μM(철-풍부)의 FeCl3 또는 FeSO4 또는 100 μM의 페리옥사민을 함유하는 배지의 경우 48 시간 후에 측정하였고, 반면에 100 μM 헴이 보충된 배지의 경우에는 72 시간 후에 증식을 측정하였다. 값들을 ㎝/h로 고체 생육 배지 상의 균사 직경 증식의 증가로서 나타낸다. 야생형 또는 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주에 비교된 *P <0.05. 도 23d는 철-풍부 배지(1000 μM FeCl3) 상에서 추정 삭제 돌연변이체의 1 라운드의 정제 후 FTR1의 증폭의 결여 및 96 시간 동안 철-고갈된 배지(즉 100 μM 페리옥사민) 상에서의 증식에 따른 동일한 단리물로부터의 FTR1의 증폭을 나타내는 젤 전기영동이다. 액틴(600 pb)의 증폭을 DNA 부하 조절에 사용하였다.
도 24는 다핵 리조푸스 오리자에 중의 FTR1의 완전한 파괴의 결여의 확인을 나타낸다. 도 24a는 단일 포자에 대해 다중 핵의 존재를 나타내는 팽창된 리조푸스 오리자에 포자의 DAPI 염색이다. 화살표는 핵을 나타낸다. 원래 배율, x1000. 도 24b는 철-풍부 배지(1000 μM FeCl3) 상에서 추정 삭제 돌연변이체의 14 회 계대배양 후 FTR1의 증폭의 결여 및 96 시간 동안 철-고갈된 배지(즉 100 μM 페리옥사민) 상에서의 증식에 이은 동일한 단리물로부터의 FTR1의 증폭을 나타내는 젤 전기영동이다. 액틴(600 pb)의 증폭을 주형으로서 사용된 DNA의 보전 및 PCR 억제제의 부재를 확인하기 위해 사용하였다. 도 24c는 추정 ftr1 중의 파괴 카세트의 통합(7380 pb 밴드는 오직 철-풍부 배지에서 생육된 추정 ftr1으로부터 추출된 DNA 샘플에서만 존재한다) 및 FTR1 사본의 거의 완전한 제거(철-풍부 배지에서 생육된 추정 ftr1으로부터 추출된 DNA 샘플중의 1960 bp의 결여)를 확인하는 서던 블럿이다.
도 25는 감소된 사본 수가 철을 흡수하는 리조푸스 오리자에의 타협된 능력을 생성시킴을 나타낸다. 도 25a는 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주 또는 철-고갈된 배지에서 생육된 동일한 돌연변이체에 비교된 추정 ftr1 삭제 돌연변이체에서의 감소된 사본수를 입증하는 정량적인 PCR이다. 도 25b는 상기 FTR1 산물에 대한 증폭 특이성을 나타내는 qPCR 튜브로부터 취한 샘플들의 젤 전기영동이다. 도 25c는 추정 ftr1 돌연변이체가 리조푸스 오리자에 야생형 또는 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주에 비해 감소된 59Fe를 획득하는 능력을 입증한다. 야생형, PyrF-보충된 리조푸스 오리자에 또는 추정 ftr1 돌연변이체에 의한 59Fe 흡수. 발아된 포자를 0.1 μM 59FeCl3(높은-친화성 철 투과효소를 유도하는 농도(Fu et al., FEMS Microbiol Lett 235:169-176(2004))와 함께 배양하였다. 리조푸스 오리자에 야생형 또는 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주와 비교 시 *P<0.05. 데이터(3 개의 별도의 실험들로부터 n=9)를 중간+사분위수 범위로서 나타낸다.
도 26은 DKA 마우스 모델에서 FTR1 사본 수의 감소가 리조푸스 오리자에 독성을 어떻게 감소시키는지를 나타낸다. 도 26a는 YPD 또는 CSM-URA 배지 상에서 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주에 필적할만한 증식을 나타낸 추정 ftr1 삭제 돌연변이의 전형이다. 도 26b는 리조푸스 오리자에 야생형(4.3 x 103), 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주(4.8 x 103 포자) 또는 추정 ftr1 삭제 돌연변이체(3.0 x 103 포자)로 iv 감염된 마우스(n=8)의 생존이다. *, 야생형 또는 PyrF-보충된 균주에 비교 시 P<0.00005. 도 26c는 리조푸스 오리자에 야생형(4.3 x 103), 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주(5.1 x 103 포자) 또는 추정 ftr1 삭제 돌연변이체(5.3 x 103 포자)로 비 내 감염된 마우스(n=9)의 생존이다. *, 야생형 또는 PyrF-보충된 균주에 비교 시 P=0.04.
도 27은 FTR1 발현의 억제가 시험관 내에서 59Fe를 흡수하는 리조푸스 오리자에의 능력을 어떻게 감소시키는지를 나타낸다. 도 27a는 빈 플라스미드(C, 대조군)로 형질전환된 리조푸스 오리자에와 비교된, RNA-간섭 플라스미드(T1 및 T3-T5)로 형질전환된 리조푸스 오리자에에서의 FTR1의 발현의 결여를 나타내는 RT-PCR이다. 18s rDNA를 증폭하는 프라이머가 출발 샘플의 보전 및 PCR 억제제의 결여를 입증하는 대조군으로서 작용하였다. 도 27b는 YPD 또는 CSM-URA 배지 상에서 빈 플라스미드로 형질전환된 리조푸스 오리자에 M16에 필적하는 증식을 나타낸 RNAi 형질전환체의 전형이다. 도 27c는 야생형, 빈 플라스미드로 형질전환된 리조푸스 오리자에 M16, 또는 RNAi 형질전환체들 중 하나에 의한 59Fe 흡수이다. 발아된 포자를 0.1 μM 59FeCl3(고-친화성 철 투과효소를 유도하는 농도(Fu et al., FEMS Microbiol Lett 235:169-176(2004))와 함께 배양하였다. 리조푸스 오리자에 야생형 또는 빈 플라스미드로 형질전환된 리조푸스 오리자에 M16과 비교 시 *P<0.05. 데이터(3 개의 별도의 실험들로부터 n=9)를 중간+사분위수 범위로서 나타낸다.
도 28은 DKA 마우스 모델에서 FTR1 발현의 억제가 리조푸스 오리자에의 독성을 어떻게 감소시키는지를 나타낸다. 도 28a는 빈 플라스미드(대조용 균주, 2.9 x 103 포자) 또는 FTR1의 발현을 표적화하는 RNA-i 플라스미드(FTR1-i, 4.1 x 103 포자)로 형질전환된 리조푸스 오리자에로 iv 감염된 마우스(n=8)의 생존이다. *, P<0.001. 도 28b는 빈 플라스미드(대조용 균주, 2.8 x 103 포자) 또는 FTR1의 발현을 표적화하는 RNA-i 플라스미드(FTR1-i, 7.6 x 103 포자)로 형질전환된 리조푸스 오리자에로 비 내 감염된 마우스(n=9)의 생존이다. *, P<0.02. 도 27c는 빈 플라스미드(대조용 균주, 4.2 x 103 포자) 또는 FTR1의 발현을 표적화하는 RNA-i 플라스미드(FTR1-i, 5.1 x 103 포자)로 형질전환된 리조푸스 오리자에로 iv 감염된 마우스(n=8)의 신장 또는 뇌 진균 부담이다. *, P<0.0006 및 ￥, 대조용 균주에 비교 시 P<0.04. 데이터를 중간+사분위수 범위로서 나타낸다. y-축은 상기 분석의 검출 하한을 반영한다. 도 27d는 리조푸스 오리자에(2.5 x 107 포자의 의도된 접종물 및 9 x 103 포자의 실제 흡입된 접종물)로 비 내 감염되고 Ftrlp 또는 빈 플라스미드 클론으로부터 수집된 단백질로 면역시킨 마우스로부터 수집한 혈청으로 처리한 마우스(n=8)의 생존이다(*, P<0.007).
본 발명은 병원성 진균, 구체적으로 모균증의 발병에 관련된 진균의 고 친화성 철 투과효소(FTR)를 직접적으로 및/또는 간접적으로 억제하는 조성물의 용도 및 방법에 관한 것이다. 고 친화성 철 투과효소는 진균에서 철의 흡수를 책임지는 분자이며; 따라서 상기 분자의 표적화 및 억제는 주위 환경에서 이용 가능한 철을 흡수하고/하거나 사용하는 진균의 능력을 방해할 것이다. 고 친화성 철 투과효소의 억제는 진균 병원체에서 철-기아를 발생시켜 상기 병원체의 생육 및/또는 독성을 방해할 것이다. 예를 들어 리조푸스 오리자에 중의 FTR 폴리펩타이드는 어떠한 공지된 인간 단백질과도 상동성이 없거나 거의 없다. 예를 들어, 인간 프로테옴의 상동성 연구는 리조푸스 오리자에의 FTR 단백질에 대해 매우 제한된 상동성을 갖는 5 개의 개방 판독 프레임을 확인하였으며, 이때 상기 5 개 단백질 모두에 대해 30.4의 정렬 점수, e=9.0을 갖는다. 이들 단백질 중 3 개는 이중 나선 도메인 함유 82(즉, EAW66982; AAH33726.1; 및 NP_079001.2)이고, 하나는 CCDC82 단백질(즉 AAH18663.1)이고 이름이 없는 단백질(즉 BAB15683.1)이다. 기준으로서, 다른 유기체들과 비교된 진균으로부터의 독특한 서열의 확인을 위한 표준 BLAST 검색 e 값은 10-8로서 지정되었으며, 이는 rFtr1p가 인간 프로테옴에 대해 의미 있는 상동성이 없음을 가리킨다. 따라서, FTR의 표적화 및 억제에 있어서 본 발명의 조성물 및 방법은 진균 병원체 중의 철 수준에만 영향을 미치고 숙주에는 미치지 않을 것이며, 이는 모균증에 대한 유효하고 표적화된 요법을 구성한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 백신과 같은 면역원성 조성물에 관한 것이다. 상기 면역원성 조성물은 개체에서 모균증에 대한 보호를 부여하는 유효 용량의 진균 FTR 폴리펩타이드 또는 그의 항원 단편을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 진균 FTR에 대해 숙주 체액 및/또는 세포 매개된 면역 반응을 유도한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 상기 백신 조성물의 면역원성을 높일 수 있는 항원보강제를 추가로 포함한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 FTR 분자의 억제제, 예를 들어 siRNA를 포함한다. 상기 FTR 억제제는 FTR 전사 또는 번역 수준을 억제하기 위해 상기 FTR 분자의 일부에 충분히 상보적인 서열을 포함하는 하나 이상의 siRNA를 발현하는 벡터를 포함한다. 예를 들어 실시예 9에 개시된 바와 같이, 리조푸스 오리자에의 FTR에 대한 간섭 RNA를 제조하였으며, 이는 상기 진균에서 FTR 발현을 억제하는 것으로 나타났다. DKA 마우스에서, 항-FTR siRNA를 갖는 리조푸스 오리자에 형질전환체는 야생형 리조푸스 오리자에보다 덜 독성인 것으로 나타났다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "FTR"이란 용어는 병원성 진균에서 철 운반을 책임지는 막 단백질인 고 친화성 철 투과효소, 예를 들어 비 제한적으로 리조푸스 오리자에, 에이 푸미가투스, 씨 귈리에르몬디이, 에이 플라부스 및 씨 트로피칼리스 중의 FTR; 및 이를 암호화하는 핵산을 지칭한다. 도 3에 도시되고 실시예 1에 개시된 바와 같이, 예를 들어 리조푸스 오리자에, 칸디다 알비칸스 및 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 FTR은 단백질 서열 상동성을 갖는 여러 영역들과 39% 이상의 일치 퍼센트를 공유한다. 예를 들어 리조푸스 오리자에 중의 FTR의 뉴클레오타이드 서열을 도 1(서열번호: 1)에 나타내고, 상응하는 아미노산 서열을 도 2(서열번호: 2)에 나타낸다. 에이 푸미가투스 중의 FTR의 뉴클레오타이드 서열은 도 15에 나타내고; 씨 귈리에르몬디이의 경우는 도 16에 나타내고; 에이 플라부스의 경우는 도 17에 나타내고; 씨 트로피칼리스의 경우는 도 18에 나타낸다. 본 명세서 전체를 통해, "FTR 발현" 또는 "FTR을 발현하는"은 FTR 핵산 또는 FTR 폴리펩타이드의 발현을 다르지 않게 표시하는데 사용될 수 있다.
일반적으로, 핵산은 RNA, 예를 들어 mRNA 또는 pre-mRNA, 또는 DNA, 예를 들어 cDNA 및 게놈 DNA이다. FTR 핵산은 예를 들어 FTR 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 단편에 상응하는 핵산 분자(단일 또는 이중 가닥의, RNA, mRAN, cDNA, 또는 게놈 DNA)를 지칭한다. DNA 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며; 단일 가닥 RNA 또는 DNA는 암호화 또는 센스 가닥이거나, 또는 비-암호화 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 상기 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 서열은 상기 유전자의 암호화 서열의 일부 또는 전부를 포함할 수 있고 추가적인 비-암호화 서열, 예를 들어 인트론 및 비-암호화 3' 및 5' 서열(예를 들어 프로모터, 조절, 폴리-A 신축 또는 인헨서 서열 포함)을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 서열을 또 다른 서열, 예를 들어 표지, 마커, 또는 폴리펩타이드의 단리 또는 정제를 돕는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 서열에 융합시킬 수 있다. 상기와 같은 서열로는 비 제한적으로 선택 마커를 암호화하는 것들(예를 들어 항생제 내성 유전자, 또는 정보제공인자 서열), 히스티딘의 반복을 암호화하는 것들(HIS 표지) 및 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질을 암호화하는 것들이 있다. 상기 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 서열은 화학적으로 또는 재조합 수단에 의해 합성되는 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 상기와 같은 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 DNA 방법에 사용하기에 적합하고 유전 공학 단백질 합성 시스템 내에 있다.
"폴리펩타이드"란 용어는 펩타이드 결합에 의해 공유 결합된 2 개 이상의 아미노산들의 쇄를 지칭한다. 본 발명과 관련하여 특히 중요한 폴리펩타이드는 항원 에피토프를 갖는 아미노산 부분서열(subsequences)이다. 항원 에피토프는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 폴리펩타이드의 면역원 성질에 실질적으로 책임이 있고 면역 반응을 불러일으킬 수 있는 서열 및/또는 구조 결정인자를 포함한다. 상기 FTR 폴리펩타이드의 작용 도메인이 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 예를 들어, 철과 상호작용하는 REGLE 동기는 본 발명의 하나의 예시적인 작용 도메인이다. 또 다른 예시적인 작용 도메인은 사카로마이세스 세레비지아에 중의 FTR의 완전한 작용에 필요한 FTR의 세포 표면 EXXE 동기이다(Stearman et al., Science 271:1552-1557(1996)). 폴리펩타이드는 예를 들어 글리코실화, 단백질분해 절단, 지질화, 신호 펩타이드 절단, 프로펩타이드 절단, 인산화 등을 포함할 수 있는 성숙 또는 번역 후 변경 과정들을 또한 겪는다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "면역원성" 또는 "항원성"이란 용어는 T-세포 및/또는 B-세포 항원 수용체에 의해 인식되는 단백질의 일부를 지칭한다. 상기 면역원성 부분은 일반적으로 FTR 폴리펩타이드 또는 그의 변이체의 5 개 이상 아미노산 잔사, 바람직하게는 10 개 이상, 보다 바람직하게는 20 개 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 30 개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직한 면역원성 부분들은 작은 N- 및/또는 C-말단 단편(예를 들어 5-30 아미노산, 바람직하게는 10-25 아미노산)을 함유할 수 있다.
변이체 폴리펩타이드는 표적 폴리펩타이드에 비해 하나 이상의 아미노산 변화를 함유한다. FTR의 폴리펩타이드 변이체는 상기 FTR 폴리펩타이드에 대해 약 39% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 70% 이상의 일치성을 나타낼 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 대개 돌연변이, 예를 들어 치환, 삽입, 결실 또는 전위에 의해 유발된, 상기 확인된 폴리뉴클레오타이드로부터 일부 염기가 일탈한 실질적으로 상동성인 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 바람직하게는 상기 확인된 폴리뉴클레오타이드에 대해 약 60% 이상(10 개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 단편의 경우), 보다 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 95%, 98% 또는 99% 이상의 일치를 나타낸다.
FTR 폴리펩타이드와 관련하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "단편"이란 용어는 FTR 아미노산 서열의 일부를 갖는 폴리펩타이드를 지칭하고자 한다. 유용한 단편은 상기 폴리펩타이드의 생물 활성들 중 하나 이상을 유지하는 것들을 포함한다. 상기와 같은 생물학적으로 활성인 단편들은 예를 들어 4, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100 또는 그 이상의 아미노산 길이를 포함하는 광범위한 길이를 가질 수 있다. 활성 이외에, 생물학적으로 활성인 단편은 또한 예를 들어 당해 분야에 널리 공지된 방법들을 사용하여 상기 폴리펩타이드 서열의 분석에 의해 확인된 동기, 도메인 또는 구획을 특징으로 할 수 있다. 상기와 같은 영역은 예를 들어 단일 펩타이드, 세포외 도메인, 막통과 구획, 리간드 결합 영역, 아연 집게 도메인 및/또는 글리코실화 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "백신"이란 용어는 감염성 질병에 대해 동물을 보호하기 위해 상기 동물에게 투여될 수 있는 조성물을 지칭한다. 백신은 상기 감염성 질병에 대해 동물에게서 면역 반응을 유도하거나 증가시킴으로써 상기 질병들에 대해 보호한다. 본 발명의 백신으로 치료될 수 있는 예시적인 감염성 질병은 모균증이다. 상기 백신-매개된 보호는 개체에게 예를 들어 FTR 또는 그의 면역원성 부분 또는 단편을 접종하는 경우 숙주에서 유발된 체액 및/또는 세포 매개된 면역일 수 있다.
"항원보강제"란 용어는 일반적으로 항원과 함께 또는 상기 항원 부위의 부근에 전달됨으로써 상기 항원에 대한 면역 반응을 증대시킬 수 있는 능력을 갖는 조성물을 의미한다. 면역 반응을 증가시키는 능력은 면역 매개된 보호의 증가에 의해 나타난다. 체액 면역의 증대를 예를 들어 상기 항원에 대해 발생한 항체의 역가의 증가에 의해 측정할 수 있다. 세포 면역의 증대는 예를 들어 양성 피부 시험, 세포독성 T-세포 분석, IFN-감마 또는 IL-2에 대한 ELISPOT 분석에 의해 측정될 수 있다. 항원보강제들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 항원보강제로는 예를 들어 프로이드 완전 항원보강제, 프로이드 불완전 항원보강제, 알루미늄 항원보강제, MF59 및 QS21이 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "항체"란 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분을 지칭한다. 항체를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다양한 기법들 중 임의의 기법에 의해 제조할 수 있다(예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988] 참조). 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 다클론 및 단클론 항체를 제공한다. 본 발명의 단클론 항체는 예를 들어 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 변이체의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 오직 한 종의 항원 결합 부위만을 함유하는 항체 단편의 집단을 포함한다. 단클론 항체를 하나 이상의 치료제에 결합시킬 수 있다. 이에 관하여 적합한 작용제는 분화 유도물질, 약물, 독소 및 그의 유도체를 포함한다. 치료제를 적합한 단클론 항체에 직접 또는 간접적으로(예를 들어 링커 그룹을 통해) 결합시킬 수 있다(예를 들어 공유 결합시킬 수 있다).
"벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"란 용어는 핵산을 숙주 세포에 도입시킬 수 있는 비히클을 의미한다. 상기 벡터를 핵산의 증식 또는 수용을 위해 또는 암호화된 서열의 폴리펩타이드 발현을 위해 사용할 수 있다. 광범위하게 다양한 벡터들이 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 플라스미드, 파지 및 바이러스를 포함한다. 예시적인 벡터를 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001)]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)]에서 찾을 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "항체 억제제"란 용어는 표적 항원(즉 FTR)의 생물 활성 또는 작용을 감소시키는 항체를 지칭한다. 활성 또는 작용의 상기와 같은 감소는 예를 들어 세포 성분과 관련하여(예를 들어 막 국소화), 또는 세포 과정과 과련하여(예를 들어 철 운반), 또는 세포의 전체 과정과 관련하여(예를 들어 세포 생육 또는 생존) 있을 수 있다. 세포 생육에 관하여, 상기 억제 효과는 살진균(진균의 살해) 또는 정균(즉 진균 생육의 정지 또는 적어도 늦춤)일 수 있다. 후자는 주어진 기간 동안 억제되지 않은 진균에 비해 더 적은 진균이 생성되도록 진균 생육을 늦추거나 막는다. 분자의 견지에서, 상기와 같은 억제는 FTR 분자의 전사 및/또는 번역 수준의 감소 또는 제거, 또는 FTR 분자 활성의 감소 또는 제거와 같을 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "치료하는" 또는 "치료"란 용어는 진균 질환을 나타내는 임상 증상의 개선을 의미한다. 임상 증상의 개선은 예를 들어 치료 전 수준에 비해 또는 진균 질환이 있는 개인에 비해 치료된 개인에게서 진균 질환의 하나 이상의 증상의 감소 또는 축소를 포함한다. "치료하는"이란 용어는 또한 진균 질환과 관련된 병적인 상태의 중증도, 만성 합병증 또는 기회감염성 진균 감염의 감소를 포함함을 의미한다. 상기와 같은 병적인 상태, 만성 합병증 또는 기회감염은 모균증과 관련하여 하기에 예시된다. 모균증 및 다른 상기와 같은 병적인 상태, 만성 합병증 및 기회감염을 또한 예를 들어 문헌[Merck Manual, Sixteenth Edition, 1992] 및 [Spellberg et al., Clin. Microbio. Rev. 18:556-69(2005)]에서 찾을 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "예방하는" 또는 "예방"이란 용어는 진균 질환을 가리키는 임상 증상을 앞질러 방해함을 의미한다. 상기와 같은 기선제압은 예를 들어 상기 질환의 명백한 증상의 발생 전에 또는 상기 질환의 진단 전에 진균 또는 진균들에 의한 감염 위험이 있는 개인에게서 정상적인 생리학적 지표들을 유지시킴을 포함한다. 따라서, "예방하는"이란 용어는 진균 질환의 발생으로부터 개인들을 보호하기 위해 상기 개인들을 예방학적으로 치료함을 포함한다. 개인에게서 진균 질환을 예방함은 또한 상기 진균 질환의 발생을 억제 또는 저지함을 포함함을 의미한다. 상기 질환의 발생의 억제 또는 저지는 예를 들어 비정상 생리 지표 또는 임상 증상, 예를 들어 상기에 개시되고/되거나 당해 분야에 널리 공지된 것들의 발생을 억제 또는 저지함을 포함한다. 따라서, 진균 질환의 유효 예방은 정상 체온, 체중, 심리 상태의 유지뿐만 아니라 진균 질환에 소인이 있는 개인의 병변 또는 다른 병적인 표시의 결여를 포함할 것이다. 진균 질환에 소인이 있는 개인은 예를 들어 AIDS, 질소혈증, 당뇨병, 기관지 확장증, 폐기종, TB, 림프종, 백혈병 또는 화상이 있는 개인, 또는 진균 질환에 걸리기 쉬운 전력이 있는 개인을 포함한다. 상기 질환의 발생의 억제 또는 저지는 또한 예를 들어 하나 이상의 병적인 상태의 진행, 만성 합병증 또는 진균 질환과 관련된 기회감염에 대한 민감성을 억제 또는 저지함을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "진균 질환"이란 용어는 진균 질병, 감염, 또는 콜로니화, 예를 들어 표재성 진균증(즉 피부, 모발, 손 발톱 및 점막의 진균 질병; 예를 들어 백선 또는 효모 감염), 피하 진균증(즉 피하 조직, 근막 및 뼈의 진균 질병; 예를 들어 균종, 색소진균증 또는 스포로트리쿰증), 및 전신 진균증(즉 원인 곰팡이에 의해 생산된 공수 포자의 흡입으로부터 일반적으로 생성되는 심재성 진균 감염; 예를 들어 접합균증, 모균증, 콕시디오이데스 진균증, 분아균증, 히스토플라스마증, 또는 파라콕시디오이데스 진균증)을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "접합균증"이란 용어는 뮤코랄레스 및 엔토모프토랄레스 목들을 포함한 지고마이세테스 강의 진균에 의해 유발된 진균 질환을 의미한다. 상기 엔토모프토랄레스는, 개발 도상국가에서 주로 면역능력 숙주들을 괴롭히는 엔토모프토라 진균증으로서 공지된 피하 및 점막피부 감염의 원인이다. 접합균증을 또한 모균증이라고도 칭하며 상기 두 용어는 진균 감염의 유사한 유형들을 지칭하는데 호환적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "모균증"이란 용어는 뮤코랄레스 목의 진균에 의해 유발된 진균 질환을 의미한다. 모균증은 개발도상국가나 선진 공업국에서 면역타협된 숙주들을 거의 균일하게 감염시키는 생명-위협성 진균 감염이다. 뮤코랄레스 목에 속하는 진균들은 6 개 이상의 과로 분류되며, 이들은 모두 피부 또는 심부 감염을 유발할 수 있다. 뮤코라세아에 과에 속하는 종들은 임의의 다른 과보다 모균증을 앓는 개체들로부터 더 흔하게 단리된다. 상기 뮤코라세아에 중에서, 리조푸스 오리자에(리조푸스 아리주스)는 감염의 통상적인 원인이다. 유사한 감염 스펙트럼을 유발하는 뮤코라세아에 과의 다른 예시적인 종들은 예를 들어 리조푸스 미크로스포루스( microsporus) 변종, 리조포디포르미스(rhizopodiformis), 아브시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 아포파이소마이세스 엘레간스(Apophysomyces elegans), 뮤코르(Mucor) 종, 리조뮤코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus) 및 컨닝하멜라 종(컨닝하멜라세아에 과)를 포함한다. 모균증은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어 비대뇌 모균증, 폐 모균증, 위장 모균증, 파종 모균증, 골 모균증, 종격 모균증, 기관 모균증, 신장 모균증, 복막 모균증, 상대정맥 모균증 또는 외이 모균증을 포함한다.
뮤코랄레스 목에 속하는 진균은 현재 코아네포라세아에(Choanephoraceae); 컨닝하멜라세아에; 뮤코라세아에(Mucoraceae); 마이코타이파세아에(Mycotyphaceae); 파이코마이세타세아에(Phycomycetaceae); 필로볼라세아에(Pilobolaceae); 삭세나에아세아에(Saksenaeaceae); 신세팔라스트라세아에(Syncephalastraceae); 및 움벨로프시다세아에(Umbelopsidaceae) 과로 분류된다. 이들 진균 과들은 각각 하나 이상의 속으로 이루어진다. 예를 들어 뮤코랄레스 목, 뮤코라세아에 과에 속하는 진균은 아브시디아(예를 들어 아브시디아 코림비페라); 액티노뮤코르(Actinomucor)(예를 들어 액티노뮤코르 엘레간스(Actinomucor elegans)); 아밀로마이세스(Amylomyces)(예를 들어 아밀로마이세스 룩시이(Amylomyces rouxii)); 아포파이소마이세스; 바쿠셀라(Backusella)(예를 들어 바쿠셀라 시르시나(Backusella circina)); 벤자미니엘라(Benjaminiella)(예를 들어 벤자미니엘라 멀티스포라(Benjaminiella multispora)); 카에토클라디움(Chaetocladium)(예를 들어 카에토클라디움 브레펠디이(Chaetocladium brefeldii)); 씨르시넬라(Circinella)(예를 들어 씨르시넬라 안가렌시스(Circinella angarensis)); 코케로마이세스(Cokeromyces)(예를 들어 코케로마이세스 레쿠르바투스(Cokeromyces recurvatus)); 디크라노포라(Dicranophora)(예를 들어 디크라노포라 풀바(Dicranophora fulva)); 엘리소마이세스(Ellisomyces)(예를 들어 엘리소마이세스 아노말루스(Ellisomyces anomalus)); 헬리코스틸룸(Helicostylum)(예를 들어 헬리코스틸룸 엘레간스); 하이포뮤코르(Hyphomucor)(예를 들어 하이포뮤코르 아사멘시스(Hyphomucor assamensis)); 키르코마이세스(Kirkomyces)(예를 들어 키르코마이세스 코르덴시스(Kirkomyces cordensis)); 뮤코르(예를 들어 뮤코르 암피비오룸(Mucor amphibiorum)); 파라시텔라(Parasitella)(예를 들어 파라시텔라 파라시티카(Parasitella parasitica)); 필로포라(Philophora)(예를 들어 필로포라 아가리시나(Philophora agaricina)); 필라이라(Pilaira)(예를 들어 필라이라 아노말라(Pilaira. anomala)); 피렐라(Pirella)(예를 들어 피렐라 시르시난스(Pirella circinans)); 리조뮤코르(Rhizomucor)(예를 들어 리조뮤코르 엔도피티쿠스(Rhizomucor endophyticus)); 리조포도프시스(Rhizopodopsis)(예를 들어 리조포도프시스 자벤시스(Rhizopodopsis javensis)); 리조푸스; 스포로디니엘라(Sporodiniella)(예를 들어 스포로디니엘라 움벨라타(Sporodiniella umbellata)); 시지지테스(Syzygites)(예를 들어 시지지테스 메갈로카르푸스(Syzygites megalocarpus)); 탐니디움(Thamnidium)(예를 들어 탐니디움 엘레간스)); 써모뮤코르(Thermomucor)(예를 들어 써모뮤코르 인디카에-세우다티카에(Thermomucor indicae - seudaticae); 및 지고르힌쿠스(Zygorhynchus)(예를 들어 지고르힌쿠스 칼리포르니엔시스(Zygorhynchus californiensis))의 속들로 추가 분류된다. 상기 리조푸스 속은 예를 들어 리조푸스 아지고스포루스(Rhizopus azygosporus); 리조푸스 카에스피토수스(Rhizopus caespitosus); 리조푸스 호모탈리쿠스(Rhizopus homothallicus); 리조푸스 오리자에; 및 리조푸스 스키페라에(Rhizopus schipperae) 종들로 이루어진다.
상기 코아네포라세아에 과는 진균 속 블라케슬레아(Blakeslea)(예를 들어 블라케슬레아 모노스포라(Blakeslea monospora)), 코아네포라(Choanephora)(예를 들어 코아네포라 쿠쿠르비타룸(Choanephora cucurbitarum)), 길베르텔라(Gilbertella)(예를 들어 길베르텔라 하이나넨시스(Gilbertella hainanensis)) 및 포이트라시아(Poitrasia)(예를 들어 포이트라시아 씨르시난스(Poitrasia circinans)로 이루어진다. 상기 컨닝하멜라세아에 과는 클라마이도아브시디아(Chlamydoabsidia)(예를 들어 클라마이도아브시디아 파데니이(Chlamydoabsidia padenii)); 컨닝하멜라(예를 들어 컨닝하멜라 안탁티카(Cunninghamella antarctica)); 곤그로넬라(Gongronella)(예를 들어 곤그로넬라 부트레리(Gongronella butleri)); 할테로마이세스(Halteromyces)(예를 들어 할테로마이세스 라디아투스(Halteromyces radiatus)); 및 헤셀티넬라(Hesseltinella)(예를 들어 헤셀티넬라 베시쿨로사(Hesseltinella vesiculosa)) 속으로 이루어진다. 상기 마이코티파세아에 과는 마이코티파(Mycotypha)(예를 들어 마이코티파 아프리카나(Mycotypha africana)) 진균 속으로 이루어진다. 상기 파이코마이세타세아에 과는 파이코마이세스(Phycomyces)(예를 들어 파이코마이세스 블라케슬레아누스(Phycomyces blakesleeanus) 및 스피넬루스(Spinellus)(예를 들어 스피넬루스 칼리베우스(Spinellus chalybeus)) 진균 속으로 이루어진다. 상기 필로볼라세아에 과는 필로불루스(Pilobolus)(예를 들어 필로불루스 롱기페스(Pilobolus longipes)) 및 유타로마이세스(Utharomyces)(예를 들어 유타로마이세스 에팔로카울루스(Utharomyces epallocaulus)) 진균 속으로 이루어진다. 상기 삭세나에아세아에 과는 아포파이소마이세스(Apophysomyces)(예를 들어 아포파이소마이세스 엘레간스) 및 삭세나에아(Saksenaea)(예를 들어 에스 바시포르미스(Saksenaea vasiformis)) 진균 속으로 이루어진다. 상기 신세팔라스트라세아에 과는 디코토모클라디움(Dichotomocladium)(예를 들어 디코토모클라디움 엘레간스); 펜넬로마이세스(Fennellomyces)(예를 들어 펜넬로마이세스 기가셀룰라리스(펜넬로마이세스 gigacellularis)); 마이코클라두스(Mycocladus)(예를 들어 마이코클라두스 블라케슬레아누스); 파스콜로마이세스(Phascolomyces)(예를 들어 파스콜로마이세스 아르티쿨로수스(Phascolomyces articulosus)); 프로토마이코클라두스(Protomycocladus)(예를 들어 프로토마이코클라두스 파이살라바덴시스(Protomycocladus faisalabadensis)); 신세팔라스트룸(Syncephalastrum)(예를 들어 신세팔라스트룸 모노스포룸); 탐노스틸룸(Thamnostylum)(예를 들어 탐노스틸룸 루크노웬세(Thamnostylum lucknowense)); 지카에아(Zychaea)(예를 들어 지카에아 멕시카나(Zychaea mexicana)) 진균 속으로 이루어진다. 마지막으로, 상기 움벨로프시다세아에 과는 움벨로프시스(Umbelopsis)(예를 들어 움벨로프시스 안굴라리스(Umbelopsis angularis)) 진균 속으로 이루어진다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는 활성 성분과 상용성인 임의의 및 모든 약제 등급 용매, 완충제, 오일, 지질, 분산 매질, 코팅제, 등장성 및 흡수 촉진제 등을 포함한다. 이들 약학적으로 허용 가능한 담체를 선택된 투여 방식, 예를 들어 주사, 비 내 투여, 경구 투여 등에 적합한 광범위한 약제 등급 물질로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, "약학적" 또는 "약학적으로 허용 가능한"이란 용어들은 공지된 기법에 의해 무독성인 것으로 제형화되고, 경우에 따라 인간에게 안전하게 투여될 수 있는 담체 또는 첨가제와 함께 사용되는 조성물을 추가로 지칭한다. 특정한 실시태양에서, "약학적으로 허용 가능한"이란 용어는 동물 및 보다 특히 인간에게 사용하기 위해 연방 또는 주 정부 규제 당국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열됨을 의미한다. "담체"란 용어는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 항원보강제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 상기와 같은 약학 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물 또는 오일, 예를 들어 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 상기 약학 조성물을 정맥 내로 투여하는 경우 물이 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 또한, 특히 주사용액에 대한 액체 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 글루코스, 락토오스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀, 백악, 실리카젤, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화 나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "면역원성 양"이란 용어는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 감염원에 대해 숙주 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 변이체의 특정 에피토프의 유효한 양을 지칭한다. 상기 양은 일반적으로 백신 용량당 항원 20 ㎍ 내지 10 ㎎의 범위이며 치료되는 개체, 상기 개체의 면역계의 항체를 합성하는 능력, 및 목적하는 보호 정도에 따라 변한다. 필요한 면역원의 정확한 양을 다양한 방법, 예를 들어 항체 역가에 의해 계산할 수 있다. 유효량이란 용어는 목적하는 결과를 제공하기에 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 따라서, 백신을 기술하는데 사용되는 바와 같이, 유효량은 보호 면역 반응을 생성시키거나 이끌어내기에 충분한 화합물 또는 조성물(예를 들어 항원)의 양을 지칭한다. 면역학적 조성물에 관하여 유효량은 면역 반응을, 상기 반응이 보호성이든 아니든 간에, 이끌어내기에 충분한 양이다.
본 발명은 부분적으로 FTR 유전자 산물이 혈행성 파종 또는 모균증에서 리조푸스 오리자에와 같은 진균 병원체의 완전 독성(full virulence)에 필요하다는 발견에 관한 것이다. 더욱이, 모균증을 갖는 숙주에서 FTR 폴리펩타이드 형성의 억제는 연장된 생존을 부여한다. 본 발명에 개시한 바와 같이, FTR1 작용의 파기는 생체 내에서 감소된 철 흡수 및 감소된 독성을 생성시켰으며, 항-Ftrlp 항체에 의한 수동 면역화는 감염된 마우스의 생존을 현저하게 개선시켰다. 본 발명에 개시한 바와 같이, FTR1에 대한 수동 면역요법은 이들 치명적인 감염 결과의 개선에 실행 가능한 전략이다.
따라서, 모균증 또는 다른 진균 질병의 치료에 있어서 FTR 분자 및/또는 그의 기능의 유효한 억제를 위한 상이한 조성물들이 본 발명에 개시되어 있다. 이들 억제 조성물은 백신, 안티센스, siRNA, 항체 또는 FTR의 작용을 유효하게 표적화하고 억제할 수 있는 임의의 다른 조성물을 포함한다. 상기와 같은 조성물은 감염된 조직에서 상기 진균의 증식을 감소시키고/시키거나 방지할 것이며 미생물을 사망에 이르게 할 것이다. 본 발명의 조성물은 또한 감염의 발병을 감소시키고/시키거나 발생을 방지하기 위한 예방학적 설정에 유용하다. 또한, 본 발명에 개시된 FTR 억제 조성물들 중 임의의 것에 다른 공지된 항진균 요법, 예를 들어 암포테리신 B 또는 철 킬레이터를 추가로 보충하고/하거나 병용할 수 있다. 예시적인 철 킬레이터는 데페리프론 및 데페라시록스를 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 FTR 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드의 항원 단편 또는 변이체를 갖는 백신 조성물을 제공한다. 상기 백신 조성물은 또한 항원보강제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 백신 조성물은 도 2에 나타낸 FTR 폴리펩타이드(서열번호: 2) 또는 상기 FTR 폴리펩타이드의 항원 단편(예를 들어 REGLE 동기), 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 항원보강제를 갖는다.
유사하게, 상기 백신 조성물은 도 15 내지 18에 나타낸 뉴클레오타이드에 상응하는 FTR 폴리펩타이드를 갖는다. 본 발명의 백신 조성물의 제형은 진균 병원체의 FTR에 대해 특정한 체액(중화 항체) 및 효과기 세포 매개된 면역 반응 모두를 자극함으로써 개체에서 보호 면역을 유도하는데 유효하다. 본 발명의 백신 조성물을 또한 진균 감염, 예를 들어 모균증의 치료 또는 예방에 사용한다.
본 발명의 백신은 면역보호성 양의 FTR 항원을 함유할 것이며 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조된다. 상기 백신의 제조는 예를 들어 문헌[M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press(1995)]; [A. Robinson, M. Cranage, and M. Hudson, eds., "Vaccine Protocols(Methods in Molecular Medicine)," Humana Press(2003)] 및 [D. Ohagan, ed., "Vaccine Ajuvants: Preparation Methods and Research Protocols(Methods in Molecular Medicine)," Humana Press(2000)]에 일반적으로 개시되어 있다.
FTR 폴리펩타이드, 및 그의 펩타이드 단편 또는 변이체는 면역원성 에피토프를 포함할 수 있으며, 이는 당해 분야에 공지되고 예를 들어 문헌[Geysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998(1984)]에 개시된 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 간단히, 표적 폴리펩타이드(즉 FTR)의 전체 아미노산 서열을 포함하는 수백 개의 중복하는 짧은 펩타이드, 예를 들어 헥사펩타이드를 합성할 수 있다. 이어서 상기 펩타이드를 그의 합성에 사용된 고체 지지체에 여전히 결합되어 있는 동안 다양한 항혈청을 사용하여 ELISA 방법에 의해 항원성에 대해 시험한다. FTR 단백질에 대한 항혈청을 공지된 기법(ohler and Milstein, Nature 256:495-499(1975))에 의해 획득할 수 있으며, 항원성이 감소되도록 인간화시키거나(예를 들어 미국 특허 제 5,693,762 호 참조) 또는 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 유전자를 남기는 트랜스제닉 마우스에서 생산할 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 5,877,397 호 참조). 일단 상기 완전 단백질에 대해 생성된 항체와 반응성인 에피토프 함유 헥사펩타이드가 확인되면, 상기 펩타이드를 모든 위치에서 아미노산 치환에 의해 및/또는 C 및/또는 N 말단 단부 모두에서 연장에 의해 특이성에 대해 추가로 시험할 수 있다. 상기와 같은 에피토프 함유 폴리펩타이드들은 전형적으로는 적어도 6 내지 14 개의 서열번호: 2의 아미노산 잔기를 함유하며, 예를 들어 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하는 폴리펩타이드 합성에 의해 또는 FTR 폴리펩타이드의 단편화에 의해 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 면역원으로서 사용된 분자에 관하여, 당해 분야의 숙련가들은 상기 FTR 폴리펩타이드를 면역원성 백신으로서 필수적인 특성의 상실 없이 절두하거나 단편화할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, FTR 폴리펩타이드를 면역원으로서 상기 분자의 작용 성질은 보존하면서 C-말단 단부로부터의 절두에 의해 절두시켜 N-말단 단편을 제공할 수 있다. 유사하게, C-말단 단편을, 면역원으로서 상기 분자의 작용 성질은 보존하면서 N-말단 단부로부터의 절두에 의해 생성시킬 수 있다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따른 다른 변경들을 본 발명에 따라 수행하여 다른 FTR 폴리펩타이드 작용 단편, 면역원성 단편, 그의 변이체, 동족체 또는 유도체를 생성시켜, 고유 단백질이 갖는 본 발명에 개시된 치료학적으로 유용한 성질들을 성취할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 통상적인 약학 담체를 추가로 함유한다. 적합한 담체는 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 이들 백신 조성물을 액체 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 다른 임의의 성분들, 예를 들어 약제 등급 안정제, 완충제, 보존제, 부형제 등은 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 그러나, 상기 조성물을 동결건조시키고 사용 전에 재조성할 수 있다. 한편으로, 상기 백신 조성물을 선택된 투여 방식, 예를 들어 비 내 투여, 경구 투여 등에 적합한 임의의 방식으로 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 백신의 제조는, pH, 등장성, 안정성 등을 참작하여, 당해 분야의 기술 내에 있다.
본 발명 백신 조성물의 면역원성을 상기 백신이 항원보강제 물질을 추가로 포함하는 경우 더욱 증대시킬 수 있다. 상기 백신에 대한 항원보강 효과를 성취하는 다양한 방법들이 공지되어 있다. 일반적인 원리 및 방법들이 문헌["The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull(ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6] 및 또한 ["Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al.(eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9](이들은 모두 본 발명에 참고로 인용된다)에 상세히 개시되어 있다.
바람직한 항원보강제는 항원 제공 세포(APC), 예를 들어 수지상 세포에 의한 상기 백신 분자의 흡수를 촉진하며 상기 세포를 활성화한다. 비 제한적인 예가 면역 표적화 항원보강제; 면역 조절 항원보강제, 예를 들어 독소, 사이토킨, 및 마이코박테리아 유도체; 오일 제형; 중합체; 미셀 형성 항원보강제; 사포닌; 면역자극 복합체 기질(ISCOM(등록상표) 기질); 입자; DDA(다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드); 알루미늄 항원보강제; DNA 항원보강제; 및 캡슐화 항원보강제로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 리포솜 제형들이 또한 항원보강 효과를 부여하는 것으로 공지되어 있으며, 따라서 리포솜 항원보강제는 본 발명에 따라 포함된다.
본 발명의 또 다른 태양은 도 1, 15 내지 18에 나타낸 FTR 서열(예를 들어 서열번호: 1)의 12 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 전사 프로모터, 및 전사 종결자를 포함하는 벡터를 갖는 백신 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 프로모터는 상기 FTR 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결되고, 상기 FTR 뉴클레오타이드 서열은 상기 전사 종결자에 작동 가능하게 연결된다. DNA 백신의 제조는 예를 들어 문헌[M. Saltzman, H. Shen, and J. Brandsma, eds., "DNA Vaccines(Methods in Molecular Medicine)", Humana Press(2006)]; [H. Ertl, ed., "DNA Vaccines," Kluwer Academic/Plenum Publishers(2003)]에 일반적으로 개시되어 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 항원보강제를 추가로 함유한다. DNA 백신과 항원보강제와의 조합은 인간에서 보다 강하고 보다 특이적인 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다(Hokey et al., Springer Semin Immun 28:267-279(2006)). 일반적으로, DNA 백신의 효능은 추가적인 면역 자극을 제공할 수 있는 항원보강제와 병용될 때 증가한다. 예를 들어, 케모카인, 예를 들어 MIP-1α는 DNA 백신용 항원보강제로서 사용될 때 면역화 부위에 전문적인 항원 제공 세포(APC)를 포함한 다양한 세포들을 모집하는 능력을 갖는다. 비교적 낮은 수준의 APC가 존재하는 부위, 예를 들어 근육으로의 APC의 요구는 근육 내 주사용 DNA 백신의 효능을 크게 증가시킬 것이다. 사이토킨, 예를 들어 GM-CSF는 DNA 백신용 항원보강제로서 사용될 때 수지상 세포를 모집할 수 있으며 면역화 부위에서 그의 생존을 증진시킬 수 있다. 분자 항원보강제, 예를 들어 세포 사를 유도하는 Fas는 또한 DNA 백신의 효능 및 효력을 증가시킬 수 있다. 항원보강제-매개된 세포사멸 및 괴사는 APC에 보다 많은 항원을 제공하는 것으로 나타났다. 다른 분자들, 예를 들어 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLG) 및 열 충격 단백질이 또한 DNA 백신용 항원보강제로서 작용하는 것으로 나타났다. 항원보강제를 완전한 분자, 예를 들어 완전한 분자로서, 또는 상기와 같은 분자를 발현하는 벡터, 예를 들어 GM-CSF를 발현하는 플라스미드로서 DNA 백신과 병용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
모균증과 같은 진균 감염에 민감한 개체들의 백신접종 이외에, 본 발명의 백신 조성물을 사용하여 다양한 진균 감염을 앓는 개체들을 면역요법적으로 치료할 수 있다. 따라서, FTR 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 본 발명에 개시된 항체 조성물들 중 하나 이상을 항원보강제와 함께 함유하고 예방 또는 치료 용도를 위한 목적으로 작용하는 백신이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 백신은 신체 자신의 면역계가 진균 FTR 분자를 찾아내어 억제하도록 유도할 것이다.
본 발명의 또 다른 태양은 FTR 서열의 일부에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, FTR 서열의 12 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, FTR 서열의 18 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 RNAi 서열, 및 FTR 뉴클레오타이드 서열, 폴리펩타이드 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 FTR의 안티센스, 작은 간섭 RNA 또는 항체 억제제; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 항원보강제를 추가로 포함한다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자를 서열번호: 1, 도 15 내지 18의 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보성 가닥, 및/또는 그의 일부 또는 변이체를 사용하여 디자인하고, 유전 공학 분야에 공지된 과정에 의해 효소적 연결 반응을 사용하여 제작할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자(예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오타이드)를 삼중 나선 형성을 통해 상기 FTR 유전자의 발현을 억제하는 유전자의 조절 영역(예를 들어 프로모터, 인헨서, 또는 전사 개시 영역)과 하이브리드화하도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오타이드 또는 천연 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 한편으로, 상기 안티센스 핵산 분자를 유전자(즉 mRNA)의 전사물과 하이브리드화하도록 디자인하고, 따라서 상기 전사물의 리보솜에의 결합을 억제함으로써 FTR의 번역을 억제할 수 있다. 상기 안티센스 방법 및 프로토콜은 예를 들어 문헌[C. Stein, A. Krieg, eds., "Applied Antisense Oligonucleotide Technology" Wiley-Liss, Inc.(1998)] 또는 미국 특허 제 5,965,722; 6,339,066; 6,358,931; 및 6,539,124 호에 일반적으로 개시되어 있다.
본 발명은 또한 안티센스 분자로서 매우 엄격한 조건 하에서 서열번호: 1, 도 15 내지 18 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 단편, 부분 또는 변이체를 함유하는 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보성 가닥을 제공한다. 본 발명의 핵산 단편은 약 12 이상, 일반적으로는 약 15, 18, 21 또는 25 이상의 뉴클레오타이드이며, 길이가 40, 50, 70, 100, 200 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 이후에 개시되는 항원 폴리펩타이드를 암호화하는 보다 긴 단편, 예를 들어 길이가 30 이상인 뉴클레오타이드가, 예를 들어 항체의 발생에 특히 유용하다.
본 발명에 사용되는 특정한 작은 핵산 분자는 짧은 간섭 RNA(siRNA)로서 공지된 이중 가닥 RNA의 짧은 신장부이다. 상기 간섭 RNA(RNAi)는 생체 내에서 FTR 유전자 작용의 선택적인 억제를 허용한다. 본 발명에서, RNAi를 모균증 감염의 DKA 마우스 모델에서 FTR 발현을 녹-다운시키는데 사용하였으며, 그렇게 함에 있어서 상기 RNAi는 생존에 대한 극적인 효과 및 상기 감염에 대한 보호를 나타낸다. 상기 RNAi 접근은 바이러스 감염에 대항하는 타고난 세포 반응에 의존한다. 상기 과정에서, 이중 가닥 mRNA가 인식되고 다이서 RNase에 의해 절단되어 RNAi의 21 내지 23 개 뉴클레오타이드의 긴 신장부를 생성시킨다. 상기 RNAi는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)에 의해 통합되고 풀린다. 이어서 상기 단일 안티센스 가닥은 상기 RISC를 상기 상보성 서열을 함유하는 mRNA로 안내하여 상기 mRNA의 내부핵산 가수분해 절단을 생성시킨다(Elbashir et al., Nature 411:494-498(2001)). 따라서, 상기 기법은 개체를 감염시키는 진균 병원체에서 생체 내 FTR mRNA의 표적화 및 분해를 위한 수단을 제공한다.
본 발명은 FTR에 결합하고 FTR 작용을 억제할 수 있는 억제 항체(단클론 또는 다클론) 및 그의 항원-결합 단편을 추가로 제공한다. 본 발명의 항체 억제제는 FTR, 또는 그의 일부, 단편, 변이체에 결합할 수 있고 단백질 작용, 즉 철 운반을 방해하거나 억제할 수 있다. 더욱 또한, 상기와 같은 항체는 FTR에 결합하고 상기 진균 막 내 상기 단백질의 적합한 배치 또는 형태를 방해하거나 억제할 수 있다. 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을, 이들이 본 발명의 FTR 폴리펩타이드와 검출 가능한 수준으로 반응하고 유사한 조건 하에서 관련되지 않은 폴리펩타이드와는 검출 하능하게 반응하지 않는 경우 상기 FTR 폴리펩타이드에 "특이적으로 결합한다", "면역학적으로 결합한다" 및/또는 "면역학적으로 반응성이다"라고 한다.
또한, 재조합 항체, 예를 들어 인간 및 비-인간 부분 모두를 포함하여, 키메릭 및 인간화된 항체(이들은 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조될 수 있다)는 본 발명의 범위 내에 있다. 또한 "항체"란 용어 내에는 단편, 예를 들어 Fab, F(ab')가 포함된다. 본 발명의 FTR 특이적 단클론 항체는 모균증의 원인인 병원성 진균 중의 FTR 또는 그의 작용성 단편에 특이적인 결합 활성을 갖는다.
단클론 항체를 예를 들어 하이브리도마, 재조합체, 파지 디스플레이, 및 조합적 항체 기술 또는 이들의 조합과 같은 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 단클론 항체의 제조 기법 및 프로토콜은 예를 들어 문헌[Harlow and lane, eds., "Antibodies: A laboratory Manual, "Cold Spring harbor Laboratory Press(1999)]; [Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory Press(1999)]; [C. Borrebaeck, ed., Antibody Engineering: A Practical Guide, W.H. Freeman and Co., Publishers, pp. 130-120(1991)]에 일반적으로 개시되어 있다.
더욱이, 본 발명에서 확인된 FTR 뉴클레오타이드 서열의 부분 또는 단편 또는 변이체(및 상응하는 완전한 유전자 서열)를 폴리뉴클레오타이드 시약으로서 다양한 방식들로 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열을 사용하여 분석, 특성화 또는 치료학적 사용을 위해 재조합 폴리펩타이드를 확인하고 발현시킬 수 있다. 상기 서열들을 이후에 개시하는 선별 및/또는 진단 분석에 시약으로서 추가로 사용할 수 있으며, 상기 선별 및/또는 진단 분석에 사용하기 위한 키트(예를 들어 진단 키트)의 성분으로서 또한 포함할 수 있다.
FTR을 억제함에 있어서 본 발명의 조성물을 접합균증 및 모균증을 포함한 광범위하게 다양한 진균 감염을 앓는 개체에게 적용할 수 있다. 본 발명의 조성물에 다른 항진균제(예를 들어 암포테리신, 데페리프론, 데페라시록스)를 추가로 보충할 수 있다. 한편으로, 본 발명의 조성물을 모균증 또는 다른 진균 감염을 나타낼 위험이 높은 모든 개체들에게 예방학적으로(예를 들어 활성 면역화를 통해) 적용할 수 있다. 이는 현행 항진균 및 외과적 표면 절제 치료에 비추어 볼 때 모균증의 높은 사망률 및 이환율을 제공하는 과잉 진료로 간주되지 않을 것이다.
더욱이, 본 발명은 또한 면역원성 FTR 폴리펩타이드 또는 FTR 억제 뉴클레오타이드(예를 들어 RNAi, 안티센스 분자)를 생산할 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다. "숙주 세포"란 용어는 특정한 개체 세포뿐만 아니라 상기 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 숙주 세포는 임의의 원핵 세포(예를 들어 이 콜라이) 또는 진핵 세포(예를 들어 효모, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 또는 COS 세포)일 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포들은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 상기와 같은 면역원성 억제 분자를 발현하는 벡터들을 통상적인 형질감염 또는 형질전환 기법을 통해 원핵 또는 진핵 세포에 도입시킬 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상술한 조성물들 중 어느 하나를 진균 질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. 진균 질환은 병원성 진균에 의한 이상 상태 또는 감염 원인이다. 본 발명의 방법에 의해 개선될 수 있는 진균 질환의 증상으로는 예를 들어 발열, 오한, 식은땀, 식욕부진, 체중 감소, 으스스한 느낌, 울증 및 폐, 피부 또는 다른 병변이 있다. 다른 증상 또는 특징적인 표시는 예를 들어 1차 병소로부터의 파종, 급성 또는 아급성 표시, 진행성 폐렴, 진균혈증, 폐외 파종의 표시, 만성 수막염, 세망내피계(간, 비장, 골수)의 전신 발생으로서 진행성 파종 히스토플라스마증 및 단일 또는 다발성 피부 병변으로서 분아균증을 포함한다. 진균 질환이 있는 개인의 유효 치료는 예를 들어 상기 치료된 개인에게서 상기와 같은 증상들 중 하나 이상의 감소를 생성시킬 것이다. 진균 질환의 다수의 다른 임상 증상들은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 또한 본 발명에 개시된 본 발명의 방법을 사용한 진균 질환의 중증도의 개선 또는 감소 수단의 척도로서 사용될 수 있다.
진균 질환의 진단은 예를 들어 타액, 뇨, 혈액, 골수 또는 감염된 조직으로부터의 시편으로부터 원인 진균을 단리함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 진균 감염을 침입 진균의 독특한 형태학적 특징들을 근거로 고도의 신뢰성으로 조직병리학적으로 및/또는 항원 확인에 선택적인 면역조직화학 등에 의해 진단할 수 있다. 상기 감염 활성의 평가는 또한 많은 상이한 부위들로부터 취한 배양물, 발열, 백혈구 수, 특정한 연루 기관과 관련된 임상 및 실험 매개변수(예를 들어 간 기능 시험), 및 면역혈청학 시험을 토대로 할 수 있다. 양성 타액 배양물의 임상적 의의를 또한 조직 침습의 확인에 의해 보강할 수 있다.
인간 및 동물의 진균 감염, 또는 진균증은 예를 들어 피부의 외층을 침범하는 표면 진균 감염; 구강(아구창), 질 및 항문 부위를 포함한 점막의 진균 감염, 예를 들어 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의한 것, 및 피부의 보다 심부 및 내장 기관을 침범하는 진균 감염을 포함하며, 상기 감염은 심한, 종종 치명적인 병, 예를 들어 리조푸스 오리자에에 의해 유발된 병을 야기할 수 있다. 진균 감염은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 접합균증, 모균증, 아스퍼질루스증, 효모균증, 칸디다증, 히스토플라스마증, 콕시디오이데스 진균증, 파라콕시디오이데스 진균증, 푸사리움증(하이알로하이포진균증), 분아균증, 페니실린균증 또는 스포로트리쿰증을 포함한다. 이들 및 다른 진균 감염을 예를 들어 문헌[Merck Manual, Sixteenth Edition, 1992] 및 [Spellberg et al., Clin. Microbio. Rev. 18:556-69(2005)]에서 찾을 수 있다.
칸디다 속의 진균에 의해 야기된 진균 질환인 칸디다증은 예를 들어 피부 및 구강 점막, 호흡관 및/또는 질에서 발생할뿐만 아니라 혈류, 특히 면역타협된 개인의 혈류를 침습할 수 있다. 칸디다증은 또한 당해 분야에 칸디도시스 또는 모닐리아증으로서도 알려져 있다. 칸디다 속의 예시적인 종으로는 예를 들어 칸디다 알비칸스(albicans), 칸디다 쿠루제이(krusei), 칸디다 트로피칼리스(tropicalis), 칸디다 글라브라타(glabrata) 및 칸디다 파라프실로시스(parapsilosis)가 있다.
아스퍼질러스 속에 의해 유발되는 진균 질병으로는 예를 들어 천식, 낭성 섬유증 및 축농증 개체를 침범하는 알러지성 아스퍼질루스증; 면역이 약해진 개체, 예를 들어 암 개체, 화학요법 중인 개체 및 AIDS 개체에서 증가된 발병률을 나타내는 급성 침습성 아스퍼질루스증; 몸 전체를 통해 널리 퍼지는 파종 침습성 아스퍼질루스증, 및 귀 및 다른 기관의 염증 및 병변을 특징으로 하는 아스퍼질루스 기회감염이 있다. 아스퍼질루스는 대략 200 개 진균들의 속이다. 침습성 질병을 유발하는 아스퍼질러스 종은 예를 들어 아스퍼질러스 푸미가투스(fumigatus) 및 아스퍼질러스 플라부스(flavus)를 포함한다. 알러지성 질병을 유발하는 아스퍼질러스 종은 예를 들어 아스퍼질러스 푸미가투스 및 아스퍼질루스 클라바투스(clavatus)를 포함한다. 다른 예시적인 아스퍼질루스 감염성 종들은 예를 들어 아스퍼질러스 테레우스(terreus) 및 아스퍼질루스 니둘란스(nidulans)를 포함한다.
사물 기생균에 의해 유발되는 상기 진균 질환, 예를 들어 접합균증 및 모균증은 비대뇌 모균증, 폐 모균증, 위장 모균증, 파종 모균증, 골 모균증, 종격 모균증, 기관 모균증, 신장 모균증, 복막 모균증, 상대정맥 모균증 또는 외이 모균증을 포함한다. 모균증을 유발하는 감염원은 리조푸스 속으로부터의 종, 예를 들어 리조푸스 오리자에(리조푸스 아리주스), 리조푸스 미크로스포루스 변종, 리조포디포르미스; 또는 아브시디아 속으로부터의 종, 예를 들어 아브시디아 코림비페라; 또는 아포파이소마이세스 속으로부터의 종, 예를 들어 아포파이소마이세스 엘레간스; 또는 뮤코르 속으로부터의 종, 예를 들어 뮤코르 암피비오룸; 또는 리조뮤코르 속으로부터의 종, 예를 들어 리조뮤코르 푸실루스; 또는 컨닝하멜 속(컨닝하멜라세아에 과 중의)으로부터의 종, 예를 들어 컨닝하멜라 베르톨레티아에를 포함하는 뮤코랄레스 목을 갖는다.
모균증 및 다른 진균 질병의 치료에 있어서 FTR 분자 및/또는 그의 작용의 유효 억제를 위한 다양한 방법들이 본 발명에 개시되어 있다. 이들 억제 방법은 백신, 안티센스, siRNA, 항체, 또는 FTR의 작용을 유효하게 표적화하고 억제할 수 있는 임의의 다른 조성물을 포함한다. 상기와 같은 방법은 병원성 미생물에 철을 공급하는 작용을 하는 주요 철 운반자를 억제함으로써 감염된 조직 중의 진균의 생육을 감소하거나 방지할 것이다. 용해성 FTR 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편 또는 변이체를 사용하는 철 운반의 면역치료학적 억제가, (i) 모균증과 관련된 사망률 및 이환율이 예를 들어 현재 이용 가능한 항진균 요법으로도 계속해서 증가하고; (ii) 상승하는 항진균 내성의 발생률이 항진균제의 증가하는 사용과 관련되고; iii) 예를 들어 중증 접합균증, 모균증, 칸디다증, 또는 아스퍼질루스증의 위험이 있는 개체 집단이 잘-한정되고 매우 크며, 예를 들어 수술 후 개체, 이식 개체, 암개체, 출생 시 저 체중 유아, 당뇨병성 케톤산증(DKA) 및 다른 형태의 대사성 산증을 앓는 개체, 코르티코스테로이드에 의한 치료를 받는 개체, 백혈구 감소증, 외상, 화상, 및 악성 혈액 질환을 앓는 개체, 및 데페록사민 킬레이트화-요법 또는 혈액투석을 받는 개체를 포함하고; iv) 심한 진균 감염이 나타나는 개체의 높은 퍼센트가 호중구 감소증이 아니고, 따라서 백신 또는 경쟁적인 폴리펩타이드 또는 화합물 억제제에 반응할 수 있기 때문에 상기와 관련하여 유용하다. 이러한 이유들로 인해, 지고마이세테스 또는 칸디다는 예를 들어 수동 면역요법, 능동 면역요법 또는 수동 또는 능동 면역요법의 조합에 대한 진균 표적이다.
기계론적으로, FTR 폴리펩타이드는 효모 중의 구리 옥시다제와 착화하고, 거의 동시에 제2철을 산화 단계로 운반한다. DKA 개체에서, 낮은 pH 조건은 트랜스페린(T)을 포함한 혈청 담체 분자로부터 제2철(Fe3 +)의 양성자-매개된 치환을 유발한다. 도 4를 참조한다. 이어서 Fe3 +는 세포 표면에서 제1철(Fe2 +)로 환원된다. 대조적으로, 데페록사민(D)은 트랜스페린으로부터 철을 직접 킬레이트화하여, 페리옥사민을 생성시킨다(철-데페록사민 착체). 이어서 페리옥사민은 진균, 예를 들어 지고마이세테스의 표면상에서 미확인 수용체(들)에 결합한다. 이어서 상기 진균은 상기 세포 표면에서 환원에 의해 페리옥사민으로부터 제1철을 유리시킨다. 상기 두 경우 모두에서, 제1철은 구리 옥시다제(Cu-옥시다제)에 의해 제2철로 다시 산화된다.
따라서, FTR의 억제에 있어서 본 발명의 방법을 접합균증 및 모균증을 포함한 광범위하게 다양한 진균 감염을 앓는 개체에게 적용할 수 있다. 본 발명의 방법에 다른 항진균제(예를 들어 암포테리신, 데페리프론, 데페라시록스)를 추가로 보충할 수 있다. 한편으로, 본 발명의 방법을 모균증 또는 다른 진균 감염이 발병할 위험이 큰 모든 개체에게 예방학적으로 적용할 수 있다(예를 들어 능동 면역화를 통해). 이는 현행 항진균 및 외과적 표면 절제 치료에 비추어 볼 때 모균증의 높은 사망률 및 이환율을 제공하는 과잉 진료로 간주되지 않을 것이다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은 파종 모균증 또는 다른 진균 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 약학적으로 허용 가능한 매질 중의 면역원성 양의 도 2에 나타낸 FTR 폴리펩타이드(서열번호: 2), 또는 상기 폴리펩타이드 또는 그의 변이체의 항원 또는 면역원성 단편을 갖는 백신을 투여함을 포함한다. 상기 백신의 제조는 예를 들어 문헌[M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press(1995)]; [A. Robinson, M. Cranage, and M. Hudson, eds., "Vaccine Protocols(Methods in Molecular Medicine)," Humana Press(2003)] 및 [D. Ohagan, ed., "Vaccine Ajuvants: Preparation Methods and Research Protocols(Methods in Molecular Medicine)," Humana Press(2000)]에 일반적으로 개시되어 있다.
상기 FTR 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드 또는 그의 변이체의 항원 또는 면역원성 단편은 지고마이세테스의 상이한 병원성 진균 종, 예를 들어 리조푸스 오리자에(리조푸스 아리주스), 리조푸스 미크로스포루스 변종 리조포디포르미스, 아브시디아 코림비페라, 아포파이소마이세스 엘레간스, 뮤코르 종, 리조뮤코르 푸실루스 및 컨닝하멜라 종(컨닝하멜라세아에 과); 또는 상이한 칸디다 종, 예를 들어 칸디다 알비칸스, 칸디다 크루제이, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 글라브라타, 및 칸디다 파라프실로시스로부터; 또는 상이한 아스파르길루스 종, 예를 들어 아스파르길루스 푸미가투스, 아스파르길루스 니거, 아스파르길루스 플라부스, 아스파르길루스테레우스, 및 아스파르길루스 니둘란스로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 백신을 투여한 결과 개체에서 진균 병원체의 증식 및/또는 독성이 억제될 것이다.
예를 들어 리조푸스 오리자에의 FTR과 사카로마이세스 세레비지아에 및 칸디다 알비칸스의 FTR과의 서열 상동성을 하기 실시예 I에 추가로 개시한다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 백신 및 방법을 모균증 또는 다른 진균 감염의 치료에 똑같이 적용할 수 있음을 알 것이다. 유사하게, 본 발명에 개시된 교시 및 방법에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 또한 본 발명의 백신 및 방법을 또한 본 발명에 개시된 FTR 단백질과 유사한 면역원성, 서열 및/또는 구조적 상동성을 갖는 철 투과효소 폴리펩타이드를 갖는 다른 병원체들, 예를 들어 진균, 세균 등에도 적용할 수 있음을 알 것이다.
상기 백신 조성물을 투여 제형에 적합한 방식으로 및 항원보강제와 함께 또는 상기 없이 예방학적으로 유효한 바와 같은 양으로 투여한다. 상기 투여되는 양(일반적으로 용량당 1 내지 10 ㎎ , 바람직하게는 1 내지 1000 ㎍ 범위의 항원이다)은 치료되는 개체, 항체를 합성하는 상기 개체의 면역계의 능력, 및 목적하는 보호 정도에 따라 다르다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 변할 수 있으며 각 개체에 고유할 수 있다. 더욱이, 각 백신 용량 중의 폴리펩타이드의 양을 면역보호 반응을 유도하는 면역원성 양으로서 선택한다. 특히 유용한 면역원성 양은 중대한 부작용이 또한 없는 FTR 폴리펩타이드의 양을 포함한다. 상기와 같은 양은 백신접종을 위해 선택된 FTR 폴리펩타이드의 면역원성 강도에 따라 변할 것이다. FTR 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 단편의 유용한 면역원성 양은 예를 들어 약 1 내지 1000 ㎍ 범위의 용량을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, FTR 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 단편의 유용한 면역원성 양은 약 2 내지 100 ㎍을 포함하고, 특히 유용한 용량 범위는 약 4 내지 40 ㎍, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35 및 40 ㎍뿐만 아니라 상기 예시된 양들 사이의 모든 값들일 수 있다. 본 발명의 선택된 FTR 폴리펩타이드 백신의 최적의 면역원성 양을 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 항체 역가 및 앞서 예시된 바와 같은 개체의 다른 면역 반응의 측정을 사용하여 확인할 수 있다. 초기 백신접종에 이어서, 개체들에게 약 3 내지 4 주 안에 추가접종을 제공한다. 백신 전달 방법은 예를 들어 문헌[S. Cohen and H. Bernstein, eds., "Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines(Drugs and The Pharmaceutical Sciences), " Vol. 77, Marcel Dekker, Inc.(1996)]에 추가로 개시되어 있다. 리포솜 내의 캡슐화가 예를 들어 풀러튼(Fullerton)의 미국 특허 제 4,235,877 호에 개시되어 있다. 거대분자에 대한 단백질의 접합이 예를 들어 릭하이트(Likhite)의 미국 특허 제 4,372,945 호 및 아모어(Armor) 등의 미국 특허 제 4,474,757 호에 개시되어 있다.
더욱 또한, 본 발명의 백신 조성물은 항원 FTR 분자를 암호화하는 DNA 백신을 포함한다. 앞서 언급한 바와 같이, DNA 백신의 제조는 예를 들어 문헌[M. Saltzman, H. Shen, and J. Brandsma, eds., "DNA Vaccines(Methods in Molecular Medicine)", Humana Press(2006)]; [H. Ertl, ed., "DNA Vaccines," Kluwer Academic/Plenum Publishers(2003)]에 일반적으로 개시되어 있다. DNA 백신을 다양한 발현 시스템에 의해 개체의 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 이들 발현 시스템은 원핵생물, 포유동물, 및 효모 발현 시스템을 포함한다. 예를 들어 한 가지 접근법은 바이러스 벡터, 예를 들어 새로운 유전 물질을 통합하는 우두 바이러스를 사용하여 상기 숙주 세포를 접종하는 것이다. 한편으로, 상기 유전 물질을 벡터에 통합시키거나 또는 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드로서, 즉 단순히 정제된 DNA로서 숙주 세포에 직접 전달할 수 있다. 또한, 상기 DNA를 감독된 세균, 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 안정하게 형질감염시킬 수 있다. 개체에게 상기 형질감염된 살모넬라를 경구로 접종하는 경우, 상기 세균은 장의 페이에르 판(즉 2차 림프 조직)으로 운반되고, 이어서 면역 반응을 자극한다. 또한, DNA 백신을 다양한 널리 공지된 전달 비히클, 예를 들어 지질 단층, 이중 층, 또는 리포솜과 같은 소낭에 의해 전달할 수 있다. 사포닌 및 블록-공중합체(세포를 투과성으로 만드는데 통상적으로 사용된다)와 같은 작용제들을 또한 DNA 백신과 함께 사용할 수 있다. 앞서 개시된 바와 같이, 본 발명의 DNA 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 항원보강제를 포함할 수 있다.
본 발명에 개시된 DNA 백신 조성물을 본 발명에 의해 고려되는 다양한 경로들에 의해 투여할 수 있다. 상기와 같은 경로는 비 내, 경구, 직장, 질, 근육 내, 피 내 및 피하 투여를 포함한다.
비 경구 투여를 위한 상기 DNA 백신 조성물은 멸균 수성 또는 비 수성 용액, 현탁액 또는 유화액, 단백질 백신, 및 본 발명에 개시된 바와 같은 항원보강제를 포함한다. 상기 조성물은 액체, 슬러리, 또는 사용 전에 멸균 주사용 매질에 용해될 수 있는 멸균 고체의 형태일 수 있다. 비 경구 투여는 근육 내 투여가 바람직하다. 근육 내 접종은 주사기를 통한 근육 내로의 주사를 수반한다. 상기 주사는 주사기 또는 필적하는 수단을 통해서 있을 수 있다. 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 항원보강제를 함유할 수 있다. 한편으로, 본 발명의 백신 조성물을 점막 경로를 통해, 적합한 용량으로, 및 액체 형태로 투여할 수 있다. 경구 투여를 위해서, 상기 백신 조성물을 적합한 담체와 함께 액체, 또는 고체 형태로 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 진균을 FTR에 대한 안티센스에 노출시킴을 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 안티센스는 FTR 뉴클레오타이드 서열의 일부에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 안티센스의 뉴클레오타이드 서열은 FTR 서열의 12 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적이다.
본 발명에 따라 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 편의상 및 통상적으로 고상 합성의 널리 공지된 기법을 통해 제조될 수 있다. 상기와 같은 합성을 위한 장비는 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)를 포함한 다수의 판매처에 의해 판매된다. 상기와 같은 합성을 위한 임의의 다른 수단들을 또한 사용할 수 있으나, 상기 올리고뉴클레오타이드의 실제 합성은 당해 분야의 숙련가들의 재능 안에 있다. 또한 유사한 기법들을 사용하여 다른 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조함은 널리 공지되어 있다. 앞서 개시한 바와 같이, 안티센스 핵산 분자(예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오타이드)를 삼중 나선 형성을 통해 상기 FTR 유전자의 발현을 억제하는 유전자의 조절 영역(예를 들어 프로모터, 인헨서, 또는 전사 개시 영역)과 하이브리드화하도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오타이드 또는 천연 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 한편으로, 상기 안티센스 핵산 분자를 FTR(즉 mRNA)의 전사물과 하이브리드화하도록 디자인하고, 따라서 상기 전사물의 리보솜에의 결합을 억제함으로써 FTR의 번역을 억제할 수 있다. 상기 안티센스 방법 및 프로토콜은 예를 들어 문헌[C. Stein, A. Krieg, eds., "Applied Antisense Oligonucleotide Technology" Wiley-Liss, Inc.(1998)] 또는 미국 특허 제 5,965,722; 6,339,066; 6,358,931; 및 6,539,124 호에 일반적으로 개시되어 있다.
본 발명의 안티센스 조성물을 당해 분야에 공지된 다양한 수단들에 의해 상기 조성물이 필요한 개체에게 전달할 수 있다. 예를 들어, 방출 가능한 형태로 상기 안티센스 조성물을 함유하는 미세입자, 예를 들어 폴리스타이렌 미세입자, 생분해성 입자, 리포솜 또는 미세기포를, 주사를 통해 상기 조성물을 조직에 직접 전달하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조하고 바이러스 벡터, 예를 들어 B형 간염 바이러스(Ji et al., J. Viral Hepat. 4:167 173(1997)); 아데노-결합된 바이러스(Xiao et al. Brain Res. 756:76 83(1997)); 또는 다른 시스템, 예를 들어 비 제한적으로 HVJ(센다이 바이러스)-리포솜 유전자 전달 시스템(Kaneda et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 811:299 308(1997)); "펩타이드 벡터"(Vidal et al. CR Acad. Sci III 32): 279 287(1997)) 중에서; 에피솜 또는 플라스미드 벡터 중의 유전자로서(Cooper et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:6450 6455(1997), Yew et al. Hum Gene Ther. 8:575 584(1997)); 펩타이드-DNA 응집체 중의 유전자로서(Niidome et al., J. Biol. Chem. 272:15307 15312(1997)); "네이키드 DNA"로서(미국 특허 제 5,580,859 호 및 미국 특허 제 5,589,466 호); 지질 벡터 시스템(Lee et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 14:173 206(1997)); 중합체 코팅된 리포솜(Marin et al., 1993년 Can 25일자로 허여된 미국 특허 제 5,213,804 호; Woodle et al., 1991년 Can 7일자로 허여된 미국 특허 제 5,013,556 호); 양이온성 리포솜(Epand et al., 1994년 2월 1일자로 허여된 미국 특허 5,283,185 호; Jessee, J.A., 1996년 11월 26일자로 허여된 미국 특허 제 5,578,475 호; Rose et al., 1994년 1월 18일자로 허여된 미국 특허 제 5,279,833 호; Gebeyehu et al., 1994년 8월 2일자로 허여된 미국 특허 제 5,334,761 호); 기체 충전된 미소구(Unger et al., 1996년 8월 6일자로 허여된 미국 특허 제 5,542,935 호), 리간드-표적화된 캡슐화된 거대분자(Low et al., 1992년 4월 28일자로 허여된 미국 특허 제 5,108,921 호; Curiel et al., 1996년 Can 28일자로 허여된 미국 특허 제 5,521,291 호; Groman et al., 1996년 9월 10일자로 허여된 미국 특허 제 5,554,386 호; Wu et al., 1992년 11월 24일자로 허여된 미국 특허 제 5,166,320 호) 중에서 전달할 수 있다.
본 발명은 또한 진균을 FTR에 대한 작은 간섭 RNA에 노출시킴을 포함하는, 상기 진균 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 상기 질환을 치료 또는 에방하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, FTR 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편에 결합할 수 있는, FTR 서열의 18 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 RNAi 서열을 사용한다.
이중 가닥 RNA(dsRNA)(또한 작은 간섭 RNA(siRNA)로도 공지됨)는 많은 미생물들에서 RNA 간섭(RNAi)으로서 공지된 방법에 의해 서열-특이적인 번역 후 유전자 침묵을 유도한다. 본 발명에서, 실시예 9에 개시된 바와 같이, RNAi가 제조되고 모균증 감염의 DKA 마우스 모델에서 FTR 발현을 녹-다운시키는데 사용되었으며, 그렇게 함에 있어서 상기 RNAi는 생존에 대한 극적인 효과 및 상기 감염에 대한 보호를 나타낸다.
상기 siRNA를 대개는 약학 조성물로서 투여한다. 상기 투여를 공지된 방법들에 의해 수행할 수 있으며, 여기에서 핵산을 시험관 내 또는 생체 내에서 목적하는 표적 세포에 도입시킨다. 통상적으로 사용되는 유전자 전달 기법은 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 일렉트로포레이션 및 미세주입 및 바이러스 방법(Graham et al. Virol. 52, 456(1973); McCutchan et al. J. Natl. Cancer Inst. 41, 351(1968); Chu et al. Nucl. Acids Res. 15, 1311(1987); Fraley et al. J. Biol. Chem. 255, 10431(1980); Capecci, Cell 22, 479(1980)); 및 양이온성 리포솜(Feigner et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 7413(1987))을 포함한다. 상업적으로 입수할 수 있는 양이온성 지질 제형은 예를 들어 Tfx 50TM(Promega) 또는 리포펙타민2000TM(Invitrogen)이다.
본 발명은 또한 FTR의 항체 억제제를 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 FTR의 항체 억제제는 FTR 뉴클레오타이드 폴리펩타이드 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
앞서 개시한 바와 같이 상기 FTR의 항체 억제제는 FTR에 결합하고 그의 작용을 억제할 수 있다. 본 발명의 항체 억제제는 FTR, 그의 일부, 단편 또는 변이체에 결합하고, 상기 단백질 작용, 즉 철 운반을 간섭하거나 억제할 수 있다. 이들 항체는 예를 들어 상기 단백질의 적합한 막 국소화, 폴딩 또는 형태, 그의 기질 결합 능력에 부정적으로 영향을 미침으로써 FTR을 억제할 수 있다.
본 발명의 항체를 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성시킬 수 있다. FTR에 대한 다클론 항체를 당해 분야에 널리 공지된 다양한 과정들에 의해 생성시킬 수 있다. 예를 들어, FTR 펩타이드 항원을 비 제한적으로 토끼, 마우스, 래트 등을 포함한 다양한 숙주 동물들에게 투여하여 상기 항원에 특이적인 다클론 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도할 수 있다. 숙주 종에 따라 다양한 항원보강제들을 사용하여 면역학적 반응을 증가시킬 수 있으며, 상기 항원보강제로는 비 제한적으로 프로인트(완전 및 불완전), 무기 젤, 예를 들어 수산화 알루미늄, 알룸(알하이드로젤), 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중 음이온, 펩타이드, 오일 유화액, 키홀 림펫 헤모시아닌, 다이나이트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 항원보강제, 예를 들어 BCG(바실러스 칼메트-게랑) 및 코리네박테리움 파르붐이 있다. 상기와 같은 항원보강제들은 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 항체 생산에 적합한 FTR 펩타이드 항원들을 널리 공지된 기법에 따라 디자인하고, 제작하여 사용할 수 있다. 예를 들어 문헌[ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Chapter 5, p. 75-76, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory(1988); Czernik, Methods In Enzymology, 201:264-283(1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:21-49(1962)]을 참조하시오. 본 발명의 단클론 항체를 하이브리도마의 사용, 재조합체, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합을 포함한 당해 분야에 공지된 광범위하게 다양한 기법들을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체를 당해 분야에 공지되고 예를 들어 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)](이들 문헌은 내용 전체가 참고로 인용된다)에 교시된 것들을 포함한 하이브리도마 기법을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 항체를 또한 당해 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 작용 항체 도메인을 상기 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지니는 파지 입자의 표면상에 표시한다. 특정한 실시태양에서, 상기와 같은 파지를 사용하여 레퍼토리 또는 조합적인 항체 라이브러리(예를 들어 인간 또는 쥐)로부터 발현된 항원 결합 도메인을 표시할 수 있다. 관심 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지를 항원에 의해, 예를 들어 표지된 항원, 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포착된 항원을 사용하여 선택하거나 확인할 수 있다. 이들 방법에 사용되는 파지는 전형적으로는 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 다이설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 파지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 섬유상 파지이다. 본 발명의 항체 제조에 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예로는 미국 특허 제 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108 호에 개시된 것들이 있으며, 이들 특허는 각각 본 발명에 내용 전체가 참고로 인용된다.
본 발명의 항체를 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 면역특이적 결합에 대해 분석할 수 있다. 사용될 수 있는 면역분석으로는 비 제한적으로 몇 가지 언급하자면, 웨스턴 블럿, 방사성면역분석, ELISA(효소 결합된 면역흡수 분석), "샌드위치" 면역 분석, 면역침전 분석, 침강소 반응, 젤 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집반응 분석, 보체-고정 분석, 면역방사 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석과 같은 기법들을 사용하는 경쟁 및 비-경쟁 분석 시스템들이 있다. 상기와 같은 분석은 통상적이며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook, Fitsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]을 참조하시오.
특이적인 결합을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 다양한 측정법들, 예를 들어 친화성(Ka 또는 Kd), 결합속도(Kon), 해리속도(Koff), 결합활성 또는 이들의 조합에 의해 측정할 수 있다. 본 발명의 항체들을 또한 FTR에 대한 그들의 결합 친화성에 관하여 개시하거나 명시할 수 있다. 바람직한 결합 친화성은 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 항체가 FTR 억제제로서 사용될 수 있는 예시적인 접근법은 FTR 폴리펩타이드에의 결합, 및 신체 중에서 FTR 폴리펩타이드를 국소적으로 또는 전신적으로 또는 상기 항체의 직접적인 세포독성에 의해, 예를 들어 보체(CDC)에 의해 또는 효과기 세포(ADCC)에 의해 매개되는 바와 같이 억제시킴을 포함한다. 본 발명의 항체를 다른 단클론 또는 키메릭 항체와 함께, 또는 림포카인 또는 조혈 성장 인자(예를 들어 IL-2, IL-3 및 IL-7)(이들은 예를 들어 상기 항체와 상호작용하는 효과기 세포의 수 또는 활성을 증가시키는 작용을 한다)와 함께 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 항체를 단독으로, 또는 다른 유형의 치료, 예를 들어 항진균 요법과 함께 투여할 수 있다. 하나의 실시태양에서, FTR 억제제 항체를 인간 개체에게 치료 또는 예방을 위해 투여한다.
다양한 전달 시스템들, 예를 들어 리포솜, 미세입자, 미세캡슐 중의 캡슐화가 공지되어 있으며 이들을 본 발명의 항체 억제제를 투여하는데 사용할 수 있다. 도입 방법으로는 비 제한적으로 피 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비 내, 경막 외 및 경구 경로가 있다.
상기 화합물 또는 조성물을 임의의 통상적인 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 일시주사에 의해, 상피 또는 점막 피부 층(예를 들어 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있으며 다른 생물 활성 작용제들과 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 폐 투여가 또한, 예를 들어 흡입기 또는 분무기의 사용에 의해, 및 분무제와의 제형에 의해 사용될 수 있다.
항체의 경우, 개체에게 투여되는 투여량은 전형적으로는 개체 체중 ㎏당 0.1 내지 100 ㎎이다. 바람직하게는 상기 개체에게 투여되는 투여량은 개체 체중 ㎏당 0.1 내지 20 ㎎, 보다 바람직하게는 1 내지 10 ㎎이다. 일반적으로, 인간화된 또는 인간 항체는 외래 폴리펩타이드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종들로부터의 항체보다 인간 항체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간화된 항체의 보다 적은 투여량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 더욱이, 본 발명 항체의 투여량 및 투여 빈도를 예를 들어 지질화와 같은 변경에 의해 상기 항체의 흡수 및 조직 침투성(예를 들어 뇌로의)을 향상시킴으로써 줄일 수 있다.
약학 투여형에서, 백신, 안티센스, siRNA 및 항체를 포함하는 본 발명의 조성물들을 단독으로, 또는 서로 또는 다른 약학적으로 활성인 화합물들과 함께 적합한 회합뿐만 아니라 조합으로 사용할 수 있다. 상기 작용제의 투여를 다양한 방식으로, 예를 들어 경구, 구강, 비, 직장, 비 경구, 복강 내, 피 내, 경피, 피하, 정맥 내, 동맥 내, 심장 내, 심실 내, 두개 내, 기관지 내, 및 기관지 내 투여 등으로, 또는 달리 이식 또는 흡입에 의해서 성취할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물을 고체, 반-고체, 액체 또는 기상 형태의 제제, 예를 들어 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 관장제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸로 제형화할 수 있다. 하기의 방법들 및 부형제들은 단지 예시적이며 결코 제한이 아니다.
본 발명에 개시된 치료 양상들 중 임의의 것들을 병용하여 진균 감염을 앓고 있거나 또는 진균 감염의 발병 위험이 있는 개체(예방학적 백신접종 또는 치료)에게 투여할 수 있다. 병용 요법에서, 예를 들어 개체에게 먼저 본 발명의 백신을 제공하여 진균에 대한 면역 반응을 발생시키고, 이어서 안티센스, siRAN 및/또는 상기 진균의 FTR을 표적화할 수 있는 항체를 제공하여 상기 진균 치료를 추가로 증대시킬 수 있다. 상기 치료의 한 실시태양에서, 본 발명의 백신을 예를 들어 모균증과 같은 진균 질환의 치료 또는 예방을 위해 안티센스, siRNA 및/또는 FTR에 대한 항체와 함께 사용한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체를 상기 진균 질환의 치료를 위해 안티센스 및/또는 siRNA와 함께 사용한다.
본 발명의 조성물을 단독으로 또는 함께, 진균 요법에 이용 가능한 하나 이상의 방법 또는 조성물과 추가로 병용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 외과적 방법과 제휴하여 사용하여 진균 감염을 치료할 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 진균 질환의 치료를 위한 약물 또는 방사선 요법과 함께 사용할 수 있다. 본 발명 조성물과의 병용 요법에 유용한 항진균 약물은 비 제한적으로 암포테리신 B, 철 킬레이터, 예를 들어 데페라시록스, 데페리프론, POSACONAZOLE(등록상표), FLUCONAZOLE(등록상표), ITRACONAZOLE(등록상표) 및/또는 KETOCONAZOLE(등록상표)을 포함한다. 진균 감염의 치료를 위한 병용 요법에 유용한 방사선은 전자기 방사선, 예를 들어 진균 감염의 치료에 유용한 특정 파장 및 에너지를 갖는 근적외선 방사선을 포함한다. 병용 요법에서, 화학요법 또는 방사선요법에 이어서, 전형적으로는 유효 항진균 면역 반응의 형성이 선행 치료의 잠재적인 잔류 효과에 의해 손상되지 않도록 하는 방식으로 백신 투여를 수행한다.
병용 요법의 추가의 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 면역사이토킨 치료와 병용할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 예를 들어 백신은 예를 들어 면역 반응을 증진하는 사이토킨이 감염 부위에 존재하는 경우 감염에 대해서 보다 유효한 면역 반응을 생성시키는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 유용한 면역사이토킨은 Th1 반응을 유도하는 것들, 예를 들어 IL-2 또는 IL-12이다. 병용 요법 중에, 예를 들어 개체에게 먼저 본 발명의 백신을 제공하여 진균 감염에 대한 면역 반응을 생성시키고, 이어서 상기 진균을 표적화하고 상기 감염과의 전투에서 상기 면역 반응을 지원할 수 있는 면역사이토킨을 제공할 수 있다. 바람직한 면역사이토킨은 전형적으로는 예를 들어 FTR과 같이 상기 진균의 표면 항원 특징을 인식하는 항체 부분을 갖는다. 면역사이토킨은 전형적으로는 또한 사이토킨 부분, 예를 들어 IL-2, IL-12, 또는 Th1 반응을 우선적으로 지향하는 다른 것들을 갖는다. 본 발명에 적합한 면역사이토킨들은 미국 특허 제 5,650,150 호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.
병용 요법의 또 다른 실시태양에서, 본 발명 조성물들의 조합을 동반하여, 예를 들어 혼합물로서, 별도로, 그러나 동시적이거나 공동으로; 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 이는 상기 병용된 작용제들을 치료 혼합물로서 함께 투여하고 또한 상기 병용된 작용제들을 투여하는 과정이 별도이지만 동시인, 예를 들어 동일한 개인에게 별도의 정맥 내 라인을 통하는 것과 같은 표현을 포함한다. "병용" 투여는 주어진 화합물들 또는 작용제들 중 하나를 먼저 투여하고 이어서 두 번째를 투여하는 분리된 투여를 또한 포함한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 암포테리신 B, 데페라시록스, 데페리프론, POSACONAZOLE(등록상표), FLUCONAZOLE(등록상표), ITRACONAZOLE(등록상표) 및/또는 KETOCONAZOLE(등록상표)과 임의로 병용하여 진균 기회감염을 예방학적으로 치료, 예방 및/또는 진단한다.
따라서, 본 발명은 개체에게 유효량의 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 약학 조성물을 투여함으로써 치료, 억제 및 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 태양에서, 본 발명의 조성물은 실질적으로 정제된다(예를 들어 상기 조성물의 효과를 제한하거나 바람직하지 못한 부작용을 생성시키는 물질이 실질적으로 없다). 상기 개체는 바람직하게는 동물, 예를 들어 비 제한적으로 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등과 같은 동물이며, 바람직하게는 포유동물, 및 가장 바람직하게는 인간이다.
상기 논의된 바와 같이, 다양한 전달 시스템들이 공지되어 있으며 이들을 사용하여 본 발명의 조성물을 투여할 수 있다. 상기 조성물을 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 일시 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 층(예를 들어 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있으며, 다른 생물 활성 작용제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다.
특정한 실시태양에서, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이를 예를 들어, 비 제한적으로, 수술 중 국소 주입, 국소 적용, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터를 사용하여, 좌약을 사용하여, 또는 이식물을 사용하여 성취할 수 있으며, 상기 이식물은 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질, 예를 들어 멤브레인, 예를 들어 사이알라스틱(sialastic) 멤브레인, 또는 섬유이다. 바람직하게는, 백신 또는 항체를 포함한 본 발명의 단백질을 투여하는 경우, 상기 단백질이 흡수하지 않는 물질을 사용할 것을 주의해야 한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 화합물 또는 조성물을 리포솜 중에서 전달할 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 화합물 또는 조성물을 조절된 방출 시스템 중에서 전달할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 조성물을 인간에의 정맥 내 투여에 적합한 약학 조성물로서 통상적인 과정에 따라 제형화한다. 전형적으로는, 정맥 내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요 시, 상기 조성물은 또한 용해제, 및 주사부위의 통증을 완화하기 위한 국소 마취제, 예를 들어 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들을 별도로 공급하거나 또는 단위 투여형으로 함께 혼합한다, 예를 들어 활성제의 양을 가리키는 앰풀과 같은 밀폐적으로 밀봉된 용기 중의 무수 동결건조된 분말 또는 수 비 함유 농축물로서 공급한다. 상기 조성물을 주입에 의해 투여해야 하는 경우, 상기 조성물을 멸균 약제 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배할 수 있다. 상기 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 주사용 멸균 수 또는 염수의 앰풀을, 상기 성분들을 투여 전에 혼합할 수 있도록 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물을 또한 중성 또는 염 형태로서 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 음이온과 형성된 것들, 예를 들어 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유도된 것들, 및 양이온과 형성된 것들, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들을 포함한다.
진균 질병 또는 병의 치료, 억제 및 예방에 유효한 본 발명의 화합물 또는 조성물의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관 내 분석을 임의로 사용하여 최적 투여량 범위의 확인을 도울 수 있다. 상기 제형 중에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 상기 질병 또는 병의 중증도에 따라 변할 것이며, 의사의 판단 및 각 개체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량을 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽할 수 있다.
하기의 실시예들은 파종 모균증의 예방학적 수단 또는 치료에 대한 기준으로서 상기 FTR의 치료학적 유용성을 예시한다. 실시예 1은 FTR의 클로닝 및 확인을 개시한다. 실시예 2는 철-고갈된 조건 하에서 리조푸스 오리자에에서의 FTR 발현을 개시한다. 실시예 3은 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 삭제 돌연변이체에서의 FTR 발현을 개시한다. 실시예 4는 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 삭제 돌연변이체에서의 FTR 작용을 개시한다. 실시예 5는 모균증의 동물 모델의 개발을 개시한다. 실시예는 리조푸스 오리자에에 대한 DKA 마우스의 민감성에 대한 혈청 철 유효성의 효과를 개시한다. 실시예 7은 리조푸스 오리자에로 감염된 DKA 마우스에서 생체 내 FTR의 발현을 개시한다. 실시예 8은 FTR 폴리펩타이드 및 다른 단백질들에 대한 그의 상동성을 개시한다. 실시예 9는 모균증의 혈행 파종의 DKA 마우스 모델에서 리조푸스 오리자에의 독성에 있어서 FTR 유전자 산물의 역할을 개시한다.
본 발명의 다양한 실시태양들의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변경들이 또한 본 발명에 제공된 본 발명의 정의 내에 포함됨은 물론이다. 따라서, 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것이지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
FTR 의 클로닝 및 확인
본 실시예는 사카로마이세스 세레비지아에 및 칸디다 알비칸스의 고 친화성 철 투과효소와 상당한 서열 상동성을 나타낸 리조푸스 오리자에의 FTR의 클로닝 및 확인을 개시한다(도 3).
하기는 본 실시예에 개시된 과정에 사용된 물질 및 방법을 개시한다. 본 발명에 따라, 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 당해 분야의 기술 내에 있는 재조합 DNA 기법을 사용할 수 있다. 상기와 같은 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook, Fitsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]을 참조하시오.
리조푸스 오리자에 99-880을 진균 시험 실험실(샌 앤토니오의 텍사스 대학 건강 과학 센터)로부터 획득하였다. 상기 균주를 비대뇌 모균증이 있는 당뇨병 개체의 뇌 농양으로부터 단리하였다.
리조푸스 오리자에의 FTR을 클로닝하기 위해서, 우리는 사카로마이세스 세레비지아에 FTR의 보존된 영역으로부터 디자인된 축퇴 프라이머를 사용하여 리조푸스 오리자에 게놈 DNA로부터 0.6 kb 단편을 증폭시켰다. 상기 단편은 사카로마이세스 세레비지아에 FTR에 대해 43% 상동성을 나타내었고 EcoRI에 의해 절단된 리조푸스 오리자에 게놈 DNA의 2.0 kb 단편에 하이브리드화되었다. 우리는 상기 PCR-생성된 단편을 사용하여 λ-파지 중에 제조된 리조푸스 오리자에 게놈 라이브러리를 선별하였다. 5 개의 상이한 플라크를 단리하였으며 각각은 상이한 제한 효소로 처리 시 2 kb 단편을 함유하였다. 상기 2.0 kb 게놈클론의 서열 분석은 인트론이 결여된 1101 bp의 단일 개방 판독 프레임을 밝혀냈다. 상기 추정 FTR 폴리펩타이드와 진뱅크 데이터베이스의 다른 단백질의 경우들과의 비교는 칸디다 알비칸스 및 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 공지된 진균 고 친화성 철 투과효소 각각에 대해 46% 및 44% 일치성을 나타내었다(Fu et al., FEMS Microbiol. Lett. 235:169-176(2004)). FTR 폴리펩타이드의 예견된 아미노산 서열의 여러 영역들은 사카로마이세스 세레비지아에 및 칸디다 알비칸스 FTR로부터의 추정 막통과 도메인들과 현저한 상동성을 나타내었다. 중요하게는, 글루탐산 잔기가 철과 직접 상호작용하는 것으로 여겨지는 상기 추정 REGLE 동기가 상기 3 개 미생물로부터의 FTR 폴리펩타이드의 예견된 아미노산 서열에서 보존되었으며 상기 단백질의 소수성 영역 중에 매몰되어 있었다. 추가로, EcoRI, DraI 또는 EcoRI + DraI에 의해 절단되고 FTR의 ORF로 탐침된 리조푸스 오리자에 게놈 DNA의 서던 블럿 분석은 상기 FTR의 유전자 지도를 입증하였다. 낮은 엄격성 하에서 FTR의 ORF를 사용하는 리조푸스 오리자에 DNA의 서던 블럿 분석은 어떠한 다른 밴드들도 밝혀내지 못했으며, 따라서 이는 상기 FTR이 유전자 과의 구성원이 아님을 가리킨다(데이터 도시 안 됨).
실시예 2
철-고갈된 조건 하에서 리조푸스 오리자에 에서의 FTR 의 발현
본 실시예는 철-고갈된 조건 하에서 더 높은 수준으로 FTR이 발현됨을 나타낸다.
고 친화성 철 투과효소의 발현은 대개 철-제한된 환경에서 유도되고 철-풍부 환경에서 억제된다. FTR 폴리펩타이드가 고-친화성 철 투과효소로서 작용함을 입증하기 위해서, 우리는 상이한 농도의 FeCl3에 반응하는 FTR 발현을 조사하였다. 리조푸스 오리자에 균사체를 여과에 의해 수집하고 이를 사용하여 철 킬레이터, 1 mM 페로진 및 100 μM의 2,2'바이피리딜이 보충된 감자 덱스트로스 브로쓰(PDB)를 접종하여 철 기아를 유도하였다. 상기 균사체를 철에 대해 앞서 킬레이트화된 PDB로 옮기고, 다양한 농도의 FeCl3을 보충하고 선택된 간격들로 37 ℃에서 배양하였다. 예상된 바와 같이, 상기 미생물이 FeCl3 결핍 배지에 노출될 때 FTR 발현이 모든 시점들에서 유도되었다. 상기 FeCl3의 첨가는 노출 후 5분 정도로 빨리 FTR 발현의 빠른 억제를 생성시켰다. 더욱이, 상기 FTR 발현의 억제는 용량 의존적인 것으로 나타났으며, 이때 50 μM FeCl3에 비해 350 μM FeCl3에서 FTR mRNA가 보다 현저하고 빠르게 감소하였다. 이러한 결과와 일관되게, FTR 발현은 균사체를 철-풍부 배지, PDB에서 증식시킬 때 검출되지 않았다. 이러한 결과는 FTR이 철-고갈된 환경에서 유도되고, 철-풍부 환경에서는 억제되며, 그의 전사는 배지 중의 철의 양에 의해 엄격하게 조절됨을 입증한다(도 5). 이러한 엄격한 전사 조절은 효모에서 보고되었으며 이는 세포 내 철 농도의 변화에 대한 전사 활성화의 감도에 기인하는 듯하다. 상기와 같은 엄격한 조절은 미생물이 과잉의 철에 의해 야기된 독성을 피할 수 있게 하는 듯하다. 중요하게, 상기 결과는 또한 FTR이, 숙주 중의 유리 철 농도가 여전히 FTR의 발현을 유도하는 것으로 나타난 최고 농도(즉 50 μM) 보다 10의 몇 승 정도로 낮을 것으로 예상되기 때문에 상승된 이용 가능한 혈청 철을 갖는 숙주에서조차 생체 내 발현되는 듯함(하기 참조)을 입증한다. 예를 들어, 우리는 DKA 마우스가 그의 혈청 중에 7.29 μM의 이용 가능한 철을 가짐을 발견하였다(하기 참조). 추가로, 아티스(Artis) 등은 DKA 개체로부터 수집한 혈청이 12.4 μM의 이용 가능한 철을 함유함을 입증하였다(Artis et al., Diabetes 31(12):1109-14(1982)).
실시예 3
사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 삭제 돌연변이체에서 FTR 의 발현
본 실시예는 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 삭제 돌연변이체에서의 리조푸스 오리자에 FTR의 발현이 철-고갈된 환경에서 증식하는 사카로마이세스 세레비지아에의 능력을 복원함을 입증한다.
FTR이 사카로마이세스 세레비지아에 FTR과 작용상 동등한지를 측정하기 위해서, 우리는 FTR이 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 삭제 돌연변이체의 철-의존성 생육 결함을 구제할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 사카로마이세스 세레비지아에를 유도성 GAL1 프로모터의 조절 하에서(즉 갈락토스의 존재 하에서만 발현) FTR을 함유하는 플라스미드로 형질전환시켰다. FTR로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에는 갈락토스를 함유하는 철-제한된 배지(50 μM 철) 상에서 배양 시 생육하였다. 대조적으로, 상기 FTR-형질전환된 세포를 글루코스(이는 상기 GAL1 프로모터의 활성화를 유도하지 못했고 따라서 FTR의 전사를 유도하지 못했다)를 함유하는 플레이트 상에서 배양 시 생육이 주목되지 않았다(도 6). 예상된 바와 같이, 벡터만(음성 대조군)을 지니는 사카로마이세스 세레비지아에 형질전환체는 갈락토스의 존재 하에서조차 철-고갈된 배지 상에서 생육하지 못했다. 모든 사카로마이세스 세레비지아에 형질전환체들은 글루코스 또는 갈락토스를 함유하는 철-풍부 플레이트(350 μM 철) 상에서 동등하게 잘 생육하였으며, 이는 철-풍부 환경에서 작용하는 것으로 여겨지는 사카로마이세스 세레비지아에의 저-친화성 철 투과효소의 존재에 기인하는듯하다(도 8).
실시예 4
FTR 이 철의 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 삭제 돌연변이체 흡수를 보완한다
본 실시예는 리조푸스 오리자에 FTR이 사카로마이세스 세레비지아에에서 작용성 폴리펩타이드를 암호화함을 나타낸다.
상기 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 돌연변이체의 FTR-매개된 생육 구제가 증가된 철 흡수에 기인함을 입증하기 위해서, 우리는 GAL1 프로모터 하에서 리조푸스 오리자에 FTR로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에의 59Fe 흡수의 동역학을 빈 벡터를 함유하는 형질전환체와 비교하였다. 상기 빈 벡터로 형질전환된 ftrl 삭제 돌연변이체 세포는 59FeCl3을 0.1 μM(오직 고 친화성 철 투과효소만이 활성인 농도)로 공급할 때 세포 내 철 축적을 보이지 않았다. 대조적으로, 사카로마이세스 세레비지아에 ftr1 삭제 돌연변이체 내로의 FTR의 도입은 상기 철 흡수를 야생형 균주에 의해 나타난 양의 48 내지 60%까지 복원하였다(도 7).
요약하면, 실시예 3 및 4에서 우리는 우리가 철-고갈된 배지 중에서 리조푸스 오리자에에서 발현되고, 철-풍부 배지에서는 억제되며, 철-불충분 배지에서 철을 흡수하는 돌연변이체의 능력을 구제함으로써 사카로마이세스 세레비지아에의 고-친화성 철 투과효소 삭제 돌연변이체의 생육 결함을 보완하는 유전자(FTR)를 클로닝하였음을 보였다. 전체적으로, 이들 데이터는 FTR 폴리펩타이드가 고 친화성 리조푸스 오리자에 철 투과효소를 암호화하고, 또한 리조푸스 오리자에 유전자가 사카로마이세스 세레비지아에에서 작용상 발현될 수 있으므로 사카로마이세스 세레비지아에에서의 FTR 폴리펩타이드의 생산에 충분한 근거를 제시함을 강하게 가리킨다.
실시예 5
모균증 동물 모델의 개발
임의의 질병의 병인을 연구하기 위해서, 관련 임상 인자들을 발생 반복하는 동물 모델을 개발하는 것은 필수적이다. 본 실시예는 우리가 모균증에 관련된 동물 모델, 혈행 파종 리조푸스 오리자에 감염의 DKA 마우스 모델을 개발하였음을 나타낸다.
우리는 복강 내로 제공된 스트렙토조토신의 단일 주사를 사용함으로써 혈행 파종 모균증의 DKA 마우스 모델을 성공적으로 개발하였다. 우리는 DKA 개체가 모균증을 발병할 위험이 높기 때문에 이 모델을 선택하였다. 예상된 바와 같이, 우리는 DKA 마우스가 정상 마우스보다 리조푸스 오리자에 감염에 더 민감함을 발견하였다. 104 포자의 정맥 내 접종 후 7일째에, 모든 DKA 마우스가 죽은 반면, 감염된 비-당뇨병 마우스는 40%가 생존하였다(도 8).
감염의 중증도를 평가하기 위해서, 우리는 조직 콜로니 수를 원래 에이 푸미가투스의 동물 모델에서 질병 진행을 측정하기 위해 개발된 정량적인 PCR-기재(qPCR)(TaqMan) 분석에 비교하였다. 상기 TaqMan 기법은, 상기 콜로니 카운트 방법이, 균사 구조가 조직 균질화에 의해 파괴되어 진균의 사망 및 기관 진균 부담의 부정확하게 낮은 평가를 발생시키므로 곰팡이의 조직 진균 부담을 측정하는데 신뢰할 수 없기 때문에 개발되었다. 실제로, 예상된 바와 같이, 콜로니 수는 리조푸스 오리자에에 의한 감염 중에 증가하지 못했으며 사망률과 상관되지 못했다. 대조적으로, 조직 진균 부담의 증가와 사망 발생 간의 일시적인 상관성이, 리조푸스 오리자에 18s DNA를 증폭하도록 디자인된 프라이머를 사용하는 qPCR-기재(TaqMan) 기법을 사용하여 조직 리조푸스 오리자에 부담을 정량화할 때 발견되었다(도 9). 이들 결과는 리조푸스 오리자에의 다양한 접종물을 가한 마우스 조직이 선형 범위의 검출을 나타낸다는 우리의 예비 결과와 일치하였다. 따라서, 상기 qPCR-분석은 상기 DKA 마우스 모델에서 모균증의 진행을 평가하기에 민감하고 신뢰할만한 방법이다.
본 분석을 사용하여 상기 질병의 병인에 있어서 철 대사의 역할을 밝힐 것이다.
실시예 6
리조푸스 오리자에 에 대한 DKA 마우스의 감수성에 대한 혈청 철 유효성의 효과
본 실시예는 리조푸스 오리자에에 대한 DKA 마우스의 감수성이 상승된 이용 가능한 혈청 철에 부분적으로 기인함을 보인다.
이용 가능한 철이 당뇨병 마우스를 리조푸스 오리자에 감염에 더욱 감수성으로 만드는 것을 입증하기 위해서, 우리는 DKA 마우스의 혈청 철의 수준을 아티스(상기 1982) 등의 방법을 사용하여 정상 마우스의 수준과 비교하였다. 상기 결과에 따라서 인간 DKA 마우스(n=11)가 정상 마우스보다 대략 5 배 더 높은 수준의 이용 가능한 혈청 철을 가짐이 발견되었다[중간(75th 사분위수, 25th 사분위수)]=7.29(11.8, 4.3) μM 대 1.69(2.3, 1.3) μM, 윌콕슨 순위 합계에 의해 p = 0.03). 이들 데이터는 우리의 DKA 마우스 모델의 임상 관련성을 뒷받침한다.
리조푸스 오리자에의 병원성에서 상승된 이용 가능한 혈청 철의 역할을 확인하기 위해서, 우리는 리조푸스 오리자에 감염에 대한 DKA 마우스의 감수성에 대한 철 킬레이트화 효과를 조사하였다. 마우스를 꼬리 정맥을 통해 리조푸스 오리자에의 포자로 감염시켰다. 상기 마우스를 0.5% 하이드록시프로필셀룰로스 중의 1, 3 또는 10 ㎎/㎏ 데페라시록스(철 과부하를 갖는 개체를 치료하기 위한 새로 FDA 승인된 철 킬레이터)로 감염 당일에 시작하여 7일간 매일 2 회(bid) 위관 영양에 의해 처리하였다. 음성 대조용 마우스를 하이드록시프로필셀룰로스 담체(위약) 또는 데페라시록스+포화 염화 제2철로 처리하였다(ip 투여). 추가적인 음성 대조군은 염화 제2철로 처리된 비 감염 마우스로 이루어졌다. 모든 용량으로 제공된 데페라시록스는 대조용에 비해 생존을 현저하게 개선시켰다(도 10a). 이러한 개선된 생존은 고 용량의 리포솜 암포테리신 B(LAmB)를 사용하여 감염을 치료하는 경우 우리가 상기 모델에서 획득한 생존에 필적하였다. 조직 진균 부담에 대한 데페라시록스의 영향을 측정하기 위해서, DKA 마우스를 상기와 같이 iv 감염시켰다. 마우스를 데페라시록스(10 ㎎/㎏ bid), 데페라시록스+포화 염화 제2철, 또는 위약으로 처리하였다. 처리를 감염 후 16시간째에 시작하였으며 3일간 매일 투여하였다. 신장 및 뇌를 제4일에 제거하고, 균질화하고, 정량적으로 배양하였다. 데페라시록스는 위약 또는 데페라시록스+포화 염화 제2철로 처리한 마우스에 비해 뇌 및 신장(1차 표적 기관) 모두에서 10 배 넘게 진균 부담을 감소시켰다(도 10b). 조직병리학에 의해, 데페라시록스-처리된 마우스의 신장은 가시적인 균사가 없는 반면, 위약 또는 데페라시록스+포화 염화 제2철로 처리된 마우스의 신장은 광범위하게 섬유화된 진균을 가졌다. 더욱 또한, 포화 철로 처리된 마우스는 감염 부위로의 호중구 유입의 현저한 부재를 갖는 반면, 데페라시록스로 처리된 마우스의 신장에서 호중구 유입은 현저하였다(데이터 도시 안 됨). 데페라시록스를 포화 용량의 FeCl3과 함께 마우스에게 투여했을 때 보호의 반전은 상기 보호 기전이 철 킬레이트화에 기인함을 추가로 입증하였다. 중요하게, 이들 결과는 데페리프론(리조푸스에 의한 철운반체로서 사용되지 않은 또 다른 킬레이트제)이 동물들을 리조푸스 감염으로부터 보호함을 입증한 우리의 선행 연구와 일치하며 철 유용성과 리조푸스 오리자에 간의 연계를 입증한다. 이들 결과는 모균증의 병인에서 철 특유의 중요성을 추가로 입증한다.
실시예 7
DKA 마우스에서 생체 내 FTR 의 발현
본 실시예는 리조푸스 오리자에의 FTR이 DKA 마우스에서 생체 내 발현됨을 보인다.
FTR 폴리펩타이드가 모균증의 병인에서 한 역할을 하기 위해서는 감염 중에 발현되어야 한다. 우리는 실시간 RT-PCR-기재 접근법을 사용하여, 꼬리 정맥 주사를 통해 리조푸스 오리자에 105 포자로 감염시킨 당뇨병 케톤산(DKA) 마우스의 뇌에서의 FTR 폴리펩타이드의 발현을 조사하였다. 상기 뇌는 상기 모델에서 1차 표적 기관이므로 선택되었다. 마우스를 감염 후 24 또는 48 시간째에 죽이고 뇌를 수거하고 분쇄 및 페놀에 의한 RNA 추출 전에 액체 질소 중에서 바로 플래시 동결시켰다. 비 감염 DKA 마우스로부터 수거한 뇌를 나란히 처리하고 음성 대조군으로서 사용하였다. DNase 처리로 오염 게놈 DNA를 제거하고 역 전사(Ambion RETROscript(등록상표) 시스템)를 수행한 후에, cDNA를 SYBR-그린 방법 및 ABI(등록상표) 프리즘 7000 사이클러를 사용하여 실시간 PCR에 의해 분석하였다. 유전자-발현을 리조푸스 오리자에 ACT1 또는 18S rRNA-발현으로 표준화하였다. FTR은 감염 후 48 시간째에 4 마리의 감염된 마우스의 뇌에서 발현된 것으로 밝혀졌으나 24 시간 후에는 아니었다(도 11). 감염 24 시간 후의 FTR 발현의 결여는, 18S rRNA 및 ACT1 유전자 모두의 발현이 감염된 마우스의 뇌 조직에서 검출되었으므로, 상기 뇌 중의 보다 낮은 진균 원소의 존재에 기인할 수는 없다. 지연된 FTR 폴리펩타이드 발현(즉 48 시간 후의 발현, 그러나 24 시간 감염 후는 아님)의 패턴은, 포자가 접종물의 제조 중에 철-풍부 배지 상에서 증식하였기 때문에 24 시간 후에 진균 요소가 충분히 철-차단되지 않았다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 감염에 이어 48 시간째에, 상기 진균 포자는 뇌에서 증식하기 시작했으므로, 리조푸스 오리자에는 FTR 폴리펩타이드를 발현하기 시작하여 상기 숙주로부터 철을 청소하였다. 예상된 바와 같이, 비 감염 마우스로부터의 뇌는 FTR 폴리펩타이드의 어떠한 발현도 나타내지 않았다.
이들 결과는 FTR 폴리펩타이드가 감염 중에 발현되고 모균증의 병인에 연루됨을 명백히 입증한다.
활동 감염 중 생체 내 FTR의 발현을 입증하기 위해서, 우리는 FTR 발현에 대한 정보제공인자 시스템으로서 GFP를 사용하였다. 리조푸스 오리자에를 FTR 프로모터를 함유하는 2 kb 단편의 하류에 클로닝된 GFP를 함유하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 상기 균주는 철-고갈된 시험관 내 환경에서 증식될 때 녹색 형광을 발하였으나, 철-풍부 환경에서는 아니었다(데이터 도시 안 됨). DKA 마우스를, 철-풍부 조건 하에서 증식시킨 상기 리조푸스 오리자에 균주의 1 x 105 포자로 감염시켰다. 감염 후 48 시간째에 마우스를 죽이고, 뇌를 수거하고, 10% 아연 포르말린에 고정시켰다. 상기 뇌의 파라핀 절편을 항-GFP 다클론 토끼 Ab로 염색하고 항-토끼 FITC 접합 Ab로 대조 염색하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, FTRp의 조절 하에서 GFP를 발현하는 리조푸스 오리자에로 감염시킨 마우스의 뇌 중의 진균 요소는 녹색 형광을 발하였으며, 따라서 이는 FTR 폴리펩타이드가 활동 감염 중에 발현되고 이는 모균증의 병인에 연루된다는 우리의 초기 발견을 입증한다.
실시예 8
FTR 폴리펩타이드 및 공지된 단백질에 대한 그의 상동성
본 실시예는 리조푸스 오리자에 FTR 폴리펩타이드가 임의의 공지된 인간 단백질과 상동성이 거의 또는 전혀 없음을 보인다.
자가면역 반응의 유도에 대한 가능성을 최소화하기 위해서, 인간 백신으로서 사용되고 있는 단백질 백신은 다수의 인간 단백질들과 현저한 상동성을 갖지 않는 것이 바람직하다. 상기 FTR 폴리펩타이드와 인간 단백질 간의 상동성에 대한 가능성을 조사하기 위해서, PubMed BLAST 조사를 수행하여 상기 FTR 폴리펩타이드의 아미노산 16-368(즉 목적하는 FTR 폴리펩타이드 백신 중의 아미노산)을 인간 프로테옴에 대해 비교하였다. 상기 조사는 매우 제한된 상동성을 갖는 5 개의 개방 판독 프레임을 확인하였으며, 이때 상기 5 개 단백질 모두에 대해 30.4의 정렬 점수, e=9.0을 갖는다. 이들 단백질 중 3 개는 이중 나선 도메인 함유 82(즉, EAW66982; AAH33726.1; 및 NP_079001.2)이고, 하나는 CCDC82 단백질(즉 AAH18663.1)이고 이름이 없는 단백질(즉 BAB15683.1)이다. 기준으로서, 다른 유기체들과 비교된 진균으로부터의 독특한 서열의 확인을 위한 표준 BLAST 검색 e 값은 10-8로서 지정되었으며, 이는 리조푸스 오리자에 FTR이 인간 프로테옴에 대해 의미 있는 상동성이 없음을 가리킨다.
실시예 9
혈행 파종 또는 모균증의 DKA 마우스 모델에서 리조푸스 오리자에 의 독성에 있어서 FTR 유전자 산물의 역할
본 실시예는 FTR 유전자 산물(예를 들어 mRNA 또는 폴리펩타이드)이 DKA 마우스 모델 모균증에서 리조푸스 오리자에의 완전 독성에 필요함을 보인다.
우리는 리조푸스 오리자에에서 FTR의 발현을 억제하는 RNA 간섭(RNAi) 기술을 사용하였다. REGLE 동기(흡수 중에 철과 상호작용하는 것으로 여겨짐)를 함유하는 FTR ORF의 400 bp 단편을 인트론 구획의 상류에서 플라스미드 pRNAi-pdc에 클로닝하였다. 상기 동일 단편의 역 상보 서열을 상기 인트론의 하류에 클로닝하였다. 상기 생성된 플라스미드를 바이오리스틱(biolistic)(등록상표) 전달 시스템(BioRad)(등록상표)을 사용하여 리조푸스 오리자에 pyrf 돌연변이체 내로 형질전환시키고 형질전환체를 유라실이 없는 최소 배지 상에서 선택하였다. 서던 블럿 분석은 모든 획득된 형질전환체들이 상기 형질전환된 플라스미드를 에피솜형으로 유지시킴을 보였다(데이터 도시 안 됨). RT-PCR을 사용하여 FTR의 발현을 대조용 균주(빈 플라스미드로 형질전환되었다)와, 5 개의 선택된 형질전환체에 의해 비교하였다. FTR 발현은 대조용 균주에 비해 시험된 5 개의 형질전환체 중 4 개에서 거의 완전히 억제되었으며 하나의 형질전환체에서 감소되었다(도 13). 18s rDNA의 발현은 어떠한 형질전환체에서도 변경되지 않았으며 이는 FTR의 발현 억제에 있어서 RNAi의 특이성을 가리킨다.
상기 RNAi 형질전환체들 중 하나의 독성을 혈행 파종 모균증의 DKA 마우스 모델 중의 대조용 균주에 대해 비교하였다. 마우스를 형질전환된 대조용 균주 또는 상기 RNAi 플라스미드를 갖는 형질전환체(FTR-i 균주)로 감염시켰다. 대조용 균주에 비해 상기 RNAi-형질전환체의 독성이 지연되고 감소되었다. 흥미롭게도, 우리는 상기 FTR-i 균주로 감염된 죽어가는 마우스의 뇌 및 신장으로부터 회수한 리조푸스 오리자에가 상기 RNAi 플라스미드를 상실하는데, 이는 리조푸스 오리자에가 유라실 없이 최소 배지 상에서는 생육하지 못하지만 풍부 배지(감자 덱스트로즈 아가) 상에서는 생육하기 때문임을 발견하였다. 대조적으로, 25일간 상기 감염에 생존한 2 마리 마우스(질병의 징후 없음)로부터 회수한 리조푸스 오리자에는 유라실이 없는 최소 배지 및 풍부 배지 모두 상에서 생육할 수 있으며, 이는 상기 RNAi 플라스미드가 여전히 상기 포자 중에 존재하고 감염 중 FTR 발현의 억제가 리조푸스 오리자에의 독성을 억제함을 가리킨다(도 14).
이들 데이터는 상기 FTR이 DKA 마우스 모델에서 리조푸스 오리자에에 대한 중요한 독성 인자이고, 모균증 감염의 예방을 위해 FTR 백신의 개발을 지원하는 추가의 합리적인 이유를 제공함을 입증한다.
실시예 10
rFtr1p 는 세포외에 노출되며 공지된 인간 단백질에 대해 제한된 상동성을 가지나 다른 뮤코랄레스들 중에서는 보존된다
상동성 모델링은 rFtr1p가 다른 미생물들에서 발견되는 이온-결합 또는 운반 단백질의 특징인 다중 나선 다발 구조를 가짐을 예견한다. 대부분의 확고한 모델에서, 상기 REGLE 철-결합 동기의 중요한 Glu154 및 Glu157 잔기는 상기 단백질의 세포외 작은 면 상에서 노출되며, 이는 상기 잔기를 항체에 의한 잠재적인 결합 및 억제에 접근할 수 있게 한다(도 19).
자가면역 반응의 유도에 대한 가능성을 최소화하기 위해서, 인간 백신으로서 사용되고 있는 단백질 백신은 다수의 인간 단백질들과 현저한 상동성을 갖지 않는 것이 바람직하다. 상기 rFtr1p와 인간 단백질 간의 상동성에 대한 가능성을 조사하기 위해서, PubMed BLAST 조사를 수행하여 상기 rFtr1p의 아미노산 16-368(즉 목적하는 rFtr1p 백신 중의 아미노산)을 인간 프로테옴과 비교하였다. 상기 조사는 매우 제한된 상동성을 갖는 5 개의 개방 판독 프레임을 확인하였으며, 이때 상기 5 개 단백질 모두에 대해 30.4의 정렬 점수, e=9.0을 갖는다. 이들 단백질 중 3 개는 이중 나선 도메인 함유 82(즉, EAW66982; AAH33726.1; 및 NP_079001.2)이고, 하나는 CCDC82 단백질(즉 AAH18663.1)이고 이름이 없는 단백질(즉 BAB15683.1)이다. 기준으로서, 다른 유기체들과 비교된 진균으로부터의 독특한 서열의 확인을 위한 표준 BLAST 검색 e 값은 10-8로서 지정되었으며, (Jones et al., Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:7329-34(2004)) 이는 rFtr1p가 인간 프로테옴에 대해 의미 있는 상동성이 없음을 가리킨다. 비교에 의해, 인간에서 B형 간염 바이러스에 대해 대단히 안전한 백신으로서 사용되는 B형 간염 표면 항원의 PubMed BLAST 조사는 18 개의 적중을 밝혔으며, 이중 하나는 유의수준이었고(점수 75.9, e = 3 x 10-14), 나머지는 27 내지 29의 범위와 5 내지 10의 e 값을 가졌다. 따라서, 상기 제안된 rFtr1p 백신은 널리 사용되는 HBSAg 백신처럼 인간 프로테옴에 필적하거나 또는 덜 상동성이다.
대조적으로, 최근의 간행물은 rFTR1이 알 미크로스포루스, 알 니베우스, 알 스톨로니퍼, 리조뮤코르 미헤이, 리조뮤코르 푸실루스, 뮤코르 씨르시넬로이데스, 엠 라세모수스, 엠 룩시이, 및 엠 플룸베우스를 포함한 다른 병원성 뮤코랄레스들 중에서 고도로 보존되며, 이때 뉴클레오타이드 상동성은 >70%임을 입증하였다. 흥미롭게도, 상기 추정 REGLE 철-결합 작용 동기는 모든 뮤코랄레스들 중에서 100% 보존된다(Nyilasi et al., Clin Microbiol Infect.(2008)). 이는 상기 제안된 백신이 다른 모균증 인자들에 대해 교차-면역원성일 것임을 가리킨다. 더욱이, 속-간(cross-genera) 보호가 일어날 것으로 예상되는데, 그 이유는 리조푸스 오리자에 rFtr1p가, 심지어 곰팡이 이외의 아스퍼질러스 종, 칸디다 알비칸스 및 크립토코커스 네오포르만스를 포함한 매우 다양한 진균 배열들로부터의 높은 철 투과효소와 고도의 일치성을 갖기 때문이다. 이들 진균 모두에서, 핵심 REGLE 철-결합 작용 동기는 100% 보존된다.
실시예 11
rFtr1p 로 백신접종 된 마우스로부터 수집한 혈청에 의한 수동 면역화는 리조푸스 오리자에 감염으로부터 마우스를 보호한다
단백질 생산을 최대화하기 위해서 상기 단백질의 국소화를 세포막으로 향하게 하는 신호 펩타이드 및 6 개 막통과 도메인을 제거함으로써 보다 친수성 단백질을 암호화하는 유전자를 합성하였다(Genscript). 상기 합성 유전자는 제거된 서열 요소를 갖지만, 나머지 서열 중 어느 것도 변경되지 않았으며, 따라서 상기 단백질의 노출된, 친수성 영역 중의 잠재적인 에피토프 변경이 회피되었다. 상기 합성 유전자는 또한 6X-His-표지를 포함하여 상기 발현된 단백질을 친화성 정제하였다. 상기 유전자는 pQE32 발현 벡터 내로 클로닝되고 이 콜라이 내로 형질전환되었다. 대수기 세균 세포를 IPTG에 의해 유도하고 상기 세포를 수확하고 재조합 단백질을 제조자의 설명(Qiagen)에 따라 Ni-아가로스 친화성 컬럼 상에서 정제하여 배양물 리터당 약 1 내지 1.3 ㎎의 정제된 단백질을 제조하였다(도 20). 상기 생성된 단백질을 사용하여 하기 개시하는 바와 같은 쥐 항체를 발생시켰다.
수동 면역화를 위한 면역 혈청을 생성시키기 위해서, Balb/c 마우스를 0일째에 완전 프로인트 항원보강제(CFA)와 혼합된 rFtr1p(20 ㎍)의 SQ 주사에 의해 면역하고, 21일째에 불완전 프로인트 항원보강제(IFA)와 함께 또 다른 용량의 항원으로 추가 접종하고, 2 주 후에 혈청 수집을 위해 채혈하였다. 백신접종된 마우스로부터 수집한 혼주 혈청은 rFtr1p에 대해 >1:800,000의 Ab 역가를 나타낸 반면, 빈 플라스미드로 백신접종한 마우스로부터 수집한 혼주 혈청은 1:200의 Ab 역가를 가졌다. 면역 또는 대조용 혈청(0.25 ㎖)을, 리조푸스 오리자에에 의한 비 내 감염 2 시간 전에 DKA 수용 마우스에게 ip 투여하였다. 혈청 투여를 감염 후 3일째에 반복하였다. 면역 혈청으로 처리된 감염 마우스는 대조용 혈청으로 처리된 마우스에 비해 생존이 개선되었다(도 21). 이들 연구는 모균증 중 생존을 개선하기 위해 rFtr1p를 표적화하는 수동 면역화의 사용 가능성을 명백히 입증한다.
실시예 12
FTR1 은 DKA 마우스에서 감염 중 리조푸스 오리자에 에 의해 발현된다
모균증의 병인에 한 역할을 하는 FTR1에 대해서, 상기 FTR1은 감염 중에 발현되어야 한다. 정량적인 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여, 2 내지 3일 이내에 100% 사망률을 야기하는 접종물인 리조푸스 오리자에의 105 포자로 정맥 내 감염된 DKA 마우스의 뇌에서 FTR1의 발현을 조사하였다(Ibrahim et al., Antimicrob Agents Chemother 49:721-727(2005)). 상기 뇌는 상기 모델에서 주요 표적 기관이므로 분석을 위해 선택되었다(Ibrahim et al., Antimicrob Agents Chemother 49:721-727(2005)). 감염 후 24 시간째에 죽인 마우스(n=5)로부터의 FTR1의 발현이 구성적인 ACT1 유전자에 비해 4배까지 증가하였다[중간(25th 사분위수, 75th 사분위수)]=4.12(1.03, 0.27), 윌콕슨 순위 합계에 의해 p = 0.03). 예상된 바와 같이, 비 감염 마우스로부터의 뇌는 FTR1의 어떠한 발현도 보이지 않았다.
상기 비-모수 로그-순위 시험을 사용하여 생존 배수의 차이를 측정하였으며, 반면에 신장 진균 부담, 철 흡수, 증식률 및 생체 내 FTR1 발현의 차이를 상기 비-모수 윌콕슨 순위 합계 시험에 의해 비교하였다.
감염 중 생체 내 FTR1의 발현을 직접 가시화하기 위해서, 리조푸스 오리자에를 FTR1 프로모터의 조절 하에 GFP를 함유하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 본 연구에 사용된 리조푸스 오리자에 균주들을 표 1에 나열한다. 간단히, 미생물들을 37 ℃에서 4일 동안 감자 덱스트로스 아가(PDA) 또는 YPD 플레이트[1% 효모 추출물(Difco Laboratories), 2% 박토-펩톤(Difco), 및 2% D-글루코스] 상에서 증식시켰다. 리조푸스 오리자에 M16(자신의 유라실을 합성할 수 없는 pyfF 삭제 돌연변이체)의 경우, PDA에 100 ㎍/㎖ 유라실을 보충하였다. 815 bp 부분 pyrF PCR 단편(pyfF P11/P13)을 사용하여 리조푸스 오리자에 M16을 양성자 이동으로 복원시켰다. 상기 단편은 M16 중에 존재하는 pyrF 돌연변이(즉 nt+205에서 G에서 A로의 점 돌연변이)와 겹치며(Skory and Ibrahim, Curr Genet 52:23-33(2007)) 유전자 치환을 통해 작용성을 복원할 수 있다. 일부 실험에서, 리조푸스 오리자에를 1 mM의 아스코르브산 및 페로진의 존재 하에 유라실이 없는 완전 보충 배지(CSM-URA)(Q-Biogene)가 보충된 효모 질소 염기(YNB)(Difco/Becton Dickinson, Sparks, MD)(YNB+CSM-URA)[제형/1000 ㎖, 1.7 g의 아미노산 없는 YNB, 20 g의 글루코스, 0.77 g의 CSM-URA] 상에서 증식시켜 철을 결핍시켰다. 상기 주머니 홀씨를 0.01% 트윈 80을 함유하는 내독소 비 함유 PBS 중에 수집하고, PBS로 세척하고, 혈구계산기로 카운트하여 최종 접종물을 제조하였다.
본 연구에 사용된 균주들
균주 유전자형 설명 및 출처
리조푸스 오리자에 99-880 야생형 임상 단리물(Ibrahim et al., J Clin Invest 117:2649-2657(2007))
리조푸스 오리자에 M16 pyrF205 유라실 결핍(Skory and Ibrahim, Curr Genet 52:23-33(2007))
PyrF 보충된리조푸스 오리자에 pyrF205::PyrF 원 유전자좌에서 PyrF의 야생형 사본이 보충된 M16, 본 연구
리조푸스 오리자에 GFP1 M16(pPFtr1-GFP) FTR1 프로모터 구동된 GFP를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 M16(Ibrahim et al., J Clin Invest 117:2649-2657(2007))
리조푸스 오리자에 FTR1Ko pyrF205, ftr1::PyrF ftr1 녹 아웃, 본 연구
리조푸스 오리자에 FTR1Inh M16(pFTRi-pdc 인트론) RNAi에 의해 억제된 FTR1, 본 연구
빈 리조푸스 오리자에 M16(pRNAi-pdc 인트론) 빈 플라스미드로 형질전환된 M16, 본 연구
상기 균주는 철-고갈된 시험관 내 배지에서 생육 될 때 녹색 형광을 발하였지만 철-풍부 배지에서는 발하지 못했고, 반면에 구성적인 액틴 프로모터의 조절 하에 GFP로 형질전환된 리조푸스 오리자에(양성 대조군)는 상기 배지에서 철 농도와 관계없이 형광을 발하였다(도 22a). KDA 마우스를 감염 전에 GFP 발현을 억제하기 위해서 GFP 정보제공인자 균주 또는 철-풍부 조건 하에서 생육된 PyrF-보충된 리조푸스 오리자에로 감염시켰다. 24 시간째 또는 감염 후 48시간째에 뇌를 수거하고 조직병리학을 위해 처리하였다. 상기 파라핀 매몰 과정이 상기 GFP 단백질의 고유 형광을 파기하므로, 상기 절편들을 형광성 항-GFP 항체로 염색하였다. 감염 후 24시간째에 취한 샘플들은 어떠한 진균 요소도 보이지 않았으며, 이는 감염 후 48 시간이 감염된 조직에서 진균 요소를 조직병리학적으로 검출할 수 있는 가장 이른 시점이므로 예상되었다(Ibrahim et al., Antimicrob Agents Chemother 49:721-727(2005)). 뇌에서 감염 48시간째에, 리조푸스 오리자에의 FTR1 정보제공인자 균주는 GFP를 발현한 반면, 음성 대조군, PyrF-보충된 리조푸스 오리자에는 발현하지 못했다(도 22b). 또한, GFP 발현은, 마우스 감염에 사용된 포자가 철-풍부 배지(FTR1 발현을 억제하는 조건)에서 생육되었고 마우스 감염에 사용된 경우에는 녹색 형광을 발하지 않았으므로(도 22b, 형광이 덮인 DIC) 상기 숙주 환경에서 낮은 철 수준에 의해 유도되었다.
실시예 13
동종핵형 ftr1 삭제의 단리는 FTR1 좌에 파괴 카세트의 통합에도불구하고 다핵 리조푸스 오리자에 에서 성취될 수 없었다
활동 감염 중 FTR1의 발현은 리조푸스 오리자에의 병원성에서 FTR1의 역할을 암시하였다. 시험관 내에서 리조푸스 오리자에의 철 흡수 능력 및 생체 내 원인 질병에 대한 FTR1 유전자 파괴의 영향을 연구하였다. 2 개의 별도의 형질전환으로부터 획득한 단리물을 1 라운드의 포자형성 및 단일 콜로니 단리로 정제하였다. 단일 콜로니 단리를 성취하기 위해서, 형질전환체를, FTR1이 ≥350 μM의 FeCl3 농도에서 불충분하게 발현되므로(Fu et al., FEMS Microbiol Lett 235:169-176(2004)), 상기 ftr1 삭제 대립유전자의 격리를 촉진하기 위해 1 mM FeCl3(철 풍부)를 보충한 화학적으로 한정된 배지(YNB+CSM-URA) 상에서 증식시켰다. 단리물을 PCR 프라이머 쌍 FTR1-P3/PyrF-P9(예상치 1054 pb) 및 PyrF-P18/FTR1-P4(예상치 1140 bp)로 파괴 카세트의 통합에 대해 선별하였다. FTR1 유전자 좌의 파괴를 프라이머 FTR1-P5/FTR1-P6(예상치 503)(FTR1의 ORF로부터의 분절을 증폭하였다)을 사용하여 PCR 증폭 산물의 부재에 의해 시험하였다(표 2 및 도 23a). PCR은 상기 FTR1 유전자 좌 중의 파괴 카세트의 통합, 및 다수의 추정 삭제 돌연변이 균주로부터의 FTR1 ORF의 부재를 확인하였다(도 23b). 더욱 또한, 상기 증폭 산물들을 또한 서열화하여 상기 파괴 카세트가 동종 재조합에 의해 FTR1 유전자 좌 내로 통합되었음을 입증하였다(데이터 도시 안 됨). 최종적으로, 상기 FTR1 유전자 좌 중의 상기 파괴 카세트의 통합을 서던 블럿팅에 의해 확인하였다(하기 참조).
FTR1의 발현을 연구하기 위해서, 우리는 FTR1 프로모터 발현에 대한 정보제공 시스템으로서 GFP를 사용하였다. 리조푸스 오리자에 M16을 앞서 개시한 바와 같이(Ibrahim et al., J Clin Invest 117:2649-2657(2007)) FTR1 프로모터(리조푸스 오리자에 GFP1)에 의해 구동되는 정보제공인자 유전자 GFP를 함유하는 플라스미드로 형질전환시켰다. GFP를 또한 구성적으로 발현된 액틴 프로모터(Act1p) 하에서 클로닝시키고 이어서 리조푸스 오리자에 M16내로 형질전환시켜 양성 대조군으로서 사용하였다. 생체 내 FTR1의 발현을 연구하기 전에, 우리는 FACS 분석을 사용하여 시험관 내 FTR1의 발현을 조사하였다. 간단히, Ftr1p 또는 Act1p에 의해 구동되는 어느 한 GFP로 형질전환된 리조푸스 오리자에를 37 ℃에서 12 시간 동안 1 mM의 아스코르브산 및 페로진의 존재(철-고갈된 조건) 또는 부재(철-충분 조건) 하에서 YNB+CSM-URA에서 증식시켰다. 이들 조건은 균사보다는 오히려 리조푸스 오리자에의 발아체를 생성시켰다. 발아체 1 ㎖의 형광을 488 ㎚에서 방출되는 아르곤 레이저가 구비된 FACSCaliber(Becton Dickinson) 장비를 사용하여 측정하였다. 형광 방출을 515/40 주파수폭 필터로 판독하였다. 형광 데이터를 대수 증폭기로 수집하였다. 104 개 사건의 평균 형광 강도를 CELLQUEST 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
생체 내 감염을 위해서, BALB/c 수컷 마우스(>20 g)를 진균 시험감염 10일 전에 0.2 ㎖ 시트레이트 완충액 중의 190 ㎎/㎏ 스트렙토조토신을 1회 ip 주사하여 당뇨성으로 만들었다(Ibrahim et al. Antimicrob Agents Chemother 47:3343-3344(2003)). 당뇨 및 케톤뇨증이 스트렙토조토신 처리 후 7일째에 모든 마우스에서 확인되었다. 당뇨병성 케톤산증 마우스를 5 x 103 포자의 표적 접종물을 갖는 꼬리 정맥 주사에 의해 진균 포자로 감염시켰다. 상기 접종물을 확인하기 위해서, 희석물을 0.1% 트리톤을 함유하는 PDA 플레이트상에 스트리킹하고 37 ℃에서 24 시간 배양 기간에 이어서 콜로니를 카운트하였다. 비 내 주사를 위해서, PBS 중의 0.01% 트윈 80의 20 ㎕ 중의 107 포자를 케타민(100 ㎎/㎏) 진정시킨 마우스의 콧구멍에 넣었다(Waldorf et al, Journal of Clinical Investigation 74:150-160(1984)). 상기 접종물을 확인하기 위해서, 마우스를 리조푸스 오리자에 포자 흡입 후 즉시 죽이고, 폐를 균질화하여 0.1% 트리톤을 함유하는 PDA 상에 도말하고 37 ℃에서 배양 후 콜로니를 카운트하였다. 상기 두 모델 모두, 1차 효능 종점은 사망시간이었다. 일부 실험에서, 2차 종점으로서, 뇌 및 신장 진균 부담(1차 표적 기관)(Ibrahim et al., Antimicrob Agents Chemother 49:721-727(2005))을 1 ㎖ 염수를 함유하는 휠-팩(Whirl-Pak) 주머니(Nasco, Fort Atkinson, WI)에 놓인 기관 상에 피펫을 굴려 균질화시켜 측정하였다. 상기 균질물을 0.85% 염수 중에서 연속 희석하고 이어서 0.1% 트리톤을 함유하는 PDA 플레이트 상에서 정량적으로 배양하였다. 값들을 log10 cfu g-1 조직으로서 나타내었다. GFP 발현을 검출하기 위해서, 항-GFP 토끼 다클론 항체(Novus)를 사용하여 상기 조직병리학적 샘플을 염색하고 이어서 FITC 접합된 항-토끼 항체로 대조 염색하였다.
감염된 조직 중의 FTR1의 발현을 정량화하기 위해서, 꼬리 정맥 주사를 통해 리조푸스 오리자에 야생형(99-880)으로 감염시킨 BALB/C 마우스의 뇌를 감염 후 24 또는 48 시간째에 수거하고 분쇄 및 페놀에 의한 RNA 추출 전에 액체 질소에서 바로 플래시 동결시켰다. 비 감염 DKA 마우스로부터 수거한 뇌를 나란히 처리하고 음성 대조군으로서 사용하였다. 이어서 동결된 뇌를 액체 질소 하에서 분쇄하고 이어서 전체 RNA를 고온 페놀 방법(Gravelat et al. Infect Immun 76:3632-3639(2008))을 사용하여 단리하였다. 오염 게놈 DNA를 실온에서 30 분간 1 ㎕의 터보-DNase(Ambion)로 처리하여 RNA 샘플로부터 제거하였다. 이어서 DNase를 RNA 클린-업 키트(Zymo Research)를 사용하여 제거하였다. 제 1 가닥 cDNA 합성을 레트로스크립트(Retroscript) 제 1 가닥 합성 키트(Ambion)를 사용하여 수행하였다. FTR1 특이적인 프라이머(표 2에 나열됨)를 온라인 프라이머 디자인 소프트웨어(Genscript)의 지원으로 디자인하였다. 상기 증폭 효율을 일련의 희석 실험에 의해 측정하고, 생성되는 효율 계수를 생성물들의 정량화에 사용하였다(Pfaffl et al., Nucleic Acids Res 29:e45(2001)).
유전자 발현을 콴티텍트 사이버 그린(QuantiTect Sybr Green) PCR 키트(Qiagen)를 사용하여 ABI 프리즘 7000 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)에 의해 분석하였다. PCR 조건은 90 ℃에서 10 분 및 40 주기의 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 1 분이었다. 단일 PCR 산물을 상기 PCR 주기의 끝에서 열 해리 프로토콜에 의해 확인하였다. 감염된 뇌 중의 FTR1 발현의 양을 18S rRNA 또는 ACT1에 표준화하고(표 2) 2(-ΔΔC(T)) 방법(Livak and Schmittgen, (2001) Methods 25:402-408(2001))을 사용하여 정량화하였다. 모든 반응을 중복 수행하였으며, 상기 혼합물은 역 전사 효소가 생략된 음성 비-가역 전사(RT) 조절을 포함하였다.
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Figure pct00002
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상기 FTR1을 파괴하기 위해서, 우리는 각각 FTR1-5' UTR 및 FTR1-3' UTR의 606 및 710 pb 단편과 측면 인접한 리조푸스 오리자에 야생형으로부터 증폭된 작용성 PyrF 사본(998 pb)을 포함하는 유전자 파괴 카세트를 제작하였다(도 23a). 상기 유전자 파괴 구조물을 동종 FTR1 UTR 서열과 측면 인접한 pyrF만을 함유하는 2.3 kb 파괴 단편을 수득하기 위해서 프라이머 FTR1 P1/P2(표 2)를 사용하여 PCR 증폭시켰다(도 23a). 이어서 상기 증폭물을 사용하여 바이오리스틱 충격으로 리조푸스 오리자에 M16(pyrF 돌연변이체)을 형질전환시켰다(Skory, Mol Genet Genomics 268:397-406(2002)). 상기 파괴 카세트는 -16에서부터 정지 코돈까지 전체 FTR1 암호화 영역을 상기 pyrF 유전자 단편으로 교체한다. 2 개의 별도의 형질전환으로부터 획득한 단리물을, FTR1 발현이 상기 철 농도에서 억제되므로(Fu et al., FEMS Microbiol Lett 235:169-176(2004)), 상기 FTR1 삭제 대립유전자의 격리를 촉진하기 위해 1 mM FeCl3(철 풍부)를 보충한 화학적으로 한정된 배지(YNB+CSM-URA) 상에서 1 라운드의 포자형성 및 단일 콜로니 단리로 정제하였다. 단리물을 PCR 프라이머 쌍 FTR1-P3/PyrF-P9(예상치 1054 pb) 및 PyrF-P18/FTR1-P4(예상치 1140 bp)로 파괴 카세트의 통합에 대해 시험하였다. FTR1의 파괴를, FTR1의 OFR를 증폭시키는 프라이머 FTR1-P5/FTR1-P6(예상치 503)을 사용하여 PCR 증폭 산물의 부재에 의해서 및 서던 블럿 분석에 의해 확인하였다. 상기 FTR1 삭제 대립유전자를 함유하는 동종핵형 단리물을 수득하고자, 상기 FTR1 유전자 좌 중에 확인된 통합을 갖는 형질전환체를 1 mM FeCl3이 보충된 YNB+CSM-URA 상에서 14 라운드의 포자형성 및 단일 콜리니 단리에 의해 추가로 취하였다.
우리는 앞서 FTR1이 철-고갈된 조건(0 내지 50 μM 농도의 FeCl3)에서 새험관 내 발현되고 철 충분 배지(≥350 μM의 FeCl3 농도)에서 억제됨을 발견하였다(Fu et al., FEMS Microbiol Lett 235:169-176(2004)). FTR1 파괴가 상이한 철 공급원 및 농도를 갖는 배지에서 증식하는 리조푸스 오리자에의 능력에 영향을 미치는지를 조사하기 위해서, 우리는 여러 개의 추정 삭제 돌연변이체 균주의 증식을 야생형 또는 PyrF-보충된 리조푸스 오리자에의 증식과 비교하였다. 증식을, 앞서 철에 대해 킬레이트화되었고 이어서 한정된 농도의 유리 철(즉, FeCl3 또는 FeSO4) 또는 데페록사민[페리옥사민] 또는 헴에 착화된 철이 보충된 배지(CSM-URA) 상에서 비교하였다. 야생형 또는 PyrF-보충된 리조푸스 오리자에에 비해, 추정 ftr1 삭제 돌연변이체 균주는 철-고갈된 배지(즉 10 μM에서 유리 철)에서 48 시간째에 현저하게 덜 증식하였다(도 23c). 헴과 100 μM에서 착화된 페리옥사민 또는 철(철이 착화되므로 비교적 고갈됨)은 상기 추정 ftr1 삭제 돌연변이체보다 상기 야생형 및 PyrF-보충된 균주의 증식을 지원하였다. 그러나, 1000 μM의 유리 철(철-풍부 배지)은 모든 균주들의 증식을 동등하게 지원하였으며(도 23c) 이는 ftr1이 철-고갈된 환경에서 주로 발현된다는 우리의 선행 발견과 일치한다.
상기 추정 ftr1 파괴 돌연변이체의 증식을 10 또는 1000 μM의 FeCl3 또는 FeSO4, 또는 100 μM의 철 공급원으로서 헴 또는 페록사민이 보충된 플레이트 YNB+CSM-URA 상에서의 증식에 의해 리조푸스 오리자에 야생형 또는 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주와 비교하였다. 또한, 추정 ftr1 삭제 또는 RNAi 돌연변이체를 YPD 또는 화학적으로 한정된 배지(즉 YNB+CSM-URA) 상에서 그들의 증식에 대해 그들의 상응하는 대조용 균주와 비교하였다. 간단히, 10 마이크로리터의 리조푸스 오리자에 포자의 105 포자를 상기 플레이트의 중심에 스폿팅하고 균사체 직경을, FeCl3, FeSO4 또는 페록사민을 함유하는 배지의 경우 48 시간 증식 후, 또는 헴 보충된 플레이트의 경우 72 시간 동안 측정하였다. 상기 실험을 상이한 날들에 3 회 반복하였으며 증식률을 시간단 진균의 균사체 직경의 증가로서 나타내었다.
흥미롭게, 상기 추정 ftr1 삭제 돌연변이체의 증식은 철-고갈된 배지 상에서 96 시간 후에 상기 야생형 및 PyrF-보충된 균주와 유사한 수준으로 증가하였다(데이터 도시 안 됨). 더욱 또한, 상기 96 시간 증식 후 배양물의 PCR 분석은 상기 FTR1 ORF가 상기 추정 ftr1 삭제 돌연변이 형질전환체 모두에서 다시 한번 검출가능함을 입증하였다(도 23d). 유사한 결과를 다수의 다른 추정 ftr1 삭제 돌연변이체에 대해 획득하였으며, 1 라운드의 포자형성 및 단일 콜로니 단리는 ftr1 동종핵형 삭제 대립유전자 균주를 정제하기에 충분하지 못하다는 결론을 내렸다.
리조푸스 오리자에는 다핵성인 것으로 공지되어 있으며, 핵의 수가 앞서 개시되지 않았지만, 주머니홀씨가 다핵성인 것으로 일반적으로 추정된다(Ma et al., PLoS Genet 5: e1000549(2009)). 유전자 파괴는 상기 균사체 및 주머니홀씨 모두 중의 이종핵형 핵의 존재에 의해 복잡해지는 것으로 나타났으며, DAPI 염색을 사용하여 팽창된 포자 중에 존재하는 핵의 수를 측정하였다. 간단히, 리조푸스 오리자에 포자 중에 존재하는 핵의 수를 측정하기 위해서, YPD 배지 중의 포자를 37 ℃에서 2 시간 동안 예비발아시켰다(pregerminated). 팽창된 포자를 저온 PBS로 1 회 세척하고 이어서 PBS 중에 5 x 105/㎖의 농도로 현탁하였다. 1 ㎕의 50 ㎍/㎖의 4'6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Sigma)을 가하고 상기 세포를 제조사의 설명에 따라 일렉트로포레이션하였다(BioRad). 상기 팽창된 포자를 100 ㎕ PBS 중에 재현탁하기 전에 저온 PBS를 사용하여 5 회 세척하였다. 10 ㎕ 샘플을 유리 슬라이드 상에 놓고 커버슬립으로 덮었다. 상기 염색된 세포를 형광 현미경을 사용하여 가시화하였다.
리조푸스 오리자에 균주 M16은 팽창된 포자당 10 개 초과의 핵을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 24a). 높은 수의 핵이 존재하는 경우, 철-풍부 배지(즉 1000 μM의 FeCl3을 함유하는 배지) 상에서 추정 ftr1 삭제 돌연변이체의 14 라운드의 포자형성 및 단일 콜로니 단리를 수행하여, FTR1을 유지하기 위해(FTR1이 철-풍부 조건에서 불충분하게 발현되므로) 선택된 압력을 경감시킴으로써 상기 삭제 대립유전자를 분리시켰다(Fu et al., FEMS Microbiol Lett 235:169-176(2004)). 14 라운드의 선택 후 상기 추정 삭제 돌연변이체의 PCR 분석은 FTR1 ORF의 증폭의 결여를 입증하였다(도 24b). 도 23c의 결과와 유사하게, 상기 삭제 돌연변이체는 야생형 또는 PyrF-보충된 균주에 비해 처음 48 시간 동안 철 제한된 공급원 상에서 불완전하게 증식하였다. 그러나, 철-고갈된 환경(100 μM 페리옥사민)에서 동일한 추정 삭제 돌연변이체의 증식 후에, 상기 FTR1 ORF를 PCR에 의해 다시 한번 증식시켰다. 상기 결과는 서던 블럿 분석에 의해 입증되었다(도 24c). 상기 서던 블럿은 철-풍부 배지 상에서 증식된 추정 ftr1 삭제 돌연변이체의 gDNA로부터 FTR1 밴드(1960 bp)의 거의 완전한 제거, 그러나 철-고갈된 배지 상에서 동일한 균주의 증식 후에는 상기 FTR1 밴드의 복귀를 입증하였다(도 24c). 또한, 서던 하이브리드화 분석은 상기 추정 ftr1 삭제 돌연변이를 철-풍부 배지에서 증식시킨 경우에만 상기 ftr1 유전자 좌 내로의 파괴 카세트의 부위-특이적인 통합을 입증하였다. 최종적으로, 이탈된 통합 또는 염색체 외 복제의 증거가 없었으며, 이는 상기 ftr1 삭제 대립유전자의 상대 사본 수가 이종핵형 핵의 비에 의존한다는 사실과 일치한다.
철-풍부 또는 철-제한된 배지 상에서 증식된 추정 ftr1 삭제 돌연변이체 중의 FTR1의 사본 수를 PyrF-보충된 균주의 경우와 비교하기 위해서 qPCR을 사용하였다. 간단히, 게놈 DNA를 1mM FeCl3이 보충된 YNB+CSM-URA 중에서 증식된 PyrF-보충된 리조푸스 오리자에 또는 1mM FeCl3 또는 100 μM 페리옥사민이 보충된 YNB+CSM-URA 중에서 증식된 추정 ftr1 삭제 돌연변이체로부터 OmniPrep 용해 완충제(GBioscience)로 추출하였다. 각 샘플 중의 FTR1 사본 수를 ABI 프리즘 7000 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 qPCR에 의해 측정하고 증폭 산물을 파워 사이버 그린 셀스 투 CTTM 키트(Power Sybr Green Cells-to-CTTM kit)(Applied Biosystems)로 검출하였다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95 ℃에서 15초간 변성 및 60 ℃에서 1 분간 수행된 어닐링/연장과 함께 증폭 40 주기. 이어서 FTR1 사본 수를 리조푸스 오리자에 ACT1에 대해 표준화하고, 상대 사본 수를 식 2-ΔΔCT(여기에서 ΔCT = [Ct표적유전자 - CtACT1] 이고 ΔΔCT = [돌연변이체의 ΔCT - PyrF-보충된 균주의 ΔCT]이다)를 사용하여 평가하였다.
qPCR을 사용하여 철-풍부 배지 상에서 14 라운드의 포자형성 및 단일 콜로니 단리를 통과한 추정 ftr1 삭제 돌연변이체뿐만 아니라 철-고갈된 배지에서 증식 후 동일한 균주, 및 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주 중의 FTR1의 사본 수를 정량화하였다. 상기 철-풍부 배지에서 증식된 추정 ftr1 삭제 돌연변이 균주는 철-고갈된 배지에서 증식된 동일한 균주 또는 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주에 비해 FTR1(ACT1 유전자에 표준화됨)의 상대 사본 수가 60% 감소하였다(도 25a 및 25b). 따라서, 상기 다핵 리조푸스 오리자에 중의 작용성 FTR1의 상대 사본 수를 현저하게 감소시킬 수 있었지만, 상기 돌연변이체 대립유전자의 동종핵형 단리물은 획득되지 않았다.
실시예 14
FTR1 사본 수의 감소는 시험관 내 철 흡수를 약화시키고 생체 내 독성을 감소시킨다
본 발명에 나타낸 바와 같이, 리조푸스 오리자에 중의 작용성 FTR1의 상대 사본 수의 감소는 철 흡수의 감소에 충분하며 따라서 독성 감소에 충분하다. 상기 추정 ftr1 삭제 돌연변이체는 야생형 리조푸스 오리자에 또는 PyrF-보충된 균주에 비해 59Fe 흡수가 약 35% 감소하였다.
상기 추정 ftr1 삭제 돌연변이체의 감소된 시험관 내 철 흡수의 생체 내 관련성을 측정하기 위해서, 상기 돌연변이체의 독성을 DKA 마우스의 감염 중에 야생형 리조푸스 오리자에 또는 PyrF-보충된 균주와 비교하였다. 마우스를 YPD 또는 CSM-URA(각각 철 풍부 CSM-URA 또는 YPD 배지 상에서 추정 ftr1 삭제의 경우 0.185±0.005 또는 0.257±0.003 ㎝/h 대 PyrF-보충된 경우 0.188±0.008 또는 0.260±0.0051㎝/h)의 철-풍부 환경에서 시험관 내에서 유사한 증식을 나타낸 균주로 정맥 내(iv) 또는 비 내(in) 감염시켰다(도 26a). 상기 두 모델 모두에서, 추정 ftr1 삭제 돌연변이체는 야생형 또는 PyrF-보충된 균주에 비해 감소된 독성을 나타내었다(파종 감염 마우스에서 돌연변이체 대 대조용 균주의 경우 62% 대 100% 사망률, 및 비 내 모델에서 돌연변이체 대 대조용 균주의 경우 44% 대 75% 사망률)(도 26b 및 도 26C). 예상된 바와 같이 상기 추정 ftr1 삭제 돌연변이체 균주로 감염된 죽어가는 동물로부터 소생한 콜로니들은 상기 pyrF-보충된 균주에 비해 FTR1의 유사한 사본 수를 나타내었으며(데이터 도시 안 됨), 이는 시험관 내에서 철-고갈된 환경에서 증식 후 나타난 바와 같은 FTR1 사본 수의 복원을 가리킨다. 추가로, 상기 두 모델 모두에서 상기 pyrF-보충된 균주는 야생형 리조푸스 오리자에와 유사한 독성을 가졌으며, 이는 원래 유전자 좌에서의 상기 pyrF 유전자의 복원이 독성에 영향을 미치지 않음을 입증한다.
실시예 15
RNAi 에 의한 FTR1 유전자 발현의 억제는 철 흡수를 감소시키고 리조푸스 오리자에의 독성을 감소시킨다
유전자 파괴 후 나타난 표현형들을 확인하기 위해서, RNA 간섭(RNAi)을 사용하여 리조푸스 오리자에에서의 FTR1 발현을 감소시켰다.
RNA 간섭(RNAi) 기술을 사용하여 리조푸스 오리자에에서의 FTR1의 발현을 억제하였다. 흡수 중에 철과 상호작용하는 것으로 여겨지는 REGLE 동기를 함유하는 FTR1 ORF의 450 pb 단편(Stearman et al., Science 271:1552-1557(1996))을 PCR 증폭시키고 리조푸스 발현 벡터 pPdcA-Ex의 조절 하에서 반전된 반복물로서 클로닝하였다(Mertens et al., Archives of microbiology 186:41-50(2006)). 또한, 상기 리조푸스 pdcA 유전자(Skory, Curr Microbiol 47:59-64(2003))로부터의 인트론을 반복물 사이에 포함시켜 상기 목적하는 dsRNA 구조의 안정화를 위한 링커로서 사용하였다(Nakayashiki et al., Fungal Genet Biol 42:275-283(2005); Wesley et al. Plant J27:581-590(2001)). 상기 생성된 플라스미드를 바이오리스틱 전달 시스템(Biorad)을 사용하여 리조푸스 오리자에 pyrF 돌연변이체로 형질전환시키고 형질전환체를 유라실이 없는 최소 배지 상에서 선택하였다.
서던 블럿 분석(데이터 도시 안 됨)은 모든 RNAi 형질전환체가 상기 형질전환된 플라스미드를 염색체 외에서 유지함을 밝혔으며, 이는 우리가 형질전환 도중 상기 플라스미드를 선형화하지 못한다는 사실과 일치한다(Skory, Mol Genet Genomics 268:397-406(2002)). FTR1 발현을 5 개의 형질전환체 대 대조용 균주(즉 빈-플라스미드로 형질전환된 리조푸스 오리자에 pyrf 삭제 돌연변이체[M16])의 종점 RT-PCR에 의해 비교하였다. FTR1 발현은 4 개의 형질전환체에서 거의 완전히 차단된 반면, 대조용 균주에서는 쉽게 검출되었다(도 27a). 동일한 RT 주형에 의한 18s rDNA의 증폭은 출발 샘플의 완전성 및 PCR 억제의 결여를 입증하였다. RNAi에 의한 FTR1 발현의 억제는 특이적이었으며, 부위 밖 유전자 발현의 명백한 감소는 없었다. 전형적인 RNAi 형질전환체는 철 풍부 YPD 또는 CSM-URA 배지 상에서 증식될 때 대조용 균주와 유사한 증식을 나타내었다(각각 철 풍부 CSM-URA 또는 YPD 배지 상에서 형질전환체의 경우 0.193±0.082 또는 0.205±0.016 ㎝/h 대 대조용 균주의 경우 0.201±0.087 또는 0.211±0.011㎝/h)(도 27b).
FTR1 발현의 거의 완전한 억제 및 대조용 균주와 유사한 증식을 갖는 형질전환체의 철을 흡수하는 능력을 시험관 내에서 시험하였다. 흥미롭게, RNAi는 리조푸스 오리자에에 의한 59Fe 흡수를 유전자 파괴보다 더 유효하게 감소시켰으며, 시험된 모든 시점에서 철 흡수의 약 50%가 억제되었다(도 27c). 간단히, 시험관 내에서 철을 흡수하는 리조푸스 오리자에의 능력에 대한 FTR1 조작의 영향을 특성화하기 위해서, ftr1 추정 파괴 돌연변이체 또는 RNAi 돌연변이체를 우리의 공개된 방법(Fu et al., FEMS Microbiol Lett 235:169-176(2004))의 변형을 사용하여 세포 내 59FeCl3(Amersham Pharmacia Biotech)을 축적하는 능력에 있어서 야생형 또는 리조푸스 오리자에 PyrF-보충된 균주와 비교하였다. 포자들을 37 ℃에서 1 mM 페로진 및 1 mM 아스코르브산이 보충된 YPD 배지에서 3 시간 동안 진탕하면서 예비 발아시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 빙냉 분석 완충제 pH 6.1(최소 배지 + 10 mM 4-모폴린프로판설폰산 + 1 mM 페로진)로 2 회 세척하고, 이어서 임의의 페로진이 없는 분석 완충액에 재현탁하여 ㎖당 108 세포의 농도를 제공하였다. 59Fe의 흡수를 측정하기 위해서, 50 ㎕의 세포 현탁액을, 페로진은 없지만 0.1 M 59FeCl3이 보충된 냉각된 분석 완충액 450 ㎕에 가하고, 30 ℃에서 진탕 수욕에서 배양하였다. 선택된 시점들 후에, 상기 분석 샘플을 얼음 상에서 냉각시키고, 와동시키고, 와트만 GF/C 필터를 통해 진공 여과하고 10 ㎖ 빙냉 SSW(1 mM EDTA, 20 mM Na3-시트레이트 pH 4.2, 1 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2, 5 mM MgSO4, 1 mM NaCl)로 세척하였다. 필터를 제거하고 10 ㎖ 섬광 유체(Filter-count)를 함유하는 유리 섬광 바이알에 넣었다. 세포-결합된 59Fe를 팩카드 2200CA 액체 섬광 카운터(Packard Instrument Co., Downers Grove, Il)에서 카운트하였다. 세포 표면 흡착으로 인한 비 특이적 흡수를 여과 및 세척 전에 10 분간 얼음 상에서 유지되는 병행 분석들을 준비함으로써 측정하였다. 59Fe의 배경 수준을 흡수율의 계산 전에 감하였다. 상기 실험을 3 회 중복 수행하고 상이한 날들에 3 회 반복하였다. 데이터를 pmole/5 x 106 발아된 포자의 비 흡수(specific uptake)로서 나타낸다.
이어서, RNAi 형질전환체의 독성을 혈행 파종 또는 비 내 모균증의 DKA 마우스 모델에서 대조용 균주와 비교하였다. 상기 RNAi-형질전환체는 상기 두 모델에서 대조용 균주에 비해 감소된 독성을 나타내었다(파종 감염 마우스에서 RNAi 형질전환체 대 대조용 균주의 경우 75% 대 100% 사망률, 및 비 내 모델에서 RNAi 형질전환체 대 대조군의 경우 11% 대 67% 사망률, 로그 순위 검정에 의한 상기 두 비교의 경우 p<0.02). 흥미롭게, 상기 RNAi 형질전환체에 의한 감염으로 죽은 마우스의 신장으로부터 회수한 균주는 YPD 플레이트 상에서 리조푸스 오리자에 콜로니의 증식에 의해 입증된 바와 같이 RNAi 플라스미드를 상실하였고 YNB+CSM-URA는 아니었으며(데이터 도시 안 됨) 따라서 FTR1을 발현하는 능력을 다시 획득하였다. 대조적으로, 25일(상기 실험을 종료한 때) 동안 감염에 생존한 마우스의 신장으로부터 회수한 균주는 그의 RNAi 플라스미드를 상실하였다. 추가로, 상기 RNAi 형질전환체로 정맥 내 감염된 마우스는 대조용 균주로 감염된 마우스에 비해 신장 및 뇌 진균 부담이 각각 약 6 배 및 3 배 감소하였다(도 28c). 이들 데이터는 상기 FTR1 유전자 산물이 DKA 마우스에서 리조푸스 오리자에에 대해 중요한 독성 인자임을 입증한다.
실시예 16
Ftr1p 로 백신접종 된 마우스로부터 수거한 혈청에 의한 수동 면역화는 마우스를 리조푸스 오리자에 감염으로부터 보호한다
본 실시예는 FTR1을 표적화하는 수동 면역화가 모균증에 대해 보호할 것임을 입증한다.
수동 면역화를 위한 면역 혈청을 생성시키기 위해서, 마우스를 완전 프로인트 항원보강제(CFA)와 혼합된 Ftr1p의 SQ 주사에 의해 면역시킨 다음 제21일에 불완전 프로인트 항원보강제(IFA)와 함께 또 다른 용량의 항원을 갖는 추가 접종으로 면역시키고, 2 주 후에 혈청 수거를 위해 채혈하였다. 또 다른 세트의 마우스를, 빈 플라스미드로 형질전환시킨 이 콜라이로부터 수거한 상등액으로 백신접종하여 비-면역 대조용 혈청을 생성시켰다. 항체 역가를 우리가 앞서 개시한 바와 같이(Ibrahim et al., Infect Immun 73:999-1005(2005)) 합성 재조합 Ftr1p 5 ㎍으로 코팅한 ELISA 플레이트를 사용하여 측정하였다. 면역 또는 대조용 혈청(0.25 ㎖)을 당뇨병성 케톤산증 수용 마우스에게, 2.5 x 107 리조푸스 오리자에 99-880 포자로 비 내 감염 2 시간 전에 ip 투여하였다. 혈청 투여를 감염 후 3일째에 반복하고 마우스 생존을 감염 후 35일간 추적하였다. 백신접종된 마우스로부터 수거한 혼주 혈청은 >1:800,000의 항-Ftr1p IgG 역가를 갖는 반면, 빈 플라스미드 형질전환된 클론으로부터 정제된 상등액으로 백신접종된 음성 대조용 마우스로부터 수거한 혼주 혈청은 1:200의 항-Ftr1p IgG 역가를 가졌다. 리조푸스 오리자에로 후속적으로 비 내 감염된 DKA 마우스에의 면역 혈청의 투여는 대조용 혈청으로 처리된 마우스에 비해 생존이 현저하게 개선되었다(면역 혈청 대 비-면역 혈청의 경우 63% 대 0%, p<0.001)(도 28d).
본 출원 전체를 통해 다양한 공보들이 참고로 인용되었다. 이들 공보의 내용은 전체가 본 발명이 속하는 분야의 현 기술 수준을 더욱 상세하게 개시하기 위해서 본 출원에 참고로 인용된다.
본 발명을 상기 개시된 실시태양들을 참고로 개시하였지만, 당해 분야의 숙련가들은 상기 상세히 나타낸 특정 실시예 및 연구들이 단지 본 발명을 예시하기 위한 것임을 쉽게 이해할 것이다. 본 발명의 기술적 사상으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변경을 가해질 수 있다. 따라서, 본 발명은 단지 하기의 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> LOS ANGELES BIOMEDICAL RESEARCH INSTITUTE AT HARBOR-UCLA MEDICAL CENTER <120> VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF MUCORMYCOSIS AND OTHER FUNGAL DISEASES <130> 066742-0100 <140> PCT/US2010/000820 <141> 2010-03-19 <150> 61/161,614 <151> 2009-03-19 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> Rhizopus oryzae <400> 1 atgtctcaag atctcttcaa cgtaccgatc ttctttatcc tttttcgtga aacgactgag 60 gcagccatca ttatttctgt cctcttgtca ttcttgaaga gaatgtttaa tacagaatct 120 cctgtttata aacgtctcag aaatcaagtc tggattggtg gtgcagctgg tctgtttatc 180 tgtttatgta tcggtgctgc cttcattgcc gtttactaca ctgtccttaa tgacttgtgg 240 ggaaattctg aagatatctg ggaaggtgtc ttctctctgg ttgctgtgat catgatcact 300 gccatgggtc ttgctatgct caagactgaa cgtatgcaag aaaagtggaa ggtcaagttg 360 gctaaagcaa tgcaaaagtc caacagtgaa aagtcatcct ttaaagaaaa acttcaaaaa 420 tacgcgttct ttgtcttgcc ttttatcacc gttctcagag aaggacttga agctgttgtc 480 tttattggtg gtgtctcctt gggtatccaa ggaaaatcaa ttcctattgc 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255 Ser Lys Ser Val Trp His Val Asn Cys Arg Asn Pro Glu Thr Asp Asn 260 265 270 Gly Trp Asp Ile Phe Asn Ala Ile Leu Gly Trp Gln Asn Ser Ala Thr 275 280 285 Tyr Gly Ser Val Ile Ser Tyr Asn Ile Tyr Trp Leu Phe Ile Ile Cys 290 295 300 Val Leu Leu Leu Met Val Tyr Glu Glu Lys His Gly His Leu Pro Phe 305 310 315 320 Thr Lys Asn Leu Thr Leu Val Gln Leu Asn Pro Met Tyr His Ile Lys 325 330 335 Gly Lys Lys Lys Leu Glu Leu Asn Lys Ala Glu Lys Asp Glu Leu Phe 340 345 350 Thr Lys Leu Gln Gln Gln Asn Phe Gly Gln Ala Ala Glu Val Asp Glu 355 360 365 Thr Ser Ser Asn Lys Gln Met Asp Ser Gln Glu Asn Ser 370 375 380 <210> 39 <211> 404 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 39 Met Pro Asn Lys Val Phe Asn Val Ala Val Phe Phe Val Val Phe Arg 1 5 10 15 Glu Cys Leu Glu Ala Val Ile Val Ile Ser Val Leu Leu Ser Phe Leu 20 25 30 Lys Gln Ala Ile Gly Glu His Asp Arg Ala Leu Tyr Arg Lys Leu Arg 35 40 45 Ile Gln Val Trp Val Gly Val Leu Leu Gly Phe Ile Ile Cys Leu Ala 50 55 60 Ile Gly Ala Gly Phe Ile Gly Ala Tyr Tyr Ser Leu Gln Lys Asp Ile 65 70 75 80 Phe Gly Ser Ala Glu Asp Leu Trp Glu Gly Ile Phe Cys Met Ile Ala 85 90 95 Thr Ile Met Ile Ser Met Met Gly Ile Pro Met Leu Arg Met Asn Lys 100 105 110 Met Gln Ser Lys Trp Arg Val Lys Ile Ala Arg Ser Leu Val Glu Ile 115 120 125 Pro His Arg Lys Arg Asp Tyr Phe Lys Ile Gly Phe Leu Ser Arg Arg 130 135 140 Tyr Ala Met Phe Leu Leu Pro Phe Ile Thr Val Leu Arg Glu Gly Leu 145 150 155 160 Glu Ala Val Val Phe Val Ala Gly Ala Gly Ile Thr Thr Gln Gly Ser 165 170 175 His Ala Ser Ala Tyr Pro Leu Pro Val Val Val Gly Leu Ile Cys Gly 180 185 190 Gly Leu Val Gly Tyr Leu Leu Tyr Tyr Gly Ala Ser Lys Ser Ser Leu 195 200 205 Gln Ile Phe Leu Ile Leu Ser Thr Ser Ile Leu Tyr Leu Ile Ser Ala 210 215 220 Gly Leu Phe Ser Arg Gly Ala Trp Tyr Phe Glu Asn Tyr Arg Phe Asn 225 230 235 240 Leu Ala Ser Gly Gly Asp Ala Ser Glu Gly Gly Asp Gly Asn Gly Ser 245 250 255 Tyr Asn Ile Arg Lys Ala Val Tyr His Val Asn Cys Cys Asn Pro Glu 260 265 270 Leu Asp Asn Gly Trp Asp Ile Phe Asn Ala Leu Leu Gly Trp Gln Asn 275 280 285 Thr Gly Tyr Leu Ser Ser Met Leu Cys Tyr Asn Ile Tyr Trp Leu Val 290 295 300 Leu Ile Ile Val Leu Ser Leu Met Ile Phe Glu Glu Arg Arg Gly His 305 310 315 320 Leu Pro Phe Thr Lys Asn Leu Gln Leu Lys His Leu Asn Pro Gly Tyr 325 330 335 Trp Ile Lys Asn Lys Lys Lys Gln Glu Leu Thr Glu Glu Gln Lys Arg 340 345 350 Gln Leu Phe Ala Lys Met Glu Asn Ile Asn Phe Asn Glu Asp Gly Glu 355 360 365 Ile Asn Val Gln Glu Asn Tyr Glu Leu Pro Glu Gln Thr Thr Ser His 370 375 380 Ser Ser Ser Gln Asn Val Ala Thr Asp Lys Glu Val Leu His Val Lys 385 390 395 400 Ala Asp Ser Leu <210> 40 <211> 969 <212> DNA <213> Aspergillus fumigatus <400> 40 atgatcggag cgttctatgg atatggtaag gatcacttcg ctagcacgga ggacctgtgg 60 gagggcatct tctccctgat cgccagtgtc atcatcacca ttatgggtgc tgccctgctt 120 cgtgtcacca agttgcagga gaagtggcgc gtcaagctag ctcaagccct ggaagcaaag 180 ccgttgactg gcggcacatt caaaaacaac ctcaaacttt gggcggagaa atacgccatg 240 tttctcctcc ccttcatcac cgttctccga gaaggcctgg aagcagtggt gttcattgga 300 ggcgtcagtc tcagttttcc tgcaactgcc ttccctctac ctgtttttac tggcattctc 360 gcaggagtgg ccattgggta cctactgtat cggtatgttg aaacccctga atcagctgtc 420 tttctcaaat agaccaccat gctgatggtc tgcagaggag gaaaccaagc ctccctccag 480 atcttcctga tcatctccac ttgcatcctc tacctggttg ctgccggcct cttctcccga 540 ggcgtctggt atctggagaa caatacttgg aaccacgtaa ttggtggtga tgctgccgag 600 acaggtgccg gtccgggatc gtatgacatc cgacagagcg tctggcatgt caactgctgt 660 agtcctctcg ttaatggtgg cgggggatgg ggtatcttca acgccatcct tggctggaca 720 aactcggcaa cctatggctc cgttctttca tacaaccttt actggattgc ggtgatcgtc 780 tggtttgtgg ctatgcgtca caaggaacgc catggacgat tgcctgtggt cgaccctctg 840 ctgaatcggc tgcgaggccg aaagtctgcc gaacctggga atggagagca agatgtcgag 900 gtcagcacga taccatctga tttgcagacg gagtccaaaa taccgaaaag cggagcatcc 960 cttgtctga 969 <210> 41 <211> 1089 <212> DNA <213> Candida guilliermondii <400> 41 atgaactttg aagactactt ctcggttcaa atcttcttta taatcctccg agaaacgttg 60 gagaccgcta tagtgatttc ggttcttctt tcgttcatca atcaaagaag 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ctcttaccct ttgttcctgt gcgttggcag ttgaagcgta tcagaaaaaa aatcaaatta 1020 tacgaagccc gggccaaaca tggcgctgca atagaggctg aaacagaggc agaattactc 1080 atggaataa 1089 <210> 42 <211> 996 <212> DNA <213> Aspergillus flavus <400> 42 agccctcttt cattcctttc tgaagcctct accttccact caacatggca accgatgtat 60 ttgcagttcc cagtatgcat tcttttcttg ttatgcccca tctattaatc aggaactaac 120 ttagtttgac taacttatcg aagtattctt catctgcttt cgagaatgcg ttgagaccag 180 catcattgtt tcggtattac ttgccttcat caagcagacg ctggggtcgg acacggatgc 240 ctttactcgc aaaaggctta tcaaacaggt tactaccatc ttctcattcc gtccccaccc 300 tatagagaca acattgacga tcaataggtc tggtggggag ttgcggtcgg gctgtttata 360 tgcctctgta ttggaggtgg tatgattggg gccttctacg ggtatggcaa ggaccatttt 420 gccagcacgg aggatttatg ggaaggcatc tttgctttag tcgccgccgt catcatcaca 480 gtcatgggag cagcccttct gcgggtgaat aaactgcagg agaaatggcg tgtcaagctg 540 gcccaggcat tggcggcaaa acctcaacct caagggagaa tgacagacaa gatcaagcaa 600 tggtcacaga agtatttcat gttcatctta cccttcatta cggtacttcg ggagggtcta 660 gaggctgtgg tgtttatcgg gggtgttagt ctcagcttcc ccgcaagcgc gttccctctc 720 cctgtattca cgggactctt ggctggtgtg gtagttggtt atatcattta ccggtgagtg 780 tgatatgggc ggcattgaaa ctgaatccca atgctgatag tagtctttgc gatttatcat 840 aggggcggga atcaaacctc acttcagata ttcatggtca tctcgacatg tctgctctac 900 ttggtcgctg ctggactttt gtcccgaggc gtctggttct tggagaacaa cacttggagc 960 aacctcatcg gtggcgatgc ctcagaaacg ggagct 996 <210> 43 <211> 1341 <212> DNA <213> Aspergillus flavus <400> 43 atggcaaatc aagtctttgc agtcactggt aactctcatt atactctctg agtctgcttt 60 tgtacaagac gaccgttgct gaccgtgtat agtctttttc atttgcttcc gagaatgtct 120 cgaaagcagt atcattgtat cggtgcttct tgccttcctc acccaaactt tgggtgctga 180 aggagacaag gcagctctga agagattgcg aatacaggtg agtgtccttc cctatttctt 240 tatacctttg tttatcatga acatcattcg ataatgagct gctaacaata acaggtatgg 300 tgtggagtag gtttaggtct attcttgtgc ctatgtatcg gtgcaggtat gatcggagct 360 ttctacgggt tggaaaaaga taccttcacg aacacagagg atatctggga aggcattttt 420 ggctttatag catccatcat tatttctatc atgggggcgg gccttttgcg 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agaacaatga gtgaagcata g 1341 <210> 44 <211> 1437 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 44 atggcacaga tcgaggagta cttttctgtt cagatattct ttatcattct cagagagact 60 cttgaaacag ctatcatcat ctcggtgttg ctatccttca tcaaccaacg ttcgcacaag 120 catggctccc agtctcagaa catagcagta tcatcgtcat caccatcgac atcatcacct 180 ggttcagtgg accccgccga tgagccacta ccttcgagtt caaccactgt caccccggga 240 cagacatccc atttggagaa agtgcatcgt aagcttaaac ttcaagtatg ggtgggcgcc 300 cttcttgggc ttttcatttg ttttgtcatc gggatggtat ttacgttgat gttttatttt 360 gtgggacagg actactgggc atacacggaa cgagtatggg aaggtgtgtt ctgcatattg 420 tcaagtgtga tcatcactgt gatggggatt gggcttttga gaatcaacaa agttatgaag 480 atcaaatggt ggatcaagtt gggagatgcg tacaataatg aagaatacgc agaagacgaa 540 gaggcagaag gcgaggaaga gattgccaag ttaggagacg acgatgtgat gtatgaggat 600 agtatggcta attatggagg caccaggtcg agctcagagt caaacaccgt ggaggagaac 660 atcccattaa ccggtacgcc tgctactcct gcaacagcta gaaccacaac cacaaagaag 720 aacacaccaa ggaaacaggg gttcaccaag aaatactacc ttgctatttt accattggtc 780 accacattga gagaagggtt agaagcggtt gtgttcattg gtggctcagc catgacgtcc 840 acggtatttt cgatcattgt gtctgttgtc tgcggaattg catttggttc cttgattggg 900 tacttgcttt accaaggggg gaacaaactc tcccttcagt attttcttat ttgctcaaca 960 tgttttcttt acatggtcag cgctgggttg atcagtcgtg gtgtctggtt tatggagctt 1020 gaaagatatg tccgtgcatg tgggggcatg gacgttagtg aaacgggaag tgggccaggt 1080 tcatatgata tcgcaaccag tgtgtggcat gtcaactgtt gtaacggact aactgacggt 1140 tggtggatgg tgttgaacgc aattgtcggc tggaccaatt cggctacata tggcagtgtg 1200 attagttata tggcatactg gttgttggta attgtgtggt tgaaagttaa gttgtatgaa 1260 gagagggaag gtgtgttgcc ttggattccc gtaagatggc aactcaagag aattagaaag 1320 aagattagat tgtatgaatt gaggacccgt cagcaagagc aacaggagca acagagaggt 1380 ggtagtggta gtggtaatga attgccagaa tcgcaaggat tgttgcaaca ggattga 1437

Claims (17)

  1. 고 친화성 철 투과효소(FTR) 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드의 항원 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항원보강제(adjuvant)를 추가로 포함하는 백신 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    항원 단편이 FTR의 철 결합 도메인 또는 세포외 영역을 포함하는, 백신 조성물.
  4. FTR 서열의 18 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 전사 프로모터 및 전사 종결자를 포함하는 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신 조성물로서, 여기에서 상기 프로모터가 상기 FTR 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결되고, 상기 FTR 뉴클레오타이드 서열이 상기 전사 종결자에 작동 가능하게 연결되어 있는, 백신 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    항원보강제를 추가로 포함하는 백신 조성물.
  6. FTR 서열의 일부에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, FTR 서열의 12 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열, FTR 서열의 18 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 RNAi 서열, 및 FTR 폴리펩타이드 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 FTR의 안티센스, 작은 간섭 RNA 또는 항체 억제제; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 진균 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물.
  7. 진균 질환을 앓는 개체 또는 진균 질환을 앓기 쉬운 개체에게 면역원성 양의 FTR 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 단편을 투여함을 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    면역원성 양의 FTR 폴리펩타이드를 약학적으로 허용 가능한 매질 또는 항원보강제와 함께 투여하는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    진균 질환이 접합균증(zygomycosis)을 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    접합균증이 모균증(mucormycosis)을 추가로 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    모균증이 비대뇌 모균증, 폐 모균증, 위장 모균증, 파종 모균증, 골 모균증, 종격 모균증, 기관 모균증, 신장 모균증, 복막 모균증, 상대정맥 모균증 또는 외이 모균증을 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    모균증이 뮤코랄레스(Mucorales) 목 내의 감염원과 관련 있는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    뮤코랄레스 목 내의 감염원이 코아네포라세아에(Choanephoraceae); 컨닝하멜라세아에(Cunninghamellaceae); 뮤코라세아에(Mucoraceae); 마이코타이파세아에(Mycotyphaceae); 파이코마이세타세아에(Phycomycetaceae); 필로볼라세아에(Pilobolaceae); 삭세나에아세아에(Saksenaeaceae); 신세팔라스트라세아에(Syncephalastraceae); 및 움벨로프시다세아에(Umbelopsidaceae)의 진균 과 중에서 선택되는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    뮤코랄레스 목 내의 감염원이 리조푸스(Rhizopus), 아브시디아(Absidia), 아포파이소마이세스(Apophysomyces), 뮤코르(Mucor) 및 컨닝하멜(Cunninghamell)의 속 중에서 선택되는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    리조푸스, 아브시디아, 아포파이소마이세스, 뮤코르 또는 컨닝하멜 속 내의 감염원이 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 리조푸스 미크로스포루스(Rhizopus microsporus), 리조포디포르미스(rhizopodiformis), 아브시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 아포파이소마이세스 엘레간스(Apophysomyces elegans), 및 리조뮤코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus) 중에서 선택되는, 진균 질환의 치료 또는 예방 방법.
  16. 진균을 FTR의 안티센스, 작은 간섭 RNA 또는 항체(다클론 또는 단클론) 억제제에 노출시킴을 포함하는, 진균 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 진균 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    FTR의 안티센스 또는 항체 억제제가 FTR 뉴클레오타이드 서열의 일부에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열; FTR 서열의 12 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열; FTR 서열의 18 개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 염기에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 RNAi 서열; 및 FTR 뉴클레오타이드 서열, 폴리펩타이드 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 억제제를 포함하는, 진균 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1403092B1 (it) * 2010-12-01 2013-10-04 Univ Degli Studi Modena E Reggio Emilia Metodo per la diagnosi e/o il monitoraggio della mucormicosi.
JP2014528715A (ja) 2011-09-15 2014-10-30 ロサンゼルス バイオメディカル リサーチ インスティテュート アットハーバー− ユーシーエルエー メディカル センター ＣｏｔＨを用いたムコール菌症の免疫療法および診断法
US20160017293A1 (en) * 2012-08-15 2016-01-21 Neostem Oncology, Llc Individualized high purity hepatocellular carcinoma stem cells, methods and use of the same
CN106590685A (zh) * 2015-10-19 2017-04-26 粮华生物科技（北京）有限公司 重金属污染土壤的原位生物修复制剂和修复方法
WO2020006438A1 (en) * 2018-06-29 2020-01-02 University Of Maryland, Baltimore Methods of treating or preventing mucormycosis

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6100380A (en) * 1991-10-28 2000-08-08 Cytran, Inc. Immunomodulating peptides and methods of use
TW349870B (en) 1993-09-30 1999-01-11 Janssen Pharmaceutica Nv An antifungal pharmaceutical composition for oral administration and a process for the preparation thereof
TW533205B (en) * 1996-06-25 2003-05-21 Novartis Ag Substituted 3,5-diphenyl-l,2,4-triazoles and their pharmaceutical composition
US20040176391A1 (en) 2002-12-31 2004-09-09 Nektar Therapeutics Aerosolizable pharmaceutical formulation for fungal infection therapy
DE50111949D1 (de) * 2000-12-16 2007-03-15 Alstom Technology Ltd Komponente einer Strömungsmaschine
US7300659B2 (en) * 2001-01-04 2007-11-27 University Of Saskatchewan Enterohemorrhagic Escherichia coli vaccine
US7363166B2 (en) * 2001-03-30 2008-04-22 Council Of Scientific & Industrial Research Computational method for the identification of candidate proteins useful as anti-infectives
US7914799B2 (en) * 2001-08-27 2011-03-29 Immunitor USA, Inc. Anti-fungal composition
GB0223978D0 (en) 2002-10-15 2002-11-20 Novartis Ag Organic compound
ITMI20022447A1 (it) 2002-11-19 2004-05-20 Carlo Ghisalberti Uso di piridinoni nel trattamento della purpura capillare ed affezioni cutanee correlate.
US7226600B2 (en) * 2003-06-11 2007-06-05 Ultra Biotech Limited Method to prepare compositions comprising yeast treated with electromagnetic energy
CA2550927A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Glaxosmithkline Biologicals S.A. A gram negative bacterium with reduced lps level in the outer membrane and use thereof for treating gram negative bacterial infection
US7588931B2 (en) * 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US20090172834A1 (en) * 2006-03-24 2009-07-02 Basf Plant Science Gmbh Proteins Associated With Abiotic Stress Response And Homologs
CL2007002026A1 (es) * 2006-07-13 2008-06-06 Los Angeles Biomed Res Inst Composicion que comprende al menos un compuesto quelante de hierro y al menos un agente antifungico; y metodo para el tratamiento o prevencion de una condicion fungica.

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