CN102639557A

CN102639557A - 用于治疗毛霉菌病和其它真菌性疾病的疫苗组合物和方法

Info

Publication number: CN102639557A
Application number: CN2010800212819A
Authority: CN
Inventors: A·S·伊布拉伊姆; B·J·斯皮尔伯格; 跃·付; J·E·爱德华兹
Original assignee: LOS ANGELES BIOMEDICAL RES INS
Current assignee: LOS ANGELES BIOMEDICAL RES INS; Harbor Ucla Medical Center; LA BioMed (The Los Angeles Biomedical Res Inst)
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2012-08-15
Also published as: NZ595271A; US20100285024A1; EP2408804A1; CL2011002284A1; WO2010107500A1; MX2011009735A; SG174413A1; KR20110139743A; TN2011000459A1; RU2011142173A; CA2755273A1; NZ614255A; EP2408804A4; IL215093A0; US8444985B2; MA33199B1; US20120093828A1; JP2012520878A; AU2010226320A1

Abstract

本发明提供了治疗和预防包括毛霉菌病的真菌性疾病或症状的治疗组合物和方法。本发明的治疗方法和组合物包括具有FTR多肽或该多肽的抗原性片段的疫苗组合物；包括基本上互补于FTR序列的至少18个连续核苷酸的核苷酸序列的载体；反义物(antisense)；小干扰RNA或FTR的抗体抑制剂。本发明的疫苗组合物可以进一步包括佐剂。

Description

用于治疗毛霉菌病和其它真菌性疾病的疫苗组合物和方法

本发明部分是在NIAID授予的NIH授权011671的美国政府支持下进行的。美国政府具有本发明的一定权利。

技术领域

本发明一般的涉及针对传染性疾病的对对象接种疫苗的组合物和方法，特别是，涉及针对条件性真菌疾病的对对象接种疫苗的组合物和方法。

发明背景

已知的250,000种真菌物种中的大约180种被认为能在人和动物中引起疾病(接合菌病)。一些真菌能在所有暴露对象中造成感染，例如，系统性病原体Histoplasma capsulatum和Coccidioides immitis。其它例如假丝酵母(Candida)、曲霉(Asergillus)种和接合菌(Zygomycetes)是条件性病原体，其通常只在其危害的宿主中引起疾病。接合菌纲或毛霉目的真菌，能引起毛霉菌病，这是一种对人类潜在的致死性真菌感染。属于毛霉目的真菌分布在至少6个科，所有的都能引起毛霉菌病(Ibrahim等人Zygomycosis，p.241-251，In W.E.Dismukes，P.G.Pappas，and J.D.Sobel(ed.)，Clinical Mycology，Oxford University Press，New York(2003)；Kwon-Chung，K.J.，and J.E.Bennett，Mucormycosis，p.524-559，Medical Mycology，Lea & Febiger，Philadelphia(1992)，以及Ribes等人Zygomycetes in HumanDisease，Clin Microbiol Rev 13：236-301(2000))。尽管如此，属于毛霉科的真菌，尤其是菌种米根霉Rhizopus oryzae(少根根霉Rhizopus arrhizus)，是到目前为止最常见引起感染的原因(Ribes等人，supra)。也有报道由于小克银汉科的小克银汉霉属(Cunninghamella spp.)感染引起的毛霉菌病案例的增加(Cohen-Abbo等人，Clinical Infectious Diseases 17：173-77(1993)；Kontoyianis等人，Clinical Infectious Diseases 18：925-28(1994)；Kwon-Chung等人，American Journal of Clinical Pathology 64：544-48(1975)，以及Ventura等人，Cancer 58：1534-36(1986))。毛霉目的其它4个科相对较少引起疾病(Bearer等人，Journal of Clinical Microbiology 32：1823-24(1994)；Kamalam and Thambiah，Sabouraudia 18：19-20(1980)；Kemna等人，Journalof Clinical Microbiology 32：843-45(1994)；Lye等人，Pathology 28：364-65(1996)，and Ribes等人，(supra))。

毛霉菌病传染物通常统一的侵袭免疫缺陷宿主(Spellberg等人，Clin.Microbiol.Rev.18：556-69(2005))。毛霉菌病的主要风险因子包括酮酸中毒中的不受控制的糖尿病，即被称为糖尿病酮酸中毒(DKA)，代谢性酸中毒的其它形式，皮质激素的治疗，器官或骨髓移植，中性粒细胞减少，外伤和烧伤，恶性血液紊乱，以及接受血液透析的对象中的去铁胺螯合疗法。

最近的报道已经表明在过去20年利毛霉菌病报道的病例数目的惊人增长(Gleissner等人，Leuk.Lymphoma 45(7)：1351-60(2004))。主要移植中心的毛霉菌病的发生率也有令人担忧的增长。例如，在Fred Hutchinson癌症中心，Marr等已经报道了从1985-1989到1995-1999年病例数目翻倍甚至更多(Marr等人，CHn.Infect.Dis.34(7)：909-17(2002))。同样，Kontoyiannis等报道了短时间内在移植对象中毛霉菌病的发病率翻倍甚至更多(Kontoyiannis et al，Clin.Infect.Dis.30(6)：851-6(2000))。由于老龄化的美国人群中糖尿病、癌症和器官移植的流行，毛霉菌病发生率的增加在可预见的将来会持续存在。

侵袭性毛霉菌病的可用疗法包括尝试改变根本的诱病因素，感染区域的突发性、广泛的外科手术清创术，和附属抗真菌治疗(Edwards，J.，Jr.，Zygomycosis，p.1 192-1199.In P.Hoeprich and M.Jordan(ed.)，InfectiousDisease，4th ed.J.B.Lippincott Co.，Philadelphia(1989)；Ibrahim等人，(2003)，supra；Kwon-Chung and Bennett，supra；Sugar，A.M.，Agent ofMucormycosis and Related Species，p.2311-2321.In G.Mandell，J.Bennett，and R.Dolin(ed.)，Principles and Practices of Infectious Diseases，4th ed.Churchill Livingstone，New York(1995))。

最近，两性霉素B(AmB)仍然是仅有的被认可的治疗侵袭性毛霉菌病(Id)的抗真菌试剂。由于真菌相对耐受AmB，因此需要高剂量，这经常引起肾毒性和其它副作用(Sugar，supra)。并且，当不进行感染病灶的外科手术移除的情况下(例如患鼻脑毛霉菌病对象的眼睛的切除)，单独的抗真菌治疗很少见效(Edwards，J.(1989)，supra；Ibrahim等人，(2003)，supra)。即使外科手术清创术与高剂量AmB联合使用，毛霉菌病相关的死亡率也超过50％(Sugar，supra)。具有扩散疾病的对象的死亡率接近100％(Husain等人，Clin Infect Dis 37：221-29(2003))。由于这不可接受的高死亡率，以及高度损伤外貌的手术治疗极端死亡率，因而迫切需要开发治疗和预防侵袭性毛霉菌病的新策略。

真菌感染的诱因的一个根本因素是升高的血清铁水平。具有升高的血清铁的对象对毛霉菌病高度易感。铁基本上是所有微生物病原体生长和致病所必需的。在哺乳动物宿主中，非常少的血清铁是对微生物可用的，因为它们高度结合在载体蛋白例如转铁蛋白上。尽管血清铁的多价螯合是宿主对抗病原体真菌的一个主要防御机制，用外源的铁螯合剂例如去铁胺治疗的对象具有显著增加的侵袭性毛霉菌病发生率，并伴有大于80％的死亡率。去铁胺作为人类宿主的螯合剂的同时，它也作为含铁细胞、向病原体真菌提供之前不可用的铁而诱导对象罹患毛霉菌病。

因此，需要能降低毛霉菌病风险和提供没有副作用的有效疗法的化合物和方法。本发明满足了这一需求，并提供了相关的优点。

发明概述

根据本文的概括的实施方式，本发明提供了疫苗组合物，包括FTR多肽，或该多肽的抗原性片段，和药学上可接受的载体。另外，本发明提供了疫苗组合物，包括具有与FTR序列的至少18个连续核苷酸基本上互补的核苷酸序列、转录启动子和转录终止子的载体，其中所述启动子可操作地连接至所述FTR核苷酸序列，和药学上可接受的载体。本发明的疫苗组合物可以进一步包含佐剂。

另外，本发明提供用于在有需要的对象中治疗或预防真菌病症的药物组合物，包括反义物(antisense)，小干扰RNA或FTR抗体抑制剂，选自基本上互补于FTR序列的一部分的核苷酸序列；基本上互补于FTR序列的至少12个连续核苷酸碱基的核苷酸序列；核苷酸RNAi序列，其基本上互补于FTR序列的至少18个连续核苷酸碱基；特异性结合FTR多肽或其片段的抗体或抗体片段；以及药学上可接受的赋形剂或载体。

另外，本发明提供了治疗或预防真菌病症的方法，包括向具有或倾向具有真菌病症的对象使用至免疫性量地FTR多肽，或其抗原性片段。另外，本发明提供对有需要的对象治疗或预防真菌病症的方法，包括将所属真菌暴露于反义物，小干扰RNA或FTR的抗体抑制剂。

附图概述

图1显示了米根霉高亲和性铁通透酶核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，Genbank cDNA accession NO.AY344587。

图2显示了米根霉高亲和性铁通透酶多肽序列(SEQ ID NO：2)，Genbank protein ID.No.AAQ24109.1.。

图3显示了米根霉的FTR的氨基酸序列比对(a)和树状图(b)，其与白色念珠菌(Candida albicans)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FTR分别具有46％和44％的同一性。氨基酸序列比对中的方框表示与铁直接发生作用的保守REGLE基序。

图4显示了在升高的可用血清铁的条件下接合菌类摄取铁的机制。

图5显示了米根霉在具有不同浓度的铁的培养基中生长时表达FTR。

图6显示了用表达FTR的载体转化的酿酒酵母ftr 1突变株的生长。

图7显示了与野生型酿酒酵母和空载体转化的酿酒酵母突变株相比，用表达FTR的载体转化的酿酒酵母ftr 1突变株的更高的铁摄取亲和力。

图8显示了与感染的非糖尿病者和患糖尿病但未感染的小鼠相比，用米根霉感染的糖尿病小鼠(n＝10)的生存率百分比。

图9显示了用TaqMan检测确定的米根霉(5x10⁴孢子)的肾脏负担与存活百分比之间的时间的联系或反相关性。

图10显示了5x 10³孢子的米根霉感染后并经以下处理的DKA小鼠的存活百分比(n＝20)(A)和组织真菌负担(n＝11)(B)：1)地拉罗司(口服给药)；2)地拉罗司+饱和FeCl₃(静脉注射)；3)静脉LAmB 4天；和4)安慰剂。未感染的DKA小鼠和未感染且FeCl₃处理被作为阴性对照。^*p＜0.05相对安慰剂或地拉罗司+铁。

图11展示了DKA小鼠的血源性传播毛霉菌病模型中的FTR表达。小鼠用10⁵孢子的米根霉99-880经尾静脉感染。在指定的时间点取出感染的脑并将总RNA用于实时RT-PCR分析(n＝4只小鼠每个时间点)。来自未感染小鼠的脑用作阴性对照。数据以平均值±SD表示。

图12显示了用在FTR启动子控制之下表达GFP的米根霉感染的DKA小鼠的脑的FTR表达。(A)米根霉感染的H&E脑；(B)用兔抗GFP多克隆抗体染色后用FITC连接的抗-兔抗体染色计数的脑切片；和(C)显示感染时的非荧光米根霉的DIC共聚焦图像。箭头指示感染的脑中的真菌元素。放大率为×400。

图13显示了RT-PCR检测的琼脂糖凝胶电泳结果，显示用RNA干扰质粒(T₁和T₃-T₅)转化的米根霉缺乏FTR表达，相比于用空质粒(C)转化的米根霉。扩增18s rDNA的引物用作对照以证明靶向FTR的RNA干扰的特异性。

图14显示了米根霉静脉注射感染的DKA小鼠(n＝8)的存活百分比，所述米根霉用空质粒(对照株，2.9×10³孢子)或靶向FTR表达的RNAi质粒(FTR-i，2.9×10³孢子)转化。对数秩检验(Log Rank test)P＜0.001。

图15显示烟曲霉高亲和性铁通透酶核苷酸序列。

图16显示高里假丝酵母(Candida guilliermondii)高亲和性铁通透酶核苷酸序列。

图17显示黄曲霉高亲和性铁通透酶核苷酸序列。

图18显示热带假丝酵母(Candida tropicalis)高亲和性铁通透酶核苷酸序列。

图19显示了根霉rFtr1p螺旋捆蛋白和铁从细胞外转入根霉种的转移。

图20显示了证明纯化的合成/重组rEtr1p的SDS-PAGE的结果。用表达6×-His标签的合成rFTR1的质粒或空质粒转化E.coli。rFtr1p用Ni-琼脂糖柱纯化并在rFtr1p克隆的28kD处检测到期望的大小，而E.coli用空质粒转化则没有。

图21显示了米根霉(2.5x 10⁷孢子)感染并用血清处理过的DKA小鼠(n＝8)的存活率，其中所述血清来自rFtr1p或空质粒免疫的小鼠，对数秩检验P＜0.007。

图22显示了FTR1在米根霉静脉感染的DKA小鼠中的表达。小图(A)显示用含有GFP报告基因的质粒转化并在富含铁或贫铁的情况下生长的米根霉的FACS检测，所述GFP报告基因由FTR1启动子或者结构性表达的ACT1启动子驱动。由空质粒转化的米根霉M16被用作阴性对照。小图(B)显示FTR1在米根霉感染的DKA小鼠脑中的表达，其中所述米根霉在FTRIp的控制之下表达GFP。对抗-GFP抗体株，组织部分用兔针对GFP的多克隆抗体染色然后用联合抗-兔抗体的FITC染色计数。对DIC，共聚焦图像显示在感染时期的非荧光米根霉。箭头表示感染的脑中的真菌元素，放大率：×400。

图23显示了中断盒(disruption cassette)整合进FTR1位点但是完全的FTR1的消除是很难实现的。小图(A)A图总结了我们用于实现FTR1中断的策略。PyrF(998bp)用作选择性标签，其侧邻于分别为606和710bp片段的FTR1-5’UTR和FTR1-3’UTR。小图(B)以凝胶电泳显示了中断盒整合进代表性的推定frt1失效突变体(KO)而不是野生型(WT)(见5’UTR和3’UTR)。引物FTR1 P1 1和FTR1 P1 2用于从FTR1 ORF扩增503bp的片段，其仅来自野生型，而不会来自推定ftr1失效突变体(见FTR1)。引物PyrF P9和PyrF P18用于检测转化的载体的可能的再环化并期望2094bp的条带(见自我连接)。小图(C)米根霉野生型、米根霉PyrF补足的，或推定ftr1失效突变株在不同的铁来源的限制铁或富含铁的培养基中生长的对比。对含有10或1000μM(富含铁)的FeCl₃或FeSO₄或100μM铁草胺的培养基，48小时后测量其生长，并在72小时后向培养基补料100μM血红素后测量其生长。数据以固体生长培养基上生长的菌丝体直径的增加以cm/h表示。^*相比于野生型或米根霉PyrF补足型菌株P＜0.05。小图(D)凝胶电泳显示了缺乏所述推定失效突变株在富含铁培养基((1000μMFeCB)上一轮纯化之后的FTR1的扩增和同样的分离在贫铁培养基(即100μM铁草胺)上生长96h后的FTR1的扩增。肌动蛋白(600bp)的扩增用作DNA加载的对照。

图24显示了多核米根霉中FTR1的完全中断的缺失的确认。小图(A)膨胀的米根霉孢子的DAPI株显示了单一孢子具有多个细胞核。箭头指示细胞核。原始放大率，×1000。小图(B)凝胶电泳显示了缺失推定失效突变株在富含铁培养基(1000μM FeCl3)经过14段之后FTR1扩增和同样的分离在贫铁培养基(即100μM铁草胺)生长96h的FTR1的扩增。肌动蛋白(600bp)的扩增用于确认DNA完整地用作模板和没有PCR抑制剂。小图(C)Southern印迹确认了推定ftr1中中断盒的整合(仅在从富含铁培养基生长的推定ftr1提取的DNA样品显示7380bp的条带)和FTR1克隆的几乎完全消除(从富含铁培养基中生长的推定ftr1提取的DNA样品缺乏1960bp)。

图25显示了减少的拷贝数目导致米根霉摄取铁能力的下降。小图(A)定量PCR证明了在贫铁的培养基中生长的推定ftr1无效突变株中相比于米根霉PyrF补足型菌株或其同样的突变株减少的拷贝数目。小图(B)来自qPCR的样品的凝胶电泳显示了FTR1产品的扩增特异性。小图(C)推定ftr1突变株显示了相比于米根霉野生型或米根霉PyrF补足型菌株获取⁵⁹Fe的能力降低。⁵⁹Fe被野生型、米根霉PyrF补足株或推定ftr1突变株摄取。发育的孢子培养与0.1μM ⁵⁹FeCl₃中(在该浓度下能诱导高亲和性铁通透酶(Fu等人，FEMS Microbiol Lett 235：169-176(2004))。^*相比于野生型或米根霉PyrF补足型菌株P＜0.05。数据(n＝9来自3个独立实验)以中位数+四分位差表示。

图26显示了FTR1拷贝数目的减少如何降低米根霉在DKA小鼠模型中的毒性。小图(A)代表性的推定ftr1无效突变株证明了米根霉PyrF补足型突变株在YPD或CSM-URA培养基上具有可比性的生长。小图(B)米根霉野生型(4.3×10³)，米根霉PyrF补足型菌株(4.8×10³孢子)或推定ftr1缺失突变株(3.0×10³孢子)静脉感染的小鼠(n＝8)的存活率。^*，相比于野生型或米根霉PyrF补足型菌株P＜0.0005。小图(C)米根霉野生型(4.3×10³)，米根霉PyrF补足型菌株(5.1×10³孢子)或推定ftr1缺失突变株(5.3×10³孢子)鼻腔感染的小鼠(n＝9)的存活率。^*，相比于野生型或米根霉PyrF补足型菌株P＝0.04。

图27显示了FTR1表达的抑制如何降低米根霉在体外摄取⁵⁹Fe的能力。(A)RT-PCR显示了RNA干扰质粒(T₁和T₃-T₅)转化的米根霉相比于空质粒转化的米根霉(C，对照)缺少FTR1的表达。扩增18s rDNA的引物作为对照以证明初始样品的完整性和没有PCR抑制剂。(B)代表性的RNAi转化株证明了相对空质粒转化的米根霉M16在YPD或CSM-URA培养基上具有可比性的生长。(C)野生型、空质粒转化的米根霉M16或所述RNAi转化株之一摄取的⁵⁹Fe。发芽的孢子在0.1μM ⁵⁹FeCl₃(该浓度下高亲和性铁通透酶被诱导(Fu等人，FEMS Microbiol Lett 235：169-176(2004))。^*P＜0.05，相比于米根霉野生型或空质粒转化的米根霉M16。数据(n＝9来自三组独立的实验)以中位数±四分位差表示。

图28显示了FTR1表达的抑制降低了DKA小鼠模型中米根霉的耐受性，而抗-Ftr1P血清的被动免疫保护DKA小鼠不受米根霉感染。小图(A)米根霉静脉感染的小鼠(n＝8)的存活率，其中所述米根霉用空质粒(对照株，2.9×10³孢子)或靶向FTR1表达的RNA-i质粒(FTR1-i，4.1×10³孢子)转化。^*P＜0.001。小图(B)米根霉经鼻腔感染的小鼠(n＝9)的存活率，其中所述米根霉用空质粒(对照株，2.8×10³孢子)或靶向FTR1表达的RNA-i质粒(FTR1-i，7.6×10³孢子)转化。^*P＜0.02。小图(C)米根霉感染的小鼠(n＝8)的肾或脑真菌损伤，其中所述米根霉用空质粒(对照株，4.2×10³孢子)或靶向FTR1表达的RNA-i质粒(FTR1-i，5.1×10³孢子)转化。^*，P＜0.0006并且

P＜0.04，相比于对照株。数据以中位数±四分位差表示。y轴反映该检测的测量的更低限制。(D)米根霉(预计2.5×10⁷孢子的接种物而实际上吸入9×10³孢子的接种物)经鼻腔感染并用从Ftr1p或从空质粒克隆收集的蛋白免疫的小鼠中收集的血清处理后的小鼠(n＝8)的存活率。^*，P＜0.007。

发明详述

本发明涉及直接和/或间接抑制病原性真菌的高亲和性铁通透酶(FTR)的组合物和方法的用途，尤其是涉及毛霉菌病的发作的那些。高亲和性铁通透酶是在真菌中造成铁的摄取的分子；因而，靶向或抑制该分子，将阻止真菌摄取和/或使用周围环境中可用铁的能力。高亲和性铁通透酶的抑制将导致病原性真菌的铁饥饿，从而妨碍其生长和/或毒性。在例如米根霉中的FTR多肽与任何已知的人蛋白具有极少或没有同源性。例如，人蛋白质组的同源性搜索鉴别出5个开放阅读框，其具有与米根霉的FTR蛋白非常有限的同源性，其比对得分为30.4，e＝9.0，对所有这5种蛋白。这些蛋白的3个是包含82的卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain containing 82)(即，EAW66982；AAH33726.1；和NP 079001.2)，一个是CCDC82蛋白(即，AAH18663.1)和一种未命名蛋白(即，BAB15683.1)。作为基准，相比于其它生物体而言真菌的独体序列鉴定的标准BLAST搜索e值设定为10^-8，表明rFtr1p与人类蛋白质组没有显著的同源性。因此，本发明的靶向或抑制FTR的组合物和方法将仅仅影响真菌病原体的铁水平而不影响宿主，这建立起有效而有针对性的毛霉菌病治疗方法。

在一个实施方式里，本发明涉及免疫原性组合物例如疫苗。所述免疫原性组合物包含有效剂量的真菌FTR多肽或其抗原片段，它在对象中引起对毛霉菌病的保护。本发明的疫苗组合物包含宿主体液和/或细胞介导的针对真菌FTR的免疫反应。在另一个实施方式里，本发明的组合物进一步包含佐剂，其能够促进所述疫苗组合物的免疫原性。

在又另一个实施方式里，本发明包含FTR分子的抑制剂例如siRNA。所述FTR抑制剂包含表达一或多个siRNA的载体，所述siRNA包含与FTR分子的部分基本上互补的序列以抑制FTR转录或翻译水平。例如如实施例9所描述的，制备了针对米根霉的FTR的干扰RNA，其显示在这些真菌中抑制FTR表达。在DKA小鼠中，证明了具有抗-FTR siRNA的米根霉转化株具有比野生型米根霉更低的毒性。

如本文所用，术语“FTR”指高亲和性铁通透酶，一种病原性真菌内引起铁转运的膜蛋白，例如，但是不限于米根霉，A.fumigatus，C.guilliermondii，Aflavus和C.tropicalis中的FTR；以及其编码核酸。如图3所示和实施例1所描述，例如，来自米根霉，白色念珠菌和酿酒酵母的FTR共享39％或更高的同一性百分比和多个蛋白质序列同源性区域。例如米根霉的FTR的核苷酸序列，显示于图1(SEQ ID NO：1)，其对应的氨基酸序列显示于图2(SEQ ID NO：2)。A.fumigatus的FTR的核苷酸序列显示于图15；C.guilliermondii的显示于图16；A.flavus的显示于图17；C.tropicalis的显示于图18。贯穿本说明书，术语“FTR表达”或“表达FTR”可用以平等的表示FTR核酸或FTR多肽的表达。

通常，核酸是RNA，例如mRNA或前-mRNA，或DNA，例如cDNA和基因组DNA。例如FTR核酸，是指对应于FTR多肽或其免疫原性片段的核酸分子(RNA、mRNA、cDNA或基因组DNA，分别是单链或双链)。DNA分子可以是双链或单链的；单链RNA或DNA可以或者是编码链或有义链，或者是非编码链或反义链。核酸分子或核苷酸序列可以包含基因的编码序列的所有或部分，并能进一步包含额外的非编码序列例如内含子或非编码3’或5’序列(例如包含启动子，调节片段，聚-A延伸或增强子序列)。另外，核酸分子或核苷酸序列可以与另一个序列融合，例如，标签，标记或编码多肽的序列，其帮助分离或纯化多肽。这种序列包括但不限于编码选择性标记的(例如抗生素抗性基因，或报告序列)，编码重复组氨酸的(HIS标签)和编码谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白的。核酸分子或核苷酸序列可以包含化学或重组方法合成的核酸分子或核苷酸序列，这种核酸分子或核苷酸序列适合用于重组DNA过程和在遗传工程蛋白表达系统中。

术语“多肽”是指两个或多个氨基酸以肽键共价连接的链。本发明的上下文中感兴趣的特定多肽是具有抗原性表位的氨基酸亚序列。抗原性表位是本领域公知的并包含足以向多肽的免疫原特性作出应答并能引起免疫反应的序列和/或结构决定子。FTR多肽的功能结构域也被认为落入本发明的范围。例如，结合铁的REGLE基序是本发明的一个示例性的功能结构域。另一个示例性功能结构域是FTR的细胞表面EXXE基序，它是在酿酒酵母中FTR发挥全部功能所必需的(Stearman等人，Science 271：1552-1557(1996))。多肽也经历成熟或后翻译修饰过程，其可能包含例如糖基化，蛋白酶切断，脂肪化，信号肽切断，前肽切断，磷酸化，等等。

术语“免疫原性”或“抗原性”如本文所用是指蛋白的部分，其能被T细胞和/或B细胞抗原受体所识别。所述免疫原性部分通常包括FTR多肽或其变体的至少5个氨基酸残基，优选至少10个，更优选至少20个，还更优选至少30个氨基酸残基。优选的免疫原性部分可以包含小的N-和/或C-末端片段(例如，5-30个氨基酸，优选10-25个氨基酸)。

变体多肽与目标多肽相比包含至少一个氨基酸的改变。FTR的多肽变体可以展现相对FTR多肽至少大约39％，更优选至少大约50％，更加优选至少70％的同一性。多肽变体包含来自确定的多核苷酸的一些碱基的基本上同源的多核苷酸，通常由突变例如替换，插入，缺失或转位而引起。多核苷酸变体优选展现相对确定的多核苷酸至少大约70％，80％或90％，并更优选至少大约95％，98％或99％的同一性。

在本文用以关于FTR多肽的术语“片段”是指具有FTR氨基酸序列的部分的多肽。有用的片段包含保留该多肽的一或多个生物活性的那些。这样的生物活性片段可以具有很大范围的长度，包括，例如，4，6，10，15，20，25，30，40，50，100，或更多氨基酸的长度。除了活性之外，生物活性片段也可以以例如基序，结构域或通过用本领域公知的方法分析多肽序列以鉴别的片段来表征。这样的区域包括，例如，信号肽，细胞外结构域，跨膜片段，配体结合区域，锌指结构域和/或糖基化位点。

术语“疫苗”，如本文所用，是指可以向动物给药以保护动物对抗传染病的组合物。疫苗通过诱导或增强动物对抗传染病的免疫反应而保护其对抗疾病。可以用本发明的疫苗处理的示例性的传染病是毛霉菌病。疫苗介导的保护可以是宿主中当面临例如FTR或其免疫原性部分或片段时诱导的体液和/或细胞介导的免疫性。

术语“佐剂”意味着具有增强抗原的免疫反应的能力的组合物，通常通过与抗原一起或在抗原附近的位点递送。增强免疫反应的能力由免疫介导的保护的增强来证明。体液免疫的增强可以通过例如针对抗原的抗体的效价的增加来证明。细胞免疫的增强可以通过例如阳性皮肤反应测试、细胞毒性T细胞检验、IFN-γ或IL-2的ELISPOT检验来证明。佐剂是本领域公知的。示例性佐剂包括例如弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，铝佐剂，MF59和QS21。

术语“抗体”如本文所用是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分。抗体可以通过本领域技术人员所知的任何种类的技术来制备(参见，例如，Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)。本发明提供了特异性结合本发明的多肽或其片段或变体的多克隆和单克隆抗体。本发明的单克隆抗体，例如，包括大量抗体分子，其包含仅一个特定的抗原结合位点，所述位点能与本发明的多肽或其片段或变体的特定表位发生免疫反应。单克隆抗体可以与一或多种治疗性试剂偶联。合适的试剂包括分化诱导剂，药物，毒素，和其衍生物。治疗性试剂可以直接或者间接(例如，通过连接基团)与合适的单克隆抗体偶联(例如，共价键合)。

术语“载体”，“克隆载体”和“表达载体”意味着这样的媒介物，核酸分子通过它可以被引入宿主细胞。载体可以用于增殖或保持核酸或者编码序列的多肽表达。多种载体是本领域公知的，其包括，例如，质粒，噬菌体和病毒。示例性的载体可以在以下描述中找到，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Ed.，Cold Spring HarborLaboratory，New York(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1999)。

术语“抗体抑制剂”如本文所用是指降低目标抗原(即，FTR)的生物活性或功能的抗体。这种活性或功能的降低可以是，例如，与细胞组分有关(例如，细胞膜定位)，或与细胞过程有关(例如，铁转运)，或与整个细胞过程有关(例如，细胞生长或存活)。对于细胞生长，其抑制效果可以是杀真菌的(杀死真菌)或抑制真菌的(即，阻止或至少延缓真菌生长)。后面的延缓或预防真菌整张导致相对于未抑制真菌在一段确定的时期内产生更少的真菌。以分子的观点，这种抑制等同于FTR分子的转录和/或翻译的水平的降低或消除，或者FTR分子活性的降低或消除。

术语“治疗”，如本文所用，意味着真菌病症的临床症状指标的改善。临床症状的改善包括，例如，治疗的个体相比于治疗前水平或相比于患真菌病症的个体，其真菌病症的至少一个症状降低或减轻。术语“治疗”也包括与真菌病症相联系的病理状况的严重性、慢性并发症或真菌感染机会的降低。这样的病理状况的严重性、慢性并发症或真菌感染机会在下文中例证作为毛霉菌病。毛霉菌病和其它这样的病理状况的严重性、慢性并发症或真菌感染机会也可以在以下描述中找到，例如，Merck Manual，Sixteenth Edition，1992，and Spellberg等人，Clin.Microbio.Rev.18：556-69(2005)。

术语“预防”，如本文所用意指真菌病症的临床症状指标的预防。这种预防包括，例如，个体中常规生理学指标的维持，所述个体在所述病症的明显症状的发展之前或者所述病症的诊断之前处于真菌感染的风险之中。因此，术语“预防”包括个体的预防性治疗以警戒其发生真菌病症。防止个体的真菌病症也试图包括抑制或阻止真菌病症的发展。抑制或阻止所述病症的发展包括，例如，抑制或阻止异常生理指标的发生或临床症状例如上文所描述的和/或本领域公知的。因此，有效预防真菌病症可以包括易感真菌病症的个体中正常的体温、体重、生理状况的维持和没有损伤或其它病例学表现。易感真菌病症的个体包括，例如，患有艾滋病，氮血症，糖尿病，支气管扩张，肺气肿，TB，淋巴瘤，白血病，或损伤的个体，或者具有易感真菌病症历史的个体。抑制或阻止所述病症的发展包括，例如，抑制或阻止一或多种病理学病症的进行，慢性并发症或易感与真菌病症相联系的机会性感染。

术语“真菌病症”如本文所用是指真菌疾病，感染，或包含表面霉菌(即，皮肤，头发，指甲和粘膜的真菌疾病；例如，癣菌病或酵母感染)、皮下霉菌(即，皮下组织、筋膜和骨的真菌疾病；例如，足分枝菌病，着色真菌病，或分支孢菌病)和系统霉菌(即，深层真菌感染，通常因为吸入起因霉菌产生的空气传播的孢子而产生)的集落；例如，按合菌病，毛霉菌病，球孢子菌病，芽生菌病，组织胞浆菌病，或副球孢子菌病。

如本文所用，术语“接合菌病”意指有接合菌纲(由毛霉目和虫霉目组成)的真菌引起的真菌病症。虫霉目是被称为虫霉病的皮下和皮肤黏膜感染的原因，其在发展中国家严重折磨着免疫活性宿主。接合菌病也被称为毛霉菌病，这两个术语可交换地指代同样类型的真菌感染。

如本文所用，术语“毛霉菌病”意指有毛霉目的真菌引起的真菌病症。毛霉菌病是一种威胁生命的真菌感染，并在发展中国家或工业化国家里都一律感染免疫受损的宿主。属于毛霉目的真菌分布在至少6个科，所有的科都能引起皮肤和深层感染。属于毛霉科的物种比其它科更频繁地被从毛霉菌病患者中分离出来。在毛霉科，米根霉(Rhizopus oryzae)(少根根霉，Rhizopus arrhizus)是普遍的感染起因。其它引起相似的感染光谱的毛霉科的示例性物种包括，例如，小孢根霉足样变种(Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)，伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)，雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)，毛霉物种，微小毛霉(Rhizomucor pusillus)和小克银汉霉属(Cunninghamella spp)(小克银汉霉科，Cunninghamellaceaefamily)。毛霉菌病是本领域公知的并包括，例如，鼻脑毛霉菌病，肺毛霉菌病，胃肠毛霉菌病，散布型毛霉菌病，骨毛霉菌病，纵膈毛霉菌病，气管毛霉菌病，肾毛霉菌病，腹膜毛霉菌病，上腔静脉毛霉菌病或外耳炎毛霉菌病。

属于毛霉目的真菌通常分布在以下科：笄霉科(Choanephoraceae)，小克银汉霉科(Cunninghamellaceae)，毛霉科(Mucoraceae)，Mycotyphaceae科(Mycotyphaceae)，Phycomycetaceae科(Phycomycetaceae)，水玉霉科(Pilobolaceae)，瓶霉科(Saksenaeaceae)，共头霉科(Syncephalastraceae)，和Umbelopsidaceae科(Umbelopsidaceae)。这些真菌科分别有一或多个属组成。例如，属于毛霉目、毛霉科的真菌进一步分类为以下属：腐化米霉菌属(例如，物种A.corymbifera)；刺毛霉属(例如，A.elegans)；淀粉霉属(例如，A.rouxii)；鳞质霉属；巴克斯霉属(例如，B.circina)；Benjaminiella属(例如，B.multispora)；丝枝霉属(例如，C.brefeldii)；卷霉属(例如，C.angarensis)；科克霉属(例如，C.recurvatus)；Dicranophora属(例如，D.fulva)；Ellisomyces属(例如，E.anomalus；卷枝霉属(例如，H.elegans)；生丝毛霉属(例如，H.assamensis)；Kirkomyces属(例如，K.cordensis)；毛霉属(例如，M.amphibiorum)；Parasitella属(例如，P.parasitica)；Philophora属(例如，P.agaricina)；Pilaira属(例如，P.anomala)；Pirella属(例如，P.circinans)；根毛霉属(例如，R.endophyticus)；Rhizopodopsis属(例如，R.javensis)；根霉属；拟小孢霉属(例如，S.umbellata)；Syzygites属(例如，S.megalocarpus)；枝霉属(例如，T.elegans)；Thermomucor属(例如，T.indicae-seudaticae)；和接霉属(例如，Z.californiensis)。根霉属，例如，包括R.azygosporus；R.caespitosus；R.homothallicus；米根霉；和R.schipperae物种。

笄霉科由以下真菌属组成：布拉霉属(例如，B.monospora)、笄霉属(例如，C.cucurbitarum)、吉尔霉属(例如，G.hainanensis)，和Poitrasia属(例如，P.circinans)。小克银汉霉科由以下属组成：Chlamydoabsidia属(例如，C.padenii)；小克银汉霉属(例如，C.南极大陆)；Gongronella属(例如，G.butleri)；Halteromyces属(例如，H.辐辏状云)；和Hesseltinella属(例如，H.vesiculosa)。Mycotyphaceae科由以下真菌属组成：Mycotypha属(例如，M.africana)。Phycomycetaceae科由以下真菌属组成：须霉属(例如，P.blakesleeanus)和伞菌霉属(例如，S.chalybeus)。水玉霉科由以下真菌属组成：水玉霉属(例如，P.longipes)和Utharomyces属(例如，U.epallocaulus)。瓶霉科由以下真菌属组成：鳞质霉属(例如，A.elegans)和瓶霉属(例如，S.vasiformis)。并头状菌科由以下真菌属组成：Dichotomocladium属(例如，D.elegans)；Fennellomyces属(例如，F.gigacellularis)；Mycocladus属(例如，M blakesleeanus)；Phascolomyces属(例如，P.articulosus)；Protomycocladus属(例如，P.faisalabadensis)；并头状菌属(例如，S.monosporum)；Thamnostylum属(例如，T.lucknowense)；Zychaea属(例如，Z mexicana)。最后，Umbelopsidaceae科由真菌属Umbelopsis属(例如，U.angularis)组成。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与活性成分相适应的任何和所有药学等级的溶剂，缓冲液，油，脂肪，分散介质，包层，等渗液和吸附促进试剂等等。这些药学上可接受的载体可以以选择的给药模式相适应的大范围的药学等级的原料来制备，例如，注射剂，鼻腔给药，口服给药，等等。为了本发明的目的，术语“药物的”和“药学上可接受的”进一步指以已知技术配制的组合物，并无毒性，并且如果需要的话，与能安全地施用于人类的载体或添加剂一起使用。在一个特别的实施方式里，术语“药学上可接受”意指经联邦管理机构或州政府核准的，或列于美国药典上或其它广泛认可的药典上适用于动物，更特别的适用于人类。术语“载体”指一起用于施行治疗的稀释剂，佐剂，赋形剂，或载体。这样的药物载体可以使无菌液体，例如谁和油，包括石油，动物，植物或人造来源的，例如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等等。当药物组合物经静脉给药的时候，水是优选的载体。盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也能被用作液体载体，特别是可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻谷、面粉、粉笔、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。

术语“致免疫的量”如本文所用是指本发明的多肽或其片段或变体的特定表位能引起宿主针对所述多肽或表达所述多肽的传染物的免疫反应的有效量。这个量通常在20μg到10mg抗原每剂量的疫苗的范围内并依赖于要治疗的对象，对象的免疫系统合成抗体的能力，和需要的保护程度。需要的免疫原的精确量可以通过多种方法来计算，例如，抗体效价。术语有效量是指化合物或组合物的足以提供需要的效果的量。因此，用于描述疫苗，有效量是指一定量的化合物或组合物(例如，抗原)，其足以产生或引起保护性免疫反应。关于免疫组合物的有效量是足以引起免疫反应的量，不管所述反应是否是保护性的。

本发明部分涉及发现了FTR基因产物是真菌病原体例如米根霉在血源性散布或毛霉菌病中的全部毒性所必需的。进一步，具有毛霉菌病的宿主中FTR多肽形成的抑制导致了生存延长。如本文所描述，FTR1功能的废除导致铁摄取的减少和体内毒性的降低，而且抗-Ftr1p抗体的被动免疫显著促进了感染小鼠的生存。如本文所公开，针对FTR1的被动免疫疗法是促进这些致命感染的结果的可行方案。

从而，本文公开了用于有效抑制FTR分子和/或其功能以治疗毛霉菌病或其它真菌疾病的不同组合物。这些抑制组合物包括疫苗，反义物，siRNA，抗体或其它任何能够有效靶向并抑制FTR功能的组合物。这样的组合物将减少和/或预防真菌在感染组织中的生长并将引起生物体死亡。本发明的组合物也用于预防性设置以降低发作和/或预防感染发生。另外，本文公开的任何FTR抑制组合物均能进一步与其它已知的抗真菌疗法补充和/或联合，包括，例如，两性霉素B或铁螯合剂。示例性的铁螯合剂包括去铁酮和地拉罗司。

在一个方面，本发明提供具有FTR多肽或该多肽的抗原片段或变体的疫苗组合物。所述疫苗组合物也可以包括佐剂。在某些实施方式里，本发明的疫苗组合物具有如图2所示的FTR多肽(SEQ ID NO：2)或该FTR多肽的抗原片段(例如，REGLE基序)，药学上可接受的载体和/或佐剂。

类似的，所述疫苗组合物具有对应于图15-18显示的核苷酸的FTR多肽。本发明的疫苗组合物的配方能在对象中通过刺激特定体液(中和抗体)和效应细胞介导的针对真菌病原体的FTR的免疫反应而有效诱导保护性免疫。本发明的疫苗组合物也能用于治疗或预防真菌感染例如毛霉菌病。

本发明的疫苗将包含免疫保护量的FTR抗原，并以本领域公知的方法制备。疫苗的制备通常地描述在，例如，M.F.Powell和M.J.Newman，eds.，″Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)，″Plenum Press(1995)；A.Robinson，M.Cranage，and M.Hudson，eds.，″Vaccine Protocols(Methodsin Molecular Medicine)，″Humana Press(2003)；以及D.Ohagan，ed.，″VaccineAjuvants：Preparation Methods and Research Protocols(Methods in MolecularMedicine)，″Humana Press(2000)。

FTR多肽，及其肽片段和变体可以包括免疫原性表位，它可以通过本领域公知的方法来鉴别，例如如下描述的：Geysen等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998(1984))。简单来说，数百个重叠的短肽，例如，六肽，可以人工合成以覆盖目标多肽(即，FTR)的整个氨基酸序列。这些多肽仍然连接在其合成的固体支持物上时用于ELISA方法用多种抗血清测试其抗原性。针对FTR蛋白的抗血清可以通过现有技术来获得，Kohler and Milstein，Nature 256：495-499(1975)，并可以人源化以降低抗原性，参见，例如，U.S.专利号5,693,762，或者在转基因小鼠中产生以保留未重排的人免疫球蛋白基因，参见，例如，U.S.专利号5,877,397。一旦含有与来自完整蛋白的抗体反应的六肽的表位被鉴别出来，该多肽可以进一步通过每个位置的氨基酸取代和/或C和/或N末端延伸来测试其特异性。这种含有表位的多肽典型的包含SEQ ID NO：2的至少6到14个氨基酸残基，并可以通过例如多肽合成来制备，使用本领域公知的方法或通过截断FTR多肽。至于依照本发明用作免疫原的分子，本领域技术人员将认识到FTR多肽可以被截断或片段化而不失去其作为免疫原性疫苗的必要性质。例如，FTR多肽可以通过从C末端开始截断以截断产生保留该分子作为免疫原的功能特性的N-端片段。类似的，可以通过从N-末端开始截断并保留该分子作为免疫原的功能特性以产生C-端片段。根据本文提供的教导和指导的其它修饰可以依照本发明来产生其它FTR多肽功能性片段，免疫原性片段，变体，同系物或其衍生物，以达到本文描述的天然蛋白具有的治疗有效性。

本发明的疫苗组合物进一步包含传统的药物载体。合适的载体是本领域技术人员所熟知的。这些疫苗组合物可以以液体单位剂量形式制备。其它可选的组分，例如，药物等级的稳定剂，缓冲液，防腐剂，赋形剂等等可以由本领域技术人员容易地选择。然而，所述组合物也可以在使用之前冻干或再生。可选地，所述疫苗组合物可以以适于选择给药模式的任何习惯来制备，例如，鼻腔给药，口服给药，等等。药学上可接受的疫苗的制备，由于关系到pH，等渗性，稳定性等等，也在本领域技术之内。

本发明的疫苗组合物的免疫原性可以进一步被增强，如果所述疫苗进一步包含佐剂物质。达到疫苗效果的佐剂的多种方法是公知的。通常的原则和方法描述于“The Theory and Practical Application of Adjuvants”，1995，Duncan E.S.Stewart-Tull(ed.)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6，以及“Vaccines：New Generationn Immunological Adjuvants”，1995，Gregoriadis G等人(eds.)，Plenum Press，New York，ISBN 0-306-45283-9，这两者均在此并入本文作为参考。

优选的佐剂促进疫苗分子被抗原提呈细胞(APC)摄取，例如树状细胞，并活化这些细胞。非限制性实例选自免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂例如毒素，细胞因子，和分支杆菌衍生物；油剂型；聚合物；微囊形成佐剂；皂角甙；免疫刺激复合基质(ISCOMmatrix)；颗粒；DDA(双十八烷基二甲基溴化铵，二甲基二十八烷基溴化铝)；铝佐剂；DNA佐剂；和胶囊佐剂。脂质体剂型也已知具有佐剂效果，因此脂质体佐剂也包括在本发明之内。

本发明的另一个方面涉及具有载体的疫苗，所述载体包含基本上互补于FTR序列(例如，SEQ ID NO：1)的至少12个连续核苷酸的核苷酸序列，如图1、15-18所示，转录启动子，和转录终止子；其中所述启动子可操作地连接至所述FTR核苷酸序列，而且其中所述FTR核苷酸序列可操作地连接至所述转录终止子。DNA疫苗的制备常规地描述于，例如，M.Saltzman，H.Shen，and J.Brandsma，eds.，“DNA Vaccines(Methods inMolecular Medicine)，”Humana Press(2006)；H.Ertl，ed.，“DNAVaccines，”Kluwer Academic/Plenum Publishers(2003)。在一个实施方式里，所述疫苗组合物进一步包含药学上可接受的载体和/或佐剂。DNA疫苗和佐剂的联合已经显示能在人中诱导更强和更专一的免疫反应Hokey等人Springer Semin Immun 28：267-279(2006))通常，当与能提供额外免疫刺激的佐剂相联合的时候DNA疫苗的效力会增强。例如，趋化因子例如MIP-1α当用作DNA疫苗的佐剂时具有募集多种细胞包括专业的抗原提呈细胞(APC)到免疫位点的能力。APC到达具有相对较低水平的APC的位点例如肌肉能极大地增强肌肉内注射的DNA疫苗的效力。细胞因子，例如，GM-CSF用作DNA疫苗的佐剂时能募集树状细胞并促进其在免疫位点上存活。分子佐剂，例如，诱导细胞死亡的Fas，也能够增加DNA疫苗的效力和效果。佐剂介导的细胞凋亡和坏死已经显示向APC提供更多抗原。其它分子例如，聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLG)和热激蛋白也显示能作为DNA疫苗的佐剂。本领域技术人员公知佐剂能联合DNA疫苗作为整个分子例如，整个分子，或作为载体表达这样的分子；例如，表达GM-CSF的质粒。

除了向易感真菌感染例如毛霉菌病的对象进行免疫，本发明的疫苗组合物也可以用于免疫疗法治疗正遭受多种真菌感染的对象。从而，包含一或多个如本文描述的FTR多核苷酸，多肽和/或抗体组合物并与佐剂联合的疫苗，以及其用于预防或治疗用途的目的，也包含在本发明的范围之内。在一个实施方式里，本发明的疫苗将诱导身体的自身免疫系统以找出并抑制真菌FTR分子。

本发明的另一个方面涉及治疗或预防真菌病症的药物组合物，其具有FTR的反义物、小干扰RNA或抗体抑制剂，所述FTR选自基本上互补于FTR序列的部分的核苷酸序列；基本上互补于FTR序列的至少12个连续核苷酸碱基的核苷酸序列；基本上互补于FTR序列的至少18个连续核苷酸碱基的核苷酸RNAi序列；特异性结合FTR核苷酸序列，多肽或其片段的抗体或其抗体片段；和药学上可接受的赋形剂或载体。在一个实施方式里，所述药物组合物进一步包含佐剂。

本发明的反义核酸分子可以用SEQ ID NO：1、图15-18的核苷酸序列，其互补链，和/或其部分或变体来设计，用遗传工程领域公知步骤的酶促连接反应来构建。例如，反义核酸分子(例如，反义寡核苷酸)可以用自然发生的核苷酸或各种修饰的核苷酸来化学合成，设计为与基因的对照区域杂交(例如，启动子，增强子，或转录抑制区域)以通过三倍螺旋形成来抑制FTR基因的表达。可选地，所述反义核酸分子可以设计为与基因的转录物(即，mRNA)杂交，并从而通过抑制转录物与核糖体的结合而抑制FTR的翻译。反义方法和步骤常规地描述于，例如，C.Stein，A.Krieg，eds.，“Applied Antisense Oligonucleotide Technology”Wiley-Liss，Inc.(1998)；或U.S.Patent Nos.5,965,722；6,339,066；6,358,931；和6,359,124。

本发明也提供反义分子、核酸或核苷酸序列，其包含在高度严紧条件下与包含选自SEQ ID NO：1、图15-18或其互补链的核苷酸序列杂交的片段、部分或变体。本发明的核酸片段为至少12个，通常至少15，18，21或25个核苷酸，并可以是40，50，70，100，200，或更多核苷酸的长度。更长的片段，例如，30或更多核苷酸长度，其编码下文所述的抗原多肽，是尤其有用的，例如用于产生抗体。

用于本发明的特别的小核酸分子是双链RNA的短延伸，其被称为小干扰RNA(siRNA)。这些干扰RNA(RNAi)允许在体内FTR基因功能的选择性抑制。在本发明中，RNAi已经用于毛霉菌病感染的DKA小鼠模型中降低FTR表达，这证明了在针对感染的生存和预防上的戏剧性效果。RNAi途径依赖于抗击病毒感染的先天细胞反应。在该过程中，双链mRNA被识别并被二聚RNA酶(dicer RNase)切断，产生21-23核苷酸长度伸长的RNAi。这些RNAi组成RNA-诱导沉默复合物(RISC)并被其解开。然后单独的反义链引导RISC至包含互补序列的mRNA导致mRNA的核苷酸内切，参见Elbashir等人(Nature 411；494-498(2001))。从而，该技术提供了在真菌病原体感染的对象体内靶向和降解FTR mRNA的手段。

本发明进一步提供抑制性抗体(单克隆和多克隆)及其抗原结合片段，它能够结合并抑制FTR功能。本发明的抗体抑制剂能结合FR，或其部分，片段，变体，并干扰或抑制其蛋白功能，即，铁转运。进一步，这些抗体能结合FTR并干扰或抑制真菌膜上的该蛋白的合适定位或形成。抗体，或其抗原结合片段，被称为“特异性结合”，“免疫结合”，和/或“免疫反应”与本发明的FTR多肽，如果它以可检测的水平与FTR多肽反应，而在相似条件下不与不相关的多肽可检测的反应。

此外，重组抗体，例如嵌合和人源化抗体，包括人和非人部分，它们可以用标准重组DNA技术来产生，也在本发明的范围之内。术语“抗体”也包含片段，例如Fab，F(ab’)。本发明的FTR特异性单克隆抗体具有特异性结合引起毛霉菌病的病原性真菌内的FTR或其功能性片段的活性。

单克隆抗体可以用这样的方法来制备，例如，杂交瘤，重组体，噬菌体展示，以及组合抗体技术或其组合。制备单克隆抗体的技术和步骤常规的描述于，例如，Harlow and lane，eds.，“Antibodies：A laboratoryManual，”Cold Spring harbor Laboratory Press(1999)；Harlow等人，UsingAntibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring harbor Laboratory Press(1999)；C.Borrebaeck，ed.，Antibody Engineering：A Practical Guide，W.H.Freemanand Co.，Publishers，pp.130-120(1991)。

而且，本文鉴定的FTR核苷酸序列的部分或片段或变体(以及对应的完整基因序列)可以以多种途径用作多核苷酸试剂。例如，这些序列能用于鉴定和表达重组多肽以分析、表征或治疗性应用。这些序列还能用作下文所描述的筛选和/或诊断检测中的试剂，也可以作为试剂盒(例如，诊断试剂盒)的组分用于筛选和/或诊断分析。

本发明的抑制FTR的组合物可以施用于遭受包括接合菌病和毛霉菌病的多种真菌感染的对象。本发明的组合物可以进一步补充以其他抗真菌试剂(例如，两性霉素，去铁酮，地拉罗司。可选地，本发明的组合物可以预防性施用于具有发展毛霉菌病或其它真菌感染的高风险的所有对象(例如，通过活性免疫)。这将不被认为是过度的治疗，因为考虑到目前抗真菌和外科清创术治疗下毛霉菌病的高死亡率和发病率。

此外，本发明也关注于能产生免疫原性FTR多肽或FTR抑制抗体(例如，RNAi，反义分子)的宿主细胞。术语“宿主细胞”理解为不仅指特定的对象细胞而且包括前述细胞的后代或潜在后代。宿主细胞可以是任何原核(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞，例如SHO或COS细胞)。其它合适的宿主细胞也是本领域技术人员熟知的。表达这样的免疫原性抑制分子的载体可以通过传统的转染或转化技术而引入原核或真核细胞(参见，ambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。

根据本发明的另一个方面，任何上文描述的组合物可以用于治疗或预防真菌病症。真菌病症是有病原性真菌引起的异常状况或感染。可以通过本发明的方法来改善的真菌病症的症状包括，例如，发烧，受寒，盗汗，食欲不振，体重减轻，不舒服，抑郁和肺、皮肤或其它损伤。其它症状和特征性表现包括，例如，原发病灶的扩散，急性或亚急性表现，递增性肺炎，真菌血症，肺外扩散的表现，慢性脑膜炎，一般性牵连网状内皮系统(肝，脾，骨髓)的进行性播散性组织胞浆菌病，以及单独或多重皮肤损伤的酵母病。对患真菌病症的个体的有效治疗，例如，将导致治疗个体的一或多个症状的减轻。真菌病症的众多其它临床症状是本领域公知的并且也可以用本文描述的本发明的方法进行真菌病症的严重性的改善或减轻的测量。

真菌病症的诊断可以通过从例如痰，尿液，血液，骨髓，或来自感染阻止的样本中分离的病因真菌来确认。例如，真菌感染可以基于侵入真菌的不同形态学特征和/或免疫组织化学选择性鉴别抗原而以高度可靠性来进行组织病理学诊断。感染的活性的评价也可以基于取自很多不同位置的培养物，发烧，白细胞计数，与特定的相关器官有关的临床和实验室参数(例如，肝功能检测)，以及免疫血清学检测。痰阳性培养物的临床意义也可以确认组织侵袭。

动物的真菌感染，或接合菌病，包括，例如，浅层真菌感染，其影响皮肤的外层；粘膜包括嘴(真菌性口炎)、阴道和肛门区域的真菌感染，例如由白色念珠菌引起的，以及影响皮肤深层和内脏器官的真菌感染能够引起严重的，经常致命的疾病，例如由Rhizopus oryzae引起。真菌感染是本领域公知的并包括，例如，接合菌病，毛霉菌病，曲霉病，隐球菌病，念珠菌病，组织胞浆菌病，球胞子菌病，镰刀霉病(透明丝孢霉病)，酵母病，青霉病或孢子丝菌病。这些和其它真菌感染可以在以下描述中找到，例如，Merck Manual，Sixteenth Edition，1992，and in Spellberg等人，Clin.Microbio.Rev.18：556-69(2005)。

由念珠菌属的真菌引起的真菌病症，念珠菌病，可以发生在例如皮肤和嘴的粘膜，呼吸道和/或阴道以及侵入血流，尤其在免疫缺陷个体内。念珠菌病(Candidiasis)在本领域也被称为candidosis或moniliasis。念珠菌属的示例性物种包括，例如，白色念珠菌(白色念珠菌)，克鲁斯念珠菌(Candidakrusei)、热带念珠菌(热带假丝酵母)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)和近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)。

由曲霉属引起的真菌疾病包括，例如，过敏性曲霉病，其影响哮喘，囊性纤维化和窦炎患者；急性侵入性曲霉病，其在免疫活化的患者例如癌症患者、经历化疗的患者和AIDS患者中显示发病率增加；扩散性侵入性曲霉病，其广泛散布于体内，以及机会性曲霉感染，其特征为耳和其它器官的炎症和损伤。曲霉是具有大约200中真菌的属。引起侵入性疾病的曲霉物种包括，例如，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和黄曲霉(Aspergillusflavus)。引起过敏性疾病的曲霉物种包括，例如，烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和棒曲霉(Aspergillus clavatus)。其他示例性的的曲霉属传染性物种包括，例如，土曲霉(Aspergillus terreus)和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)。

由腐生性霉菌引起的真菌病症例如接合菌病和毛霉菌病包括鼻脑毛霉菌病、肺毛霉菌病、肠胃毛霉菌病、播散性毛霉菌病、骨毛霉菌病、纵隔毛霉菌病、气管毛霉菌病、肾毛霉菌病、腹膜毛霉菌病、上腔静脉毛霉菌病或外耳炎毛霉菌病。引起毛霉菌病的感染性因素是毛霉目，包括根霉属的物种例如米根霉(Rhizopus oryzae)(Rhizopus arrhizus，少根根霉)，小孢根霉足样亚种(Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)；或腐化米霉菌属的物种例如伞状犁头霉(Absidia corymbifera)；或鳞质霉属的物种例如雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)；或毛霉属的物种例如Mucor amphibiorum；或根毛霉属的物种例如微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)；或小克银汉霉属(在小克银汉霉科中)的物种例如灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)。

本文描述在治疗毛霉菌病或其他真菌疾病中有效抑制FTR分子和/或其功能的多种方法。这些抑制方法涉及疫苗，反义物，siRNA，抗体，或其它任何能有效靶向并抑制FTR活性的组合物。这样的方法将通过抑制主要的铁转运来降低或阻止感染组织中真菌的生长，其中铁转运在想病原体生物提供铁中起作用。使用可溶性FTR多肽或其功能性片段或变体进行的铁转运的免疫疗法抑制在这方面很有用，因为：(i)毛霉菌病相关的致病率和死亡率，例如，持续增长，即使在目前允许的抗真菌治疗下；(ii)抗真菌耐受性的发生率的上升与抗真菌试剂的使用相联系；(iii)严重接合菌病，毛霉菌病，念珠菌病，或曲霉病风险中的患者人群，举例来说，被明确定义并非常庞大，并且包括，例如，手术后患者，移植患者，癌症患者，低出生重婴儿，糖尿病酮酸中毒(DKA)和其它形式的代谢酸中毒的患者，接受皮质激素治疗的对象，具有中性白细胞减少，外伤，烧伤，和恶性血液紊乱的患者，以及接受去铁胺螯合疗法或血液透析的患者；和(iv)发展严重真菌感染的患者高百分比不是嗜中性白细胞减少，从而能对疫苗或竞争性多肽或化合物抑制剂作出反应。由于这些原因，接合菌和念珠菌，例如，是被动免疫、主动免疫疗法或被动和主动免疫疗法相结合的真菌目标。

机械学方面，FTR多肽在酵母中与铜氧化酶物理性复合，几乎同时转运铁离子至氧化步骤。在患DKA的对象中，低pH状况引起质子介导的铁离子(Fe³⁺)从血清中载体分子上分离，包括转铁蛋白(T)。参见图4。随后Fe³⁺在细胞表面被还原为亚铁离子(Fe²⁺)。作为对照，去铁胺(D)直接螯合来自转铁蛋白的铁，产生铁胺(铁-去铁胺复合物)。然后铁胺结合至真菌表面未确认的受体，例如，接合菌。真菌然后通过在细胞表面还原铁胺而释放亚铁离子。在两种情况下亚铁离子均由铜氧化酶(Cu-oxidase)重新氧化回铁离子。

因此，本发明的抑制FTR的方法可以施用于遭受多种真菌感染的对象，包括接合菌病和毛霉菌病。本发明的方法能进一步补充其他抗真菌试剂(例如，两性霉素，去铁酮，地拉罗司)。可选地，本发明的方法可以预防性施用于具有发展毛霉菌病或其它真菌感染的高风险的对象(例如，通过主动免疫)。这将不被认为是过度的治疗，因为考虑到目前抗真菌和外科清创术治疗下毛霉菌病的高死亡率和发病率。

相应的，在一个方面，本发明提供治疗或预防扩散性毛霉菌病或其它真菌疾病的方法。该方法包括给药免疫原量地疫苗，所述疫苗具有图2显示的FTR多肽(SEQ ID NO：2)，或该多肽的抗原或免疫原片段或其变体，在药学上可接受的介质中。疫苗的制备常规的描述于，例如，M.F.Powell和M.J.Newman，eds.，“Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)，”Plenum Press(1995)；A.Robinson，M.Cranage，and M.Hudson，eds.，“VaccineProtocols(Methods in Molecular Medicine)，”Humana Press(2003)；以及D.Ohagan，ed.，“Vaccine Ajuvants：Preparation Methods and ResearchProtocols(Methods in Molecular Medicine)，”Humana Press(2000)。

FTR多肽，或该多肽的抗原性或免疫原性片段或其变体，可以源自接合菌的不同的病原性真菌物种例如米根霉(Rhizopus oryzae)(Rhizopusarrhizus，少根根霉)，小孢根霉足样亚种(Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)，伞状犁头霉(Absidia corymbifera)、雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)，毛霉物种，微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)和小克银汉霉属物种(小克银汉霉科)；或不同的念珠菌属物种，例如白念珠菌(白色念珠菌)，克鲁斯念珠菌(Candida krusei)，热带念珠菌(热带假丝酵母)，光滑假丝酵母(Candida glabrata)，和近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)；或不同的曲霉属物种，例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，黑曲霉(Aspargillus niger)，黄曲霉(Aspergillus flavus)，土曲霉(Aspergillusterreus)，和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。本发明的疫苗的给药将导致对象中真菌病原体的生长和/或毒性的抑制。

同源于例如米根霉的FTR和酿酒酵母和白色念珠菌的序列进一步描述于实施例1。由于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解本发明的疫苗和方法能用于治疗毛霉菌病和其它真菌感染。类似的，由于本文描述的方法和教导，本领域技术人员将理解本发明的疫苗和方法也能用于其它具有铁通透酶多肽的病原体，所述多肽具有与本文描述的FTR蛋白相似的免疫原性，序列和/或结构同源性，包括真菌和细菌等等。

所述疫苗组合物以可接受的剂量配方和能预防性影响的量并含有或不含佐剂的方式来给药。给药的量通常在1-10mg范围，优选1-10μg抗原每剂量，取决于所治疗的对象，对象的免疫系统合成抗体的能力，以及期望的保护程度。需要给药的活性成分的精确量可以取决于医师的判断并对每个对象各不相同。此外，多肽在每个疫苗剂量中的量挑选为能诱导免疫保护反应的致免疫量。尤其有用的致免疫量包括不会产生显著副作用的FTR多肽的量。这样的量将依据选作疫苗的FTR多肽的致免疫强度而变化。FTR多肽或其免疫原片段的有益的致免疫量包括，例如，大约1-1000μg范围内的剂量。在某些实施方式里，FTR多肽或其免疫原片段的有益的致免疫量包括大约2-100μg，特别有益的剂量范围可以在4-40μg的范围，包括例如5，6，7，8，9，10，12，15，20，25，30，35和40μg，以及在上述例举的量之间的数值。本发明选定的FTR多肽疫苗的最优的致免疫量可以用本领域公知的方法来确定，例如确定抗体效价和如前所例举的对象中的其它免疫反应。在初次接种之后，对象在大约3-4周之内接受加强。疫苗递送方法进一步描述于，例如，S.Cohen和H.Bernstein，eds.，“Microparticulate Systemsfor the Delivery of Proteins and Vaccines (Drugs and The PharmaceuticalSciences)，”Vol.77，Marcel Dekker，Inc.(1996)。包囊于脂质体之内描述于，例如，Fullerton，U.S.Pat.No.4,235,877。蛋白质连接大分子描述于，例如，Likhite，U.S.Pat.No.4,372,945和Armor等人，U.S.Pat.No.4,474,757。

此外，本发明的疫苗组合物包括编码抗原FTR分子的DNA疫苗。如前文所提及的，DNA疫苗的制备常规地描述于，例如，M.Saltzman，H.Shen，和J.Brandsma，eds.，“DNA Vaccines(Methods in MolecularMedicine)，”Humana Press(2006)；H.Ertl，ed.，“DNA Vaccines，”KluwerAcademic/Plenum Publishers(2003)。DNA疫苗可以通过多种表达系统引入所述对象的宿主细胞。这些表达系统包括原核，哺乳动物，和酵母表达系统。例如，一种途径是使用病毒载体，例如整合了新的遗传材料的牛痘病毒，以无毒化所述宿主细胞。可选地，所述遗传材料可以整合进载体或直接以“裸露”多核苷酸递送进入宿主细胞，即，仅作为纯化的DNA。另外，所述DNA能稳定转染进入削弱的细菌例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)。当对象用转化的沙门氏菌口服接种时，该细菌转运进入消化道的派伊尔氏结(即，次级淋巴系统)，这随后刺激免疫反应。另外，DNA疫苗可以以公知的递送载体例如，油脂单层膜，双层膜，或载体例如脂质体来递送。试剂例如皂角苷和封闭共聚物，它们通常用于通透化的细胞，也能与DNA疫苗一起使用。如前所述，本发明的DNA疫苗组合物可以包括药学上可接受的载体和/或佐剂。

本文描述的DNA疫苗组合物可以以本发明预期的多种通道来给药。这些通道包括鼻内、经口、直肠、阴道、肌肉内、皮内和皮下给药。

用于肠胃外给药的DNA疫苗组合物包括无菌水相或非水相溶液，悬浮液或乳浊液，蛋白质疫苗，和如本文所述的佐剂。所述组合物可以是液体、悬浮液或无菌固体的形式，并能在使用之前溶于无菌可注射介质。肠胃外给药优选肌肉内。肌肉内接种包括通过注射器向肌肉进行注射。所述注射可以通过注射器或同等途径来进行。所述疫苗组合物可以包含药学上可接受的载体和/或佐剂。可选地，该疫苗组合物可以通过粘膜途径而给药，以合适的剂量和液体形式。对于经口给药，所述疫苗组合物可以以液体或固体的形式与合适载体一起给药。

本发明也提供在有需要的对象中治疗或预防真菌病症的方法，包括将所述真菌暴露于针对FTR的反义物。在一个实施方式里，所述反义物包含基本上与FTR核苷酸序列的部分互补的核苷酸序列。在另一个实施方式里，，所述反义物的核苷酸序列基本上互补于FTR序列的至少12个连续核苷酸。

根据本发明所使用的反义寡核苷酸可以通过公知的固相合成技术而方便地和常规地合成。这种合成的设备由包括Applied Biosystems等多个商家出售。这种合成的任何其他途径也可以使用，然而寡核苷酸的实际合成是本领域技术人员所公知的。使用类似的技术以制备其他寡核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。如前所述，反义核酸分子(例如，反义寡核苷酸)可以用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸来化学合成，并设计为杂交于基因的对照序列(例如，启动子、增强子或转录抑制区域)以通过三倍螺旋体形成而抑制FTR基因的表达。可选地，所述反义核酸分子可以设计为杂交于FTR的转录物(即，mRNA)，并从而通过抑制转录物结合至核糖体而抑制FTR的翻译。反义方法和步骤常规地描述于，例如，C.Stein，A.Krieg，eds.，“Applied Antisense Oligonucleotide Technology”Wiley-Liss，Inc.(1998)；或U.S.Patent Nos.5,965,722；6,339,066；6,358,931；和6,359,124。

本发明的反义组合物可以以本领域已知的各种方法递送给有需要的对象。例如，微粒例如包含科释放形式的反义组合物的聚苯乙烯微粒，生物可降解颗粒，脂质体或微泡可以用于将组合物通过注射直接递送到组织。在某些实施方式里，所述反义寡核苷酸可以在以下途径制备和递送：病毒载体例如乙肝病毒中(参见，例如，Ji等人，J.Viral Hepat.4：167 173(1997))；腺关联病毒(参见，例如，Xiao等人Brain Res.756：76 83(1997))；或其它系统包括但不限于HVJ(Sendai病毒)-脂质体基因递送系统(参见，例如，Kaneda等人Ann.N.Y.Acad.Sci.811：299 308(1997))；“肽载体”(参见，例如，Vidal等人CR Acad.Sci III 32)：279 287(1997))；作为附加体活质粒载体中的基因(参见，例如，Cooper等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：6450 6455(1997)，Yew等人Hum Gene Ther.8：575 584(1997))；作为肽-DNA集合体中的基因(参见，例如，Niidome等人J.Biol.Chem.272：15307 15312(1997))；作为“裸露基因”(参见，例如，U.S.Pat.No.5,580,859和U.S.Pat.No.5,589,466)；在脂载体系统中(参见，例如，Lee等人Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.14：173 206(1997))；聚合物包被的脂质体(Marin等人，U.S.Pat.No.5,213,804 issued Can 25，1993；Woodle等人，U.S.Pat.No.5,013,556 issued Can 7，1991)；阳离子脂质体(Epand等人，U.S.Pat.No.5,283,185 issued Feb.1，1994；Jessee，J.A.U.S.Pat.No.5,578,475 issued Nov.26，1996；Rose et al，U.S.Pat.No.5,279,833 issued Jan.18，1994；Gebeyehu等人，U.S.Pat.No.5,334,761 ssued Aug.2，1994)；充气的微球体(Unger等人，U.S.Pat.No.5,542,935 issued Aug.6，1996)，配体-靶向的胶囊大分子(LoW等人U.S.Pat.No.5,108,921 issued Apr.28，1992；Curiel等人，U.S.Pat.No.5,521,291issued Can 28，1996；Groman等人，U.S.Pat.No.5,554,386 issued Sep.10，1996；Wu等人，U.S.Pat.No.5,166,320 issued Nov.24，1992)。

本发明也提供在有需要的对象中治疗或预防真菌病症的方法，包括将所述真菌暴露于针对FTR的小干扰RNA。在一个实施方式里，使用基本上互补于FTR序列的至少18个连续核苷酸碱基的核苷酸RNAi序列，其能够结合至FTR核苷酸序列或其片段。

双链RNA(dsRNA)也被称为小干扰RNA(siRNA)，在很多物种中通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程来诱导序列特异的转录后基因沉默。在本发明中，如实施例9所述，RNAi被制备并用于降低毛霉菌病感染的DKA小鼠模型中的FTR表达，在做这些之后其证明了在针对感染的存活和保护中具有戏剧性的效果。

siRNA通常作为药物组合物来给药。所述给药可以通过已知方法来进行，其中核酸分子引入预定的体内或体外的目标细胞。通常使用的基因转移技术包括磷酸钙，DEAE葡聚糖，电穿孔和微注射和病毒方法(Graham等人Virol.52，456(1973)；McCutchan等人J.Natl.Cancer Inst.41，351(1968)；Chu等人Nucl.Acids Res.15，1311(1987)；Fraley等人J.Biol.Chem.255，10431(1980)；Capecchi，Cell 22，479(1980)；和阳离子脂质体(Feigner等人Proc.Natl.Acad.Sci USA 84，7413(1987))。商业上允许的阳离子液体配方是例如Tfx 50^TM(Promega)或Lipofectamin2000^TM(Invitrogen)。

本发明也提供在有需要的对象中治疗或预防真菌病症的方法，包括FTR抗体抑制剂。在一个实施方式里，所述FTR抗体抑制剂是抗体或特异性结合FTR核苷酸多肽或其片段的抗体片段。

如前文所述FTR抗体抑制剂能结合并抑制FTR功能。本发明的抗体抑制剂能结合FTR，其部分，片段，或变体，并干扰或抑制蛋白功能，即，铁转运。这些抗体能通过消极影响例如蛋白的合适的膜定位、折叠或构象、底物结合能力而抑制FTR。

本发明的抗体可以通过本领域已知的任何合适的方法来产生。针对FTR的多克隆抗体可以通过本领域公知的多种程序来生产。例如，FTR多肽抗原可以给药于多种宿主动物包括，但不限于，兔，小鼠，大鼠，等等来诱导包含对所属抗原特异性的多克隆抗体的血清。多种佐剂可以用于增加其免疫学反应，依赖于宿主物种，包括但不限于，弗氏(完全和不完全)，矿物凝胶例如氢氧化铝，明矾(水凝胶)，表面活性物例如溶血卵磷脂，多羟基聚醚，聚阴离子，肽，油乳浊液，钥孔戚血蓝蛋白二硝基酚，和潜在用于人的佐剂例如BCG(bacille Calmette-Guerin)和小型棒状杆菌。这些佐剂是本领域所公知的。

适合产生本发明的抗体的FTR肽抗原可以依据公知技术来设计、构造和使用。参见，例如，ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，Chapter5，p.75-76，Harlow & Lane Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；Czernik，Methods In Enzymology，201：264-283(1991)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：21-49(1962))。本发明的单克隆抗体可以用本领域已知的多种技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或其组合。例如，单克隆抗体可以用杂交瘤技术来产生，包括本领域已知的并描述于，例如，Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling，等人，Monoclonal Antibodiesand T-CeIl Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述参考文献整体并入作为参考)。

本发明的抗体也可以用本领域已知的各种噬菌体展示技术来产生。在噬菌体展示技术中，功能性抗体结构域展示于噬菌体颗粒的表面，其携带编码它们的多核苷酸序列。在特别的实施方式里，这些噬菌体能用于展示由全部或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。表达能结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原来筛选或鉴别，例如，使用标记的抗原或抗原结合至或捕捉至固体表面或颗粒。用于该方法的典型噬菌体是丝状噬菌体，包括噬菌体表达的fd和M13结合结构域，以及Fab，Fv或二硫键稳定化的Fv抗体结构域，其重组融合于噬菌体基因III或基因VIII蛋白。可以用于制备本发明的抗体的噬菌体展示方法的实例包括描述于以下文献：U.S.Pat.Nos.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；其中每篇均被整体并入本文作为参考。

本发明的抗体可以通过本领域已知的任何方法来检测器免疫特异性结合。可用的免疫分析包括但不限于竞争性和非竞争性分析系统，并使用技术例如蛋白质印迹、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、“三明治”免疫分析、免疫沉淀反应分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析，或以其它命名。这些分析和途径是本领域公知的。参见，例如，Sambrook，Fitsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。

特异性结合可以通过本领域技术人员已知的任何种类的量度来确认，包括，例如，亲和力(K_a或K_d)，关联率(k_on)，解离率(k_off)，活性或其组合。本发明的抗体也可以以其结合FTR的亲和力来描述或说明。优选的结合亲和力包括解离常数Kd小于5×10^-2M，10^-2M，5×10^-3M，10^-3M，5×10^-4M，10^-4M，5×10^-5M，10^-5M，5×10^-6M，10^-6M，5×10^-7M，10^-7M，5×10^-8M，10^-8M，5×10^-9M，10^-9M，5×10^-10M，10^-10M，5×10^-11M，10^-11M，5×10^-12M，10^-12M，5×10^-13M，10^-13M，5×10^-14M，10^-14M，5×10^-15M，或10^-15M。

本发明的抗体可以用作FTR抑制剂的示例性途径包括在身体内局部或系统地结合至并抑制FTR多肽或者通过直接的抗体细胞毒性，例如有补体(CDC)或效应细胞(ADCC)介导的。本发明的抗体可以与其它单克隆抗体或嵌合抗体结合使用，或与淋巴因子或造血生长因子(例如，IL-2，IL-3和IL-7)，例如，其服务于增加对所述抗体感兴趣的效应细胞的数量或活性。

本发明的抗体可以单独给药或与其它类型的疗法组合给药，例如，抗真菌疗法。在一个实施方式里，FTR抑制剂抗体给药于人类患者以治疗或预防。

已知多种递送系统并能用于给药本发明的抗体抑制剂，例如，包囊于脂质体中，微粒，微胶囊，重组细胞。引入的方法包括但不限于皮内，肌肉内，腹膜内，静脉内，皮下，鼻内，硬脑膜外，或经口途径。

所述化合物或组合物可以通过任何方便的途径来给药，例如通过输注或大丸剂注射，通过上皮或粘膜内存吸收(例如，口腔黏膜，直肠和肠道粘膜，等等)并可以与其它生物活性试剂一起给药。给药可以是系统性的或局部的。肺部给药可以通过例如使用吸入器或喷雾器来完成，并与成雾试剂一起配方。

对于抗体，向对象给药的剂量典型的是0.1mg/kg至100mg/kg对象体重。优选的，向对象给药的剂量是0.1mg/kg至20mg/kg对象体重，更优选1mg/kg至10mg/kg对象体重。通常，人源化或人抗体在人体内具有比来自其它物种的抗体更长的半衰期，这是由于对外来多肽的免疫反应。因此，更低剂量的人源化抗体和更不频繁的给药经常是可行的。进一步，可以通过例如脂肪化来增强抗体摄取和组织穿透(例如，至脑)从而降低本发明的抗体给药的剂量和频率

在药学剂量形式里，本发明的组合物包括疫苗，反义物，siRNA和抗体可以单独使用或适当的联合使用，以及结合使用，相互之间或与其它药物活性化合物。这些试剂的给药可以以各种途径来达到，包括经口，口腔，鼻内，直肠，肠胃外，腹膜内，皮内，穿过表皮，皮下，静脉内，动脉内，心脏内，心室内，颅内，气管内，和鞘内给药，等等，或通过输注或吸入的其它形式。因此，对象组合物可以制备为固体、半固体、液体或气体形式的剂型，例如片剂、胶囊、粉、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、灌肠、注射、吸入药和气溶胶。随后的方法和实例仅仅是示例性的而不限制任何途径。

本文公开的任何治疗形式都可以组合并给药于忍受真菌感染或者处于发展真菌感染的风险之中的对象(预防性疫苗或治疗)。在一种组合疗法中，例如，对象可以首先接受本发明的疫苗以产生针对真菌的免疫反应，然后反义物，siRNA和/或抗体，其靶向真菌FTR，并进一步增强真菌治疗。在所述治疗的一个实施方式里，本发明的疫苗与反义物，siRNA和/或针对FTR的抗体组合使用以治疗或预防真菌病症例如毛霉菌病。在另一个实施方式里，本发明的抗体与反义物和/或siRNA组合使用以治疗真菌病症。

本发明的组合物，包括单独或组合使用，可以进一步与一朵多种真菌治疗的合适方法或组合物联合。在一个实施方式里，本发明的组合物与相应的外科方法一起使用以治疗真菌感染。在另一个实施方式里，本发明的组合物与药物或放射疗法联合使用以治疗真菌病症。可用于与本发明的组合物联合治疗的抗真菌药物包括，但不限于，两性霉素B，铁螯合剂例如地拉罗司，去铁酮，POSACONAZOLE

FLUCONAZOLE

ITRACONAZOLE

和/或KETOCONAZOLE

可用于联合疗法治疗真菌感染的的辐射包括电磁辐射例如，用于治疗真菌感染的特定波长和能量的近红外辐射。在联合疗法中，化学疗法或放射典型地随后接着以这样的方式给药疫苗，使得有效抗真菌免疫反应的形成不被先前治疗的潜在副作用而损害。

在联合疗法的进一步的实施方式里，本发明的组合物与免疫细胞因子治疗相联合。不希望限于理论，人们相信，例如，当促进免疫反应的细胞因子存在于感染的位点时，疫苗能产生更有效的针对例如感染的免疫反应。例如，有用的免疫细胞因子是引起Th1反应的那些，例如IL-2或IL-12。在联合疗法期间，例如，对象可以首先接受本发明的疫苗以产生针对真菌感染的免疫反应，然后是靶向所述真菌并支持免疫反应对抗所述感染的免疫细胞因子。优选的免疫细胞因子代表性的具有，例如，识别真菌的表面抗原特征例如FTR的抗体部分。免疫细胞因子代表性的具有细胞因子部分例如IL-2，IL-12，或其它优先导向Th1反应的那些。适合于本发明的免疫细胞因子描述于U.S.Pat.No.5,650,150，其内容在此整体并入作为参考。

在联合疗法的另一个实施方式里，本发明的组合物的联合可以是伴随给药，例如，作为混合物，分开但是同时地或并发地；或者顺序地。这包括这样的说明，其中所述联合试剂与治疗混合物一起给药，以及这样的程序，其中所述联合试剂分开或同时给药，例如，通过分离的静脉线进入同样的个体。“联合”给药进一步包括一种首先给予的化合物或试剂，随后第二种分开给药。在另一个特定的实施方式里，本发明的组合物与以下任意联合：两性霉素B，地拉罗司，去铁酮，POSACONAZOLE

FLUCONAZOLE

ITRACONAZOLE

和/或KETOCONAZOLE

以预防性治疗，预防，和/或诊断机会性真菌感染。

从而，本发明提供了通过向对象给药以有效量的一或多种本发明的化合物或药物组合物以治疗、抑制和预防的方法。在一个优选的方面，本发明的组合物被基本上纯化(例如，基本上不含限制其效果或产生不希望的副作用的物质)。所述对象优选动物，包括但不限于动物例如牛，猪，马，鸡，猫，狗，等等，并优选哺乳动物，更优选人。

如前问所讨论，已知多种递送系统并能用于给药本发明的组合物。所述组合物能通过任何合适的途径来给药，例如通过输注或大丸剂注射，通过上皮或粘膜内层的吸收(例如，口腔粘膜，直肠和肠道粘膜，等等)并能与其它生物活性试剂一起给药。给药可以是系统性的或局部的。

在一个特定的实施方式里，可以期望将本发明的药物化合物或组合物施用于有治疗需要的局部区域；这可以通过以下方法而达到，例如，但不限于，外科手术期间的局部输注，局部滴旋，例如，与外科手术后产生的创口相联系，通过注射，通过导管，通过栓剂，或通过插入物，所述插入物具有一种多孔的、非多孔的或胶粘的材料，包括膜，例如sialastic膜，或纤维。优选的，当给药本发明蛋白质，包括疫苗或抗体，必须小心使用不吸附所述蛋白的材料。在另一个实施方式里，所述化合物或组合物可以以脂质体的形式递送。在另外一个实施方式里，所述化合物或组合物可以在控制释放体系中递送。

在一个实施方式里，所述组合物根据药物组合物的常规程序来配方，并改变以适应静脉内给药于人类。代表性的，静脉内给药的组合物是无菌等渗水相缓冲液中的溶液。在需要的地方，所述组合物也可以包括加溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因以减少感染位置的疼痛。常规地，成分以分离的或混合的单位剂量形式提供，例如，密封容器中的冻干粉或无水浓缩物例如指示活性试剂的量的安瓿瓶。在所述组合物通过输注来使用的地方，其可以分散在含有无菌药学等级的水或盐水的输注瓶中。在所述组合物通过注射来给药的地方，可以使用用于注射的无菌水或盐水的安瓿瓶以在给药之前混合所述成分。

本发明的化合物也能配方为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，例如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸等等衍生的盐，以及与阳离子形成的盐，例如由钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等衍生的盐。

本发明的化合物或组合物在治疗、抑制和预防真菌疾病或病症中有效的量可以通过标准临床技术来确定。另外，体外检测能任选的用于协助鉴别优化的剂量范围。配方中所用的精确剂量也依赖于给药途径，以及所述疾病或病症的严重性，并可以根据医师的判断和每个患者的情况来确定。有效剂量可以从来自体外或动物模型测试体系的剂量-反应曲线来推断。

下述的实施例例证了FTR作为预防处理或治疗扩散性毛霉菌病的基础的治疗用途。实施例1描述了克隆和鉴定FTR。实施例2描述了在贫铁条件下米根霉的FTR表达。实施例3描述了酿酒酵母ftr1缺失突变株中的FTR表达。实施例4描述了酿酒酵母ftr1缺失突变株中FTR的功能。实施例5，描述了毛霉菌病动物模型的开发。实施例6描述了血清铁对DKA小鼠对米根霉易感性的效果。实施例7描述了米根霉感染的DKA小鼠体内FTR的表达。实施例8描述了FTR多肽及其与其它蛋白的同源性。实施例9描述了FTR基因产品对血源性播散性毛霉菌病的DKA小鼠模型中米根霉毒性的作用。

应当理解，基本上不影响本发明的各种实施方式的活性的修饰也包括在本文提供的本发明的定义范围之内。从而，下述实施例意在例证但不限制本发明。

实施例1 FTR的克隆与鉴定

该实施例描述米根霉的FTR的克隆与鉴定，其展示与酿酒酵母和白色念珠菌的高亲和力铁通透酶较大的序列同源性。

下文描述在本实施例中描述的步骤中使用的材料与方法。与本发明相一致，可以使用本领域通常的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中被完整地解释。参见，例如，Sambrook，Fitsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。

Rhizopus oryzae 99-880从真菌检测实验室(Fungus Testing Laboratory，University of Texas Health Science Center at San Antonio)获得。该菌株从一位有鼻脑型毛霉菌病的糖尿病患者的脑脓肿中分离。

为了克隆米根霉的FTR，我们采用由酿酒酵母FTR的保守区域设计的简并引物从米根霉基因组DNA扩增0.6kb的片段。该片段显示与酿酒酵母43％的同源性并与米根霉基因组DNA用EcoRI切断后的2.0kb的片段杂交。我们使用该PCR-产生的片段来筛选λ-噬菌体中制备的米根霉基因组文库。分离出5个不同的菌斑，每个分别含有不同限制性酶处理之后的2kb片段。这2.0kb基因组克隆的序列分析显示出一个1101bp的单独开放阅读框且不含内含子。该推定的FTR多肽与GenBank数据库中的其它蛋白的比较显示其具有与来自白色念珠菌和酿酒酵母的已知的真菌高亲和力铁通透酶分别为46％和44％的一致性(Fu等人FEMS Micorbiol.Lett.235：169-176(2004)))。预测的FTR多肽的氨基酸序列的多个区域显示出与来自酿酒酵母和白色念珠菌FTR的推定跨膜结构域显著的同源性。重要的是，推定的REGLE基序(其中该基序中的谷氨酸残基被认为直接与铁结合)在这三个物种的推测的FTR多肽的氨基酸序列中是保守的并植入该蛋白的一个疏水区域。此外，米根霉基因组DNA用EcoRI、DraI或EcoRI+DraI切断并用FTR的OFR探测的Southern印迹分析确认了FTR的基因图谱。使用FTR的ORF在低严紧条件下的米根霉gDNA的Southern印迹分析不显示任何条带，因此证明了该FTR不是一个基因家族的成员(数据未显示)。

实施例2 缺铁条件下FTR在米根霉中的表达

本实施例显示了在缺铁条件下FTR的高水平表达。

高亲和力铁通透酶的表达通常在铁受限的环境中被诱导而在富含铁的环境中被抑制。为了验证FTR多肽作为高亲和力铁通透酶的功能，我们检测了FTR表达对不同浓度的FeCl₃的反应。米根霉菌丝体通过过滤来收集并用于接种在马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)中，所述马铃薯葡萄糖肉汤补加了铁鳌合剂，1mM菲洛嗪和100μM的2，2’-二吡啶基，以诱导铁缺乏。所述菌丝体转移至事先螯合了铁的PDB中，补加不同浓度的FeCl₃，37℃培养选定的间隔。如预期一样，在任何时间点当该生物体暴露于缺乏FeCl₃的培养基时，FTR表达被诱导。FeCl₃的添加导致在5分钟之后FTR表达就被快速抑制。进一步，FTR表达的抑制显示出剂量依赖性，与50μM FeCl₃相比，350μM FeCl₃时FTR mRNA的快速降低更为明显。与这些结果相一致，当菌丝体在富含铁培养基PDB中生长时，FTR表达是检测不到的。这些结果证明了FTR在缺乏铁的环境中被诱导，在富含铁的环境中被抑制，以及其转录被培养基中的铁的量紧密地调节(图5)。这种紧密的转录调节已经在酵母中被报道，并且这可能是由于其转录活性改变在细胞内铁浓度的敏感性。这种紧密调节很可能允许生物体避免铁过剩引起的毒性。应当注意，这些结果也证明FTR也可能在体内表达(见下文)即使是具有提高的可用血清铁的宿主中，因为在这些宿主中的游离铁浓度仍然认为是比现实诱导FTR的最高浓度(即，50μM)低好几个数量级。例如，我们发现DKA小鼠在其血清中具有7.29μM的可用铁(参见下文)。此外，Artis等人证明了从DKA患者中收集的血清包含12.4μM可用铁(Artis等人，Diabetes 31(12)：1109-14(1982))。

实施例3 酿酒酵母ftr1缺失突变株中的FTR表达

本实施例现实了酿酒酵母ftr1缺失突变株中米根霉FTR的表达恢复了酿酒酵母在缺铁环境中生长的能力。

为了确定FTR是否功能上等同于酿酒酵母FTR，我们测试了FTR能否拯救酿酒酵母ftr1缺失突变株的铁依赖性生长缺陷。酿酒酵母用包含在可诱导GAL1启动子控制之下的FTR的质粒转化(即，仅在存在半乳糖时表达)。转化了FTR的酿酒酵母在含半乳糖的铁受限培养基(50μM铁)中培养时生长。作为对比，当FTR转化细胞在包含葡萄糖的平板上培养的时候未观察到生长，该培养基不能诱导GAL1启动子的活性，以及FTR的转录(图6)。同预期一样，酿酒酵母仅含有空载体的转化株(阴性对照)在缺乏铁的培养基上不生长，即使在半乳糖存在时。所有酿酒酵母转化株在含有或者葡萄糖或者半乳糖的富含铁平板上(350μM)生长得同样好，可能是因为酿酒酵母低亲和力铁通透酶的存在，其被认为在富含铁的环境中发挥功能(图8)。

实施例4 FTR补足的酿酒酵母ftr1缺陷突变株摄取铁

本实施例显示了米根霉FTR在酿酒酵母内编码功能性多肽。

为了确认酿酒酵母ftr1缺失突变株中FTR介导的生长拯救是因为铁摄取的增加，我们比较了用GAL1启动子控制下的米根霉FTR转化的酿酒酵母与包含空载体的转化株摄取⁵⁹Fe的动力学。用空载体转化的ftr1缺失突变株细胞在59FeCl₃以0.1μM补充时(该浓度下仅仅高亲和力铁通透酶是活性的)显示没有细胞内铁积累。作为对比，FTR引入酿酒酵母ftr1缺失突变株恢复了铁摄取相对于野生型菌株展现的量的48-60％之间(图7)。

总之，实施例3和4显示我们克隆了一个基因(FTR)，其再米根霉中在铁缺乏培养基中表达，在富含铁培养基中被抑制，并且通过拯救突变株在贫铁培养基摄取铁的能力而补充了酿酒酵母的高亲和力铁通透酶缺失突变株的生长缺陷。作为总结，这些数据强力的证明了FTR多肽编码高亲和力米根霉铁通透酶，并且证实了FTR多肽在酿酒酵母中的产生，因为米根霉基因在酿酒酵母中被功能性表达。

实施例5 毛霉菌病的动物模型的开发

为了研究任何疾病的发病机理，需要开发概括了相关临床特点的动物模型。本实施例显示我们开发了与毛霉菌病相关的动物模型，血源性播散型毛霉菌病感染的DKA小鼠模型。

我们通过使用腹膜链脲菌素单独注射而成功开发了血源性播散型毛霉菌病的DKA小鼠模型。我们选择该模型是因为DKA患者处于发展毛霉菌病的高风险中。与期望相符，我们发现DKA小鼠比正常小鼠对米根霉感染更加易感。在静脉内接受10⁴孢子7天之后，患有DKA的所有小鼠都死亡，而40％的感染的非糖尿病小鼠存活(图8)。

为了评估感染的严重性，我们比较了基于定量PCR(qPCR)(TaqMan)分析的组织克隆计数，其最初被用于确定烟曲霉的动物模型中的疾病进展。由于菌丝结构被组织均匀性所干扰，导致真菌死亡和器官真菌损伤的不准确低估，克隆计数方法对确定模型的组织真菌损伤是不可靠的，因此开发了TaqMan技术。事实上，正如预期一样，米根霉感染期间的克隆计数没有增加并且不与死亡率相联系。相反，当使用设计为扩增米根霉18s rDNA的引物进行基于qPCR(TaqMan)的技术来定量组织米根霉损伤的时候，发现组织真菌损伤的增加与死亡率的发作之间有时间相关性(图9)。这些结果与我们的初始结果相一致，其中具有米根霉菌液变化的花穗的小鼠组织显示出检测的线性分布。因此，qPCR分析是一种评估DKA小鼠模型中毛霉菌病的进程的灵敏而可信赖的方法。

这种分析被用于阐明铁代谢在该疾病的发病机理中的作用。

实施例6 血清铁可用性在DKA小鼠对米根霉的易感性中的效果

本实施例显示了DKA小鼠对米根霉的易感性部分是因为可用的血清铁的提高。

为了确认可用铁使得糖尿病小鼠更易感米根霉感染，我们通过Artis等人(1982，supra)的方法比较了DKA小鼠与正常小鼠中血清铁的水平。与人类中发现的结果相一致，DKA小鼠(n＝11)具有比正常小鼠的可用血清铁大约5倍高的水平[中位数(75^th四分位数，25^th四分位数)]＝7.29(11.8，4.8)μM vs.1.69(2.3，1.3)μM，p＝0.03，Wilcoxon Rank Sum)。这些数据强调了我们的DKA小鼠模型的临床相关性。

为了确认可用血清铁的提高在米根霉致病性中的角色，我们研究了铁螯合剂对DKA小鼠对米根霉感染的易感性的影响。小鼠通过尾静脉用米根霉感染。所述小鼠用经口强饲法以0.5％的羟丙基纤维素中的1、3或10mg/kg地拉罗司(一种新型的FDA认可的铁螯合剂，以治疗铁过载的患者)处理每天两次(bid)从感染后那天开始持续7天。阴性对照小鼠用羟丙基纤维素载体(安慰剂)或地拉罗司加饱和氯化铁(腹腔给药)。另外一个阴性对照由未感染小鼠组成并用氯化铁处理。以所有剂量给药地拉罗司与对照相比均显著促进了其存活(图10A)。这种促进的存活与我们在高剂量脂质体两性霉素B(LAmB)用于处理感染的模型中获得的存活相平行。为了确定地拉罗司在组织真菌损伤中的效果，DKA小鼠如前所述经静脉感染。小鼠用地拉罗司(10mg/kg bid)，地拉罗司加饱和氯化铁或安慰剂处理。处理在感染16h之后开始并每天给药持续3天。在第四天肾和脑被移出，均质化，并定量培养。地拉罗司导致在脑和肾中(初级目标歧器官)的真菌损伤大于10倍的降低，相比于用安慰剂或地拉罗司加饱和氯化铁处理的小鼠(图10B)。从组织病理学来说，地拉罗司处理的小鼠的肾脏不具有可见的菌丝，而用安慰剂或地拉罗司加饱和氯化铁处理的小鼠的肾脏具有大范围的菌丝状真菌。进一步，用饱和铁处理的小鼠没有显著的中心粒细胞汇集感染区域的现象，而在地拉罗司处理的小鼠的肾脏中性粒细胞汇集是显著的(数据未显示)。当地拉罗司施用于具有饱和剂量的FeCl₃的小鼠时保护的逆转进一步验证了保护的机制是由于铁螯合。需要注意，这些结果与我们的前期工作相一致，其显示去铁酮(另一种螯合试剂，不用做根霉的铁载体)保护了根霉感染的动物，并确认了铁可用性与米根霉之间的联系。这些结果进一步证实了铁在毛霉菌病发病机理中的独特重要性。

实施例7 FTR在DKA小鼠体内的表达

本实施例显示了米根霉FTR在DKA小鼠体内表达。

为了使FTR多肽在毛霉菌病发病机理中起作用，它必须在感染期间被表达。我们使用基于实时RT-PCR的方法以研究FTR多肽在糖尿病酮酸中毒(DKA)小鼠的脑中的表达，其中所述小鼠用米根霉10⁵孢子经尾静脉注射而被感染。选择脑是因为它是在该模型中的主要目标器官。小鼠在感染后24h或48h后处死，收集脑并立即快速冷冻于液氮中，之后研磨并用酚提取RNA。由未感染的DKA小鼠的收集的脑平行操作作为阴性对照。在DNase处理以消除污染的基因组DNA，和反转录(Ambion RETROscript

体系)之后，cDNA通过实时PCR使用SYBR-Green方法和ABI

Prism 7000仪器进行分析。基因表达规格化为ACT1或18S rRNA表达。结果发现有4只感染的小鼠在感染后48h后而不是24h后其脑中FTR被表达(图11)。感染后24h后FTR表达的缺失不能归因于感染的小鼠的脑中表现更低的真菌元素，因为18S rRNA和ACT1基因的表达均在该组织中被检测到。延迟的FTR多肽表达的模式(即，感染后的48h后而不是24h后表达)可以通过以下事实解释，即24h后真菌元素不是显著的缺铁的，因为孢子已经在制备菌种期间在富含铁的培养基中生长起来。感染后48小时之后，由于真菌孢子开始在脑中增殖，米根霉开始表达FTR多肽以从宿主中摄取铁。与预期相符，未感染小鼠的脑不显示任何FTR多肽的表达。

这些结果清楚地证明了FTR多肽在感染期间被表达并涉及毛霉菌病的发病机理。

为了确认在活性感染期间FTR在体内的表达，我们使用GFP作为FTR表达的报告系统。用质粒转化米根霉，其中所述质粒含有GFP克隆于包含FTR启动子的2kb片段的下游。该菌株在体外在缺铁条件下生长时发出绿色荧光，而在富含铁环境中不发出(数据未显示)。DKA小鼠用1×10⁵孢子的在富含铁情况下生长的这种米根霉菌株感染。感染48小时之后处死小鼠并收集脑，固定于10％福尔马林锌。脑的石蜡切片用抗-GFP多克隆兔抗体染色并用抗-兔FITC连接的Ab染色计数。如图14所示，用在FTRp控制之下表达GFP的米根霉感染的小鼠的脑中的真菌元素发出绿色荧光，因此确认了我们早先的发现，即FTR多肽在活性感染期间被表达，并与毛霉菌病的发病机理有关。

实施例8 FTR多肽及其与已知蛋白的同源性

本实施例显示了米根霉FTR多肽很少或不同源于已知的人类蛋白。

为了最小化诱导自身免疫反应的潜力，需要用做人类疫苗的蛋白疫苗不具有显著的与众多人类蛋白的同源性。为了研究所述FTR多肽和人类蛋白之间的同源性的潜力，PubMed BLAST搜索被用于比较FTR多肽的16-368位氨基酸(即，预定的FTR多肽疫苗)与人类蛋白质组。该搜索鉴别出5个开放阅读框，其具有非常有限的同源性，所有5个蛋白的比对分数为30.4，e＝9.0。这些蛋白的3个时卷曲螺旋结构域并包含82(即，EAW66982；AAH33726.1；和NP_079001.2)；一个是CCDC82蛋白(即，AAH 18663.1)和一个未命名蛋白(即，BAB 15683.1)。作为基准，鉴别真菌的相比于其它物种的独特序列的标准BLAST搜索的e值被设定为10^-8，表明米根霉FTR不具有与人类蛋白质组显著的同源性。

实施例9 在血源性播散型毛霉菌病的DKA小鼠模型中FTR基因产物在米根霉毒性中的作用

本实施例显示FTR基因产物(例如，mRNA或多肽)在毛霉菌病的DKA小鼠模型中是米根霉完全毒性所必需的。

我们使用RNA干扰(RNAi)技术来抑制FTR在米根霉中的表达。FTRORF的一个包含REGLE基序的400bp片段(被认为在摄取时与铁结合)克隆进入质粒pRNAi-pdc的一个内含子片段的上游。同样片段的反向互补序列克隆在该内含子的下游。产生的质粒用biolistic

递送系统(BioRad

)转化进入米根霉pyrf突变株。Southern印迹分析显示所有获得的转化株均以游离状态维持所转化的质粒(数据未显示)。RT-PCR被用于比较所挑选的5个转化株相比于对照株的FTR表达，对照株用空质粒转化。相比于对照株，在测试的5个转化株中的4个中FTR表达几乎完全被抑制，在一个转化株中降低(图13)。任何转化株中的18s rDNA的表达均未改变，表明了RNAi在抑制FTR表达中的特异性。

RNAi转化株之一在血源性播散型毛霉菌病的DKA小鼠模型中的毒性与对照株进行了对比。小鼠用转化的对照株或者具有RNAi质粒的转化株(FTR-i菌株)感染。与对照株相比，RNAi转化株具有延迟的和降低的毒性。有趣的是，我们发现从FTR-i菌株感染的垂死小鼠的脑和肾中回收的米根霉失去了RNAi质粒，因为米根霉未能在不含尿嘧啶的矿物培养基上生长，但是在富饶培养基上生长(马铃薯葡萄糖琼脂)。作为对比，从感染后25天后存活的两只小鼠(没有疾病迹象)中回收的米根霉能在不含尿嘧啶的矿物培养基上和在富饶培养基上生长，表明RNAi质粒仍然存在于这些孢子中，并且感染期间FTR表达的抑制抑制了米根霉的毒性(图14)。

这些数据证明在DKA小鼠模型中FTR对米根霉是一种关键的毒性银子，并提供了额外的理由以支持开发FTR疫苗以预防毛霉菌病感染。

实施例10 fFtr1p暴露于细胞外并具有与已知人类蛋白有限的同源性但是与其它毛霉之间保守

同源性模型预测rFtr1p具有多螺旋束状结构，这是在其它微生物中发现的离子结合或转运蛋白的特点。在最粗略的模型中，至关重要的REGLE离子结合基序的Glu154和Glu157残基暴露于该蛋白的保外部分，使其可以进行潜在的结合和抗体抑制(图19)。

为了最小化诱导自身免疫反应的潜力，需要用做人类疫苗的蛋白质疫苗不具有显著的与众多人类蛋白的同源性。为了研究rFtr1p与人类蛋白之间的同源性，PubMed BLAST搜索被用于比较rFtr1p的16-368位氨基酸(即，预定的rFtr1p疫苗的氨基酸)与人类蛋白质组。该搜索鉴别出5个开放阅读框，其具有非常有限的同源性，所有5个蛋白的比对分数为30.4，e＝9.0。这些蛋白的3个是卷曲螺旋结构域并包含82(即，EAW66982；AAH33726.1；和NP_079001.2)；一个是CCDC82蛋白(即，AAH 18663.1)和一个未命名蛋白(即，BAB 15683.1)。作为基准，鉴别真菌的相比于其它物种的独特序列的标准BLAST搜索的e值被设定为10^-8，(Jones等人，Proc Natl AcadSci USA 2004；101：7329-34)(2004))表明米根霉rFtr1p不具有与人类蛋白质组显著的同源性。作为对比，乙肝病毒表面抗原，其用作人类对抗乙肝病毒非常安全的疫苗，其PubMed BLAST检索显示18条记录，其中之一是很显著的(得分75.9，e＝1×10^-14)，其余的得分分布在27-29的范围，e值为5-10。因此，建议的rFtr1p疫苗与广泛使用的HBSAg疫苗相比具有与人类蛋白质组可比的或更低的同源性

作为对比，最近公开的资料证明了rFTR1在其它病原性毛霉包括微孢根霉，R.niveus，R.stolonifer，Rhizomucor miehei，Rhizomucor pusillus，Mucor circinelloides，M.racemosus，M.rouxii和M.plumbeus之间是高度保守的，具有大于70％的核苷酸同源性。有趣的是，推定的REGLE离子结合功能性基序在所有毛霉中100％保守。Nyilasi等人，Clin Microbiol Infect(2008)。这表明提议的疫苗将针对其它毛霉菌病试剂具有交叉免疫原性。进一步，期望发生属之间的交叉保护，因为米根霉rFtr1p在多种真菌的高铁通透酶之间具有高度同一性，即使在霉菌之外，包括曲霉属物种，白色念珠菌，和新生隐球菌。在所有这些真菌中，其核心REGLE铁结合功能性基序是100％保守的。

实施例11 从rFtr1p免疫的小鼠收集的血清的被动免疫能保护小鼠免受米根霉感染

为了最大化蛋白质的生产，通过去除信号肽和6次跨膜结构域而合成了编码更亲水的蛋白的基因，所述结构域将蛋白质直接定位与细胞膜上。虽然合成的基因具有序列元素的去除，其剩余序列没有改变，以避免改变蛋白的暴露的、亲水的区域中的潜在表位。合成的基因也包括一个6X-His-标签以亲和纯化所表达的蛋白。该基因克隆进入pQE32表达载体并转化进入大肠杆菌。对数期细菌细胞用IPTG诱导，收获细胞，重组蛋白通过Ni-琼脂糖亲和柱纯化，根据生产商(Qiagen)，的说明以约1-1.3mg纯化蛋白每升培养基的生产(图20)。产生的蛋白质用于如下所述升高鼠抗体。

为了产生被动免疫的免疫血清，在第0天Balb/c小鼠用rFtr1p(μg)混合完全弗氏佐剂(CFA)经20SQ注射来免疫，在第21天用另一剂量的抗原混合不完全弗氏佐剂(IFA)加强，2周之后放血用于血清收集。由免疫的小鼠收集的血清证明抗rFtr1p抗体效价大于1∶800,000，而由空质粒免疫的小鼠收集的血清具有抗体效价为1∶200。在米根霉经鼻腔感染2h之前，免疫或对照血清(0.25ml)腹腔给药于DKA患者小鼠。感染之后血清剂量重复3天。感染的小鼠用免疫血清处理后促进了其存活，相比于对照血清处理的小鼠(图21)。这些研究清楚地证明了使用靶向rFtr1p的被动免疫以促进毛霉菌病期间的存活的可行性。

实施例12 FTR1在感染DKA小鼠期间的米根霉中的表达

由于FTR1在毛霉菌病的发病机理中起作用，它必须在感染期间被表达。定量实时PCR(qPCR)被用于研究FTR1在DKA小鼠的脑中的表达，其中所述小鼠用10⁵孢子的米根霉经静脉感染，该接种物在2-3天内引起100％的死亡率(Ibrahim等人，Antimicrob Agents Chemother 49：721-727(2005)。感染24小时后处死的小鼠(n＝5)的FTR1表达增加4倍[中位数(25^th四分位数，75四分位数)＝4.12(1.03，0.27)，p＝0.03 Wilcoxon RankSum)]，相对于构成性ACT1基因。与期望相符，来自未感染小鼠的脑没有显示FTR1的表达。

非参数对数秩检测用于确定存活时间的不同，其中肾脏真菌损伤、铁摄取、生长速率和体内FTR1表达的不同通过非参数Wilcoxon Rank Sum测试来比较。

为了直观显示感染期间FTR1体内的表达，米根霉用包含GFP位于FTR1启动子控制之下的质粒转化的米根霉转化。该研究中所用的米根霉菌株列于表1。简而言之，生物体在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)或YPD平板[1％酵母提取物(Difco Laboratories)，2％细菌蛋白胨(Difco)，和2％D-葡萄糖]上在37℃下生长4天。对米根霉M16，(pyrF缺失突变株，其不能合成自身的尿嘧啶)，PDA补充100μg/ml尿嘧啶。一个815bp部分的pyrF PCR片段(pyrF P1 1/P13)用于使米根霉M16回复为原养型。该片段与M16中出现的pyrF突变相重叠(即，在nt+205位G到A的点突变)(Skory andIbrahim，Curr Genet 52：23-33(2007))并能够通过基因置换而恢复功能。在一些实验中，米根霉通过在酵母氮基培养基(YNB)(Difco/BectonDickinson，Sparks，MD)中生长而急需铁，所述培养基补充了完全补足培养基除了尿嘧啶(CSM-URA)(Q-Biogene)，(YNB+CSM-URA)，[配方/100ml，1.7g YNB不含氨基酸，10g葡萄糖，0.77g CSM-URA]，并存在1mM抗坏血酸和菲啰嗪。孢囊孢子收集于无内毒素且含0.01％吐温80的PBS中，用PBS洗涤，用血球计数器制备最终的接种液。

表1 本研究所用的菌株

该菌株在体外在缺铁条件下生长时发出绿色荧光，而在富含铁培养基中不发出，而米根霉用GFP处于结构性肌动蛋白启动子控制之下(阳性对照)转化的米根霉发出荧光与培养基中的铁浓度无关(图22A)。DKA小鼠用GFP报告菌株或PyrF-补充的米根霉感染，所述米根霉在感染之前在富含铁条件下生长以抑制GFP表达。感染24或48小时之后收集脑并处理用于组织病理学。由于石蜡填充过程废除了GFP蛋白的内在荧光，切片用荧光性抗-GFP抗体染色。感染24h之后取的样本不显示任何真菌元素，这是期望的结果，因为感染48h后是真菌能在被感染组织中以组织病理学检测到的最早时间点(Ibrahim等人，Antimicrob Agents Chemother 49：721-727(2005))。在感染48h时的脑中，米根霉的FTR1报告菌株表达了GFP，而阴性对照，PyrF-补足的米根霉没有(图22B)。另外，GFP表达在宿主环境中被低铁水平所诱导，因为用于感染小鼠的孢子在富含铁培养基中生长(抑制FTR1表达的条件)并且用于uganrna小鼠时不发出绿色荧光(图22B，DIC与荧光重叠)。

实施例13 在多核米根霉中分离同型核ftr1缺失不能完成，尽管中断盒整合在FTR1位点

活性感染期间FTR1的表达提示了FTR1在米根霉致病机理中的角色。研究了FTR1基因在米根霉体外摄取铁和体内致病的能力上的干扰的影响。由2株分离的转化株获得的分离物通过一轮孢子形成和单克隆分离来纯化。为了获得单克隆分离，转化株在补充了1mM FeCl₃(富含离子)的化学确定培养基(YNB+CSM-URA)上生长以形成ftr1缺失等位基因的隔离，因为FTR1几乎不在浓度大于350μM的FeCl₃中表达(Fu等人，FEMSMicrobiol Lett 235：169-176(2004))。分离物用于筛选中断盒的整合，使用PCR引物对FTR1-P3/PyrF-P9(期望1054bp)和PyrF-P18/FTR1-P4(期望1140bp)。FTR1位点的干扰通过PCR扩增产物的缺失来检测，使用引物对FTR1-P5/FTR1-P6(期望503)，其扩增来自FTR1的ORF的片段(表2和图23A)。PCR确认了FTR1位点的中断盒的整合，以及来自数个推定缺失突变株的FTR1 ORF的缺失(图23B)。此外，扩增产物也用于测序以证明中断盒已经被通过同源重组整合进入FTR1位点(数据未显示)。最后，FTR1位点的中断盒的整合通过Southern印迹来确认(见下文)。

为了研究FTR1的表达，我们使用GFP作为FTR1启动子表达的报告系统。米根霉M16用包含在FTR1启动子驱动下的报告基因GFP的质粒转化(米根霉GFP1)，如前所述(Ibrahim等人，J Clin Invest 117：2649-2657(2007))。GFP也克隆在结构性表达的肌动蛋白启动子(Act Ip)下游然后转化进入米根霉M16以作为阳性对照。在研究体内FTR1的表达之前，我们用FACS分析检测了FTR1在体外的表达。简而言之，用GFP处于Ftr1p或Act1p驱动下转化的米根霉在含有(缺铁条件)或不含(铁充足条件)1mM的抗坏血酸和菲啰嗪的YNB+CSM-URA中37℃下生长12h。这些条件产生了米根霉的幼殖体而不是菌丝。用FACSCaliber(Becton Dickinson)仪器检测1ml幼殖体的荧光，仪器用氩激光器在488nm发射来预备。荧光发射用515/40带通滤镜来读数。荧光数据用对数放大器来收集。用CELLQUEST软件来计算104事件的平均荧光亮度。

对于体内感染，在真菌感染10天之前BALB/c雄性小鼠(＞20g)腹腔注射0.2ml柠檬酸缓冲液中的190mg/kg链脲菌素以致使其糖尿病(Ibrahim等人Antimicrob Agents Chemother 47：3343-3344(2003))。在链脲菌素处理7天之后糖尿和酮尿得到确认。糖尿病酮酸中毒小鼠用真菌孢子通过目标接种量为5×10³孢子的尾静脉注射而感染。为了确认接种量，在含0.1％曲通的PDA平板中稀释划线并在37℃培养24小时之后计数克隆。对于鼻内感染，在20μl的0.01％吐温80在PBS中的10⁷孢子置于克他命(100mg/kg)稳定的小鼠的鼻腔内(Waldorf et al，Journal of Clinical Investigation 74：150-160(1984))。为了确认接种量，在吸入米根霉后立即处死小鼠，肺脏均质化，平铺于含0.1％曲通的PDA上，在37℃孵育之后计数克隆。对每个模型，其主要功效终点是死亡时间。在一些实验中，作为次级功效，脑和肾的真菌损伤(主要靶向器官)(Ibrahim等人，Antimicrob AgentsChemother 49：721-727(2005))通过置于含1ml盐水的Whirl-Pak包((Nasco，FortAtkinson，WI)并用转动移液器来均质化。匀浆梯度稀释在0.85％盐水中然后在含0.1％曲通的PDA平板上定量培养。数据以log10cfu g-1组织来表示。为了检测GFP表达，抗-GFP兔多克隆抗体(Novus)被用于染色组织病理学样本然后计数FITC连接的抗-兔抗体染色。

为了定量化FTR1在感染组织中的表达，米根霉野生型(99-880)经尾静脉注射的BALB/c小鼠的脑在感染24或48小时之后收集并立即快速冷冻于液氮中，之后磨碎并用酚提取RNA。由未感染的DKA小鼠收集的脑平行处理作为阴性对照。冷冻的脑之后在液氮下磨碎并用热酚方法分离总RNA(Gravelat等人Infect Immun 76：3632-3639(2008))。RNA样品中通过用1μl的Turbo-DNase(Ambion)室温下处理30分钟以去除污染的基因组DNA。然后用RNA Clean-Up试剂盒(Zymo Research)去除DNase。用Retroscript第一链合成试剂盒(Ambion)来进行第一链的cDNA合成。在在线引物设计软件(Genscript)的辅助下设计FTR1特异性引物(列于表2)。扩增效率通过梯度稀释实验来确认，导致的效率系数用于定量化产品(Pfaffl等人，Nucleic Acids Res 29：e45(2001))。

基因表达通过ABI Prism 7000 Sequence Detection System(AppliedBiosystems)使用QuantiTect Sybr Green PCR试剂盒(Qiagen)来分析。PCR条件是10min 90℃和40个循环的15s 95℃和1min 60℃。单独的PCR产品用热分裂方法在PCR循环末尾时来确认。在感染的脑中FTR1的表达的量标准化为10S rRNA或ACT1(表2)，量化使用2(-ΔΔC(T))方法(Livakand Schmittgen，(2001)Methods 25：402-408(2001))。所有反应以双份进行，混合物包含阴性未反转录(RT)对照，在其中反转录被省略。

表2.本研究所用的寡核苷酸

为了中断FTR1，我们构建了基因中断盒，其包含由野生型米根霉扩增得到的功能性PyrF拷贝(998bp)，两侧分别是606和710bp的FTR1-5′UTR和FTR1-3′UTR片段(图23A)。该基因中断结构用引物FTR1 P1/P2(表2)经PCR扩增以获得2.3kb的中断片段，包含仅pyrF侧邻于同源FTR1 UTR序列(图23A)。它然后用于基因枪轰击转化米根霉M16(pyrF突变株)(Skory，MoI Genet Genomics 268：397-406(2002))。该中断盒用pyrF基因片段取代了整个FTR1编码区域从-16到终止密码子。由2株分离的转化株获得的分离物通过一轮孢子形成和单克隆分离来纯化，所述分离在补充了1mM FeCl₃(富含离子)的化学确定培养基(YNB+CSM-URA)上生长以形成FTR1缺失等位基因的隔离，因为FTR1表达在该铁浓度下被抑制(Fu等人，FEMS Microbiol Lett 235：169-176(2004))。分离物用于筛选中断盒的整合，使用PCR引物对FTR1-P3/PyrF-P9(期望1054bp)和PyrF-P18/FTR1-P4(期望1140bp)。FTR1的中断通过PCR扩增产物的缺失来检测，使用引物对FTR1-P5/FTR1-P6(期望503)，其扩增来自FTR1的ORF的片段，以及通过Southern印迹分析。在为了获得包含FTR1缺失等位基因的同型核分离物的努力中，具有确定的在FTR1位点的整合的转化株进一步用于14轮的孢子形成和在补充了1mM FeCl₃的YNB+CSM-URA上的单克隆分离。

我们之前发现FTR1在体外在缺铁(FeCl₃浓度在0-50μM)条件下表达而在铁充足培养基(FeCl₃浓度大于350μM)中被抑制(Fu等人，FEMSMicrobiol Lett 235：169-176(2004))。为了研究FTR1中断对米根霉在不同来源和浓度的铁的培养基中生长的能力是否有影响，我们比较了几个推定缺失突变株的生长与野生型或PyrF-补足型米根霉的生长。生长在培养基(CSM-URA)上比较，该培养基事先螯合了铁然后补充确定浓度的游离铁(即，FeCl₃或FeSO₄)或铁复合的去铁胺[铁草胺]或血红素。与野生型或PyrF-补足型米根霉相比，推定ftr1缺失突变株在缺铁培养基中(即，游离铁为10μM)48h具有显著少的生长(图23C)。铁草胺或铁复合的血红素在100μM(相对缺乏，因为铁被复合)支持野生型和PyrF-补足型菌株的生长好于推定ftr1缺失突变株。然而，1000μM的游离铁(富含铁培养基)平等地支持所有菌株的生长(图23C)，与我们之前的发现相一致，即ftr1主要在缺铁环境中表达。

通过在补充了10或1000μM的FeCl₃，FeSO₄，或100μM的血红素，或铁草胺作为铁源的YNB+CSM-URA平板上生长，推定ftr1中断突变株的生长与野生型米根霉或米根霉PyrF-补足型菌株做比较。此外，推定ftr1缺失或RNAi突变株与其对应的对照株比较了它们在YPD或化学确定培养基(即YNB+CSM-URA)上的生长。简而言之，米根霉孢子的10毫升的10⁵孢子点在平板中央，对于含FeCl₃，FeSO₄，或铁草胺的培养基，生长48h后测量菌丝体直径；对于补充血红素的平板，则72小时后。该实验在不同的日期重复3次，而生长速率以每小时真菌的菌丝体直径的增长来表示。

有趣的是，在缺铁培养基上生长96h后，推定ftr1缺失突变株的生长增加至于野生型和PyrF-补足型菌株相似的水平(数据未显示)。进一步，这些培养物生长96h之后的PCR分析确认了FTR1ORF再一次在所有推定ftr1缺失突变转化株中都是可检测的(图23D)。从几个其它推定ftr1缺失突变株获得了相似的结果，可以推断一轮的孢子生成和单独克隆分离不足够纯化出ftr1同型核的缺失等位基因菌株。

米根霉被认为是多核体，通常认为其孢囊孢子是多核的，尽管其细胞核的数目之前尚未被描述(Ma等人，PLoS Genet 5：el 000549(2009))。在菌丝体和孢囊孢子两者之中的异型细胞核的存在使得基因中断显得很复杂，用DAPI染色技术确定了肿胀孢子中细胞核的数目。简而言之，为了确定米根霉孢子中出现的细胞核的数目，YPD培养基中的孢子在37℃下重新发芽2h。肿胀孢子用冷PBS洗一次然后以5×10⁵/ml的浓度悬浮于PBS中。加入1μl的50μg/ml的4′6-脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)，细胞根据生产商的说明书电转化(BioRad)。肿胀孢子用冷PBS洗5次，之后重悬于100μl PBS中。10μl样品置于玻璃载片上并用盖玻片盖住。这些染色的细胞用表面荧光显微镜显像观察。

发现米根霉菌株M16具有每个肿胀孢子多于10个的细胞核(图24A)。由于存在大量细胞核，在富含铁培养基(即，含有1000μM的FeCl₃的培养基)上对推定ftr1缺失突变株进行了14轮的孢子形成与单独克隆分离，以通过援助维持FTR1的筛选压力来分离缺失的等位基因(因为FTR1在富含铁条件下几乎不表达)(Fu等人，FEMS Microbiol Lett 235：169-176(2004))。14轮筛选之后推定缺失突变株的PCR分析证明了其缺少FTR1 ORF的扩展(图24B)。与图23C的结果相似，与野生型和PyrF-补足型菌株相比，在最初48h内，缺失突变株在铁限制培养基中具有欠缺的生长。然而，在同样的推定缺失突变株在缺铁环境(100μM铁草胺)生长之后，再次通过PCR扩展了其FTR1 ORF。这些结果通过Southern印迹分析来确认(图24C)。Southern印迹证明在富含铁培养基中生长的推定ftr1缺失突变株的gDNA的FTR1条带(1960kb)几乎全部消失，但是同样菌株在缺铁培养基中生长后FTR条带回来了(图24C)。此外，DNA杂交分析确认了仅当推定ftr1缺失突变株在富含铁培养基中生长时中断盒位点特异性整合进入ftr1位点。最后，没有异位整合或染色体外复制的迹象，与以下事实相一致，即ftr1缺失等位基因的相对拷贝数目依赖于异型细胞核的比例。

为了比较富含铁或限制铁培养基中推定ftr1缺失突变株或者PyrF-不足菌株中FTR1的拷贝数目，使用了qPCR。简而言之，PyrF-补足型米根霉在补充了1mM FeCl3的YNB+CSM-URA上生长，或者推定ftr1缺失突变株在补充了1mM FeCl3或者100mM铁草胺的YNB+CSM-URA上生长之后，用OmniPrep裂解缓冲液(GBiosciences)提取基因组DNA。每个样本中的FTR1拷贝数目通过qPCR使用ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems)来确定，扩增产物用Power Sybr Green Cells-to-CTTM试剂盒(Applied Biosystems)检测。PCR条件如下所述：95℃变性15s min，扩增40循环，退火/延伸在60℃下进行1min。FTR1拷贝数目用米根霉ACT1标准化，相对拷贝数目用公式2^-ΔΔCT估计，其中ΔCT＝[Ct_目标基因-Ct_ACT1]而ΔΔCT＝[突变株的ΔCT-PyrF补足型菌株的ΔCT]。

qPCR用于定量化在富含铁培养基上经过了14轮孢子形成和单独克隆分析之后的推定ftr1缺失突变株的FTR1拷贝数目，以及同样的菌株在缺铁培养基上生长之后，以及米根霉PyrF-补足型菌株。在富含铁培养基中生长的推定ftr1缺失突变株具有60％的FTR1相对拷贝数目(标准化为ACT1基因)的减少，相比于同样菌株在却铁培养基中生长或米根霉PyrF-补足型菌株(图25A和25B)。因此，由于可能显著降低多核米根霉中功能性FTR1的相对拷贝数目，该突变等位基因的同型核分离株未能得到。

实施例14 FTR1拷贝数目的降低削弱了体外铁摄取并降低了体内毒性

如本文所显示，米根霉中功能性FTR1的相对拷贝数目的减少足以降低其铁摄取从而降低毒性。推定ftr1缺失突变株与野生型或米根霉PyrF-补足型菌株相比其铁摄取具有大约35％的降低(图25C)。

为了确定推定ftr1缺失突变株的体外铁摄取的降低的体内相关性，其感染DKA小鼠期间的毒性与米根霉野生型或PyrF-补足型菌株做了对比。小鼠经静脉(i.v)或鼻内(i.n.)用菌株感染，所述菌株别证明在体外生长于富含铁环境的YPD或CSM-URA(推定ftr1缺失用0.185+0.005或0.257±0.003cm/h，而PyrF-补足型用0.188±0.008或0.260+0.0051cm/h，分别在富含铁CSM-URA或YPD培养基)(图26A)。在两个模型中，推定ftr1缺失突变株显示出降低的毒性，相比于野生型或PyrF-补足型菌株(具有播散型感染的小鼠中突变株对对照菌株具有62％对100％的死亡率，而在鼻内模型中突变株对对照菌株具有44％对75％的死亡率)(图26B，C)。与预期相符，从推定缺失突变株感染的垂死动物中回收的克隆显示出与PyrF-补足型菌株相比相似的FTR1拷贝数(数据未显示)，其FTR1拷贝数得到回复，与在体外在缺铁环境中生长之后一样。另外，在两个模型中PyrF-补足型菌株均具有与野生型米根霉相似的毒性，证明了pyrF基因在其原位置的回复不影响毒性。

实施例15 RNAi抑制FTR1基因表达降低了铁摄取并减弱了米根霉的毒性

为了确认基因中断之后显示的表现型，RNA干扰(RNAi)用于削弱米根霉中FTR1的表达。

RNA干扰(RNAi)技术用于抑制FTR1在米根霉中的表达。FTR1 ORF包含REGLE基序的一个450bp的片段被PCR扩增并克隆作为反向重复并处于根霉表达载体pPdcA-Ex(Mertens等人，Archives of microbiology 186：41-50(2006))控制之下，其中REGLE基序被认为是在铁摄取期间与铁相结合。另外，来自根霉pdcA基因的内含子(Skory，Curr Microbiol 47：59-64(2003))引入重复之间以作为稳定预定的dsRNA结构的接头(Nakayashiki等人，Fungal Genet Biol 42：275-283(2005)；Wesley等人Plant J 21：581-590(2001))。产生的质粒使用biolistic递送系统(BioRad)转化进入米根霉pyrF突变株，转化株在缺乏尿嘧啶的矿物培养基中筛选。

Southern印迹分析(数据未显示)显示所有RNAi转化株染色体外保持了转化的质粒，与这一事实一致，即我们在转化期间没有线形化质粒(Skory，MoI Genet Genomics 268：397-406(2002))。5个转化株的FTR1表达通过端点RT-PCR与对照菌株(即，用空质粒转化的米根霉pyrf缺失突变株[M16])进行了比较。在4个转化株中FTR1表达几乎完全被封闭，而在对照株中则轻易地检测到(图27A)。用同样模板的18s rDNA的扩增证明了起始样品的整合和不存在PCR抑制剂。RNAi对FTR1表达的抑制是特异性的，没有附近位点基因表达的明显降低。代表性的RNAi转化株证明了与对照株相似的生长，在富含铁的YPD或CSM-URA培养基上生长时(转化株用0.193+0.082或0.205±0.016cm/h，而对照株用0.201±0.087或0.211+0.011cm/h，分别在富含铁CSM-URA或YPD培养基)(图27B)。

测试了转化株在接近完全抑制FTR1表达和与对照相似的生长时摄取铁的能力。有趣的是，RNAi比基因中断更有效地降低米了根霉的⁵⁹Fe摄取，在所有检测时间都抑制铁摄取的大约50％(图27C)。简而言之，为了表征FTR1操作对米根霉在体外摄取铁的能力的影响，ftr1推定中断突变株或RNAi突变株与野生型或PyrF-补足型菌株比较了其积累细胞内⁵⁹FeCl₃的能力(Amersham Pharmacia Biotech)，使用我们公开的方法的修正(Fu等人，FEMS Microbiol Lett 235：169-176(2004))。在补充了1mM菲啰嗪和1mM抗坏血酸的YPD培养基中孢子在37℃下振荡预生长3h。离心收获细胞，冰冷的分析缓冲液pH6.1(矿物培养基+10mM 4-丙磺酸基吗啉+1mM菲啰嗪)洗两次，然后重悬于不含任何菲啰嗪的分析缓冲液以提供10⁸细胞每毫升的浓度。为了测量⁵⁹Fe摄取，50ul的细胞悬浮液加入450ul的冷却的不含菲啰嗪但添加了0.1M ⁵⁹FeCl₃的分析缓冲液，在振荡水浴中30℃培养。在选定时间点之后，分析样品在冰上冷却，振荡，真空过滤通过WhatmanGF/C过滤器并用10ml冰冷的SSW(1mM EDTA，20mM Na₃-柠檬酸pH4.2，1mMKH₂PO4，1mM CaCl₂，5mM MgSO₄，1mM NaCl)洗。移出过滤器并置于包含10ml闪烁液(Filter-count)的玻璃闪烁管中。细胞相关的⁵⁹Fe在Packard 2200CA液体闪烁计数器(Packard Instrument Co.，DownersGrove，II)中计数。通过准备平行分析检测到了由于细胞表面吸附而产生的非特定摄取，所述平行分析在过滤和冲洗之前在冰上保持10分钟。在计算摄取速率之前减去⁵⁹Fe的背景水平。实验重复以三倍形式在不同日期重复三次。数据以pmole/5×10⁶生长的孢子的特异性摄取来表示。

之后，RNAi转化株的毒性与对照株在血源性散布性或鼻内毛霉菌病的KDA小鼠中做了比较。RNAi转化株在两个模型中均证实了相比于对照株减少的毒性(散布性感染的小鼠中RNAi转化株对对照株为75％对100％死亡率，而在鼻内模型中RNAi转化株对对照株为11％对67％的死亡率，两次对比的对数秩检测的p＜0.02)(图28A，B)。有趣的是，RNAi转化株感染后死亡的小鼠的肾脏中回收的菌株失去了RNAi质粒，这在米根霉克隆在YPD平板上生长时很明显，而在YNB+CSM-URA中则没有(数据未显示)，从而恢复了表达FTR1的能力。作为对比，感染经过25天后在试验结束时存活的小鼠的肾脏中回收的菌株，没有失去其RNAi质粒。另外，与对照株感染的小鼠相比，RNAi转化株经静脉感染的小鼠分别具有约6和3倍降低的肾和脑真菌损伤(图28C)。这些数据证明了FTR1基因产品对DKA小鼠中的米根霉是关键性的毒性因子。

实施例16 Ftr1p免疫的小鼠中收集的血清的被动免疫保护了小鼠免于米根霉感染

本实施例证明了靶向FTR1的被动免疫可以预防毛霉菌病。

为了产生用于被动免疫的血清，小鼠用Ftr1p混合完全弗氏佐剂(CFA)通过SQ注射而免疫，然后用另一剂量的抗原与不完全弗氏佐剂(IFA)在第21天加强，2周之后放血收集血清。另一组小鼠用从大肠杆菌的空质粒转化株收集的上清液免疫以产生非免疫对照血清。抗体效价用涂覆了5ug的如前所述的合成重组Ftr1p(Ibrahim等人，Infect Immun 73：999-1005(2005))的ELISA平板来确定。免疫或对照血清(0.25ml)经静脉给药于糖尿病酮酸中毒易感小鼠，2h之后用1.5×107米根霉99-880孢子经鼻内感染。感染3天之后充分血清剂量，存活小鼠在感染之后跟踪35天。由免疫小鼠收集的血清具有抗-Ftr1p IgG效价大于1∶800,000，而由阴性对照小鼠收集的血清具有抗-Ftr1p IgG效价1∶200。相比于用对照血清，向DKA小鼠给药免疫血清随后米根霉经鼻内感染显著促进了其存活(免疫血清对非免疫血清为63％对0％，p＜0.001)(图28D)。

通过本申请多种公开被引用。这些申请的公开内容以其整体并入本文作为本申请的参考，以更全面地描述本发明属于的领域的状况。

尽管本发明结合参考文献来描述公开的实施方式，本领域技术人员能很容易认识到这些特定的实施例和教导的细节仅仅是本发明的示例性内容。应当理解可以做出各种改变而不超出本发明的精神。从而，本发明仅受以下权利要求的限制。

Claims

1.一种疫苗组合物，包含FTR多肽，或所述多肽的抗原性片段，和药学上可接受的载体。

2.权利要求1的疫苗组合物，进一步包含佐剂。

3.权利要求1的疫苗组合物，其中所述抗原性片段包含FTR的铁结合结构域或细胞外区域。

4.一种疫苗组合物，包含载体，所述载体包含与FTR序列的至少18个连续核苷酸基本上互补的核苷酸序列、转录启动子和转录终止子；其中所述启动子可操作地连接至所述FTR核苷酸序列，并且其中所述FTR核苷酸序列可操作地连接至转录终止子，以及药学上可接受的载体。

5.权利要求4的疫苗组合物，进一步包含佐剂。

6.一种用于在有需要的对象中治疗或预防真菌病症的药物组合物，包含FTR的反义物、小干扰RNA或抗体抑制剂，其选自：基本上互补于FTR序列的部分的核苷酸序列；基本上互补于FTR序列的至少12个连续核苷酸碱基的核苷酸序列；基本上互补于FTR序列的至少18个连续核苷酸碱基的核苷酸RNAi序列；特异性结合FTR多肽或其片段的抗体或其抗体片段；以及药学上可接受的赋形剂或载体。

7.一种治疗或预防真菌病症的方法，包含向患有或容易患有真菌病症的对象施用致免疫量的FTR多肽，或其免疫原性片段。

8.权利要求7的方法，其中所述FTR多肽的致免疫量是与药学上可接受的介质或佐剂一起施用。

9.权利要求7的方法，其中所述真菌病症包含接合菌病。

10.权利要求9的方法，其中所述接合菌病进一步包含毛霉菌病。

11.权利要求11的方法，其中所述毛霉菌病包含鼻脑型毛霉菌病、肺毛霉菌病、肠胃毛霉菌病、散布性毛霉菌病、骨毛霉菌病、纵膈毛霉菌病、气管毛霉菌病、肾毛霉菌病、腹膜毛霉菌病、上腔静脉毛霉菌病或外耳炎毛霉菌病。

12.权利要求11的方法，其中所述毛霉菌病与毛霉目的传染物有关。

13.权利要求12的方法，其中所述毛霉目的传染物选自以下真菌科：笄霉科、毛霉科、Mycotyphaceae、Phycomycetaceae、水玉霉科、瓶霉科、共头霉科或Umbelopsidaceae。

14.权利要求12的方法，其中所述毛霉目的传染物选自以下属：根霉、犁头霉、鳞质霉、毛霉或小克银汉霉属。

15.权利要求14的方法，其中所述根霉、犁头霉、鳞质霉、毛霉或小克银汉霉属的传染物选自：米根霉、小孢根霉、足样亚种、伞枝犁头霉、雅致鳞质霉或微小毛霉。

16.一种用于在有需要的对象中治疗或预防真菌病症的方法，包括将所述真菌暴露于FTR的反义物、小干扰RNA或抗体(多克隆或单克隆)抑制剂。

17.权利要求16的方法，其中所述FTR的反义物或抗体抑制剂包含选自下列的抑制剂：基本上互补于FTR核苷酸序列的部分的核苷酸序列；基本上互补于FTR序列的至少12各连续核苷酸碱基的核苷酸序列，基本上互补于FTR序列的至少18各连续核苷酸碱基的核苷酸RNAi序列；和特异性结合FTR核苷酸序列、多肽或其片段的抗体或抗体片段。