KR20140026479A - 합성 유전자 - Google Patents

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KR20140026479A
KR20140026479A KR1020137029911A KR20137029911A KR20140026479A KR 20140026479 A KR20140026479 A KR 20140026479A KR 1020137029911 A KR1020137029911 A KR 1020137029911A KR 20137029911 A KR20137029911 A KR 20137029911A KR 20140026479 A KR20140026479 A KR 20140026479A
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이그나시오 마리오 라리누아
도널드 제이 멀로
아부투 에스 레디
아르빈드 쿠마르 티루말라이스와미세크하르
애런 토드 우슬리
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 것으로서, 특히 식물에서 잘 발현하도록 적합화된 것인 합성 핵산 서열을 제공한다. 청구된 서열은 평균적으로 식물 종에서 천연적으로 발생된 유전자 중에서 사용되는 것과 대략적으로 동일한 빈도로 식물 최적화된 코돈을 사용한다. 본 발명은 추가로 제초제 내성, 물 및/또는 열 스트레스에 대한 내성, 건강에 좋은 오일 변형에 유용하고, 형질전환 마커 유전자 및 선별가능한 마커 유전자에 유용한 합성 DNA 서열을 포함한다. 합성 서열을 함유하는 DNA 구축물 및 트랜스제닉 식물은 농업에서 본 식물을 사용하기 위한 방법 및 조성물과 같이 교시된다.

Description

합성 유전자{SYNTHETIC GENES}
트랜스제닉 식물에서 이종성 단백질이 원하는 수준으로 발현될 수 있도록 하기 위해서는 종종 야생형 또는 원래의 DNA 코딩 서열이라고도 지칭되는 천연 DNA 코딩 서열을 예컨대, 코돈 선호도가 숙주 식물 종의 코돈 선호도에 더욱 가깝게 매치될 수 있도록, 및/또는 코딩 서열의 G+C 함량이 전형적으로 숙주 식물 종의 코딩 서열에서 발견되는 G+C 수준에 더욱 가깝게 매치될 수 있도록, 및/또는 mRNA를 탈안정화시키는 특정 서열을 제거하도록 하는 다양한 방식으로 변경시키는 것이 유익하다는 것을 발견하게 되었다. 이러한 방식들 중 하나 이상을 사용하였을 때, 예를 들어, 식물에서의 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) (B.t.) 결정 단백질 곤충 독소 발현은 개선되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5380301호, 미국 특허 번호 제5625136호, 미국 특허 번호 제6218188호, 미국 특허 번호 제6340593호, 미국 특허 번호 제6673990호, 미국 특허 번호 제7741118호를 참조할 수 있다. 코돈 축퇴성에 기인하여, 원래의 DNA 코딩 서열에서 사용되는 것과는 상이한 코돈을 사용함으로써 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 합성 DNA 서열을 제조할 수 있다.
mRNA를 탈안정화시킬 수 있는 서열을 제거하는 것과 관련하여, 미국 특허 번호 제7741118호에는 16개의 폴리아데닐화 신호 서열에 관한 목록이 개시되어 있으며 (표 II, 15열), 식물에서 발현시키고자 하는 합성 코딩 서열 중 상기 서열의 개수를 감소시키는 것을 필요로 한다. US 7741118, 표 II에 열거되어 있는 폴리아데닐화 신호 서열은 하기 표 1에 열거되어 있다:
Figure pct00001
US 7741118은 또한 (쇼-케멘(Shaw-Kamen) 서열로도 공지되어 있는) 서열 ATTTA가 잠재적으로는 mRNA를 탈안정화시키는 것으로 확인되었는 바, 이에 바람직하게는 상기 서열을 제거하는 것을 필요로 한다.
US 7741118의 교시와는 대조적으로, 상기 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수를 감소시키는 것이 식물에서 합성 유전자의 발현을 증진시키는 데 있어서 필요하지도 않으며, 충분하지도 않다는 것을 본 발명자들은 발견하게 되었다.
본 발명의 요약
하기 표 2에서는 옥수수 유전자에 빈번하게 존재하는 20개의 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 확인할 수 있다.
Figure pct00002
하기 표 3에서는 대두 유전자에 빈번하게 존재하는 20개의 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 확인할 수 있다.
Figure pct00003
본 발명은
a) 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 DNA 서열,
b) 하기 클래스 I 및 클래스 II로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 합성 DNA 서열이며,
클래스 I은 AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA, 및 CATAAA로 이루어진 군으로부터 선택되고;
클래스 II는 ATATAT, TTGTTT, TTTTGT, TGTTTT, TATATA, TATTTT, TTTTTT, ATTTTT, TTATTT, TTTATT, TAATAA, ATTTAT, TATATT, TTTTAT, ATATTT, TATTAT, TGTTTG, TTATAT, TGTAAT, 및 AAATAA 이루어진 군으로부터 선택되며;
상기 코돈-최적화된 DNA 서열은 클래스 II로부터의 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 상기 합성 DNA 서열은 단백질의 천연 DNA 서열보다 더 적은 개수의 클래스 II 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 천연 DNA 서열과 비교하여 동일한 개수의 클래스 I 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하는 것인, 옥수수 세포에서 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키기 위한 합성 DNA 서열을 제공한다.
본 발명은 또한
a) 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 DNA 서열,
b) 하기 클래스 I 및 클래스 III으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 합성 DNA 서열이며,
클래스 I은 AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA, 및 CATAAA로 이루어진 군으로부터 선택되고;
클래스 III은 ATTTTT, TATTTT, TTATTT, TTTATT, TTTTTT, TTTTAT, AATTTT, TTTTTA, ATATAT, TAATTT, TTAATT, AAATTT, AAATAA, ATATTT, TTTGTT TTGTTT, ATTATT, ATTTTA, TTTAAT, 및 TTTTAA로 이루어진 군으로부터 선택되며;
상기 코돈-최적화된 DNA 서열은 클래스 III으로부터의 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 상기 합성 DNA 서열은 단백질의 천연 DNA 서열보다 더 적은 개수의 클래스 III 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 천연 DNA 서열과 비교하여 동일한 개수의 클래스 I 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하는 것인, 대두 세포에서 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키기 위한 합성 DNA 서열을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 표 2에 열거된 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 천연 서열(들)에 의해 코딩되는 천연적으로 발생된 폴리펩티드(들)로부터 유래되는 관심의 대상이 되는 단백질의 아미노산 서열로 출발하는 단계, 및 (b) 상기 아미노산 서열을 코딩하고, 천연 서열(들)의 상응하는 코딩 서열과 비교하여 더 적은 개수의 표 2에 열거된 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 동일한 개수의 표 1에 열거된 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하는 합성 DNA 서열을 제조하는 단계를 포함하는, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 합성 DNA 서열을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 표 3에 열거된 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 천연 서열(들)에 의해 코딩되는 천연적으로 발생된 폴리펩티드(들)로부터 유래되는 관심의 대상이 되는 단백질의 아미노산 서열로 출발하는 단계, 및 (b) 상기 아미노산 서열을 코딩하고, 천연 서열(들)의 상응하는 코딩 서열과 비교하여 더 적은 개수의 표 3에 열거된 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 동일한 개수의 표 1에 열거된 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하는 합성 DNA 서열을 제조하는 단계를 포함하는, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 합성 DNA 서열을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 합성 DNA 서열에는 표 2 및/또는 표 3에 열거된 폴리아데닐화 신호 서열이 없거나, 또는 표 2 및/또는 표 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 가능한 한 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열을 유지시키고, 서열 중 그의 원래의 위치에 표 1의 서열을 유지시키는 데 일관되게 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 합성 DNA 서열은 임의적으로 바실러스 투린지엔시스로부터 유래된 살충 단백질 뿐만 아니라, 제초제 내성, 물 및/또는 열 스트레스에 대한 내성, 건강에 좋은 오일 변형에 유용하고, 형질전환 마커 유전자 및 선별가능한 마커 유전자에 유용한 DNA 서열을 코딩한다.
본 발명의 합성 DNA 서열은 DNA 구축물이 5' 비번역 서열, 본 발명의 합성 DNA 서열, 및 3' 비번역 영역을 포함하고, 상기 5' 비번역 서열은 식물에서 작용하는 프로모터를 함유하고, 상기 3' 비번역 서열은 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 것인, 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구축물에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 합성 DNA 서열을 함유하는 트랜스제닉 식물을 제공한다.
합성 DNA 서열이 곤충 독소, 예를 들어, 바실러스 투린지엔시스 Cry 단백질을 코딩하는 것인, 본 발명의 합성 DNA 서열을 식물에서 발현시키는 단계를 포함하는, 해충을 방제하는 방법 또한 제공한다.
합성 DNA 서열이 공지된 제초제 내성 효소, 예를 들어, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD1) (WO/2005/107437 참조), 또는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 또는 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 효소를 코딩하는 것인, 본 발명의 합성 DNA 서열을 식물에서 발현시키는 단계를 포함하는, 식물에서 제초제 내성을 위한 방법 또한 제공한다.
합성 DNA 서열이 식물에서 오일 프로파일을 변형시키는 것으로 알려져 하나 이상의 효소, 예를 들어, 지방산 데사투라제를 코딩하는 것인, 하나 이상의 본 발명의 합성 DNA 서열을 식물에서 발현시키는 단계를 포함하는, 식물에서 오일 프로파일을 변형시키는 방법 또한 제공한다.
합성 DNA 서열이 물 및/또는 열 스트레스에 대한 공지의 스트레스 내성 유전자, 예를 들어, 스트레스 관련 단백질 (SAP1) (미국 특허 공개 번호 2010/0275327), 및 1-Cys 퍼록시레독신 (Per1) 단백질 (문헌 [Mowla, et al., 2002, Planta 215:716-726])을 코딩하는 것인, 본 발명의 합성 DNA 서열을 식물에서 발현시키는 단계를 포함하는, 식물에서 스트레스 내성을 위한 방법 또한 제공한다.
합성 DNA 서열이 식물에서 작용성인 공지된 형질전환 마커 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 베타 글루쿠로니다제 효소를 코딩하는 것인, 본 발명의 합성 DNA 서열을 식물에서 발현시키는 단계를 포함하는, 식물에서 리포터 유전자를 부가하는 방법 또한 제공한다.
곤충 독소를 발현하는 본 발명의 합성 유전자를 함유하는 식물로부터 곡물 또는 종자를 수득하는 단계를 포함하는, 곡물 또는 종자에서 해충을 방제하는 방법, 및 곤충 독소를 발현하는 본 발명의 합성 유전자를 함유하는 곡물로부터 굵은 가루(meal) 또는 고운 가루(flour)를 수득하는 단계를 포함하는, 굵은 가루 또는 고운 가루에서 해충을 방제하는 방법 또한 제공한다.
굵은 가루, 고운 가루, 단백질 농축물, 또는 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품인 것인, 본 발명의 합성 DNA를 함유하는 트랜스제닉 식물로부터 유래된 조성물 또한 제공한다.
일부 경우에서, 표 1에 열거된 폴리아데닐화 신호의 개수는, AATAAA 존재부를 결실시키고, 표 1에 열거된 또 다른 폴리아데닐화 신호 서열로 치환함으로써 본 발명의 합성 DNA 서열에서 유지될 수 있다. 이는 실시예 1, 서열 번호 5에 예시되어 있다.
서열 설명
서열 번호 1은 바실러스 투린지엔시스 Cry1Fa 코어 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 2는 바실러스 투린지엔시스 Cry1Fa 코어 독소 서열이다.
서열 번호 3 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry1Fa 코어 독소를 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 4는 바실러스 투린지엔시스 Cry1Fa 코어 독소 서열이다.
서열 번호 5는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry1Fa 코어 독소를 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 6은 바실러스 투린지엔시스 Cry1Fa 코어 독소 서열이다.
서열 번호 7은 바실러스 투린지엔시스 Cry34Ab1 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 8은 바실러스 투린지엔시스 Cry34Ab1 독소 서열이다.
서열 번호 9는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry34Ab1 독소를 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 10은 바실러스 투린지엔시스 Cry34Ab1 독소 서열이다.
서열 번호 11은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry34Ab1 독소를 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 12는 바실러스 투린지엔시스 Cry34Ab1 독소 서열이다.
서열 번호 13은 바실러스 투린지엔시스 Cry35Ab1 독소을 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 14는 바실러스 투린지엔시스 Cry35Ab1 독소 서열이다.
서열 번호 15는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry35Ab1 독소를 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 16은 바실러스 투린지엔시스 Cry35Ab1 독소 서열이다.
서열 번호 17은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry35Ab1 독소를 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 18은 바실러스 투린지엔시스 Cry35Ab1 독소 서열이다.
서열 번호 19는 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ab1 코어 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 20은 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ab1 코어 독소 서열이다.
서열 번호 21은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ab1 코어 독소를 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 22는 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ab1 코어 독소 서열이다.
서열 번호 23은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ab1 코어 독소를 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 24는 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ab1 코어 독소 서열이다.
서열 번호 25는 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ca 코어 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 26은 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ca 코어 독소 서열을 코딩하는 것이다.
서열 번호 27은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ca 코어 독소를 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 28은 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ca 코어 독소 서열을 코딩하는 것이다.
서열 번호 29는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ca 코어 독소를 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 30은 바실러스 투린지엔시스 Cry1Ca 코어 독소 서열을 코딩하는 것이다.
서열 번호 31은 바실러스 투린지엔시스 Cry6Aa 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 32는 바실러스 투린지엔시스 Cry6Aa 독소 서열이다.
서열 번호 33은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry6Aa 독소를 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 34는 바실러스 투린지엔시스 Cry6Aa 독소 서열이다.
서열 번호 35는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 바실러스 투린지엔시스 Cry6Aa 독소를 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 36은 바실러스 투린지엔시스 Cry6Aa 독소 서열이다.
서열 번호 37은 스핑고피움 허비시도보란스(Sphingobium herbicidovorans) AAD1 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 38은 스핑고피움 허비시도보란스 AAD1 단백질 서열이다.
서열 번호 39는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 & 표 2 서열은 유지되는 것인, 스핑고피움 허비시도보란스 AAD1 단백질을 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 40은 스핑고피움 허비시도보란스 AAD1 단백질 서열이다.
서열 번호 41은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 스핑고피움 허비시도보란스 AAD1 단백질을 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 42는 스핑고피움 허비시도보란스 AAD1 단백질 서열이다.
서열 번호 43은 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 델타-9 지방산 데사투라제 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 44는 아스퍼질러스 니둘란스 델타-9 지방산 데사투라제 단백질 서열이다.
서열 번호 45는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 & 표 2 서열은 유지되는 것인, 아스퍼질러스 니둘란스 델타-9 지방산 데사투라제 단백질을 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 46은 아스퍼질러스 니둘란스 델타-9 지방산 데사투라제 단백질 서열이다.
서열 번호 47은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 아스퍼질러스 니둘란스 델타-9 지방산 데사투라제 단백질을 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 48은 아스퍼질러스 니둘란스 델타-9 지방산 데사투라제 단백질이다.
서열 번호 49는 제로피타 비스코사(Xerophyta viscosa) SAP1 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 50은 제로피타 비스코사 SAP1 단백질 서열이다.
서열 번호 51은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 & 표 2 서열은 유지되는 것인, 제로피타 비스코사 SAP1 단백질을 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 52는 제로피타 비스코사 SAP1 단백질 서열이다.
서열 번호 53은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 제로피타 비스코사 SAP1 단백질을 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 54는 제로피타 비스코사 SAP1 단백질 서열이다.
서열 번호 55는 아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria) GFP1 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 56은 아에쿠오레아 빅토리아 GFP1 단백질 서열이다.
서열 번호 57은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 & 표 2 서열은 유지되는 것인, 아에쿠오레아 빅토리아 GFP1 단백질을 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 58은 아에쿠오레아 빅토리아 GFP1 단백질 서열이다.
서열 번호 59는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 아에쿠오레아 빅토리아 GFP1 단백질을 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 60은 아에쿠오레아 빅토리아 GFP1 단백질 서열이다.
서열 번호 61은 렙토스파에리아 노도룸(Leptosphaeria nodorum) 델타-9 지방산 데사투라제 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 62는 렙토스파에리아 노도룸 델타-9 지방산 데사투라제 단백질 서열이다.
서열 번호 63은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 & 표 2 서열은 유지되는 것인, 렙토스파에리아 노도룸 델타- 9 지방산 데사투라제 단백질을 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 64는 렙토스파에리아 노도룸 델타-9 지방산 데사투라제 단백질 서열이다.
서열 번호 65는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 렙토스파에리아 노도룸 델타-9 지방산 데사투라제 단백질을 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 66은 렙토스파에리아 노도룸 델타-9 지방산 데사투라제 단백질 서열이다.
서열 번호 67은 제로피타 비스코사 PER1 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열이다.
서열 번호 68은 제로피타 비스코사 PER1 단백질 서열이다.
서열 번호 69는 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 1 & 표 2 서열은 유지되는 것인, 제로피타 비스코사 PER1 단백질을 코딩하는 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 70은 제로피타 비스코사 PER1 단백질 서열이다.
서열 번호 71은 옥수수에 대해 최적화된 코돈을 사용하고, 표 2에서 확인되는 서열은 제거되고, 표 1 서열은 유지되는 것인, 제로피타 비스코사 PER1 단백질 을 코딩하는 본 발명에 따른 합성 DNA 서열이다.
서열 번호 72는 제로피타 비스코사 PER1 단백질 서열이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 합성 핵산 서열을 제공한다. 합성 코딩 서열은 특히 트랜스제닉 식물에서 관심의 대상이 되는 단백질을 발현하는 데 사용할 수 있도록 적합화된 것이다.
관심의 대상이 되는 단백질은 천연으로 발생된 임의의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 상기 단백질의 프로세싱된 형태를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 천연적으로 발생된 변이체이다. 관심의 대상이 되는 단백질은 또한 예컨대, 작용성 단백질 도메인을 혼합하고 매치시켜 1 초과의 천연적으로 발생된 단백질의 일부 또는 단편을 조합함으로써 형성된 단백질일 수 있다.
바람직한 관심의 대상이 되는 단백질 군은 생성된 표현형이 작물학적 형질 또는 작물학적 형질을 생성하는 데 유용한 리포터 단백질인 것이다. 이는 곤충에 대한 저항성, 제초제에 대한 내성, 물 및/또는 열 스트레스에 대한 내성, 및 오일 프로파일 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
더욱 바람직한 관심의 대상이 되는 단백질 군은 생성된 표현형이 작물학적 형질인 것이다. 또 다른 바람직한 군은 생성된 표현형이 제초제 내성을 제공하는 것이다. 또 다른 바람직한 군은 생성된 표현형이 스트레스 내성을 제공하는 것이다. 또 다른 바람직한 군은 생성된 표현형이 보다 건강한 식품을 위해 변형된 오일 프로파일을 제공하는 것이다. 더욱 고도로 바람직한 군은 관심의 대상이 되는 단백질이 곤충 저항성을 제공하는 Cry 단백질인 것이다.
관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 천연/야생형 DNA 서열을 확인하고, 분석함으로써 표 1 및 2, 및/또는 3에 열거되어 있는 폴리아데닐화 신호 서열이 존재하는지 여부를 확인하여야 한다. 본 발명에 따라, 옥수수에서 사용하고자 하는 코딩 서열의 경우, 표 2에 열거되어 있는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수는 천연 서열에 존재하는 것과 비교하여 감소되어 있다. 대두에서 사용하고자 하는 코딩 서열의 경우, 표 3에 열거되어 있는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수는 감소되어 있다. 표 2 및 3에 열거되어 있는 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하는 것이 매우 중요한데, 특히, 상기 서열이 네스티드 다량체 형태로 존재하는 경우에 그러하다.
표 2 및 3에 열거되어 있는 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하는 것 이외에도, 쇼-케멘 서열, ATTTA 존재부를 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
폴리아데닐화 신호 서열 및 쇼-케멘 서열을 제거하는 것 이외에도, 본 발명자들은 평균적으로 합성 DNA 서열이 사용될 식물 종에서 천연적으로 발생된 유전자 중에서 사용되는 것과 대략적으로 동일한 빈도로 코돈을 사용하는 합성 DNA 코딩 서열을 구축하는 것을 선호한다. 하기 표 4에는 각종의 특이 작물에서 사용하고자 할 뿐만 아니라, 일반적으로 쌍자엽 또는 일반적으로 식물에서 사용하고자 하는 합성 유전자에서의 코돈 선호도에 대해 적합한 표적 비율(%)이 제시되어 있다.
Figure pct00004
트랜스제닉 식물
본 대상 발명의 바람직한 실시양태는 곤충 독소를 코딩하는 유전자로 식물을 형질전환하는 것이다. 곤충 독소 유전자를 발현하는 형질전환된 식물은 형질전환된 식물의 세포에서 조절량의 대상 살충 단백질 또는 그의 변이체의 존재에 의해서 곤충 표적 해충에 의한 공격에 대해 저항성을 띤다. B.t. 살충 독소의 살충 독소를 코딩하는 유전 물질을 특정 곤충 해충이 섭취하는 식물의 게놈 내로 혼입시킴으로써 성체 또는 유충은 먹이 식물을 섭취한 후 사멸하게 된다. 단자엽 및 쌍자엽 문의 많은 구성원들이 형질전환되어 왔다. 트랜스제닉 작물학적 작물 뿐만 아니라, 과일 및 야채가 상업상 관심의 대상이 된다. 그러한 작물로는 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 외래 유전 물질을 식물 세포 내로 도입시키거나, 또는 도입된 유전자를 안정적으로 유지시키고 발현하는 식물을 수득하는 기법에는 여러 가지가 존재한다. 그러한 기법으로는 미세 입자 상에 코팅된 유전 물질을 직접 세포 내로 도입시키는 것을 가속화시키는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 제4945050호 및 미국 특허 번호 제5141131호). 아그로박테리움(Agrobacterium) 기술을 사용하여 식물을 형질전환시킬 수 있다 (미국 특허 번호 제5177010호, 유럽 특허 번호 EP131624B1, 유럽 특허 번호 EP159418B1, 유럽 특허 번호 EP176112B1, 미국 특허 번호 제5149645호, EP120516B1, 미국 특허 번호 제5464763호, 미국 특허 번호 제4693976호, 유럽 특허 번호 EP116718B1, 유럽 특허 번호 EP290799B1, 유럽 특허 번호 EP320500B1, 유럽 특허 번호 EP604662B1, 미국 특허 번호 제7060876호, 미국 특허 번호 제6037526호, 미국 특허 번호 제6376234호, 유럽 특허 번호 EP292435B1, 미국 특허 번호 제5231019호, 미국 특허 번호 제5463174호, 미국 특허 번호 제4762785호, 미국 특허 번호 제5608142호, 및 미국 특허 번호 제5159135호 참조). 다른 형질전환 기술로는 위스커(WHISKERS)™ 기술을 포함한다 (미국 특허 번호 제5302523호, 및 미국 특허 번호 제5464765호 참조). 식물을 형질전환시키는 데 전기천공 기술 또한 사용되어 왔다 (WO1987006614, 미국 특허 번호 제5472869호, 미국 특허 번호 제5384253호, WO199209696, 미국 특허 번호 제6074877호, WO1993021335, 및 미국 특허 번호 제5679558호 참조). 식물을 형질전환시키는 수많은 기술 이외에도, 외래 유전자와 접촉되는 조직 유형 또한 달라질 수 있다. 그러한 조직으로는 배 발생 조직, 캘러스 조직 I형 및 II형, 배축, 분열 조직 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않을 것이다. 당업자의 기술 범위 내에 포함되어 있는 적절한 기법을 사용함으로써 거의 모든 식물 조직을 탈분화 동안에 형질전환시킬 수 있다.
DNA를 식물 내로 삽입시키는 공지의 기법으로는 형질전환제로서의 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)에 의해 전달되는 T-DNA로의 형질전환을 포함한다. 식물 세포의 형질전환을 위해 T-DNA를 함유하는 벡터를 사용하는 것은 집중적으로 연구되어 왔으며, 이는 유럽 특허 번호 EP120516B1; 문헌 [Lee and Gelvin (2008) Plant Physiol . 146:325-332]; [Fraley et al. (1986) Crit . Rev . Plant Sci . 4:1-46]; 및 [An et al. (1985) EMBO J. 4:277-284]에 충분하게 기술되어 있고; 당업계에 잘 확립되어 있다. 추가로, 전달하고자 하는 DNA를 함유하는 리포솜과의 식물 원형질체 융합, DNA의 직접적인 주입, 바이오리스틱스 형질전환 (미세 입자 충격법), 또는 전기천공 뿐만 아니라, 가능한 다른 방법이 사용될 수 있다.
일단 삽입된 DNA가 식물 게놈 내로 통합되고 나면, 전 후속 세대에 걸쳐 상대적으로 안정성을 띤다. 식물 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 벡터는 보통 형질전환된 식물 세포에 제초제 또는 항생제, 예컨대, 그 중에서도 비알라포스, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 선별가능한 마커 유전자를 함유한다. 따라서, DNA가 삽입되어 있지 않은 세포의 성장은 선별 화합물에 의해 억제되면서, 개별적으로 사용되는 선별가능한 마커 유전자를 통해 형질전환된 세포는 선별될 수 있어야 한다.
본 대상 발명의 바람직한 실시양태에서, 식물은 단백질 코딩 영역의 코돈 선호도가 최적화된 유전자로 형질전환된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5380831호를 참조할 수 있다. 유리하게는 절두된 독소, 예컨대, 작용성 단백질 도메인을 코딩하는 식물 또한 사용될 수 있다. 절두된 독소는 전형적으로 전장의 천연 독소의 약 55% 내지 약 80%를 코딩한다. 식물에서 사용하기 위한 합성 B.t. 유전자를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Stewart 2007, Frontiers in Drug Design and Discovery 1:297-341]).
형질전환 기법과는 상관없이, 유전자는 바람직하게는 벡터 중에 식물 프로모터를 포함시킴으로써 식물 세포에서 관심의 대상이 되는 단백질을 발현하도록 적합화된 유전자 전달 벡터 내로 혼입된다. 식물 프로모터 이외에도, 외래 유전자를 발현시키는 데 다양한 공급원으로부터의 프로모터가 식물 세포에서 효율적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 기원의 프로모터, 예컨대, 옥토파인 신타제 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터, 만노파인 신타제 프로모터; 바이러스 기원의 프로모터, 예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 및 19S 프로모터 등이 사용될 수 있다. 식물-유래 프로모터로는 리불로스-1,6-비스포스페이트 (RUBP) 카르복실라제 소형 서브유닛 (ssu), 베타-콘글리시닌 프로모터, 파세올린 프로모터, ADH (알콜 데히드로게나제) 프로모터, 열 충격 프로모터, ADF (액틴 해중합 인자) 프로모터, 및 조직 특이 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 프로모터는 또한 전사 효율을 개선시킬 수 있는 특정 인핸서 서열 요소를 함유할 수 있다. 전형적인 인핸서로는 ADH1-인트론 1 및 ADH1-인트론 6을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 구성적 프로모터가 사용될 수 있다. 구성적 프로모터는 거의 모든 세포 유형에서, 및 거의 모든 시기에 연속 유전자 발현을 지시한다 (예컨대, 액틴, 유비퀴틴, CaMV 35S). 조직 특이 프로모터는 특이 세포 또는 조직 유형, 예컨대, 잎 또는 종자에서의 유전자 발현을 담당하고 (예컨대, 제인, 올레오신, 나핀, ACP (아실 운반 단백질)), 상기 프로모터 또한 사용될 수 있다. 식물 발생 중 특정 단계 동안에 활성을 띠는 프로모터 뿐만 아니라, 특이 식물 조직 및 기관에서 활성을 띠는 프로모터 또한 사용될 수 있다. 그러한 프로모터의 예로는 뿌리 특이, 화분 특이, 배아 특이, 옥수수 수염 특이, 목화 섬유 특이, 종자 배유 특이, 체관부 특이 프로모터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다
특정 환경하에서는 유도성 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 유도성 프로모터는 특이 신호, 예컨대: 물리적 자극 (예컨대, 열 충격 유전자); 광 (예컨대, RUBP 카르복실라제); 호르몬 (예컨대, 글루코코르티코이드); 항생제 (예컨대, 테트라시클린); 대사산물; 및 스트레스 (예컨대, 가뭄)에 대한 반응으로 유전자를 발현시키는 것을 담당한다. 식물에서 작용하는 다른 바람직한 전사 및 번역 요소, 예컨대, 5' 비번역 리더 서열, RNA 전사 종결 서열 및 폴리아데닐레이트 부가 신호 서열이 사용될 수 있다. 많은 식물 특이 유전자 전달 벡터가 당업계에 공지되어 있다.
곤충 저항성 (IR) 형질을 포함하는 트랜스제닉 작물은 북미 전역의 옥수수 및 목화 식물에 널리 퍼져 있으며, 이러한 형질의 사용은 전세계적으로 확대되어 가고 있다. IR과 제초제 내성 (HT) 형질을 조합한 상업용 트랜스제닉 작물이 많은 종자 회사에 의해 개발되었다. 이는 B.t. 살충 단백질에 의해 부여받은 IR 형질과, HT 형질, 예컨대, 아세토락테이트 신타제 (ALS) 억제제, 예컨대, 술포닐우레아, 이미다졸리논, 트리아졸로피리미딘, 술폰아닐리드 등, 글루타민 신테타제 (GS) 억제제, 예컨대, 비알라포스, 글루포시네이트 등, 4-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD) 억제제, 예컨대, 메소트리온, 이속사플루톨 등, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 억제제, 예컨대, 글리포세이트 등, 및 아세틸-조효소 A 카르복실라제 (ACCase) 억제제, 예컨대, 할록시폽, 키잘로폽, 디클로폽 등에 대한 내성의 조합을 포함한다. 트랜스제닉 방식으로 제공된 단백질이 제초제 화학물질 부류, 예컨대, 페녹시산 제초제 및 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제 (WO2007053482 참조), 또는 페녹시산 제초제 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 제초제 (미국 특허 출원 번호 제20090093366호 참조)에 대한 식물 내성을 제공하는 것인 다른 일례도 공지되어 있다. IR 형질을 통해 다중의 해충 문제들을 방제할 수 있는 능력은 상업용 제품 개념에 있어서 가치가 크고, 이러한 제품 개념에 있어서 편의성은 곤충 방제 형질 및 잡초 방제 형질이 같은 식물에서 조합될 경우, 증진된다. 추가로, 단일 식물에서의 예컨대, 본 대상 발명의 것과 같은 B.t. 살충 단백질에 의해 부여되는 IR 형질과, 하나 이상의 추가의 입력 형질 (예컨대, B.t.-유래 또는 다른 살충 단백질에 의해 부여받은 다른 곤충 저항성, 예컨대, RNAi 등과 같은 기전에 의해 부여받은 곤충 저항성, 선충 저항성, 질환 저항성, 스트레스 내성, 질소 이용 개선 등), 또는 출력 형질 (예컨대, 고함량의 오일, 건강에 좋은 오일 조성물, 영양상의 개선 등)과 함께, 예컨대, 상기 언급된 것과 같은 하나 이상의 추가의 HT 형질의 조합을 통해 가치는 개선될 수 있다. 상기와 같은 조합은 통상의 교배 (교배 스택)을 통해, 또는 공동으로 다중의 유전자를 동시에 도입하는 것 (분자 스택 또는 공형질전환)을 포함하는 신규한 형질전환 이벤트로 수득될 수 있다. 곤충 해충을 관리할 수 있는 능력, 및 작물 식물에서 잡초 방제 개선이라는 이점을 포함하며, 후자의 경우에는 생산자 및/또는 소비자에게 2차적인 이점을 제공한다는 이점을 가지고 있다. 따라서, 본 대상 발명은 임의의 많은 작물학적 문제들을 유연하게 및 비용면에서는 효율적으로 제어할 수 있는 능력이 있는 작물 품질이 개선된 완전한 작물학적 패키지를 제공하기 위해 다양한 형질과 함께 사용될 수 있다.
본원에서 참조되거나, 인용되는 모든 특허, 특허 출원, 가출원, 및 공개 문헌은 본 명세서의 명백한 교시와 상반되지 않는 정도로 그 전문이 참고로 포함된다. 구체적으로 명시 또는 암시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 용어는 "1 이상"인 것을 의미한다. 본 출원인이 의미하는 "단리된"이란, 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 분자가 그의 천연 환경으로부터 제거되고, 인공으로 다른 환경에 배치되었다는 것을 나타낸다.
본 발명의 실시양태는 하기 실시예에서 추가로 정의된다. 본 실시예는 단지 예시에 의해 제공된다는 것을 이해하여야 한다. 상기 논의 및 본 실시예로부터 당업자는 본 발명의 필수적인 특징들을 확인할 수 있고, 그의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 본 발명의 실시양태를 각종 용법과 조건에 맞게 적합화시키기 위해 그를 다양한 변형 및 수정시킬 수 있다. 따라서, 본원에서 제시되고 기술된 것 이외에도, 본 발명의 실시양태의 다양한 변형은 당업자에게는 상기 기술로부터 자명할 것이다. 그러한 변형 또한 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함시키고자 한다.
달리 언급되지 않는 한, 백분율은 모두 중량%이고, 용매 혼합물의 비율은 모두 부피%이다. 온도는 모두 섭씨 온도이다.
실시예 1
바실러스 투린지엔시스 Cry1Fa 코어 독소를 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. Cry1Fa 코어 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 1에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 1에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 1에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 부위를 제거하고, 표 1에서 확인되는 서열을 회복시키기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 1에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 3에 기재되어 있다.
서열 번호 3을 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 5에 기재되어 있다. 하기 표 5에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 5에서 유지되는데, 단, 예외적으로, 서열 번호 1에서 nt 426에 있는 것 하나와 nt 582에 있는 것 하나인, 두 AATAAA 존재부가 AATCAA로 치환되어 있고, 이로써 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치는 유지되지만, 각각의 상기 두 AATAAA 서열은 문제성이 더 적은 서열로 치환된 것이 제시되어 있다. 하기 표 6에는 표 2에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 5에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다. 표 2 및 3에서 확인되는 서열에는 중복되는 것이 존재하기 때문에 (표 2에서 서열 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 13, 및 20은 표 3에서 각각 서열 16, 15, 2, 5, 1, 3, 4, 6, 13, 및 12에 상응한다), 표 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 5에서 감소되어 있다는 것 또한 사실이다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 5의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 5의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 5의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
상기 구축물의 한 실시양태에서, 서열 번호 5를 포함하는 1차 mRNA 전사체 제조는 그의 천연 인트론1과 함께 1 카피의 옥수수 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되었다 (미국 특허 번호 제5510474호). 옥수수 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역을 포함하는 단편 (ZmPer5 3'UTR v2; 미국 특허 번호 제6699984호)을 사용하여 전사를 종결시켰다. 상기 언급된 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 식물 형질전환 플라스미드인 pDAB111440을 구축하고, 트랜스제닉 옥수수 식물을 제조하는 데 사용하였다. 플라스미드 pDAB111440은 사탕수수 바실러스형 바드나바이러스(bacilliform badnavirus) (ScBV) 프로모터 (문헌 [Schenk et al. (1999) Plant Molec . Biol . 39: 1221-30])의 전사 제어하에 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD-1 v3; 미국 특허 번호 제7838733호(B2), 및 문헌 [Wright et al. (2010) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 107:20240-5])에 대한 코딩 영역을 포함하는 제초제 저항성 유전자를 추가로 포함하였다. 옥수수 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역을 포함하는 단편 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 번호 제7179902호)을 사용하여 전사를 종결시켰다.
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 2
바실러스 투린지엔시스 Cry34A 독소를 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. Cry34A 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 7에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 7에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 표준 유전자 코드를 사용하여 천연 DNA 서열을 상응하는 아미노산 서열로 번역시켰다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 7의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 7에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 부위를 제거하고, 표 1에서 확인되는 서열을 회복시키기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 7에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 9에 기재되어 있다. 서열 번호 9의 서열을 가지는 DNA를 합성하였다.
서열 번호 9를 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 11에 기재되어 있다. 하기 표 7에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 11에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 8에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 5에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 5의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 1 및 서열 번호 3을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 5의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 5의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 5의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 3
바실러스 투린지엔시스 Cry35Ab1 독소를 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. Cry35Ab1 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 13에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 13에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 13에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 13에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 15에 기재되어 있다. 상기 서열을 합성하고, 이는 본 발명에 따라 디자인된 합성 코딩 영역과의 비교를 위해 사용하는 것으로 하였다.
서열 번호 15를 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰는데, 단, 예외적으로, 서열 번호 8의 nt 228에 있는 것 하나와 nt 276에 있는 것 하나인, 두 AATAAA 존재부를 AATCAA로 치환하였다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 17에 기재되어 있다. 하기 표 9에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 17에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 10에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 13과 비교하여 서열 번호 17에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 17의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 13 및 서열 번호 15를 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 17의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 17의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 17의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 4
바실러스 투린지엔시스 Cry1Ab 코어 독소를 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. Cry1Ab 코어 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 19에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 19에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 19에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 19에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 21에 기재되어 있다.
서열 번호 21을 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 23에 기재되어 있다. 하기 표 11에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 23에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 12에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 19와 비교하여 서열 번호 23에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 23의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 23의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 23의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
상기 구축물의 한 실시양태에서, 서열 번호 23을 포함하는 1차 mRNA 전사체 제조는 그의 천연 인트론1과 함께 1 카피의 옥수수 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되었다 (미국 특허 번호 제5510474호). 옥수수 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역을 포함하는 단편 (ZmPer5 3'UTR v2; 미국 특허 번호 제6699984호)을 사용하여 전사를 종결시켰다. 상기 언급된 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 식물 형질전환 플라스미드인 pDAB111449를 구축하고, 트랜스제닉 옥수수 식물을 제조하는 데 사용하였다. 플라스미드 pDAB111449는 사탕수수 바실러스형 바드나바이러스 (ScBV) 프로모터 (문헌 [Schenk et al. (1999) Plant Molec . Biol . 39: 1221-30])의 전사 제어하에 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD-1 v3; 미국 특허 번호 제7838733호(B2), 및 문헌 [Wright et al. (2010) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 107:20240-5])에 대한 코딩 영역을 포함하는 제초제 저항성 유전자를 추가로 포함하였다. 옥수수 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역을 포함하는 단편 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 번호 제7179902호)을 사용하여 전사를 종결시켰다.
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 5
바실러스 투린지엔시스 Cry1Ca 코어 독소를 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. Cry35A 코어 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 25에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 25에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 25에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 25에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 27에 기재되어 있다. 상기 서열을 합성하고, 이는 본 발명에 따라 디자인된 합성 유전자와의 비교를 위해 사용하는 것으로 하였다.
서열 번호 27을 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 29에 기재되어 있다. 하기 표 13에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 29에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 14에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 25와 비교하여 서열 번호 29에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 29의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 25 및 서열 번호 27을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 29의 합성 유전자를 최적화시켰다.
서열 번호 29의 합성 유전자를, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 29의 합성 유전자를 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00013
Figure pct00014
실시예 6
바실러스 투린지엔시스 Cry6Aa 독소를 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. Cry6Aa 독소를 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 31에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 31에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 31에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 31에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 33에 기재되어 있다. 상기 서열을 합성하고, 이는 본 발명에 따라 디자인된 합성 유전자와의 비교를 위해 사용하는 것으로 하였다.
서열 번호 33을 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 35에 기재되어 있다. 하기 표 15에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 35에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 16에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 31과 비교하여 서열 번호 35에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 35의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 31 및 서열 번호 33을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 35의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 35의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 35의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00015
Figure pct00016
실시예 7
스핑고피움 허비시도보란스 AAD1을 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. AAD1 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 37에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 37에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 37에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 37에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 39에 기재되어 있다. 상기 서열을 합성하고, 이는 본 발명에 따라 디자인된 합성 유전자와의 비교를 위해 사용하는 것으로 하였다.
서열 번호 39를 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 41에 기재되어 있다. 하기 표 17에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 41에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 18에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 37과 비교하여 서열 번호 41에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 41의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 37 및 서열 번호 39를 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 41의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 41의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 41의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00017
Figure pct00018
실시예 8
아스퍼질러스 니둘란스 델타-9 데사투라제를 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. 아스퍼질러스 니둘란스 델타-9 데사투라제 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 43에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 43에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 43에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 43에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 45에 기재되어 있다. 상기 서열을 합성하고, 이는 본 발명에 따라 디자인된 합성 유전자와의 비교를 위해 사용하는 것으로 하였다.
서열 번호 45를 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 47에 기재되어 있다. 하기 표 1에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 47에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 20에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 43과 비교하여 서열 번호 47에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 47의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 43 및 서열 번호 45를 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 47의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 47의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 47의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00019
Figure pct00020
실시예 9
제로피타 비스코사 SAP1을 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. 제로피타 비스코사 SAP1 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 49에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 49에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 49에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 49에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 51에 기재되어 있다. 상기 서열을 합성하고, 이는 본 발명에 따라 디자인된 합성 유전자와의 비교를 위해 사용하는 것으로 하였다.
서열 번호 52를 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 53에 기재되어 있다. 하기 표 1에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 53에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 21에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 49와 비교하여 서열 번호 53에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 53의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 49 및 서열 번호 51을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 53의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 53의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 53의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00021
Figure pct00022
실시예 10
아에쿠오레아 빅토리아 GFP1을 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. 아에쿠오레아 빅토리아 GFP1을 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 55에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 55에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 55에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 55에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 57에 기재되어 있다. 상기 서열을 합성하고, 이는 본 발명에 따라 디자인된 합성 코딩 영역과의 비교를 위해 사용하는 것으로 하였다.
서열 번호 57을 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 59에 기재되어 있다. 하기 표 1에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 59에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 23에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 55와 비교하여 서열 번호 59에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 59의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 55 및 서열 번호 57을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 59의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 59의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 59의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00023
Figure pct00024
실시예 11
렙토스파에리아 노도룸 FAD9를 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. 렙토스파에리아 노도룸 FAD9 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 61에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 61에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 61에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 61에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 63에 기재되어 있다. 상기 서열을 합성하고, 이는 본 발명에 따라 디자인된 합성 코딩 영역과의 비교를 위해 사용하는 것으로 하였다.
서열 번호 63을 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 65에 기재되어 있다. 하기 표 1에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 65에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 25에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 61과 비교하여 서열 번호 65에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 65의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 61 및 서열 번호 63을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 65의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 65의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 65의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 12
제로피타 비스코사 PER1을 코딩하는 합성 코딩 영역
비교 서열. 제로피타 비스코사 PER1 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열은 서열 번호 67에 기재되어 있다. 상기 서열을 분석하여 표 1에서 확인되는 서열 중 어느 서열이 서열 번호 67에 존재하는지, 및 그의 위치에 대해 측정하였다. 이어서, 옥수수에서 사용하고자 하는 합성 유전자를 위해 표 4의 열에 기재된 표적 코돈 빈도를 사용하여 서열 번호 67에 의해 코딩된 아미노산 서열을 역 번역하였다. 생성된 DNA 서열을 분석하고, 표 1에서 확인되는 서열들은 모두 유지시키면서, 원치않는 오픈 리딩 프레임을 제거하고, 원치않는 제한 효소 인식 부위를 제거하기 위해 필요에 따라 코돈을 변경시켰다. 서열 번호 67에 의해 코딩된 아미노산 서열은 보존시켰다. 생성된 DNA 서열은 서열 번호 69에 기재되어 있다. 상기 서열을 합성하고, 이는 본 발명에 따라 디자인된 합성 코딩 영역과의 비교를 위해 사용하는 것으로 하였다.
서열 번호 69를 분석하고, 동일한 개수의 표 1에서 확인되는 서열은 유지시키면서, 표 2에서 확인되는 잠재적인 폴리아데닐화 신호 서열을 제거하기 위해 코돈을 변경시켰다. 본 발명을 구현하는 생성된 서열은 서열 번호 71에 기재되어 있다. 하기 표 1에는 표 1에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수 및 위치가 서열 번호 71에서 유지된다는 것이 제시되어 있다. 하기 표 27에는 표 2 및 3에서 확인되는 폴리아데닐화 신호 서열의 개수가 서열 번호 67과 비교하여 서열 번호 71에서 감소되어 있다는 것이 제시되어 있다.
서열 번호 71의 DNA를 합성하고, 상기 서열을 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준을 서열 번호 67 및 서열 번호 69를 발현하도록 형질전환된 식물 세포에서 관찰되는 발현 수준과 비교하였다.
옥수수에서의 발현을 위해 서열 번호 71의 합성 코딩 영역을 최적화시켰다.
서열 번호 71의 합성 코딩 영역을, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함하는 5' 비번역 영역, 및 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 3' 비번역 영역과 조합함으로써 서열 번호 71의 합성 코딩 영역을 발현시키는 데 사용하기 위한 구축물을 제조하였다.
Figure pct00027
Figure pct00028
실시예 13
Xv SAP1로의 옥수수의 위스커® 형질전환
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 프로모터인 Rd29A가 본 발명의 재디자인된 XvSAP1 코딩 영역 서열 (서열 번호 53)에 대해 5' 방향에 배치되어 있는 표준 위스커 형질전환 벡터를 구축하였다. 재디자인된 코딩 영역의 발현을 안정화시키기 위해 상기 서열 양 측면에는 지 메이즈(Zea maize) PER5인 3' 및 5' 비번역 영역이 존재하였다. 벼 액틴1 프로모터에 의해 구동되는 pat 선별 카세트 (예를 들어, US 5648477 참조)는 XvSAP1 발현 카세트에 대해 3' 방향에 배치되었다.
벡터 DNA를 적절한 제한 효소로 분해하여 벡터 골격 중에 존재하는 박테리아 암피실린 저항성 유전자를 함유하는 단편을 유리시키고, 위스커™-매개 형질전환에 적합한 선형 DNA 단편을 수득하였다. 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분취 규모로 XvSAP1 및 pat 발현 카세트를 함유하는 선형 단편을 정제하였다. (특별히 미국 특허 번호 제5302523호 및 제5464765호; 미국 특허 공개 번호 제2008/0182332호; 및 문헌 [Petolino and Arnold (2009) (Methods Molec. Biol. 526:59-67)]에 기술되어 있는 바와 같이) 위스커™-매개 형질전환을 통해 상기 식물 형질전환 DNA를 옥수수 Hi-II 현탁 세포 배양물 내로 전달하였다.
형질전환체를 선별용 배지 중에 놓고, 이후, 대략 8주 동안에 걸쳐 형질전환된 단리물을 수득하였다. 선별용 배지는 비알라포스 (골드 바이오테크놀로지(Gold BioTechnology))를 함유하는 LS 기반 배지 (LS 기초 배지, N6 비타민 1.5 mg/L 2,4-D, 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 일수화물; 피토테크놀로지스 라보라토리즈(PhytoTechnologies Labr.)), 30.0 gm/L 수크로스, 6 mM L-프롤린, 1.0 mg/L AgNO3, 250 mg/L 세포탁심, 2.5 gm/L 젤란검(Gellan gum) (pH 5.7))였다. 배 발생 단리물을 수득할 때까지 3 mg/L 비알라포스를 함유하는 선별용 배지로 배아를 옮겨 놓았다. 재생 및 추가 분석을 위하여 2주간의 간격을 두고 새 선별용 배지로 옮겨 놓음으로써 회수된 단리물을 벌크 업시켰다.
재생시키기 위해 배양물을 저광 조건 (14 μEm-2s-1)하에 1주 동안, 이어서, 고광 조건 (대략 89 μEm-2s-1)하에 1주 동안 있도록 "28" 유도 배지 (MS 염 및 비타민 30 gm/L 수크로스, 5 mg/L 벤질아미노퓨린, 0.25 mg/L 2,4-D, 3 mg/L 비알라포스, 250 mg/L 세포탁심, 2.5 gm/L 젤란검 (pH 5.7))로 옮겨 놓았다. 이어서, 조직을 "36" 재생 배지 (유도 배지와 동일, 단, 예외적으로, 식물 성장 조절 인자를 함유하지 않는다)로 옮겨 놓았다. 묘목의 길이가 3-5 cm에 도달하였을 때, 어린 싹 및 뿌리가 추가로 성장 및 발생할 수 있도록 하기 위해 SHGA 배지 (셴크(Schenk) 및 힐데브란트(Hildebrandt) 염 및 비타민 (1972); 피토테크놀로지스 라보라토리즈), 1.0 gm/L 미오-이노시톨, 10 gm/L 수크로스 및 2.0 gm/L 젤란검 (pH 5.8))을 함유하는 유리 배양용 튜브로 상기 묘목을 옮겨 놓았다. 본원에서 앞서 기술된 것과 동일한 토양 혼합물에 식물을 옮겨 심고, 개화할 때까지 온실에서 재배하였다. 종자 생산을 위해 인공 수분을 수행하였다.
실시예 14
아그로박테리움 형질전환
바이너리 식물 형질전환 및 발현 플라스미드를 구축하는 데 표준 클로닝 방법을 사용하였다. 제한 엔도뉴클레아제 및 T4 DNA 리가제는 NEB로부터 입수하였다. 뉴클레오스핀(NucleoSpin)® 플라스미드 제조용 키트 또는 뉴클레오본드® AX Xtra 미디 키트(NucleoBond® AX Xtra Midi kit) (상기 둘 모두 마슈레이-나겔(Macherey-Nagel)로부터 입수)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 플라스미드를 제조하였다. QIA퀵(QIAquick)® PCR 정제용 키트 또는 겔 단리 후, QIAEX II® 겔 추출용 키트 (둘 모두 퀴아젠(Qiage)으로부터 입수)를 사용하여 DNA 단편을 정제하였다.
본 발명에 따른 합성 유전자는 상업적 업체 (에컨대, DNA2.0 (미국 캘리포니아주 멘로파크))에 의해 합성되고, 표준 플라스미드 벡터 중의 클로닝된 단편으로서 공급받을 수 있거나, 또는 적절한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 다른 구축물의 표준 분자 생물학적 제작에 의해 수득할 수 있다.
비제한적인 일례로, 기본 클로닝 전략법은 전장의 코딩 서열 (CDS)을 NcoI 및 SacI 제한 부위에서 식물 발현 플라스미드로 서브클로닝하는 것일 수 있다. 예를 들어, 게이트웨이(Gateway)® 기술 또는 표준 제한 효소 단편 클로닝 방법을 사용하여 식물 발현 요소 (예컨대, 식물 발현가능한 프로모터, 3' 말단 전사 종결 및 폴리아데닐레이트 부가 결정기 등)의 제어하에 놓인 적절한 코딩 영역을 함유하는 생성된 식물 발현 카세트를 바이너리 벡터 플라스미드로 서브클로닝하였다. 게이트웨이® 기술이 사용되는 경우, 예를 들어, LR 클로나제(LR Clonase)™ (인비트로겐(Invitrogen))를 사용하여 전장 및 변형된 유전자 식물 발현 카세트를 바이너리 식물 형질전환 플라스미드로 재조합시킬 수 있다. 플라스미드가 E. 콜라이(E. coli) 및 아그로박테리움 세포에 존재할 경우, 항생제인 스펙티노마이신에 대한 저항성을 부여하는 박테리아 유전자를 보유하는 바이너리 식물 형질전환 벡터를 사용하는 것이 편리하다. 원하는 숙주 식물에서 작용성을 띠는 식물-발현가능한 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 바이너리 식물 형질전환 벡터를 사용하는 것 또한 편리하다. 식물-발현가능한 선별가능한 마커 유전자의 예로는 항생제인 카나마이신, 네오마이신 및 G418에 대해 저항성을 부여하는 것인, 트랜스포존 Tn5의 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자 (aphII)를 코딩하는 것 뿐만 아니라, 글리포세이트; 히그로마이신; 메토트렉세이트; 포스피노트리신 (비알라포스), 이미다졸리논, 술포닐우레아 및 트리아졸로피리미딘 제초제, 예컨대, 클로로술푸론, 브로목시닐, 달라폰 등에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
아그로박테리움 투메파시엔스 균주 Z707S (Z707의 스트렙토마이신-저항성 유도체; 문헌 [Hepburn et al., 1985, J. Gen . Microbiol. 131:2961-2969])의 전기-적격 세포를 제조하고, 전기천공을 사용하여 형질전환시켰다 (문헌 [Weigel and Glazebrook, 2002, Arabidopsis : A Laboratory Manual]). 전기천공 후, 1 mL의 YEP 브로쓰 (gm/L: 효모 추출물, 10; 펩톤, 10; NaCl, 5)를 큐벳에 첨가하고, 4시간 동안 일정하게 교반하면서 수조 중 28℃에서 인큐베이션시키기 위해 세포-YEP 현탁액을 15 mL 배양용 튜브로 옮겨 놓았다. 스펙티노마이신 (200 ㎍/mL) 및 스트렙토마이신 (250 ㎍/mL)을 포함하는 YEP + 아가 (25 gm/L) 상에 세포를 플레이팅하고, 플레이트를 28℃에서 2-4일 동안 인큐베이션시켰다. 잘 분리된 단일 콜로니를 선택하여 상기와 같은 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신을 포함하는 새 YEP + 아가 플레이트 상에 스트리킹하고, 28℃에서 1-3일 동안 인큐베이션시켰다.
선택된 아그로박테리움 콜로니로부터 제조된 주형 플라스미드 DNA와 함께 특이 프라이머를 사용하여 PCR 분석에 의해 바이너리 식물 형질전환 벡터 중 합성 유전자 삽입체의 존재에 대해 시험하였다. 상기와 같은 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신을 포함하는 YEP 중에서 밤새도록 성장된 15 mL의 배양물 중 4 mL의 분취량으로부터 얻은 세포 펠릿을 퀴아젠 스핀® 미니 프렙스(Qiagen Spin® Mini Preps)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 추출하였다. 아그로박테리움 전기천공 형질전환에서 사용된 바이너리 벡터로부터의 플라스미드 DNA는 대조군으로서 포함시켰다. 인비트로겐으로부터 입수한 Taq DNA 폴리머라제를 0.5X 농도로 사용하여 제조사의 설명서에 따라 PCR 반응을 완료하였다. 하기 조건으로 프로그래밍된 MJ 리서치 펠티에 써머 사이클러(MJ Research Peltier Thermal Cycler)에서 PCR 반응을 수행하였다: 단계 1) 94℃에서 3분 동안; 단계 2) 94℃에서 45초 동안; 단계 3) 55℃에서 30초 동안; 단계 4) 72℃에서 예상되는 생성물의 길이 1 kb당 1분씩; 단계 5) 단계 2까지 29회; 단계 6) 72℃에서 10분 동안. 사이클링한 후 반응물을 4℃에서 유지시켰다. 아가로스 겔 전기영동 (예컨대, 0.7w/v% 내지 1w/v% 아가로스)에 의해 증폭 생성물을 분석하고, 에티디움 브로마이드 염색에 의해 시각화시켰다. 플라스미드 대조군과 동일한 PCR 생성물을 갖는 콜로니를 선택하였다.
별법으로, 아그로박테리움 조작 분야의 당업자에게 주지되어 있는 표준 분자 생물학 방법에 의해 후보 아그로박테리움 단리물로부터 제조된 플라스미드 DNA의 제한 분해 핑거 프린트 지도화에 의해 합성 유전자 삽입체를 함유하는 바이너리 식물 형질전환 벡터의 플라스미드 구조를 분석하였다.
아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 통해 형질전환된 식물을 수득하는 데 있어서 당업자는 Z707S 이외의 다른 아그로박테리움 균주가 아주 잘 사용될 수 있으며, 균주의 선택은 형질전환시키고자 하는 숙주 식물 종의 아이덴티티에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 15
쌍자엽 식물에서의 살충 단백질 제조
아라비돕시스 형질전환. 플로랄 침지 방법 (문헌 [Weigel and Glazebrook, 상기 문헌 동일])을 사용하여 아라비돕시스 탈리아나 Col-01을 형질전환시켰다. 선택된 아그로박테리움 콜로니를 사용하여 선별용으로 적절한 항생제를 함유하는 1 mL 내지 15 mL의 YEP 브로쓰 배양물에 접종하였다. 배양물을 220 rpm으로 일정하게 교반하면서 28℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 각 배양물을 사용하여 선별용으로 적절한 항생제를 함유하는 500 mL의 두 YEP 브로쓰 배양물에 접종하고, 새 배양물을 일정하게 교반하면서 28℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 세포를 실온에서 10분 동안 대략 8,700 x g로 펠릿화하고, 생성된 상청액은 버렸다. ½ x 무라쉬게 및 스쿠그(Murashige and Skoog) 염 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))/겜보르그(Gamborg) B5 비타민 (골드 바이오테크놀로지: 미국 미주리즈 세인트 루이스), 10% (w/v) 수크로스, 0.044 μM 벤질아미노퓨린 (DMSO 중 1 mg/mL 스톡 1 ℓ당 10 ㎕) 및 300 ㎕/ℓ 실?(Silwet) L-77을 함유하는, 500 mL의 침투 배지 중에 세포 펠릿을 완만하게 재현탁시켰다. 대략 1개월 된 식물을 15초 동안 상기 배지 중에 침지시켰는데, 특히 가장 최근에 개화된 것이 확실히 잠기도록 주의를 기울여 침지시켰다. 이어서, 식물을 옆으로 눕혀 놓고, 24시간 동안 (투명 또는 불투명 덮개로) 커버링하고, 물로 세척하고, 똑바로 세워 놓았다. 식물을 16시간 동안의 명기/8시간 동안 암기인 광주기로 22℃에서 재배하였다. 침지 후 대략 4주 경과 후 종자를 수확하였다.
아라비돕시스 성장 및 선별. 새로 수확된 T1 종자를 건조제의 존재하에 실온에서 7일 이상 동안 건조시켰다. 종자를 0.1% 아가/물 (시그마-알드리치) 용액 중에 현탁시킨 후, 4℃에서 2일 동안 계층화하였다. 식재 준비를 위해 10.5 인치 x 21 인치의 발아용 트레이 (T.O. 플라스틱 인코퍼레이티드(T.O. Plastics Inc.: 미국 미네소타주 클리어워터)) 중의 선샤인 믹스 LP5(Sunshine Mix LP5) (선 그로 호어티컬처 인코퍼레이티드(Sun Gro Horticulture Inc.: 미국 워싱턴주 벨뷰))를 고운 질석으로 커버링하고, 젖을 때까지 호글랜드액(Hoagland's solution) (문헌 [Hoagland and Arnon, 1950])으로 지하 관수한 후, 24시간 동안 배수시켰다. 계층화된 종자를 질석 위에 파종하고, 7일 동안 습도용 돔(humidity dome) (KORD 프로덕츠(KORD Products: 캐나다 온타리오주 브래멀리))으로 커버링하였다. 장일 조건하에 (16시간 동안의 명기/8시간 동안 암기) 120-150 μmol/㎡sec의 광도로 일정한 온도 (22℃) 및 습도 (40-50%)하에 콘비론(Conviron) (모델 CMP4030 또는 CMP3244; 컨트롤드 인바이런먼츠 리미티드(Controlled Environments Limited: 캐나다 매니토바주 위니펙))에서 종자를 발아시키고, 식물을 재배하였다. 식물에 처음에는 호글랜드액으로 물을 공급한 후, 탈이온수로 공급하여 토양이 젖지 않고, 습윤 상태로 유지되도록 하였다.
파종 후 5-6일 경과하였을 때, 돔을 제거하고, 형질전환되지 않은 종자로부터 발아된 식물은 사멸시키기 위해서 선별용 화학 물질을 식물에 분무하였다. 예를 들어, 바이너리 식물 형질전환 벡터에 의해 제공받은 식물 발현가능한 선별가능한 마커 유전자가 pat 또는 bar 유전자일 경우 (문헌 [Wehrmann et al., 1996, Nat . Biotech. 14: 1274-1278]), 1,000X 피날레(Finale) 용액 (5.78% 글루포시네이트 암모늄, 파남 컴퍼니즈 인코퍼레이티드(Farnam Companies Inc.: 미국 애리조나주 피닉스))을 분무함으로써 형질전환된 식물을 선별해 낼 수 있었다. 5-7일 간격으로 2회에 걸쳐 연속하여 분무하였다. 최종 분무 후 7-10일이 경과하였을 때, 생존한 식물 (활발하게 성장하는 식물)을 확인하고, 선샤인 믹스 LP5가 준비된 포트로 옮겨 심었다. 옮겨 심은 식물을 3-4일 동안 습도용 돔으로 커버링하고, 상기 언급한 재배 조건하에 콘비론에 놓았다.
쌍자엽 식물 형질전환 분야의 당업자는 다른 식물 발현가능한 선별가능한 마커 유전자 (예컨대, 제초제 내성 유전자)가 사용될 경우, 형질전환된 식물을 선별하는 다른 방법도 이용가능하다는 것을 이해할 것이다.
트랜스제닉 아라비돕시스의 곤충 생물검정. Cry 단백질을 발현하는 트랜스제닉 아라비돕시스계는 인공 사료 오버레이 검정에서 감수성인 곤충 종에 대해 활성을 띠는 것으로 입증되었다. 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 아라비돕시스계로부터 추출된 단백질을 적절한 방법으로 정량화하고, 샘플의 부피를 조정하여 단백질 농도를 정규화하였다. 상기 기술된 바와 같이 인공 사료에 대한 생물검정을 수행하였다. 배경 체크 처리군으로서 검정에 비-트랜스제닉 아라비돕시스 및/또는 완충제 및 물을 포함시켰다.
실시예 16
슈퍼바이너리 벡터 생성을 위한 아그로박테리움 형질전환
단자엽 식물 숙주를 형질전환시키는 데에는 편리하게 아그로박테리움 슈퍼바이너리 시스템을 사용하였다. 슈퍼바이너리 벡터를 구축하고 입증하는 방법은 잘 개시되어 있으며, 본원에 참고로 포함된다 (문헌 [Operating Manual for Plasmid pSB1, Version 3.1], 일본 타바코 인코퍼레이티드(Japan Tobacco, Inc.: 일본 도쿄)로부터 이용가능). 표준 분자 생물학 및 미생물학 방법을 사용하여 슈퍼바이너리 플라스미드를 생성하였다. 상기에 바이너리 벡터에 대해 기술된 것과 같은 방법을 사용하여 슈퍼바이너리 플라스미드의 구조를 확인/입증하고, 문헌 [Operating Manual for Plasmid pSB1]에서 제안된 바와 같이 변형시킬 수 있었다.
실시예 17
단자엽 식물에서의 살충 단백질 제조
옥수수의 아그로박테리움-매개 형질전환. 95% 메트로-믹스(Metro-Mix) 360 무토양 재배 배지 (선 그로 호어티컬처: 미국 워싱턴주 벨뷰) 및 5% 점토/롬 토양의 혼합물을 함유하는 5갤런짜리 포트에 하이 II F1 잡종(High II F1 cross) (문헌 [Armstrong et al., 1991, Maize Genet . Coop . Newsletter 65:92-93])으로부터의 종자를 식재하였다. 고압 나트륨 및 금속 할라이드 램프와 16:8시간 동안의 명기:암기인 광주기의 조합을 사용하여 식물을 재배하였다. 형질전환을 위해 미성숙한 F2 배아를 수득하기 위하여 인공 동계 수분을 수행하였다. 배아의 크기가 대략 1.0 내지 2.0 mm가 되었을 때인, 수분 후 8-10일째에 미성숙한 배아를 단리시켰다.
감염 및 공동 배양. 액체 비누로 문지르고, 2분 동안 70% 에탄올 중에 침지시킨 후, 멸균수로 세정하기 전에 30분 동안 20% 시판용 표백제 (0.1% 차아염소산나트륨) 중에 침지시켜 옥수수 이삭 표면을 멸균시켰다. 28℃에서 2-3일 동안 100 mg/L 스펙티노마이신, 10 mg/L 테트라시클린, 및 250 mg/L 스트렙토마이신을 함유하는 YEP 고체 배지 중에서 성장시킨 박테리아 1-2 루프를, 100 μM 아세토시린곤을 함유하는 5 mL의 액체 감염 배지 (LS 기초 배지 (문헌 [Linsmaier and Skoog, 1965, Physiol . Plant . 18:100-127]), N6 비타민 (문헌 [Chu et al., 1975, Scientia Sinica 18:659-668]), 1.5 mg/L 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D), 68.5 gm/L 수크로스, 36.0 gm/L 글루코스, 6 mM L-프롤린 (pH 5.2))로 옮겨 놓음으로써 슈퍼바이너리 벡터를 함유하는 아그로박테리움 세포 현탁액을 제조하였다. 현탁액이 균일해질 때까지 용액을 와동시키고, 퍼플 필터가 장착된 클레트-서머슨(Klett-Summerson) 비색계를 사용하여 최종 밀도가 약 200 클레트 단위, 또는 (550 nm에서) 광학 밀도가 대략 0.4가 되도록 농도를 조정하였다. 2 mL 감염 배지를 함유하는 미량 원심분리관으로 직접 미성숙한 배아를 단리시켰다. 상기 배지를 제거하고, 밀도가 200 클레트 단위인 1 mL의 아그로박테리움 용액으로 대체하고, 아그로박테리움 및 배아 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 암실 조건하에 25℃에서 5일 동안 공동 배양용 배지 (LS 기초 배지, N6 비타민 1.5 mg/L 2,4-D, 30.0 gm/L 수크로스, 6 mM L-프롤린, 0.85 mg/L AgNO3, 100 μM 아세토시린곤, 3.0 gm/L 젤란검 (피토테크놀로지스 라보라토리즈: 미국 캔자스주 르넥사) (pH 5.8))로 옮겨 놓았다.
공동 배양한 후, 배아를 선별용 배지로 옮겨 놓고, 이어서, 대략 8주 동안에 걸쳐 형질전환된 단리물을 수득하였다. 식물 발현가능한 pat 또는 bar 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 슈퍼바이너리 플라스미드로 형질전환된 옥수수 조직을 선별하기 위해, 비알라포스 (골드 바이오테크놀로지)를 포함하는 LS 기반 배지 (LS 기초 배지, N6 비타민 1.5 mg/L 2,4-D, 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 일수화물; 피토테크놀로지스 라보라토리즈), 30.0 gm/L 수크로스, 6 mM L-프롤린, 1.0 mg/L AgNO3, 250 mg/L 세포탁심, 2.5 gm/L 젤란검 (pH 5.7))를 사용하였다. 배 발생 단리물을 수득할 때까지, 3 mg/L 비알라포스를 함유하는 선별용 배지로 배아를 옮겨 놓았다. 재생 및 추가 분석을 위하여 2주간의 간격을 두고 새 선별용 배지로 옮겨 놓음으로써 회수된 단리물을 벌크 업시켰다.
옥수수 형질전환 분야의 당업자는 다른 식물 발현가능한 선별가능한 마커 유전자 (예컨대, 제초제 내성 유전자)가 사용될 경우, 형질전환된 식물을 선별하는 다른 방법도 이용가능하다는 것을 이해할 것이다.
재생 및 종자 생산. 재생시키기 위해 배양물을 저광 조건 (14 μEm-2s-1)하에 1주 동안, 이어서, 고광 조건 (대략 89 μEm-2s-1)하에 1주 동안 있도록 "28" 유도 배지 (MS 염 및 비타민 30 gm/L 수크로스, 5 mg/L 벤질아미노퓨린, 0.25 mg/L 2, 4-D, 3 mg/L 비알라포스, 250 mg/L 세포탁심, 2.5 gm/L 젤란검 (pH 5.7))로 옮겨 놓았다. 이어서, 조직을 "36" 재생 배지 (유도 배지와 동일, 단, 예외적으로, 식물 성장 조절 인자를 함유하지 않는다)로 옮겨 놓았다. 묘목의 길이가 3-5 cm에 도달하였을 때, 어린 싹 및 뿌리가 추가로 성장 및 발생할 수 있도록 하기 위해 SHGA 배지 (셴크 및 힐데브란트 염 및 비타민 (1972); 피토테크놀로지스 라보라토리즈), 1.0 gm/L 미오-이노시톨, 10 gm/L 수크로스 및 2.0 gm/L 젤란검 (pH 5.8))을 함유하는 유리 배양용 튜브로 상기 묘목을 옮겨 놓았다. 본원에서 앞서 기술된 것과 동일한 토양 혼합물에 식물을 옮겨 심고, 개화할 때까지 온실에서 재배하였다. 종자 생산을 위해 인공 수분을 수행하였다.
별법으로, 바이너리 벡터를 사용하여 식물 게놈 내로 안정하게 통합되어 있고, 본원에 개시된 코딩 영역을 포함하는 하나 이상의 키메라 유전자를 함유하는 트랜스제닉 옥수수 식물을 생산할 수 있었다. 예를 들어, 서열 번호 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 또는 71 중 1 이상의 코딩 영역을 포함하는 식물은 아그로박테리움-매개 형질전환에 따라 생산할 수 있었다. 바이너리 형질전환 벡터를 사용하는 옥수수 형질전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 형질전환된 조직은 할록시폽-함유 배지 중에서 성장할 수 있는 그의 능력에 의해 선별되고, 적절할 경우, 단백질 생산에 대해 스크리닝된다.
이삭 멸균 및 배아 단리. 온실에서 성장시킨 지 메이즈 근교계 B104 식물로부터 옥수수 미성숙한 배아를 수득하고, 자가 수분 또는 동계 수분시켜 이삭을 생산하였다. 수분 후 대략 9 내지 12일째에 이삭을 수확하였다. 실험 당일, 20% 차아염소산나트륨 용액 (6.15%) 중에 침지시켜 껍질이 제거된 이삭 표면을 멸균시키고, 20 내지 30 min 동안 진탕시킨 후, 멸균수로 3회에 걸쳐 세정하였다. 멸균시킨 후, 각 이삭으로부터 미성숙한 접합자배 (1.5 내지 2.4 mm)를 무균 방식으로 절개하고, 액체 접종용 배지가 함유되어 있는 미량 원심분리관으로 무작위로 분배하였다. 접종용 배지는 2.2 gm/L MS 염 (문헌 [Frame et al., 2011, Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos . IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, ( Eds ), SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA , LLC . pp 327-341]); 1 X ISU 변형된 MS 비타민 (문헌 [Frame et al., 2011 상기 문헌 동일]); 68.4 gm/L 수크로스; 36 gm/L 글루코스; 115 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 미오-이노시톨; 및 200 μM 아세토시린곤 (DMSO 중에서 제조) (pH 5.4)을 함유하였다. 주어진 실험 설정을 위해 풀링된 이삭으로부터의 배아를 각 형질전환에 사용하였다.
아그로박테리움 배양 개시. 바이너리 형질전환 벡터 pDAB111440 (실시예 1)을 함유하는 아그로박테리움 균주 DAt13192 (국제 PCT 공개 번호 WO2012016222(A2))의 글리세롤 스톡을 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 (문헌 [Watson, et al., (1975) J. Bacteriol . 123:255-264]) 상에 스트리킹하고, 3 내지 4일 동안 20℃에서 성장시켰다. 단일 콜로니를 선택하고, 같은 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 (gm/L: 효모 추출물, 10; 펩톤, 10; NaCl 5)상에 스트리킹하고, 1-2일 동안 20℃에서 인큐베이션시켰다.
아그로박테리움 배양 및 공동 배양. 아그로박테리움 콜로니를 YEP 플레이트로부터 채취하고, 50 mL 일회용 튜브 중 10 mL의 접종용 배지 중에 현탁시키고, 분광광도계를 사용하여 세포 밀도를 OD550 = 0.2 내지 0.4 (550 nm에서 측정된 광학 밀도; 세포 성장의 척도)로 조정하였다. 배아를 절개하면서, 아그로박테리움 배양물을 125 rpm (실온)의 회전식 진탕기 상에서 인큐베이션시켰다. (앞서 멸균된 옥수수 낟알로부터 단리되고, 1 mL 접종용 배지 중에 놓여진) 미성숙한 접합자배를 같은 배지 중에서 1회 세척하였다. 2 ml의 아그로박테리움 현탁액을 각각의 배아 튜브에 첨가하고, 튜브를 10 내지 15분 동안 진탕기 플랫폼 상에 놓았다. 배아를 공동 배양용 배지 위로 옮겨 놓고, 배반이 위쪽으로 향하게 하고, 50 μEm-2sec-1 광도로 24시간 명기하에 3일 동안 인큐베이션시켰다. 공동 배양용 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1 X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바 (3,6-디클로로-o-아니스산 또는 3,6-디클로로-2-메톡시벤조산); 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수 분해물; 15 mg/L AgNO3; DMSO 중 100 μM 아세토시린곤; 및 3 gm/L 젤잔(GELZAN)™ (시그마-알드리치) (pH 5.8)을 함유하였다.
캘러스 선별 및 추정 이벤트 재생. 공동 배양 기간 후, 배아를 휴면 배지로 옮겨 놓고, 25℃에서 3일 동안 50 μEm-2sec-1 광도로 24시간 동안 명기하에 인큐베이션시켰다. 휴면 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1 X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바; 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수 분해물; 15 mg/L AgNO3; 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 일수화물; 피토테크놀로지스 라보라토리즈: 미국 캔자스주 르넥사); 250 mg/L 카르베니실린; 및 2.3 gm/L 젤잔™ (pH 5.8)을 함유하였다. 배아를 (100 nM R-할록시폽산 (0.0362 mg/L)과 함께 (상기) 휴면 배지로 구성된) 선별용 배지 1 상에 옮겨 놓고, 28℃에서 7 내지 14일 동안 암실에서 및/또는 50 μEm-2sec-1 광도로 24시간 동안 명기하에 인큐베이션시켰다. 증식성 배 발생 캘러스를 (500 nM R-할록시폽산 (0.1810 mg/L)과 함께 (상기) 휴면 배지로 구성된) 선별용 배지 2 상에 옮겨 놓고, 28℃에서 14 내지 21일 동안 50 μEm-2sec-1 광도로 24시간 동안 명기하에 인큐베이션시켰다. 상기 선별 단계를 통해 트랜스제닉 캘러스를 추가로 증식시키고, 분화시켰다.
증식성 배 발생 캘러스를 전갱(PreRegeneration)용 배지 상에 옮겨 놓고, 28℃에서 7일 동안 50 μEm-2sec-1 광도로 24시간 동안 명기하에 인큐베이션시켰다. 전갱용 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1 X ISU 변형된 MS 비타민; 45 gm/L 수크로스; 350 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 미오-이노시톨; 50 mg/L 카세인 효소 가수 분해물; 1.0 mg/L AgNO3; 0.25 gm/L MES; NaOH 중 0.5 mg/L 나프탈렌아세트산; 에탄올 중 2.5 mg/L 아브시스산; 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린; 250 mg/L 카르베니실린; 2.5 gm/L 젤잔™; 및 500 nM R-할록시폽산 (pH 5.8)을 함유하였다. 어린 싹-유사 눈이 있는 배 발생 캘러스를 전갱용 배지 상으로 옮겨 놓고, 7일 동안 50 μEm-2sec-1 광도로 24시간 동안 명기하에 배양하였다. 전갱용 배지 I은 4.33 gm/L MS 염; 1 X ISU 변형된 MS 비타민; 60 gm/L 수크로스; 100 mg/L 미오-이노시톨; 125 mg/L 카르베니실린; 3.0 gm/L 젤잔™; 및 500 nM R-할록시폽산 (pH 5.8)을 함유하였다. 주근이 있는 작은 어린 싹을 피타트레이스(PHYTATRAYS) (피토테크놀로지스 라보라토리즈: 미국 캔자스주 르넥사) 중의 어린 싹/뿌리용 배지로 옮겨 놓고, 27℃에서 7일 동안 140 내지 190 μEm-2sec-1 광도로 16:8 hr 동안의 명기:암기하에 인큐베이션시켰다. 어린 싹/뿌리용 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1 X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 100 mg/L 미오-이노시톨; 3.5 gm/L 젤잔™을 pH 5.8로 함유하였다. 정량적 실시간 PCR 또는 다른 표준 분자 분석 기법에 의해 트랜스진 카피수를 분석하고, 토양으로 옮겨 놓았다.
종자 생산을 위한 T0 식물의 온실로의 옮김 및 확립. 500 nM R-할록시폽산을 함유하는 배지 상에서 성장할 수 있는 그의 능력에 의해 선별된 형질전환된 식물 조직을 메트로-믹스 360 무토양 재배 배지 (선 그로 호어티컬처)로 옮겨 심고, 성장실에서 튼튼하게 하였다. 이어서, 식물을 선샤인 커스텀 블렌드 160(SUNSHINE CUSTOM BLEND 160) 토양 혼합물로 옮겨 심고, 개화할 때까지 온실에서 재배하였다. 종자 생산을 위해 인공 수분을 수행하였다.
선택된 T0 식물의 잎 조직을 V-3 내지 V-5기에서 샘플링하였다. 직경이 6 mm인 잎 샘플 2개를 분석 당일날까지 -80℃에서 96웰 클러스터 튜브 꽂이에 보관하였다. 두 데이지(DAISY)™ 스틸 BB 및 200 ㎕의 추출용 완충제 (0.05%의 트윈(Tween) 20 및 5 ㎕/ml의 시그마(SIGMA) 프로테아제 억제제 칵테일 (카탈로그 번호 9599)을 함유하는 PBS 용액)을 각 튜브에 첨가하였다. 최대의 설정 환경하에 3분 동안 클레코(KLECO) 비드 밀 (미국 캘리포니아주 비세일리아)에서 밀링하였다. 샘플을 5분 동안 3,000 x g로 원심분리한 후, 100 ㎕ 상청액을 빈 샘플 튜브로 옮겨 놓았다. 또 다른 100 ㎕ 추출용 완충제를 식물 샘플에 첨가하고, 추가로 3분 동안 비드 밀링하였다. 다시 원심분리한 후, 100 ㎕의 상기 추출물을 처음의 100 ㎕의 것과 함께 조합하였다. 조합된 상청액을 혼합하고, 추출한 날과 같은 날에 분석하였다.
잎 조직의 측정된 면적으로부터 추출된 단백질을 표준 ELISA (효소-결합 면역흡착 검정법) 또는 단백질 면역블롯 (웨스턴 블롯)에 의해 Cry1Fa 단백질 및 AAD-1 단백질 발현에 관하여 분석하였다. Cry1Fa ELISA 검출을 위해, 엔비롤로직스(ENVIROLOGIX) ELISA 키트 (카탈로그 번호 AP 016 NW V10; 미국 메인주 포틀랜드)로부터의 시약을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 정제된 AAD-1 단백질에 대해 제조된 토끼 항체를 사용하여 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (1995 및 최신판) Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley and Sons, New York]에 교시된 바와 같은) 표준 ELISA 방법에 의해 AAD-1 검출을 수행하였다.
pDAB111440-형질전환된 식물의 추출물로부터 얻은 ELISA 결과는 하기 표 29에 개시되어 있다. 단백질 수준은 잎 수확 면적 1 ㎠당 검출되는 대상 단백질의 ng 수로 표시하였다.
Figure pct00029
표 29에 열거되어 있는 5개의 pDAB111440-형질전환 식물의 단백질 추출물 (뿐만 아니라, 형질전환되지 않은 음성 대조군 식물로부터의 추출물)을 상기와 같이 제조하고, 면역블롯 (웨스턴 블롯) 상에서 Cry1Fa 항체로 프로빙하였다. 면역블롯 방법은 본질적으로 문헌 [Gallagher et al. (2008; Immunoblotting and Immunodetection. Current Protocols in Immunology 8.10.1-8.10.28]에 기술되어 있는 것과 같았다. 단백질 샘플 (80 ㎕)을 20 ㎕의 인비트로겐 NuPAGE LDS 샘플 완충제와 혼합하고, 5 min 동안 >90℃에서 가열하고, 인비트로겐 NuPAGE 4-12% 비스-트리스 겔 상에서 로딩하고, MOPS SDS 전개용 완충제 중에서 전개시켰다 (45분 동안 200 볼트). 바이오래드 프리시전 플러스 듀얼 컬러 스탠다드(BIORAD PRECISION PLUS Dual Color Standards)를 별개의 래인에 로딩하였다. 단백질을 인비트로겐 i블롯 겔 트랜스퍼 시스템(INVITROGEN iBLOT Gel Transfer system)에 의해 제조사의 설명서에 따라 0.2 μM 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 놓았다. 막을 인비트로겐 웨스턴 브리즈 블로킹 믹스(INVITROGEN WESTERN BREEZE BLOCKING MIX)로 차단한 후, 1차 항체 (항-Cry1F 정제된 토끼 항체 번호 D0609RA07-A0; 스트러티직 다이어그나스틱스 인코퍼레이티드(Strategic Diagnostics Inc: 미국 델라웨어주 뉴어크))에 이어, 2차 항체 (인비트로겐 비오티닐화된 염소 항-토끼 항체)와 반응시켰다. 이어서, 인비트로겐 HRP-스트렙트아비딘 컨쥬게이트와 반응시키고, 피어스 슈퍼시그널 피코 루미놀 인핸서 앤드 스테이블 퍼옥시드(PIERCE SUPERSIGNAL WEST PICO LUMINOL ENHANCER AND STABLE PEROXIDE) (번호 34080)에 의해 반응 밴드를 검출하였다.
양성 대조군 래인은 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 발현 시스템에서 전장의 Cry1Fa 코딩 영역의 발현에 의해 제조된 0.5 ng 또는 1.0 ng의 정제된 Cry1Fa 코어 독소 단백질을 함유하였다 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 20100269223A1 참조). 전장의 Cry1Fa 단백질을 트립신으로 처리하여 계산된 분자 크기가 68 kDa인 Cry1Fa 코어 독소 세그먼트를 유리시키고, 이를 면역블롯시 양성 대조군 표준으로서 사용하였다. 음성 대조군 식물로부터의 추출물 중에서는 어떤 항체-반응 밴드도 검출되지 않은 반면, 5개의 트랜스제닉 식물 추출물은 모두 예측 크기가 75 kDa보다는 다소 더 큰, 단일의 우세한 밴드 (대조군 Cry1Fa 단백질과 강도가 거의 동일)를 함유하였다.
곤충 해충을 방제하는 방법. 곤충이 트랜스제닉 식물 발현을 통해 전달된 유효량의 독소와 접촉하였을 때, 그 결과로 전형적으로는 곤충은 사멸하거나, 독소가 곤충에 이용될 수 있도록 하는 공급원을 곤충은 상식하지 못하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC <120> Synthetic Genes <130> DAS-P0273-01-WO <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1818 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <220> <221> CDS <222> (1)..(1818) <223> Native DNA sequence encoding Bacillus thuringiensis Cry1Fa core toxin <400> 1 atg gag aat aat att caa aat caa tgc gta cct tac aat tgt tta aat 48 Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn 1 5 10 15 aat cct gaa gta gaa ata tta aat gaa gaa aga agt act ggc aga tta 96 Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu 20 25 30 ccg tta gat ata tcc tta tcg ctt aca cgt ttc ctt ttg agt gaa ttt 144 Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe 35 40 45 gtt cca ggt gtg gga gtt gcg ttt gga tta ttt gat tta ata tgg ggt 192 Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly 50 55 60 ttt ata act cct tct gat tgg agc tta ttt ctt tta cag att gaa caa 240 Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln 65 70 75 80 ttg att gag caa aga ata gaa aca ttg gaa agg aac cgg gca att act 288 Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr 85 90 95 aca tta cga ggg tta gca gat agc tat gaa att tat att gaa gca cta 336 Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu 100 105 110 aga gag tgg gaa gca aat cct aat aat gca caa tta agg gaa gat gtg 384 Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val 115 120 125 cgt att cga ttt gct aat aca gac gac gct tta ata aca gca ata aat 432 Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn 130 135 140 aat ttt aca ctt aca agt ttt gaa atc cct ctt tta tcg gtc tat gtt 480 Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val 145 150 155 160 caa gcg gcg aat tta cat tta tca cta tta aga gac gct gta tcg ttt 528 Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe 165 170 175 ggg cag ggt tgg gga ctg gat ata gct act gtt aat aat cat tat aat 576 Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn 180 185 190 aga tta ata aat ctt att cat aga tat acg aaa cat tgt ttg gac aca 624 Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr 195 200 205 tac aat caa gga tta gaa aac tta aga ggt act aat act cga caa tgg 672 Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp 210 215 220 gca aga ttc aat cag ttt agg aga gat tta aca ctt act gta tta gat 720 Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp 225 230 235 240 atc gtt gct ctt ttt ccg aac tac gat gtt aga aca tat cca att caa 768 Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln 245 250 255 acg tca tcc caa tta aca agg gaa att tat aca agt tca gta att gag 816 Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu 260 265 270 gat tct cca gtt tct gct aat ata cct aat ggt ttt aat agg gcg gaa 864 Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu 275 280 285 ttt gga gtt aga ccg ccc cat ctt atg gac ttt atg aat tct ttg ttt 912 Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe 290 295 300 gta act gca gag act gtt aga agt caa act gtg tgg gga gga cac tta 960 Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu 305 310 315 320 gtt agt tca cga aat acg gct ggt aac cgt ata aat ttc cct agt tac 1008 Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr 325 330 335 ggg gtc ttc aat cct ggt ggc gcc att tgg att gca gat gag gat cca 1056 Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro 340 345 350 cgt cct ttt tat cgg aca tta tca gat cct gtt ttt gtc cga gga gga 1104 Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly 355 360 365 ttt ggg aat cct cat tat gta ctg ggg ctt agg gga gta gca ttt caa 1152 Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln 370 375 380 caa act ggt acg aac cac acc cga aca ttt aga aat agt ggg acc ata 1200 Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile 385 390 395 400 gat tct cta gat gaa atc cca cct cag gat aat agt ggg gca cct tgg 1248 Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp 405 410 415 aat gat tat agt cat gta tta aat cat gtt aca ttt gta cga tgg cca 1296 Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro 420 425 430 ggt gag att tca gga agt gat tca tgg aga gct cca atg ttt tct tgg 1344 Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp 435 440 445 acg cac cgt agt gca acc cct aca aat aca att gat ccg gag agg att 1392 Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile 450 455 460 act caa ata cca ttg gta aaa gca cat aca ctt cag tca ggt act act 1440 Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr 465 470 475 480 gtt gta aga ggg ccc ggg ttt acg gga gga gat att ctt cga cga aca 1488 Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr 485 490 495 agt gga gga cca ttt gct tat act att gtt aat ata aat ggg caa tta 1536 Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu 500 505 510 ccc caa agg tat cgt gca aga ata cgc tat gcc tct act aca aat cta 1584 Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu 515 520 525 aga att tac gta acg gtt gca ggt gaa cgg att ttt gct ggt caa ttt 1632 Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe 530 535 540 aac aaa aca atg gat acc ggt gac cca tta aca ttc caa tct ttt agt 1680 Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser 545 550 555 560 tac gca act att aat aca gct ttt aca ttc cca atg agc cag agt agt 1728 Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser 565 570 575 ttc aca gta ggt gct gat act ttt agt tca ggg aat gaa gtt tat ata 1776 Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile 580 585 590 gac aga ttt gaa ttg att cca gtt act gca aca ttt gaa tag 1818 Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Phe Glu 595 600 605 <210> 2 <211> 605 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 2 Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn 1 5 10 15 Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu 20 25 30 Pro Leu 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Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln 245 250 255 Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu 260 265 270 Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu 275 280 285 Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe 290 295 300 Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu 305 310 315 320 Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr 325 330 335 Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro 340 345 350 Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly 355 360 365 Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln 370 375 380 Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile 385 390 395 400 Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp 405 410 415 Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro 420 425 430 Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp 435 440 445 Thr His Arg Ser Ala Thr 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atc cag aat caa tgc gtg cct tac aat tgt tta aat 48 Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn 1 5 10 15 aat ccc gag gtg gag ata tta aac gag gag aga tcc act ggc aga ctg 96 Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu 20 25 30 cca ctc gat ata tcc ttg tcc ctt acc cgt ttc ctt ttg agc gaa ttt 144 Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe 35 40 45 gtt cct ggt gtg gga gtg gct ttc gga tta ttt gat ctg ata tgg ggt 192 Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly 50 55 60 ttt atc act cct tct gat tgg agc tta ttt ctt ctc cag att gag caa 240 Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln 65 70 75 80 ttg att gag cag aga ata gaa acc ttg gaa agg aac cgt gca atc acg 288 Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr 85 90 95 acc ttg cgc ggt ctc gcc gat agc tat gaa att tat att gaa gca ctg 336 Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu 100 105 110 agg gag tgg gag gcc aac cct aat aat gct caa tta agg gaa gat gtg 384 Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val 115 120 125 cgt att cgt ttt gct aat aca gac gac gct tta ata aca gca ata aat 432 Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn 130 135 140 aat ttc aca ctt aca tcc ttt gaa atc ccg ctt tta tca gtg tac gtt 480 Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val 145 150 155 160 caa gcc gcc aat ctc cat tta tca ctt ctg agg gac gct gtc tcc ttt 528 Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe 165 170 175 ggg caa ggt tgg gga ctg gat atc gct act gtt aat aat cac tac aat 576 Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn 180 185 190 aga tta ata aac ctg att cat aga tat acg aag cat tgt ttg gac aca 624 Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr 195 200 205 tac aat caa gga ctg gag aac ctt agg gga act aac act agg cag tgg 672 Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp 210 215 220 gca agg ttc aac cag ttc aga cgt gat ctc aca ctt act gtg ctg gat 720 Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp 225 230 235 240 atc gtt gct ctc ttt ccg aac tac gat gtt cgc acc tac cca atc cag 768 Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln 245 250 255 acg tca tcc caa tta aca agg gaa att tat acc tcc tca gtg att gag 816 Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu 260 265 270 gac tct ccc gtt tct gct aac ata cct aac ggc ttc aac cgc gcc gag 864 Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu 275 280 285 ttc gga gtt aga ccg ccc cac ctt atg gac ttt atg aat agc ttg ttt 912 Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe 290 295 300 gtg act gct gag act gtt aga agc caa act gtg tgg ggc ggc cac ttg 960 Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu 305 310 315 320 gtc agc tca cgc aac acg gct ggc aac cgt atc aac ttc ccg tct tac 1008 Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr 325 330 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Phe Ser Trp 435 440 445 acg cac cgt tca gcc acc cct aca aat aca att gac ccg gag agg att 1392 Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile 450 455 460 act caa atc cca ttg gtc aaa gca cat aca ctt cag tct ggg acc acc 1440 Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr 465 470 475 480 gtg gtc aga ggg cct ggg ttc acg gga gga gac att ctt agg cgc aca 1488 Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr 485 490 495 tcc gga gga ccc ttc gct tat act atc gtt aat ata aat ggg cag ctc 1536 Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu 500 505 510 ccc cag cgc tat cgt gcc aga atc cgt tac gcc tct act aca aat ctc 1584 Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu 515 520 525 aga atc tac gtg acg gtt gcc ggt gag cgc att ttt gct ggt cag ttt 1632 Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe 530 535 540 aac aag acg atg gat act ggc gac cca ctg aca ttc caa tct ttc tca 1680 Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser 545 550 555 560 tac gca act att aat aca gct ttc aca ttc cca atg agc cag tca tct 1728 Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser 565 570 575 ttc acc gtc ggt gct gat acc ttc agc tct ggc aac gaa gtt tat ata 1776 Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile 580 585 590 gac aga ttt gag ttg att cca gtt act gca acg ttt gag tga 1818 Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Phe Glu 595 600 605 <210> 4 <211> 605 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn 1 5 10 15 Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu 20 25 30 Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe 35 40 45 Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly 50 55 60 Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln 65 70 75 80 Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr 85 90 95 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Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu 515 520 525 Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe 530 535 540 Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser 545 550 555 560 Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser 565 570 575 Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile 580 585 590 Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Phe Glu 595 600 605 <210> 5 <211> 1818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA sequence in accordance with the invention encoding Bacillus thuringiensis Cry1Fa core toxin using codons optimized for maize and with sequences identified in Table 2 removed and Table 1 sequences are maintained <220> <221> CDS <222> (1)..(1818) <400> 5 atg gag aat aat atc cag aat caa tgc gtg cct tac aat tgt ctc aat 48 Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn 1 5 10 15 aat ccc gag gtg gag ata tta aac gag gag aga tcc act ggc aga ctg 96 Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu 20 25 30 cca ctc gac ata tcc ttg tcc ctt acc cgt ttc ctt ttg agc gaa ttt 144 Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe 35 40 45 gtt cct ggt gtg gga gtg gct ttc gga ctg ttc gat ctg ata tgg ggc 192 Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly 50 55 60 ttt atc act cct tct gat tgg agc ctc ttc ctt ctc cag att gag caa 240 Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln 65 70 75 80 ttg att gag cag aga ata gaa acc ttg gaa agg aac cgt gca atc acg 288 Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr 85 90 95 acc ttg cgc ggt ctc gcc gat agc tat gaa atc tac att gaa gca ctg 336 Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu 100 105 110 agg gag tgg gag gcc aac ccc aat aat gct caa tta agg gaa gat gtg 384 Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val 115 120 125 cgt att cgt ttt gct aat aca gac gac gct ctc atc aca gca atc aat 432 Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn 130 135 140 aat ttc aca ctt aca tcc ttt gaa atc ccg ctt ttg agc gtg tac gtt 480 Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val 145 150 155 160 caa gcc gcc aat ctc cac ctc tca ctt ctg agg gac gct gtc tcc ttt 528 Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe 165 170 175 ggg caa ggt tgg gga ctg gat atc gct act gtg aat aat cac tac aat 576 Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn 180 185 190 aga tta atc aac ctg att cat aga tat acg aag cac tgc ttg gac aca 624 Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr 195 200 205 tac aat caa gga ctg gag aac ctt agg gga act aac act agg cag tgg 672 Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp 210 215 220 gca agg ttc aac cag ttc aga cgt gat ctc aca ctt act gtg ctg gat 720 Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp 225 230 235 240 atc gtt gct ctc ttt ccg aac tac gat gtt cgc acc tac cca atc cag 768 Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln 245 250 255 acg tca tcc caa tta aca agg gaa atc tac acc tcc tca gtg att gag 816 Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu 260 265 270 gac tct ccc gtt tct gct aac ata cct aac ggc ttc aac cgc gcc gag 864 Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu 275 280 285 ttc gga gtt aga ccg ccc cac ctt atg gac ttt atg aat agc ttg ttc 912 Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe 290 295 300 gtg act gct gag act gtt aga agc caa act gtg tgg ggc ggc cac ttg 960 Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu 305 310 315 320 gtc agc tca cgc aac acg gct ggc aac cgt atc aac ttc ccg tct tac 1008 Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr 325 330 335 ggg gtc ttt aac cct ggt ggc gcc att tgg att gca gac gag gac cca 1056 Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro 340 345 350 cgt cct ttt tac cgc acc ctg tca gat ccg gtt ttc gtc aga ggc gga 1104 Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly 355 360 365 ttt ggg aat cct cat tat gtc ctg ggc ctt agg gga gtg gct ttc caa 1152 Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln 370 375 380 cag act ggc acc aac cac acc cgt acg ttt cgc aat agc ggg acc ata 1200 Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile 385 390 395 400 gat tct ctt gat gaa atc cca cct caa gat aac agc ggc gca cct tgg 1248 Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp 405 410 415 aac gat tat tcc cac gta tta aat cac gtt acg ttc gtc cgc tgg ccg 1296 Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro 420 425 430 ggt gag atc agc ggc agc gat tca tgg aga gca cca atg ttc tct tgg 1344 Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp 435 440 445 acg cac cgt tca gcc acc cct aca aat aca att gac ccg gag agg att 1392 Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile 450 455 460 act caa atc cca ttg gtc aaa gca cat aca ctt cag tct ggg acc acc 1440 Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr 465 470 475 480 gtg gtc aga ggg cct ggg ttc acg gga gga gac att ctt agg cgc aca 1488 Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr 485 490 495 tcc gga gga ccc ttc gct tat act atc gtt aat ata aat ggg cag ctc 1536 Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu 500 505 510 ccc cag cgc tat cgt gcc aga atc cgt tac gcc tct act aca aat ctc 1584 Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu 515 520 525 aga atc tac gtg acg gtt gcc ggt gag cgc atc ttt gct ggt cag ttt 1632 Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe 530 535 540 aac aag acg atg gat act ggc gac cca ctg aca ttc caa tct ttc tca 1680 Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser 545 550 555 560 tac gca act att aat aca gct ttc aca ttc cca atg agc cag tca tct 1728 Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser 565 570 575 ttc acc gtc ggt gct gat acc ttc agc tct ggc aac gaa gtc tat atc 1776 Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile 580 585 590 gac aga ttt gag ttg att cca gtt act gca acg ttt gag tga 1818 Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Phe Glu 595 600 605 <210> 6 <211> 605 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn 1 5 10 15 Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu 20 25 30 Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe 35 40 45 Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly 50 55 60 Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln 65 70 75 80 Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr 85 90 95 Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu 100 105 110 Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val 115 120 125 Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile 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gaa att agt tta tat ttt gac aat cct ttt gca 240 Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala 65 70 75 80 ggt tct aat aaa tat gat gga cat tcc aat aaa tct caa tat gaa att 288 Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln Tyr Glu Ile 85 90 95 att acc caa gga gga tca gga aat caa tct cat gtt acg tat act att 336 Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 100 105 110 caa acc aca tcc tca cga tat ggg cat aaa tca taa 372 Gln Thr Thr Ser Ser Arg Tyr Gly His Lys Ser 115 120 <210> 8 <211> 123 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 8 Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His 1 5 10 15 Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30 Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45 Glu Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser 50 55 60 Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala 65 70 75 80 Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln 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ttt gac aat cca ttc gcg 240 Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala 65 70 75 80 ggg tct aat aaa tac gac gga cac tcc aat aaa tct caa tat gaa atc 288 Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln Tyr Glu Ile 85 90 95 att aca caa ggc ggc agc gga aat caa agc cac gtc acg tat act atc 336 Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 100 105 110 cag acc act tca tcg cgc tac ggg cat aaa tca tag 372 Gln Thr Thr Ser Ser Arg Tyr Gly His Lys Ser 115 120 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His 1 5 10 15 Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30 Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45 Glu Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser 50 55 60 Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala 65 70 75 80 Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn 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aat tgt aaa gtt tgg aat gtt aat aat gat aaa ata aat gtt tcg 240 Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 65 70 75 80 act tat tct tca aca aat tca ata caa aaa tgg caa ata aaa gct aat 288 Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn 85 90 95 ggt tct tca tat gta ata caa agt gat aat gga aaa gtc tta aca gca 336 Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 110 gga acc ggt caa gct ctt gga ttg ata cgt tta act gat gaa tcc tca 384 Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser 115 120 125 aat aat ccc aat caa caa tgg aat tta act tct gta caa aca att caa 432 Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln 130 135 140 ctt cca caa aaa cct ata ata gat aca aaa tta aaa gat tat ccc aaa 480 Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys 145 150 155 160 tat tca cca act gga aat ata gat aat gga aca tct cct caa tta atg 528 Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met 165 170 175 gga tgg aca tta gta cct tgt att atg gta aat gat cca aat ata gat 576 Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp 180 185 190 aaa aat act caa att aaa act act cca tat tat att tta aaa aaa tat 624 Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr 195 200 205 caa tat tgg caa cga gca gta gga agt aat gta gct tta cgt cca cat 672 Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His 210 215 220 gaa aaa aaa tca tat act tat gaa tgg ggc aca gaa ata gat caa aaa 720 Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys 225 230 235 240 aca aca att ata aat aca tta gga ttt caa atc aat ata gat tca gga 768 Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly 245 250 255 atg aaa ttt gat ata cca gaa gta ggt gga ggt aca gat gaa ata aaa 816 Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys 260 265 270 aca caa cta aat gaa gaa tta aaa ata gaa tat agt cat gaa act aaa 864 Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser His Glu Thr Lys 275 280 285 ata atg gaa aaa tat caa gaa caa tct gaa ata gat aat cca act gat 912 Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp 290 295 300 caa tca atg aat tct ata gga ttt ctt act att act tcc tta gaa tta 960 Gln Ser Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu 305 310 315 320 tat aga tat aat ggc tca gaa att cgt ata atg caa att caa acc tca 1008 Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser 325 330 335 gat aat gat act tat aat gtt act tct tat cca aat cat caa caa gct 1056 Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asn His Gln Gln Ala 340 345 350 tta tta ctt ctt aca aat cat tca tat gaa gaa gta gaa gaa ata aca 1104 Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr 355 360 365 aat att cct aaa agt aca cta aaa aaa tta aaa aaa tat tat ttt taa 1152 Asn Ile Pro Lys Ser Thr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe 370 375 380 <210> 14 <211> 383 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 14 Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn 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<222> (1)..(1152) <400> 15 atg ctc gat act aat aaa gtg tat gaa ata agc aac cat gcc aac ggg 48 Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly 1 5 10 15 cta tat gcc gca act tat ttg agt ctg gac gac agc ggt gtg agc tta 96 Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu 20 25 30 atg aat aaa aac gac gac gac att gac gac tac aac ctc aag tgg ttt 144 Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe 35 40 45 tta ttt cct att gac gac gat caa tat att att aca agc tac gca gca 192 Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 aat aat tgc aaa gtc tgg aac gtt aat aat gat aaa ata aat gtt tcg 240 Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 65 70 75 80 acc tac agc tcc acc aac tca ata caa aag tgg caa ata aaa gct aat 288 Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn 85 90 95 gga tcg tcg tat gta ata cag agt gac aat ggg aag gtc ttg aca gcg 336 Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu 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Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser 325 330 335 gac aat gac act tat aac gtc acc tct tac ccg aat cat caa caa gct 1056 Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asn His Gln Gln Ala 340 345 350 tta ttg ctt ctt aca aac cac agt tat gaa gag gtg gaa gaa ata acg 1104 Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr 355 360 365 aac att cct aaa tcc aca cta aag aaa tta aaa aaa tat tat ttt tga 1152 Asn Ile Pro Lys Ser Thr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe 370 375 380 <210> 16 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly 1 5 10 15 Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu 20 25 30 Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe 35 40 45 Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys 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Glu Val Glu Glu Ile Thr 355 360 365 aac att cct aaa tcc aca cta aag aaa tta aaa aaa tat tat ttc tga 1152 Asn Ile Pro Lys Ser Thr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe 370 375 380 <210> 18 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly 1 5 10 15 Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu 20 25 30 Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe 35 40 45 Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn 85 90 95 Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser 115 120 125 Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln 130 135 140 Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr 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caa aga ata gaa gaa ttc gct agg aac caa gcc 288 Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 att tct aga tta gaa gga cta agc aat ctt tat caa att tac gca gaa 336 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu 100 105 110 tct ttt aga gag tgg gaa gca gat cct act aat cca gca tta aga gaa 384 Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 gag atg cgt att caa ttc aat gac atg aac agt gcc ctt aca acc gct 432 Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala 130 135 140 att cct ctt ttt gca gtt caa aat tat caa gtt cct ctt tta tca gta 480 Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 tat gtt caa gct gca aat tta cat tta tca gtt ttg aga gat gtt tca 528 Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 gtg ttt gga caa agg tgg gga ttt gat gcc gcg act atc aat agt cgt 576 Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg 180 185 190 tat aat gat tta act agg ctt att ggc aac tat aca gat tat gct gta 624 Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val 195 200 205 cgc tgg tac aat acg gga tta gaa cgt gta tgg gga ccg gat tct aga 672 Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg 210 215 220 gat tgg gta agg tat aat caa ttt aga aga gaa tta aca cta act gta 720 Asp Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 tta gat atc gtt gct ctg ttc ccg aat tat gat agt aga aga tat cca 768 Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 att cga aca gtt tcc caa tta aca aga gaa att tat aca aac cca gta 816 Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val 260 265 270 tta gaa aat ttt gat ggt agt ttt cga ggc tcg gct cag ggc ata gaa 864 Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu 275 280 285 aga agt att agg agt cca cat ttg atg gat ata ctt aac agt ata acc 912 Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr 290 295 300 atc tat acg gat gct cat agg ggt tat tat tat tgg tca ggg cat caa 960 Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln 305 310 315 320 ata atg gct tct cct gta ggg ttt tcg ggg cca gaa ttc act ttt ccg 1008 Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro 325 330 335 cta tat gga act atg gga aat gca gct cca caa caa cgt att gtt gct 1056 Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala 340 345 350 caa cta ggt cag ggc gtg tat aga aca tta tcg tcc act tta tat aga 1104 Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg 355 360 365 aga cct ttt aat ata ggg ata aat aat caa caa cta tct gtt ctt gac 1152 Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp 370 375 380 ggg aca gaa ttt gct tat gga acc tcc tca aat ttg cca tcc gct gta 1200 Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val 385 390 395 400 tac aga aaa agc gga acg gta gat tcg ctg gat gaa ata ccg cca cag 1248 Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln 405 410 415 aat aac aac gtg cca cct agg caa gga ttt agt cat cga tta agc cat 1296 Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His 420 425 430 gtt tca atg ttt cgt tca ggc ttt agt aat agt agt gta agt ata ata 1344 Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile 435 440 445 aga gct cct atg ttc tct tgg ata cat cgt agt gct gaa ttt aat aat 1392 Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn 450 455 460 ata att cct tca tca caa att aca caa ata cct tta aca aaa tct act 1440 Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr 465 470 475 480 aat ctt ggc tct gga act tct gtc gtt aaa gga cca gga ttt aca gga 1488 Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly 485 490 495 gga gat att ctt cga aga act tca cct ggc cag att tca acc tta aga 1536 Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg 500 505 510 gta aat att act gca cca tta tca caa aga tat cgg gta aga att cgc 1584 Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser 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Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile 435 440 445 aga gca cct atg ttc agc tgg ata cat cgt tcc gcc gag ttt aat aat 1392 Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn 450 455 460 ata att ccc tcc tct caa atc aca cag atc cct ctg aca aag tct act 1440 Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr 465 470 475 480 aat ctt ggc tct ggg act tct gtc gtt aag ggg cct ggc ttt acg ggc 1488 Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly 485 490 495 ggc gat att ctg cgg aga act tca cct ggc cag att tcc acc ctg cgc 1536 Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg 500 505 510 gtg aat atc acc gcg cca ttg tca caa cgt tac cgc gtg cgg att cgc 1584 Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg 515 520 525 tac gct tct acc aca aac ctc cag ttc cat aca tct att gac ggc aga 1632 Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg 530 535 540 ccc att aat caa ggg aat ttc tcc gcc acg atg tcg tcc 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Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala 340 345 350 caa cta ggt caa ggc gtg tac cgg aca ctg tcg tcc act ctc tat cgg 1104 Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg 355 360 365 cgg cct ttc aat ata ggg atc aat aat caa cag ttg tct gtg ctg gac 1152 Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp 370 375 380 ggg aca gag ttt gct tac gga acc tca agc aac ttg cca tcc gct gta 1200 Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val 385 390 395 400 tac aga aaa agc ggc acg gtg gac tcg ctg gat gaa atc ccg ccc cag 1248 Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln 405 410 415 aat aac aac gtg ccc cct cgg caa ggc ttc agt cat cga ctg agc cac 1296 Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His 420 425 430 gtt agc atg ttc cgt tcg ggc ttc agc aac tcc tcc gta agt atc ata 1344 Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile 435 440 445 aga gca cct atg ttc agc tgg ata cat cgt tcc gcc gag ttc aat aat 1392 Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn 450 455 460 ata att ccc tcc tct caa atc aca cag atc cct ctg aca aag tct act 1440 Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr 465 470 475 480 aat ctt ggc tct ggg act tct gtc gtt aag ggg cct ggc ttt acg ggc 1488 Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly 485 490 495 ggc gat att ctg cgg aga act tca cct ggc cag att tcc acc ctg cgc 1536 Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg 500 505 510 gtg aat atc acc gcg cca ttg tca caa cgt tac cgc gtg cgg att cgc 1584 Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg 515 520 525 tac gct tct acc aca aac ctc cag ttc cat aca tct att gac ggc aga 1632 Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg 530 535 540 ccc att aat caa ggg aat ttc tcc gcc acg atg tcg tcc ggc tcc aat 1680 Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn 545 550 555 560 ctc cag tcc gga agt ttc cgc acc gta ggt ttt act acc ccg ttc aac 1728 Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn 565 570 575 ttt tca aac ggc tca agt gtg ttt acg ctg tcc gct cat gtg ttc aac 1776 Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn 580 585 590 tct ggc aat gag gtt tac atc gac cgg att gag ttc gtc ccg gca gaa 1824 Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu 595 600 605 gtc acc 1830 Val Thr 610 <210> 24 <211> 610 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly 20 25 30 Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser 35 40 45 Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile 50 55 60 Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu 100 105 110 Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala 130 135 140 Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg 180 185 190 Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val 195 200 205 Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg 210 215 220 Asp Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val 260 265 270 Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu 275 280 285 Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr 290 295 300 Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr 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Leu Val Gln Phe Leu Val Ser 35 40 45 aac ttc gtc cca ggc gga gga ttc ctg gtt gga tta ata gat ttt gta 192 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 tgg gga ata gtt ggc cct tct caa tgg gat gca ttt cta gta caa att 240 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 gaa caa tta att aat gaa aga ata gct gaa ttt gct agg aat gct gct 288 Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala 85 90 95 att gct aat tta gaa gga tta gga aac aat ttc aat ata tat gtg gaa 336 Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 gca ttt aaa gaa tgg gaa gaa gat cct aag aat cca gca acc agg acc 384 Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro Ala Thr Arg Thr 115 120 125 aga gta att gat cgc ttt cgt ata ctt gat ggg cta ctt gaa agg gac 432 Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 att cct tcg ttt cga att tct gga ttt gaa gta ccc ctt tta tcc gtt 480 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 tat gct caa gcg gcc aat ctg cat cta gct ata tta aga gat tct gta 528 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 att ttt gga gaa aga tgg gga ttg aca acg ata aat gtc aat gaa aac 576 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 tat aat aga cta att agg cat att gat gaa tat gct gat cac tgt gca 624 Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 aat acg tat aat cgg gga tta aat aat tta ccg aaa tct acg tat caa 672 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 gat tgg ata aca tat aat cga ttg cgg aga gac tta aca ttg act gta 720 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 tta gat atc gcc gct ttc ttt cca aac tat gac aat agg aga tat cca 768 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 att cag cca gtt ggt caa cta aca agg gaa gtt tat acg gac cca tta 816 Ile Gln Pro Val Gly 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Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu 370 375 380 cgt ggt gtt gaa gga gta gaa ttt tct aca cct aca aat agc ttt acg 1200 Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr 385 390 395 400 tat cga gga aga ggt acg gtt gat tct tta act gaa ttg ccg cct gag 1248 Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu 405 410 415 gat aat agt gtg cca cct cgc gaa gga tat agt cat cgt tta tgt cat 1296 Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His 420 425 430 gca act ttt gtt caa aga tct gga aca cct ttt tta aca act ggt gta 1344 Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val 435 440 445 gta ttt tct tgg acg cat cgt agt gca act ctt aca aat aca att gat 1392 Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp 450 455 460 cca gag aga att aat caa ata cct tta gtg aaa gga ttt aga gtt tgg 1440 Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp 465 470 475 480 ggg ggc acc tct gtc att aca gga cca gga ttt aca gga ggg gat atc 1488 Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 485 490 495 ctt cga aga aat acc ttt ggt gat ttt gta tct cta caa gtc aat att 1536 Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile 500 505 510 aat tca cca att acc caa aga tac cgt tta aga ttt cgt tac gct tcc 1584 Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser 515 520 525 agt agg gat gca cga gtt ata gta tta aca gga gcg gca tcc aca gga 1632 Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly 530 535 540 gtg gga ggc caa gtt agt gta aat atg cct ctt cag aaa act atg gaa 1680 Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu 545 550 555 560 ata ggg gag aac tta aca tct aga aca ttt aga tat acc gat ttt agt 1728 Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser 565 570 575 aat cct ttt tca ttt aga gct aat cca gat ata att ggg ata agt gaa 1776 Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu 580 585 590 caa cct cta ttt ggt gca ggt tct att agt agc ggt gaa ctt tat ata 1824 Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile 595 600 605 gat aaa att gaa att att cta gca gat gca aca ttt gaa taa 1866 Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu 610 615 620 <210> 26 <211> 621 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 26 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly 20 25 30 Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser 35 40 45 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala 85 90 95 Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro Ala Thr Arg Thr 115 120 125 Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe 275 280 285 Asn Val Met Glu Asn Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile 290 295 300 Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn 305 310 315 320 Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro 340 345 350 Arg Ser Phe Thr Phe 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gat ttt gta 192 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 tgg gga ata gtt ggc cct tct caa tgg gac gca ttt cta gta caa att 240 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 gaa caa tta att aat gaa aga ata gct gaa ttt gct agg aac gct gct 288 Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala 85 90 95 att gct aat tta gaa gga tta gga aac aat ttc aat ata tat gtg gaa 336 Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 gca ttt aag gaa tgg gaa gaa gat cct aag aat cca gca acg agg acc 384 Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro Ala Thr Arg Thr 115 120 125 aga gta att gat cgc ttt cgt ata ctt gat ggg cta ctt gaa agg gac 432 Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 att cct tcg ttt cga att tct gga ttt gaa gta ccc ctt tta tcc gtt 480 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 tat gct caa gcg gcc aat ctg cat cta gct ata tta aga gat tct gta 528 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 att ttt gga gaa aga tgg gga ttg aca acg ata aat gtc aat gaa aac 576 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 tat aat aga cta att agg cat att gat gaa tat gct gat cac tgt gca 624 Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 aat acg tat aat cgg gga tta aat aat tta ccg aaa tct acg tat caa 672 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 gat tgg ata aca tat aat cga ttg cgg aga gac tta aca ttg act gta 720 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 tta gat atc gcc gct ttc ttt cca aac tat gac aat agg aga tat cca 768 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 att cag cca gtt ggt caa cta aca agg gaa gtt tat acg gac cca tta 816 Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 att aat ttt aat cca cag tta cag tct gta gct caa tta cct act ttt 864 Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe 275 280 285 aac gtt atg gag aac agc gca att aga aat cct cat tta ttt gat ata 912 Asn Val Met Glu Asn Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile 290 295 300 ttg aat aat ctt aca atc ttt acg gat tgg ttt agt gtt gga cgc aat 960 Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn 305 310 315 320 ttt tat tgg gga gga cat cga gta ata tct agc ctt ata gga ggt ggg 1008 Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly 325 330 335 aac atc aca tcg cct ata tat gga aga gag gcg aac caa gag cct cca 1056 Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro 340 345 350 aga tcc ttt act ttt aat gga ccc gtg ttt agg act tta tca aat cct 1104 Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro 355 360 365 act tta cga tta tta cag caa cct tgg cca gcg cca cca ttt aat tta 1152 Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu 370 375 380 cgt ggt gtt gaa gga gta gaa ttt tct aca cct aca aat agc ttt acg 1200 Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr 385 390 395 400 tat cga gga aga ggg acg gtt gat tct tta act gaa ttg ccg cct gag 1248 Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu 405 410 415 gat aat agt gtg cca cct cgc gaa gga tat agt cat cgt tta tgt cat 1296 Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His 420 425 430 gca act ttt gtt caa aga tcg gga aca cct ttt tta aca act ggt gta 1344 Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val 435 440 445 gta ttt tct tgg acg cat cgt agt gca act ctt aca aat aca atc gac 1392 Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp 450 455 460 cca gag aga att aat caa ata cct tta gtg aag gga ttt aga gtt tgg 1440 Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp 465 470 475 480 ggg ggc acc tct gtc att acc gga ccc gga ttt acc gga ggg gat atc 1488 Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 485 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Glu Leu Tyr Ile 595 600 605 gat aaa att gaa att att cta gca gat gca aca ttt gaa tga 1866 Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu 610 615 620 <210> 28 <211> 621 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly 20 25 30 Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser 35 40 45 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala 85 90 95 Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro Ala Thr Arg Thr 115 120 125 Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe 275 280 285 Asn Val Met Glu Asn Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile 290 295 300 Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn 305 310 315 320 Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro 340 345 350 Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro 355 360 365 Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu 370 375 380 Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr 385 390 395 400 Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu 405 410 415 Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His 420 425 430 Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val 435 440 445 Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp 450 455 460 Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp 465 470 475 480 Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 485 490 495 Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile 500 505 510 Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser 515 520 525 Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly 530 535 540 Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu 545 550 555 560 Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser 565 570 575 Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu 580 585 590 Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile 595 600 605 Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu 610 615 620 <210> 29 <211> 1866 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA sequence in accordance with the invention encoding Bacillus thuringiensis Cry1Ca core toxin using codons optimized for maize and with sequences identified in Table 2 removed and Table 1 sequences are maintained <220> <221> CDS <222> (1)..(1866) <400> 29 atg gat aac aat ccg aac atc aat gag tgc atc ccg tac aac tgc ctg 48 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 agc aac ccg gaa gaa gtg ctg ttg gat gga gaa cgg ata tca act ggc 96 Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly 20 25 30 aat tca tcc att gac att tct ctg tca ctt gtt cag ttt ctg gtg tct 144 Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser 35 40 45 aac ttc gtc ccc ggc gga gga ttc ctg gtt gga tta ata gat ttc gta 192 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 tgg gga ata gtt ggc cct tct caa tgg gac gca ttt cta gta caa att 240 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 gaa caa tta att aat gaa aga ata gct gaa ttt gct agg aac gct gct 288 Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala 85 90 95 att gct aat tta gaa gga tta gga aac aat ttc aac atc tat gtg gaa 336 Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 gca ttt aag gaa tgg gaa gaa gat cct aag aat cca gca acg agg acc 384 Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro Ala Thr Arg Thr 115 120 125 aga gta att gat cgc ttt cgt ata ctt gat ggg cta ctt gaa agg gac 432 Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 att cct tcg ttt cga att tct gga ttt gaa gta ccc ctt ctc tcc gtt 480 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 tat gct caa gcg gcc aat ctg cat cta gct atc tta aga gat tct gtc 528 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 atc ttt gga gaa aga tgg gga ttg aca acg ata aat gtc aat gaa aac 576 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 tat aat aga cta att agg cat att gat gaa tat gct gat cac tgt gca 624 Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 aat acg tat aat cgg gga tta aat aat tta ccg aaa tct acg tat caa 672 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 gat tgg ata aca tat aat cga ttg cgg aga gac tta aca ttg act gta 720 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 tta gat atc gcc gct ttc ttt cca aac tat gac aat agg aga tat cca 768 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 att cag cca gtt ggt caa cta aca agg gaa gtt tat acg gac cca tta 816 Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 att aat ttt aat cca cag tta cag tct gta gct caa tta cct act ttt 864 Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe 275 280 285 aac gtt atg gag aac agc gca att aga aat cct cat ttg ttc gac ata 912 Asn Val Met Glu Asn Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile 290 295 300 ttg aat aat ctt aca atc ttt acg gat tgg ttt agt gtt gga cgc aac 960 Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn 305 310 315 320 ttc tat tgg gga gga cat cga gta ata tct agc ctt ata gga ggt ggg 1008 Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly 325 330 335 aac atc aca tcg cct atc tat gga aga gag gcg aac caa gag cct cca 1056 Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro 340 345 350 aga tcc ttt act ttt aat gga ccc gtg ttt agg act tta tca aat cct 1104 Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro 355 360 365 act tta cga tta tta cag caa cct tgg cca gcg cca cca ttt aat tta 1152 Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu 370 375 380 cgt ggt gtt gaa gga gta gaa ttt tct aca cct aca aat agc ttt acg 1200 Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr 385 390 395 400 tat cga gga aga ggg acg gtt gat tct tta act gaa ttg ccg cct gag 1248 Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu 405 410 415 gat aat agt gtg cca cct cgc gaa gga tat agt cat cgt tta tgt cat 1296 Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His 420 425 430 gca acc ttt gtt caa aga tcg gga aca cct ttc tta aca act ggt gta 1344 Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val 435 440 445 gta ttc tct tgg acg cat cgt agt gca act ctt aca aat aca atc gac 1392 Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp 450 455 460 cca gag aga att aat caa ata cct tta gtg aag gga ttt aga gtt tgg 1440 Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp 465 470 475 480 ggg ggc acc tct gtc att acc gga ccc gga ttt acc gga ggg gat atc 1488 Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 485 490 495 ctt cga aga aat acc ttt ggt gat ttc gta tct cta caa gtc aac att 1536 Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile 500 505 510 aat tca cca att acc caa aga tac cgt tta aga ttt cgt tac gct tcc 1584 Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser 515 520 525 agt agg gat gca cga gtt ata gta tta acg gga gcg gca tcc acc gga 1632 Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly 530 535 540 gtg gga ggc caa gtt agt gta aat atg cct ctt cag aaa act atg gaa 1680 Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu 545 550 555 560 ata ggg gag aac tta aca tcc aga aca ttt aga tat acc gat ttt agt 1728 Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser 565 570 575 aat cct ttt tca ttt aga gct aat cca gat ata att ggg ata agt gaa 1776 Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu 580 585 590 caa cct cta ttt ggg gcg ggt tct att agt agc ggt gaa ctt tac ata 1824 Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile 595 600 605 gat aaa att gaa att att cta gca gat gca aca ttt gaa tga 1866 Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu 610 615 620 <210> 30 <211> 621 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly 20 25 30 Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser 35 40 45 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala 85 90 95 Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro Ala Thr Arg Thr 115 120 125 Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe 275 280 285 Asn Val Met Glu Asn Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile 290 295 300 Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn 305 310 315 320 Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro 340 345 350 Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro 355 360 365 Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu 370 375 380 Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr 385 390 395 400 Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu 405 410 415 Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His 420 425 430 Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val 435 440 445 Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp 450 455 460 Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp 465 470 475 480 Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 485 490 495 Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile 500 505 510 Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser 515 520 525 Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly 530 535 540 Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu 545 550 555 560 Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser 565 570 575 Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu 580 585 590 Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile 595 600 605 Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu 610 615 620 <210> 31 <211> 1428 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <220> <221> CDS <222> (1)..(1428) <223> Native DNA sequence encoding Bacillus thuringiensis Cry6Aa toxin <400> 31 atg att att gat agt aaa acg act tta cct aga cat tca ctt att cat 48 Met Ile Ile Asp Ser Lys Thr Thr Leu Pro Arg His Ser Leu Ile His 1 5 10 15 aca att aaa tta aat tct aat aag aaa tat ggt cct ggt gat atg act 96 Thr Ile Lys Leu Asn Ser Asn Lys Lys Tyr Gly Pro Gly Asp Met Thr 20 25 30 aat gga aat caa ttt att att tca aaa caa gaa tgg gct acg att gga 144 Asn Gly Asn Gln Phe Ile Ile Ser Lys Gln Glu Trp Ala Thr Ile Gly 35 40 45 gca tat att cag act gga tta ggt tta cca gta aat gaa caa caa tta 192 Ala Tyr Ile Gln Thr Gly Leu Gly Leu Pro Val Asn Glu Gln Gln Leu 50 55 60 aga aca cat gtt aat tta agt cag gat ata tca ata cct agt gat ttt 240 Arg Thr His Val Asn Leu Ser Gln Asp Ile Ser Ile Pro Ser Asp Phe 65 70 75 80 tct caa tta tat gat gtt tat tgt tct gat aaa act tca gca gaa tgg 288 Ser Gln Leu Tyr Asp Val Tyr Cys Ser Asp Lys Thr Ser Ala Glu Trp 85 90 95 tgg aat aaa aat tta tat cct tta att att aaa tct gct aat gat att 336 Trp Asn Lys Asn Leu Tyr Pro Leu Ile Ile Lys Ser Ala Asn Asp Ile 100 105 110 gct tca tat ggt ttt aaa gtt gct ggt gat cct tct att aag aaa gat 384 Ala Ser Tyr Gly Phe Lys Val Ala Gly Asp Pro Ser Ile Lys Lys Asp 115 120 125 gga tat ttt aaa aaa ttg caa gat gaa tta gat aat att gtt gat aat 432 Gly Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Asp Glu Leu Asp Asn Ile Val Asp Asn 130 135 140 aat tcc gat gat gat gca ata gct aaa gct att aaa gat ttt aaa gcg 480 Asn Ser Asp Asp Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ile Lys Asp Phe Lys Ala 145 150 155 160 cga tgt ggt att tta att aaa gaa gct aaa caa tat gaa gaa gct gca 528 Arg Cys Gly Ile Leu Ile Lys Glu Ala Lys Gln Tyr Glu Glu Ala Ala 165 170 175 aaa aat att gta aca tct tta gat caa ttt tta cat ggt gat cag aaa 576 Lys Asn Ile Val Thr Ser Leu Asp Gln Phe Leu His Gly Asp Gln Lys 180 185 190 aaa tta gaa ggt gtt atc aat att caa aaa cgt tta aaa gaa gtt caa 624 Lys Leu Glu Gly Val Ile Asn Ile Gln Lys Arg Leu Lys Glu Val Gln 195 200 205 aca gct ctt aat caa gcc cat ggg gaa agt agt cca gct cat aaa gag 672 Thr Ala Leu Asn Gln Ala His Gly Glu Ser Ser Pro Ala His Lys Glu 210 215 220 tta tta gaa aaa gta aaa aat tta aaa aca aca tta gaa agg act att 720 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Leu Lys Thr Thr Leu Glu Arg Thr Ile 225 230 235 240 aaa gct gaa caa gat tta gag aaa aaa gta gaa tat agt ttt cta tta 768 Lys Ala Glu Gln Asp Leu Glu Lys Lys Val Glu Tyr Ser Phe Leu Leu 245 250 255 gga cca ttg tta gga ttt gtt gtt tat gaa att ctt gaa aat act gct 816 Gly Pro Leu Leu Gly Phe Val Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Thr Ala 260 265 270 gtt cag cat ata aaa aat caa att gat gag ata aag aaa caa tta gat 864 Val Gln His Ile Lys Asn Gln Ile Asp Glu Ile Lys Lys Gln Leu Asp 275 280 285 tct gct cag cat gat ttg gat aga gat gtt aaa att ata gga atg tta 912 Ser Ala Gln His Asp Leu Asp Arg Asp Val Lys Ile Ile Gly Met Leu 290 295 300 aat agt att aat aca gat att gat aat tta tat agt caa gga caa gaa 960 Asn Ser Ile Asn Thr Asp Ile Asp Asn Leu Tyr Ser Gln Gly Gln Glu 305 310 315 320 gca att aaa gtt ttc caa aag tta caa ggt att tgg gct act att gga 1008 Ala Ile Lys Val Phe Gln Lys Leu Gln Gly Ile Trp Ala Thr Ile Gly 325 330 335 gct caa ata gaa aat ctt aga aca acg tcg tta caa gaa gtt caa gat 1056 Ala Gln Ile Glu Asn Leu Arg Thr Thr Ser Leu Gln Glu Val Gln Asp 340 345 350 tct gat gat gct gat gag ata caa att gaa ctt gag gac gct tct gat 1104 Ser Asp Asp Ala Asp Glu Ile Gln Ile Glu Leu Glu Asp Ala Ser Asp 355 360 365 gct tgg tta gtt gtg gct caa gaa gct cgt gat ttt aca cta aat gct 1152 Ala Trp Leu Val Val Ala Gln Glu Ala Arg Asp Phe Thr Leu Asn Ala 370 375 380 tat tca act aat agt aga caa aat tta ccg att aat gtt ata tca gat 1200 Tyr Ser Thr Asn Ser Arg Gln Asn Leu Pro Ile Asn Val Ile Ser Asp 385 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Synthetic DNA sequence in accordance with the invention encoding Bacillus thuringiensis Cry6Aa toxin using codons optimized for maize and with sequences identified in Table 2 removed and Table 1 sequences are maintained <220> <221> CDS <222> (1)..(1428) <400> 35 atg atc atc gac tcc aag acg acc ctg cca cgg cac tcc ctt atc cac 48 Met Ile Ile Asp Ser Lys Thr Thr Leu Pro Arg His Ser Leu Ile His 1 5 10 15 aca att aaa tta aat agc aat aag aag tac ggt ccc ggt gat atg act 96 Thr Ile Lys Leu Asn Ser Asn Lys Lys Tyr Gly Pro Gly Asp Met Thr 20 25 30 aac gga aat caa ttc att atc tca aag caa gag tgg gct acc atc gga 144 Asn Gly Asn Gln Phe Ile Ile Ser Lys Gln Glu Trp Ala Thr Ile Gly 35 40 45 gcg tac atc cag act ggg ctg ggc cta cca gta aat gaa caa caa tta 192 Ala Tyr Ile Gln Thr Gly Leu Gly Leu Pro Val Asn Glu Gln Gln Leu 50 55 60 agg acc cat gtc aac ctc agc caa gat atc agc atc cct agc gac ttt 240 Arg Thr His Val Asn Leu Ser Gln Asp Ile Ser Ile Pro Ser Asp Phe 65 70 75 80 tct cag ctc tac gac gtc tat 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Ile Ser Ser Gly Ile Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe 370 375 380 aat ggg gga gtc tac tac cac agc aac gca gca cac aat ctc ttg tca 1200 Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser 385 390 395 400 aca atg agg gtg ggt gtt att agg ggc ggc tgt gaa gtc gaa atc tgg 1248 Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp 405 410 415 aag agg gcg caa aag gag aat gtg gag tac gtg cga gat ggc tct ggt 1296 Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly 420 425 430 caa cgc gtg atc aga gcg ggc gag cag cca acc aag ata cca gaa ccg 1344 Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro 435 440 445 att ccc aca gcg gat gcg gcg tag 1368 Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala 450 455 <210> 48 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys 20 25 30 His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu 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optimized for maize and Table 1 & Table 2 sequences are maintained <220> <221> CDS <222> (1)..(798) <400> 51 atg aga aac gaa ggt ttt ctg aag atg aaa acg gac gtt ggg gtt gct 48 Met Arg Asn Glu Gly Phe Leu Lys Met Lys Thr Asp Val Gly Val Ala 1 5 10 15 gac gaa gtc atc agc ggt gat ttg aag cag ttg ggt gat gct gcc aaa 96 Asp Glu Val Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gln Leu Gly Asp Ala Ala Lys 20 25 30 cgc ctt gct aag cac gct atc aaa ctg gga gcc agc ttt ggt gtt ggt 144 Arg Leu Ala Lys His Ala Ile Lys Leu Gly Ala Ser Phe Gly Val Gly 35 40 45 tca act atc gtt caa gcc atc gca tca ata gca gcc atc tat ctt ctg 192 Ser Thr Ile Val Gln Ala Ile Ala Ser Ile Ala Ala Ile Tyr Leu Leu 50 55 60 att ctc gat agg acc aac tgg agg acc aac atc ttg acg tcc ctc ctc 240 Ile Leu Asp Arg Thr Asn Trp Arg Thr Asn Ile Leu Thr Ser Leu Leu 65 70 75 80 att ccc tac gtg tat ctg tcc ctc ccg agc gtc atc ttc aat ctc ttt 288 Ile Pro Tyr Val Tyr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ile Phe Asn Leu Phe 85 90 95 cgt ggg gac ctc ggg aga tgg ctg tca ttc ata ggc gtt gtg atg aag 336 Arg Gly Asp Leu Gly Arg Trp Leu Ser Phe Ile Gly Val Val Met Lys 100 105 110 ctg ttc ttt cat agg cac ttt cct gtt act ttg gag ctg ctt gtg agc 384 Leu Phe Phe His Arg His Phe Pro Val Thr Leu Glu Leu Leu Val Ser 115 120 125 ctc att ctt ttg att gtc gtg tca cct acc ttc ata gct cat aca att 432 Leu Ile Leu Leu Ile Val Val Ser Pro Thr Phe Ile Ala His Thr Ile 130 135 140 cgt gga tct ttg att ggg gtg ttc atc ttc ttg gtg ata gca tgt tat 480 Arg Gly Ser Leu Ile Gly Val Phe Ile Phe Leu Val Ile Ala Cys Tyr 145 150 155 160 ctg ctt caa gag cac att aga tca gct ggt ggc ttc aag aac gcc ttt 528 Leu Leu Gln Glu His Ile Arg Ser Ala Gly Gly Phe Lys Asn Ala Phe 165 170 175 aca aag tct aat gga atc tcc aac agc gtg ggc atc atc atc ctt ctg 576 Thr Lys Ser Asn Gly Ile Ser Asn Ser Val Gly Ile Ile Ile Leu Leu 180 185 190 atc cac ccg att tgg tct ctc gtc gtc tac ttc ctc tac act tca ctt 624 Ile His Pro Ile Trp Ser Leu Val Val Tyr Phe Leu Tyr Thr Ser Leu 195 200 205 ctc cag ctt ttg gcc tac tca cca tcc ccg tgc tgc tgc ata tta tac 672 Leu Gln Leu Leu Ala Tyr Ser Pro Ser Pro Cys Cys Cys Ile Leu Tyr 210 215 220 aac aag tgg ttc aac ttc atg cat gtt tgc aag tgc gtc tct ttg cac 720 Asn Lys Trp Phe Asn Phe Met His Val Cys Lys Cys Val Ser Leu His 225 230 235 240 atg tac tct cag tcc ata ggc tca tgt gtt tca ata ttt ttc gtc cag 768 Met Tyr Ser Gln Ser Ile Gly Ser Cys Val Ser Ile Phe Phe Val Gln 245 250 255 ttc gtg ttc atc tat gag gct gag ttt taa 798 Phe Val Phe Ile Tyr Glu Ala Glu Phe 260 265 <210> 52 <211> 265 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Met Arg Asn Glu Gly Phe Leu Lys Met Lys Thr Asp Val Gly Val Ala 1 5 10 15 Asp Glu Val Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gln Leu Gly Asp Ala Ala Lys 20 25 30 Arg Leu Ala Lys His Ala Ile Lys Leu Gly Ala Ser Phe Gly Val Gly 35 40 45 Ser Thr Ile Val Gln Ala Ile Ala Ser Ile Ala Ala Ile Tyr Leu Leu 50 55 60 Ile Leu Asp Arg Thr Asn Trp Arg Thr Asn Ile Leu Thr Ser Leu Leu 65 70 75 80 Ile Pro Tyr Val Tyr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ile Phe Asn Leu Phe 85 90 95 Arg Gly Asp Leu Gly Arg Trp Leu Ser Phe Ile Gly Val Val Met Lys 100 105 110 Leu Phe Phe His Arg His Phe Pro Val Thr Leu Glu Leu Leu Val Ser 115 120 125 Leu Ile Leu Leu Ile Val Val Ser Pro Thr Phe Ile Ala His Thr Ile 130 135 140 Arg Gly Ser Leu Ile Gly Val Phe Ile Phe Leu Val Ile Ala Cys Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Gln Glu His Ile Arg Ser Ala Gly Gly Phe Lys Asn Ala Phe 165 170 175 Thr Lys Ser Asn Gly Ile Ser Asn Ser Val Gly Ile Ile Ile Leu Leu 180 185 190 Ile His Pro Ile Trp Ser Leu Val Val Tyr Phe Leu Tyr Thr Ser Leu 195 200 205 Leu Gln Leu Leu Ala Tyr Ser Pro Ser Pro Cys Cys Cys Ile Leu Tyr 210 215 220 Asn Lys Trp Phe Asn Phe Met His Val Cys Lys Cys Val Ser Leu His 225 230 235 240 Met Tyr Ser Gln Ser Ile Gly Ser Cys Val Ser Ile Phe Phe Val Gln 245 250 255 Phe Val Phe Ile Tyr Glu Ala Glu Phe 260 265 <210> 53 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA sequence in accordance with the invention encoding Xerophyta viscosa SAP1 protein using codons optimized for maize and with sequences identified in Table 2 removed and Table 1 sequences are maintained <220> <221> CDS <222> (1)..(798) <400> 53 atg aga aac gaa ggt ttt ctg aag atg aaa acg gac gtt ggg gtt gct 48 Met Arg Asn Glu Gly Phe Leu Lys Met Lys Thr Asp Val Gly Val Ala 1 5 10 15 gac gaa gtc atc agc ggt gat ttg aag cag ttg ggt gat gct gcc aaa 96 Asp Glu Val Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gln Leu Gly Asp Ala Ala Lys 20 25 30 cgc ctt gct aag cac gct atc aaa ctg gga gcc agc ttt ggt gtt ggt 144 Arg Leu Ala Lys His Ala Ile Lys Leu Gly Ala Ser Phe Gly Val Gly 35 40 45 tca act atc gtt caa gcc atc gca tca ata gca gcc atc tat ctt ctg 192 Ser Thr Ile Val Gln Ala Ile Ala Ser Ile Ala Ala Ile Tyr Leu Leu 50 55 60 att ctc gat agg acc aac tgg agg acc aac atc ttg acg tcc ctc ctc 240 Ile Leu Asp Arg Thr Asn Trp Arg Thr Asn Ile Leu Thr Ser Leu Leu 65 70 75 80 att ccc tac gtg tat ctg tcc ctc ccg agc gtc atc ttc aat ctc ttt 288 Ile Pro Tyr Val Tyr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ile Phe Asn Leu Phe 85 90 95 cgt ggg gac ctc ggg aga tgg ctg tca ttc ata ggc gtt gtg atg aag 336 Arg Gly Asp Leu Gly Arg Trp Leu Ser Phe Ile Gly Val Val Met Lys 100 105 110 ctg ttc ttt cat agg cac ttt cct gtt act ttg gag ctg ctt gtg agc 384 Leu Phe Phe His Arg His Phe Pro Val Thr Leu Glu Leu Leu Val Ser 115 120 125 ctc att ctt ttg att gtc gtg tct cct acc ttc ata gct cat aca att 432 Leu Ile Leu Leu Ile Val Val Ser Pro Thr Phe Ile Ala His Thr Ile 130 135 140 cgt gga tct ttg att ggg gtg ttc atc ttc ttg gtg ata gca tgt tat 480 Arg Gly Ser Leu Ile Gly Val Phe Ile Phe Leu Val Ile Ala Cys Tyr 145 150 155 160 ctg ctt caa gag cac att aga tca gct ggt ggc ttc aag aac gcc ttt 528 Leu Leu Gln Glu His Ile Arg Ser Ala Gly Gly Phe Lys Asn Ala Phe 165 170 175 aca aag tct aat gga atc tcc aac agc gtg ggc atc atc atc ctt ctg 576 Thr Lys Ser Asn Gly Ile Ser Asn Ser Val Gly Ile Ile Ile Leu Leu 180 185 190 atc cac ccg att tgg tct ctc gtc gtc tac ttc ctc tac act tca ctt 624 Ile His Pro Ile Trp Ser Leu Val Val Tyr Phe Leu Tyr Thr Ser Leu 195 200 205 ctc cag ctt ttg gcc tac tca cca tcc cca tgc tgc tgt att ctt tac 672 Leu Gln Leu Leu Ala Tyr Ser Pro Ser Pro Cys Cys Cys Ile Leu Tyr 210 215 220 aac aaa tgg ttc aac ttc atg cac gtg tgc aag tgc gtc tct ttg cac 720 Asn Lys Trp Phe Asn Phe Met His Val Cys Lys Cys Val Ser Leu His 225 230 235 240 atg tac tct cag tcc att ggc tca tgt gtt tca atc ttc ttt gtc cag 768 Met Tyr Ser Gln Ser Ile Gly Ser Cys Val Ser Ile Phe Phe Val Gln 245 250 255 ttc gtg ttc atc tat gag gct gag ttt taa 798 Phe Val Phe Ile Tyr Glu Ala Glu Phe 260 265 <210> 54 <211> 265 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 Met Arg Asn Glu Gly Phe Leu Lys Met Lys Thr Asp Val Gly Val Ala 1 5 10 15 Asp Glu Val Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gln Leu Gly Asp Ala Ala Lys 20 25 30 Arg Leu Ala Lys His Ala Ile Lys Leu Gly Ala Ser Phe Gly Val Gly 35 40 45 Ser Thr Ile Val Gln Ala Ile Ala Ser Ile Ala Ala Ile Tyr Leu Leu 50 55 60 Ile Leu Asp Arg Thr Asn Trp Arg Thr Asn Ile Leu Thr Ser Leu Leu 65 70 75 80 Ile Pro Tyr Val Tyr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ile Phe Asn Leu Phe 85 90 95 Arg Gly Asp Leu Gly Arg Trp Leu Ser Phe Ile Gly Val Val Met Lys 100 105 110 Leu Phe Phe His Arg His Phe Pro Val Thr Leu Glu Leu Leu Val Ser 115 120 125 Leu Ile Leu Leu Ile Val Val Ser Pro Thr Phe Ile Ala His Thr Ile 130 135 140 Arg Gly Ser Leu Ile Gly Val Phe Ile Phe Leu Val Ile Ala Cys Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Gln Glu His Ile Arg Ser Ala Gly Gly Phe Lys Asn Ala Phe 165 170 175 Thr Lys Ser Asn Gly Ile Ser Asn Ser Val Gly Ile Ile Ile Leu Leu 180 185 190 Ile His Pro Ile Trp Ser Leu Val Val Tyr Phe Leu Tyr Thr Ser Leu 195 200 205 Leu Gln Leu Leu Ala Tyr Ser Pro Ser Pro Cys Cys Cys Ile Leu Tyr 210 215 220 Asn Lys Trp Phe Asn Phe Met His Val Cys Lys Cys Val Ser Leu His 225 230 235 240 Met Tyr Ser Gln Ser Ile Gly Ser Cys Val Ser Ile Phe Phe Val Gln 245 250 255 Phe Val Phe Ile Tyr Glu Ala Glu Phe 260 265 <210> 55 <211> 717 <212> DNA <213> Aequorea victoria <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <223> Native DNA sequence encoding Aequorea victoria GFP1 protein <400> 55 atg agt aaa gga gaa gaa ctt ttc act gga gtg gtc cca gtt ctt gtt 48 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Val Leu Val 1 5 10 15 gaa tta gat ggc gat gtt aat ggg caa aaa ttc tct gtc agt gga gag 96 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 ggt gaa ggt gat gca aca tac gga aaa ctt acc ctt aat ttt att tgc 144 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Asn Phe Ile Cys 35 40 45 act act ggg aag cta cct gtt cca tgg cca aca ctt gtc act act ttc 192 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 tct tat ggt gtt caa tgc ttc tca aga tac cca gat cat atg aaa cag 240 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 cat gac ttt ttc aag agt gcc atg ccc gaa ggt tat gta cag gaa aga 288 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 act ata ttt tac aaa gat gac ggg aac tac aag aca cgt gct gaa gtc 336 Thr Ile Phe Tyr Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 aag ttt gaa ggt gat acc ctt gtt aat aga atc gag tta aaa ggt att 384 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 gat ttt aaa gaa gat gga aac att ctt gga cac aaa atg gaa tac aac 432 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Met Glu Tyr Asn 130 135 140 tat aac tca cat aat gta tac atc atg gga gac aaa cca aag aat ggc 480 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Gly Asp Lys Pro Lys Asn Gly 145 150 155 160 atc aaa gtt aac ttc aaa att aga cac aac att aaa gat gga agc gtt 528 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Lys Asp Gly Ser Val 165 170 175 caa tta gca gac cat tat caa caa aat act cca att ggc gat ggc cct 576 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 gtc ctt tta cca gac aac cat tac ctg tcc aca caa tct gcc ctt tcc 624 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 aaa gat ccc aac gaa aag aga gat cac atg atc ctt ctt gag ttt gta 672 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Ile Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 aca gct gct agg att aca cat ggc atg gat gaa cta tac aaa taa 717 Thr Ala Ala Arg Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 56 <211> 238 <212> PRT <213> Aequorea victoria <400> 56 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Val Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Asn Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Tyr Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Met Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Gly Asp Lys Pro Lys Asn Gly 145 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Asn Val Tyr Ile Met Gly Asp Lys Pro Lys Asn Gly 145 150 155 160 ata aag gtt aac ttc aag att cga cac aac att aaa gac ggc agc gtt 528 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Lys Asp Gly Ser Val 165 170 175 cag ttg gcc gac cac tat caa caa aat act cca att ggc gat ggc cct 576 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 gtc ctc tta ccc gac aac cat tac ctg tcc acg caa tca gcg ctc agc 624 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 aag gac ccc aac gag aag agg gat cac atg atc ctc ctt gag ttt gtc 672 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Ile Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 acc gca gct agg ata acc cac ggc atg gat gaa ctg tac aag taa 717 Thr Ala Ala Arg Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 58 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Val Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser Val Ser 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<211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA sequence in accordance with the invention encoding Aequorea victoria GFP1 protein using codons optimized for maize and with sequences identified in Table 2 removed and Table 1 sequences are maintained <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 59 atg agt aaa ggg gaa gaa ctt ttc acc ggc gtg gtc cca gtc ctc gtt 48 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Val Leu Val 1 5 10 15 gag ttg gat ggc gat gtg aat ggg caa aaa ttc tct gtc tcc ggg gag 96 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 ggt gag ggt gat gca acc tac gga aag ctg acc cta aat ttc atc tgc 144 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Asn Phe Ile Cys 35 40 45 acg act ggg aag ttg cct gtg cct tgg ccg aca ctg gtg acg acg ttc 192 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 tct tat ggt gtg cag tgt ttc tca cgc tac ccg gat cat atg aaa cag 240 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 cat gac ttt ttc aag tcg gcc atg cca gaa ggc tat gta caa gag aga 288 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 act atc ttt tac aag gac gac ggg aac tac aag aca cgt gct gag gtg 336 Thr Ile Phe Tyr Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 aag ttc gag ggt gat acc ctt gtt aat cgg atc gag cta aag ggc att 384 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 gac ttt aag gag gac gga aac att ctg gga cac aaa atg gaa tac aac 432 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Met Glu Tyr Asn 130 135 140 tat aac tcg cac aac gta tac atc atg gga gac aaa cca aag aat ggc 480 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Gly Asp Lys Pro Lys Asn Gly 145 150 155 160 ata aag gtt aac ttc aag att cga cac aac att aaa gac ggc agc gtt 528 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Lys Asp Gly Ser Val 165 170 175 cag ttg gcc gac cac tat caa caa aat act cca att ggc gat ggc cct 576 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 gtc ctc tta ccc gac aac cat tac ctg tcc acg caa tca gcg ctc agc 624 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 aag gac ccc aac gag aag agg gat cac atg atc ctc ctt gag ttt gtc 672 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Ile Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 acc gca gct agg ata acc cac ggc atg gat gaa ctg tac aag taa 717 Thr Ala Ala Arg Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 60 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Val Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Asn Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile 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Val Trp Gln His Lys His 165 170 175 Tyr Gly Lys Cys Leu Leu Phe Ala Ala Trp Ile Phe Pro Met Ile Val 180 185 190 Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Trp Gly Gly Leu Val Tyr Ala Gly 195 200 205 Ile Ile Arg Ala Cys Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser 210 215 220 Leu Ala His Trp Ile Gly Glu Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro 225 230 235 240 Arg Asp His Val Leu Thr Ala Leu Val Thr Met Gly Glu Gly Tyr His 245 250 255 Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Ile Trp 260 265 270 Tyr Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Leu Ile Tyr Leu Phe Ser Leu Gly 275 280 285 Pro Phe Pro Leu Ala Tyr Ser Leu Lys Thr Phe Arg Ser Asn Glu Ile 290 295 300 Glu Lys Gly Arg Leu Gln Gln Gln Gln Lys Ala Leu Asp Lys Lys Arg 305 310 315 320 Ser Gly Leu Asp Trp Gly Leu Pro Leu Phe Gln Leu Pro Val Ile Ser 325 330 335 Trp Asp Asp Phe Gln Ala Arg Cys Lys Glu Ser Gly Glu Met Leu Val 340 345 350 Ala Val Ala Gly Val Ile His Asp Val Ser Gln Phe Ile Glu Asp His 355 360 365 Pro Gly Gly Arg Ser Leu Ile Arg Ser Ala Val Gly Lys Asp Gly Thr 370 375 380 Gly Met Phe Asn Gly Gly Val Tyr Glu His Ser Asn Ala Ala His Asn 385 390 395 400 Leu Leu Ser Thr Met Arg Val Gly Val Leu Arg Gly Gly Gln Glu Val 405 410 415 Glu Val Trp Lys Lys Gln Arg Val Asp Val Leu Gly Lys Ser Asp Ile 420 425 430 Leu Arg Gln Val Thr Arg Val Glu Arg Leu Val Glu Gly Ala Val Ala 435 440 445 Ala <210> 67 <211> 660 <212> DNA <213> Xerophyta viscosa <220> <221> CDS <222> (1)..(660) <223> Native DNA sequence encoding Xerophyta viscosa PER1 protein <400> 67 atg ccg ggg ctc acc att ggc gac acg atc ccc aac ctg gag ctt gac 48 Met Pro Gly Leu Thr Ile Gly Asp Thr Ile Pro Asn Leu Glu Leu Asp 1 5 10 15 acc acc cag ggt agg atc aaa atc cac gat tac gtc ggc aac ggc tac 96 Thr Thr Gln Gly Arg Ile Lys Ile His Asp Tyr Val Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 gtc atc ttg ttc tca cac cct gga gac ttc act cct gtc tgc acc acc 144 Val Ile Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr 35 40 45 gaa ctt gga aag atg gct gct tac gcc gac gag ttc agc aag cgc ggg 192 Glu Leu Gly Lys Met Ala Ala Tyr Ala Asp Glu Phe Ser Lys Arg Gly 50 55 60 gtt aag ctt ctt ggt ctt tcc tgc gac gat gta cag agc cac aag gag 240 Val Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Val Gln Ser His Lys Glu 65 70 75 80 tgg atc aag gat atc gaa gcc tat acg ccg gga tgt cac gta aaa tat 288 Trp Ile Lys Asp Ile Glu Ala Tyr Thr Pro Gly Cys His Val Lys Tyr 85 90 95 cct atc gcg gcg gac cca acc cgc gag att atc cag cag cta aac atg 336 Pro Ile Ala Ala Asp Pro Thr Arg Glu Ile Ile Gln Gln Leu Asn Met 100 105 110 gta gac cca gac gag aca gag tcc agc aaa tgc gcc gtg cct tcg cga 384 Val Asp Pro Asp Glu Thr Glu Ser Ser Lys Cys Ala Val Pro Ser Arg 115 120 125 gct ctg cac atc att ggg ccc gac aag agg atc aag ctg agt ttc ctg 432 Ala Leu His Ile Ile Gly Pro Asp Lys Arg Ile Lys Leu Ser Phe Leu 130 135 140 tac ccc gcg tcg acg ggg cga aac atg gat gag gtg ctg agg gca gtg 480 Tyr Pro Ala Ser Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Val Leu Arg Ala Val 145 150 155 160 gag tcg ctc cag cag gcg gca aag cac aag gtg gca acg ccg gcg aac 528 Glu Ser Leu Gln Gln Ala Ala Lys His Lys Val Ala Thr Pro Ala Asn 165 170 175 tgg aag cct ggt gaa cct gtt gtg atc aag cct gat gtg tcc agc gag 576 Trp Lys Pro Gly Glu Pro Val Val Ile Lys Pro Asp Val Ser Ser Glu 180 185 190 gag gcc aag aag ctt ttc ccg cag ggt tat aaa agt gtt gat ctt cca 624 Glu Ala Lys Lys Leu Phe Pro Gln Gly Tyr Lys Ser Val Asp Leu Pro 195 200 205 tcc aag aag gat tac ctt cgt ttt acg aac gtc tga 660 Ser Lys Lys Asp Tyr Leu Arg Phe Thr Asn Val 210 215 <210> 68 <211> 219 <212> PRT <213> Xerophyta viscosa <400> 68 Met Pro Gly Leu Thr Ile Gly Asp Thr Ile Pro Asn Leu Glu Leu Asp 1 5 10 15 Thr Thr Gln Gly Arg Ile Lys Ile His Asp Tyr Val Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 Val Ile Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr 35 40 45 Glu Leu Gly Lys Met Ala Ala Tyr Ala Asp Glu Phe Ser Lys Arg Gly 50 55 60 Val Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Val Gln Ser His Lys Glu 65 70 75 80 Trp Ile Lys Asp Ile Glu Ala Tyr Thr Pro Gly Cys His Val Lys Tyr 85 90 95 Pro Ile Ala Ala Asp Pro Thr Arg Glu Ile Ile Gln Gln Leu Asn Met 100 105 110 Val Asp Pro Asp Glu Thr Glu Ser Ser Lys Cys Ala Val Pro Ser Arg 115 120 125 Ala Leu His Ile Ile Gly Pro Asp Lys Arg Ile Lys Leu Ser Phe Leu 130 135 140 Tyr Pro Ala Ser Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Val Leu Arg Ala Val 145 150 155 160 Glu Ser Leu Gln Gln Ala Ala Lys His Lys Val Ala Thr Pro Ala Asn 165 170 175 Trp Lys Pro Gly Glu Pro Val Val Ile Lys Pro Asp Val Ser Ser Glu 180 185 190 Glu Ala Lys Lys Leu Phe Pro Gln Gly Tyr Lys Ser Val Asp Leu Pro 195 200 205 Ser Lys Lys Asp Tyr Leu Arg Phe Thr Asn Val 210 215 <210> 69 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA sequence encoding Xerophyta viscosa PER1 protein using codons optimized for maize and Table 1 & Table 2 sequences are maintained <220> <221> CDS <222> (1)..(660) <400> 69 atg cct gga ttg act att ggt gac aca att ccc aac ttg gag ctg gat 48 Met Pro Gly Leu Thr Ile Gly Asp Thr Ile Pro Asn Leu Glu Leu Asp 1 5 10 15 acg aca caa ggt cgc atc aag atc cac gac tat gtc ggg aat gga tac 96 Thr Thr Gln Gly Arg Ile Lys Ile His Asp Tyr Val Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 gtg att ctc ttc tca cat cct ggt gat ttc act ccg gtg tgt acc acc 144 Val Ile Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr 35 40 45 gaa ttg ggc aag atg gct gct tat gcc gac gag ttc tct aag cgt ggt 192 Glu Leu Gly Lys Met Ala Ala Tyr Ala Asp Glu Phe Ser Lys Arg Gly 50 55 60 gtg aag ctg ctt ggg ttg tcc tgt gat gat gtc caa tca cat aag gag 240 Val Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Val Gln Ser His Lys Glu 65 70 75 80 tgg atc aaa gac ata gag gct tac aca cct ggc tgt cac gta aaa tat 288 Trp Ile Lys Asp Ile Glu Ala Tyr Thr Pro Gly Cys His Val Lys Tyr 85 90 95 ccg att gct gct gat cca acc aga gaa atc ata cag cag ctg aac atg 336 Pro Ile Ala Ala Asp Pro Thr Arg Glu Ile Ile Gln Gln Leu Asn Met 100 105 110 gtg gac cct gat gag acg gaa agc tct aag tgc gct gtg cct tct agg 384 Val Asp Pro Asp Glu Thr Glu Ser Ser Lys Cys Ala Val Pro Ser Arg 115 120 125 gca ctt cac atc ata gga cca gat aag agg atc aag ctg tcc ttc ctc 432 Ala Leu His Ile Ile Gly Pro Asp Lys Arg Ile Lys Leu Ser Phe Leu 130 135 140 tac cct gcc tct act ggt cgc aac atg gac gaa gtt ctt aga gcc gtt 480 Tyr Pro Ala Ser Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Val Leu Arg Ala Val 145 150 155 160 gag tct ctt cag caa gca gct aaa cac aaa gtt gca act cct gct aac 528 Glu Ser Leu Gln Gln Ala Ala Lys His Lys Val Ala Thr Pro Ala Asn 165 170 175 tgg aaa cct ggc gaa cca gtc gtc atc aaa cca gac gtc agc tcc gag 576 Trp Lys Pro Gly Glu Pro Val Val Ile Lys Pro Asp Val Ser Ser Glu 180 185 190 gag gcc aag aag ctc ttt cct caa ggt tat aaa agc gtt gat ttg cct 624 Glu Ala Lys Lys Leu Phe Pro Gln Gly Tyr Lys Ser Val Asp Leu Pro 195 200 205 tca aag aag gac tac ttg agg ttc acc aat gtt tga 660 Ser Lys Lys Asp Tyr Leu Arg Phe Thr Asn Val 210 215 <210> 70 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 Met Pro Gly Leu Thr Ile Gly Asp Thr Ile Pro Asn Leu Glu Leu Asp 1 5 10 15 Thr Thr Gln Gly Arg Ile Lys Ile His Asp Tyr Val Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 Val Ile Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr 35 40 45 Glu Leu Gly Lys Met Ala Ala Tyr Ala Asp Glu Phe Ser Lys Arg Gly 50 55 60 Val Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Val Gln Ser His Lys Glu 65 70 75 80 Trp Ile Lys Asp Ile Glu Ala Tyr Thr Pro Gly Cys His Val Lys Tyr 85 90 95 Pro Ile Ala Ala Asp Pro Thr Arg Glu Ile Ile Gln Gln Leu Asn Met 100 105 110 Val Asp Pro Asp Glu Thr Glu Ser Ser Lys Cys Ala Val Pro Ser Arg 115 120 125 Ala Leu His Ile Ile Gly Pro Asp Lys Arg Ile Lys Leu Ser Phe Leu 130 135 140 Tyr Pro Ala Ser Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Val Leu Arg Ala Val 145 150 155 160 Glu Ser Leu Gln Gln Ala Ala Lys His Lys Val Ala Thr Pro Ala Asn 165 170 175 Trp Lys Pro Gly Glu Pro Val Val Ile Lys Pro Asp Val Ser Ser Glu 180 185 190 Glu Ala Lys Lys Leu Phe Pro Gln Gly Tyr Lys Ser Val Asp Leu Pro 195 200 205 Ser Lys Lys Asp Tyr Leu Arg Phe Thr Asn Val 210 215 <210> 71 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA sequence in accordance with the invention encoding Xerophyta viscosa PER1 protein using codons optimized for maize and with sequences identified in Table 2 removed and Table 1 sequences are maintained <220> <221> CDS <222> (1)..(660) <400> 71 atg cct gga ttg act att ggt gac aca att ccc aac ttg gag ctg gat 48 Met Pro Gly Leu Thr Ile Gly Asp Thr Ile Pro Asn Leu Glu Leu Asp 1 5 10 15 acg aca caa ggt cgc atc aag atc cac gac tat gtc ggg aat gga tac 96 Thr Thr Gln Gly Arg Ile Lys Ile His Asp Tyr Val Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 gtg att ctc ttc tca cat cct ggt gat ttc act ccg gtg tgt acc acc 144 Val Ile Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr 35 40 45 gaa ttg ggc aag atg gct gct tat gcc gac gag ttc tct aag cgt ggt 192 Glu Leu Gly Lys Met Ala Ala Tyr Ala Asp Glu Phe Ser Lys Arg Gly 50 55 60 gtg aag ctg ctt ggg ttg tcc tgt gat gat gtc caa tca cat aag gag 240 Val Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Val Gln Ser His Lys Glu 65 70 75 80 tgg atc aaa gac ata gag gct tac aca cct ggc tgt cac gta aaa tat 288 Trp Ile Lys Asp Ile Glu Ala Tyr Thr Pro Gly Cys His Val Lys Tyr 85 90 95 ccg att gct gct gat cca acc aga gaa atc ata cag cag ctg aac atg 336 Pro Ile Ala Ala Asp Pro Thr Arg Glu Ile Ile Gln Gln Leu Asn Met 100 105 110 gtg gac cct gat gag acg gaa agc tct aag tgc gct gtg cct tct agg 384 Val Asp Pro Asp Glu Thr Glu Ser Ser Lys Cys Ala Val Pro Ser Arg 115 120 125 gca ctt cac atc ata gga cca gat aag agg atc aag ctg tcc ttc ctc 432 Ala Leu His Ile Ile Gly Pro Asp Lys Arg Ile Lys Leu Ser Phe Leu 130 135 140 tac cct gcc tct act ggt cgc aac atg gac gaa gtt ctt aga gcc gtt 480 Tyr Pro Ala Ser Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Val Leu Arg Ala Val 145 150 155 160 gag tct ctt cag caa gca gct aaa cac aaa gtt gca act cct gct aac 528 Glu Ser Leu Gln Gln Ala Ala Lys His Lys Val Ala Thr Pro Ala Asn 165 170 175 tgg aaa cct ggc gaa cca gtc gtc atc aaa cca gac gtc agc tcc gag 576 Trp Lys Pro Gly Glu Pro Val Val Ile Lys Pro Asp Val Ser Ser Glu 180 185 190 gag gcc aag aag ctc ttt cct caa ggt tat aaa agc gtt gat ttg cct 624 Glu Ala Lys Lys Leu Phe Pro Gln Gly Tyr Lys Ser Val Asp Leu Pro 195 200 205 tca aag aag gac tac ttg agg ttc acc aat gtt tga 660 Ser Lys Lys Asp Tyr Leu Arg Phe Thr Asn Val 210 215 <210> 72 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 Met Pro Gly Leu Thr Ile Gly Asp Thr Ile Pro Asn Leu Glu Leu Asp 1 5 10 15 Thr Thr Gln Gly Arg Ile Lys Ile His Asp Tyr Val Gly Asn Gly Tyr 20 25 30 Val Ile Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr 35 40 45 Glu Leu Gly Lys Met Ala Ala Tyr Ala Asp Glu Phe Ser Lys Arg Gly 50 55 60 Val Lys Leu Leu Gly Leu Ser Cys Asp Asp Val Gln Ser His Lys Glu 65 70 75 80 Trp Ile Lys Asp Ile Glu Ala Tyr Thr Pro Gly Cys His Val Lys Tyr 85 90 95 Pro Ile Ala Ala Asp Pro Thr Arg Glu Ile Ile Gln Gln Leu Asn Met 100 105 110 Val Asp Pro Asp Glu Thr Glu Ser Ser Lys Cys Ala Val Pro Ser Arg 115 120 125 Ala Leu His Ile Ile Gly Pro Asp Lys Arg Ile Lys Leu Ser Phe Leu 130 135 140 Tyr Pro Ala Ser Thr Gly Arg Asn Met Asp Glu Val Leu Arg Ala Val 145 150 155 160 Glu Ser Leu Gln Gln Ala Ala Lys His Lys Val Ala Thr Pro Ala Asn 165 170 175 Trp Lys Pro Gly Glu Pro Val Val Ile Lys Pro Asp Val Ser Ser Glu 180 185 190 Glu Ala Lys Lys Leu Phe Pro Gln Gly Tyr Lys Ser Val Asp Leu Pro 195 200 205 Ser Lys Lys Asp Tyr Leu Arg Phe Thr Asn Val 210 215

Claims (23)

  1. a) 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 DNA 서열,
    b) 하기 클래스 I 및 클래스 II로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 합성 DNA 서열이며,
    클래스 I은 AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA, 및 CATAAA로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    클래스 II는 ATATAT, TTGTTT, TTTTGT, TGTTTT, TATATA, TATTTT, TTTTTT, ATTTTT, TTATTT, TTTATT, TAATAA, ATTTAT, TATATT, TTTTAT, ATATTT, TATTAT, TGTTTG, TTATAT, TGTAAT, 및 AAATAA로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    상기 코돈-최적화된 DNA 서열은 클래스 II로부터의 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 상기 합성 DNA 서열은 단백질의 천연 DNA 서열보다 더 적은 개수의 클래스 II 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 상기 천연 DNA 서열과 비교하여 동일한 개수의 클래스 I 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하는 것인, 옥수수 세포에서 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키기 위한 합성 DNA 서열.
  2. 제1항에 있어서, 실질적으로 클래스 II 폴리아데닐화 신호 서열이 없는 합성 DNA 서열.
  3. 제1항에 있어서, 클래스 II 폴리아데닐화 신호 서열이 없는 합성 DNA 서열.
  4. 제1항에 있어서, 상기 합성 DNA 서열이 살충 단백질, 제초제 내성 단백질, 스트레스 내성-관련 단백질, 및 오일 프로파일 변형 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 단백질을 코딩하는 것인 합성 DNA 서열.
  5. 제4항에 있어서, 상기 합성 DNA 서열이 살충 단백질을 코딩하는 것인 합성 DNA 서열.
  6. 제4항에 있어서, 상기 합성 DNA 서열이 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 1 단백질을 코딩하는 것인 합성 DNA 서열.
  7. a) 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 DNA 서열,
    b) 하기 클래스 I 및 클래스 III으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 합성 DNA 서열이며,
    클래스 I은 AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA, 및 CATAAA로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    클래스 III은 ATTTTT, TATTTT, TTATTT, TTTATT, TTTTTT, TTTTAT, AATTTT, TTTTTA, ATATAT, TAATTT, TTAATT, AAATTT, AAATAA, ATATTT, TTTGTT TTGTTT, ATTATT, ATTTTA, TTTAAT, 및 TTTTAA로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    상기 코돈-최적화된 DNA 서열은 클래스 III으로부터의 1 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 상기 합성 DNA 서열은 단백질의 천연 DNA 서열보다 더 적은 개수의 클래스 III 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하고, 상기 천연 DNA 서열과 비교하여 동일한 개수의 클래스 I 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하는 것인, 대두 세포에서 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키기 위한 합성 DNA 서열.
  8. 제7항에 있어서, 실질적으로 클래스 III 폴리아데닐화 신호 서열이 없는 합성 DNA 서열.
  9. 제7항에 있어서, 클래스 III 폴리아데닐화 신호 서열이 없는 합성 DNA 서열.
  10. 제7항에 있어서, 상기 합성 DNA 서열이 살충 단백질, 제초제 내성 단백질, 스트레스 내성-관련 단백질, 및 오일 프로파일 변형 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 단백질을 코딩하는 것인 합성 DNA 서열.
  11. 제10항에 있어서, 상기 합성 DNA 서열이 살충 단백질을 코딩하는 것인 합성 DNA 서열.
  12. 제10항에 있어서, 상기 합성 DNA 서열이 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 1 단백질을 코딩하는 것인 합성 DNA 서열.
  13. 서열 번호 5, 서열 번호 11, 서열 번호 17, 서열 번호 23, 서열 번호 29, 서열 번호 35, 서열 번호 41, 서열 번호 47, 서열 번호 53, 서열 번호 59, 서열 번호 65, 및 서열 번호 71로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 DNA 서열.
  14. 5' 비번역 서열, 관심의 대상이 되는 단백질에 대한 코딩 서열, 및 3' 비번역 영역을 포함하고, 상기 5' 비번역 서열은 식물 세포에서 작용성인 프로모터를 함유하고, 상기 코딩 서열은 제1항의 합성 DNA 코딩 서열이고, 상기 3' 비번역 서열은 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 것인, 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구축물.
  15. 5' 비번역 서열, 관심의 대상이 되는 단백질에 대한 코딩 서열, 및 3' 비번역 영역을 포함하고, 상기 5' 비번역 서열은 식물 세포에서 작용성인 프로모터를 함유하고, 상기 코딩 서열은 제7항의 합성 DNA 코딩 서열이고, 상기 3' 비번역 서열은 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 것인, 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구축물.
  16. 제1항의 합성 DNA 서열을 함유하는 트랜스제닉 식물.
  17. 제7항의 합성 DNA 서열을 함유하는 트랜스제닉 식물.
  18. 제5항의 합성 DNA를 함유하는 식물로부터 곡물 또는 종자를 수득하는 단계를 포함하는, 곡물 또는 종자에서 해충을 방제하는 방법.
  19. 제11항의 합성 DNA를 함유하는 식물로부터 곡물 또는 종자를 수득하는 단계를 포함하는, 곡물 또는 종자에서 해충을 방제하는 방법.
  20. 제5항의 합성 DNA를 함유하는 식물로부터 곡물 또는 종자를 수득하는 단계를 포함하는, 곡물 또는 종자에서 해충을 방제하는 방법.
  21. 제5항의 합성 DNA를 함유하는 곡물로부터 굵은 가루(meal) 또는 고운 가루(flour)를 수득하는 단계를 포함하는, 굵은 가루 또는 고운 가루에서 해충을 방제하는 방법.
  22. 굵은 가루, 고운 가루, 단백질 농축물, 또는 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품(commodity product)인, 제16항의 트랜스제닉 식물로부터 유래된 조성물.
  23. 굵은 가루, 고운 가루, 단백질 농축물, 또는 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품인, 제17항의 트랜스제닉 식물로부터 유래된 조성물.
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