CN101379183A - 流感病毒的拯救 - Google Patents
流感病毒的拯救 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101379183A CN101379183A CNA2005800447512A CN200580044751A CN101379183A CN 101379183 A CN101379183 A CN 101379183A CN A2005800447512 A CNA2005800447512 A CN A2005800447512A CN 200580044751 A CN200580044751 A CN 200580044751A CN 101379183 A CN101379183 A CN 101379183A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- virus
- nucleic acid
- influenza
- influenza virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 100
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 98
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 49
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 151
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 14
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims description 10
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 22
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 abstract description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 7
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 5
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 abstract 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 70
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 70
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 70
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 65
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 56
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 37
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 37
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 37
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 37
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 37
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 25
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 19
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 19
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 19
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 16
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 description 12
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 10
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 10
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 7
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 7
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 7
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 6
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 6
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 5
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 5
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 5
- -1 Streptomycin sulphates Chemical class 0.000 description 5
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 4
- 238000013326 plasmid cotransfection Methods 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 3
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 3
- 108091034135 Vault RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001572 5'-adenylyl group Chemical group C=12N=C([H])N=C(N([H])[H])C=1N=C([H])N2[C@@]1([H])[C@@](O[H])([H])[C@@](O[H])([H])[C@](C(OP(=O)(O[H])[*])([H])[H])([H])O1 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241001533413 Deltavirus Species 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 241000351643 Metapneumovirus Species 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N amantadine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(N)C3 DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003805 amantadine Drugs 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UBCHPRBFMUDMNC-UHFFFAOYSA-N 1-(1-adamantyl)ethanamine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(C(N)C)C3 UBCHPRBFMUDMNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 1
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005646 Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein K Human genes 0.000 description 1
- 108010084680 Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein K Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001508691 Martes zibellina Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 description 1
- 229940123424 Neuraminidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101150105115 PA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103639 PB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150030427 PB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 235000001630 Pyrus pyrifolia var culta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002609 Pyrus pyrifolia var. culta Species 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 1
- 159000000013 aluminium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910000329 aluminium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003360 nephrocyte Anatomy 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229960003752 oseltamivir Drugs 0.000 description 1
- VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N oseltamivir Chemical compound CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N 0.000 description 1
- PGZUMBJQJWIWGJ-ONAKXNSWSA-N oseltamivir phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 PGZUMBJQJWIWGJ-ONAKXNSWSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical group 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 241000856131 recombinant Influenza A viruses Species 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229960000888 rimantadine Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002911 sialidase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940061367 tamiflu Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229960001028 zanamivir Drugs 0.000 description 1
- ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N zanamivir Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)C=C(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
- C12N2760/18651—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及流感疫苗生产领域。流感疫苗已在含胚鸡蛋中生产了50多年，但近来对发展用于疫苗生产的细胞培养系统作出了相当多的努力。本发明提供了核酸或所述核酸的互补链以及细胞，所述核酸包含流感基因片段和噬菌体聚合酶启动子，所述细胞包含这样的能够产生想要的流感病毒的核酸。此外，本发明提供了组合物，所述组合物包含细胞或来自本发明的细胞的材料以及来源于本发明的病毒颗粒的病毒或材料。
Description
本发明涉及流感病毒疫苗生产的领域。
流感病毒(正粘病毒科)是具有片段化基因组(Taubenberger和Layne，Molecular Diagnosis第6卷No.4 2001)的有包膜负链RNA病毒。基于其核蛋白和基质蛋白之间的显著抗原差异，将其分为两个属:一个属包含A型和B型流感病毒，而另一个属由C型流感病毒组成。所述三种病毒类型在病原性和基因组组织上也不相同。A型发现于广泛的恒温动物中，但B型和C型主要是人的病原体。根据血凝素(HA)和NA表面糖蛋白的抗原特征对A型流感病毒进一步分类，所述NA表面糖蛋白是病毒体表面突出物。目前有15种HA和9种NA亚型。A型流感病毒感染广泛的动物，包括禽类、猪、马、人和其它哺乳动物。水生禽类充当了所有已知A型流感病毒亚型的天然储存库，并且可能是人大流行性流感株系的遗传材料源。
与相关的副粘病毒不同，流感病毒具有片段化的RNA基因组。A型和B型流感病毒具有相似的结构，而C型流感病毒更具趋异性。其中A和B型病毒各包含8个分开的基因片段(各编码至少一个蛋白)，C型包含7个分开的片段，其中合并了A和B型的片段4和6。A和B型流感病毒覆盖有三种蛋白:HA、NA和基质2(M2)。C型流感病毒只具有一种表面糖蛋白。各流感RNA片段被核蛋白(NP)包裹以形成核糖核苷酸核蛋白(RNP)复合体。三个聚合酶蛋白与RNP复合体的一个末端结合。RNPs被具有基质蛋白(基质1)的膜包围。所述膜的磷脂部分来源于细胞宿主的膜。在病毒颗粒内部也发现了非结构性蛋白2(NS2)。针对流感病毒的命名系统，世界卫生组织(WHO)的指导方针如下。首先，指出病毒类型(A、B或C)，然后是宿主(如果是非人类)、分离的地方、分离的编号和分离的年份(通过斜扛分隔)。对于A型流感病毒，在括号内注明HA和NA亚型。例如，包含于最近的2000至2001季度的三价疫苗的株系是:A/Panama/2007/99(H3N2)、A/New Caledonia/20/99(H1N1)和B/Yamanashi/16/98。自1977年以来，已有两种A型亚型流感病毒H1N1和H3N2在人中共循环。
流感病毒在复制期间积累了点突变，因为其RNA聚合酶复合物不具有校正活性。改变表面糖蛋白抗原部分的氨基酸的突变可能为病毒株系提供选择性的有利方面，以允许其避开已存在的免疫性。HA分子通过结合某些宿主细胞上的受体启动感染。抗HA蛋白的抗体阻止受体结合并且非常有效地阻止相同株系的再感染。通过抗原性飘移或抗原性转变，HA可逃避之前已获得的免疫性，在所述抗原性飘移中，当前循环的HA基因的突变干扰了抗体结合，而在抗原性转变中，所述病毒获得了HA新亚型。在HA分子中，抗原性飘移压力是不均等的，正选择变化主要发生在HA蛋白的球状头部。在HA中，这些变化积累的程度也超过NA中积累的程度。在其它流感蛋白中变化的发生更加缓慢。同样，在人适合的流感株系中抗原性飘移压力是最大的，在猪和马适合性株系中抗原性飘移压力居中，在禽类适合性株系中抗原性飘移压力是最小的。
因为流感病毒具有片段化的基因组，所以在相同的宿主中用两种不同的株系共感染可导致新的重排流感病毒株系的产生，所述重排株系包含亲本基因片段的不同重组。已知在野生鸟类中存在15种HA亚型，其提供了新的人HAs源。通过抗原性转变在人循环中出现的具有新亚型的流感株系曾经是过去的1957和1968年中两次流感大流行的原因和很可能是1918年流感大流行的原因。与所有已知的有关大流行流感病毒出现相一致，大流行株系必须具有在抗原性上不同于当前流行的HA的HA；该HA不能已在人中循环60-70年；并且所述病毒必须可在人与人之间传染。1957年和1968年中，大流行是由于HA转变导致的，在这两种情况下，大流行株系的HAs与禽类株系紧密相关。尽管大流行的一个必要条件是HA必须改变，但病毒的其余部分可以或必须改变的程度是未知的。只能获得1957和1968年的大流行病毒用于直接研究，1918年的大流行流感病毒可通过使用分子考古学来进行表征。在1957年，三个基因:HA、NA和聚合酶复合物(PB1)的亚基被鸟类样基因替换。在1968年，只有HA和PB1被替换。
可通过病毒分离、血凝素抑制(HI)检测、通过免疫测定进行的抗原检测、血清学检验、分泌物中NA活性的验证或基于分子的测定法进行流感感染的特异性诊断。可将唾液、鼻咽抹拭物或用缓冲盐水溶液漱洗的鼻咽洗出液作为样品进行收集。流感诊断的标准曾经是培养后进行免疫学表征。血清学分析提供了精确的但溯及以往的用于流感感染的方法，因为其要求收集急性的和康复期的血清。
流感病毒可培养在含胚鸡蛋或许多组织培养系统中。胰蛋白酶(用于HA的切割激活)的加入允许流感病毒在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞和其它细胞系中增殖。用于疫苗生产的主要方法仍是在蛋中培养流感病毒。细胞系中的培养通常用于初级的人流感病毒(A型和B型)分离。许多人流感病毒可直接在含胚蛋的尿囊腔中培养。一些A型和B型流感病毒要求在羊膜腔中进行初始培养，然后再适应在尿囊腔中培养。在培养分离后，使用免疫测定法或免疫荧光最后确定大部分流感分离株。流感病毒的HA分子结合呼吸细胞表面上的唾液酸残基以使病毒进入。
通过利用流感病毒在体外凝集红细胞的能力在抗原性上表征流感株系。抗HA抗体可抑制凝集。因此，血凝抑制(HI)测定法是用于表征流感株系的一个标准方法。HI测定法用于确定样品株系是否是与最近的疫苗株系免疫学相关(即，交叉反应的)的。将确定的血清类型(通常在白鼬中产生的)以两倍稀释的系列加入小孔中，然后实验室工作人员通过观察悬浮的与凝聚成团的红细胞的比值来给测定小孔打分。在大多数情况下，成组的血清用于将样品株系与疫苗和参照株系匹配，在任何给定的流感活动期，通过HI测定法，绝大多数样品株系被成功地匹配。
在鉴定单个病毒株系的抗原特征上，WHO提供了指导方针，WHO合作中心也提供了指导，并且可为希望获得其的机构提供这些株系。根据免疫学系谱可对样品株系进行分类，例如A/Moscow/10/99(H3N2)样、A/New Caledonia/20/99(H1N1)样和B/Beijing/184/93样病毒。对于在HI测定法中未能表征的样品株系，实验室工作人员必须将其接种到白鼬中以产生株系特异性抗血清。当准备好新的抗血清后，如上所述再次进行HI测定。如果新的血清在交叉反应性上显示显著的差距(通常定义为样品和疫苗株系之间的4倍差异)，那么将其合并入常规的实验室组中并用于寻找新的流行性株系。因此，HI测定法在用于疫苗株系选择的流感病毒监视努力中是极其重要的并且是估计抗原性飘移最普遍使用的方法。
通过单个基因片段的序列比较可从遗传上表征流感株系，WHO指导方针和WHO合作中心对包含流感病毒基因组的单个RNA片段的性质的鉴定提供了指导；也提供指导鉴定下列的性质:A型和B型流感病毒核酸片段，编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)；和C型流感病毒核酸片段，编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶1(PB1)、碱性聚合酶2(PB2)、血凝素-神经氨酸酶样糖蛋白(HN)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)。
如果需要参照株系，例如用于抗原性分析、核酸序列比较和鉴定疫苗病毒，可求助于位于45 Poplar Road，Parkville，Victoria 3052，澳大利亚(传真:+61 3 9389 1881，网址:http//www.influenzacentre.org)的WHO流感鉴定和研究合作中心；WHO流感鉴定和研究合作中心，国家传染病研究所，Gakuen 4-7-1，Musashi-Murayama，东京208-0011，日本(传真:+81 42 5610812或+81 42 5652498)；WHO监视、流行病学和流感控制合作中心、疾病控制和预防中心，1600Clifton Road，Mail stop G16，亚特兰大，GA 30333，美国(传真:+1404 639 23 34)；或WHO流感鉴定和研究合作中心，国家医学研究所，The Ridgeway，Mill Hill，伦敦NW7 1AA，英国(传真:+44 208 9064477)。在WHO的网站http://www.who.int/influenza和地理信息系统，FluNet，http://www.who.int/flunet上可获得更新的流行病学信息。
对流感的影响和其预防的健康和经济利益的意识在不断地增长，过去十年已看到接种的用途和益处，并且产生了大量的抗流感药物。在许多国家，由于更长的预期寿命的原因，更多的人处于并发症的风险中，在流感大流行期间健康保健系统的负担受到更广泛的承认，更频繁的国际旅行已为病毒的传播提供了机会，同时新的药物的引入已增加了预防和治疗疾病的选择。大约50个国家具有政府资助的国家流感免疫项目，并且所述疫苗在许多其它国家是可获得的。疫苗应用的特定推荐是可变的，但通常包括对年长的和超过6个月大的个体每年进行免疫，所述个体由于已存在的慢性医学状况的原因，处于增加的严重疾病的风险中。在一些国家，疫苗用于减少流感对处于增加的医学风险的人的传播。成员国家需要考虑流感预防工作在其全体公共卫生优先背景中的利益。
灭活的疫苗分为几种类型，视其是否包含完整的病毒颗粒、部分破坏的病毒颗粒(分裂疫苗)或纯化的包膜抗原(亚单位疫苗)而定。一些亚单位疫苗已和佐剂或递送系统结合。
少数国家已批准针对某些靶群体的活的减毒流感疫苗。在俄罗斯联邦，一种疫苗的两种不同制剂已用于健康的成人和孩子中，并且另一种活疫苗已进行广泛的测试但仍未被批准。在活的减毒疫苗能更广泛地获得之前，其通常不会被推荐用于流感预防。
已发展了两类抗病毒剂用于预防和治疗流感。M2抑制剂，即金刚烷胺和金刚乙胺，被限定用于治疗A型流感病毒并且据报道在流感预防方面也是有效的。然而两种药物都导致一些副作用，在使用金刚烷胺的情况下，更容易产生显著的神经学上的副作用。神经氨酸酶抑制剂，例如扎那米韦和奥塞米韦，在许多国家近来被批准用于治疗A型和B型流感，并且已报道在预防方面是有效的。在接受这两类抗病毒剂的患者中已检测到抗性突变体。尽管目前并不认为这是个重要的公共卫生问题，但当这些药物在非常大的规模上使用时，情形将发生变化。
WHO维持着由位于82个国家的110个国家流感中心以及位于亚特兰大(美国)、伦敦(英国)、墨尔本(澳大利亚)和东京(日本)的4个WHO流感鉴定和研究合作中心合作运行的国际监视项目。这些中心为具有大流行潜能的新出现的株系提供早期预警系统。该系统非常重要，因为如果流感疫苗不包含目前循环的株系那么其功效将会降低。WHO发布疫苗组合物的推荐组合物，如可在由世界卫生组织出版的Weekly Epidemiological Record(例如参见2004，79，第9期，第88页或http://www.who.int/wer)中查到的，在二月份用于北半球的疫苗和在九月份用于南半球的疫苗。由于在赤道地区的流感季节模式还不明确，流行病学因素将影响这些推荐疫苗(二月或九月)中何种疫苗适合用作用于赤道国家的疫苗。
所述合作中心对国家中心提供的流感分离株系进行抗原和遗传分析。当观察到抗原变异的迹象时，将该变异与流行病学数据进行比较以估计变体的流行病学重要性。通过使用成组的在接种之前或之后收集的人血清，将代表性的分离株与当前的疫苗株系进行比较，从而估计目前的疫苗是否预期能抵抗这些病毒。根据WHO公开的每年的推荐疫苗，培育了高生长速率的株系并作为参照病毒提供给生产者以帮助产生用于疫苗生产的种子病毒。流感疫苗的安全性和功效检测包括病毒的灭活、微生物灭菌、用于破坏所述病毒的化学物质的测量和推荐的抗原的浓度确定。一般推荐疫苗要遵照WHO的要求，然而，国家控制机构应当批准用于各国的特异性疫苗病毒。国家公共卫生机构负责有关疫苗使用的推荐。WHO也公开了用于预防流感病毒感染的推荐疫苗。(参见WER No.35，2002，pp.281-288.)。
在含胚鸡蛋中生产流感疫苗已超过50年，但近来在发展用于疫苗生产的细胞培养系统上作出了大量的努力。含胚鸡蛋中的常规标准方法学非常繁琐并且具有一些主要的不利方面:需要数百万的鸡蛋；在美国每个季度超过100万个鸡蛋必须单个地接种和收获；要求许多过滤和离心步骤进行繁琐的纯化以确保疫苗不含卵蛋白，从而最大限度地减小过敏的风险；要求许多难以自动化并且非常费力的生产步骤，更不用说费时和遭受污染。
因此在工业上长期存在对发展疫苗生产技术的需求，所述生产技术证明要优于目前的疫苗生产技术，即，通过发展利用特异性细胞系的生产方案以取代现有的疫苗生产方法学，所述细胞系能够支持流感病毒生长并适合在自动化的生物反应器中、在生物载体上或在其它细胞培养系统中生长。
通常，良好表征的传代细胞系，例如VERO细胞或其它灵长类动物来源的细胞，被建议用于流感病毒疫苗的生产。然而，注册机构今天仍回避用于人用途的灵长类动物细胞中生产的疫苗。越来越多地，这些机构建议所有来自灵长类动物细胞(例如Vero)的产品不含有残留的完整细胞并且对在这些细胞中生产的产物中的残留材料(例如灵长类动物细胞DNA)水平表示持续的关注。尽管世界卫生组织(WHO)目前接受在肠胃外施用时每剂10ng来自传代细胞系的残留DNA的限定，但基于个案基础，注册机构仍要考虑由残留的灵长类细胞材料例如DNA施加的风险水平。
长期以来，由于缺少可获得的有效的反向遗传学系统，阻碍了A型流感病毒的基础研究。尽管事实上发展了最早的针对A型流感病毒的用于负链RNA病毒的反向遗传学技术，但只有到最近才实现从重组DNA中专门地拯救出该病毒。重组流感病毒通过用成组的八个质粒(各基因组病毒RNA(vRNA)片段通过RNA聚合酶I从所述质粒转录)和成组的四个额外的表达核蛋白(NP)和聚合酶蛋白PB1、PB2和PA的质粒转染真核细胞产生。据报道使用该12-质粒系统的病毒生产效率相对较低。当编码血凝素(HA)、神经氨酸酶(HA)、基质蛋白1和2(M1和M2)和非结构蛋白2(NS2)的5个额外质粒共表达时，上清液中病毒的滴度可增加。这些12和17-质粒系统的简化修饰是提供双向载体将转染的质粒数目减少至8个。使用该系统后，可从同一质粒中合成负链vRNA和正链mRNA。
产生重组A型流感病毒的能力促进了未来流感病毒的研究，然而，由于绝大部分(如果不是全部)用于疫苗生产的细胞系统由于聚合酶(参与反向遗传学系统)和最常用的细胞种类之间的不相容性导致不允许或仅极少量允许上述重组病毒的复制，还未发现使用重组A型病毒以充分地提高疫苗产品滴度的实际解决方案，所述重组A型病毒通过反向遗传学技术获得。
A型流感病毒是负链RNA病毒。这意味着在一轮复制周期中，产生三种类型的RNA:反义vRNA、有义cRNA和有义mRNA。与病毒RNA(vRNA)不同，mRNA被加帽并且具有poly(A)尾巴。mRNA的poly(A)尾巴的第一A残基与基因组中的U残基短片段匹配，所述U片段被认为是转录终止/聚腺苷酰信号。据认为，当聚合酶到达该U残基片段时，其进行相反方向滑动的重复循环并通过这种方式产生完整的mRNA poly(A)尾巴。
发明简述
本发明提供了能够应用于不同物种的细胞类型的用于流感病毒的反向遗传学系统。聚合酶I是转录核糖体RNA的核仁中的酶并且在正在生长的细胞中大量表达。rRNA，与vRNA相似，不具有帽和poly(A)尾巴，因此聚合酶I可用于从cDNA产生vRNA。通过聚合酶I的病毒cDNA的转录允许产生具有正确5’和3’末端的病毒样RNAs。然而，尽管聚合酶II的转录机器通常与来自不同物种的基因相容，但聚合酶I转录表现出严格的(尽管不是绝对的)种特异性。该种特异性是由转录因子与启动子之间的相互作用和在较低的程度上由所述因子间的蛋白-蛋白相互作用提供的。基于聚合酶I的反向遗传学系统的种特异性是疫苗发展的主要不利方面，因为除了人以外的细胞种类的聚合酶I启动子例如犬类或禽类的聚合酶I启动子还未曾被描述，而在工业上，良好确定的犬类(即Madin Darby犬肾(MDCK)细胞)或禽类细胞(鸡胚胎成纤维细胞(CEF))通常用于流感病毒疫苗生产。
本发明提供了包含流感病毒基因片段和噬菌体聚合酶启动子的核酸或所述核酸的互补链。与Neumann和Kawaoka(Virology 287，243-240，2001)的发现相反，本发明为该基于噬菌体聚合酶的反向遗传学技术学在有关质粒载体和其包含的元件方面提供了显著的灵活性，所述发现表明:与非片段病毒相反，所述非片段病毒明显例外地是流感病毒，其中T7聚合酶被认为不起作用，除了来自克隆的cDNA的聚合酶和核蛋白外，其产生包括八个病毒RNAs的增加的合成复杂性。例如，我们使用噬菌体T7的RNA聚合酶产生vRNA或cRNA样RNA分子，但也可使用各种其它的RNA聚合酶例如噬菌体SP6RNA聚合酶。在优选的实施方案中，本发明提供了包含流感基因片段和T7启动子的核酸或所述核酸的互补链，从而允许我们将本发明的系统建立在于T7启动子的控制之下的流感病毒基因片段的表达的基础上。在一个实施方案中，缺少聚合酶终止子。优选地，在紧邻启动子之后给所述核酸提供了一个或两个额外的鸟嘌呤残基。为了疫苗目的，提供了根据本发明的核酸，所述核酸包含来源于流感病毒的基因片段，所述病毒是由WHO推荐用于疫苗目的的病毒。在优选的实施方案中，本发明提供了包含A型流感病毒的基因片段和T7启动子的核酸或所述核酸的互补链。特别是在双向系统中，优选地，根据本发明的核酸不包含T7终止子。因为所述聚合酶优选地表达自与表达所述病毒的质粒一起转染的质粒，此处提供的系统并不限定于特定物种。尽管基于T7聚合酶的反向遗传学系统有时用于非片段负链病毒的拯救，但基于噬菌体聚合酶技术的片段化流感病毒的反向遗传学系统之前从未被成功地利用过。有时试图通过在转录起始位点引入G残基以增强T7聚合酶驱动的转录来克服使用T7聚合酶转录cDNA的反向遗传学系统中的一个限制因素。该方法已用于例如RV、VSV和SV的拯救，然而，Zobel等人(Virology.1994 Jul；202(1):477-9；Nucleic Acids Res.1993 Aug11；21(16):3607-14)明确指出需要精确地确定A型流感基因片段的5’和3’以使病毒聚合酶正确地发挥作用；因此明显地在转录位点无空间加入额外的核苷酸，从而与在转录起始位点引入G残基冲突。然而，令人惊奇的是，在本发明优选的实施方案中，我们提供了根据本发明的核酸，在所述核酸上，在紧接着T7启动子的位置提供了至少一个额外的鸟嘌呤残基。甚至更优选地，在紧接着T7启动子之处提供了两个额外的鸟嘌呤残基。此外，本发明还提供了具有T7聚合酶的MadinDarby犬肾(MDCK)或鸡胚胎成纤维(CEF)细胞。特别地，本发明提供了具有至少一个根据本发明的核酸的细胞。本发明有助于多质粒系统例如17-质粒或12-质粒或8-质粒系统的使用，并且，因为本发明提供了具有根据本发明的核酸的细胞，所述核酸额外地被提供T7聚合酶，所述核酸优选地表达自与一个或多个能够表达根据本发明的流感病毒基因片段的质粒一起转染的质粒，因此所述系统不限定于特定物种。此处也提供了根据本发明的细胞的用途，其中所述T7聚合酶包含细胞核定位信号。在优选的实施方案中，此处提供的细胞是非灵长类动物细胞，因此避免了将灵长类动物DNA引入来源于根据本发明的核酸或细胞的细胞材料或疫苗中。优选地，使用MDCK细胞或CEF细胞。本发明的有利方面是反向遗传学系统不需要辅助病毒，所有通过转染提供的病毒颗粒包含想要的核酸并且可被使用而不用在随后的疫苗生产系统中建立克隆步骤。本发明也第一次提供了包含根据本发明的核酸的复制型病毒颗粒。在美国5,166,057中，还未提供这种能够复制的病毒颗粒，在本发明之前，其它试图将T7系统用于片段化流感病毒的努力也未获成功。如此处提供的具有大约104个病毒颗粒的病毒滴度的细胞培养组合物可在经转染的细胞培养物中在无病毒复制的情况下容易地获得，当病毒复制时所述细胞培养物的病毒滴度可被提高至>107。在无辅助病毒的情况下实现根据本发明的颗粒的复制特别有用。这种细胞培养组合物可有利地用于生产药物组合物，所述细胞培养组合物包含细胞或来源于本发明细胞的材料或者病毒或来源于本发明病毒颗粒的材料，所述药物组合物用于产生抵抗流感病毒感染受试者的免疫学保护作用。可以肯定的是，在美国5,166,057中还未提供如此处提供的这些细胞。因此，本发明也提供了用于生产复制型流感病毒颗粒的方法，所述方法包括培养具有至少一个根据本发明的核酸的细胞。优选地，用于所述方法的至少一个核酸包含至少一个，但优选地7或8个流感基因片段和噬菌体聚合酶启动子或所述核酸或酸的互补链。更优选地，所述片段不包含噬菌体聚合酶终止子，由此有利地该片段在紧接着启动子的位置被提供以至少一个额外的鸟嘌呤残基，或在紧接启动子的位置被提供以二个额外的鸟嘌呤残基。优选地，所述片段来源于由WHO推荐的用于疫苗目的的流感病毒，例如A型流感病毒的基因片段。最后，本发明提供了可用上面公开的方法获得的复制型流感病毒颗粒。因此本明也提供了用于产生抗流感病毒对受试者感染的免疫保护的方法，所述方法包括为有此需要的受试者提供此处提供的组合物。将该组合物优选地配制为疫苗，即，通过将病毒颗粒或来源于该颗粒的病毒蛋白(亚单位疫苗)与恰当的药物载体例如盐溶液或佐剂(例如，铝盐或其它普遍使用的赋形剂(参见例如http://www.cdc.gov/nip/publications/pink/Appendices/A/Excip ient.pdf.))混合。
附图说明
图1，用于基于T7pol的反向遗传学系统的构建体。克隆策略的详述参见说明书。
图2，用编码GFP小基因组(0.6μg)、T7pol(0.6μg)和A型流感病毒聚合酶基因(各1μg)的构建体转染的293T细胞的FACS分析。左图:转染30小时后GFP阳性细胞的百分比。右图:GFP阳性部分中GFP表达的水平(平均荧光强度)。在X轴上，显示以有义(S)或反义(AS)方向排列的被转染的GFP小基因组构建体，并标明额外G核苷酸的数目。黑色条形表示用A型流感病毒聚合酶复合体的所有4个成分(PB2、PB1、PA和NP)进行的共转染，白色条形表示用省去pHMG-NP构建体的构建体转染的对照。
图3，经转染的293T细胞的FACS分析，所述细胞用0.6μg具有2个额外G残基的反义GFP小基因组、4μg A型流感病毒聚合酶构建体、和0.6μg野生型T7pol(C)、含有核定位信号(N)的T7pol或以1:1比例(C/N)的两种构建体来进行转染。左图:转染30小时后GFP阳性细胞的百分比。右图:GFP阳性部分中GFP表达的水平(平均荧光强度)。
图4，经转染的293T或BSR-T7细胞的FACS分析，所述细胞用0.6μg编码具有2个额外G残基的GFP小基因组的构建体和4μg A型流感病毒聚合酶构建体来进行转染。显示了细胞的GFP阳性部分中GFP表达的水平(平均荧光强度)。用或不用表达T7pol的质粒转染细胞，所述T7pol含有核定位信号(293T和293T N比较或BSR-T7和BSR-T7 N的比较)。黑色条形表示用A型流感病毒聚合酶复合体的所有4个成分(PB2、PB1、PA和NP)进行的共转染，白色条形表示用省去pHMG-NP构建体的构建体转染的对照。
图5，经转染的293T细胞的FACS分析，所述细胞用0.6μg编码具有2个额外G残基的反义GFP小基因组(AS-2G)或有义GFP小基因组(S-0G)的构建体和0.6μg表达具有核定位信号的T7pol的质粒和4μg表达A型流感病毒聚合酶基因的质粒来进行转染。左图:转染30小时后GFP阳性细胞的百分比。右图:GFP阳性部分中GFP表达的水平(平均荧光强度)。黑色条形表示用A型流感病毒聚合酶复合体的所有4个成分(PB2、PB1、PA和NP)进行的共转染，白色条形表示用省去pHMG-NP构建体的构建体转染的对照。
图6，经转染的293T和MDCK细胞的FACS分析，所述细胞用0.6
μg编码具有2个额外G残基的反义GFP小基因组(AS-2G)的构建体、0.6μg表达具有核定位信号的T7pol的质粒和4μg表达A型流感病毒聚合酶基因的质粒来进行转染。左图:转染30小时后GFP阳性细胞的百分比。右图:GFP阳性部分的GFP表达水平(平均荧光强度)。黑色条形表示用A型流感病毒聚合酶复合体的所有4个成分(PB2、PB1、PA和NP)进行的共转染，白色条形表示用省去pHMG-NP构建体的构建体转染的对照。
详述
实施例1
使用基于T7 RNA聚合酶的反向遗传系统产生重组A型流感病毒
导言
长期以来，由于缺少可获得的有效的反向遗传学系统，阻碍了A型流感病毒的基础研究。尽管事实上发展了最早的针对A型流感病毒(7，18)的用于负链RNA病毒的反向遗传学技术，但只是到最近才实现从重组DNA中专门地拯救该病毒(9，20)。
A型流感病毒是负链RNA病毒。在病毒复制周期中，产生三种类型的RNA:反义基因组病毒RNA(vRNA)、与基因组RNA互补的有义RNA(cRNA)和有义信使RNA(mRNA)。尽管vRNA和cRNA基本上不含修饰的末端，但mRNA被加帽并且具有poly(A)尾巴(16)。
RNA聚合酶I(PolI)是转录核糖体RNA(rRNA)的核仁中的酶并且在正在生长的细胞中大量表达。与vRNA相似，rRNA不具有帽和poly(A)尾巴(23)。Hobom和同事成功地使用PolI产生具有精确的5’和3’末端的人工流感病毒vRNA样片段。在PolI启动子-终止子盒背景中克隆的cDNA的转录允许产生具有正确的5’和3’末端的vRNA样分子(29)。随后的涉及辅助流感病毒的研究证明这些基因组vRNA分子可被识别并且通过流感病毒聚合酶复合体进行复制并被包装入后代流感病毒中。该系统允许产生流感病毒，所述流感病毒包含其中一个病毒基因片段或额外的基因片段内的突变，因此允许对病毒基因和其产物进行研究。作为使用辅助病毒的结果，要求选择转染子病毒，这是非常麻烦的。
Neumann等人设计了用于从克隆的cDNA(20)完整地回收A型流感病毒的PolI系统。将编码A型流感病毒的全长vRNAs的cDNAs克隆入人PolI启动子和小鼠PolI终止子之间。原则上，将这8个质粒导入真核细胞应当导致所有8个流感vRNAs的合成。用这8个vRNA表达质粒和表达病毒核蛋白以及来自RNA聚合酶II(PolII)启动子控制下的聚合酶蛋白PB2、PB1和PA的质粒共转染人胚胎肾细胞(293T)。由细胞PolI合成的vRNAs被包装入RNPs并且可以每ml(pfu/ml)上清液超过1 x 103蚀斑形成单位的感染性病毒的量回收。用表达其它病毒结构蛋白的质粒共转染导致病毒产量的显著增加，即3 x 104至5 x 107pfu/ml(20)。Fodor等人报道了相似的用于回收A型流感病毒(9)的系统。该系统依赖于8个编码所有8个vRNA cDNAs的质粒，所述cDNAs在侧翼连接人PolI启动子，但其包含δ型肝炎病毒核酶(HδVrib)序列而非PolI终止子序列。这些质粒与四个表达2型腺病毒主要晚期启动子控制下的PB1、PB2、PA和NP蛋白的质粒共转染Vero细胞。通过使用等量的各表达质粒，Fodor等人报道了从106经转染的细胞(9)中获得1-2个感染性病毒颗粒的拯救率。我们已设计了相似的反向遗传学系统来产生重组流感病毒A/PR/8/34。我们得出在经转染的细胞培养物中在无病毒复制的情况下可获得大约104的病毒滴度，当病毒复制时，所述病毒滴度可提高至>107(4)。因为这些PolI驱动的系统要求12-16个质粒的共转染，因此使用可高效转染的细胞系是有效地生产重组病毒所必需的。
后来，Hoffmann等人发展了用于产生仅来自8个质粒(12)的A型流感病毒的双向PolI-PolII转录系统。在该双向系统中，将vRNAcDNA插入在人PolI启动子和小鼠PolI最小终止子序列之间。将该完整盒插入PolII启动子和多聚腺苷酰位点之间。这使得可以从单个构建体中分别转录来自PolI和PolII启动子的vRNA和mRNA。8个PolI-PolII质粒(各编码一个A型流感病毒基因片段)在和MadinDarby犬肾(MDCK)细胞共培养的293T细胞中的共转染导致感染性A型流感病毒的回收，产量高达2 x 107pfu/ml上清液(12)。mRNA和vRNA的合成都使用一个模板，这减少了要求用于病毒产生的质粒数目。据报道在该系统中病毒产生的效率与单向(12-16质粒)PolI系统中的效率相似。
尽管PolII启动子通常与来自不同种的转录机器相容，但来自PolI启动子的转录表现严格的(尽管不是绝对的)种特异性。该种特异性是由转录因子与启动子之间的相互作用和在较低的程度上由所述因子间的蛋白-蛋白相互作用提供的(23)。
基于PolI的反向遗传学系统的种特异性形成了主要的不利方面。上述的反向遗传学系统使用了人PolI启动子，从而将重组病毒的产生限制在灵长类动物来源的细胞例如293T细胞或Vero细胞中。尽管对几种物种包括人、小鼠、大鼠和猪(8，14，17)的PolI启动子已进行了表征，但对其它许多物种仍不了解。犬和禽类细胞常规地用于A型流感病毒的研究和疫苗生产中，但犬和禽类PolI启动子仍未得以描述。为提高流感病毒反向遗传学技术的灵活性，我们试图发展通用的反向遗传学系统。我们已选择设计基于在噬菌体T7RNA聚合酶启动子(pT7)控制之下表达A型流感病毒的基因片段的系统。因为可通过转染或通过使用稳定修饰的细胞系将噬菌体T7RNA聚合酶(T7pol)提供给细胞，所以该系统并不被限定于来自特定物种的细胞。
将基于T7pol的反向遗传学系统用于拯救非片段化负链病毒。Schnell等人第一次从克隆的cDNA(27)中单独地拯救出非片段化负链病毒。制备编码狂犬病毒(RV)的全长反基因组RNA的cDNA克隆。该cDNA在紧接着T7pol终止子序列(tT7)的位置侧翼连接pT7和HδVrib序列。通过T7pol转录后，通过所述HδVrib序列在3’末端的自溶性切割产生精确的基因组3’末端。将该质粒和编码在pT7控制下的病毒N蛋白以及聚合酶L和P蛋白的质粒共转染入表达T7pol的细胞中。该方法导致重组RV的拯救，但只从大约2x107个经转染的细胞(27)中拯救出一个。其后，曾描述过用于副粘病毒科、弹状病毒科和非片段NSV的线状病毒科家族(10)的类似系统。
为了成功地回收来自cDNA的非片段负链病毒，通常产生有义反基因组RNA(cRNA)而非反义vRNA。据认为，裸露的反义vRNA和编码病毒蛋白的有义mRNA的同时存在将导致杂交，阻止了基因组装配成核糖核蛋白复合体(RNPs)(27)。负链病毒通常不会遭遇这种问题，因为其总是以RNP形式保持其基因组，所述形式防止了杂交。已报道了用编码反义基因组RNA的cDNA回收仙台病毒(15)、人3型副流感病毒(6)和人metapneumovirus(11)；然而，效率显著低于通过用有义RNA获得的结果。该原理也已用于重组流感病毒的拯救。Hoffmann等人(13)也确定了来自反基因组有义RNA的重组流感病毒生产的效率。与只在细胞质中复制的非片段化和片段化负链病毒相反，A型流感病毒可从基因组和反基因组载体中拯救，并且具有相似的效率。
使用pT7的病毒拯救系统中的一个限制因素是在+1至+3位点的残基可影响转录。据观察，通过在pT7(22)的下游直接导入2或3个G残基可增加cDNA的转录。该观察结果已用于例如重组RV(27)、水疱性口炎病毒(28)、呼吸道合胞病毒(3)和人metapneumovirus(11)的拯救。很明显，对于这些病毒，在基因组的一个末端加入G残基不会影响病毒复制但对T7pol驱动的转录具有正效应。
基于T7pol的系统已广泛地用于流感病毒的反向遗传学研究(18)，但基于质粒的重组流感病毒的生产至今仍未得以描述。此处我们第一次描述了这种用于重组流感病毒生产的基于T7pol的反向遗传学系统。
材料和方法
细胞和病毒
将Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞培养在含有10％ FCS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、1.5mg/ml碳酸氢钠、10mM Hepes和非必需氨基酸的EMEM(BioWhittaker)中。将293T细胞培养在含有10％ FCS、100 IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和非必需氨基酸的DMEM(BioWhittaker)中。BSR-T7细胞是稳定地表达T7RNA聚合酶(2)的幼年仓鼠肾细胞系。将BSR-T7细胞培养在含有10 ％FCS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和0.5mg/ml G418(Life Technologies，Breda，The Netherlands)的DMEM中。
将适合于在含胚鸡蛋中复制但可能不在哺乳动物细胞培养物中最优复制的流感病毒A/PR/8/34以低感染复数在培养于Episerf培养基(Gibco BRL)中的MDCK细胞中传代7次，所述培养基含有10IU/ml青霉素和10μg/ml链霉素。第七次传代后，常规地获得108TCID50/ml的病毒滴度。
293T细胞的转染
基本上按(24)所描述的方法进行磷酸钙介导的293T细胞瞬时转染。在转染前一天将细胞涂布在凝胶化的100mm直径的培养皿中以获得50％的汇合单层。转染过夜后，用新鲜的含有2％ FCS的培养基替换转染培养基以用于病毒生产或用含有10％ FCS的培养基替换以用于所有其它转染。将细胞温育30至72小时，之后收集上清液，如果合适对细胞进行荧光分析。在所有的实验中平行地使用质粒pEGFP-N1(Clontech，BD Biosciences，Amsterdam，The Netherlands)进行转染并在FACSCa libur(Becton Dickinson)流式细胞仪中测量荧光细胞的百分比，经确定转染效率在95-100％的范围之内。通过在300xg下离心10分钟澄清含有病毒的上清液。立即或在4℃贮存短于一周后，或在-80℃贮存超过一周后确定上清液中的病毒滴度。
MDCK细胞的转染
基本上如以前(1)所描述的进行MDCK细胞的瞬时转染。简而言之，向10μl脂转染胺2000中加入240μl Optimem I培养基(GibcoBRL)并在室温下温育5分钟。将所需量的DNA用Optimem I培养基调整至50μl体积再加入至该混合物中。将该混合物在室温下温育20分钟。温育后，加入200μl不含青霉素和链霉素的MDCK培养基(参见上面)并将该混合物加入至6孔板中的1 x 106个悬浮MDCK细胞中。在5小时温育后，用PBS清洗细胞两次并在2ml不含青霉素和链霉素的MDCK培养基中培养。在过夜温育后，用含有2％FCS的MDCK培养基替换该培养基。
BSR-T7细胞的转染
为进行BSR-T7细胞的瞬时转染，在转染前将400.000细胞涂布在6孔培养皿中以获得50-70％的汇合单层。将无血清DMEM(240μl)加入至10μl脂转染胺2000中并在室温下温育4分钟。用无血清DMEM将DNA调整至50μl再加入到该混合物中，并在室温下温育20分钟。在转染前，用2ml无血清DMEM替换培养基。温育后，将转染混合物逐滴加入至细胞中并在37℃下温育5小时。转染后，用PBS清洗细胞一次并加入2ml含有2％ FCS的DMEM以用于病毒生产或含有10％ FCS的DMEM以用于FACS分析。
质粒
使用编码T7pol(pAR3126和pAR3132)的真核表达载体。尽管质粒pAR3126编码野生型T7pol，但质粒pAR3132表达含有核定位信号(NLS)的T7pol，所述核定位信号有效地将T7pol靶向细胞核(5)。表达A型流感病毒聚合酶蛋白的真核表达质粒使用小鼠羟基甲基戊二酰辅酶A还原酶启动子，它们是pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PA和pHMG-NP(25)。
通过PCR扩增pPolI-CAT-RT(25)的HδVrib并克隆入pSP72的XbaI-BamHI位点。将用BamHI-EcoRV消化的tT7序列克隆在pSP72-HδVrib的BamHI-HpaI位点，产生pSP72-HδVrib-tT7(MS24)。在合适的背景中将编码pT7的寡核苷酸连接在pSP72-HδVrib-tT7的NdeI-XbaI位点以引入BbsI位点，产生载体pSP72-pT7-Hδ Vrib-tT7(MS25，图1)。通过使用pSP-Hu-GFP-Mu(4)作为模板，将绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框克隆在pSP72-pT7-Hδ Vrib-tT7的BbsI位点，所述开放阅读框的侧翼连接有来自流感病毒A/PR/8/34的片段5的NCRs。将该GFP小基因组以有义和反义的方向克隆，并且在紧接着pT7的下游包含0/2/3个额外的G残基(图1)。
为将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆pSP72-pT7-HδVrib-tT7，de Wit等人(4)描述的双向流感病毒A/PR/8/34构建体被用作PCR的模板(第4个3’核苷酸对应着国家流感序列数据库中报道的流感病毒A/PR/8/34的序列)。将包含AarI限制性位点的引物用于克隆片段1、2、3、4、6、7、8，并对片段5使用平末端连接；将基因片段以反义方向克隆BbsI位点并在pT7之后包含2个额外的G残基。
通过克隆tT7下游的CMV启动子(pCMV)产生双向载体pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV(MS65，图1)，从而允许从相应的基因片段产生mRNA。使用含有AseI限制性位点的引物通过PCR扩增pCMV。用AseI部分消化pSP72-pT7-HδVrib-tT7并以合适的方向将pCMV连接在tT7的下游，从而从基因片段产生mRNA.
再次克隆流感病毒A/PR/8/34片段以获得各双向T7pol驱动的流感病毒A/PR/8/34构建体。
我们也产生了其中删除了tT7的一组双向载体。通过用BamHI-BpeEI消化pSP72-pT7-Hδ Vrib-tT7-pCMV、用klenow酶进行处理、和再连接以产生pSP72-pT7-HδVrib-pCMV(MS90，图1)来制备该双向载体。再次克隆流感病毒A/PR/8/34的片段以获得各双向T7pol驱动的流感病毒A/PR/8/34构建体。
按照厂商说明书，使用Big Dye Terminator v3.1 CycleSequencing试剂盒(Applied Biosystems)和3100 Genetic Analyser(Applied Biosystems)对所有质粒进行测序。
用基于T7pol的系统产生重组病毒
如上所述，用5μg包含PR/8/34的基因片段的各单向质粒、表达质粒HMG-PB2、HMG-PB1、HMG-PA、HMG-NP各5μg和15μg pAR3132转染293T细胞。或者，我们用5μg包含PR/8/34的基因片段的各双向质粒和15μg pAR3132进行转染。转染72小时后收集上清液并用1ml感染汇合的MDCK细胞单层。
病毒的感染和滴定
在接种之前，用PBS清洗MDCK细胞2次，并用1ml293T上清液接种6孔板中的MDCK细胞汇合单层；在感染期间加入40μg胰蛋白酶(2.5％，Bio Whittaker)。将板在37℃贮存1小时并用PBS清洗两次，之后加入2ml含有4％ BSA、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、1.5mg/ml碳酸氢钠、10mM Hepes、非必需氨基酸和20μg/ml胰蛋白酶的EMEM(BioWhittaker)(感染培养基)。在感染后3天，收集培养物的上清液并检测作为细胞感染指标的HA的活性。如前面所述(26)进行病毒滴定。简而言之，在感染培养基中制备转染细胞的十倍系列稀释。在接种之前，用PBS清洗细胞两次。将100μl稀释的培养上清液用于接种96孔板中的MDCK细胞汇合单层。在37℃温育1小时后再次用PBS清洗细胞，并向各孔中加入200μl新鲜感染培养基。感染后3天，就各孔中作为细胞感染指示剂的HA活性对培养物的上清液进行检测。根据Spearman-Karber(26)的方法从10个重复实验中计算感染性滴度。
结果
使用基于单向T7pol的反向遗传学系统的GFP小基因组测定法
构建包含pT7、HδVrib和tT7的单向载体。以有义(S)和反义(AS)方向将GFP开放阅读框克隆入pSP72-pT7-HδVrib-tT7并且具有0、2或3个额外的G残基(图1和附录2和3)，所述开放阅读框侧翼连接有流感病毒A/PR/8/34的片段5的非编码区(NCRs)。这些构建体分别称为S-0G、S-2G、S-3G、AS-0G、AS-2G和AS-3G。我们检测这些选择中产生最佳表现的选择。
我们用GFP小基因组(S-0G、S-2G、S-3G、AS-0G、AS-2G、AS-3G)、T7pol表达质粒(pAR3132)和4种表达PB2，PB1，PA和NP蛋白的质粒(pHMG-PB2，pHMG-PB1，pHMG-PA，pHMG-NP)之一转染293T细胞。作为对照，我们用省去pHMG-NP从而导致GFP小基因复制丧失的质粒进行相同的转染。转染后30小时，在FACSCalibur中对细胞进行荧光分析。
图2描述了所述结果。从左图可看出在以反义方向排列的、具有两个额外的G残基的GFP小基因的转染中观察到最高比例的GFP阳性细胞。
其它的GFP小基因组构建体也产生了稍小比例的GFP阳性细胞。当将GFP阳性细胞的平均荧光值进行比较(图2，右图)时，具有两个额外G残基以反义方向排列的GFP小基因组再次显示最佳的表现。在该实验中，具有两个额外G残基以有义方向排列的GFP小基因组显示最差的表现，而其它构建体表现适中。
尽管我们在不同的实验中在表达GFP的细胞的比例上和不同GFP小基因组质粒之间的GFP表达水平上观察到一些变化(数据未显示)，但具有两个额外G残基以反义方向排列的GFP小基因组总体上表现最佳，因此选用该构建体进行随后的实验。
细胞核与细胞质T7pol表达的比较。
我们潜在地需要解决的一个问题是T7pol的表达。对于副粘病毒反向遗传学，使用主要在细胞质中表达的T7pol，这是想要的，因为副粘病毒的复制也发生在细胞质中。流感病毒在细胞核中复制，因此在细胞质中表达T7pol可能不是最佳选择。因此当使用细胞质版本的T7pol(质粒AR3126)或包含核定位信号(NLS，质粒pAR3132)的T7pol时，我们希望比较GFP表达水平。
该实验的结果显示于图3。当使用野生型T7pol表达质粒时，阳性细胞中的平均GFP荧光强度是521。通过使用包含核定位信号的T7pol可显著增加GFP的表达水平(平均荧光1106)。当将具有和不具有核定位信号的T7pol一起使用(1:1比例，保持转染质粒的总量不变)时，观察到中等的GFP表达水平(平均荧光强度为775)。在大量的独立实验中，使用多种GFP小基因组质粒，这些结果是可重复的；当使用细胞核版本的T7pol时观察到GFP的表达增加2至10倍(数据未显示)。因此，在随后的实验中，我们使用包含核定位信号的T7pol。
瞬时和稳定的T7pol表达的比较
对于几种副粘病毒反向遗传学系统，不是通过质粒转染而是通过使用允许T7pol稳定表达的细胞系提供T7pol。为进行该目的，可获得幼年仓鼠肾细胞(BSR-T7)。我们检测BSR-T7是否能用于流感病毒GFP小基因组的转录，所述GFP小基因组随后可被流感病毒聚合酶复合体复制，从而导致GFP表达(图4)。
从图4中可看到，293T细胞中高度GFP荧光强烈地依赖于T7pol的表达。在BSR-T7细胞中，与用其中省去pHMG-NP质粒的材料的转染相反，在用GFP小基因组与流感病毒聚合酶复合体共转染时观察到相对较高水平的GFP表达。当加入表达细胞核版本的T7pol后，发现GFP的表达水平甚至更高。BSR-T7细胞中相对高水平的GFP表达暗示着T7pol的稳定表达比通过转染进行的瞬时表达更有效。然而，其中由转染提供细胞核T7pol的实验表明:对于流感病毒反向遗传学，表达细胞核T7pol而非野生型T7pol的稳定细胞系将更有效。
用基于单向T7pol的反向遗传学系统产生重组病毒
然后，将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入pSP72-pT7-HδVrib-tT7载体中以产生重组流感病毒A/PR/8/34。
我们用编码流感病毒A/PR/8/34的基因片段的8个构建体、pT7pol(pAR3132)、pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PA和pHMG-NP转染293T细胞。转染后，向培养基中加入胰蛋白酶以使产生的病毒能够复制。转染后72小时，收集上清液并用于接种MDCK细胞。接种后3天，对这些MDCK细胞的上清液进行HA检测，其作为病毒复制的指示。HA检测呈阳性。接着，确定293T和MDCK上清液的病毒滴度。293T上清液中的病毒滴度显示为1.6 x 101TCID50/ml；MDCK上清液中的病毒滴度为2.0 x 107TCID50/ml。当转染后不向293T细胞中加入胰蛋白酶时，在293T细胞和MDCK细胞中获得稍微下降的病毒滴度(数据未显示)。因此这代表了第一个只是质粒重组流感A病毒的拯救，所述拯救不使用PolI启动子。
双向T7系统
然后我们希望发展在pT7控制下的双向反向遗传学系统。通过将pCMV克隆入pSP72-pT7-HδVrib-tT7，导致载体pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV(图1)的产生。将侧翼连接流感病毒A/PR/8/34的片段5的非编码区(NCRs)的GFP开放阅读框(具有2个额外G残基)以反义方向克隆在pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV内。因为我们预期该质粒在无需通过流感聚合酶复合体复制小基因组的情况下产生GFP表达(相对于所述小基因组，pCMV是以有义方向排列)，我们也制备了相似的包含小基因组(0G残基)的构建体，所述小基因组相对pT7以有义方向排列，从而与pCMV形成反义方向排列)。将小基因组质粒和表达细胞核T7pol的质粒和pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PA和pHMG-NP转染293T细胞。30小时后通过FACS分析细胞(图5)。
用不完整的流感病毒聚合酶复合体和有义GFP小基因组(S-0G)进行转染导致非常少的具有非常低的GFP表达(图5，右图)的GFP阳性细胞(图5，左图)。在完整的流感病毒聚合酶复合体存在的情况下，大约7％的细胞是具有平均荧光强度大约为1200的GFP阳性细胞。通过使用反义GFP小基因组质粒，在缺少完整流感病毒聚合酶复合体的情况下，相对较大比例的细胞(大约10％)表达GFP，但只以低水平表达(平均GFP荧光强度为182)。当用完整的流感病毒聚合酶复合体共转染时，表达GFP的细胞的比例不增加，但是每个细胞的GFP表达水平显著增加(平均GFP荧光强度为1205)。因此，从这个实验我们可以得出结论:双向表达载体是有功能的；我们观察到作为来自pCMV的GFP mRNA产生的结果，在无需流感病毒聚合酶复合体的情况下GFP表达水平较低。很明显，这可以通过单独地使用AS-2G GFP小基因组质粒转染293T细胞来证实，所述转染导致相似的GFP表达水平(约19％细胞以128的平均荧光值表达)(数据未显示)。此外，我们观察到作为从pT7转录的小基因组的复制的结果，在流感病毒聚合酶复合体存在的情况下GFP表达水平增加。因此，双向pT7-pCMV表达质粒是有功能的。
用基于双向T7pol的反向遗传学系统产生重组病毒
然后，将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入载体pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV中以产生重组流感病毒A/PR/8/34。
我们用编码流感病毒A/PR/8/34的基因片段和pT7pol(pAR3132)的8个构建体转染293T细胞。转染后，向培养基中加入胰蛋白酶以允许所产生的病毒复制。转染后72小时，收集上清液并用于接种MDCK细胞。接种后3天，对这些MDCK细胞的上清液进行HA检测，其作为病毒复制的指示。所述HA检测呈阴性，表明没有重组病毒被回收。
根据使用双向载体表达PB2、PB1、PA和NP基因的小基因组报道测定，我们获得证据:来自这些质粒的蛋白表达非常低(数据未显示)。我们假设tT7序列干扰从pCMV的转录，导致被编码的基因的产量较低。因此我们产生新的双向质粒，在该质粒中tT7序列被除去(pSP72-pT7-HδVrib-pCMV)。将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入载体pSP72-pT7-HδVrib-pCMV以产生重组流感病毒A/PR/8/34。在最初的努力中，再次未产生重组病毒。然而，当对用于转染的质粒量进行一些优化后，我们成功地产生了重组病毒。用于该实验的质粒的量是:编码PB2、PB1、PA和HA的各构建体各10μg和编码NP、NA、MA和NS的各构建体各5μg。尽管不能检测到293T细胞中的重组病毒滴度，但随后MDCK细胞的接种产生具有1.3 x 105TCID50/ml的初始滴度的病毒。
MDCK细胞中的T7pol系统
为给基于T7pol的反向遗传学系统的通用特性提供进一步的证据，我们检测MDCK细胞而非293T细胞中的GFP小基因组的复制。尽管使用BSR-T7细胞的实验已提供了证据:T7pol反向遗传学系统在非灵长类动物来源的细胞中发挥作用(图4)，但MDCK更广泛地用于流感病毒研究和疫苗生产。
如可在图6中看到的，发现基于T7pol的反向遗传学系统在MDCK细胞中具有功能。与BSR-T7细胞(图4)中的结果相结合，这些实验表明T7pol反向遗传系统确实代表着“通用”系统，可用于广泛的细胞类型。根据该实验，可以认为可以从非灵长类动物细胞中生产重组流感病毒。
此处我们已第一次显示，使用基于T7pol的系统可在293T细胞中产生重组流感病毒A/PR/8/34(MDCK-适应性NIBSC株系)。然而，并不假定将这些方法的应用限定于流感病毒A/PR/8/34；其可用于所有A、B和C型流感病毒以及其它片段化负链RNA病毒。也没有假定将这些方法的应用限定于293T细胞、BSR-T7细胞和MDCK细胞；可通过例如广泛的细胞系的转染来提供T7pol，在所述细胞系中可产生重组病毒。
用于该基于T7pol的反向遗传学系统技术学的质粒载体和其包含的元件也具有明显的灵活性。此处，我们使用噬菌体T7的RNA聚合酶产生vRNA或cRNA样RNA分子，但也可使用各种其它的RNA聚合酶例如噬菌体SP6RNA聚合酶。在此处显示的实验中，T7RNA聚合酶经修饰包含SV40大T抗原的核定位信号，但可使用各种其它核靶向信号(例如，hnRNP K蛋白的核靶向信号)修饰RNA聚合酶。我们在此使用δ型肝炎病毒的核酶序列，但已描述了其它可选择使用的核酶序列。最后，此处描述的系统不依赖于流感病毒聚合酶蛋白质表达载体的应用，所述表达载体基于小鼠羟基甲基戊二酰辅酶A还原酶启动子(pHMG构建体)；可使用来自广泛的流感病毒的聚合酶蛋白，并且可使用广泛的表达载体表达所述聚合酶蛋白。
参考文献:
1.Basler，C.F.，X.Wang，E.Muhlberger，V.Volchkov，J.Paragas，H.D.Klenk，A.Garcia-Sastre，and P.Palese.2000.TheEbola virus VP35 protein functions as a type I IFN antagonist.Proc Natl Acad Sci U S A 97:12289-94.
2.Buchholz，U.J.，S.Finke，and K.K.Conzelmann.1999.Generation of bovine respiratory syncytial virus(BRSV) from cDNA:BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture，and the human RSV leader region acts as a funct ional BRSV genomepromoter.J Virol 73:251-9.
3.Collins，P.L.，M.G.Hill，E.Camargo，H.Grosfeld，R.M.Chanock，and B.R.Murphy.1995.Production of infectious humanrespiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms anessential role for the transcription elongation factor from the5′proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expressionand provides a capability for vaccine development.Proc Natl AcadSci U S A 92:11563-7.
4.de Wit，E.，M.I.Spronken，T.M.Bestebroer，G.F.Rimmelzwaan，A.D.Osterhaus，and R.A.Fouchier.2004.Efficientgeneration and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eightcDNA fragments.Virus Res 103:155-61.
5.Dunn，J.J.，B.Krippl，K.E.Bernstein，H.Westphal，andF.W.Studier.1988.Targeting bacteriophage T7 RNA polymeraseto the mammalian cell nucleus.Gene 68:259-266.
6.Durbin，A.P.，S.L.Hall，J.W.Siew，S.S.Whitehead，P.L.Collins，and B.R.Murphy.1997.Recovery of infectioushuman parainfluenza virus type 3 from cDNA.Virology 235:323-32.
7.Enami，M.，W.Luytjes，M.Krystal，and P.Palese.1990.Introduction of site-specific mutations into the genome ofinfluenza virus.Proc Natl Acad Sci U S A 87:3802-5.
8.Financsek，I.，K.Mizumoto，Y.Mishima，and M.Muramatsu.1982.Humanr ibosomal RNA gene:nucleotide sequence of thetranscription initiation region and comparison of threemammalian genes.Proc Natl Acad Sci U S A 79:3092-6.
9.Fodor，E.，L.Devenish，O.G.Engelhardt，P.Palese，G.G.Brownlee，and A.Garcia-sastre.1999.Rescue of influenza Avirus from recombinant DNA.J Virol 73:9679-9682.
10.Garcia-Sastre，A.1998.Negative-strand RNA viruses:applications to biotechnology.Trends Biotechnol 16:230-5.
11.Herfst，S.，M.de Graaf，J.H.Schickli，R.S.Tang，J.Kaur，C.F.Yang，R.R.Spaete，A.A.Haller，B.G.van den Hoogen，A.D.Osterhaus，and R.A.Fouchier.2004.Recovery of humanmetapneumovirus genetic lineages a and B from cloned cDNA.J Virol78:8264-70.
12.Hoffmann，E.，G.Neumann，Y.Kawaoka，G.Hobom，and R.G.Webster.2000.A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids.Proc Natl Acad Sci USA97:6108-13.
13.Hoffmann，E.，and R.G.Webster.2000.Unidirectional RNApolymerase I-polymerase II transcription system for thegeneration of influenza A virus from eight plasmids.J Gen Virol81:2843-7.
14.Ishikawa，Y.，G.Safrany，K.Hisatake，N.Tanaka，Y.Maeda，H.Kato，R.Kominami，and M.Muramatsu.1991.Structureof the core promoter of human and mouser ibosomal RNA gene.Asymmetry of species-specific transcription.J Mol Biol218:55-67.
15.Kato，A.，Y.Sakai，T.Shioda，T.Kondo，M.Nakanishi，andY.Nagai.1996.Initiation of Sendai virus multiplicationfrom transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.Genes Cells v1:569-79.
16.Lamb，R.A.，and R.M.Krug.1996.Orthomyxoviridae:theviruses and their replication，p.1353-1395.In B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.Howley(ed.)，Virology，vol.2.Lippincott-Raven publishers，Philadelphia.
17.Ling，X.，and N.Arnheim.1994.Cloning andidentification of the pig ribosomal gene promoter.Gene150:375-9.
18.Luytjes，W.，M.Krystal，M.Enami，J.D.Pavin，and P.Palese.1989.Amplification，expression，and packaging offoreign gene by influenza virus.Cell 59:1107-13.
19.Neumann，G.，and G.Hobom.1995.Mutational analysis ofinfluenza virus promoter elements in vivo.J Gen Virol76:1709-17.
20.Neumann，G.，T.Watanabe，H.Ito，S.Watanabe，H.Goto，P.Gao，M.Hughes，D.R.Perez，R.Donis，E.Hoffman，G.Hobom，and Y.Kawaoka.1999.Generation of influenza A viruses entirelyfrom cloned cDNAs.Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350.
21.Neumann，G.，A.Zobel，and G.Hobom.1994.RNA polymeraseI-mediated expression of influenza viral RNA molecules.Virology202:477-9.
22.Pattnaik，A.K.，L.A.Ball，A.W.LeGrone，and G.W.Wertz.1992.Infectious defective interfering particles of VSV fromtranscripts of a cDNA clone.Cell 69:1011-20.
23.Paule，M.R.，and R.J.White.2000.Survey and summary:transcription by RNA polymerases I and III.Nucleic Acids Res28:1283-98.
24.Pear，W.S.，G.P.Nolan，M.L.Scott，and D.Baltimore.1993.Production of high-titre helper-free retroviruses bytransient transfection.Proc Natl Acad Sci U S A 90:8392-6.
25.Pleschka，S.，R.Jaskunas，O.G.Engelhardt，T.Zurcher，P.Palese，and A.Garcia-Sastre.1996.A plasmid-based reversegenetics system for influenza A virus.J Virol 70:4188-92.
26.Rimmelzwaan，G.F.，M.Baars，E.C.Claas，and A.D.Osterhaus.1998.Comparison of RNA hybridization，hemagglutination assay，titration of infectious virus andimmunofluorescence as methods for monitor inginfluenza virusreplication in vitro.J Virol Methods 74:57-66.
27.Schnell，M.J.，T.Mebatsion，and K.K.Conzelmann.1994.Infectious rabies viruses from cloned cDNA.Embo J 13:4195-203.
28.Whelan，S.P.，L.A.Ball，J.N.Barr，and G.T.Wertz.1995.Efficient recovery of infectious vesicular stomatitisvirus entirely from cDNA clones.Proc Natl Acad Sci U S A92:8388-92.
29.Zobel，A.，G.Neumann，and G.Hobom.1993.RNA polymeraseI catalysed transcription of insert viral cDNA.Nucleic Acids Res21:3607-14.
实施例2
如上所述基于相关流行性病毒(例如A/Moscow/10/99)的HA和NA基因和高生产能力的病毒主链(例如来源于疫苗株系A/PR/8/34)生产重组病毒。在通过转染产生重组病毒后，在合适的细胞基质(例如，鸡蛋、MDCK细胞、Vero细胞)中扩增所述病毒以达到足够高的量。当在含胚鸡蛋中扩增时，通过在1000xg下离心10分钟和通过0.45微米的过滤器过滤来清除尿囊液体。通过在4℃下在150.000xg下离心1.5小时沉淀所述病毒并重新悬浮于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。然后用2％的癸酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA)处理病毒，将病毒加在一层25％的PBS中的蔗糖上并在4℃下在250.000xg下离心1.5小时。
然后将含有HA和NA蛋白的最上层对PBS进行透析并用12.5％的经考马斯亮蓝染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶确定蛋白制剂的纯度和量。用大约10微克HA/NA蛋白肌内免疫白鼬。如果想要，可使用连续多剂或使用佐剂(MF59、ISCOM)进行接种。使用血凝抑制测定法、神经氨酸酶抑制测定法、ELISA、病毒中和测定法等确定接种前和接种后收集的血清样品中的抗HA和NA抗体的滴度。在接种后6周，使用1 x 10E550％组织培养半感染剂量(TCID-50)的流感病毒A/Moscow/10/99或异源病毒分离株攻击接受接种的动物和对照动物。攻击后，10天内每天从动物收集鼻或咽拭抹样品，通过定量PCR分析或病毒滴定确定由接受感染的动物分泌的病毒量。因此，通过对抗体滴度和抗所述攻击病毒感染的保护水平的增加进行定量来确定获得的疫苗诱导的免疫性。
Claims (20)
1.包含流感基因片段和噬菌体聚合酶启动子的核酸或所述核酸的互补链。
2.权利要求1的核酸，其不包含噬菌体聚合酶终止子。
3.权利要求1或2的核酸，在其与启动子相邻的位置被提供以至少一个额外的鸟嘌呤残基。
4.权利要求3的核酸，在其与启动子相邻的位置被提供以两个额外的鸟嘌呤残基。
5.权利要求1至4中任一项的核酸，所述核酸包含来源于流感病毒的基因片段，所述流感病毒由WHO推荐用于疫苗目的。
6.权利要求1至5中任一项的核酸，所述核酸包含A型流感病毒基因片段。
7.权利要求1至6中任一项的核酸，其中所述噬菌体聚合酶是T7聚合酶。
8.被提供以至少一个权利要求1至7中任一项的核酸的细胞。
9.被额外地提供以噬菌体聚合酶的权利要求8的细胞。
10.权利要求9的细胞，其中所述聚合酶包含核定位信号。
11.权利要求8至10中任一项的非灵长类动物细胞。
12.权利要求11的细胞，所述细胞是MDCK细胞或CEF细胞。
13.权利要求8至12中任一项的细胞，所述细胞未提供以辅助病毒。
14.权利要求8至13中任一项的细胞，其中所述噬菌体聚合酶是T7聚合酶。
15.包含权利要求1至7中任一项的核酸的病毒颗粒。
16.一种组合物，所述组合物包含权利要求8至14中任一项的细胞或来自所述细胞的材料或来自权利要求15的病毒颗粒的病毒或材料。
17.权利要求16的组合物用于生产药物组合物的用途，所述药物组合物用于产生抵抗流感病毒感染受试者的免疫学保护作用。
18.用于产生抵抗流感病毒感染受试者的免疫学保护作用的方法，其包括为有此需要的受试者提供权利要求16的组合物。
19.被提供以噬菌体聚合酶，优选T7聚合酶的Madin Darby犬肾(MDCK)或鸡胚成纤维(CEF)细胞。
20.被提供以核酸或所述核酸的互补链的权利要求19的细胞，所述核酸包含流感基因片段和噬菌体聚合酶启动子。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP04078527.1 | 2004-12-24 | ||
| EP04078527 | 2004-12-24 | ||
| PCT/EP2005/057092 WO2006067211A1 (en) | 2004-12-24 | 2005-12-22 | Rescue of influenza virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101379183A true CN101379183A (zh) | 2009-03-04 |
| CN101379183B CN101379183B (zh) | 2013-07-03 |
Family
ID=34928779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2005800447512A Expired - Fee Related CN101379183B (zh) | 2004-12-24 | 2005-12-22 | 流感病毒的拯救 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7959930B2 (zh) |
| EP (2) | EP2295542B1 (zh) |
| JP (2) | JP5620048B2 (zh) |
| KR (1) | KR101272487B1 (zh) |
| CN (1) | CN101379183B (zh) |
| AU (1) | AU2005318087B2 (zh) |
| BR (1) | BRPI0518568A2 (zh) |
| CA (1) | CA2592439C (zh) |
| DK (1) | DK1831357T3 (zh) |
| ES (1) | ES2395813T3 (zh) |
| HK (1) | HK1125674A1 (zh) |
| IL (1) | IL183888A (zh) |
| MX (1) | MX2007007889A (zh) |
| NO (1) | NO20073737L (zh) |
| NZ (1) | NZ556061A (zh) |
| PT (1) | PT1831357E (zh) |
| RU (2) | RU2435855C2 (zh) |
| TW (2) | TWI495724B (zh) |
| WO (1) | WO2006067211A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA200705145B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103118704A (zh) * | 2010-07-13 | 2013-05-22 | 克劳德伯纳德里昂第一大学 | 经修饰的病毒株及用于改善流感病毒的疫苗种子的产生的方法 |
| CN103237890A (zh) * | 2010-06-02 | 2013-08-07 | 巴克斯特保健股份有限公司 | 用于产生rna 病毒的方法和辅助病毒 |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921732A (zh) | 2001-01-19 | 2010-12-22 | 维洛诺瓦蒂夫公司 | 在易感哺乳动物中引起呼吸道疾病的病毒 |
| WO2003072720A2 (en) | 2002-02-21 | 2003-09-04 | Medimmune Vaccines, Inc. | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus |
| JP5620048B2 (ja) * | 2004-12-24 | 2014-11-05 | アボツト・バイオロジカルズ・ベー・ブイＡｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｂ．Ｖ． | インフルエンザウイルスの救済（ｒｅｓｃｕｅ） |
| EP1917361A4 (en) * | 2005-06-21 | 2009-07-29 | Medimmune Vaccines Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXPRESSING NEGATIVE SENSE RNA VIRUS IN CANINE CELLS |
| US7790434B2 (en) | 2005-06-21 | 2010-09-07 | Medimmune, Llc | Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells |
| AU2006310163B2 (en) | 2005-11-04 | 2011-09-15 | Seqirus UK Limited | Influenza vaccine with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant |
| DE202006021242U1 (de) | 2005-11-04 | 2014-01-29 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Emulsionen mit freiem wässrigen Phasen Tensid als Adjuvans für Spalt-Grippeimpfstoffe |
| JP2009514838A (ja) | 2005-11-04 | 2009-04-09 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル | 細胞培養物において増殖されたインフルエンザウイルスから調製された非ビリオン抗原を含むアジュバントワクチン |
| CN102755645A (zh) | 2005-11-04 | 2012-10-31 | 诺华疫苗和诊断有限公司 | 佐剂配制的包含细胞因子诱导剂的流感疫苗 |
| ES2377884T3 (es) | 2005-11-04 | 2012-04-02 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Vacunas contra la gripe que incluyen combinaciones de adyuvantes particulados e inmunopotenciadores |
| DK2478916T3 (da) | 2006-01-27 | 2020-06-15 | Seqirus Uk Ltd | Influenzavacciner indeholdende hæmagglutinin og matrixproteiner |
| CA2646349A1 (en) | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg | Storage of influenza vaccines without refrigeration |
| WO2007126810A2 (en) | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Warf - Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines |
| US7682619B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-03-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine influenza virus |
| GB0614460D0 (en) | 2006-07-20 | 2006-08-30 | Novartis Ag | Vaccines |
| ES2694805T7 (es) | 2006-09-11 | 2021-10-21 | Seqirus Uk Ltd | Fabricación de vacunas contra virus de la gripe sin usar huevos |
| SG177141A1 (en) | 2006-12-06 | 2012-01-30 | Novartis Ag | Vaccines including antigen from four strains of influenza virus |
| US9474798B2 (en) | 2007-06-18 | 2016-10-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines |
| EP2185191B1 (en) | 2007-06-27 | 2012-09-12 | Novartis AG | Low-additive influenza vaccines |
| GB0810305D0 (en) | 2008-06-05 | 2008-07-09 | Novartis Ag | Influenza vaccination |
| CN101998990B (zh) | 2008-03-18 | 2013-11-27 | 诺华股份有限公司 | 流感病毒疫苗抗原制备方法的改进 |
| JP5642712B2 (ja) | 2009-02-10 | 2014-12-17 | ノバルティス アーゲー | 少ない量のスクアレンを含むインフルエンザワクチン |
| US20120093860A1 (en) | 2009-02-10 | 2012-04-19 | Novartis Ag | Influenza vaccines with increased amounts of h3 antigen |
| EA201171032A1 (ru) | 2009-02-10 | 2012-02-28 | Новартис Аг | Схемы лечения с помощью вакцины против гриппа, связанного с пандемическими штаммами |
| USH2284H1 (en) | 2009-04-27 | 2013-09-03 | Novartis Ag | Vaccines for protecting against influenza |
| WO2011012999A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Novartis Ag | Reverse genetics systems |
| US9109013B2 (en) | 2009-10-26 | 2015-08-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells |
| US10130697B2 (en) | 2010-03-23 | 2018-11-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses |
| WO2013057715A1 (en) | 2011-10-20 | 2013-04-25 | Novartis Ag | Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming |
| GB201218195D0 (en) | 2012-10-10 | 2012-11-21 | Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie | Composition |
| WO2014145287A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | University Of Maryland | Swine influenza viruses and constructs and uses thereof |
| AU2014290203B2 (en) | 2013-07-15 | 2020-12-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in MDCK or vero cells or eggs |
| US10053671B2 (en) | 2014-06-20 | 2018-08-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
| US10633422B2 (en) | 2015-06-01 | 2020-04-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA |
| WO2016201127A1 (en) * | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Sanofi Pasteur, Inc. | Methods of optimizing nucleotide sequences encoding engineered influenza proteins |
| KR20180035807A (ko) | 2015-06-26 | 2018-04-06 | 세퀴러스 유케이 리미티드 | 항원적으로 매치된 인플루엔자 백신 |
| WO2017007839A1 (en) | 2015-07-06 | 2017-01-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Improved influenza virus replication for vaccine development |
| BR112018000296A2 (pt) | 2015-07-07 | 2018-09-04 | Seqirus UK Limited | ensaios de potência de influenza |
| AU2017221444B2 (en) | 2016-02-19 | 2021-07-29 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Improved influenza B virus replication for vaccine development |
| JP2022527235A (ja) | 2019-01-23 | 2022-06-01 | 義裕 河岡 | インフルエンザウイルスにおける付加的遺伝子に遺伝的安定性を付与する突然変異 |
| CN113874496A (zh) | 2019-02-08 | 2021-12-31 | 威斯康星校友研究基金会(Warf) | 人源化细胞系 |
| US11390649B2 (en) | 2019-05-01 | 2022-07-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
| US11807872B2 (en) | 2019-08-27 | 2023-11-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5166057A (en) * | 1989-08-28 | 1992-11-24 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand rna virus expression-systems |
| US6001634A (en) | 1989-08-28 | 1999-12-14 | Palese; Peter | Recombinant negative strand RNA viruses |
| US5854037A (en) | 1989-08-28 | 1998-12-29 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
| US6887699B1 (en) | 1990-05-22 | 2005-05-03 | Medimmune Vaccines, Inc. | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
| US6544785B1 (en) | 1998-09-14 | 2003-04-08 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses |
| US8715940B2 (en) * | 1999-04-06 | 2014-05-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of making recombinant influenza virus |
| EP2910629B1 (en) | 1999-04-06 | 2018-09-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy |
| DK1194580T4 (da) | 1999-07-14 | 2011-01-03 | Sinai School Medicine | In-vitro rekonstitution af segmenterede negativstrengede RNA-virus |
| EP1218499A2 (en) * | 1999-08-02 | 2002-07-03 | Wyeth | RESCUE OF MUMPS VIRUS FROM cDNA |
| US6764685B1 (en) * | 2000-03-21 | 2004-07-20 | Medimmune Vaccines, Inc. | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines |
| US6951754B2 (en) | 2000-04-28 | 2005-10-04 | St. Jude Children's Research Hospital | DNA transfection system for the generation of infectious influenza virus |
| KR20030013451A (ko) * | 2000-06-23 | 2003-02-14 | 아메리칸사이아나미드컴파니 | 인플루엔자 에이/유돈/72(에이치3엔2) 게놈의뉴클레오타이드 서열 |
| WO2003072720A2 (en) * | 2002-02-21 | 2003-09-04 | Medimmune Vaccines, Inc. | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus |
| WO2003091401A2 (en) * | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Medimmune Vaccines, Inc. | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
| US7037707B2 (en) * | 2003-09-04 | 2006-05-02 | St. Jude Children's Research Hospital | Method for generating influenza viruses and vaccines |
| JP5620048B2 (ja) * | 2004-12-24 | 2014-11-05 | アボツト・バイオロジカルズ・ベー・ブイＡｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｂ．Ｖ． | インフルエンザウイルスの救済（ｒｅｓｃｕｅ） |
-
2005
- 2005-12-22 JP JP2007547535A patent/JP5620048B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-22 KR KR1020077017093A patent/KR101272487B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-12-22 CA CA2592439A patent/CA2592439C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-22 WO PCT/EP2005/057092 patent/WO2006067211A1/en active Application Filing
- 2005-12-22 EP EP10182258A patent/EP2295542B1/en not_active Not-in-force
- 2005-12-22 BR BRPI0518568-8A patent/BRPI0518568A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-12-22 EP EP05825287A patent/EP1831357B1/en active Active
- 2005-12-22 PT PT58252875T patent/PT1831357E/pt unknown
- 2005-12-22 NZ NZ556061A patent/NZ556061A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-12-22 RU RU2007128336/10A patent/RU2435855C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-12-22 CN CN2005800447512A patent/CN101379183B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-22 MX MX2007007889A patent/MX2007007889A/es active IP Right Grant
- 2005-12-22 ES ES05825287T patent/ES2395813T3/es active Active
- 2005-12-22 US US11/722,769 patent/US7959930B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-22 DK DK05825287.5T patent/DK1831357T3/da active
- 2005-12-22 AU AU2005318087A patent/AU2005318087B2/en not_active Ceased
- 2005-12-23 TW TW101113590A patent/TWI495724B/zh not_active IP Right Cessation
- 2005-12-23 TW TW094146438A patent/TWI402344B/zh not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-06-13 IL IL183888A patent/IL183888A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 ZA ZA200705145A patent/ZA200705145B/xx unknown
- 2007-07-18 NO NO20073737A patent/NO20073737L/no not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-04-30 HK HK09104018.1A patent/HK1125674A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-04-15 US US13/088,120 patent/US20120156241A1/en not_active Abandoned
- 2011-05-31 RU RU2011122117/10A patent/RU2011122117A/ru not_active Application Discontinuation
-
2012
- 2012-03-22 JP JP2012065345A patent/JP5702321B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103237890A (zh) * | 2010-06-02 | 2013-08-07 | 巴克斯特保健股份有限公司 | 用于产生rna 病毒的方法和辅助病毒 |
| CN103118704A (zh) * | 2010-07-13 | 2013-05-22 | 克劳德伯纳德里昂第一大学 | 经修饰的病毒株及用于改善流感病毒的疫苗种子的产生的方法 |
| CN103118704B (zh) * | 2010-07-13 | 2015-01-14 | 克劳德伯纳德里昂第一大学 | 经修饰的病毒株及用于改善流感病毒的疫苗种子的产生的方法 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101379183B (zh) | 流感病毒的拯救 | |
| US8742089B2 (en) | Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells | |
| JP5303603B2 (ja) | インフルエンザウイルスの生産用多重プラスミドシステム | |
| MX2007005719A (es) | Particulas de virus de la influenza defectuosas. | |
| CA2646526A1 (en) | Methods and compositions for expressing negative-sense viral rna in canine cells | |
| US20070031941A1 (en) | Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells | |
| CN102586199A (zh) | 有缺陷的流感病毒颗粒 | |
| AU2011204881B2 (en) | Rescue of influenza virus | |
| Sakaguchi et al. | Studies on the paramyxovirus accessory genes by reverse genetics in the Sendai virus–mouse system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1125674 Country of ref document: HK |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SOLVAN BIOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SOLVAY PHARMA GMBH Effective date: 20090821 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20090821 Address after: Holland Weesp Applicant after: Solva biology Co., Ltd. Co-applicant after: Univ Erasmus Medical Ct Address before: Holland Weesp Applicant before: The drug Co., Ltd. Co-applicant before: Univ Erasmus Medical Ct |
|
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Holland Weesp Applicant after: Abbott Biologicals B.V. Applicant after: Univ Erasmus Medical Ct Address before: Holland Weesp Applicant before: Solvay Pharm BV Applicant before: Univ Erasmus Medical Ct |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: SOLVAY PHARM BV TO: ABBOTT BIOLOGY CO., LTD. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1125674 Country of ref document: HK |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130703 Termination date: 20161222 |