JP2011188859A - インフルエンザウイルス作製のための多重プラスミド系 - Google Patents

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Abstract

【課題】組換えインフルエンザワクチンとして好適なインフルエンザウイルスを細胞培養において作製するためのベクターおよび方法を提供する。
【解決手段】多重プラスミドインフルエンザウイルス発現系において使用するための2方向性発現ベクター。さらに、発育鶏卵および／または細胞（例えばVero細胞および／もしくはMDCK）において増強された複製能力を有するインフルエンザウイルスを作製するための方法、ならびにさらに増強された複製特性を有するインフルエンザウイルス。さらに、改善された回収方法を含み、この方法において動物細胞（SF Vero細胞など）に上記プラスミドおよびベクターをエレクトロポレーションする。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養におけるインフルエンザウイルス作製のための多重ベクター系、ならびに弱毒生インフルエンザワクチンを含むワクチン（鼻腔内投与に適したワクチン製剤など）に適した組換えインフルエンザウイルスおよびリアソータントインフルエンザウイルス（弱毒（att）、好冷（ca）および／または温度感受性（ts）インフルエンザウイルスなど）の作製方法に関する。
インフルエンザウイルスは、分節されている１本鎖RNAゲノムを含む内側のリボ核タンパク質コアとマトリックスタンパク質によって裏打ちされている外側のリポタンパク質エンベロープとからなる。A型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスの各々は、８つのセグメントに分かれている負の極性を有する１本鎖RNAを含む。A型インフルエンザのゲノムは少なくとも１１個のポリペプチドをコードする。セグメント1〜3が、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼを構成する３個のポリペプチドをコードする。セグメント1はポリメラーゼ複合体タンパク質PB2をコードする。セグメント2およびセグメント3によって、残りのポリメラーゼタンパク質PB1およびPAがそれぞれコードされている。さらに、あるA型インフルエンザ株のセグメント1はPB1コード領域内のオルターナティブなリーディング・フレームから産生される小タンパク質であるPB1-F2をコードする。セグメント4は、感染時の細胞接着および侵入に関与する赤血球凝集素（HA）表面糖タンパク質をコードする。セグメント5はヌクレオカプシド核タンパク質（NP）ポリペプチドをコードする。これはウイルスRNAと結合する主要な構造構成要素である。セグメント6はノイラミニダーゼ（NA）エンベロープ糖タンパク質をコードする。セグメント7はM1およびM2と称される２つのマトリックスタンパク質をコードする。これらは異なるようにスプライシングされたmRNAから翻訳される。セグメント8は２つの非構造的タンパク質であるNS1およびNS2（NEP）をコードする。これらはオルターナティブにスプライシングされたmRNA変異体から翻訳される。
B型インフルエンザの８つのゲノムセグメントは11個のタンパク質をコードする。最も大きい３つの遺伝子は、RNAポリメラーゼであるPB1、PB2およびPAの構成要素をコードする。セグメント4はHAタンパク質をコードする。セグメント5はNPをコードする。セグメント6はNAタンパク質およびNBタンパク質をコードする。NBおよびNAの両タンパク質は、バイシストロン性mRNAの重複したリーディング・フレームより翻訳される。B型インフルエンザのセグメント7はまた、２つのタンパク質（M1およびBM2）をコードする。最も小さいセグメントは２つの産物をコードする：NS1は全長RNAから翻訳され、一方NS2はスプライシングされたmRNA変異体から翻訳される。
インフルエンザウイルスに特異的な防御免疫応答を生じることができるワクチンが５０年間以上作製されている。ワクチンは全ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、表面抗原ワクチンおよび弱毒生ウイルスワクチンとして特徴付けできる。これらワクチン型のいずれかの適切な製剤は全身性免疫応答を生じることが可能であるが、弱毒生ウイルスワクチンはまた、気道の局所的な粘膜性免疫を刺激することも可能である。
FluMistTMはインフルエンザ病から子供および大人を保護する弱毒生ワクチンである（Belsheら（1998） The efficacy of attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338：1405-12；Nicholら（1999） Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults：a randomized controlled trial JAMA 282：137-44）。FluMistTMワクチン株は一般的な主要ドナーウイルス（MDV）に由来する、６つの遺伝子セグメント（PB1、PB2、PA、NP、MおよびNS）と共に、現在広まっている野生型株に由来するHAおよびNA遺伝子セグメントを含む。FluMistのA型インフルエンザ株のMDV（MDV-A）は、連続して低温にてトリ腎臓組織の初代培養であるwt A／Ann Arbor／6／60（A／AA／6／60）を連続的に継代することよって作製された（Maassab（1967） Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213：612-4）。MDV-Aは25℃にて効率的に複製する（ca：好冷）が、しかしその増殖は38℃および39℃にて制限される（ts：温度感受性）。さらに、このウイルスは感染したフェレットの肺では複製しない（att：弱毒化）。ts表現型は気道の最も低温の領域を除く全ての領域においてウイルスの複製を抑えることにより、ヒトにおけるワクチンの弱毒化に関与していると考えられる。このts特性の安定性は動物モデルおよび臨床実験において示されている。化学的変異誘発により作製されたインフルエンザのts表現型に対して、MDV-Aのts特性は感染したハムスターを用いて継代した後にも、子供から単離したシェド中元に戻ることはなかった（最近の概要については、Murphy & Coelingh（2002） Principles underlying the development and use of attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol 15：295-323を参照のこと）。
20,000人にわたる大人および子供における、12の別個の6:2リアソータントを含む臨床実験は、これらのワクチンが弱毒化された、安全で、有効なものであることを示している（Belsheら（1998） The efficacy of attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338：1405-12；Boyceら（2000） Safety and immunogenicity ofadjuvanted and unadjuvanted subunit influenza virus vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19：217-26；Edwardsら（1994） A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J Infect Dis 169：68-76；Nicholら（1999） Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults：a randomized controlled trial JAMA 282：137-44）。MDV-Aの６つの内部遺伝子とwtウイルスの2つのHAおよびNA遺伝子セグメントを有するリアソータント（6：2リアソータント）は常に、ca、tsおよびatt表現型を維持する（Maassabら（1982） Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets J Infect Dis 146：780-900）。
今日まで、米国において商業的に入手できる全てのインフルエンザワクチンは発育鶏卵で増殖されている。インフルエンザウイルスは鶏卵で良好に増殖するが、ワクチンの製造は卵の利用性によって決まる。卵の供給を体系付け、次のインフルエンザの時期の数ヶ月前にはワクチン製造のために株を選択しなければならない。これはこの方法の柔軟性を制限し、しばしばワクチンの製造および供給における遅れや不足をもたらす。あいにく、2003〜04年に蔓延したプロトタイプA／Fujian／411／02株などのインフルエンザワクチン株は発育鶏卵において十分に複製せず、費用と時間がかかる方法で細胞培養より単離しなければならない。本発明さらに、発育鶏卵におけるワクチン株の複製能力を増加させる新しい技術を提供する。その上、本発明は効率的で、経済的なインフルエンザワクチンの製造を可能とする。
細胞培養にてインフルエンザウイルスを作製する系がまた近年において開発されている（例えば、Nicholsonら（eds）によるTextbook of Influenza におけるFurminger. Vaccine Production pp. 324-332；Cohen & Shafferman（eds）によるNovel Strategies in Design and Production of vaccines における、Mertenらによる（1996） Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, pp. 141-151を参照のこと）。典型的に、これらの方法は好適な不死化宿主細胞に選択したウイルス株を感染させる工程を含む。鶏卵でのワクチン製造に関する多くの困難を取り除いたにもかかわらず、全ての病原性インフルエンザ株が良好に増殖し、また確立された組織培養法に従って作製できるわけではない。さらに、弱毒化生ワクチンの製造に適した望ましい特徴（例えば、弱毒性、温度感受性および好冷性）を有する多くの株が、確立された方法を用いた組織培養において良好に増殖しなかった。
組換えDNAによるインフルエンザウイルスの作製は、インフルエンザワクチン製造のための組織培養法の適応性および有用性を顕著に増加させる。近年、ウイルスゲノムをコードしているcDNAを組み込んだ組換えプラスミドよりA型インフルエンザウイルスを産生するための系が報告された（例えば、Neumann ら（1999） Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 96：9345-9350；Fodorら（1999） Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol 73：9679-9682；Hoffmannら、（2000） A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97：6108-6113；WO 01／83794を参照のこと）。これらの系は、任意の選択した株に由来する免疫原性HAおよびNAタンパク質を発現する組換えウイルス、およびリアソータントウイルスを産生する可能性を示す。しかし、A型インフルエンザウイルスとは異なり、B型インフルエンザウイルスのためのプラスミドのみの系が記載された報告は公開されていない。
さらに、弱毒生ワクチンの製造に適した弱毒、温度感受性、好冷株の製造に好適である、現在利用可能なプラスミドだけの系はない。本発明は、もっぱらクローン化cDNAよりB型インフルエンザウイルスを作製するための8個のプラスミド系、およびワクチン製剤（鼻腔内投与に有用である生ウイルス製剤など）に好適である弱毒生A型インフルエンザウイルスおよび弱毒生B型インフルエンザウイルス製造のための方法、ならびに本願明細書より明らかとなる複数の他の利点を提供する。
WO 01／83794
Belsheら（1998） The efficacy of attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children, N Engl J Med, 338：1405-12 Nicholら（1999） Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults：a randomized controlled trial, JAMA, 282：137-44 Maassab（1967） Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C, Nature, 213：612-4 Murphy & Coelingh（2002） Principles underlying the development and use of attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines, Viral Immunol, 15：295-323 Boyceら（2000） Safety and immunogenicity ofadjuvanted and unadjuvanted subunit influenza virus vaccines administered intranasally to healthy adults, Vaccine, 19：217-26 Edwardsら（1994） A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease, J Infect Dis, 169：68-76 Maassabら（1982） Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets, J Infect Dis, 146：780-900 Nicholsonら（eds）によるTextbook of InfluenzaにおけるFurminger. Vaccine Production pp. 324-332 Cohen & Shafferman（eds）によるNovel Strategies in Design and Production of vaccinesにおける、Mertenらによる（1996） Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, pp. 141-151 Neumann ら（1999） Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 96：9345-9350 Fodorら（1999） Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol 73：9679-9682 Hoffmannら、（2000） A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids, Proc Natl Acad Sci USA, 97：6108-6113
本発明は、細胞培養におけるインフルエンザウイルス作製のための多重ベクター系、ならびに弱毒生インフルエンザワクチンを含むワクチン（鼻腔内投与に適したワクチン製剤など）に適した組換えインフルエンザウイルスおよびリアソータントインフルエンザウイルス（弱毒（att）、好冷（ca）および／または温度感受性（ts）インフルエンザウイルスなど）の作製方法に関する。
pAD3000プラスミド（配列番号90）の実例。 感染細胞の顕微鏡写真。 プラスミドのトランスフェクションによるrMDV-Aおよび6：2 H1N1リアソータントウイルスの遺伝子型解析。 B型インフルエンザウイルス作製のための８つのプラスミド系の実例。 AおよびBはRT-PCRによる組換えMDV-Bウイルスの特徴づけ。 CおよびDはRT-PCRによる組換えB／Yamanashi／166／98の特徴づけ。 GeneBank形式におけるpAD3000の配列。 GeneBank形式におけるpAD3000の配列。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 MDV-Bと８つのプラスミド（それぞれ配列番号91-98）を用いた配列アライメント。 B型インフルエンザ株のHAおよびNAセグメントの同時増幅より得たRT-PCR産物。 組換えウイルスおよびリアソータントウイルスの相対的なタイターを示す棒グラフ。 ウイルスの複製を許容するおよび抑制する温度（温度感受性）におけるリアソータントウイルスの相対的なタイターを示す棒グラフ。 温度感受性に関する特定のts突然変異を組み込んだ（ノックイン）リアソータントウイルスのグラフ図（左パネル）ならびにウイルスの複製を許容するおよび抑制する温度（温度感受性）における相対的なタイターのグラフ図（右パネル）。 ミニゲノムアッセイにおける突然変異の測定。（A）HEp-2細胞をPB1、PB2、PA、NPおよびpFlu-CATを用いてトランスフェクションし、33℃または39℃にて18時間インキュベートし、そして細胞抽出物をCATレポーター遺伝子の発現について分析した。（B）プライマー伸長アッセイによるCAT mRNA発現。 PA、NP、およびM1タンパク質の野生型残基を用いた三重遺伝子組み換えの模式的な実例。 単一遺伝子および二重遺伝子組換えウイルスの増殖についての作表。 非ts表現型に対応する核タンパク質のアミノ酸残基の作表。 組換えPR8変異体の模式図。PB1および／またはPB2遺伝子に導入された突然変異を黒点で示す。 33℃および39℃における相対的なタイターを示す棒グラフ。 種々の温度におけるPR8変異体のプラーク形態を示す顕微鏡写真。MDCK細胞を表示されるウイルスに感染させ、33℃、37℃および39℃にて3日間インキュベートした。ウイルスプラークを免疫染色によって視覚化し、撮影した。 ウイルスの複製を許容する温度および許容しない温度におけるタンパク質合成。MDCK細胞を表示されるウイルスに感染させ、33℃または39℃にて一晩インキュベートする。放射標識したポリペプチドをSDS-PAGEで電気泳動し、オートラジオグラフした。ウイルスタンパク質であるHA、NP、M1およびNSを示す。 MDCK細胞における複製と相関的なPer.C6細胞におけるMDV-AおよびMDV-Bの差異的な複製を示す線グラフ。 Per.C6細胞におけるMDV-A単一遺伝子リアソータントの差異的な複製を示す線グラフ。 リアソータントウイルスの差異的な複製を示す棒グラフ。グレイの囲み部分は野生型アミノ酸残基を示す。点線は2.0 log10であるシャットオフ温度（ts）を示す。 A／Panama／99（H3N2）とA／Fujian／411／02様（H3N2）との抗原性の比較。 A／Panama／99（H3N2）とA／Fujian／411／02様（H3N2）との抗原性の比較。 A／Panama／99からA／Fujian／02様への抗原ドリフトについての分子基盤を示す。 A／Panama／99からA／Fujian／02様への抗原ドリフトについての分子基盤を示す。 A／Panama／99からA／Fujian／02様への抗原ドリフトについての分子基盤を示す。 A／Panama／99からA／Fujian／02様への抗原ドリフトについての分子基盤を示す。 A／Panama／99からA／Fujian／02様への抗原ドリフトについての分子基盤を示す。 発育鶏卵におけるウイルス増殖を増加させるための株における細部の改変。 発育鶏卵におけるウイルス増殖を増加させるための株における細部の改変。 発育鶏卵におけるウイルス増殖を増加させるための株における細部の改変。 発育鶏卵におけるウイルス増殖を増加させるための株における細部の改変。 発育鶏卵におけるウイルス増殖を増加させるための株における細部の改変。 発育鶏卵におけるウイルス増殖を増加させるための株における細部の改変。 発育鶏卵におけるウイルス増殖を増加させるための株における細部の改変。 組換えウイルスのHA受容体結合親和性。6：2 A／Fujian、A／Sendai、A／Wyoming、ならびにV186およびI226またはL183およびA226の変化を伴うA／Fujian変異体を4℃または33℃にて30分間、1.0の感染効率でMDCK細胞に吸着させ、この感染細胞を３回洗浄する（+）か、または未処理のまま（−）放置した。33℃にて6時間のインキュベーションの後、この細胞を免疫蛍光染色により処理した。各イメージに示された感染細胞の割合（平均値±標準偏差）は６つのイメージの平均であった。 MDCK細胞における組換えウイルスの増殖速度。MDCK細胞を33℃または4℃のいずれかにて30分間、1.0の感染効率で感染させ、PBSを用いて3回洗浄した。感染細胞を33℃にてインキュベートし、示した時間間隔にて培養上清を回収し、そしてプラークアッセイによってウイルス量を測定した。 H3N2サブタイプのHAおよびNAにおける受容体結合部位。シアル酸（SIA）結合部位に関連して、HA受容体結合親和性を増加させ、またNA酵素活性を減少させることを示した残基を示す。HA単量体を、5HMGを用いて形作り、NA単量体をWebLab ViewerLite 3.10（Accelrys, San Diego, CA）を用いて2BATに基づいて形作った。
第１の態様において、本発明は細胞培養において、例えばヘルパーウイルスの非存在下（すなわち、ヘルパーウイルスの存在しない細胞培養系）において、組換えB型インフルエンザウイルスを作製するためのベクターおよび方法を提供する。本発明方法は、B型インフルエンザウイルスの一部をそれぞれ含む複数のベクターをウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団へ導入する工程を含む。ウイルスの増殖を許容する条件下にて宿主細胞を培養し、そしてインフルエンザウイルスを回収する。いくつかの実施形態において、B型インフルエンザウイルスは弱毒ウイルス、好冷ウイルスおよび／または温度感受性ウイルスである。例えば１つの実施形態において、本発明のベクターに由来する組換えB型インフルエンザウイルスは弱毒、好冷、温度感受性ウイルスであり、例えば鼻腔内ワクチン製剤中の弱毒生ワクチンとして投与することに適している。典型的な実施形態において、インフルエンザB／Ann Arbor／1／66 ウイルスのゲノム（ca B／Ann Arbor／1／66ウイルスのゲノムなど）の全てまたは一部を含む複数のベクターを導入することによって、ウイルスを作製する。
例えば、いくつかの実施形態において、B型インフルエンザウイルスは、インフルエンザ株 ca B／Ann Arbor／1／66に特徴的な生物学的特性に影響を及ぼす１つ以上のアミノ酸置換を含む人工的に操作したインフルエンザウイルスである。このようなインフルエンザウイルスはPB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34（PB1391（K391E）、PB1581（E581G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G））の１つ以上の位置でアミノ酸置換を生じる突然変異を含む。野生型ウイルスと比べて増加した温度感受性、好冷性または弱毒性を個々に、または組合せにおいて生じる任意の突然変異（上記位置の１つ以上の位置における）が、本発明との関連において好適な突然変異である。
いくつかの実施形態において、異なるインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする１つ以上のゲノムセグメントと共に１つのB型インフルエンザ株の少なくとも６つの内部ゲノムセグメントを含む複数のベクターを宿主細胞の集団に導入する。例えば、選択した弱毒、好冷および／もしくは温度感受性B型インフルエンザ株（B／Ann Arbor／1／66のca、att、ts株など）または上に挙げた１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む人工的に操作したB型インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントを、別のウイルス株に由来する免疫原性抗原をコードする１つ以上のセグメントと共に宿主細胞の集団に導入する。典型的に免疫原性表面抗原は、赤血球凝集素（HA） 抗原および／またはノイラミニダーゼ（NA）抗原のいずれか、または両方を含む。実施形態において免疫原性表面抗原をコードする単一のセグメントが導入される場合、選択したウイルスの７つの相補的なセグメントもまた宿主細胞に導入される。
特定の実施形態において、B型インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを含む複数のプラスミドベクターを宿主細胞の集団に導入する。例えば、それぞれ異なるゲノムセグメントを含む８つのプラスミドは、完全なB型インフルエンザゲノムを宿主細胞に導入することに有用である。あるいは、ゲノムの一部の小さな配列を含む多数のプラスミドを用いることができる。
典型的に、本発明のプラスミドベクターは２方向性発現ベクターである。本発明の２方向性発現ベクターは典型的に、第１プロモータと第２プロモータとを含む。この第１および第２プロモータは、インフルエンザウイルスゲノムのセグメントを含むウイルス核酸をコードする同一の２本鎖cDNAのそれぞれの鎖に機能的に結合している。必要に応じて、この２方向性発現ベクターは、ポリアデニル化シグナルおよび／または終結配列を含む。例えば、ポリアデニル化シグナルおよび／または終結配列は２つのプロモータの内側に、インフルエンザウイルスゲノムのセグメントに隣接して配置することができる。本発明との関連において、１つの好ましいポリアデニル化シグナルはSV40ポリアデニル化シグナルである。本発明の典型的なプラスミドベクターは、図１に例証されているプラスミドpAD3000である。
ベクターのプロモータからのインフルエンザウイルスの複製を支持できる宿主細胞にベクターを導入する。宿主細胞の好ましい例としては、Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞（293T細胞など）およびCOS細胞が挙げられる。本明細書中に記載されるpAD3000プラスミドベクターとの組合せにおいては、Vero細胞、293細胞、およびCOS細胞が特に好ましい。いくつかの実施形態において、これら細胞系統の少なくとも２つの混合物（COS細胞とMDCK細胞との組合せまたは293T細胞とMDCK細胞との組合せ）からなる共培養物が宿主細胞の集団を構成する。
次に、B型インフルエンザベクターを含む宿主細胞を、ウイルスの複製および組み立てを可能とする条件下にて培養によって増殖させる。典型的に、本発明のB型インフルエンザプラスミドを含む宿主細胞を37℃よりも低い温度で、好ましくは、35℃以下の温度にて培養する。典型的に、この細胞を32℃〜35℃の温度にて培養する。いくつかの実施形態において、この細胞を約32℃〜34℃（例えば約33℃）の温度にて培養する。好適な期間培養を行い、ウイルスが複製して高いタイターを得ることができた後、組換えおよび／またはリアソータントウイルスを回収する。必要に応じて、この回収したウイルスを不活性化しうる。
本発明はまた、細胞培養にて組換えインフルエンザウイルスを作製するための幅広く適用可能である方法を提供する。この方法は、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団にインフルエンザウイルスのゲノムを含む複数のベクターを導入し、35℃以下の温度でこの細胞を培養して、そしてインフルエンザウイルスを回収する。
特定の実施形態において、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを含む複数のプラスミドベクターを宿主細胞の集団に導入する。特定の実施形態において、宿主細胞に完全なインフルエンザゲノムを導入するために、それぞれ異なるゲノムセグメントを含む8つのプラスミドを利用する。典型的に、本発明のプラスミドベクターは２方向性発現ベクターである。本発明の典型的なプラスミドベクターはプラスミドpAD3000（図1に例証）である。
いくつかの実施形態において、インフルエンザウイルスはB型インフルエンザウイルスに相当する。いくつかの実施形態において、インフルエンザウイルスはA型インフルエンザウイルスに相当する。特定の実施形態において、本方法は組換えおよび／またはリアソータントインフルエンザウイルスを回収する工程を含む。このウイルスは被験体に投与（鼻腔内投与など）した際に免疫応答を誘導することが可能である。いくつかの実施形態において、このウイルスは投与する前に不活性化され、他の実施形態においては、弱毒生ウイルスを投与する。本発明方法により作製される組換えおよびリアソータントA型インフルエンザおよびB型インフルエンザウイルスもまた本発明の特徴である。
特定の実施形態において、ウイルスとしては、弱毒インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、またはこれらの望ましい特性のいずれかの組み合わせを有するウイルスが挙げられる。１つの実施形態において、インフルエンザウイルスはインフルエンザB／Ann Arbor／1／66株ウイルス（B／Ann Arbor／1／66の好冷性、温度感受性、弱毒性株など）を含む。別の実施形態において、インフルエンザウイルスはインフルエンザA／Ann Arbor／6／60株ウイルス（A／Ann Arbor／6／60の好冷、温度感受性、弱毒株など）を含む。本発明の別の実施形態において、ウイルスは１つ以上の置換アミノ酸を含む人工的に操作したインフルエンザウイルスである。この置換アミノ酸は例えば、ca A／Ann Arbor／6／60またはca B／Ann Arbor／1／66に特徴的な生物学的特性に影響を及ぼす。このような置換アミノ酸はca A／Ann Arbor／6／60またはca B／Ann Arbor／1／66に特有のアミノ酸（例えば、A株ウイルスにおける：PB1391（K391E）、PB1581（E581G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G）；ならびにB株ウイルスにおける：PB2630（S630R）；PA431（V431M）；PA497（Y497H）；NP55（T55A）；NP114（V114A）；NP410（P410H）；NP509（A509T）；M1159（H159Q）およびM1183（M183V））に好ましくは相当する。同様に、温度感受性、好冷性および／または弱毒性を生じる、上記いずれかの位置とは別のアミノ酸置換も本発明のウイルスおよび方法に含む。
必要に応じて、ベクターを導入することによってリアソータントウイルスを作製する。このベクターはワクチン製造に関するその好ましい特性により選択したウイルス株の６つの内部遺伝子と、選択した病原性株などの表面抗原（HAおよびNA）をコードするゲノムセグメントとを組み合わせて含む。例えば、このHAセグメントは、日常的にワクチン製造において行われているように、病原性を有するH1、H3またはB株より好ましくは選択する。同様に、HAセグメントをH2株（H2N2など）、H5株（H5N1など）またはH7株（H7N7など）のような出現病原性株から選択できる。あるいは、第１株の７つの相補的な遺伝子セグメントをHAまたはNAのいずれかをコードするセグメントと組み合わせて導入する。特定の実施形態において、内部遺伝子セグメントはインフルエンザB／Ann Arbor／1／66またはA／Ann Arbor／6／60株に由来する。
さらに、本発明はワクチン製造に関して望ましい特性を有する新規のインフルエンザウイルス（温度感受性、弱毒性、および／または好冷性インフルエンザウイルスなど）、ならびにこのような新規のインフルエンザウイルスを含有するインフルエンザワクチンを製造するための方法を提供する。特定の実施形態において、新規A型インフルエンザウイルス株を、温度感受性表現型に重要である本明細書中に示した１つ以上の特定の位置（例えば、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34）においてアミノ酸置換を生じる突然変異を導入することによって作製する。例えば、特定のアミノ酸位置でアミノ酸置換を生じるヌクレオチド位置PB11195、PB11766、PB12005、PB2821およびNP146、または他のヌクレオチド位置に突然変異を導入する。野生型ウイルスと比較して増加した温度感受性、好冷性または弱毒性を個々に、または組合せにおいて生じる、上記位置の１つ以上の位置における任意の突然変異が本発明との関連において好適な突然変異である。例えば、PB1391（K391E）、PB1581（E581G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G）の中から選択した突然変異を野生型A型インフルエンザ株のゲノム（例えばPR8）に好適に導入し、弱毒生ワクチンのような投与に好適な温度感受性変異体を作製する。望ましい表現型の安定性を増加させるために、典型的に複数の突然変異を導入する。インフルエンザゲノムに選択した突然変異を導入した後、この突然変異したインフルエンザゲノムをウイルスが産生される条件下にて複製する。例えば、この突然変異したインフルエンザウイルスのゲノムを鶏卵中にて複製できる。あるいは、インフルエンザウイルスのゲノムを細胞培養中にて複製できる。細胞培養中にて複製する場合、必要に応じてウイルスを鶏卵中にてさらに増幅させ、タイターを増加させる。本発明方法により作製された温度感受性ウイルス、ならびに必要に応じて、弱毒および／または好冷ウイルスもまた、このようなウイルスを含むワクチンと同じく、本発明の特徴である。同様に、位置PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34に１つ以上の突然変異を含む（例えばPB1391（K391E）、PB1581（E5
81G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G）の中から選択される突然変異を含む）新規組換えウイルスの核酸ならびに、このようなアミノ酸置換を有するポリペプチドは本発明の特徴である。
同様に、本明細書中に提示されている方法は、B型インフルエンザゲノムに１つ以上の特定の突然変異を導入して、温度感受性ならびに、必要に応じて弱毒および／または好冷表現型を有する新規B型インフルエンザ株を作製するように適合されている。例えば、PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP509；M1159およびM1183の中から選択された位置でアミノ酸置換を生じる１つ以上の突然変異をB型インフルエンザ株ゲノムに導入して温度感受性B型インフルエンザウイルスを作製する。典型的なアミノ酸置換としては以下：PB2630（S630R）；PA431（V431M）；PA497（Y497H）；NP55（T55A）；NP114（V114A）；NP410（P410H）；NP509（A509T）；M1159（H159Q）およびM1183（M183V）が挙げられる。上に示したようなウイルスを含むワクチンならびに上記のような突然変異およびアミノ酸置換を含む核酸およびポリペプチドは全て、本発明の特徴である。
従って、本発明の突然変異を含むインフルエンザウイルスは、それらの製造方法にかかわらず、本発明の特徴である。すなわち本発明は、本発明の突然変異を含むインフルエンザ株（例えば、野生型に対してPB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択された１以上の位置にアミノ酸置換を有する任意のA型インフルエンザウイルスまたは野生型に対してPB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP509；M1159およびM1183の中から選択される１以上の位置にアミノ酸置換を有する任意のB型インフルエンザウイルス）を含むが、ただし、ca A／Ann Arbor／6／60株およびB／Ann Arbor／1／66株は本発明の特徴とは考えない。特定の好ましい実施形態において、A型インフルエンザウイルスはPB1391（K391E）、PB1581（E581G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G）の中から選択される複数の突然変異を、B型インフルエンザウイルスはPB2630（S630R）；PA431（V431M）；PA497（Y497H）；NP55（T55A）；NP114（V114A）；NP410（P410H）；NP509（A509T）；M1159（H159Q）およびM1183（M183V）の中から選択される複数の突然変異を、それぞれ含む。
１つの実施形態において、インフルエンザウイルスのゲノムを含む複数のプラスミドベクターを宿主細胞に導入する。例えば、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを少なくとも8つのプラスミドベクターに含むことができる。１つの好ましい実施形態において、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを8つのプラスミドに含むことができる。例えば、8つプラスミドそれぞれが、インフルエンザウイルスの異なるゲノムセグメントを適宜含むことができる。
本発明のベクターは２方向性発現ベクターでありうる。本発明の２方向性発現ベクターは典型的に、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを含む同一の２本鎖ウイルス核酸のそれぞれの鎖に機能的に結合している第１プロモータと第２プロモータとを含む。必要に応じて、この２方向性発現ベクターはポリアデニル化シグナルおよび／または終結配列を含む。例えば、ポリアデニル化シグナルおよび／または終結配列を２つのプロモータの内側にあるインフルエンザウイルスのゲノムのセグメントに隣接して配置することができる。本発明との関連において１つの好ましいポリアデニル化シグナルはSV40ポリアデニル化シグナルである。本発明の典型的なプラスミドベクターはプラスミドpAD3000である（図１に例証）。
本発明との関連において、ベクターのプロモータによるインフルエンザウイルスの複製を支持できる任意の宿主細胞が好適である。宿主細胞の好ましい例としては、Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞（293T細胞など）およびCOS細胞が挙げられる。本明細書中に記載されるpAD3000プラスミドベクターとの組合せにおいては、Vero細胞、293細胞、COS細胞が特に好適である。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの上記細胞系統の混合物（COS細胞とMDCK細胞との組合せまたは293T細胞とMDCK細胞との組合せ）である共培養物が宿主細胞集団を構成する。
本発明の特徴は、本発明のプラスミドを含む宿主細胞を37℃よりも低い温度で、好ましくは35℃以下の温度で培養することである。典型的に、細胞を32℃〜35℃の温度にて培養する。いくつかの実施形態において、細胞を約32℃〜34℃（例えば約33℃）の温度にて培養する。
本発明の別の態様は、組換えまたはリアソータントA型インフルエンザまたはB型インフルエンザウイルス（すなわちA型インフルエンザおよび／またはB型インフルエンザウイルスの野生型または変異株）を培養中のVero細胞より回収するための新規方法に関する。インフルエンザウイルスのゲノムを含む複数のベクターをVero細胞の集団にエレクトロポレーションによって導入する。この細胞をウイルスの複製が可能である条件下にて増殖させる。例えば好冷、弱毒、温度感受性ウイルス株の場合には、Vero細胞を37℃よりも低い温度、好ましくは35℃以下の温度にて増殖させる。典型的に、この細胞を32℃〜35℃の温度にて培養する。いくつかの実施形態において、この細胞を約32℃〜34℃（例えば約33℃）の温度にて培養する。必要に応じて（例えばワクチン製造のために）、Vero細胞を動物由来の産生物のない無血清培地中で増殖させる。
上記の本発明方法において、インフルエンザゲノムプラスミドを含む宿主細胞を培養した後にウイルスを回収する。いくつかの実施形態において、回収したウイルスは組換えウイルスである。いくつかの実施形態において、このウイルスは１つ以上のウイルスの親株に由来する遺伝的関与を有するリアソータントインフルエンザウイルスである。必要に応じて、回収した組換えまたはリアソータントウイルスをさらに培養細胞における継代によってまたは鶏卵中にて増幅させる。
必要に応じて、回収したウイルスを不活性化する。いくつかの実施形態において、回収したウイルスはインフルエンザワクチンを構成する。例えば、回収したインフルエンザワクチンは、選択したA型インフルエンザ株またはB型インフルエンザ株に由来するHAおよび／またはNA抗原を有するリアソータントインフルエンザウイルス（例えば6：2または7：1リアソータントウイルス）でありうる。特定の好ましい実施形態において、リアソータントインフルエンザウイルスは弱毒表現型を有する。必要に応じて、リアソータントウイルスは好冷および／または温度感受性であり、例えば表１７に記載される置換から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する弱毒、好冷または温度感受性B型インフルエンザウイルスである。このようなインフルエンザウイルスは例えば、選択された病原性インフルエンザ株などに特異的な免疫応答の予防的産生のための弱毒生ワクチンとして有用である。本発明方法により作製されたインフルエンザウイルス（弱毒リアソータントウイルスなど）は本発明の特徴である。
別の態様において、本発明は組換えインフルエンザウイルスワクチンを作製するための方法に関する。この方法はインフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団にインフルエンザウイルスのゲノムを含む複数のベクターを導入する工程、この宿主細胞を35℃以下の温度にて培養する工程、そして被験体に投与した際に免疫応答を誘発することができるインフルエンザウイルスを回収する工程を含む。本発明のワクチンはA型インフルエンザウイルス株またはB型インフルエンザウイルス株のいずれかでありうる。いくつかの実施形態において、インフルエンザワクチンウイルスとしては弱毒インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルス、または温度感受性インフルエンザウイルスが挙げられる。特定の実施形態において、ウイルスは上記の望ましい特性の組合せを有する。１つの実施形態において、インフルエンザウイルスはインフルエンザA／Ann Arbor／6／60株ウイルス含む。別の実施形態において、インフルエンザウイルスはインフルエンザB／Ann Arbor／1／66株ウイルスを含む。あるいは、ワクチンは人工的に操作したA型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含む。これらのウイルスは、ca A／Ann Arbor／6／60株またはca／B／Ann Arbor／1／66株に特有のアミノ酸のように、これらの株の特徴的な生物学的特性に影響を及ぼす少なくとも１つの置換アミノ酸を含む。例えば、本発明に含まれるワクチンとしては、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択された位置にアミノ酸置換を生じる少なくとも１つの突然変異を含む人工的に操作した組換えおよびリアソータントA型インフルエンザウイルス、ならびにPB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、M1159およびM1183の中から選択された位置にアミノ酸置換を生じる少なくとも１つの突然変異を含む人工的に操作した組換えおよびリアソータントB型インフルエンザウイルスが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、１種以上のインフルエンザウイルス株に由来するウイルスゲノムセグメントを有するリアソータントインフルエンザウイルス（例えば6：2または7：1リアソータント）を含む。例えばリアソータントインフルエンザウイルスワクチンとは好ましくは、ワクチン製造に関する望ましい特性について選択したウイルス株の内部ゲノムセグメントと組み合わせて、A型インフルエンザまたはB型インフルエンザより選択した株に由来するHAおよび／またはNA表面抗原を含む。多くの場合、HAおよび／またはNAをコードするセグメントの由来となるインフルエンザ株は、病原性株（上記のものなど）の局所的または世界的な流行予測に基づいて選択することが望ましい。いくつかの場合、この内部ゲノムセグメントに関与するウイルス株は、例えば望ましい表現型を生じる１つ以上のアミノ酸置換を有するA／Ann Arbor／6／60、B／Ann Arbor／1／66、または人工的に操作したインフルエンザ株の弱毒、好冷および／または温度感受性インフルエンザ株である。それは例えば、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択される位置にアミノ酸置換を生じる少なくとも１つの突然変異を含むA型インフルエンザウイルスならびにPB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、M1159およびM1183の中から選択される位置にアミノ酸置換を生じる少なくとも１つの突然変異を含むB型インフルエンザウイルスである。例えば、好ましいリアソータントウイルスとしては、PB1391（K391E）、PB1581（E581G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G）の中から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作したA型インフルエンザウイルス；ならびにPB2630（S630R）；PA431（V431M）；PA497（Y497H）；NP55（T55A）；NP114（V114A）；NP410（P410H）；NP509（A509T）；M1159（H159Q）およびM1183（M183V）の中から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作したB型インフルエンザウイルスが挙げられる。
必要な場合には、インフルエンザワクチンウイルスを回収の際に不活性化する。
本発明方法により製造される、弱毒生ワクチンを含むインフルエンザウイルスワクチンもまた本発明の特徴である。特定の好ましい実施形態において、インフルエンザウイルスワクチンはリアソータントウイルスワクチンである。
本発明の別の態様では、２方向性発現ベクターのプラスミドを提供する。本発明の２方向性発現ベクターは、第２プロモータとポリアデニル化部位（SV40ポリアデニル化部位など）の間に挿入された第１プロモータを含む。１つの実施形態において、第１プロモータと第２プロモータは少なくとも１つのクローニング部位に、反対向きに隣接して配置することができる。本発明の典型的なベクターはプラスミドpAD3000（図１に例証）である。
いくつかの実施形態において、インフルエンザウイルスのゲノムの少なくとも１つのセグメントは、例えば２本鎖核酸としてクローニング部位に挿入されている。例えば、本発明のベクターは第２プロモータとSV40ポリアデニル化部位との間に挿入されている第１プロモータを有するプラスミドを含む。この第１プロモータと第２プロモータはインフルエンザウイルスの少なくとも１つのセグメントに、反対向きに隣接して配置されている。
本発明の１つ以上の発現ベクターを含むキットもまた本発明の特徴である。典型的に、キットはまた１つ以上の：インフルエンザウイルスの複製を支持することができる細胞系統、緩衝液、培養培地、取扱説明書、包装材料、および容器を含む。いくつかの実施形態において、キットはそれぞれが少なくとも１つのインフルエンザウイルスのゲノムセグメントを含む複数の発現ベクターを含む。例えば、ワクチンの製造または投与に関する望ましい特性について選択されるウイルス株の１つの内部ゲノムセグメントをそれぞれ含む複数の発現ベクターを含むキットは本発明の特徴である。例えば、選択したウイルス株は弱毒、好冷および／または温度感受性株でありうる。それは例えば、A／Ann Arbor／6／60もしくはB／Ann Arbor／1／66、または所望される特性を有するオルターナティブな株（本明細書中（例えば表17）に記載されるような１つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作した株など）でありうる。１つの実施形態において、キットは変異HA抗原および／または変異NA抗原をコードする核酸ライブラリーの一部を組み込んだ発現ベクターを含む。
インフルエンザウイルスのゲノムを組み込んだ複数のベクターを含む少なくとも１つの細胞を含む、35℃以下の温度にて生産的に増殖する細胞培養物もまた本発明の特徴である。この組成物は細胞培養培地も含みうる。いくつかの実施形態において、複数のベクターは例えば第２プロモータとSV40ポリアデニル化部位との間に挿入されている第１プロモータを含んでなる２方向性発現ベクターを含む。例えば、第１プロモータおよび第２プロモータを、インフルエンザウイルスの少なくとも１つのセグメントに、反対向きに隣接して配置することができる。本発明の細胞培養物を35℃以下（約32℃〜35℃など、典型的に、約32℃〜約34℃、例えば、約33℃）の温度に維持する。
本発明はまた細胞培養系を含む。この細胞培養系は上記のようなインフルエンザウイルスのゲノムを組み込んだ複数のベクターを含む少なくとも１つの細胞からなる生産的に増殖する細胞培養物、および35℃以下の温度にこの培養を維持するためのレギュレータを含む。例えば、このレギュレータは好ましくは約32℃〜35℃、典型的に約32℃〜約34℃（例えば約33℃）の温度に細胞培養を維持する。
本発明の別の特徴は温度感受性、好冷性および／または弱毒性に影響を及ぼす１つ以上のアミノ酸置換を含む人工的に操作した組換えインフルエンザウイルスまたはリアソータントインフルエンザウイルスである。例えば、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作したA型インフルエンザウイルスならびにPB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、M1159およびM1183の中から選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作したB型インフルエンザウイルスが本発明の好ましい実施形態である。典型的な実施形態としては：PB1391（K391E）、PB1581（E581G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G）のいずれか１つ以上のアミノ酸置換を有するA型インフルエンザウイルス；ならびに：PB2630（S630R）；PA431（V431M）；PA497（Y497H）；NP55（T55A）；NP114（V114A）；NP410（P410H）；NP509（A509T）；M1159（H159Q）およびM1183（M183V）のいずれか１つ以上のアミノ酸置換を有するB型インフルエンザウイルスが挙げられる。特定の実施形態において、ウイルスは上に示した位置に、例えば１、２、３、４、５、６、７、８または９つのアミノ酸置換を有するような複数の突然変異を含む。従って、上に示した５つの全ての位置（例えばPB1391（K391E）、PB1581（E581G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G））にアミノ酸置換を有する人工的に操作したA型インフルエンザウイルスならびに、上記の８つまたは９つ全ての位置（例えばPB2630（S630R）；PA431（V431M）；PA497（Y497H）；NP55（T55A）；NP114（V114A）；NP410（P410H）；NP509（A509T）；M1159（H159Q）およびM1183（M183V））にアミノ酸置換を有する人工的に操作したB型インフルエンザウイルスを、本発明に含む。さらに、ウイルスは上に列挙していない１つ以上のさらなるアミノ酸置換を含みうる。
特定の実施形態において、人工的に操作したインフルエンザウイルスは温度感受性インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルスおよび／または弱毒インフルエンザウイルスである。例えば、本発明による温度感受性インフルエンザウイルスは典型的に、39℃における増殖において野生型インフルエンザウイルスと比べて約2.0〜5.0 log10減少を示す。例えば、温度感受性ウイルスは好ましくは、39℃における増殖において野生型インフルエンザウイルスのそれと比べて少なくとも約2.0 log10、少なくとも約3.0 log10、少なくとも約4.0 log10、または少なくとも約4.5 log10減少を示す。温度感受性インフルエンザウイルスは33℃にて力強い増殖特性を保持することは、典型的であるが必ずしも必要ではない。典型的に、本発明の弱毒インフルエンザウイルスはフェレットを用いた弱毒性アッセイにおける増殖について、野生型インフルエンザウイルスと比べて約2.0〜5.0 log10減少を示す。例えば、本発明の弱毒インフルエンザウイルスはフェレットを用いた弱毒性アッセイにおける増殖について、野生型インフルエンザウイルスと比べて少なくとも約2.0 log10、しばしば約3.0 log10、好ましくは少なくとも約4.0 log10減少を示す。
本発明はまた細胞および発育鶏卵におけるインフルエンザウイルスの複製に影響を及ぼすHAおよびNAのアミノ酸残基の同定および操作にも関する。さらに本発明は発育鶏卵および／または細胞における改善された複製を有するHAおよびNAインフルエンザウイルスワクチン変異体を作製するための逆遺伝子技術の使用に関する。さらに本発明はHA受容体結合活性および／またはNAノイラミニダーゼ活性を改変するための方法に関する。さらに、本発明は発育鶏卵および／または細胞において増強された複製能力を有するインフルエンザウイルスを提供する。
１つの実施形態において、本発明は発育鶏卵および／または細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を増加させるためにHAおよび／またはNAのアミノ酸残基を操作するための方法を提供する。この方法はHAおよび／またはNAにアミノ酸残基の置換を導入することを含み、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団にインフルエンザウイルスのゲノムを組み込んだ複数のベクターを導入し、この細胞を培養して、そしてインフルエンザウイルスを回収することによって、細胞培養においてインフルエンザウイルスを作製する方法を用いる。好ましくは、回収したインフルエンザウイルスは発育鶏卵および／または細胞において増加した複製能力を有する。別の実施形態において、本発明は、改変されていないインフルエンザウイルス株と比べた場合、発育鶏卵において増加した複製能力を有するインフルエンザウイルス変異体（本明細書中では「複製能が増強されたインフルエンザ変異体」として言及される）を提供する。
本発明はさらに、改善された回収方法を含む。この方法においてエレクトロポレーションした（例えば本発明のポリヌクレオチド（プラスミドおよびベクターなど）を用いてエレクトロポレーションした）動物（SF VERO）細胞を、トリ胚腎臓（CEK）細胞、トリ胚繊維芽細胞、トリ腎臓プライマリー細胞、および発育鶏卵の漿尿膜より単離した細胞を含むがこれらに限定されない群から選択される別の細胞と共培養する。この回収方法に有用である他の細胞としては、インフルエンザウイルスの複製を支持し、規制認可についての許容基準を満たす任意の細胞が挙げられる。細胞の供給源としては、例えばSPFトリ群に由来するものが挙げられる。本明細書中の実施例９および１０を参照のこと。
本発明の１つの好ましい実施形態において、ウイルスの回収効率は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、または少なくとも5倍ほど改善される。
本発明の別の好ましい実施形態において、ウイルスの回収効率は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも99％である。効率は例えば、回収されるウイルスを注射した卵数（X）とその後HAタイターを検出することができた卵数（Y）を計測し、YをXで割り算することによって測定できる。
実施例9および10のような上記の方法は 、本明細書中または米国特許出願第09／396,539号、同上第09／844,517号、PCT／US0113656、PCT／US00／09021、US03012728；米国特許第6,649,372号；WO 03／091401、US200201677など（これらは本明細書中に参考として援用される）に記載されるポリヌクレオチド（例えばプラスミドおよびベクター）をエレクトロポレーションするために用いることができる。
本発明の好ましい実施形態はインフルエンザウイルスの回収方法である。この方法において動物細胞（Vero細胞など）にインフルエンザRNAポリメラーゼと核タンパク質をコードするプラスミドをエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションした動物細胞を別の細胞型と共培養する。
本発明の好ましい実施形態はインフルエンザウイルス（A型インフルエンザウイルス、好冷ウイルス、弱毒ウイルスなど）の回収方法である。この方法において動物細胞（Vero細胞など）にインフルエンザRNAポリメラーゼと核タンパク質をコードするプラスミドをエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションされるプラスミドの数は例えば、８または１２個でありうる。
本発明の好ましい実施形態はインフルエンザウイルス（A型インフルエンザウイルス、好冷ウイルス、弱毒ウイルスなど）の回収方法である。この方法において動物細胞（Vero細胞など）にインフルエンザRNAポリメラーゼと核タンパク質をコードするプラスミドをエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションした動物細胞を別の細胞型（CEK細胞など）と共培養する。エレクトロポレーションされるプラスミドの数は例えば、８または１２個でありうる。
本発明の別の好ましい実施形態はインフルエンザウイルスの回収方法である。この方法において、（a）動物細胞に、この細胞内にてゲノムまたはアンチゲノムvRNAセグメント、および核タンパク質、およびRNA依存性ポリメラーゼを発現する細胞発現ベクターをエレクトロポレーションして、そしてリボ核タンパク質複合体を形成することができ、ウイルス粒子を（ヘルパーウイルスを用いてまたは用いることなく）組み立てることができる；そして（b）ウイルス粒子がパッケージされ、回収される上記細胞を培養する。
本発明の別の好ましい実施形態はインフルエンザウイルスの回収方法である。この方法において動物細胞に、例えばインフルエンザウイルスのゲノムセグメントに相当するウイルスcDNAを含む発現プラスミド（米国特許出願第09／396,539号、同上第09／844,517号、PCT／US0113656、PCT／US00／ 09021、US03012728；米国特許第6,649,372号；WO 03／091401、US200201677（これらは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）をエレクトロポレーションする。この方法において、cDNAをRNAポリメラーゼ I（polI）プロモータと的確な3’末端を有するvRNAまたはcRNAの合成調節エレメントとの間に挿入し、同様にRNAポリメラーゼ II（polII）プロモータとポリアデニル化シグナルとの間に挿入する。このcDNAはインフルエンザウイルスタンパク質のみをコードしている。
本発明の他の実施形態は、本明細書中に記載される方法（実施例9および10など）によって製造されるインフルエンザウイルスならびにこのウイルスを含んでなるワクチンを含む。
本発明の他の好ましい実施形態は、クローン化ウイルスcDNAより感染性インフルエンザウイルスを産生する組成物を含む。この組成物はそれぞれのプラスミドが1つのウイルスゲノムセグメントを含んで成る1組のプラスミドをエレクトロポレーションしたSF Vero細胞を含む。このゲノムセグメントに相当するウイルスcDNAは、RNAポリメラーゼ I（polI）プロモータと的確な3’末端を有するvRNAまたはcRNAの合成調節エレメントとの間に挿入されており、ウイルスmRNAおよび対応するウイルスタンパク質の発現を生じ、フルセットのvRNAまたはcRNAおよびウイルスタンパク質の発現によって、感染性インフルエンザウイルスの組み立てを生じる。
詳細な説明
多くの病原性インフルエンザウイルス株は組織培養において、不十分に増殖するだけで、弱毒生ウイルスワクチンの製造に好適な株（温度感受性、好冷および／または弱毒インフルエンザウイルスなど）は、商業的生産にかなうほど培養細胞中にて首尾よく増殖しなかった。本発明は、標準的な細胞培養条件下での増殖に適合していないインフルエンザウイルス株の増殖および回収を可能とする多重プラスミドトランスフェクション系を提供する。インフルエンザワクチンの開発および製造におけるさらなる課題は１種以上の循環インフルエンザ株が発育鶏卵では十分に複製することができないことである。本発明はHAおよびNAタンパク質の活性に影響を及ぼす複数のアミノ酸残基を発見し、そのような活性を調節できる特定のアミノ酸置換をつきとめた。本発明はHA受容体結合活性および／またはNA ノイラミニダーゼ活性の調節によって、卵および／または宿主細胞（Vero細胞もしくはMDCK細胞など）におけるインフルエンザの複製を高めることができることを開示する。特に本発明は卵および／または細胞におけるウイルスの複製を高めることができるHAおよび／またはNAにおけるアミノ酸置換の組み合わせを開示し、これらのアミノ酸置換が組換えインフルエンザウイルスの抗原性に重大な影響を与えないことを示す。従って、本発明はインフルエンザウイルスワクチンの製造を改善するための逆遺伝子技術の使用を提供する。
第1の態様において、本発明方法は、細胞培養中にて、もっぱらクローン化ウイルスDNAより組換えB型インフルエンザウイルスを作製するためのベクターおよび方法を提供する。別の態様において、本発明方法は、ワクチン製造に関して望ましい特性（弱毒病原性または弱毒表現型、好冷性、温度感受性など）を有するウイルス株（A株およびB株インフルエンザウイルスの両方）の in vitroにおける培養細胞での増殖を支持する組織培養条件の開発に一部基づく。宿主細胞にクローン化ウイルスゲノムセグメントを組み込んだ複数のベクターを導入し、この細胞を35℃を超えない温度で培養することによって、インフルエンザウイルスを製造する。インフルエンザウイルスのゲノムを含むベクターをトランスフェクトした場合、ワクチンとして好適な組換えウイルスを標準的な精製方法によって回収できる。本発明のベクター系および方法を用いて、ワクチン製造に関する望ましい特性によって選択された株の６つの内部遺伝子セグメント、および選択された病原性株などに由来する免疫原性HAおよびNAセグメントを含むリアソータントウイルスを組織培養において迅速かつ効率的に製造することができる。従って、本明細書中に記載される系および方法は、細胞培養における組換えおよびリアソータントA型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスの迅速な製造に有用である。これらのウイルスは、鼻腔内投与に好適なワクチンなどの弱毒生ワクチンを含むワクチンとして用いるのに好適なウイルスを含む。
典型的に、単一の主要ドナーウイルス（MDV）株をAサブタイプおよびB サブタイプのそれぞれから選択する。弱毒生ワクチンの場合、主要ドナーウイルス株を典型的に、ワクチン製造に関してその好ましい特性（温度感受性、好冷性および／または弱毒性など）によって選択する。例えば、典型的な主要ドナー株としてはA／Ann Arbor／6／60およびB／Ann Arbor／1／66それぞれの、温度感受性株、弱毒株および好冷株などが挙げられる。本発明は、上記ウイルス株のca、tsおよびattの表現型を生じる根本的な突然変異を解明し、組換えおよびリアソータントワクチンの製造に関連して、ドナー株として用いることに好適なインフルエンザの新規株を作製するための方法を提供する。
例えば、選択した主要ドナーA型ウイルス（MDV-A）、または主要ドナーB型ウイルス（MDV-B）を、ウイルスゲノムからなる複数のクローン化ウイルスcDNAより作製する。典型的な実施形態において、組換えウイルスを８つのクローン化ウイルスcDNAより作製する。PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、MおよびNSから成る選択したMDV-AまたはMDV-B配列のいずれかを表す８つのウイルスcDNAをプラスミド（例えばPAD3000）のような２方向性発現ベクターにクローン化し、そしてウイルスゲノムRNAが１つの鎖のRNAポリメラーゼ I（pol I）プロモータより転写され得、そしてウイルスmRNAが他方の鎖のRNAポリメラーゼ II（pol II）プロモータから合成できる。必要に応じて、いずれかの遺伝子セグメントが、例えば多塩基性切断部位（multi-basic cleavage site）を取り除くために、改変され、HAセグメントを含みうる。
次に、適切な宿主細胞（例えばVero細胞、共培養されたMDCK／293細胞またはMDCK／COS細胞）に８つのウイルスcDNAを有するプラスミドをトランスフェクションした後に、感染性組換えMDV-AウイルスまたはMDV-Bウイルスを回収する。本明細書中に記載されるプラスミドおよび方法を用いた場合、本発明は例えば、選択したウイルス（例えばMDV-A、MDV-B）の6つの内部遺伝子（PB1、PB2、PA、NP、MおよびNS）を（A型またはB型に）対応する別の型のインフルエンザウイルスに由来するHAおよびNAと一緒にコトランスフェクションすることによって、6：2リアソータントインフルエンザワクチンを製造することに有用である。例えば、HAセグメントを、ワクチン製造について日常的に行われているように、病原性に関連するH1、H3またはB株より適宜選択する。同様に、HAセグメントを病原性株（H2株（例えばH2N2）、H5株（例えばH5N1）またはH7株（例えばH7N7）など）のように関連性を示している株から選択できる。MDVの7つのゲノムセグメントと選択した株のHAまたはNA遺伝子のいずれかを組み込んだリアソータント（7：1リアソータント）もまた作製できる。さらに、この系はワクチン製造に関する表現型特性（弱毒 （att）、好冷 （ca）、および温度感受性（ts）表現型）の分子基盤を決定することに有用である。
別の態様において、本発明はHAおよび／またはNAのアミノ酸残基を操作して、発育鶏卵および／または細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を高めるための方法を提供する。例えば、本発明方法はHA受容体結合活性および／またはNAノイラミニダーゼ活性を調節して、卵および／または細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を高めるために用いることができる。さらに、本発明は発育鶏卵および／または細胞における増強された複製能力を有するインフルエンザウイルスを提供する。
定義
別途定義されない限り、全ての科学的および技術的用語は、当該分野において一般に用いられているのと同一の意味を有するものとして理解される。本発明の目的に関して、以下の用語を以下に定義する。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」という用語は、１本鎖または２本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体、それらのキメラもしくは類似体をいう。本明細書中で用いられた場合、この用語は必要に応じて、天然に生じるヌクレオチド類似体の重合体を含む。この重合体は、天然のヌクレオチドが天然に生じるヌクレオチドにある程度類似した１本鎖核酸（ペプチド核酸など）にハイブリダイズする際に重要な性質を有する。別途示されない限り、本発明の特定の核酸配列は相補的な配列、さらに、明示的に示される配列を含む。
「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連する任意の核酸をいうために広く用いられる。従って遺伝子とは、コード配列および／またはそれらの発現に必要とされる調節配列を含む。「遺伝子」という用語を特定のゲノム配列、およびそのゲノム配列によってコードされるcDNAまたはmRNAに適用する。
遺伝子はまた、例えば他のタンパク質の認識配列を形成する発現されない核酸セグメントを含む。発現されない調節配列としては「プロモータ」および「エンハンサー」が挙げられる。これらに対して転写因子のような調節タンパク質が結合し、隣接配列または近くの配列の転写を生じる。「組織特異的」プロモータまたはエンハンサーは特定の組織型または細胞型における転写を調節するものである。
「ベクター」という用語は、核が生物、細胞、または細胞構成要素間で増幅および／または移動することを可能とする手段をいう。ベクターとしてはプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、および人工染色体などが挙げられ、これらは自立的に複製するか、または宿主細胞の染色体に組み込むことができる。ベクターはまた、ネイキッド（naked）RNAポリヌクレオチド、ネイキッドDNAポリヌクレオチド、同一の鎖の中でDNAとRNAの両方からなるポリヌクレオチド、ポリリシン結合DNAまたはRNA、ペプチド結合DNAまたはRNA、リポソーム結合DNAなどでありうる。これらは自立的に複製しない。最も一般的には、本発明のベクターはプラスミドである。
「発現ベクター」とはプラスミドなどのベクターであり、組み込まれている核酸の発現および複製を促進することが可能である。典型的に、発現される核酸はプロモータおよび／またはエンハンサーに「機能的に結合」されており、プロモータおよび／またはエンハンサーによる転写調節制御の対象となる。
「２方向性発現ベクター」は典型的に、２つのオルタナティブなプロモータがこれらプロモータ間に配置されている核酸に関して反対向きに配置されており、その結果両方向に発現が開始され、例えばプラス（+）またはセンス鎖RNA、およびネガティブ（−）またはアンチセンス鎖RNAの転写を生じることが可能であることを特徴とする。あるいは、２方向性発現ベクターとは、ウイルスmRNAとウイルスゲノムRNA（例えばcRNA）を同一の鎖から発現する両方向性ベクターでありうる。
本発明との関連において、「単離された」物質という用語は、核酸またはタンパク質の天然に生じる環境下にて、それらと普通は共にあるかまたは相互作用する構成要素が実質的に存在しない核酸またはタンパク質などの生物学的物質をいう。必要に応じて、単離された物質とは、その天然の環境（例えば細胞）において、この物質と共に見出されない物質を含む。例えば、この物質がその天然の環境（細胞など）にある場合、この物質はその環境下で見出される物質が産生されない細胞内の位置（ゲノムまたは遺伝子エレメントなど）に配置されている。例えば、天然に生じる核酸（例えばコード配列、プロモータ、エンハンサーなど）は、その核酸が産生されないゲノムの位置（例えばベクター（プラスミドベクターもしくはウイルスベクターなど）または単位複製配列）に天然に生じない手段によって導入されている場合、単離された状態となる。このような核酸はまた「異種性」核酸として言及される。
「組換え体」という用語は物質（核酸またはタンパク質など）がヒトによる処理によって人工的にまたは合成的に（非天然に）変えられていることを示す。この変化を天然の環境または状態にある物質またはそれらから取り出した物質にて行いうる。特にウイルス（例えばインフルエンザウイルス）についていう場合、組換え核酸の発現によって産生される場合そのウイルスは組換え体である。
ウイルスについていう場合、「リアソータント」という用語は、１種以上の親ウイルス株または供給源に由来する遺伝子および／またはポリペプチド構成要素を含むウイルスを示す。例えば、7：1リアソータントは、第1の親ウイルスに由来する7つのウイルスゲノムセグメント（または遺伝子セグメント）と第2の親ウイルスに由来する単一の相補的なウイルスゲノムセグメント（例えば赤血球凝集素またはノイラミニダーゼをコードする）を含む。6：2リアソータントは6つのゲノムセグメント（最も一般的に第1の親ウイルスに由来する６つの内部遺伝子）と別の親ウイルスに由来する２つの相補的なセグメント（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼなど）を含む。
「導入」という用語は異種性または単離した核酸についていう場合、真核細胞または原核細胞への核酸の組み込みをいう。これら細胞においてこの核酸は細胞のゲノム（染色体、プラスミド、色素体もしくはミトコンドリアDNAなど）に組み込まれるか、自立的なレプリコンに変えられるか、または一過的に発現され得る（トランスフェクトmRNAなど）。この用語は「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」および「形質導入」などの方法を含む。本発明との関連において、原核細胞に核酸を導入するためにエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、脂質媒介トランスフェクション（リポフェクション）などを含む種々の方法を用いることができる。
「宿主細胞」という用語は、ベクターなどの異種性核酸を含み、その核酸の複製および／または発現、ならびに必要に応じてポリペプチドおよび／またはウイルスを含む１つ以上のコードされた生成物の産生を支持する細胞を意味する。宿主細胞はE. coliなどの原核細胞または酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、鳥類細胞またはヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞でありうる。本発明との関連において、典型的な宿主細胞としてはVero（アフリカミドリザル腎臓）細胞、Per.C6細胞（ヒト胎児網膜細胞）、BHK（乳呑みハムスター腎臓）細胞、トリ腎臓初代（PCK）細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞、Madin-Darbyウシ腎臓（MDBK）細胞、293細胞（例えば293T細胞）、およびCOS細胞（例えばCOS1細胞、COS7細胞）が挙げられる。宿主細胞という用語は例えば、様々な細胞型または細胞系統の混合培養物を含む細胞の組合せまたは混合物を含む。
「温度感受性」、「好冷」および「弱毒」という用語は当該分野において周知である。例えば、「温度感受性」（「ts」）という用語は、A型インフルエンザ株について、33℃と比べて39℃におけるタイターが100倍かまたはそれ以上の減少を示すウイルスを示し、B型インフルエンザウイルス株について、33℃と比べて37℃におけるタイターが100倍かまたはそれ以上の減少を示すウイルスを示す。例えば、「好冷」（「ca」）という用語は、25℃における増殖が33℃における増殖の100倍以内であるウイルスを示す。例えば、「弱毒」（「att」）という用語は、フェレットの上気道では複製するが、肺組織においては検出されず、動物にインフルエンザ様疾患を引き起こさないウイルスを示す。中間の表現型を有するウイルス、すなわちA株ウイルスについて39℃にて、またはB株ウイルスについて37℃にて100倍未満のタイター減少を示し、25℃における増殖が33℃における増殖の100倍以上（200倍、500倍、1000倍、10,000倍未満など）であり、ならびに／またはフェレットの上気道における増殖と比べて肺における減少した増殖（すなわち部分的弱毒）、および／もしくは動物における減少したインフルエンザ様疾患を示すウイルスであって、本明細書中に記載される1つ以上のアミノ酸置換を有するウイルスもまた、本発明に含まれる有用なウイルスであることがわかる。増殖は、タイター、プラークのサイズもしくは形態、粒子密度または当業者に公知である他の測定法によって示されるようなウイルスの量を示す。
「人工的に操作した」という語句は、組換え法（例えば部位特異的変異誘発、PCR変異誘発など）によって導入した少なくとも１つの突然変異を含むウイルス、ウイルス核酸またはウイルス性コード産物（例えばポリペプチド）、ワクチンを示すために本明細書中に用いられる。「人工的に操作した」という語句は１つ以上のヌクレオチド突然変異および／またはアミノ酸置換を含むウイルス（またはウイルス構成要素もしくは産生物）をいう場合、ウイルス（またはウイルス構成要素もしくは産生物）をコードするウイルスゲノムまたはゲノムセグメントが、天然に生じたか、非組換え方法（25℃における進行的継代など）によって作製された研究室の既存のウイルス株（例えば野生型または好冷性A／Ann Arbor／6／60またはB／Ann Arbor／1／66株）のような天然源に由来しないことを示す。
インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルスのゲノムは8つのセグメントからなる線状（−）鎖リボ核酸（RNA）からなり、これらは免疫原性赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）タンパク質および６つの内部核ポリペプチド：ヌクレオカプシド核タンパク質（NP）；マトリックスタンパク質（M）；非構造タンパク質（NS）；3つの RNAポリメラーゼ（PA、PB1、PB2） タンパク質をコードする。複製の間にゲノムウイルスRNAは宿主細胞の核内において（+）鎖メッセンジャーRNAおよび（−）鎖ゲノムcRNAに転写される。８つのゲノムセグメントの各々はリボ核タンパク質複合体にパッケージされる。このリボ核タンパク質複合体はRNAに加えて、NPおよびポリメラーゼ複合体（PB1、PB2、およびPA）を含む。
本発明において、８つのセグメント各々に相当するウイルスゲノムRNAをインフルエンザウイルスの操作および作製のために組換えベクターに挿入する。ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージ、および人工染色体を含む種々のベクターを本発明との関連において用いることができる。典型的に操作を容易にするために、ウイルスゲノムセグメントを、プラスミドベクターに挿入する。このプラスミドベクターは細菌細胞および真核細胞において機能する１つ以上の複製起点、および必要に応じて、プラスミド配列を含む細胞をスクリーニングまたは選択することに都合が良いマーカーを提供する。典型的なベクターであるプラスミドpAD3000を図１に例証する。
最も一般的には、本発明のプラスミドベクターは、いずれかの向きで挿入されているウイルスゲノムセグメントの転写を開始すること、すなわち（+）鎖および（−）鎖のウイルスRNA分子の両方をもたらすことができる２方向性発現ベクターである。２方向性の転写をもたらすために、各ウイルスゲノムセグメントを少なくとも２つの独立したプロモータを有するベクターに挿入し、その結果ウイルスゲノムRNAのコピーが第1のRNAポリメラーゼプロモータ（例えばPol I）によって一方の鎖より転写され、ウイルスmRNAが第2のRNAポリメラーゼプロモータ（例えばPol II）より合成される。従って２つのプロモータを、ウイルスゲノムRNAセグメントの挿入に好適な少なくとも１つのクローニング部位（すなわち、制限酵素認識配列）好ましくは特有のクローニング部位に隣接して反対向きに配置する。あるいは、（+）鎖mRNAおよび（−）鎖ウイルスRNA（cRNAのような）をベクターの同一鎖から転写する場合、「両方向性」ベクターを用いることができる。
発現ベクター
発現されるべきインフルエンザウイルスのゲノムセグメントを、mRNA合成を導くために適切な転写制御配列（プロモータ）に機能的に結合する。種々のプロモータは、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントの転写を調節するために発現ベクターに用いることに適している。特定の実施形態において、例えばベクターがプラスミドpAD3000である場合、サイトメガロウイルス（CMV）DNA依存性RNAポリメラーゼII（Pol II）プロモータを利用する。必要な場合には、例えば条件発現を調節するために、特定の条件下、または特定の組織もしくは細胞においてRNA転写を引き起こす他のプロモータを代わりに用いることができる。多数のウイルスおよび哺乳動物（ヒトなど）のプロモータが利用可能であるか、または意図される特定の用途により単離することができる。例えば、動物およびヒトのウイルスのゲノムから得た代替的なプロモータとしては、アデノウイルス（アデノウイルス2型など）、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルスおよびサルウイルス40（SV40）などのプロモータ、ならびに種々のレトロウイルスのプロモータが挙げられる。哺乳動物のプロモータとしては、アクチンプロモータ、免疫グロブリンプロモータ、熱ショックプロモータなどが挙げられる。さらに、バクテリオファージプロモータを同種のRNAポリメラーゼと共に用いることができる（例えばT7プロモータ）。
必要に応じて、エンハンサー配列を含めることによって転写を増加できる。典型的にエンハンサーは、転写を増加させるためにプロモータと共に作用する短い（例えば10〜500 bp）シス-アクチンg DNAエレメントである。多くのエンハンサー配列は、哺乳動物遺伝子（ヘモグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）、ならびに真核細胞のウイルスから単離された。エンハンサーを異種性コード配列の5’側または3’側位置にてベクターに結合させることができるが典型的には、プロモータの5’側部位に挿入する。典型的に、プロモータおよび、必要な場合にはさらなる転写増強配列を、異種性DNAが導入される宿主細胞型における発現を最適化するために選択する（Scharfら（1994） Heat stress promoters and transcription Results Probl Cell Differ 20：125-62；Krieglerら（1990） Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185：512-27）。必要に応じて、単位複製配列にはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位または内部リボソーム侵入部位（IRES）も含むことができる。
本発明のベクターはまた、転写の終結およびmRNAを安定化させるために必要な配列（ポリアデニル化部位または終結配列など）を適宜含む。このような配列は一般に、真核生物DNAもしくはウイルスDNAの5’側、しばしば3’側の非翻訳領域またはcDNAより得ることができる。例えばプラスミドpAD3000を含む1つの実施形態において、SV40ポリアデニル化配列はポリアデニル化シグナルを提供する。
さらに、上記のような発現ベクターは、形質転換した宿主細胞を選択するための表現型の形質を与えるために１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を必要に応じて含み、先に挙げた遺伝子に加えて、ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性などのマーカーが真核細胞培養における選択に好適である。
上記のような適切なDNA配列、および適切なプロモータ配列または制御配列を含むベクターを、タンパク質の発現を可能とする宿主細胞を形質転換するために用いることができる。本発明のベクターは細菌細胞にて複製され得るが、最も頻繁には発現のために、哺乳動物細胞（Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞など）にベクターを導入することが望ましい。
さらなる発現エレメント
最も一般的には、インフルエンザウイルスタンパク質をコードするゲノムセグメントは、機能的ウイルスタンパク質への翻訳を含む、その発現に必要ななんらかのさらなる配列を含む。別の状況において、ミニ遺伝子またはウイルスタンパク質（HAもしくはNAタンパク質など）をコードする他の人工構築物を用いることができる。この場合においては、異種性コード配列の効率的な翻訳を補助する特定の開始シグナルを含むことがしばしば望ましい。これらのシグナルは、例えばATG開始コドンおよび隣接配列を含むことができる。全挿入物の翻訳を確実にするために、開始コドンをウイルスタンパク質に関して正しいリーディング・フレーム内に挿入する。外来性転写エレメントおよび開始コドンは、天然と合成の両方のさまざまな起源のものでありうる。発現の効率は用いる細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって増強することができる。
必要な場合には、シグナル配列、分泌配列または局在化配列などのさらなる発現エレメントをコードするポリヌクレオチド配列を、所望される細胞区画、膜もしくは細胞小器官でのポリペプチドの発現を目的として、ベクター、通常は目的のポリヌクレオチド配列を含むインフレームに含むか、または細胞培養培地に含むことができる。このような配列は当業者に公知であり、分泌リーダーペプチド、細胞小器官標的配列（核局在化配列、ER保留シグナル、ミトコンドリア移行配列など）、膜局在化／アンカー配列（例えばストップトランスファー配列、GPIアンカー配列）などを含む。
インフルエンザウイルスワクチン
歴史的に、インフルエンザウイルスワクチンは発育鶏卵において、関連株についての経験的予測に基づいて選択したウイルス株を用いて作製していた。ごく近年、認可された弱毒温度感受性主株との関連において、選択された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原を含むリアソータントウイルスが作製された。鶏卵において継代を重ねたウイルス培養の後、インフルエンザウイルスを回収し、そして必要に応じて、ホルムアルデヒドおよび／またはβ−プロピオラクトンなどを用いて不活性化する。しかし、この方法によるインフルエンザワクチンの製造は多くの重大な欠点を有する。鶏卵から残存する汚染物質は高い抗原性、発熱性のものであり、しばしば投与の際に重大な副作用を生じる。さらに重大なことには、製造用に用意される株は、インフルエンザワクチンの製造および不活性化のための時間を得るために、典型的に次のインフルエンザ時期の数ヶ月前には選択および供給しなければならない。組換えおよびリアソータントワクチンを細胞培養にて製造する試みは、ワクチン製造用に認可された何れの株も標準的な細胞培養条件下にて効率的に増殖することができないことによって妨げられていた。
本発明は、培養にて組換えおよびリアソータントウイルスを作製するためのベクター系および方法を提供する。これらは選択した1つ以上のウイルスの抗原性株に対応するワクチンを迅速に製造することが可能である。特に、細胞培養において多重プラスミド系よりウイルスの効率的な産生を生じる、条件および株が提供される。必要に応じて、所望される場合には、ウイルスを鶏卵にてさらに増幅することが可能である。
例えば、標準的な細胞培養条件下（例えば37℃）では、B型インフルエンザ主要株 B／Ann Arbor／1／66を増殖することは不可能であった。本発明方法においては、インフルエンザウイルスのゲノムのセグメントをそれぞれ含む多数のプラスミドを好適な細胞に導入し、35℃以下の温度にて培養中に維持する。典型的に、培養物を約32℃〜35℃、好ましくは約32℃〜約34℃（例えば約33℃）にて維持する。
典型的に、培養物を、制御された湿度およびCO2の下、温度レギュレータ（温度が35℃を超えないことを保証するサーモスタットなど）を用いた一定の温度にて、細胞培養インキュベーターのような系内に維持する。
リアソータントインフルエンザウイルスを、目的の株（目的の抗原性変異体など）に由来する相補的なセグメントと組み合わせて主要インフルエンザウイルスのゲノムセグメントに対応するベクターのサブセットを導入することによって容易に得ることができる。典型的に、主要株はワクチン投与に関する望ましい特性に基づいて選択する。例えばワクチン製造に関して（弱毒生ワクチンの製造に関してなど）、主要ドナーウイルス株を弱毒表現型、好冷および／または温度感受性によって選択できる。この関連において、A型インフルエンザ株ca A／Ann Arbor／6／60；B型インフルエンザ株ca B／Ann Arbor／1／66；またはその望ましい表現型特性によって選択した別の株（弱毒性、好冷性、および／もしくは温度感受性株、例えば、実施例4に記載されるような人工的に操作したA型インフルエンザ株；あるいは表17に挙げられた１つ以上のアミノ酸置換を含む人工的に操作したB型インフルエンザ株が、主要ドナー株として適宜選択される。
1つの実施形態において、インフルエンザ主要ウイルス株の6つの内部遺伝子（すなわちPB1、PB2、PA、NP、NB、M1、BM2、NS1およびNS2）を含むプラスミドを、望ましい抗原性株（例えば、局所的または世界的に重大なインフルエンザ感染を引き起こすことが予測される株）の赤血球凝集素およびノイラミニダーゼセグメントと組み合わせて好適な宿主細胞にトランスフェクトする。効率的な回収に適した温度（例えば、35℃以下、約32℃〜35℃、例えば約32℃〜約34℃、または約33℃）における細胞培養中にてリアソータントウイルスを複製した後、リアソータントウイルスを回収する。必要に応じて、回収したウイルスをホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンのような変性剤を用いて不活性化できる。
弱毒、温度感受性および好冷インフルエンザウイルスワクチン
1つの態様において、本発明はウイルスの好ましい主要ドナー株におけるts表現型の基礎をなす突然変異の決定に基づく。MDV株ゲノムにおける単一のヌクレオチド変化の機能的重要性を決定するために、A／AA／6／60系統内の非常に関連のある株に由来するリアソータントウイルスを温度感受性について調べた。2つの親株の同質遺伝子的性質によって、ts表現型における単一のヌクレオチド変化を評価することができる。従って、PB1、PB2およびNP内の特定のアミノ酸残基にヌクレオチドレベルでMDV-Aのts表現型に関する遺伝子基盤が与えられる。
ca A／AA／6／60のts表現型の遺伝子基盤を調べるこれまでの試みは、古典的な同時感染／リアソータント技術を利用して、A／AA／6／60と無関係のwt株との間の単一および多重遺伝リアソータントを作製した。これらの研究はPB2とPB1の両方がts表現型に関与することを示唆した（Kendalら（1978） Biochemical characteristics of recombinant viruses derived at sub-optimal temperatures：evidence that ts lesions are present in RNA segments 1 and 3, and that RNA 1 codes for the virion transcriptase enzyme, p. 734-743. In B. W. J. Mahy, and R.D. Barry （ed.） Negative Strand Viruses, Academic Press；Kendalら（1977） Comparative studies of wild-type and cold mutant （temperature） influenza viruses：genealogy of the matrix（M） and the non-structural （NS） proteins in recombinant cold-adapted H3N2 viruses J Gen Virol 37：145-159；Kendalら（1979） Comparative studies of wild-type and cold-mutant （temperature sensittive） influenza viruses：independent segregation of temperature-sensitivity of virus replication from temperature -sensitivity of virion transcriptase activity during recombination of mutant A／Ann Arbor／6／60 with wild-type H3N2 strains J Gen Virol 44：443-4560；Snyderら（1988） Four viral genes independently contribute to attenuation of live infkuenza A／Ann Arbor／6／60（H2N2） cold-adapted reassortant virus vaccines J Virol 62：488-95）。しかし、これらの研究の解釈はコンステレーション効果により妨げられた。このコンステレーション効果は多岐にわたるA型インフルエンザ株の2つに由来する遺伝子セグメントを混合することによって生じた。A／AA／6／60とA／AA／6／60バックグラウンドのts表現型の発現に関与するもの以外のwt遺伝子セグメントとの間の変化により弱められた相互作用が生じた。M遺伝子セグメントとatt表現型との関連を解釈することを妨げるコンステレーション効果示された（Subbaraoら（1992） The attenuation phenotype conferred by the M gene of the influenza A／Ann Arbor／6／60 cold-adapted virus （H2N2） on the A／Korea／82（H3N2） reassortant virus results from a gene constellation effect Virus Res 25：37-50）。
本発明において、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の位置でアミノ酸置換を生じる突然変異が、MDV-A株ウイルスに温度感受性表現型を与えることに機能的に重要であるとして同定された。当業者に理解されるように、ヌクレオチドのPB11195、PB11766、PB12005、PB2821およびNP146位置における突然変異は、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34におけるアミノ酸置換をそれぞれ示す。従って、これらの位置で置換アミノ酸を生じる任意のヌクレオチド置換が本発明の特徴である。典型的な突然変異であるPB1391（K391E）、PB1581（E581G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G）は単独で、より好ましくは組合せにおいて、温度感受性表現型を生じる。これらの突然変異の野生型への復帰突然変異が同時に起こることによってts表現型が消失するが、これらの突然変異を野生型バックグラウンドに導入することによってts表現型を有するウイルスを生じる。ウイルスの継代の間これら表現型の安定性は一貫しており、単一の変化では、得られたウイルスの温度感受性プロフィールを野生型の温度感受性プロフィールに戻すことはできない。むしろ、これらの変化はts表現型を完全に発現するために相互に協力して作用するようである。この発見によって、弱毒生インフルエンザワクチン製造用の主要ドナーウイルスに好適な温度感受性A型インフルエンザウイルスのさらなる株の作製を可能とする。
同様に、主要ドナーウイルスB株における個々のアミノ酸置換は、表17に例証するようにts表現型に関連する。従って、B型インフルエンザゲノムの１つ以上の特定の突然変異を導入することによって、温度感受性、必要に応じて弱毒および／または好冷表現型を有する新規B型インフルエンザ株を作製するために本明細書中に示される方法を適合する。例えば、PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP509；M1159およびM1183の中から選択される位置にアミノ酸置換を生じる１つ以上の突然変異を、温度感受性B型インフルエンザウイルスを作製するためにB型インフルエンザ株のゲノムに導入する。典型的なアミノ酸置換としては、PB2630（S630R）；PA431（V431M）；PA497（Y497H）；NP55（T55A）；NP114（V114A）；NP410（P410H）；NP509（A509T）；M1159（H159Q）およびM1183（M183V）が挙げられる。
本発明の突然変異を含むインフルエンザウイルスは、それらの作製方法にかかわらず本発明の特徴である。すなわち、本発明は、本発明の突然変異を含むインフルエンザ株、例えば、野生型に関してPB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を有するA型インフルエンザウイルスまたは、PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP509；M1159およびM1183の中から選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を有するB型インフルエンザウイルスを含むが、ただしca A／Ann Arbor／6／60株およびB／Ann Arbor／1／66株は本発明の特徴とはみなさない。特定の好ましい実施形態においてそれぞれ、A型インフルエンザウイルスはPB1391（K391E）、PB1581（E581G）、PB1661（A661T）、PB2265（N265S）およびNP34（D34G）の中から選択される複数の突然変異（例えば、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の突然変異）を含み；そしてB型インフルエンザウイルスは、PB2630（S630R）；PA431（V431M）；PA497（Y497H）；NP55（T55A）；NP114（V114A）；NP410（P410H）；NP509（A509T）；M1159（H159Q）およびM1183（M183V）の中から選択される複数の突然変異を含む。例えば、ワクチン製造に関して所望される表現型を有するウイルスを提供することに加えて、一部の突然変異（例えば、選択された突然変異にうちの1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ）を有するウイルスは、ウイルスの表現型へのさらなる突然変異の関与を明らかにすることに有用である。特定の実施形態において、インフルエンザウイルスは少なくとも1つのさらなる非野生型ヌクレオチド（例えば、おそらくさらなるアミノ酸置換を生じるもの）を含み、このヌクレオチドが必要に応じて所望される表現型を減じたり、または別の所望される表現型特性を与える。
ウイルスの増強された複製
本発明はまた、発育鶏卵および／または宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を増加するために、HAおよび／またはNAに少なくとも1つのアミノ酸残基置換を導入する方法を提供する。本発明はさらに、HAおよび／またはNAが置換されていないインフルエンザウイルスと比べた場合、発育鶏卵および／または宿主細胞において増加された複製能力を有するインフルエンザウイルス変異体（本明細書中では「複製増強された変異体」という）を提供する。本発明方法を宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの複製を増強するために利用することができ、また複製増強された変異体が鶏卵および／または宿主細胞において増強された複製を有し得るということが特に意図される。インフルエンザウイルスの複製に好適な宿主細胞としては、例えばVero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞およびCOS細胞（293T細胞、COS7細胞を含む）が挙げられる。
1つの実施形態において、本発明方法はHAおよび／またはNAに少なくとも1つのアミノ酸置換を導入し、これによって、卵および／または宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を、改変していないインフルエンザウイルスと比べて、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、または少なくとも500％増強する。HAおよびNAの両方にてアミノ酸置換がなされる得ることが特に意図される。好ましくは本発明方法は、置換されていないウイルスと比べて、置換されたインフルエンザウイルスの抗原性を顕著に変化させない。特定の実施形態において、本発明方法は置換されていないウイルスと比べて、置換されたインフルエンザウイルスの抗原性を10％未満、20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、80％未満、90％未満、または100％未満減少させる。ウイルス抗原性を決定するための方法は当該分野において周知である（「実施例11」も参照のこと）。
1つの実施形態において、本発明方法は弱毒インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、またはこれらの望ましい特性のいずれかを組み合わせで有するウイルスをさらに含む。好ましくは、本発明方法により組み込まれるウイルスとしては、インフルエンザB／Ann Arbor／1／66株ウイルス、インフルエンザA／Ann Arbor／6／60株ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明方法は、ワクチン製造に関するその好ましい特性によって選択されたウイルス株の6つの内部遺伝子を、望ましく操作したHAおよびNA表面抗原をコードするゲノムセグメントと組み合わせて含むベクターを導入して、発育鶏卵および／または宿主細胞において増強された複製能力を有するインフルエンザウイルスを作製する（上記および「実施例11」を参照のこと）。別の実施形態において、本発明方法は非弱毒インフルエンザウイルスをさらに含む。
1つの実施形態において、本発明方法はHAの受容体結合活性を改変する少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。HAの受容体結合活性としては、細胞表面糖タンパク質または糖脂質上に存在するシアル酸残基（例えば、2,6-結合シリアル-ガラクトシル部分[Siaα（2,6）Gal]および2,3-結合シリアル-ガラクトシル部分[Siaα（2,3）Gal]）へのHAの結合が挙げられるが、これらに限定されない。HA結合をアッセイするための1つの方法は「実施例11」（下記）に示されており、他の方法は当該分野にて周知である。別の実施形態において、本発明方法は、[Siaα（2,6）Gal]部分および／または[Siaα（2,3）Gal]部分に対するHAの受容体結合特異性を改変するアミノ酸置換を導入する。好ましくは本方法は、[Siaα（2,3）Gal]部分に対するHAの結合を増強する。
1つの実施形態において、本発明方法はHAの受容体結合活性を増強する少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、または少なくとも200％増加させる。
別の実施形態において、本発明方法はHAの受容体結合活性を減少させる少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、または少なくとも200％減少させる。
好ましい実施形態において、本方法はHAの位置183、186および／または226に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、アミノ酸置換を位置183および226または位置186および226にて行う。最も好ましくは、位置183がロイシンであり、位置226がアラニンであるか、または位置186がバリンであり、位置226がイソロイシンであるようにアミノ酸置換を行う。
1つの実施形態において、本発明方法はNAのノイラミニダーゼ活性を改変する少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。NAのノイラミニダーゼ活性としては、α-ケトシド結合（ketosidically linked）N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）を含む基質の加水分解が挙げられるが、これに限定されない。ノイラミニダーゼ活性を測定する方法は当該分野にて周知である（下記「実施例11」をまた参照のこと）。
1つの実施形態において、本発明方法はNAのノイラミニダーゼ活性を増強する少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、または少なくとも200％増加させる。
別の実施形態において、本発明方法はNAのノイラミニダーゼ活性を減少させる少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、ノイラミニダーゼ活性を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、または少なくとも200％減少させる。
好ましい実施形態において、本方法はNAの位置119および／または136に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、位置119がグルタミン酸であり、位置136がグルタミンとなるように、アミノ酸置換を行う。
当業者は、時としてHAおよび／またはNAタンパク質が前記の１つ以上の位置に好ましいアミノ酸残基を既に有することがわかる。この状況において、置換を残りの非適合の位置にだけ導入する。
同類アミノ酸置換を、上記のHAの位置183、186および／または226ならびにNAの位置119および／または136におけるアミノ酸置換について行い得ることが特に意図される。
「同類アミノ酸置換」とは、機能的に同等のアミノ酸に置換するアミノ酸置換をいうことが当該分野において周知である。同類アミノ酸変化によって、得られるペプチドのアミノ酸配列にサイレンとな（表現型として無変化の）変化を生じる。例えば、良く似た極性を有する１つ以上のアミノ酸は機能的に同等に作用し、かつペプチドのアミノ酸配列にサイレントな変化を生じる。電荷中性であり、残基がより小さな残基に置き換わる置換はたとえ残基が別のグループのものであっても、「同類アミノ酸置換」と考えることができる（例えば、フェニルアラニンとより小さなイソロイシンとの置換）。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野において明らかにされている。同類アミノ酸置換のファミリーとしては、非極性のもの（Trp、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala、Proなど）、電荷は持たないが極性を有するもの（Gly、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys）、酸性／負電荷のもの（Asp、Gluなど）、塩基性／陽電荷のもの（Arg、Lys、Hisなど）、β分枝のもの（Thr、Val、Ile）、鎖の配向性に影響を及ぼす残基（Gly、Proなど）および芳香族（Trp、Tyr、Phe、Hisなど）が挙げられるが、これらに限定されない。「同類アミノ酸置換」という用語はまた、アミノ酸の類似体または変異体の使用をいう。どのようにして表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するのかについての手引きが、Bowieら「Deciphering the Message in Protein hairetu Sequens：Tolerance to Amino Acid Substitutions」（1990, Science 247：1306-10）に提供される。
1つの実施形態において、本発明は改変インフルエンザウイルスを提供し、このウイルスは本明細書中において「複製が増強されたインフルエンザ変異体」として言及され、HAおよび／またはNAに少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。このアミノ酸置換は改変していないインフルエンザウイルスと比べて、発育鶏卵および／または宿主細胞におけるウイルスの複製を増強する。好ましくは、改変していないインフルエンザウイルスと比べて、卵および／または宿主細胞における複製が増強されたインフルエンザ変異体の能力を、改変していないインフルエンザウイルスと比べて、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、または少なくとも500％増強した。
特定の実施形態において、複製が増強されたインフルエンザ変異体にはさらに、弱毒インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、またはこれらの望ましい特性を任意の組み合わせで有するウイルスを含む。好ましくは、複製が増強されたインフルエンザ変異体に含まれるウイルスとしては、インフルエンザB／Ann Arbor／1／66株ウイルス、インフルエンザA／Ann Arbor／6／60株ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。複製が増強されたインフルエンザ変異体を、ワクチン製造に関するその好ましい特性によって選択したウイルス株の6つの内部遺伝子と、望ましく置換されたHAおよびNA表面抗原をコードするゲノムセグメントとを組み合わせて含むベクターを導入することによって作製することが特に意図される（上記および「実施例11」を参照のこと）。
1つの実施形態において、複製が増強されたインフルエンザ変異体はHAに少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、これはHAの受容体結合活性を改変する（上記参照のこと）。好ましくは、本方法は[Siaα（2,3）Gal]部分に対するHAの結合を増強する。
特定の実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はHAの受容体結合活性を増強する少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、または少なくとも200％増加させる。卵増強インフルエンザ変異体は置換されていないインフルエンザウイルスと比べて、顕著に変化したウイルス抗原性を有さないことが特に意図される。特定の実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体は置換されていないウイルスと比べて、10％未満、20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、80％未満、90％未満、または100％未満減少した抗原性を有する。ウイルス抗原性を測定する方法は、当該分野において周知である（「実施例11」をまた参照のこと）。
別の実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はHAの受容体結合活性を減少させる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、または少なくとも200％減少させる。
好ましい実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はHAの位置183、186および／または226に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、アミノ酸置換は位置183および226または位置186および226に存在する。最も好ましくは、位置183がロイシンであり、位置226がアラニンであるか、または位置186がバリンであり、位置226がイソロイシンであるように、アミノ酸置換が存在する。
1つの実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はNAのノイラミニダーゼ活性を改変する少なくとも1つのアミノ酸置換を含む（上記参照のこと）。
1つの実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はNAのノイラミニダーゼ活性を増強する少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、または少なくとも200％増加させる。
別の実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はNAのノイラミニダーゼ活性を減少させる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、ノイラミニダーゼ活性を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、または少なくとも200％減少させる。
好ましい実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はNAの位置119および／または136に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、位置119がグルタミン酸であり、位置136がグルタミンであるようにアミノ酸置換を行う。
細胞培養
典型的に、ウイルス増殖は、一般に宿主細胞が培養される培地組成物中で成し遂げられる。インフルエンザウイルスの複製に好適な宿主細胞としては、Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞およびCOS細胞（293T細胞COS7細胞を含む）が挙げられる。一般に上記細胞系統の2つ（例えばMDCK細胞と293T細胞またはCOS細胞のいずれか）を例えば1：1の割合で含む共培養物を用いて、複製効率を改良する。典型的に、細胞を制御された湿度および中性に緩衝されたpH（例えばpH 7.0〜7.2）を維持するのに好適なCO2濃度の下、血清（例えば10％胎児ウシ血清）を添加した標準的な市販の培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地など）または、無血清培地中で培養する。必要に応じて、培地は細菌の増殖を防ぐための抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）および／またはさらなる栄養分（L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸など）、好ましい増殖特性を促進するためのさらなる栄養補給物（例えばトリプシン、β-メルカプトエタノール）などを含む。
培養にて哺乳動物細胞を維持するための方法は多数報告されており、当業者に公知である。一般的なプロトコルは例えば、Freshney（1983） Culture of Animal Cellss：Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, New York；PAul（1975） Cell and Tissue Culture, 第5版, Livingston, Edinburgh；Adams（1980） Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon（eds.） Elsevier, Amsterdamに提供される。in vitroにおけるインフルエンザウイルスの作製に特に関係のある組織培養方法に関するさらなる詳細としては、Mertenら（1996） Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation、CohenおよびShafferman（eds） Novel Strategies in Design and Production of Vaccines（その全体が本明細書中に援用される）が挙げられる。さらに、本発明に適合された上記方法などにおける変更は日常的な実験によって容易に決定できる。
インフルエンザウイルス作製のための細胞を血清含有培地または無血清培地中で培養できる。いくつかの場合において、例えば精製したウイルスを調製するために、宿主細胞を無血清条件にて増殖させることが望ましい。小規模（例えば25 ml未満の培地）の培養チューブもしくはフラスコ、または撹拌を伴う大きなフラスコ中で、回転ボトル中で、またはフラスコ、ボトルあるいは反応培地中のマイクロキャリアビーズ（DEAE-デキストランマイクロキャリアビーズ（Dormacellなど）, Pfeifer & Langen；スーパービーズ, Flow Laboratories；スチレン共重合体-トリ-メチルアミンビーズ（Hillex、SoloHill、Ann Arborなど））にて細胞を培養しうる。マイクロキャリアビーズは小さな球体（直径100〜200ミクロンの範囲）であり、接着性細胞増殖のために細胞培養の容積あたり大きな表面積を提供する。例えば1Lの培地は2000万個以上のマイクロキャリアビーズを含み、8000 cm2 より大きな増殖表面を提供できる。ウイルスの商業的作製のために（例えばワクチン製造のために）、バイオリアクターまたは発酵槽中にて細胞を培養することがしばしば望ましい。バイオリアクターは1L未満〜100Lを超える容積のものが利用できる（例えばCyto3バイオリアクター（Osmonics, Minnetonka, MN）；NBSバイオリアクター（New Brunswick Scientific, Edison, N.J.）；研究室および商業的規模のB. Braun Biotech Internationalのバイオリアクター（B. Braun Biotech, Melsungen, Germany））。
培養容積にかかわらず、本発明との関連において、本明細書中に記載される多重プラスミド系を用いた組換えおよび／またはリアソータントインフルエンザウイルスの効率的な回収を確実にするために、35℃以下の温度に培養物を維持することが重要である。例えば、細胞を約32℃〜35℃の温度、典型的に、約32℃〜約34℃、普通は約33℃の温度にて培養する。
典型的に、レギュレータ（例えばサーモスタット）または細胞培養系の温度を感知および維持するための他の装置を用いて、ウイルス複製の期間に温度が35℃を超えないことを確実にする。
宿主細胞へのベクターの導入
当該分野において周知である真核細胞に異種性核酸を導入するための方法（例えばリン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションおよびポリアミントランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションなど）により、宿主細胞にインフルエンザゲノムセグメントを含むベクターを導入（例えばトランスフェクト）する。例えば、ベクター（プラスミドなど）を製造者の指示に従ってポリアミントランスフェクション試薬 TransIT-LT1（Mirus）を用いて宿主細胞（COS細胞、293T細胞またはCOS細胞もしくは293T細胞とMDCK細胞との組合せ）にトランスフェクトすることができる。総量200 μl中において、160 μlの培地（好ましくは無血清培地）に希釈したおよそ2 μlのTransIT-LT1を用いて、宿主細胞の集団におよそ1 μg の各ベクターを導入する。DNA：トランスフェクション試薬混合物を室温にて45分間インキュベートし、その後、800 μlの培地を加える。トランスフェクション混合物を宿主細胞に加え、そしてこの細胞を上記のように培養する。このように、細胞培養における組換えまたはリアソータントウイルスの作製のために、8つのゲノムセグメント（PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HAおよびNA）をそれぞれ含むベクターをおよそ20 μlのTransIT-LT1と混合し、そして宿主細胞にトランスフェクトする。必要に応じて、血清含有培地をトランスフェクションの前に無血清培地（例えばOpti-MEM I）に代え、4〜6時間インキュベートする。
あるいは、エレクトロポレーションを用いて、インフルエンザゲノムセグメントを含むベクターを宿主細胞に導入することができる。例えば、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含むプラスミドベクターを、以下の手順によりエレクトロポレーションを用いてVero細胞に適宜導入する。簡潔にいえば、5×106個のVero細胞（例えば10％胎児ウシ血清（FBS）を添加した改変イーグル培地（MEM）中で増殖したもの）を0.4 mlのOptiMEMに再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに入れる。25 μlまでの容積中20 μgのDNAをキュベット中の細胞に加え、次にタッピングによって優しく混合する。エレクトロポレーションを製造者の支持に従って（例えば、BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plus connectedを用いて）、28〜33 m秒の時定数で300ボルト、950 マイクロファラッドにて行う。細胞を優しくタッピングして再び混合し、エレクトロポレーションからおよそ1〜2分後、0.7 mlの10％ FBS含有MEMを直接キュベットに加える。次に細胞を2 ml MEM、10％ FBSまたは無血清のOPTI-MEMを入れた標準的な6ウェル組織培養ディッシュの2ウェルに移す。残っている細胞を回収するためにキュベットを洗浄し、そして洗浄懸濁液を上記の2ウェルに分配する。最終容積はおよそ3.5 mlである。次に細胞をウイルスの増殖を許容する条件下にて（例えば好冷性株についてはおよそ33℃にて）インキュベートする。
ウイルスの回収
典型的にウイルスを、感染（トランスフェクト）細胞が増殖していた培養培地から回収する。典型的に、粗製培地をインフルエンザウイルスを濃縮する前に清澄させる。一般的方法としては、濾過、限外濾過、硫酸バリウムへの吸着および溶出、ならびに遠心分離が挙げられる。例えば、感染させた培養物の粗製培地を初めに、例えば1000〜2000×gにて、細胞の残骸および他の大きな粒子物質を除去するのに十分な時間（例えば10〜30分間）遠心分離することによって清澄させることができる。あるいは、培地を0.8 μm酢酸セルロースフィルターを通して濾過し、インタクトな細胞および他の大きな粒子物質を除去する。必要に応じて、次に清澄した培地上清を例えば15,000×gにておよそ3〜5時間遠心分離し、インフルエンザウイルスをペレットにする。適切な緩衝液（STE（0.01 M Tris-HCl；0.15 M NaCl；0.0001 M EDTA）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH 7.4）など）にウイルスペレットを再懸濁した後、ウイルスをスクロース（60％〜12％）または酒石酸カリウム（50％〜10％）の密度勾配遠心分離によって濃縮する。連続的または段階的勾配（例えば12％ずつ4段階からなる12％〜60％のスクロース勾配）のいずれかが好適である。回収のためにウイルスが目に見えるバンドに濃縮するのに十分なスピード、および時間で勾配を遠心分離する。あるいは、最大規模の商業的用途のために、ウイルスを連続的方法で操作するゾーン遠心分離ローターを用いて、密度勾配により溶出する。組織培養からインフルエンザウイルスを抽出することを当業者にすべて示すのに十分なさらなる詳細は、例えばNicholsonら（eds） Textbook of Influenza pp. 324-332におけるFurminger. Vaccine Production；Cohen & Shafferman（eds） Novel Strategies in Design and Production of Vaccine s pp. 141-151におけるMertenら（1996） Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparationおよび米国特許第5,690,937号に提供される。必要な場合には、回収したウイルスを安定剤であるスクロース-リン酸-グルタミン酸（SPG）の存在下において−80℃で保存できる。
ワクチンの予防的投与のための方法および組成物
本発明の組み換えおよびリアソータントウイルスを、１つ以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激するために適切なキャリアまたは賦形剤に入れて予防的に投与することができる。典型的に、キャリアまたは賦形剤は製薬上許容できるキャリアまたは賦形剤（滅菌水,水溶性生理食塩水、水溶性緩衝生理食塩水、水溶性ブドウ糖溶液、水溶性グリセロール溶液、エタノール、未感染の鶏卵に由来する尿膜液（すなわち、正常尿膜液「NAF」）またはそれらの組み合わせなど）である。無菌性、pH、等張性、および安定性を確実にする上記溶液の調製を当該分野において確立されたプロトコルにより行う。一般に、キャリアまたは賦形剤をアレルギーおよび他の望ましくない効果を最小限にするように、および特定の投与経路（皮下、筋肉内、鼻腔内など）に適するように選択する。
一般に、本発明のインフルエンザウイルスを１種以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激するのに十分な量で投与する。好ましくは、インフルエンザウイルスの投与により防御的免疫応答を誘発する。１種以上のインフルエンザ株に対する防御的免疫応答を誘発するための投薬量および方法は当業者に公知である。例えば、不活性化インフルエンザウイルスは、投与される1回の用量あたり約1〜1000 HID50（ヒト感染用量）、すなわち、約105 〜108 pfu（プラーク形成単位）の範囲で与える。あるいは、約10〜50 μg（例えば約15 μg）のHAをアジュバントと共に投与される用量よりも少量で、アジュバントを用いずに投与する。典型的に、用量は年齢、身体の状態、体重、性別、食事、投与時間、および他の医療的要因などに基づいて上記範囲内にて調節する。予防的ワクチン製剤を針とシリンジ、または無針注射装置を用いて、例えば皮下または筋肉内注射により全身投与する。あるいは、ワクチン製剤をドロップ、大きな粒子のエアロゾル（約10ミクロンよりも大きい）、または上気道に噴霧することによって鼻腔内投与する。上記送達経路のいずれかによって、防御的全身性免疫応答を生じるが、鼻腔内投与はインフルエンザウイルスの侵入部位において粘膜免疫を誘発する付加的利益を与える。鼻腔内投与については、弱毒生ウイルスワクチンがしばしば好まれる（例えば弱毒、好冷および／または温度感受性の組換えまたはリアソータントインフルエンザウイルス）。単一用量を用いた防御的免疫応答の刺激が好ましいが、望ましい予防的効果を得るために同一または別の経路でさらなる投薬量を投与できる。
あるいは、免疫応答を、インフルエンザウイルスを用いた、ex vivoまたはin vivo における樹状細胞のターゲッティングにより刺激できる。例えば、増殖樹状細胞を十分な量のウイルスに、細胞がインフルエンザ抗原を捕捉するのに十分な時間曝す。次にこの細胞を標準的な静脈内移植方法によってワクチン接種される被験体に移植する。
インフルエンザウイルスまたはそのサブユニットを予防的に投与するための製剤はまた、必要に応じて、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するために１種以上のアジュバントを含む。好適なアジュバントとしては、サポニン、ミネラルゲル（水酸化アルミニウムなど）、表面活性剤（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルション、バシル・カルメット-ゲラン（BCG）、コリネバクテリウム・パルブム、ならびに合成アジュバントQS-21およびMF59が挙げられる。
必要な場合には、インフルエンザウイルスの予防的ワクチン投与を１種以上の免疫刺激分子の投与と共に行うことができる。免疫刺激分子としては、免疫賦活活性、免疫増強活性、前炎症性活性を有する種々のサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン（インターロイキン（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13）；増殖因子（例えば、顆粒球-マクロファージ（GM）-コロニー刺激因子（CSF））；および他の免疫刺激分子（マクロファージ炎症性因子、Flt3リガンド、B7.1；B7.2）など）が挙げられる。免疫刺激分子はインフルエンザウイルスと同一の製剤に入れて投与することも、別々に投与することもできる。上記タンパク質または上記タンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを免疫刺激効果を生じさせるために投与できる。
別の実施形態において、インフルエンザゲノムセグメントを含む本発明のベクターを用いて、宿主生物または宿主細胞（哺乳動物細胞など（例えばヒト被験体に由来する細胞））に異種性核酸を好適な上記医薬キャリアまたは賦形剤と組み合わせて導入することができる。典型的に、異種性核酸を遺伝子または遺伝子セグメントの非必須領域（例えばセグメント7のM遺伝子）に挿入する。異種性ポリヌクレオチド配列はポリペプチドもしくはペプチド、またはアンチセンスRNAもしくはリボザイムのようなRNAをコードすることができる。次に異種性核酸を、異種性核酸を含む組換えウイルスを作製することによって、宿主または宿主細胞に導入する。このウイルスは上記のように投与する。
あるいは、異種性核酸を含む本発明のベクターを、インフルエンザウイルスに感染した細胞にこのベクターをコトランスフェクトすることによって導入し、宿主細胞に発現させることができる。必要に応じて、次に細胞を被験体に、典型的にその細胞を得た部位に戻すか、または送達する。いくつかの適用において、細胞を目的の組織、器官、またはシステム部位（上記のような）へ、確立された細胞の転移または移植方法を用いて移植する。例えば、造血系統の幹細胞（骨髄、臍帯血、または末梢血由来の造血幹細胞など）を標準的な送達または注入技術を用いて被験体に送達することができる。
あるいは、異種性核酸を含むウイルスをin vivoにおいて被験体の細胞に送達することができる。典型的に、このような方法には、標的細胞集団（例えば血液細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、神経（脳を含む）細胞、腎臓細胞、子宮細胞、筋細胞、腸細胞、子宮頸細胞、膣細胞、前立腺細胞など）ならびに種々の細胞、組織および／または器官に由来する腫瘍細胞へのベクター粒子の投与を含む。投与は、例えばウイルス粒子の静脈内投与による全身性のものか、または組織、器官または皮膚部位への注射（例えば針もしくはシリンジを使用する）、無針ワクチン送達、局所的投与、または押し込みを含む種々の方法によって目的の部位に直接的にウイルス粒子を送達することによるものでありうる。例えば、ウイルスベクター粒子を、吸入、経口的、静脈内、皮下（subcutaneously）、皮下（subdermally）、皮内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内に送達するか、膣または直腸投与によるか、または身体の腔もしくは他の部位に例えば外科手術中にウイルス粒子を置くことによって送達できる。
上記方法は、in vitro、ex vivoまたはin vivoにおいて標的細胞の集団に治療的または予防的に有効なポリペプチド（もしくはペプチド）またはRNA（例えばアンチセンスRNAもしくはリボザイム）をコードする異種性ポリヌクレオチドを含む本発明のベクターを導入することによって、疾患または障害を治療的および／または予防的に処置することに有用である。典型的に、目的のポリペプチド（もしくはペプチド）、またはRNAをコードするポリヌクレオチドは、上記「発現ベクター」および「さらなる発現エレメント」と題されたセクションに記載されるように適切な調節配列に機能的に結合されている。必要に応じて、１種以上の異種性コード配列を単一のベクターまたはウイルスに組み込む。例えば、治療的または予防的に活性なポリペプチドまたはRNAをコードするポリヌクレオチドに加えて、ベクターはまた、さらなる治療的または予防的ポリペプチド（例えば、抗原、共刺激分子、サイトカイン、抗体など）および／またはマーカーなどを含むことができる。
本発明の方法およびベクターを、遺伝的および後天的障害を含む広範な種々の障害を治療的または予防的に処置するために（例えばウイルス、細菌などによる感染性疾患のためのワクチンとして）用いることができる。
キット
本発明のベクターおよびベクター系の使用を容易にするために、インフルエンザウイルスのパッケージングおよび感染に有用な、ベクターのいずれか（共通インフルエンザウイルスプラスミド、変異体インフルエンザポリペプチドプラスミド、インフルエンザポリペプチドライブラリープラスミドなど）およびさらなる構成要素（緩衝液、細胞、培養培地など）がキットの形態でパッケージされうる。典型的に、キットは上記構成要素に加えて本発明方法をおこなうための解説書、パッケージング物質、および容器などを含みうるさらなる物質を含む。
ウイルス核酸およびタンパク質の操作
本発明との関連において、インフルエンザウイルスの核酸および／またはタンパク質を周知の分子生物学的技術により操作する。増幅、クローニング、変異誘発、形質転換などを含む多数の方法についての詳細なプロトコルは例えばAusubelら Current Protocols in Molecular Biology （2000年に補遺） John Wiley & Sons, New York（「Ausubel」）；Sambrookら Molecular Cloning−A Laboratory Manual（第2版）, Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989（「Sambrook」）、ならびにBergerおよびKimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA（「Berger」）に記載される。
上記参照に加えて、in vitroにおける増幅技術（ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、Qβ複製酵素増幅、および例えば本発明のcDNAプローブを増幅するのに有用な他のRNAポリメラーゼ媒介性技術（例えばNASBA）など）についてのプロトコルは、Mullisら（1987）米国特許第4,683,202号；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications（Innisら編者） Academic Press Inc. San Diego, CA（1990）（「Innis」）；ArnheimおよびLevinson（1990） C & EN 36；The Journal Of NIH Research（1991） 3：81；Kwohら（1989） Proc Natl Acad Sci USA 86, 1173；Guatelliら（1990） Proc Natl Acad Sci USA 87：1874；Lomellら（1989） J Clin Chem 35：1826；Landegrenら（1988） Science 241：1077；Van Brunt（1990） Biotechnology 8：291；Wu and Wallace（1989） Gene 4：560；Barringerら（1990） Gene 89：117、ならびにSooknananおよびMalek（1995） Biotechnology 13：563に見出せる。本発明との関連において、核酸のクローニングに有用なさらなる方法としては、Wallaceらの米国特許第5,426,039号が挙げられる。PCRによって大きな核酸を増幅するための改良方法はChengら（1994） Nature 369：684およびその参考文献に要約されている。
本発明の特定のポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）は、モノヌクレオチドおよび／またはトリヌクレオチド系ホスホラミダイト共役化学を含む種々の固相ストラテジーを利用して合成できる。例えば、核酸配列を、ポリヌクレオチド鎖を伸長するために活性化単量体および／または三量体を連続的に付加することによって合成できる。例えばCaruthers, M.H.ら（1992） Meth Enzymol 211：3を参照のこと。
所望される配列を合成する代わりに、基本的に核酸は、The Midland Certified Reagent Company（mcrc@oligos.com）, The Great American Gene Company（www.genco.com）, ExpressGen, Inc.（www.expressgen.com）, Operon Technologies, Inc.（www.operon.com）などの種々の商業的供給元のいずれかによるオーダーメードでありうる。
さらに、ウイルスポリペプチドの選択したアミノ酸残基の置換を、例えば部位特異的変異誘発によって達成できる。例えば、望ましい表現型特性（弱毒表現型、好冷性、温度感受性など）と機能的に関連するアミノ酸置換を有するウイルスポリペプチドを、ポリペプチドをコードするウイルス核酸のセグメントに特異的な突然変異を導入することによって作製できる。部位特異的変異誘発の方法は当該分野において周知であり、例えばAusubel、Sambrook、およびBerger（上記）に記載される。部位特異的変異誘発を行うための多数のキットが商業的に入手可能であり（例えばChameleon Site Directed Mutagenesis Kit（Stratagene, La Jolla））、製造者の指示に従ってそれを用いて、A型インフルエンザまたはB型インフルエンザのポリペプチドをコードするゲノムセグメントに表6または表17に記載される１つ以上のアミノ酸置換をそれぞれ導入することができる。
pAD 3000の構築
プラスミドpHW2000（Hoffmannら（2000） A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97：6108-6113）を改変して、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナルとシミアンウイルス40（SV40）に由来するポリアデニル化シグナル配列を置換した。
SV40に由来する配列を以下のオリゴヌクレオチド（5’側から3’側方向に示されている）：
ポリA.1：AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT（配列番号1）
ポリA.2：TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA（配列番号2）
を使用してTaq MasterMix（Qiagen）を用いて増幅した。
プラスミドpSV2Hisを鋳型として用いた。推定175 bpの産物と一致する断片を得て、製造者の指示に従ってTopo TAクローニングベクター（Invitrogen）を使用して、pcDNA3.1にクローン化した。SV40ポリアデニル化シグナルを含む所望される138 bpの断片を得られたプラスミドよりEcoRVとBstEIIとを用いて切り出し、アガロースゲルより単離し、そして従来技術（例えばAusubel、Berger、Sambrookを参照のこと）を用いてpHW2000の唯一のPvuII部位とBstEII部位の間に連結する。得られたプラスミドPAD3000（図1）を配列決定し、正しい向きでSV40ポリアデニル化部位を含むことを確認した。pAD3000のヌクレオチド295〜423はSV40株 777（AF332562）のヌクレオチド2466〜2594にそれぞれ対応する。
MDV-A作製のための8つのプラスミド系
好冷A型インフルエンザウイルス株A／AA／6／60変異体は一般に、経鼻投与されるA型インフルエンザワクチン製造のための主要ドナーウイルスとして用いられていた。この株は本発明との関連において、典型的な主要ドナーウイルス（MDV）である。便宜上、この株A／AA／6／60の変異体を本明細書中においてはMDV-Aと示す。MDV-AウイルスRNAをRNeasy mini kit （Qiagen）を用いて抽出し、8つの対応するcDNA断片を表1に挙げたプライマーを用いてRT-PCRによって増幅した。
Figure 2011188859
Aar I制限酵素認識部位を含むプライマーを使用して増幅したHAおよびPB2をコードするインフルエンザのゲノムセグメントを除いて、残りの6つの遺伝子をBsmB I制限酵素認識部位を含むプライマーを用いて増幅した。AarIとBsmB Iの両方のcDNA断片をpAD3000ベクターの2つのBsmB I部位の間にクローン化した。
配列決定分析によって、クローン化した全てのcDNA断片が、クローニング工程の間に導入されたと思われるコンセンサスMDV-A配列に関連した突然変異を含んでいたことが明らかとなった。各遺伝子セグメントに見出された突然変異を表2に要約する。
Figure 2011188859
全ての突然変異を、QuikChange Site-directed Mutagenesis Kit （Stratagene）および表3に示す合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてコンセンサスMDV-A配列に戻して正した。
Figure 2011188859
感染性組換えMDV-Aおよびリアソータントインフルエンザウイルスの作製
Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞およびヒトCOS7細胞を、10％胎児ウシ血清（FBS）を含む改変イーグル培地（MEM）中に維持した。ヒト胎児腎臓細胞（293T）を5％ FBSを含むOpti-MEM I（Life Technologies）中に維持する。MDCK細胞とCOS7細胞または293T細胞のいずれかを1：1の割合で6ウェルプレートにて共培養し、この細胞を、およそ80％コンフルエントな状態にてトランスフェクションに用いた。293T細胞およびCOS7細胞は高いトランスフェクション効率を有するが、インフルエンザウイルスの複製を許容しない。MDCK細胞との共培養により組換えウイルスの効率的な複製を確実にする。トランスフェクションの前に、血清含有培地を無血清培地（Opti-MEM I）に代え、4〜6時間インキュベートした。プラスミドDNAのトランスフェクションを、1 μgの8つのプラスミドDNA （PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HAおよびNA）の各々のと160 μlのOpti-MEM Iに希釈した20 μlのTransIT-LT1を全量200 μlにて混合し、TransIT-LT1（Mirus）を用いて行った。DNA：トランスフェクション試薬混合物を45分間、室温にてインキュベートし、その後800 μlのOpti-MEM Iを加えた。次にトランスフェクション混合物を共培養したMDCK細胞／293T細胞またはMDCK細胞／COS7細胞に加えた。トランスフェクトした細胞を35℃または33℃にて、6時間〜24時間（例えば一晩）インキュベートし、そしてトランスフェクション混合物を各ウェルにおいて1 mlのOpti-MEM Iと代えた。35℃または33℃にて24時間インキュベーションした後、1μg／mlのTPCK-トリプシンを含有する1mlのOpti-MEM Iを各ウェルに加え、さらに12時間インキュベートした。次に回収したウイルスをコンフルエントな状態のMDCK細胞にて増幅するか、発育鶏卵において直接的に増幅した。12ウェルプレートに入れたMDCK細胞を室温にて1時間、0.2 mlのトランスフェクション混合物で感染させ、次に混合物を取り除き、1μg／mlのTPCK-トリプシンを含有する2mlのOpti-MEM Iと代えた。細胞を35℃または33℃にて、3〜4日間インキュベートした。増幅したウイルスをSPG安定剤の存在下にて-80℃で保存するか、またはプラーク精製し、MDCK細胞または発育鶏卵にて増幅した。
MDV-Aポリメラーゼタンパク質の機能的発現
4つのMDV-Aポリメラーゼタンパク質（PB2、PB1、PAおよびNP）の機能的活性を、EGFPレポーター遺伝子をコードするインフルエンザウイルスのミニゲノムを複製するそれらの能力によって分析した。1組8つの発現プラスミド（例えば表4を参照のこと）（Hoffmannら（2001） Eight plasmid rescue system for influenza A virus；Options for the control of influenza International Congress Series 1219：1007-1013）は、A／PR／8／34株（H1N1）のcDNAと増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP, pHW72-EGFP）をコードするレポーター遺伝子を含むインフルエンザウイルスミニゲノムを含んでいた。
MDV-A PB1、PB2、PAおよびNPまたはPB1、PA、NP（ネガティブコントロールとしてPB2）をA型インフルエンザウイルスEGFPミニゲノムを示すプラスミド（pHW72-EGFP）（Hoffmannら「Ambisense」 approach for the generation of influenza A virus：vRNA and mRNA synthesis from one template Virology 15：267（2）：310-7） （2000）と共に、共培養したMDCK細胞／293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をトランスフェクション後48時間にて、位相差顕微鏡または蛍光顕微鏡下にて観察した。あるいは、フローサイトメトリーを用いてEGFPの発現を検出できる。
図2に示すように、EGFPミニゲノムの発現を示す緑色の蛍光がMDV-AのPB2、PB1、PAおよびNPを用いてトランスフェクトした細胞では観察されたが、3つのポリメラーゼタンパク質のみを用いてトランスフェクトした細胞においては観察されなかった。このことはpAD3000のMDV-Aポリメラーゼタンパク質が機能的であったことを示した。
他のアッセイにおいては、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（CAT）遺伝子を含むミニゲノム（pFlu-CATと示す）を利用してポリメラーゼ活性を測定する。このようなアッセイにおいて、CAT発現をミニゲノム複製の指標として、タンパク質レベル（例えばELISAによって）またはRNAレベルで測定する。
単一遺伝子のリアソータント実験によるMDV-Aプラスミドの分析
pAD3000にクローン化した8つのMDV-Aゲノムセグメントの各々が、MDV-Aに由来する単一遺伝子セグメントと共に、対照であるA／PR／8／34株に由来する相補的な7つのセグメントをコトランスフェクトすることによるリアソータントの実験において機能的に発現することを示す。相補的な対照セグメントとの組合せにおいて8つ全ての単一ゲノムセグメントプラスミドは感染性リアソータントウイルスを生じた。これは感染したMDCK細胞において細胞変性効果を生じ、8つ全てのプラスミドが機能的MDV-Aタンパク質をコードしていることを示す。
Figure 2011188859
A型インフルエンザウイルスのパッケージングの抑制をさらに測定するために、NSセグメントを2つの別々の遺伝子セグメント（1つはNS1ゲノムセグメントをコードし、もう1つはNS2ゲノムセグメントをコードする）に分けた。A型インフルエンザのゲノムセグメントを含む9つのプラスミドを上記のようにMDCK／COS細胞にトランスフェクトし、そして回収したウイルスをMDCK細胞を用いた滴定の前に発育鶏卵にて増幅した。上記の8つのプラスミド系と比べて9つのプラスミド系については縮小したプラークサイズが観察された。RT-PCR分析によって、NS2セグメントのみがウイルス粒子に存在したこと、またNS1遺伝子セグメントはパッケージされなかったことが示された。
MDV-Aおよび6：2リアソータントウイルスの回収
上記手順に続いて、8つのMDV-Aプラスミド（組換え体）、または6つのMDV-A内部遺伝子、およびA／PR／8／34に由来するHAとNAを含むプラスミド（6：2リアソータント）のいずれかを用いてトランスフェクションして3日後、トランスフェクトした培養上清を用いて新しいMDCK細胞を感染させ、そしてこの感染細胞を1μg／mlのTPCK-トリプシンの存在下において33℃にて3日間インキュベートした。感染したMDCK細胞における組換えウイルスの細胞質効果を顕微鏡を使用して観察した。ウイルス赤血球凝集素の発現を標準的な赤血球凝集アッセイ（HA）を用いて調べた。HAアッセイを50μlの連続的に2倍希釈した培養上清と50μlの1％トリ赤血球とを96ウェルプレートにおいて混合することによって行った。トランスフェクトした8つのMDV-Aプラスミドまたは6：2リアソータントウイルスのいずれかに由来する増幅したウイルスについて、およそ1：254〜1：1024のHAタイターを検出した。Dr. E. Hoffmanより入手した8つのA／PR／8／34プラスミドを用いたトランスフェクション反応をポジティブコントロールとして用いた。感染性インフルエンザウイルスを表5に示すような3つのトランスフェクション反応により作製した。
Figure 2011188859
RT-PCRを行い回収したウイルスの遺伝子型を調べた。ウイルスRNAを感染細胞の培養上清からRNeasy mini Kit （Qiagen）を用いて単離し、そして8つのインフルエンザウイルスセグメントを各MDV-A遺伝子セグメントに特異的なプライマーならびにH1およびN1特異的プライマーを用いてRT-PCRによって増幅した。図3に示すように、rMDV-AはMDV-Aに特異的であったPB2、PB1、NP、PA、MおよびNSならびに、H2およびN2サブタイプに特異的なHAおよびNAを含んでいた。6：2リアソータントは、MDV-Aに由来する6つの内部遺伝子とA／PR／8／34に由来するHAおよびNA （H1N1）とを含んでいた。これによってトランスフェクトしたプラスミドより産生されたウイルスが正しい遺伝子型を有していたことが確認された。
回収したウイルスを、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって滴定し、そしてプラークがインフルエンザウイルスであることをMDV-Aに対して生じたトリ血清を用いた免疫染色によって確認した。12ウェルプレートにおいて100％コンフルエントな状態のMDCK細胞を100 μlの10倍連続希釈したウイルスを用いて、室温にて1時間、優しく揺らしながら感染させた。接種物を取り除き、そしてこの細胞を0.8 ％アガロースおよび1 μg／mlのTPCK-トリプシンを含有する1×L15で覆った。このプレートを35℃または33℃にて3日間インキュベートし、100％メタノールを用いて固定し、5％ミルク（PBS中）を用いてブロッキングし、そして2000分の1に希釈したトリ抗MDV-A 抗血清と共に1時間インキュベートし、その後HRP結合ウサギ抗トリIgGと共に1時間インキュベートした。HRP基質溶液（DAKO）を添加してプラークを視覚化した。回収した全てのウイルスは免疫染色にて陽性を示した。
MDV-Aのca、ts、att表現型の遺伝子基盤のマッピング
MDV-Aインフルエンザウイルスワクチン株は、ワクチン製造に関する様々な表現型（弱毒生ワクチン：好冷性（ca）、温度感受性（ts）および弱毒性（att）など）を有する。MDV-A株と非ts病原性wt A／AA／6／60株との配列比較よって、これら2つの株の間で最小17ヌクレオチドの違いが明らかとなった（表6）。MDV-A配列における複数の変化は、GeneBankデータベースにおいて利用可能である全てのA型インフルエンザウイルスと比べて、この株特有のことである。これは１つ以上のこれらのアミノ酸置換がatt、caおよびts表現型に機能的に関連することを示唆している。PB2821における単一のアミノ酸変化は、MDV-Aのts表現型の決定因子としてこれまでに報告されていた、たった1つのヌクレオチド位置だけであった（Subbaraoら（1995） Addition of Temperature-Sensitive Missense Mutations into the PB2 Gene of Influenza A Transfectant Viruses Can Effect an Increase in Temperature Senstivity and Attenuation and Permits the Rational Design of a Genetically Engineered Live Influenza Avirus Vaccine J. Virol. 69：5969-5977）。
MDV-A表現型に含まれる最小の置換を示すために、wt A／AA／6／60とは異なるMDV-Aクローンのヌクレオチドをwt A／AA／6／60のヌクレオチドにそれぞれ変えた（すなわち「戻した」）。次に、戻した遺伝子セグメントの各々を、MDV-Aの相補的なセグメントと組み合わせて宿主細胞に導入し、単一遺伝子リアソータントを回復した。さらに、戻した遺伝子セグメントおよび対応するMDV-Aセグメントをまた、他の野生型株（例えばA／PR／8／34株）に由来するセグメントと組み合わせてトランスフェクトし、ウイルス表現型への各遺伝子セグメントの関与を調べることができる。上記組換えMDV-Aプラスミド系を用いて、部位特異的変異誘発を行い、非tsリアソータントを産生するために6つの内部遺伝子をさらに改変した。全部で15個のヌクレオチド置換型突然変異を6つのMDV-Aプラスミドに導入し、表6に挙げるような組換え野生型A／AA／6／60ゲノム（rWt, Flu064）を示した。Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞およびCOS-7細胞を維持し、上記のようにトランスフェクトした。次に回収したウイルスをMDCK細胞でいったん継代し、その後発育鶏卵の尿膜腔にて増幅した。MDCKおよび卵におけるトランスフェクションおよびウイルス増殖を33℃、caおよびwtウイルス両方の温度淘汰圧を最小にする温度にて行った。ウイルスの遺伝子型をウイルスRNAより増幅したcDNA断片の配列分析によって確認した。
Figure 2011188859
表現型特性を「Recombinant tryptophan mutants of influenza」と題されたParkinの米国特許第 6,322,967号（その全体が本明細書中に援用される）に以前に記載されたような、当該分野において公知の方法によって決定した。簡潔にいえば、組換えウイルスの温度感受性を33℃、38℃および39℃におけるMDCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定した。6ウェルプレートに入れたMDCK細胞を400 μlの10倍連続希釈したウイルスで感染させ、室温にて60分間吸着させた。接種物を取り除き、1％アガロースおよび1 μg／mlのTPCK-トリプシンを含有する1×L15／MEMに代えた。感染細胞をCO2インキュベーターまたは38 ±0.1℃もしくは39 ±0.1℃に維持された循環水槽に浸した5％CO2を含む漏水しない容器中で33℃にてインキュベートした（Parkinら（1996） Temperature sensitive mutants of influenza Avirus generated by reverese genetics and clustered charged to alanine mutagenesis. Vir. Res. 46：31-44）。3日間のインキュベーションの後、単層をトリ抗MDV ポリクローナル抗体を用いて免疫染色し、プラークを数えた。各温度にて得られたプラーク数を比較して各ウイルスのts表現型を評価した。各アッセイは最低3回行った。シャットオフ（shut-off）温度とは、33℃と比べて100倍またはそれ以上のタイター減少を有する最低温度として定義した。
8つのプラスミド（pMDV-PB2、pMDV-PB1、pMDV-PA、pMDV-NP、pMDV-HA、pMDV-NA、pMDV-M、およびpMDV-NS）を用いてトランスフェクトした共培養されたCOS-7／MDCK細胞より得られた感染性ウイルスを発育鶏卵中で増幅し、そしてこのウイルスが、MDV-Aに由来する非組換え体、すなわち生物学的に派生したMDV-Aの特徴的なts表現型を示すことが示された（表7）。MDV-AとrMDV-Aのいずれも39℃においては明瞭なプラークを形成しなかったが、33℃においては共に明瞭なプラークを形成した。
Figure 2011188859
MDV-Aのts表現型の遺伝子基盤を体系的に、詳細に分析するために、ca A／AA／6／60（非常に関連して単離したものであるwt A／AA／6／60 E10SE2を含む）とは17〜48ヌクレオチドの差異を有する、複数の密接に関連した非ts、非att wt A／AA／6／60株の配列を比較のために利用する。全部で19ヌクレオチドの差異がE10SE2とMDV-Aとの間に存在する（表6）。E10SE2はフェレットにおいて非ts（表7）および非attであることが示された。組換え非tsウイルスを作製するために、MDV-Aプラスミドを部位特異的変異誘発によって、10アミノ酸変化を示す19のうちの15の差異を含むことによって変化させた。MDV-AとE10SE2との間で異なる4つのヌクレオチド位置（PB2-1182、1212、PB1-123、およびNP-1550）はMDV-A配列から変えなかった。それはこれらのヌクレオチドがA／AA／6／60の他の非ts単離物には見られず、そのためts表現型の発現に機能を有するとは思われないためであった（Herlocherら（1996） Sequence comparisons of A／AA／6／60 influenza viruses：mutations which may contribute to attenuation. Virus Research 42：11-25）。15ヌクレオチド変化をコードする組換えウイルス（rWt, Flu064）を、1組8つのプラスミド（pWt-PB2、pWt-PB1、pWt-PA、pWt-NP、pWt-M、pWt-NS、pMDV-HA、およびpMDV-NA）を用いてトランスフェクトした共培養されたCOS-7／MDCK細胞から得た。配列決定分析によって、rWtが特定の遺伝子変化を含み、39℃において非tsであり、生物学的に派生したwt A／AA／6／60と同一であったことを示した。これらの観察によって、ts表現型がこれらの15ヌクレオチドの一部の変化にあることが示された。
6つの内部遺伝子セグメントのウイルスts表現型への関与
MDV-A ts表現型への各wt 遺伝子セグメントの影響を、組換え体、すなわち単一遺伝子リアソータントを作製することによって調べた（表7）。rMDV-Aへのwt PB2の導入によって、38℃においてのみ非tsであったウイルスを生じたが、しかし39℃においてはtsのままであった。33℃と比較して、38℃および39℃におけるウイルスタイターの減少は、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定されるように、それぞれ0.6 log10および2.7 log10であった。wt PB1遺伝子セグメントを含むリアソータントは、38℃と39℃の両方においてプラークを形成するその能力についていうと、非tsであった。しかし、この組換え体のプラークサイズは上昇した温度によって影響を受け、rWtと比べて、39℃において顕著に縮小した。rMDV-Aへのwt NP遺伝子セグメントの導入によって、38℃においても非tsであったウイルスを生じたが、wt PB2組換え体と対照的に、wt NP遺伝子セグメントを含むウイルスは39℃においてプラークを形成しなかった。rMDV-Aへのwt PA、MまたはNS遺伝子セグメントの独立した導入は、ts表現型を変化させなかった。以上より3つの遺伝子セグメントが、この表現型の維持において最小限の機能を有したことを示す。
MDV-Aバックグラウンドにそれぞれ発現したwt PB1、wt PB2およびwt NPのいずれもが、非ts rWTと同一のプラーク効率およびプラークサイズのプロフィールを作製することができなかったため、これらの遺伝子セグメントを種々の組合せでMDV-Aに導入した。wt PB1とwt PB2との組合せによって、38℃と39℃の両方において非tsであったウイルスを生じた（表7）。プラークサイズはいずれの単一遺伝子リアソータントのプラークサイズよりも大きかったが、rWtのプラークサイズよりも顕著に小さかった。rMDV-Aにおけるwt PB1／PB2／NPの3つの組合せによって、39℃におけるそのプラーク効率およびプラークサイズがrWtと類似または同一であったウイルスを生じた。従って、wt PB2、PB1およびNP遺伝子セグメントが個々に導入された場合、ts表現型を部分的に元に戻すだけであったが、3つ全てのwt遺伝子セグメントの組合せは、ts表現型をrWtと同一である非tsの挙動に完全に戻すことが可能であった。
これら3つの遺伝子セグメントがWtに特徴的なMDV-A ts表現型を与えることができたか否かを決定するために、MDV-Aに由来する6つの内部遺伝子セグメントをrWtに、個々にまたは組み合わせて導入した。rWtへのPB1、PB2、またはNP遺伝子セグメントの単一の導入によって、ウイルスタイターが38℃において減少し、39℃においてより大幅に減少した。しかしこれら単一遺伝子リアソータントのいずれもが、rMDV-Aのように高温にて通常の速さで増殖できないものではなかった（図10）。MDV-Aに由来するPA、MおよびNS遺伝子セグメントはrWtの非ts表現型に影響を及ぼさなかった。これまでのリアソータントと同じく、rWtバックボーンへのMDV-A PB1遺伝子とPB2遺伝子の両方の導入により、38℃におけるウイルスts表現型を非常に増加させることが示されたが、しかしウイルスts表現型の完全な復帰突然変異はNP遺伝子の付加を必要とした。従って、MDV-Aに由来するPB1、PB2およびNP遺伝子セグメントは完全なts表現型を与えることに重要であった。
確定したMDV-A ts表現型の遺伝子座のマッピング
rWtとrMDV-AのPB1、PB2およびNP遺伝子セグメントの間の特異的な差異を体系的に処理し、ts表現型に重要な機能を果たすこれらの変化を同定した。rMDV-AのNP遺伝子はヌクレオチド146においてのみrWt NPと異なった（G34D, 表6）。rMDV-AのPB2遺伝子は3つの部位でrWtと異なったが、ヌクレオチド821のみがアミノ酸変化を生じ（N265S, 表6）、PB2遺伝子セグメントに配置されているts遺伝子座をおそらく示した。MDV-AのPB1遺伝子は6つのヌクレオチド位置においてwt PB1と異なる。その内4つは翻訳領域の変化であった（表6）。各wtアミノ酸残基の置換をrMDV-AのPB1遺伝子セグメントに個々に置換することによって、ts表現型におけるそれらの機能を調べた。1395G（Glu-457）および2005G（Ala）は、MDV-Aのts表現型に影響しなかった。1195A（Lys-391）および1766A（Glu-581）の各々は、38℃においてts表現型にわずかな減少を生じたが、39℃においては影響がなかった（表8）。これらのデータは1195Aおよび1766Aが、PB1遺伝子セグメント内の有望なts遺伝子座であったことを示した。しかし、1195Aと1766Aとの両方の組合せはwt PB1に類似したts表現型を生じなかった（表6）。1395Aではなく2005GのPB1-1195A／1766Aへの付加によって、39℃におけるウイルスのts表現型がさらに減少した。このことは2005AがまたMDV-AのPB1セグメントによって特定されるts表現型の発現において機能を有したことを示す。
Figure 2011188859
次にPB1単一部位突然変異を、wt PB2とwt NPと共にrMDV-Aに導入した。Wt PB2／NPおよびrMDV-Aリアソータントは38℃において非tsであり、39℃において1.25 log10のタイター減少を有したが、そのプラークサイズはrWtと比べて非常に減少した。PB1-1195Aまたは1766Aのいずれかの添加ではwt PB2／NPリアソータントの表現型を顕著に変化させなかった。wt PB2およびwt NPと合わせた、PB1-1195Aと1766Aとの組合せによってのみ、wt PB1／PB2／NPおよびrMDV-Aリアソータントと同一の非ts表現型を有するウイルスを生じた（表8）。PB1-1395G または2005Gのwt PB1-1766／PB2／NPへの添加によっては、ウイルスを特徴的なrWt非ts表現型に変えなかった。従って、これらのデータはPB1、PB2およびNPの3つの遺伝子に分配される4つのアミノ酸が、MDV-A ts表現型を完全に戻すことができるということを示した。
MDV-Aおよびリアソータントウイルスの宿主細胞の抑制
MDV-A ウイルスおよび上記の１つ以上のMDV-A由来セグメントを有するリアソータントウイルスによって示される温度感受性および弱毒表現型に加えて、MDV-Aウイルスは、MDCK細胞における増殖と相対的にPer.C6細胞における減少した増殖によって示されるような宿主細胞の抑制を示した。MDV-AおよびMDV-Aに由来するPB1およびPB2セグメントを有するリアソータントウイルスはMDCK細胞におけるそれらの増殖と相対的にPer.C6細胞において顕著に減少した増殖を示した（図20 AおよびBに示す）。
温度感受性、弱毒ウイルス株の操作
MDV-AのPB1、PB2およびNP遺伝子セグメント中に同定された5つのアミノ酸がMDV-Aのtsおよびatt表現型を再び生じるか否かを決定するために、PB1-391E、581G、661T、PB2-265S、NP-34Gを多岐にわたる野生型ウイルス株（A／PR／8／34；「PR8」）に導入した。得られたウイルスは38℃において1.9 log10減少のウイルスタイター、および39℃において4.6 log10減少（これはrMDV-Aの値と非常に近似した）を示した（図11）。
ca A／AA／6／60（MDV-A）ならびにA／PR／8／34のPB1、PB2およびNP遺伝子間の配列比較によって、MDV-AのPB1およびPB2遺伝子に同定された4つの置換アミノ酸が特有であることが明らかとなった。NP34はMDV-AとPR8との間で保存されており、そのために、MDV-AのPB1遺伝子中に同定された3つのts部位（PB1391（K391E）、PB1581（E581G）およびPB1661（A661T）をA／PR／8／34のPB1に導入し、そしてPB2265（N265S）を部位特異的変異誘発によってA／PR／8／34のPB2に導入した。PB1およびPB2遺伝子に導入した突然変異を配列決定分析によって確認した。変異誘発反応に用いたプライマー対を表9に列挙する。これらのウイルスを図16に模式的に示す。
Figure 2011188859
PR8のPB1およびPB2遺伝子に導入されたts突然変異がin vitroにおいてts表現型を与えるか否かを調べるために、ミニゲノムアッセイを行った。pFlu-CATと称されるインフルエンザミニゲノムレポーターは対照のpol Iプロモータ下にクローン化したネガティブセンスCAT遺伝子を含んでいた。CATタンパク質の発現はインフルエンザPB1、PB2、PA、およびNPタンパク質の発現に依存していた。
簡潔にいえば、HEp-2細胞にリポフェクトアミン2000（Invitrogen）を用いて1 μg のPB1、PB2、PA、NPおよびpFlu-CATミニゲノムの各々をトランスフェクトした。33℃または39℃にて一晩（およそ18時間）インキュベーションした後、細胞抽出物をCAT ELISAキット（Roche Bioscience）によってCATタンパク質の発現について分析した。CAT mRNAのレベルをプライマー伸長アッセイによって測定した。トランスフェクションから48時間後に、細胞の全RNAをTRIzol試薬（Invitrogen）によって抽出し、そして3分の1のRNAを、5’末端を[r-32P]-ATPを用いて標識した過剰量のDNAプライマー（5’-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG, 配列番号89）およびT4ポリヌクレオチドキナーゼと6ulの水中にて混合した。95℃にて3分間変性した後、50 Uのsuperscript reverese transcriptase（Invitrogen）を添加した後に、酵素と共に提供される、0.5mM dNTPを含む反応緩衝液中にて42℃において1時間、プライマー伸長を行った。転写産物を、TBE緩衝液中8M尿素を含有する6％ポリアクリルアミドゲル上で分析し、オートラジオグラフによって検出した。
図12AおよびBに示すように、3つのアミノ酸置換（PB1391（K391E）、PB1581（E581G）およびPB1661（A661T））を保有するPB1遺伝子（PR8-3s）は、PR8対照と比べて33℃において減少した活性を有した。この変異体については、39℃におけるCATタンパク質発現について大幅な減少が観察された（図12A）。これは3つの導入されたMDV-A ts部位を有するPB1遺伝子が、このin vitroアッセイにおいて温度感受性複製を示したことを示す。PR8へのPB2265（N265S）の導入は、ウイルスの複製を許容する温度（33℃）および許容しない温度（39℃）の両方において、その活性にほとんど影響を与えなかった。PB1-3sとPB2-1sとの両方の組合せによって、タンパク質活性の、より大幅な減少を生じた（PR8-4s）。これはMDV-Aよりもさらにtsのようであった。予想されたとおり、39℃においてwt A／AA／6／60（wt A／AA）と比べて、低レベルの活性（15％）を、MDV-Aに由来するPB1、PB2、PA、NP遺伝子を用いてトランスフェクトした細胞において検出した。
PR8変異体ウイルスを作製し、上記のように回収した。要するに、共培養したcos7細胞およびMDCK細胞に、PR8に由来するPR8 HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、MおよびNS遺伝子をコードする8つのプラスミドをトランスフェクトした。4つのts遺伝子座を保有するウイルス（PR8-4s）を作製するために、PB1の3つの位置（ヌクレオチド1195（K391E）、ヌクレオチド1766（E581G）およびヌクレオチド2005（A661T））に変化を含むPB1-3sならびにPB2の1つの位置821（N265S）に変化を含むPB1-1を用いた。さらに、PB1中に3つの突然変異（PR8-3s）またはPB2中に1つの突然変異（PR8-1s）のいずれかを保有するPR8ウイルスをまた、別々に回収した。これらのウイルスを図16に模式的に示す。4つ全ての組換え変異PR8ウイルスが、発育鶏卵において非常に高いタイターまで増殖した。これは表10に示すように9.0 log10 pfu／mlまたはそれ以上のタイターに達した。
感染細胞におけるウイルスのタンパク質合成を調べるために、MDCK細胞を感染効率5にてウイルスに感染させ、感染から7時間後に、細胞を35S-Trans を用いて1時間標識した。標識した細胞の溶菌液を、SDSを含有する1.5％ ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフした。タンパク質合成をまたウエスタンブロッティングによって調べた。ウイルス感染細胞を感染から8時間後に回収し、4〜15％勾配ゲルで電気泳動した。ブロットを抗M1抗体またはトリ抗MDV-Aポリクローナル抗体を用いて調べ、その後HRP結合二次抗体と共にインキュベートした。抗体結合タンパク質のバンドをChemiluminescent Detection System（Invitrogen）によって検出し、その後X線フィルムに露光した。
図19に示すように、33℃において、全て同一レベルのタンパク質合成を行ったが、39℃においては、タンパク質合成のレベルは、PR8-1sについてはわずかに減少したが、PR8-3sおよびPR8-4s感染細胞においては大幅に減少した。ウエスタンブロッティング分析によってまた、タンパク質合成の減少量が、PR8-4s、PR8-3s、PR8-1sの順序で小さくなることを示した。従って、ts変異体の減少した複製はおそらく、複製を許容しない温度における減少した複製の結果であった。
PR8変異体ウイルスの温度感受性を、33℃、37℃、38℃および39℃にて、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定した。回収したウイルスを発育鶏卵において増幅し、上記のように細胞に導入した。明示した温度にて3日間、ウイルス感染細胞をインキュベーションした後、細胞の単層をトリ抗MDVポリクローナル抗体を用いて免疫染色し、そしてプラークを数えた。各温度にて得られたプラーク数を比較し、各ウイルスのts表現型を調べた。シャットオフ温度とは33℃と比べて、100倍またはそれ以上のタイター減少を生じた最低温度として定義された。
表10および図17に示すように、全ての変異体は33℃において十分に複製したが、ウイルスタイターにわずかな減少がみられた。38℃において、全ての変異体についてウイルスタイターにかなりの減少がみられた。39℃において、PB1遺伝子に3つのts遺伝子座を保有するウイルス（PR8-3sおよびPR8-4s）については、4.0 log10以上ウイルスタイターの減少がみられた。PR8-1sはまた39℃においてtsであった。PR8-4sのts表現型は、33℃と比べて39℃において4.6 log10の減少を有するMDV-Aのts表現型と非常に類似していた。3つ全てのPR8変異体は、37℃におけるウイルスタイターにおいて2.0 log10以上の減少を有さなかったが、それらのプラーク形態は33℃における形態とは異なっていた。図18に示すように、各変異体についての33℃におけるプラークサイズは、PR8と比べてわずかに減少したのみであった。PR8-3sについては、37℃におけるプラークサイズに大幅な減少がみられ、これはPR8-4sについての減少よりも大きかった。PR8-1sは37℃におけるプラークサイズに大幅な減少はみられなかった。39℃において、少数のごく小さなサイズのプラークのみがPR8-3sとPR8-4sの両方についてみられた。PR8-1sについては、wt PR8のプラークサイズのおよそ30％のプラークサイズがみられた。
Figure 2011188859
変異PR8ウイルスの弱毒性をフェレットにおいて調べた。簡潔にいうと、オスのフェレット（9〜10週齢）を用いて、動物宿主の呼吸器におけるウイルスの複製を調べた。フェレットを別々に飼い、8.5 log10pfuのウイルスを用いて鼻腔内に接種した。感染から3日後、フェレットをケタミン-HCLを用いて麻酔し、肺と鼻甲介（NT）を回収した。肺組織のホモジェネートを連続希釈し、10日齢の発育鶏卵を用いて滴定した。肺におけるウイルスタイター（log10EID50／ml）をKarber法によって算出する。NTにおけるウイルス複製をプラークアッセイによって測定し、log10 pfu／mlとして表した。
肺および鼻甲介におけるウイルス複製のレベルをEID50またはプラークアッセイによって測定した（表11）。感染から3日後、PR8は肺組織において5.9 log10EID50／gのレベルまで複製した。しかし、PR8-1sはフェレット肺における複製にて3.0 log10減少を示した。またPR8-3sについては、ほとんど複製を検出しなかった。PR8-4sについては複製が検出されなかった（別個に得たウイルスに感染させた2つのウイルス群で調べた）。EID50アッセイによるフェレット肺におけるウイルスの検出限界は1.5 log10であり、従ってPR8-4sについては、1.5 log10EID50のタイターを割り当てた。対照として、MDV-Aはフェレット肺において複製せず、またwt A／AA／6／60は4.4 log10のタイターまで複製した。鼻甲介（NT）におけるウイルス複製を、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって調べた。PR8は鼻において6.6 log10pfu／gのタイターまで複製した。PR8-1sおよびPR8-3sについては、ウイルスタイターのわずかな減少のみがみられた。PR8-4s（A）については2.2 log10の減少がみられ、一方PR8-4s（B）（PB1遺伝子に変化を有する（E390G））については4.3 log10減少がみられた。PR8-4s（B）の非常に減少した複製は、37℃におけるそのts表現型にかなり関係する。MDV-Aに由来するインフルエンザワクチンの弱毒表現型を評価するために普通用いられていた7.0 log10 pfuに代えて、ここでは8.5 log10 pfuの感染用量を使用した。この結果は、MDV-Aに由来する4つのts遺伝子座を保有するPR8がフェレットの下気道における複製において弱毒化されていたことを示した。
Figure 2011188859
tsおよびattアッセイの両方において、PR8変異体ウイルスはMDV-Aと非常に類似したtsおよびatt表現型の両方を示した。これらのデータは、MDV-Aの特有のアミノ酸置換を多岐にわたるインフルエンザウイルス株に導入することによって、弱毒生ワクチンなどを作製するのに望ましい温度感受性および弱毒表現型を示すウイルスが生じることを示す。さらに、弱毒生インフルエンザワクチンまたは不活性化インフルエンザワクチンを作製するための主要ドナーウイルスとして用いるのに好適なts、att、PR-8ウイルスを高タイターになるまで増殖した。これらの結果は、5つのMDV-A突然変異（PB1-391E、PB1-581G、PB1-661T、PB2-265S、およびNP-34G）が任意のA型インフルエンザ株にtsおよびatt表現型を与えうることを示す。同様に、ワクチン製造に好適な新規ts、att B株を、MDV-B株の突然変異をB型インフルエンザウイルス株に導入することによって作製できる。弱毒生ウイルスワクチンを作製することに加えて、これら突然変異をドナー株へ導入することによって、より安全な不活性化ワクチンの産生を引き起こす。
MDV-B作製のための8つのプラスミド系
典型的なB型インフルエンザ主要ドナー株（MDV-B）であるインフルエンザB／Ann Arbor／1／66の好冷変異体（ca／Master Ann Arbor／1／66 P1 Aviron 10／2／97）に由来するウイルスRNAを、感染した発育鶏卵に由来する100 μlの尿膜液よりRNeasyキット（Qiagen, Valencia, CA）を使用して抽出し、そしてこのRNAを40 μlのH2Oに溶出した。各反応に1 μlの抽出したRNAを用いて、ゲノムセグメントのRT-PCRを提供されたプロトコルの従ってOne Step RT-PCRキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて行った。このRT反応を50℃にて50分間、続いて94℃にて15分間行った。PCRを、94℃にて1分間、54℃にて1分間、および72℃にて3分間を25サイクル行った。P遺伝子をBsmBI部位を有するセグメント特異的プライマーを用いて増幅し、2つの断片形成を生じた（表12）。
Figure 2011188859
プラスミドのクローニング
PCR断片を単離し、BsmBI（またはNPについてはBsaI）を用いて消化し、そして上記のようにpAD3000（ネガティブセンスvRNAおよびポジティブmRNAの転写を可能とするpHW2000の派生物）のBsmBI部位に挿入した。得られたプラスミドの2〜4つを配列決定し、RT-PCR断片の直接的な配列決定に基づいてMDV-Bのコンセンサス配列と比較した。コンセンサス配列と異なるアミノ酸変化を生じるヌクレオチド置換を有するプラスミドを、プラスミドのクローニングによるか、またはQuikchangeキット（Stratagene, La Jolla, CA）を利用して「修復」した。得られたB／Ann Arbor／1／66プラスミドを、pAB121-PB1、PAB122-PB2、PAB123-PA、PAB124-HA、PAB125-NP、PAB126-NA、PAB127-M、およびpAB128-NSと称した。この２方向性の転写系を用いて、全てのウイルスRNAおよびタンパク質を細胞内に産生し、そして感染性B型インフルエンザウイルスの産生を生じる（図4）。
注目すべきは、コンセンサス配列と比べてpAB121-PB1およびpAB124-HAが2つ、pAB128-NSが1つ、サイレントなヌクレオチド置換を有することである（表13）。これらのヌクレオチド変化はアミノ酸変化を生じず、またウイルスの増殖および回収に影響することが予期されない。これらのサイレントな置換を、組換えウイルスの遺伝子型同定を容易にするために維持した。
Figure 2011188859
PA、NP、およびM1遺伝子内にヌクレオチド置換を有するプラスミドを構築するために、プラスミドのpAB123-PA、PAB125-NP、PAB127-Mを鋳型として用いた。ヌクレオチドをQuikchangeキット（Stratagene, La Jolla, CA）によって変えた。あるいは、2つの断片を所望される突然変異を含むプライマーを用いたPCRによって増幅し、BsmBIを用いて消化し、3つの断片の連結反応によってpAD3000-BsmBIへ挿入した。作製したプラスミドを配列決定し、cDNAが不必要な突然変異を含まないことを確実にした。
鋳型DNAの配列をAmpliTaq（登録商標）DNAポリメラーゼFsを用いてRhodamine or dRhodamine dye-terminator cycle sequencing readyreaction kit （Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA）を使用して決定した。試料を電気泳動によって分離し、そしてPE／ABIモデル373、モデル373 Stretch、またはモデル377のDNA配列決定装置によって分析した。
別個の実験において、インフルエンザB／Yamanshi／166／98に由来するウイルスRNAを増幅し、MDV-B株に関しては、上記pAD3000にクローン化した。ただし、増幅を94℃にて30秒、54℃にて30秒および72℃にて3分間、25サイクル行った。B／Yamanashi／166／98株のセグメントを増幅するために、同一のプライマーを用いた。NPおよびNAセグメントを増幅するために以下のプライマーに、それぞれ代えた：MDV-B 5’BsmBI-NP：TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTG（配列番号75）およびMDV-B 3’BsmBI-NP：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTTTTTAC（配列番号76）およびBm-NAb-1：TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA（配列番号77）およびBm-NAb-1557R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTT（配列番号78）。B／Yamanashi／166／98プラスミドはpAB251-PB1、pAB252-PB2、pAB253-PA、pAB254-HA、pAB255-NP、pAB256-NA、pAB257-M、およびpAB258-NSと称される。3つのサイレントなヌクレオチドの差異をPA内に同定し、これにより組換えおよびリアソータントB／Yamanashi／166／98ウイルスの遺伝子型同定を容易にした。
感染性組換えB型インフルエンザおよびリアソータントインフルエンザウイルスの作製
ヘルパーウイルスの存在しない細胞培養系でB型インフルエンザを増殖する試みにて直面する障害を克服するために、本発明は組換えおよびリアソータントB型インフルエンザウイルス株を作製するための新規ベクターおよびプロトコルを提供する。B型インフルエンザウイルスの回収に用いられるベクター系は、A型インフルエンザウイルス作製のために開発されたものに基づく（Hoffmannら（2000） A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97：6108-6113；Hoffmann & Webster（2000） Unidirectional RNA polymerse I- polymerse II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids J Gen Virol 81：2843-7）。293T細胞またはCOS-7細胞（高いトランスフェクション効率とpolI活性とを有する霊長類の細胞）をMDCK細胞（インフルエンザウイルスの増殖を許容する）と共培養した。293T細胞を5％ FBSを含有するOptiMEM I-AB培地中に維持し、COS-7細胞を10％ FBSを含有するDMEM I-AB 培地中に維持した。MDCK細胞を、抗生物質および抗真菌剤を添加した1×MEM、10 ％ FBS中に維持した。ウイルスゲノムベクターを用いたトランスフェクションの前に、細胞をPBSまたはFBSを含まない5 mlの培地を用いて1回洗浄した。10 mlのトリプシン-EDTAを75 cm2 フラスコ中のコンフルエントな細胞に加えた（MDCK細胞を20〜45分間インキュベートし、293T細胞を1分間インキュベートした）。この細胞を遠心分離し、10 mlのOptiMEM I-AB中に再懸濁した。次に、1 mlの懸濁した各細胞系統を18 mlのOptiMEM I-ABに希釈し、混合した。次に、細胞を1ウェルあたり3 mlずつ6ウェルプレートに分けた。6〜24時間後、1 μgの各プラスミドを1.5 ml エッペンドルフチューブ中にてOptiMEM I-AB と混合した（プラスミド（x μlプラスミド + x μl OptiMEM I-AB + x μl TransIT-LT1 = 200 μl）；1 μgのプラスミドDNAにつき2 μlのTransIT-LT1）。この混合物を室温にて45分間インキュベートした。次いで、800 μlのOptiMEM I-ABを加えた。培地を細胞から取り除き、そしてトランスフェクション混合物を33℃にて6〜15時間、細胞に加えた。トランスフェクション混合物を細胞から徐々に取り除き、1 mlのOptiMEM I-ABを加え、そして細胞を33℃にて24時間、インキュベートした。トランスフェクションから48時間後、1 μg／mlのTPCK-トリプシンを含有する1 mlのOptiMEM I-ABを細胞に加えた。トランスフェクションから96時間後、1 μg／mlのTPCK-トリプシンを含有する1 mlのOptiMEM I-ABを細胞に加えた。
トランスフェクションの後4日〜7日の間に、1 mlの細胞培養上清を回収し、HAまたはプラークアッセイによって調べた。簡潔にいえば、1 mlの上清を1本のエッペンドルフチューブにとり、5000 rpmにて5分間遠心分離した。900 μlの上清を新しいチューブに移し、そして1ウェルあたり500 μlにて、例えば12ウェルプレートにおいてMDCK細胞に対して段階希釈した。この上清を細胞と1時間インキュベートした後に取り除き、そして1 μg／mlのTPCK-トリプシンを含有する感染培地（1×MEM）と代えた。次にHAアッセイまたはプラークアッセイを行った。例えばプラークアッセイについては、上清を、33℃にて3日間0.8％アガロースで覆ってインキュベートしたMDCK細胞を用いて滴定した。卵の感染のために、トランスフェクトした細胞の上清をトランスフェクションから6日後または7日後に回収し、Opti-MEM I中のウイルス希釈物100 μlを11日齢の発育鶏卵に33℃にて注射した。接種から3日後にTCID50アッセイによってMDCK細胞におけるタイターを測定した。
MDV-Bを作製するために、共培養した293T-MDCK細胞またはCOS-7-MDCK細胞のいずれかに1 μgの各プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから5〜7日後に調べたとき、共培養したMDCK細胞が細胞変性効果（CPE）を示した。これはクローン化cDNAに由来する感染性MDV-Bウイルスの産生を示す。7つのプラスミドを用いてトランスフェクトした細胞においては、CPEはみられなかった（表14）。ウイルス産生のためのDNAトランスフェクション系の効率を測定するために、細胞の上清をトランスフェクションから７日後にMDCK細胞を用いて滴定し、ウイルスタイターをプラークアッセイによって測定した。共培養した293T-MDCKの上清のウイルスタイターは5.0×106 pfu／mlであり、COS7-MDCK細胞では7.6×106 pfu／mlであった。
Figure 2011188859
一過的に共培養した293T-MDCK細胞（1, 2）または共培養したCOS7-MDCK細胞（3, 4）に7つまたは8つのプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから７日後共培養したMDCK細胞における細胞変性効果（CPE）を調べた。トランスフェクションから7日後、トランスフェクトした細胞の上清を、MDCK細胞を用いて滴定した。pfu／mlのデータは多数の（例えば3つまたは4つの）トランスフェクション実験の平均を示す。
B／Yamanashi／166／98プラスミドベクターを用いたトランスフェクション実験において比較可能な結果を得た。これらの結果は、このトランスフェクション系が8つのプラスミドに由来するB型インフルエンザウイルスの再現可能な新規産生を可能とする。
組換えB型インフルエンザの遺伝子型同定
MDCK細胞での続く継代の後に、感染細胞の上清のRT-PCRを用いて、産生したウイルスの出所の確かさを確認した。8つ全てのセグメントについて、セグメント特異的プライマー（表12）を用いてRT-PCRを行った。図5Aに示すように、全てのセグメントについてPCR産物を得た。PB1、HA、およびNSセグメントのPCR産物の直接的配列決定によって、分析した4つのヌクレオチドがプラスミドpAB121-PB1、PAB124-HA、およびpAB128-NSに見出されるものと同一であることが明らかとなった。これらの結果は、産生されたウイルスが特定のプラスミドより産生されたことを裏付け、また（ネガティブコントロールに加えて）親ウイルスによる研究室汚染の可能性を除外する（図5B）。
同様に、B／Yamanashi／166／98プラスミドベクターを用いたトランスフェクションの後、ウイルスを回収し、そしてPAセグメントのヌクレオチド1280〜1290を含む領域を増幅した。配列決定によって、回収したウイルスがプラスミド由来の組換えB／Yamanashi／166／98に相当することを確認した（図5CおよびD）。
rMDV-Bの表現型同定
MDV-Bウイルスは2つの特徴的な表現型：温度感受性（ts）および好冷性（ca）を示す。tsは、33℃と比べて37℃におけるウイルスタイターが2 log（またはそれ以上）異なるという定義によって規定され、caは33℃と比べて25 ℃におけるウイルス増殖が2 log未満の差であることによって規定される。トリ腎臓プライマリー（PCK）細胞を親ウイルスMDV-Bまたはプラスミドに由来するトランスフェクトウイルスに感染させ、3つの温度におけるウイルス増殖を測定した。
プラークアッセイのために、6ウェルプレート中コンフルエントなMDCK細胞（ECACC）を用いた。ウイルス希釈物を33℃にて30〜60分間インキュベートした。この細胞を0.8％アガロースで覆った。感染細胞を33℃または37℃にてインキュベートした。感染から3日後、細胞を0.1％クリスタルバイオレット溶液を用いて染色し、そしてプラークの数を測定した。
ca-ts表現型アッセイを、25℃、33℃および37℃における、ウイルス試料のTCID50滴定によって行った。このアッセイ形式は、異なる温度（25℃、33℃、37℃）において、96ウェル細胞培養プレート中のトリ腎臓プライマリー細胞単層における、インフルエンザウイルスによる細胞変性効果（CPE）調べることによってTCID50タイターを測定する。このアッセイは温度およびウイルス株によって変化するプラーク形態に依存せず、その代わりにインフルエンザウイルスの複製能力およびCPEを生じる能力にのみ依存する。一次組織のトリプシン処理によって調製されたトリ腎臓プライマリー（PCK）細胞の懸濁液を、5％FCSを含有するMEM（イーグル）培地に懸濁した。PCK細胞を、48時間で90％を超えるコンフルエントな状態の単層を調製するために96ウェル細胞培養プレートに播種した。48時間後、PCK細胞の単層を5mM L-グルタミン、抗生物質、非必須アミノ酸を含有する無血清MEM培地（表現型アッセイ培地（PAM）と称される）を用いて1時間洗浄した。連続10倍希釈のウイルス試料を、PAMを入れた96ウェルブロック中に調製した。次に、希釈したウイルス試料を96ウェルプレート中の洗浄したPCK単層上に播いた。ウイルス試料の各希釈度において、6ウェルの複製物を希釈したウイルスによる感染に用いた。各試料についての6ウェルの複製物と同様に、細胞対照として非感染細胞を含めた。各ウイルス試料を2〜4の複製物を用いて滴定した。25℃、33℃、および37℃にて予め定めたタイターを有する表現型対照ウイルスを各アッセイに含む。ウイルス試料のts表現型を測定するために、プレートを5％ CO2細胞培養インキュベーター内において、33℃または37℃にて6日間インキュベートした。ca表現型の特徴付けのために、プレートを25℃にて10日間インキュベートした。ウイルスタイターをKarber法によって計測し、Log10平均（n=4） TCID50タイター／ml +標準偏差として報告した。図1〜3に示されたウイルスタイターの標準偏差は0.1〜0.3に及んだ。33℃と37℃におけるウイルスタイターの差異をts表現型を決定するために用いて、そして25℃と33℃におけるウイルスタイターの差異をca表現型を決定するために用いた。
プラスミドに由来する組換えMDV-B（recMDV-B）ウイルスは、予測されたとおり2つの特徴的な表現型（caおよびts）を細胞培養において発現した。ca表現型（25℃における効率的な複製）を、PCK細胞においてアッセイした場合、25℃と33℃との間の2 log10以下のタイターの差異として機能的に測定する。親MDV-BおよびrecMDV-Bの両方がcaを発現した；25℃と33℃との間の差異はそれぞれ0.3と0.4 log 10であった（表15）。ts表現型はまた、2つの異なる温度でのPCK細胞におけるタイターを観察することによって測定する；しかしこの表現型については、37℃におけるタイターは33℃におけるタイターよりも2 log 10またはそれ以上小さくなければならない。親MDV-BおよびrecMDV-Bの33℃と37℃との間の差異はそれぞれ3.4と3.7 log10であった（表15）。従って、組換えプラスミドに由来するMDV-Bウイルスはcaおよびts表現型の両方を発現した。
組換えウイルスは、33℃にて7.0 log10 TCID50／ml、37℃にて3.3 TCID50／mlおよび25℃にて8.8 log10 TCID50／mlのタイターを有した（表15）。従って、8つのインフルエンザMDV-Bゲノムセグメントプラスミドを用いたトランスフェクションに由来する組換えウイルスはcaおよびts両方の表現型を有する。
Figure 2011188859
リアソータントB／Yamanashi／166／98ウイルスの作製
B型インフルエンザの主要系統を表す複数の異なる株のHAおよびNAセグメントを、本質的に上記のように増幅し、そしてpAD3000にクローン化した。プライマーをHAおよびNAセグメントの同時RT-PCR増幅のために最適化した。セグメント4（HA）およびセグメント6（NB／NA）の非コード領域を示すvRNAの終末領域の比較によって、B型インフルエンザウイルスのHA遺伝子とNA遺伝子との間で、5’末端の20終末ヌクレオチドと3’末端の15ヌクレオチドが同一であることが明らかとなった。RT-PCR用のプライマー対（下線部の配列はB型インフルエンザウイルス特異的である） Bm-NAb-1：TAT TCG TCT CAG GGA GCA GAA GCA GAG CA（配列番号87）； Bm-NAb-1557R：ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGT AAC AAG AGC ATT TT（配列番号88）を合成し、種々のB型インフルエンザ株よりHAおよびNA遺伝子を同時増幅するために用いた（図8）。B／Victoria／504／2000、B／Hawaii／10／2001、およびB／Hong Kong／330／2001のHAおよびNAのPCR断片を単離し、BsmBIを用いて消化し、そしてpAD3000に挿入した。これらの結果は、B型インフルエンザ主要系統を表す複数の様々な野生型ウイルスよりB型インフルエンザのHAおよびNA遺伝子を含むプラスミドを効率的に作製するための上記プライマーの適応性を示した。このRT-PCR産物を配列決定および／または発現プラスミドへのクローニングのために用いることができる。
種々のB型インフルエンザ系統の抗原を効率的に発現するB／Yamanashi／166／98（B／Yamagata／16／88様ウイルス）の有用性を示すために、B／Yamanashi／166／98に由来するPB1、PB2、PA、NP、M、NSならびにVictoriaおよびYamagata系統の両方を示す株に由来するHAおよびNAを含むリアソータント（6+2リアソータント）を作製した。一過的に共培養したCOS7-MDCK細胞にB／Yamanashi／166／98を表す6つのプラスミドと、B／Victoria／2／87系統、B／Hong Kong／330／2001およびB／Hawaii／10／2001に由来する2つの株およびB／Yamagata／16／88系統、B／Victoria／504／2000に由来する1つの株のHAおよびNAセグメントのcDNAを含む2つのプラスミドを上記方法によりコトランスフェクトした。トランスフェクションから6〜7日後、上清を新しいMDCK細胞を用いて滴定した。3つ全ての6+2リアソータントウイルスは4〜9×106 pfu／mlのタイターを有した（表16）。これらのデータはB／Yamanashi／166／98の6つの内部遺伝子が両B型インフルエンザ系統に由来するHAおよびNA遺伝子セグメントと共に、感染性ウイルスを効率的に形成できることを示した。
共培養したCOS7-MDCK細胞の上清をトランスフェクションから6日または7日後に滴定し、そしてウイルスタイターを、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定した。
Figure 2011188859
卵における野生型B／Yamanashi／166／98の複製によって、相対的に高タイターが得られる。この特性がこのウイルスの6つの「内部」遺伝子による固有の表現型であるか否かを決定するために実験を行った。この特性を評価するために、卵中において適度に複製された野生型 B／Victoria／504／2000の産生量を、B／Victoria／504／2000のHAおよびNAを発現する6+2リアソータントの産生量と比較した。野生型および組換えB／Yamanashi／166／98に加えてこのウイルスを3つまたは4つの発育鶏卵に、100 または1000 pfuのいずれかにてそれぞれ接種した。感染から3日後、尿膜液を卵から回収し、そしてTCID50タイターをMDCK細胞を用いて測定した。6+2リアソータントは尿膜液中にwtおよび組換えB／Yamanashi／166／98株と同程度の量のウイルスを産生した（図9）。B／Victoria／504／2000と6+2組換え体との間のタイターの差異はおよそ1.6 log10 TCID50（0.7〜2.5 log10 TCID50／mL, 95％ CI）であった。B／Victoria／504／2000と6+2組換え体との間の差異を、3つの独立した実験において確認した（P <0.001）。これらの結果は、B／Yamanashi／166／98の卵における増殖特性が、卵にて不十分に複製する株より普通に発現されているHAおよびNA抗原に与えられることを示した。
ca B／Ann Arbor／1／66の弱毒性に関する分子基盤
MDV-Bウイルス（ca B／Ann Arbor／1／66）はヒトにおいては弱毒化され、フェレットにおいては弱毒表現型を示し、そして細胞培養においては好冷および温度感受性表現型を示す。MDV-Bの内部遺伝子の推定アミノ酸配列をBLAST検索アルゴリズムを用いてロスアラモスのインフルエンザデータベース（ワールドワイドウェブ：flu.lanl.gov）の配列と比較した。他の株には存在しないMDV-B特有の8つのアミノ酸を同定した（表17）。PB1、BM2、NS1、およびNS2をコードするゲノムセグメントは特有の置換残基を示さない。PAおよびM1タンパク質はそれぞれ2つ、そしてNPタンパク質は4つの特有の置換アミノ酸を有する（表17）。1つの置換アミノ酸はPB2の位置630に見出される（さらなる株 B／Harbin／7／94（AF170572）はまた位置630にアルギニン残基を有する）。
これらの結果は、遺伝子セグメントPB2、PA、NPおよびM1がMDV-Bの弱毒表現型に含まれうることを示唆した。MDV-Aについても上記と同様の方法によって、8つのプラスミド系を利用して、ヘルパーに依存しない様式にて、MDV-Aについても上記のように培養細胞に適切なプラスミドをただコトランスフェクションすることによって、組換え体およびリアソータント（単一および／または二重、すなわち7：1；6：2リアソータント）を産生することができる。例えば、B／Lee／40の6つの内部遺伝子をMDV-Bに由来するHAおよびNAセグメントと共に用いて、6 + 2リアソータントを産生することができる。
Figure 2011188859
8つの特有アミノ酸の違いがMDV-Bの特徴的な表現型に影響を及ぼすか否かを決定するために、8つ全てのヌクレオチド位置がwtインフルエンザの遺伝子補体を示すアミノ酸をコードする組換えウイルスを構築した。PA、NP、およびM1遺伝子の8つの残基を部位特異的変異誘発によって、野生型アミノ酸を示すように変えた（表17に示すように）、1組のプラスミドを構築した。構築したプラスミドを共培養したCOS7-MDCK細胞にコトランスフェクションすることによって、8つ全ての変化を有する組換え体（rec53-MDV-Bと称される）を産生した。MDCK細胞を共培養し、33℃にて増殖させることによって、トランスフェクションから6〜7日後に、上清が高ウイルスタイターを含むようにした。トランスフェクトした細胞の上清を滴定し、タイターを33℃および37℃にて、MDCK細胞およびPCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定した。
図13に示すように、2つの別々の独立した実験において、recMDV-BはMDCK細胞およびPCK細胞の両方においてts表現型を発現した。8つ全てのアミノ酸変化を有する特定の三重リアソータントウイルスのrec53-MDV-Bは非ts表現型を発現し、33℃と37℃との間のタイターの差異はPCK細胞においてわずか0.7 log10であった。このタイターは、tsの定義に必須の2 log10の差異を有する特性を満たさず、recMDV-Bにて観察される~3 log10の差異よりも著しく低かった。これらの結果は、PA、NP、およびM1タンパク質内の8つのアミノ酸の変化が、相同性および異種性の両方の糖タンパク質を有する非ts、野生型様ウイルスを産生するのに十分であったことを示す。
次に各遺伝子セグメントのts表現型への関与を決定した。PA、NP、またはM遺伝子セグメントのいずれかと野生型アミノ酸補体を有するプラスミドに由来する組換え体をDNAのコトランスフェクション技術によって作製した。全ての単一遺伝子組換え体は、37℃におけるMDCK細胞およびPCK細胞において、増殖抑制を示した（図14）。これは1つの遺伝子セグメントの変化ではts表現型を元に戻すことができないことを示す。さらに、NPおよびM遺伝子セグメントまたはPAおよびM遺伝子セグメントの両方を一緒に有する組換えウイルスはまたts表現型を保持する。対照的に、PAおよびNP遺伝子セグメントの両方を有する組換えウイルスは、37℃と33℃との間で2.0 log10またはそれ以下のタイターの差異を有した（rec53-MDV-Bに類似）。これらの結果は、NPおよびPA遺伝子が主にts表現型に関与することを示す。
NPタンパク質中の4つ全てのアミノ酸およびPAタンパク質中の2つのアミノ酸が非tsに関与しているか否かを決定するために、変化したNPおよびPA遺伝子を有する三重遺伝子および二重遺伝子組換え体を作製した（図15）。NPタンパク質中の2つのアミノ酸置換（A114からV114へ、およびH410からP410へ）は非ts表現型を生じた。核タンパク質中に単一の置換（H410からP410へ）を有するウイルスはMDCKおよびPCKにおいて非ts表現型を示した。一方、単一の置換（A55からT55へ）は、位置509における単一の置換と同じくts表現型を示した。これらの結果は、NP中のアミノ酸残基V114およびP410が37℃における効率的な増殖に関与していることを示す（図21A）。同様のストラテジーを用いて、PA遺伝子中の2つのアミノ酸の関与を分析した。4つの野生型コンセンサスアミノ酸を有するNP遺伝子セグメントと2つのコンセンサス野生型アミノ酸のうちの1つだけを有するPA遺伝子をそれぞれ有する1組の組換え体を構築した。H497からY497への置換はtsのままであった（図21B）。これはこの遺伝子座が表現型の発現にほとんど影響を与えないことを示す。対照的に、M431とV431との置換はts表現型の復帰変異を生じた。これらの結果は、NP中のアミノ酸A114とH410およびPA中のM431がMDV-Bの温度感受性の主要な決定因子であることを示す。
これまでの証拠より、ts表現型と弱毒表現型は非常に関連している。ca B／Ann Arbor／1／66 ウイルスは感染したフェレットの肺組織において検出することができない一方、非弱毒B型インフルエンザウイルスは鼻腔内感染の後、肺において検出できるということが十分に証明されている。同一の突然変異が、tsおよびatt表現型の基礎となっているか否かを決定するために、以下の研究を行った。
トランスフェクション後に得られた組み換えウイルスを発育鶏卵において継代し、ウイルスストックを作製した。9週齢のフェレットに、5.5、6.0または7.0 log10 pfu／mlのタイターを有するウイルスを鼻孔ごとに0.5 mlずつ用いて鼻腔内接種した。感染から3日後、フェレットを屠殺し、その肺と鼻甲介を上記のように調べた。
フェレット（各群に4匹の動物）をrecMDV-Bまたはrec53-MDV-Bを用いて鼻腔内感染させた。感染3日後、ウイルスの鼻甲介および肺組織を回収し、そしてウイルスの存在について試験した。7.0 log10 pfuのrecMDV-Bに感染したフェレットの肺組織においては、ウイルスを検出しなかった。7.0 log10 pfuのrec53-MDV-B ウイルスに感染した4匹の動物のうち3匹の動物において、肺組織にウイルスを検出した（この群の1匹の動物については原因不明）。低用量（5.5 log pfu／ml）のrec53-MDV-Bに感染したフェレットの4つのうちの2つの肺組織において、ウイルスを肺組織より単離することができた。従って、PA、NP、およびM1のタンパク質中の、8つの特有アミノ酸の野生型残基への変化はatt表現型を非att表現型に変えるのに十分であった。
細胞培養におけるデータによって、PAおよびNPが主にts表現型に関与していることが示されたため、第2の実験において、フェレットを6 log pfuのrec53-MDV-B（PA,NP,M）、rec62-MDV-B（PA）、NP rec71-MDV-B（NP）に感染させた。rec53-MDV-Bに感染した4匹のうち2匹の動物が肺にウイルスを有した。単一または二重のリアソータントウイルスに感染したフェレットの肺組織はどれも検出可能なレベルのウイルスを有さなかった。従って、PAおよびNPタンパク質中のアミノ酸に加えて、M1タンパク質がatt表現型に重要である。wt PAおよびNPを有するウイルスはフェレットの肺において複製しなかった。このことは弱毒性に関与する一部の突然変異がts表現型に含まれることを示す。
従って、B／Ann Arbor／1／66のtsおよびatt表現型は、多くて3つの遺伝子によって決定される。PA、NP、およびM1タンパク質中の8つのアミノ酸の野生型残基への変化によって、37℃において効率的に複製する組換えウイルスを生じた。同様に、MDV-Bの6つの内部遺伝子とts表現型を示すB／HongKong／330／01に由来するHAおよびNAセグメントおよび三重組換えを示す6+2組換えウイルスは、非tsであった。
MDV-Bバックボーンを用いた本発明者らの結果は、6つのアミノ酸がts／att表現型を非ts／非att表現型に変化させるのに十分であることを示した。そのため、本発明者らは、それら6つの「弱毒性」残基の導入が上記ウイルスの生物学的特性を異種性野生型、非弱毒性B型インフルエンザウイルス（B／Yamanashi／166／98など）に変えるか否かを決定することに関心を抱いた。
組み換え野生型B／Yamanashi／166／98（recYam）（7）および組換えウイルス（rec6-Yam）（６つのアミノ酸変化：PA（V431からM431へ、H497からY497へ）、NP（V114からA114へ、P410からH410へ）、およびM1（H159からQ159へ、M183からV183へ）を有する）を作製した。RecYamは33℃と比べて37℃におけるタイターにおいて、0.17 log10タイター減少を示したが、rec6Yam は明らかにtsであり、37℃と33℃との間のウイルスタイターの差異は4.6 log10であった。典型的な野生型B型インフルエンザウイルスと予測されるrecYamに感染したフェレットよりウイルスを効率的に回収した。rec6Yamがフェレットに接種された場合、肺組織においてウイルスは検出されなかった（表18）。従って、MDV-Bのts／att遺伝子座の変化は、ts表現型およびatt表現型を多岐にわたるウイルスに変化させるのに十分である。
Figure 2011188859
A型インフルエンザ株に関しては上記したように、上記残基の置換（例えばPB2630（S630R）；PA431（V431M）；PA497（Y497H）；NP55（T55A）；NP114（V114A）；NP410（P410H）；NP509（A509T）；M1159（H159Q）およびM1183（M183V））はtsおよびatt表現型を与える。従って、上記アミノ酸置換の１つ以上を有するB型インフルエンザウイルス株の人工的に操作した変異体はtsおよびatt表現型を示し、弱毒生インフルエンザウイルスワクチンの製造において、例えば主要ドナーウイルス株として用いることに好適である。
Vero細胞のエレクトロポレーションによる8つのプラスミドに由来するインフルエンザウイルスの回収
これまでにVero細胞より組換えA型インフルエンザを回収できることが示唆されている（Fodorら（1999） Rescue of influenza A virus from recombinant DNA J. Virol. 73：9679-82；Hoffmannら（2002） Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccine Vaccine 20：3165-3170）。報告された方法は脂質試薬を用いることを必要とし、たった1つの株、つまりA型インフルエンザ（A／WSN／33およびA／PR／8／34）の高い複製能力を有する研究用の株について記述されているのみであり、ワクチン製造に好適な弱毒生ウイルスの製造における用途を限定する。本発明は、エレクトロポレーションを用いてVero細胞より組換えインフルエンザウイルスを回収するための新規方法を提供する。これらの方法はA型インフルエンザウイルス株およびB型インフルエンザウイルス株の両方の製造に好適なものであり、鼻腔内ワクチン製剤などの投与に好適な弱毒生ワクチンの調製を容易にする無血清条件下にて増殖したVero細胞より好冷、温度感受性、弱毒ウイルスなどの回収を可能とする。ウイルス株における幅広い適用性に加えて、エレクトロポレーションは、細胞培養基のための増殖培地以外のさらなる薬剤を必要とせず、従って、望ましくない汚染の可能性を減少させる。特に、本方法は無血清条件下での増殖に適合したVero細胞（病原体が存在しないことが認められ、ワクチン製造に好適なVero細胞単離物など）を用いて組換えおよびリアソータントウイルスを作製することに有効である。この特性により、細胞基質へのDNAの商業的導入に適切な方法としてエレクトロポレーションを選択することを支持する。
エレクトロポレーションを、DNAをVero細胞に導入するための種々の方法（多数の脂質系試薬を用いたトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿および細胞マイクロインジェクションを含む）と比較した。A型インフルエンザの回収のために脂質系試薬を用いた場合、多少の成果は得られたが、エレクトロポレーションのみがVero細胞よりB型インフルエンザおよびA型インフルエンザを回収できることを示した。
エレクトロポレーションの1日前に、90〜100％コンフルエントなVero細胞を分け、ペニシリン／ストレプトマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸および10％FBSを添加したMEM（MEM, 10％ FBS）にT225フラスコあたり9×106細胞の密度で播種した。翌日、細胞をトリプシンで処理し、T225 フラスコあたり50 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁した。次にこの細胞をペレット化し、そしてT225フラスコあたり0.5 mlのOptiMEM Iに再懸濁した。必要に応じて、非ヒトまたは動物由来の成分を含むカスタマイズされたOptiMEM培地を用いることができる（これは要求に応じてOptiMEM Iの製造者より得ることができる）。細胞密度を例えば、血球計数器中にて40分の1希釈物を計数することによって測定した後、5×106細胞を終容量400μlのOptiMEM Iで0.4 cmエレクトロポレーションキュベットに加えた。MDV-AまたはMDV-Bゲノムのいずれかを含む8つのプラスミドの等モル混合物からなる12μgのDNA（25μlを超えない容量）を次に、キュベットに入れた細胞に加えた。細胞をタッピングによって優しく混合し、BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plus connected（BioRad, Hercules, CA）を用いて、300ボルト、950マイクロファラッドにてエレクトロポレーションした。時定数は28〜33 msecの範囲にすべきである。
キュベットの内容物をタッピングによって優しく混合し、エレクトロポレーションの1〜2分間後、0.7mlのMEM、10％ FBSを1 mlピペットにより加えた。この細胞を上下に数回ピペッティングによって優しくさらに混合し、次に1ウェルあたり2 mlのMEM、10％ FBSを含む6ウェルディッシュのうちの2つのウェルに分けた。次にキュベットを1 mlのMEM、10％ FBSを用いて洗浄し、1ウェルあたり約3.5 mlの終用量で2つのウェルに分けた。
代替的な実験において、無血清の増殖条件（例えばOptiPro（SFM）（Invitrogen, Carlsbad, CA）中にて）に適合したVero細胞に上記のようにエレクトロポレーションを行った。ただし、OptiMEM I中でのエレクトロポレーションの後、細胞をOptiPro（SFM）に希釈し、続いてその中で細胞を、ウイルスを回収するために培養した。続く実験では、エレクトロポレーションの後に、細胞をOptiMEM Iまたは非ヒトまたは動物由来の成分を含むカスタマイズしたOptiMEM培地に希釈しうることを示した。
次にエレクトロポレーションした細胞を、導入したウイルスの複製および回収に適切な条件下にて（すなわち好冷主要ドナー株については33℃にて）増殖した。翌日（例えばエレクトロポレーションのおよそ19時間後）、培地を除去し、そして細胞を1ウェルあたり3 mlのOptiMEM IまたはOptiPro（SFM）を用いて洗浄した。ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するOptiMEM IまたはOptiPro（SFM）を1ウェルあたり1 mlずつ、各ウェルに加え、そしてその上清を培地を交換することによって毎日回収する。上清をSPG中に−80℃で保管した。ウイルス産生のピークは典型的に、エレクトロポレーションの2〜3日後にみられた。
従って、本発明は動物細胞（SF Vero細胞など）に本発明のポリヌクレオチド（プラスミドおよびベクターなど）をエレクトロポレーションする、改良された回収方法を含む。
Figure 2011188859
エレクトロポレーションしたSF Vero細胞の共培養は回収効率を改善する
上記考察のとおり、ウイルスゲノムの8つのセグメントの各々をコードするプラスミドを細胞にエレクトロポレーションすることによって、SF Vero細胞よりインフルエンザウイルスを回収できる。この方法を用いて、野生型インフルエンザ株のHAおよびNAとMDV株（例えば好冷MDV株またはPR8）のPB1、PB2、PA、NP、NS、およびMからなる6：2 ウイルスを作製することができる。一部の野生型HAおよびNAセグメントのために、SF Vero細胞における回収が不十分となる。エレクトロポレーションしたSF Vero細胞とトリ胚腎臓（CEK）細胞との共培養がプラスミドの回収効率を改善することが見出された。例えば、SF Vero細胞のエレクトロポレーションを行ってA／Panama 6：2 ウイルスを回収した場合、試験した30個の卵（1日あたり5個の卵、エレクトロポレーションの2〜7日後）のうちどれも検出可能なHAタイターを有さなかった。しかし、同じ試料を同様にエレクトロポレーションしたSF Vero細胞を、CEK細胞と共培養した場合、30個のうち27個の卵が検出可能なHA タイターを有し（90％効率）、これらのタイターは100またはそれ以上であった。さらに、この改善された回収効率はMDV Aについてもみられる。さらに、A／Sendai（SF cero細胞より回収することが困難である別の6：2ウイルス）は共培養方法によって回収した。
従って、本発明は改善された回収方法を含む。この方法においてエレクトロポレーションしたSF Vero細胞を、トリ胚腎臓（CEK）細胞、トリ胚繊維芽細胞、トリ腎臓プライマリー細胞および発育鶏卵の漿尿膜より単離した細胞を含むがこれらに限定されない群から選択された別の細胞と共培養する。この回収方法に有用な他の細胞としては、インフルエンザウイルスの複製を支持し、規制認可の基準にかなう任意の細胞が挙げられうる。細胞の供給源としては、SPFのトリ群に由来するものが挙げられる。
本発明の１つの好ましい実施形態において、ウイルスの回収効率は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、または少なくとも5倍、改善される。
本発明の別の好ましい実施形態において、ウイルスの回収効率は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも99％である。効率は例えば、回収したウイルスを注射した卵の数（X）とその内その後検出可能なHAタイターを有する卵の数（Y）を計数し、YをXで割り算することによって測定できる。
遺伝子送達のためのインフルエンザウイルスベクター系
本発明のベクターはまた、遺伝子送達系として、また遺伝子治療のために用いることができる。このような用途については、組換えインフルエンザウイルス（外来性タンパク質を発現する組換えA型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスなど）を作製するために望ましい。例えば、B型インフルエンザウイルスのセグメント7はスプライシングされないために、異種性核酸配列を挿入することに都合の良い遺伝子エレメントを提供する。mRNAはM1およびBM2タンパク質をコードする2つのオプーンリーディング・フレームを有する2つのシストロンを含む。BM2またはM1のオプーンリーディング・フレームは、目的の異種性配列（増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）をコードする遺伝子など）に置換される。本発明のプラスミドを基盤とするベクター系を用いて、M1-EGFPおよびBM2のオプーンリーディング・フレームをコードするcDNAを2つの異なるプラスミドにクローン化する。オプーンリーディング・フレームは、複製および転写に必要とされるシグナルを含む、セグメント7の非コード領域に隣接する。あるいは、2つのプラスミドを、1つはM1 ORFを含み、そしてもう1つはEGFP-BM2を含み、構築する。得られた9つのプラスミドのコトランスフェクションによって、異種性遺伝子配列を含む組換えB型インフルエンザウイルスの産生を生じる。同様にEGFPがA型インフルエンザのNS1 セグメントより発現されうる。
典型的な「緑色」B型インフルエンザウイルスはウイルスアッセイ（マイクロ中和アッセイなど）の標準化に用いることができる。プラスミド系技術とタンパク質発現の簡単な検出法 （EGFPに由来する蛍光を図2に例証するように顕微鏡によって調べることができる）とを組み合わせることによって、タンパク質発現の最適化が可能となる。
最近のH3N2 インフルエンザワクチン株の遺伝的研究
典型的な好ましい実施形態において、弱毒、好冷生インフルエンザA／AA／6／60株はA型インフルエンザ FluMistTM ワクチンの主要ドナーウイルス（MDV-A）である。MDV-Aの6つの内部遺伝子は好冷（ca）温度感受性（ts）および弱毒（att）表現型を各ワクチン株に与える。逆遺伝子学を用いて、多重アミノ酸が3つの遺伝子セグメント：PB1-K391E、E581G、A661T、PB2-N265S、およびNP-D34Gに分離したことを示す。これらはMDV-Aのtsおよびatt表現型の発現を制御する。6：2ワクチン株のプラスミド回収によって、古典的な再集合技術よりも、効率的なインフルエンザワクチンの製造を可能とする。
不活性化した2003〜04年のインフルエンザワクチンはA／Panama／99（H3N2）抗原を含み、この時期に蔓延したドリフトしたA／Fujian／411／02様H3N2株に対する、強い抗体反応を血清陰性の子供に誘導することが可能であった。図22および23を参照のこと。あいにく、A／Fujian／411／02は発育鶏卵において十分に複製することができなかったため、ワクチン製造にそれを用いることができなかった。逆遺伝子学技術を用いて本願発明者らは、HAおよびNA活性の平衡が損失することによって、卵におけるプロトタイプA／Fujian／411／02株の不十分な複製を招くことを示した。図29〜34を参照のこと。A／FujianウイルスはそのHA活性を増加させるか、またはそのNA活性を減少させることによって、卵における効率的な複製を得ることができる。特に本願発明者らは、複数の様々な単一アミノ酸置換がA／Fujian／411／02株の卵における複製をやや増強することができるが、複数の組み合わせがより強い増強を生じたことを示す。図35〜38を参照のこと。この効果はウイルスの抗原性に影響を与えることなくHAまたはNA遺伝子に特異的な変化を導入することによって、発育鶏卵および／または宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖を改善する可能性を示す。
卵にて増殖可能な株を作製するために、A／Fujian／411／02系統の1組の関連H3N2 6：2リアソータントをMDCK細胞、発育鶏卵およびフェレットにおけるそれらの複製について調べた。A／Fujian／411／02は卵において増殖しなかったが、A／Fujian／411／02ウイルスの卵への適合により、HAに2つのアミノ酸置換（H183LおよびV226A）を生じた。これらのアミノ酸置換によって、発育鶏卵におけるウイルスの増殖が可能となった。さらに、卵に適合したA／Wyoming／03／2003株（卵およびフェレットにて十分に増殖した）とA／Sendai／H-F4962／02 ワクチン（卵においては十分に増殖するが、フェレットにおける複製は不十分であった）を配列について比較した。HAにおけるG186VおよびV226I、ならびに／またはNAにおけるQ119EおよびK136Qがin vitroおよびin vivoにおける効率的なウイルス複製に必要とされることが確定した。それにもかかわらず、これらのアミノ酸変化はウイルスの抗原性に影響を及ぼさなかった。卵における増殖が困難／不確実な株について卵における増殖を可能とする株を作製するために、または卵において既に増殖できる株について卵における増殖がより可能である株を作製するために上記技術を他のインフルエンザウイルスに用いることが意図、また予期される。
A／Panama／99からA／Fujian／02様株への抗原ドリフトに関する分子基盤を、A／Panama／99からA／Wyoming／03へのHA残基のクラスター変化によって研究した。図24を参照のこと。改変した6：2リアソータントの抗原性を、A／Panama／99またはA／Wyoming／03のいずれかを用いて免疫化した動物に由来するフェレット血清を用いて、HAIおよびマイクロ中和アッセイによって調べた。図25〜28を参照のこと。ほんのわずかの変化が抗原ドリフトを招いたが、他のものはウイルス複製に、より劇的な影響を及ぼしたことが確定した。従って、データによって示されるように、必要に応じて逆遺伝子学を用いてワクチン株を改変し、ウイルスの抗原性に影響を与えることなくワクチンの収率を増加させる。
材料および方法
ウイルス株、細胞および抗体：野生型（wt） A型インフルエンザウイルス株、A／Fujina／411／02（A／Fujian）、A／Sendai-H／F4962／02（A／Sendai）およびA／Wyoming／03／03（A／Wyoming）をCenter for Disease Control（Atlanta, GA）から得て、MDCK細胞または発育鶏卵（卵）にて一度増幅した。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ（MVA-T7）を発現する改変したワクシニアウイルスAnkara株をCEK細胞において増殖した。HEp-2細胞、COS-7細胞およびMDCK細胞（American Type Culture Collections（ATCC）より得た）を5％胎児ウシ血清（FBS）を含有する最小必須培地（MEM）中に維持した。A／Ann Arbor／6／60、A／Sendai-H／F4962／02およびA／Wyoming／03／03に対するポリクローナル抗血清をトリにおいて産生した。A型インフルエンザのNPタンパク質に対するモノクローナル抗体をBioDesign（Saco, MI）より得た。
組換え6：2リアソータントの産生：MDV-Aに再分類されたH3N2株のHAおよびNAのRNAセグメントを含む組換え6：2リアソータントを上記手順に従って作製した。簡潔にいえば、MDV-Aの内部遺伝子を含む6つのプラスミドと一緒にHAおよびNA発現プラスミドの1組をTransIT LT1試薬（Mirus, Madison, WI）を用いて、共培養したCOS-7／MDCK細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞培養の上清をトランスフェクションから3日後に回収し、新しいMDCK細胞および10日齢の発育鶏卵を感染させるために用いた。感染したMDCK細胞を、80〜90％の細胞が細胞変性効果を示すまで33℃においてインキュベートした。感染した発育鶏卵を33℃にて3日間インキュベートし、そして尿膜液を回収し、SPG 安定剤（0.2 Mスクロース、3.8 mM KH2PO4、7.2 mM K2HPO4、5.4 mMグルタミン酸モノナトリウム）の存在下において-80℃で保存する。1×L5／MEM、1％アガロースおよび1 μg／mlのTPCK-トリプシンからなる覆いの下で3日間、33℃にてインキュベートしたMDCK細胞を用いたプラークアッセイによって、ウイルスタイターを測定した。トリ抗MDV-A ポリクローナル抗体を用いて免疫染色することによってプラークを数えた。
HAおよびNA 発現プラスミドのクローニング：H3N2 サブタイプのHAおよびNAセグメントと6つの内部MDV-A RNAセグメントとを含む組換え6：2リアソータントウイルスを作製するために、wt A／Sendai-H／F4962／02およびA／Wyoming／03／03のHAおよびNAのcDNAをSuperscriptIII逆転写酵素（Invitrogen, Carlsbad, CA）、pfu DNA ポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）、鋳型として抽出したvRNA、ならびにH3およびN2に特異的なプライマーを用いたRT-PCRによって増幅した。HA-AarI5（5’cacttatattcacctgcctcagggagcaaaagcagggg3’）およびHA-AarI3（5’cctaacatatcacctgcctcgtattagtagaaacaagggtgtt3’）プライマーを、HAセグメントを増幅するために用いた。N2-AarI5（5’cacttatattcacctgcctcagggagcaaaagcaggagt3’）およびN2-AarI3（5’cctaacatatcacctgcctcgtattagtagaaacaaggagttt3’プライマーを、NAセグメントを増幅するために用いた。HAおよびNA両方のプライマー対はAar I制限酵素部位を含み、pAD3000 pol I／pol II発現プラスミドに存在するBsmB I部位に類似するように設計した。HAおよびNAのcDNAクローンを配列決定し、コンセンサスHAおよびNA配列と比較した。このコンセンサスHAおよびNA配列はHAおよびNA のRT-PCRにより増幅したcDNA産物を直接配列決定することによって得た。クローニング工程の間にcDNAクローンに導入された任意の突然変異をQuickChange部位特異的変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA）によって正した。
HAIアッセイ（インフルエンザウイルスの赤血球凝集阻害アッセイ）：試薬：0.5％ cRBC（PBS-を用いて3回洗浄、2〜3日以内において使用できる）；96ウェルU底マイクロプレート；PBS-（CaおよびMgを含まない）；チップ；インフルエンザウイルス；高または低いタイターの製剤の血清試料および陽性対照血清：HAアッセイによるウイルスのHAタイターの測定（HAIのために1：8にてウイルスタイターを使用。所与のウイルスのHAタイターが1：256である場合、それを8つに割る。このようにウイルスを1：32に希釈することが必要である。各96ウェルプレートに2.5 mlのウイルスを調製する。）；血清、必要に応じてフェレット試料をRDE（受容体破壊酵素）で処理する；製造者の指示のとおりRDEを調製する；RDEと血清試料とを1：4希釈で組み合わせる。例えば、100 μlの血清を300 μlのRDEに加える。この混合物をボルテックスし、37℃のインキュベーター中で一晩（18〜20時間）インキュベートする。混合物を56℃にて45〜50分間加熱する。非特異的な凝集素について血清をスクリーニングする；25 μlのRDEで処理した血清と25 μlのPBS- を上下に3回ピペッティングすることによって混合する；50 μlの0.5％ cRBCを、この混合物に加えるかまたはPBS-だけを加えた対照のウェルに加える；室温にて30〜45分間インキュベートする（+は部分的または完全な非特異的赤血球凝集を示し、 -は赤血球凝集を示さない）；血清とパックされたRBC とを20：1の割合で4℃にて1時間予めインキュベーションし、その後4℃にて10分間、2000rpm にて遠心分離することによって、非特異的cRBC凝集素を取り除くことができる。典型的に、対照としては以下のcRBC細胞対照；ウイルス逆滴定：用いたウイルスが正確な濃度であること確実にするために1：2〜1：32に希釈した2倍希釈の8ユニット／50 μlウイルス；陽性血清対照：試験血清試料と共に、タイターの血清を2倍連続希釈する、が挙げられる。典型的なHAIプロトコルは、血清試料を2倍連続希釈する；25 μlのPBS- を各ウェルに加える；25 μlのウイルスをウェル1Aに加える（例えば1：2）、上下に3回ピペッティングして混合する；ウェルAからウェルBに25 μl を移し（例えば1：4） 上下に3回ピペッティングして混合する、ウェルHまで希釈を繰り返す（例えば1：256）；ウイルス25μl（8ユニット／50μl） を希釈した血清試料に加え、上下に3回混合し、室温にて30〜40分間インキュベートする；50 μl の0.5％cRBCを加え、上下に3回ピペッティングすることによってウェルを混合する；室温にて30〜45分間インキュベートする；赤血球凝集を記録する、工程を含みうる。HAIタイターは、赤血球凝集を完全に阻害する最高希釈の血清により定義される。阻害がみられない場合、タイターは1：4よりも小さい。全てのウェルが阻害を示す場合、タイターは1：256よりも大きい。
一過的に発現するNAタンパク質のノイラミニダーゼ活性の測定：NAタンパク質のノイラミニダーゼ活性を測定するために、wt NAおよびその改変誘導体を、プラスミドをトランスフェクトした細胞から発現させた。NAタンパク質の高レベルの発現を得るために、NA RNAをT7およびCMVプロモータより転写した。これら二重のプロモータの下流に遺伝子を挿入した。10 cm ディッシュに入れたHEp-2細胞を感染効率5.0にて1時間、MVA-T7に感染させ、その後Lipofectmine 2000試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて5 μgのNAプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクトした細胞を35℃にて48時間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて洗浄した後、細胞をディッシュからこすり取り、そして100 μlの0.125M NaOAc, pH 5.0中に溶解した。トランスフェクトした細胞のノイラミニダーゼ活性を蛍光定量アッセイによって測定した。一度凍結乾燥した後、50 μlの細胞溶菌液を2倍連続希釈し、150 μlの1.2 mM 2’-（4-メチルウンベリフェリル）-α-D-N-アセチルノイラミン酸（MU-NANA）基質（Sigma, St. Louis, MO） と共に37℃にて1時間インキュベートし、75 μlの1.0 M グリシン（pH 5.5）によって停止させた。放出されたクロモフォア 4-メチルウンベリフェロンの蛍光レベルをSpectroMAXプレートリーダー上にて362 nmで測定した。トランスフェクトした細胞において発現した各NAタンパク質のレベルをトリ抗A／Wyoming抗血清を用いたウエスタンブロッティングによって調べた。100 μlに6.0 log10PFUを含むwt A／SendaiおよびA／Wyomingウイルスのノイラミニダーゼ活性をまた蛍光定量的なアッセイによって測定した。
MDCK細胞における6：2組換え体の受容体結合および複製：組換え6：2リアソータントのHA受容体結合および増殖反応速度をMDCK細胞において測定した。6ウェルプレートに入れたMDCK細胞に6：2 A／Fujian、A／Sendai、A／Wyomingおよび2つの改変組換えウイルスを感染効率1.0にて感染させた。33℃または4℃のいずれかにて30分間の吸着の後、感染細胞をPBSで3回洗浄するか、1 μg／mlのTPCK-トリプシンを含有する3 mlのOpti-MEM Iで直接的に覆い、33℃にてインキュベートした。一組の感染させたプレートを感染から6時間後に室温にて15分間、1％パラホルムアルデヒドで固定し、15分間 PBS中0.2％ Triton X-100を用いて透過性にし、その後抗NP モノクローナル抗体を用いて免疫蛍光分析した。ORCA-100デジタルカメラで撮影した細胞の画像をCompix image capture and dynamic intensity analysis software, Version 5.3（Cranberry Township、PA）によって分析し、感染した細胞の割合を算出した。プレートの別の組を33℃にてインキュベートした。様々な時間間隔で、250 μl の培養上清を回収し、ウイルス滴定の前にSPGの存在下にて-80℃で保存した。各アリコートを取り除いた後、等量の新しい培地を細胞に加えた。これらのアリコート中のウイルスタイターを33℃にてMDCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定した。
これらのウイルス間における結合能の差異がMDCK細胞におけるウイルス増殖速度に影響を及ぼすか否かを決定するために、感染したMDCK細胞を33℃にてインキュベートし、そしてその培養上清をウイルス滴定のために様々な時間に回収した。33℃にて吸着させた場合、6：2 A／Fujianは緩やかな増殖速度、かつ低いタイターを有し（図2）、HA-V186I226またはHA-L183A226を有する6：2 A／Sendai、A／Fujianは6：2 A／Wyomingと同様の反応を示した。4℃にて吸着を行った場合、6：2 A／Fujianおよび6：2 A／Sendaiは緩やかな増殖速度を有した。6：2 A／Wyomingおよび2つのA／Fujian変異体は同様に増殖した。これらの結果はウイルス結合アッセイと一致したが、洗浄工程は両温度におけるA／Fujianの効率的な感染を減少させた。
6：2組換えウイルスの抗原性：各ウイルスの抗原性をフェレット抗A／Sendai血清および抗A／Wyoming血清を用いた血球凝集阻害（HAI）アッセイによって分析した。フェレット抗血清を2倍連続希釈した25μlのアリコートを6：2リアソータントウイルスの4つのHA単位を含む25μlのウイルスと共に37℃にて1時間インキュベーションし、その後50μlの0.5％シチメンチョウ赤血球（RBC）と共に25℃にて45分間インキュベーションした。このHAIタイターは赤血球凝集を阻害する最高の血清希釈の相対物として定義された。
6：2 A／Fujian、A／Sendai、およびA／Wyomingワクチン株の作製
野生型（wt） A型インフルエンザウイルス株、A／Fujian／411／02、A／Sendai-H／F4962／02およびA／Wyoming／03／03をCenter for Disease Control （Atlanta, GA）より得て、MDCK細胞または発育鶏卵において一度増幅した。表20に示すように、A／Fujianは細胞培養において3回継代したのみであったが、A／SendaiおよびA／Wyomingは卵において11回継代した。これらの3つの株のHAおよびNAの配列を、これらのウイルスから抽出したvRNAを用いたRT-PCR産物の配列決定によって決定した。これら3つのH3N2株のHAおよびNAの配列の差異を表1に挙げる。A／SendaiはそのHA1アミノ酸配列においてはA／Fujianと同一であったが、NA配列においては位置119、146および347の3つのアミノ酸が異なっていた。A／WyomingはA／Fujianと同一のNA配列を有したが、A／FujianおよびA／SendaiのHA1とは4つのアミノ酸が異なっていた。さらに、A／SendaiとA／Wyomingの両方はHA2のGly-150に代えてGlu-150を有した。MDCK細胞において一度増幅した後、wt A／FujianのHA1における183残基がHis-183からLeu-183に変化し、His-183を有するwt A／Fujianウイルスを単離することが困難となった。これはHis-183を有するウイルスが、in vitroにおける増殖優位性を有したことを示す。
これら3つのwtウイルスはMDCK細胞においてそれぞれに増殖し、タイターはwt A／Fujian、wt A／Sendaiおよびwt A／Wyomingについてそれぞれ、6.1、8.1および6.7 log10PFU／mlに達した。wt A／Fujianは卵における複製が不十分であり、タイターは4.1 log10PFU／mlに達した（表20）。卵より単離されたウイルスはHAにおけるH183L変化を有した。対照的に、wt A／Sendaiおよびwt A／Wyomingは卵において十分に増殖し、タイターはそれぞれ9.0および8.9 log10PFU／mlを有した。
これらH3N2株のHAおよびNAセグメントが、卵および細胞におけるウイルス複製を制御したことを確認するために、HAおよびNA遺伝子セグメントを好冷A／Ann Arbor／6／60株（弱毒生インフルエンザFluMist ワクチンの主要ドナーウイルス（MDV-A））の内部遺伝子セグメントとリアソートして、3つの6：2リアソータントウイルスを作製した。これら3つのウイルスの複製を、MDCK細胞および発育鶏卵において調べた。6：2 A／Fujian（6.2 log10PFU／ml）はMDCK細胞において、6：2 A／Sendai（7.1 log10PFU／ml）およびA／Wyoming（7.0 log10PFU／ml）よりも低いタイターを示した。wt A／Fujianと同様に、6：2 A／Fujianは発育鶏卵において不十分に複製し、タイターは4.1 log10PFU／mlを有した。6：2 A／SendaiとA／Wyomingの両方は、それぞれ8.7および8.1 log10PFU／mlの高タイターまで複製した。このように、wt HAおよびNA遺伝子セグメントのMDV-Aへの変化は、各ウイルスの卵における複製能力を変化させなかった。
Figure 2011188859
NAにおけるアミノ酸変化によるノイラミニダーゼ活性およびウイルス複製への影響
A／Fujianは、A／SendaiとNAにおける3つのアミノ酸（E119Q、Q136KおよびH347Y）だけ異なり（表20）、１つ以上のこれらの変化によりA／Fujianよりも高いタイターまで発育鶏卵におけるA／Sendaiの複製を可能にしたと推測された。G、D、AまたはV残基によるE119の置換が、減少したノイラミニダーゼ活性を生ずる様々な抗ノイラミニダーゼ薬剤耐性株について報告されている。NAにおけるE119Qまたは他の2つのいずれかの変化がA／FujianのNA活性および発育鶏卵における複製能力に影響を及ぼすか否かを決定するために、単一または二重の置換突然変異をA／Fujian NA発現プラスミドに導入し、そしてトランスフェクトしたHEp-2細胞のNA活性を測定した。さらに、A／Fujian NAに突然変異を有する組換え6：2組換えウイルスをまた回収し、MDCK細胞および卵におけるその増殖を比較した（表21）。A／Fujian（E119Q136H147）はA／Sendai（Q119K136Y147）よりもおよそ80％高いNA活性を有した。単一のQ119突然変異は66％のNA活性を有し、Y347変化はNA活性に最小限の影響を及ぼしたが、K136のみでは25％の活性を有した。二重突然変異（K136Y347、Q119Y347、およびQ119K136）はA／Fujianのそれぞれ、29％、52％よび25％のレベルに減少したNA活性を有した。これらのデータは、上記3つのNA残基がK136>Q119>Y347の順序でNA活性に影響を及ぼしたことを示した。
NA変異体のNA活性と発育鶏卵におけるウイルス複製との関係を調べた（表21）。6つの改変ウイルスが、MDCK細胞において十分に複製し、6.2〜6.9 log10PFU／mlの範囲にあるタイターに達するが、卵における複製は全く異なっていることが示された。A／Fujianの66％および99％のNA活性を有するFJ-Q119およびFJ-347は、卵においては増殖することができなかった。25％のNA活性を有するFJ-K136は、卵において4.8 log10PFU／mlのタイターまで増殖できるが、A／Sendaiのタイター（8.8 log10PFU／ml）よりも4.0 log10低かった。意外にも、K136Y347はin vitroにおけるNA活性が著しく減少したが、上記2つの突然変異を有する組換えウイルス（FJ-K136Y347）は発育鶏卵において複製することができなかった。52％のNA活性を有したQ119Y347は、卵において4.5 log10fpu／mlのタイターまで複製した。A／SendaiのNA活性よりもやや高いNA活性を有するQ119K136は、6.2 log10fpu／mlのタイターまで複製したが、A／Sendaiよりも2.6 log10低いままであった。これらの結果は、A／FujianとA／Sendaiとの間で異なる3つのNA残基の各々がウイルス複製に別々に影響を与えたことを示す。様々なNA突然変異が、A／SendaiのNA活性に近いレベルまでNA活性を減少させることができたが、Q136KおよびE119Qの変化のみが、発育鶏卵におけるウイルス複製に、顕著な改善を生じることができた。Q119K136の二重突然変異が卵においてA／Sendaiウイルスのように効率的に複製しなかったために、Y347残基はまた卵におけるウイルス複製に影響しうる。
Figure 2011188859
HA残基のウイルス複製への影響
A／Fujianとは異なるA／Wyoming／03／03における4つのHA1残基の変化を、ウイルス複製におけるそれらの役割について調べた。単一または多重の置換突然変異をA／Fujian HA cDNAに導入し、改変したHAプラスミドをA／Fujian NAのどちらかと共にMDV-Aに導入した。全ての6：2リアソータントウイルス変異体はMDCK細胞において十分に複製したが、発育鶏卵においては別の様式で増殖した（表33）。A／Fujian HA（T128G186S219V226）を有する6：2リアソータントは、卵において複製することができなかった。単一のT128A変化は、卵におけるウイルス増殖を改善しなかった。しかし、G186VまたはV226Iの単一の変化によって、卵における増加したウイルス複製を生じた。HAにおけるG186VおよびV226Iの二重の変化によって、卵において効率的に複製した。残基128および／または219におけるさらなる置換は、ウイルスの複製を顕著に増加させなかった。このように、G186VおよびV226Iの最小2つの変化によって、6：2 A／Fujianの発育鶏卵における効率的な増殖を可能とした。
Figure 2011188859
6：2 A／Fujian／411／02の適応
6：2 A／Fujian株が発育鶏卵における増殖に適応できるか否かを決定するために、ウイルスをMDCK細胞において増幅し、その後卵において継代した（表23）。3.0 log10PFUのウイルスを卵に接種した場合、2.0 log10PFU／ml未満のウイルスを、回収した尿膜液中に検出した。この材料の継代後には、感染性ウイルスを回収することができなかった。第2の継代実験の間に、発育鶏卵に接種されるウイルスの量を5.9 log10PFUまで増加した。回収した尿膜液（FJ-EP1）において3.9 log10PFU／mlのタイターを検出し、そして卵においてさらに継代したものは6.2 log10PFU／mlのウイルスタイターまで増加した（FJ-EP2）。卵においてさらに継代したもの（FJ-EP3）は、ウイルスタイターが8.2 log10PFU／mlまで増加した。FJ-EP2ウイルスの配列分析によって、HA RNAセグメントのヌクレオチド625におけるAからUへの突然変異が明らかとなった。この突然変異はHAタンパク質におけるH183L変化を生じた。さらなる分析によって、この変化がMDCK細胞におけるウイルス増幅の間にも生じることが明らかとなった。H183L突然変異はまた、上記のようにMDCKおよび卵におけるwt A／Fujain HAの複製の間にwt A／Fujain HAにも見出された。V226A置換を生じるHAのヌクレオチド754におけるUからCへのさらなる突然変異が、FJ-EP3の増幅されたウイルスに見出された（表23）。NAセグメントに変化は検出されなかった。
HAにおけるH183LおよびV226A突然変異が、卵における6：2 A／Fujianの複製増加を実際に招いたか否かを確認するために、H183LおよびV226Aを単独で、または組み合わせてA／Fujian HAに導入し、3つの組換えウイルスを得た。FJ-H183Lについては7.4 log10PFU／ml、FJ-V226Aについては7.9 log10PFU／ml、およびFJ-H183L／V226Aについては8.4 log10PFU／mlのタイターまで増殖した（表23）。従って、H183LおよびV226Aは独立して、発育鶏卵におけるA／Fujianウイルスの改善された複製に関与した。
Figure 2011188859
受容体結合特性および組換えウイルスの複製
上記研究から、A／FujianのNA活性を減少させるNA変化は、このウイルスが卵にて増殖するのに十分であることを示した。一方、HA変化（G186VおよびV226IまたはH183LおよびV226A）が受容体結合親和性を増加させ、A／Fujianの高いNA活性を補うことができる。A／FujianのHAタンパク質における変化がその受容体結合能を増加させるか否かを決定するために、HA-V186I226変化を有する6：2 A／FujianおよびHA-L183A226変化を含む卵に適合した6：2 A／Fujianの吸着を、6：2 A／Fujian, A／Sendai、およびA／Wyomingと比較した。各ウイルスを4℃または33℃において30分間、感染効率1.0にてMDCK細胞に吸着させ、接種物を取り除き、そして感染細胞を3回洗浄するか、または洗浄しなかった。33℃における6時間のインキュベーションの後、感染細胞の割合を抗NP抗体を用いた免疫蛍光分析によって測定した。図36に示すように、吸着を4℃にて行った場合、6：2 A／FujianおよびA／Sendaiには26〜27％の細胞が感染したが、大半のウイルスは洗浄工程によって容易に除去された。33℃にて、洗浄することによって、6：2 A／Fujianウイルスの感染を非常に減少させた（37.8％に対して6.2％）が、6：2 A／Sendaiの感染には顕著な効果がなかった（51.7％に対して42.8％）。対照的に、HA-V186I226またはHA-L183A226を有する6：2 A／Wyoming、A／Fujianは、細胞を4℃または33℃にて吸着させるとか、洗浄工程の有無にかかわらず、同様の感染効率を有した。これらのデータは、A／FujianおよびA／Sendai HAが、4℃において結合したウイルスは細胞より容易に洗い流すことができるような低い結合親和性を有することを示した。結合およびウイルス侵入速度は33℃において速かったため、洗浄工程は6：2 A／Sendaiウイルス感染に最小限度の影響を与えた。しかし、大半の結合6：2 A／Fujianは、その高いNA活性が33℃において効率的なウイルス結合を妨げるために（データは示さない）、同様の条件で洗い流された。
組換えウイルスの抗原性
改変HAおよびNA残基を有するウイルスが、ウイルス抗原性に影響するか否かを調べるために、赤血球凝集阻害アッセイ（HAI）をフェレット抗A／Wyoming血清および抗A／Sendai血清を用いて行った（表24）。抗A／Wyomingフェレット血清または抗A／Sendaiフェレット血清は6：2 A／FujianウイルスまたはA／Sendaiウイルスのいずれかを用いて測定した場合、同様のHAIタイターを有した。6：2 A／Wyomingウイルスを用いた場合、やや高いHAIタイターを検出した。おそらくこれは、赤血球上の細胞受容体に対するA／Wyoming HAの堅い結合によるものである。2つの改変したウイルス（A／FujianHA-V186I226およびA／Fujian HA-L183A226）は、いずれかの血清で測定した場合、A／Wyomingと類似したHAIタイターを有した。これらの結果は、A／SendaiとA／Wyomingとの間のアミノ酸の差異および、本研究にて作製された改変HAウイルスが、ウイルス抗原性を変化させなかったことを示した。
Figure 2011188859
前述の発明は明瞭性および理解性のために詳細に記述されているが、この開示を読むことによって、本発明の真の目的を離れることなく形態および詳細において種々の変更がなされうることは、当業者にとって明らかである。例えば、上記全ての技術および装置は様々な組合せにおいて用いることができる。全ての出版物、特許、特許出願、または本願に引用されるほかの書類は、個々の出版物、特許、特許出願、または他の書類がすべての目的のために参考として援用されるためにそれぞれ示されるのと同一範囲まで、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。
特に、以下の特許出願はその全体が参考として援用される：米国仮出願第60／574,117号（2004年5月24日提出）；同上第60／578,962号（2004年6月12日提出）；同上第60／532,164号（2003年12月23日提出）；PCT出願US03／12728（2003年4月25日提出）；および米国特許出願第10／423,828号（2003年4月25日提出）。

Claims (15)

  1. リアソータントインフルエンザウイルスの回収方法であって、該方法は
    （i）リボ核タンパク質複合体を形成でき、ヘルパーウイルスの非存在下でウイルス粒子を組み立てることができるように、Vero細胞内にてゲノムまたはアンチゲノムvRNAセグメント、核タンパク質、およびRNA依存性ポリメラーゼを発現するポリヌクレオチドベクターを用いて前記Vero細胞にエレクトロポレーションすること、
    ここで、該ポリヌクレオチドベクターの少なくとも１つが、インフルエンザウイルスタンパク質のみをコードするインフルエンザウイルスのゲノムセグメントに対応するウイルスcDNAを含み、該cDNAがRNAポリメラーゼI（polI）プロモータエレメントと的確な3’末端を有するvRNAまたはcRNAの合成調節エレメントとの間に挿入されており、該エレメントがRNAポリメラーゼ II（polII）プロモータとポリアデニル化シグナルとの間に挿入されている、
    （ii）該エレクトロポレーションしたVero細胞を別の細胞型と、ウイルス複製が許容される条件下で共培養すること、および
    （iii）少なくとも９０％の回収効率で、インフルエンザウイルスを回収すること、
    を含む、前記方法。
  2. 前記Vero細胞が、無血清Vero細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記インフルエンザウイルスが好冷ウイルスである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記インフルエンザウイルスが弱毒ウイルスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記ベクターが一組のプラスミドであり、該一組のプラスミドにおける異なるプラスミドの数が８個である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ベクターが一組のプラスミドであり、該一組のプラスミドにおける異なるプラスミドの数が１２個である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記別の細胞型がCEK細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記別の細胞型がMDCK細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記インフルエンザウイルスがA型インフルエンザウイルスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ベクターがA／PR／8／34に由来する少なくとも一のvRNAセグメントを発現する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ベクターがMDV-Aに由来する少なくとも一のvRNAセグメントを発現する、請求項９に記載の方法。
  12. MDV-AがA/Ann Arbor/6/60である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記インフルエンザウイルスがB型インフルエンザウイルスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記ベクターがMDV-Bに由来する少なくとも一のvRNAセグメントを発現する、請求項１３に記載の方法。
  15. MDV-BがB/Ann Arbor/1/66である、請求項１４に記載の方法。
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