CN1904070B

CN1904070B - 一种甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN1904070B
Application number: CN2006100506803A
Authority: CN
Inventors: 严菊英; 卢亦愚; 茅海燕; 冯燕; 史雯; 周敏; 李敏红
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2006-05-10
Filing date: 2006-05-10
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2026-05-10
Also published as: CN1904070A

Abstract

本发明提供了一种甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒及其利用试剂盒检测甲1型流感病毒的方法，试剂盒包括甲1型流感病毒血凝素基因标准品、荧光扩增检测试剂以及DNA聚合酶与逆转录酶，荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，所述甲1型流感病毒血凝素基因部分序列为5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATT-3’，本发明方法可直接检测病原体核酸，在流感发病早期，就可以检测出是否含有甲1型流感病毒特异性基因，为及早隔离、确诊和治疗提供方便。

Description

一种甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

流行性感冒(流感)的临床症状易与普通感冒相混淆，最终必须通过实验室方法来进行确诊。近年来，国外开发出流感病毒快速诊断试剂盒，其原理有荧光法，酶标法，金标法等等，虽能达到快速诊断的目的，但其敏感度远低于病毒分离法，假阴性较高，加上价格昂贵，在我国实际上很少使用。流感病毒的RT-PCR检测较经典的病毒分离方法更为敏感，而且6～7 h就可得出结果，但其存在着检测易污染与假阳性率高的缺点。

近几年发展起来的荧光定量PCR技术，它利用了PCR对脱氧核糖核酸(DNA)的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量特点，不仅克服了常规PCR定性检测的不足，而且具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点。

荧光定量PCR技术原理：荧光定量PCR是利用荧光染料在激发光的作用下所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变化。因荧光信号变量与扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化荧光定量PCR仪就可以通过对荧光信号的采集与分析来实现对初始模板的定量。

常用的荧光标记方法可简单分为两大类：1、非特异检测-双链DNA内插式荧光染料；2、扩增序列专一检测-主要指荧光探针和特异性引物，荧光标记的探针共有三类：(1)分子信标探针；(2)杂交双探针；(3) Taqman双标记探针。广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5′端荧光基团的发射波长正好是3′端荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3′端荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从仪器检测出荧光值出峰的最低循环数(cyclethreshold，Ct)与检测病毒核酸量对数值呈线性负相关。根据荧光定量PCR反应中的Ct值就能算出原始的模板量。

(三)发明内容

本发明就是根据上述原理，设计适合甲1型流感病毒的特异性引物和特异性探针，发明目的在于提供一种甲1型流感病毒的基因快速检测试剂盒及检测方法。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒，包括甲1型流感病毒血凝素基因标准品、荧光扩增检测试剂以及DNA聚合酶与逆转录酶，所述荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，所述甲1型流感病毒血凝素基因部分序列为5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATT-3’，所述特异性扩增引物为：上游引物序列FluA1(YG)F3：5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGG-3’，下游引物序列FluA1(YG)R2：5’-AATTCGCATTCTGGGTTTCCT-3’，所述特异性探针序列为FluA1 PB2-3：5’FAM-AGATCCATCCGGCAACGCTGCA-TAMRA 3’，其中FAM为报告荧光基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

所述荧光扩增检测试剂主要成分如下：

一步法RT-PCR缓冲液终浓度为1×

特异性扩增上游引物 0.6～1.0μM

特异性扩增下游引物 0.6～1.0μM

特异性探针 0.2～0.6μM

脱氧三磷酸核苷混合物 400～800μM

余量为 DEPC水。

上述各物质浓度均为各物质在反应体系中的终浓度。脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合。所述的DEPC水指diethypyrocarbonate(焦碳酸二乙酯)处理过并经高温、高压消毒的MiliQ级纯水。

所述一步法RT-PCR缓冲液终浓度为1×，意思是缓冲液中各组分浓度与1×RT-PCR buffer相同，即表示缓冲液中各组分在反应液中终浓度如下：KCl 50mM，Tris-HCl 10mM，TritonX-100 0.1％，MgCl₂ 1.5mM。本发明中选用体积为反应液总体积50％的2×RT-PCR buffer。

通常，为减少RNA酶污染，所述荧光扩增检测试剂中还添加有RNA酶抑制剂，本发明中RNA酶抑制剂优选终浓度为0.8活力单位/μL的RNasin。RNasin核酸酶抑制剂是由Promega研究和开发的，具有广谱的RNA酶抑制活力，用于清除RNA酶污染。RNasin核酸酶抑制剂是1个50kD大小的蛋白，它和RNA酶以非共价键按1∶1结合，而抑制RNA酶活力，结合常数为10-14。RNasin核酸酶抑制剂的活力单位定义为抑制5ngRNase A水解2`，3`-单磷酸环化胞苷的50％的活力所用的抑制剂的量。

所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量1∶1∶1∶1的混合物。

所述DNA聚合酶用量为0.5～5酶活力单位/反应，选自下列之一：①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶；③rTth DNA聚合酶XL。

所述逆转录酶用量为6～300酶活力单位/反应，选自下列之一：①M-MuLV逆转录酶；②AMV逆转录酶。

具体的，所述荧光扩增检测试剂组成如下：

一步法RT-PCR buffer 终浓度为1×

RNA酶抑制剂RNasin 0.8活力单位/μL

特异性扩增上游引物 0.88μM

特异性扩增下游引物 0.88μM

特异性探针 0.32μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各 150μM

余量为 DEPC水。

一种甲1型流感病毒荧光扩增检测方法，所述的检测方法以甲1型流感病毒血凝素基因标准品为对照，采用待测病人的含漱液为分析样本，所述方法步骤如下：

(1)取含漱液提取病毒RNA；

(2)荧光PCR扩增检测：取荧光扩增检测试剂与反应所需的DNA聚合酶与逆转录酶配成反应液，加入对照品与分析样本的RNA分别进行扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；

(3)结果分析：选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性；

所述甲1型流感病毒血凝素基因部分序列为5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATT-3’，所述荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，所述特异性扩增引物为：上游引物序列FluA1(YG)F3：5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGG-3’，下游引物序列FluA1(YG)R2：5’-AATTCGCATTCTGGGTTTCCT-3’，所述特异性探针序列为FluA1 PB2-3：

5’FAM-AGATCCATCCGGCAACGCTGCA-TAMRA 3’，其中FAM为报告荧光基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

具体的，所述的方法取定量荧光扩增检测试剂配制反应液，反应体系每25μL组成如下：

2×RT-PCR buffer 12.5μL

RNA酶抑制剂RNasin 0.8活力单位/μL

特异性扩增上游引物 0.88μM

特异性扩增下游引物 0.88μM

特异性探针 0.32μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各 150μM

Ampli TaqR DNA聚合酶 2.5酶活力单位/反应

AMV逆转录酶 50酶活力单位/反应

分析样本病毒RNA 5μL

DEPC水补足至 25μL；

所述检测方法步骤(2)PCR循环条件设置为45℃30min逆转录，94℃变性2min，以93℃ 15s，50℃退火30sec扩增40个循环，在50℃进行单点荧光检测。退火温度适宜范围为50～55℃，退火时间适宜范围为30sec～1min。

本发明的有益效果主要体现在：

1、早期诊断：PCR可直接检测病原体核酸，在流感发病早期，就可以检测出是否含有甲1型流感病毒特异性基因，为及早隔离、确诊和治疗提供方便。

2、取样简单方便：可取潜伏期或发病早期流感患者呼吸道样本进行检测。

3、与传统的基因扩增技术相比，本发明提供的检测方法省时省力，可在2～3小时内完成检测。

4、灵敏度高，由于采用了特异性基因扩增和特异性基因探针杂交结合的双重技术，诊断的灵敏度更高。

5、采用计算机实时监测技术，在实验进程中即可判断是否含有病毒基因，且实验结果的判断方便准确。

6、可实现病毒核酸的定量分析。

(四)说明书附图

图1为荧光定量RT-PCR对甲1型流感病毒核酸检测的敏感性和重复性；

A：1000 TCID₅₀/管；B：100 TCID₅₀/管；C：10 TCID₅₀/管；D：1 TCID₅₀/管；

E：0.1 TCID₅₀/管，TCID₅₀为病毒滴度单位；

图2为荧光定量RT-PCR方法对部分甲1型流感疑似患者含漱液样本检测。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

浙江省疑似流感暴发疫情及流感监测医院送检的8份患者含漱液应用本发明TaqMan荧光定量RT-PCR方法，常规RT-PCR方法与病毒分离方法进行检测，其中病毒分离阳性5份，RT-PCR阳性6份，TaqManRT-PCR阳性7份，这三者检测的阳性患者结果一致。对于荧光RT-PCR阳性而病毒分离阴性的病例为了排除荧光RT-PCR结果假阳性的可能性，我们对患者发病早期和恢复期双份血清进行流感病毒血凝抑制抗体(HI)测定，结果甲1型流感病毒HI抗体均≥4倍增长，血清学与TaqMan RT-PCR结果完全一致。

TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系组成如下：

2×RT-PCR buffer 12.5μL

RNA酶抑制剂RNasin 0.8活力单位/μL

特异性扩增上游引物 0.88μM

特异性扩增下游引物 0.88μM

特异性探针 0.32μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各 150μM

Ampli TaqR DNA聚合酶 2.5酶活力单位/反应

AMV逆转录酶 50酶活力单位/反应

分析样本病毒RNA(1μg/μL) 5μL

DEPC水补足至 25μL；

PCR循环条件设置为45℃30min逆转录，94℃变性2min，以93℃15s，50℃退火30sec扩增40个循环，在50℃进行单点荧光检测。

敏感性和重复性实验方法：对已知病毒滴度的10⁵ TCID₅₀/ml流感病毒株甲1/北京/53/97株按10倍系列稀释成1000、100、10、1、0.1TCID₅₀ 5个梯度，每个梯度各取200μL，提取病毒RNA，进行荧光定量RT-PCR(方法同上)，对每一个浓度的样本，都重复3次，见图1。结果表明：甲1型流感荧光定量RT-PCR的敏感性为0.1TCID₅₀.通过评价每个稀释度重复三次实验的Ct值变异系数(CV)评价方法的重复性。见表1。变异系数均小于3％，说明该方法重复性良好。

表1：荧光定量RT-PCR检测甲1型流感病毒的重复性

[0081]

荧光定量RT-PCR方法对部分甲1型流感疑似患者含漱液样本检测的结果见图2。

对10⁵TCID₅₀/ml流感病毒株甲1/北京/53/97株按10倍系列稀释成1000、100、10、1、0.1、0.01 TCID₅₀，提取病毒RNA，进行荧光定量PCR，并与常规RT-PCR和病毒分离相比较。结果见表2：结果表明荧光定量RT-PCR方法检测甲1型流感病毒的敏感性，高于经典的病毒分离法，灵敏度与RT-PCR方法相一致。

表2：荧光定量RT-PCR、RT-PCR和病毒分离的检测敏感度比较

[0086] 序列表.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

<120>一种甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>75

<212>DNA

<213>Influenza A virus

<400>1

ggaatagccc cactacaatt gggtaattgc agcgttgccg gatggatgga tcttaggaaa 60

cccagaatgc gaatt 75

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

ggaatagccc cactacaatt gg 22

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

aattcgcatt ctgggtttcc t 21

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

[0123] agatccatcc ggcaacgctg ca 22

Claims

1.一种甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒，包括甲1型流感病毒血凝素基因标准品、荧光扩增检测试剂以及DNA聚合酶与逆转录酶，所述荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，其特征在于：所述甲1型流感病毒血凝素基因标准品部分序列为5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATT-3’，所述特异性扩增引物为：上游引物序列FluA1(YG)F3：5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGG-3’，下游引物序列FluA1(YG)R2：5’-AATTCGCATTCTGGGTTTCCT-3’，所述特异性探针序列为FluA1PB2-3：5’FAM-AGATCCATCCGGCAACGCTGCA-TAMRA3’，其中FAM为报告荧光基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂主要成分如下：

一步法RT-PCR缓冲液终浓度为1×

特异性扩增上游引物 0.6～1.0μM

特异性扩增下游引物 0.6～1.0μM

特异性探针 0.2～0.6μM

脱氧三磷酸核苷混合物 400～800μM

余量为DEPC水。

3.如权利要求2所述的甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂中还添加有RNA酶抑制剂。

4.如权利要求3所述的甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述RNA酶抑制剂为终浓度为0.8活力单位/μL的RNasin。

5.如权利要求1所述的甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量1∶1∶1∶1的混合物。

6.如权利要求1所述的甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶用量为0.5～5酶活力单位/反应，选自下列之一：①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶。

7.如权利要求1所述的甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述逆转录酶用量为6～300酶活力单位/反应，选自下列之一：①M-MuLV逆转录酶；②AMV逆转录酶。

8.如权利要求1所述的甲1型流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂组成如下：

2×一步法RT-PCR缓冲液终浓度为1×

RNA酶抑制剂RNasin 0.8活力单位/μL

特异性扩增上游引物 0.88μM

特异性扩增下游引物 0.88μM

特异性探针 0.32μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μM

余量为DEPC水。