CN1904069B

CN1904069B - 一种麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN1904069B
Application number: CN2006100506786A
Authority: CN
Inventors: 卢亦愚; 严菊英; 冯燕; 茅海燕; 徐昌平; 龚黎明
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2006-05-10
Filing date: 2006-05-10
Publication date: 2010-07-21
Anticipated expiration: 2026-05-10
Also published as: CN1904069A

Abstract

本发明提供了一种麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒及及其利用试剂盒检测麻疹病毒的方法，试剂盒包括麻疹病毒血凝素基因标准品、荧光扩增检测试剂以及DNA聚合酶和逆转录酶，荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，所述麻疹病毒血凝素基因标准品部分序列为5’-CCAATCAGTTCCTAGCTGTCTCAAAGGGGAACTGCTCAGGGCCCACTACAATCAGAGGTCAATTCTCAAACATGTCGCTGTCCCTG-3’，本发明方法可直接检测病原体核酸，在麻疹发病早期症状不典型时期，就可以检测出是否含有麻疹病毒特异性基因，为及早隔离、确诊和治疗提供方便。

Description

一种麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种麻疹病毒的快速基因检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

麻疹是由麻疹病毒引起的一种以发热、呼吸道症状与出疹为特征的急性传染病。自泛美卫生组织(PAHO)率先提出2000年在世界卫生组织(WHO)美洲区实现消除麻疹的战略目标以来，全球消除麻疹的活动取得了实质性的进展。为加速控制麻疹，卫生部办公厅在1998年下发了《全国麻疹监测方案(试行)》，要求除测定血清麻疹IgM抗体外，还提出用分离麻疹病毒或用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)方法来确诊麻疹病例。麻疹病毒的RT-PCR检测较经典的病毒分离方法更为敏感，而且5h～6h就可得出结果，但存在着检测易污染与假阳性率高的缺点。

近几年发展起来的荧光定量PCR技术，它利用了PCR对脱氧核糖核酸(DNA)的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量特点，不仅克服了常规PCR定性检测的不足，而且具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点。

荧光定量PCR技术原理：荧光定量PCR是利用荧光染料在激发光的作用下所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变化。因荧光信号变量与扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化荧光定量PCR仪就可以通过对荧光信号的采集与分析来实现对初始模板的定量。

常用的荧光标记方法可简单分为两大类：1、非特异检测—双链DNA内插式荧光染料；2、扩增序列专一检测—主要指荧光探针和特异性引物，荧光标记的探针共有三类：(1)分子信标探针；(2)杂交双探针；(3)Taqman双标记探针。广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5′端荧光基团的发射波长正好是3′端荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3′端荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从仪器检测出荧光值出峰的最低循环数(cyclethreshold，Ct)与检测病毒核酸量对数值呈线性负相关。根据荧光定量PCR反应中的Ct值就能算出原始的模板量。

(三)发明内容

本发明就是根据上述原理，设计适合麻疹病毒的特异性引物和特异性探针，发明目的在于提供一种麻疹病毒的基因快速检测方法。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒，包括麻疹病毒血凝素基因标准品、荧光扩增检测试剂以及DNA聚合酶和逆转录酶，所述荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，所述麻疹病毒血凝素基因标准品部分序列为5’-CCAATCAGTTCCTAGCTGTCTCAAAGGGGAACTGCTCAGGGCCCACTACAATCAGAGGTCAATTCTCAAACATGTCGCTGTCCCTG-3’，所述特异性扩增引物为：上游引物序列MV-H(YG)F：5’-CCAATCAGTTCCTAGCTGTCTCAA-3’，下游引物序列MV-H(YG)R：5’-CAGGGACAGCGACATGTTTG-3’，所述特异性探针序列为Probel：5’-FAM-AGGGCCCACTACAATCAGAGGTCA A-TAMRA-3’，其中FAM为报告荧光基团，TAMRA为淬灭荧光基团。

其特征在于所述荧光扩增检测试剂主要成分如下：

一步法RT-PCR缓冲液终浓度为1×

特异性扩增上游引物 0.1～0.7μM

特异性扩增下游引物 0.1～0.7μM

特异性探针 0.1～0.4μM

脱氧三磷酸核苷混合物 400～800μM

余量为DEPC水。

以上浓度均为各物质在反应体系中的终浓度。所述的脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合。所述的DEPC水指diethypyrocarbonate(焦碳酸二乙酯)处理过并经高温、高压消毒的MiliQ级纯水。

所述一步法RT-PCR缓冲液终浓度为1×，意思是缓冲液中各组分浓度与1×RT-PCR buffer相同，即表示缓冲液中各组分在反应液中终浓度如下：KCl 50mM，Tris-HCl 10mM，TritonX-100 0.1％，MgCl₂1.5mM。本发明中选用体积为反应液总体积50％的2×RT-PCR buffer。

通常，为减少RNA酶污染，所述荧光扩增检测试剂中还添加有RNA酶抑制剂，本发明中RNA酶抑制剂优选终浓度为0.8活力单位/μL的RNasin。RNasin核酸酶抑制剂是由Promega研究和开发的，具有广谱的RNA酶抑制活力，用于清除RNA酶污染。RNasin核酸酶抑制剂是1个50kD大小的蛋白，它和RNA酶以非共价键按1∶1结合，而抑制RNA酶活力，结合常数为10-14。RNasin核酸酶抑制剂的活力单位定义为抑制5ngRNase A水解2`，3`-单磷酸环化胞苷的50％的活力所用的抑制剂的量。

所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量1∶1∶1∶1的混合物。

所述DNA聚合酶用量为0.5-5酶活力单位/反应，选自下列之一：①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶；③rTth DNA聚合酶XL。

所述逆转录酶用量为6～300酶活力单位/反应，选自下列之一：①M-MuLV逆转录酶；②AMV逆转录酶。

所述荧光扩增检测试剂组成如下：

一步法RT-PCR buffer 终浓度为1×

RNA酶抑制剂RNasin 0.8活力单位/μL

特异性扩增上游引物 0.4μM

特异性扩增下游引物 0.4μM

特异性探针 0.2μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μM余量为DEPC水。

所述的检测方法以麻疹病毒血凝素基因标准品为对照，采用待测病人的含漱液为分析样本，所述方法步骤如下：

(1)取含漱液提取病毒RNA；

(2)荧光PCR扩增检测：取荧光扩增检测试剂与反应所需的DNA聚合酶与逆转录酶配成反应液，加入对照品与分析样本的RNA分别进行扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；

(3)结果分析：选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性；

所述麻疹病毒血凝素基因部分序列为5’-CCAATCAGTTCCTAGCTGTCTCAAAGGGGAACTGCTCAGGGCCCACTACAATCAGAGGTCAATTCTCAAACATGTCGCTGTCCCTG-3’，所述荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，所述特异性扩增引物为：上游引物序列MV-H(YG)F：5’-CCAATCAGTTCCTAGCTGTCTCAA-3’，下游引物序列MV-H(YG)R：5’-CAGGGACAGCGACATGTTTG-3’，所述特异性探针序列为Probel：5’-FAM-AGGGCCCACTACAATCAGAGGTCAA-TAMRA-3’，其中FAM为报告荧光基团，TAMRA为淬灭荧光基团。

所述的方法取定量荧光扩增检测试剂配制反应液，反应体系每25μL组成如下：

2×RT-PCR buffer 12.5μL

RNA酶抑制剂RNasin 0.8活力单位/μL

特异性扩增上游引物 0.4μM

特异性扩增下游引物 0.4μM

特异性探针 0.2μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μM

Ampli TaqR DNA聚合酶 2.5酶活力单位/反应

AMV逆转录酶 50酶活力单位/反应

分析样本病毒RNA 5μL

DEPC水补足至25μL；

所述检测方法步骤(2)PCR循环条件设置为45℃30min逆转录，94℃变性2min，以93℃ 15s，60℃退火30sec扩增40个循环，在60℃进行单点荧光检测。退火温度适宜范围为60～50℃，退火时间适宜范围为30sec～1min。

本发明的有益效果主要体现在：

1、早期诊断：PCR可直接检测病原体核酸，在麻疹发病早期症状不典型时期，就可以检测出是否含有麻疹病毒特异性基因，为及早隔离、确诊和治疗提供方便。

2、取样简单方便：可取潜伏期或发病早期麻疹患者呼吸道样本进行检测。

3、与传统的基因扩增技术相比，本发明提供的检测方法省时省力，可在2～3小时内完成检测。

4、灵敏度高，由于采用了特异性基因扩增和特异性基因探针杂交结合的双重技术，诊断的灵敏度更高。

5、采用计算机实时监测技术，在实验进程中即可判断是否含有病毒基因，且实验结果的判断方便准确。

6、可实现病毒核酸的定量分析。

(四)说明书附图

图1为荧光定量RT-PCR对麻疹病毒核酸检测的敏感度和准确性；A：1000TCID₅₀/管；B：100TCID₅₀/管；C：10TCID₅₀/管；D：1TCID₅₀/管；E：0.1TCID₅₀/管，TCID₅₀为病毒滴度单位。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

对2起麻疹暴发疫情的11份患者含漱液(采集时间为出疹后3～4天)应用本发明TaqMan荧光定量RT-PCR方法，常规RT-PCR方法与病毒分离方法进行检测，其中病毒分离阳性2份，RT-PCR阳性7份，TaqManRT-PCR阳性10份，这三者检测的阳性患者结果一致。后经出疹15天时患者血清麻疹病毒IgM抗体测定，11例患者中有10例麻疹IgM抗体显示阳性与TaqMan RT-PCR结果完全一致。

TaqMan RT-PCR反应体系如下：

2×RT-PCR buffer 12.5μL

RNA酶抑制剂RNasin 0.8活力单位/μL

特异性扩增上游引物 0.4μM

特异性扩增下游引物 0.4μM

特异性探针 0.2μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μM

Ampli TaqR DNA聚合酶 2.5酶活力单位/反应

AMV逆转录酶 50酶活力单位/反应

分析样本病毒RNA(1μg/μL) 5μL

DEPC水补足至25μL；

PCR循环条件设置为45℃ 30min逆转录，94℃变性2min，以93℃15s，60℃退火30sec扩增40个循环，在60℃进行单点荧光检测。

实施例2：

对已知病毒滴度的麻疹病毒株沪191按10倍系列稀释成1000、100、10、1、0.1TCID₅₀5个梯度，每个梯度各取200μL，提取病毒RNA，进行荧光定量PCR进行检测(方法同实施例1)，对每一个浓度的样本，都重复3次，结果见图1。荧光定量PCR反应体系组成同实施例1。结果表明：麻疹病毒荧光定量RT-PCR的敏感性为0.1TCID₅₀。

通过评价每个稀释度重复三次实验的Ct值变异系数(CV)评价方法的重复性，结果见表1。变异系数均小于3％，说明该方法重复性良好。

表1 荧光RT-PCR检测麻疹病毒的重复性

对麻疹病毒株沪191按10倍系列稀释成1000、100、10、1、0.1TCID₅₀，提取病毒RNA，应用进行荧光定量PCR，并与常规RT-PCR方法与病毒分离方法进行比较，结果见表2：结果表明荧光定量RT-PCR方法检测麻疹病毒的敏感性，高于经典的病毒分离法和RT-PCR方法。

表2：荧光RT-PCR、常规RT-PCR和病毒分离的敏感性比较

序列表.WorkFile

Application Project

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<120>Title：一种麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法

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SequenceName：麻疹病毒血凝素基因

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SequenceName：上游引物MV-H(YG)F

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SequenceName：下游引物MV-H(YG)R

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序列表.WorkFile

<212>Type：RNA

SequenceName：特异性探针Probel

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Claims

1.一种麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒，包括麻疹病毒血凝素基因标准品、荧光扩增检测试剂以及DNA聚合酶和逆转录酶，所述荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，其特征在于：所述麻疹病毒血凝素基因标准品部分序列为

5’-CCAATCAGTTCCTAGCTGTCTCAAAGGGGAACTGCTCAGGGCCCACTACAATCAGAGGTCAATTCTCAAACATGTCGCTGTCCCTG-3’，所述特异性扩增引物为：上游引物序列MV-H(YG)F：5’-CCAATCAGTTCCTAGCTGTCTCAA-3’，下游引物序列MV-H(YG)R：5’-CAGGGACAGCGACATGTTTG-3’，所述特异性探针序列为Probe 1：5’-FAM-AGGGCCCACTACAATCAGAGGTCAA-TAMRA-3’，其中FAM为报告荧光基团，TAMRA为淬灭荧光基团。

2.如权利要求1所述的麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂主要成分如下：

一步法RT-PCR缓冲液终浓度为1×

特异性扩增上游引物 0.1～0.7μM

特异性扩增下游引物 0.1～0.7μM

特异性探针 0.1～0.4μM

脱氧三磷酸核苷混合物 400～800μM

余量为DEPC水。

3.如权利要求2所述的麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂中还添加有RNA酶抑制剂。

4.如权利要求3所述的麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述RNA酶抑制剂为终浓度为0.8活力单位/μL的RNasin。

5.如权利要求1所述的麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量1∶1∶1∶1的混合物。

6.如权利要求1所述的麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶用量为0.5～5酶活力单位/反应，选自下列之一：

①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶；③rTth DNA聚合酶XL。

7.如权利要求1所述的麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述逆转录酶用量为6～300酶活力单位/反应，选自下列之一：①M-MuLV逆转录酶；②AMV逆转录酶。

8.如权利要求2所述的麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂组成如下：

2×RT-PCR buffer 终浓度为1×

RNA酶抑制剂RNasin 0.8活力单位/μL

特异性扩增上游引物 0.4μM

特异性扩增下游引物 0.4μM

特异性探针 0.2μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μM余量为DEPC水。