CN111378729B

CN111378729B - 大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒

Info

Publication number: CN111378729B
Application number: CN202010251912.1A
Authority: CN
Inventors: 孙万平; 陶静; 韩蓉; 丁威
Original assignee: Suzhou Prim Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Prim Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2040-04-01
Also published as: CN111378729A

Abstract

本发明公开了一种大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒，包括2×Taq master Mix、无菌去离子水、引物LC01490和LC02198、引物COI924F和COI924R；通过大黄䗪虫丸中成药的DNA提取、COI通用引物对大黄䗪虫丸中成药DNA的PCR扩增、COI924引物对COI通用引物PCR产物进行二轮扩增、扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测、扩增产物Sanger测序、对测序结果峰图采用seqman软件进行序列拼接，将拼接后的DNA序列在NCBI中用BLAST相似性搜索，同时与相似性搜索分值较高的水蛭品种进行单独COI序列的比对，完成大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定。本发明试剂盒提高了PCR检测的敏感性和特异性，从而可以实现对多种正伪品水蛭的鉴定，为简便快速的方法，填补了大黄䗪虫丸水蛭成分质量控制的空白。

Description

大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒

技术领域

本发明属于大黄䗪虫丸中成药水蛭种属鉴定技术，更具体的说是采用大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒对大黄䗪虫丸中成药的DNA进行扩增后，对扩增产物测序鉴定水蛭种属的一种方法。

背景技术

大黄䗪虫丸是一种由熟大黄、土鳖虫、水蛭、虻虫、蛴螬（炒）、干漆、桃仁、苦杏仁、黄芩、地黄、白芍、甘草等按一定剂量混合而制成的处方药。其功能主治活血破瘀，通经消症瘕。用于瘀血内停所致的症瘕、闭经，盆腔包块、子宫内膜异位症、继发性不孕症，症见腹部肿块、肌肤甲错、面色黯黑、潮热羸瘦、经闭不行。

水蛭作为大黄䗪虫丸臣药之一，其功能主治破血通经，逐瘀消症。用于血瘀经闭，症瘕痞块，中风偏瘫，跌扑损伤。迄今为止医学研究的水蛭越来越多，但是中国药典（2015版）收录的药用水蛭只有宽体金线蛭（Whitmania pigra）、柳叶蚂蟥（Whitmaniaacranulata）和日本医蛭（Hirudo nipponia）。近年来随着水蛭中药制剂的不断开发，水蛭已成为畅销中药材之一。随之而来的是水蛭伪品比如菲牛蛭、石蛭等在市场流通，急需建立一种快速简便通用的方法对水蛭真伪进行鉴定，加强对大黄䗪虫丸中成药的质量控制，确保临床用药安全。

目前水蛭的鉴定方法主要依赖于性状鉴定，但存在鉴定结果准确度存疑且对鉴定人员专业性要求高的缺陷。同时，大黄䗪虫丸中成药中的水蛭是经过多次加工，无法通过性状鉴定水蛭的真伪。目前，随着分子生物学技术的发展，分子生物学鉴定方法已经越来越成为水蛭真伪鉴定的主要手段，其中以DNA条形码技术最为常见。DNA条形码技术就是利用生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段对物种鉴定的分子诊断新技术, 而“大黄䗪虫丸”中成药中的药材是经过加工处理的，其DNA片段碎片化，且水蛭含量低，不能被通用引物扩增出来，同时大黄䗪虫丸中成药中含有四味动物药材，其也可以被通用引物扩增出目的片段，常规的DNA条形码技术不能实现对大黄䗪虫丸中水蛭成分的定向鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种PCR方法联合Sanger测序技术对“大黄䗪虫丸”中的水蛭正、伪品的鉴定。本发明采用新的PCR方法扩增大黄䗪虫丸DNA，然后对PCR扩增产物进行测序，通过对测序结果在NCBI数据库中进行比对鉴定水蛭真伪。

本发明采用以下技术方案：

大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒，包括第一轮PCR扩增引物LC01490和LC02198、第二轮扩增引物COI924F和COI924R。

大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用引物，包括第一轮PCR扩增引物LC01490和LC02198、第二轮扩增引物COI924F和COI924R。

上述大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒或者大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用引物在大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定中的应用。

上述技术方案中，所述大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒还包括2×Taq master Mix、无菌去离子水，2×Taq master Mix为现有产品，属于常规技术手段，其不会影响本发明技术效果的实现。

利用本发明大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒进行大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定时，操作方法包括以下步骤：提取大黄䗪虫丸的DNA作为模板，然后进行两轮PCR扩增，然后将PCR反应液测序；再将测序峰图进行序列拼接后在NCBI数据库中进行比对，完成大黄䗪虫丸中水蛭的检测及正伪品鉴定。

上述技术方案中，将大黄䗪虫丸在水中粉碎后离心处理，将沉淀物用无菌水洗涤后用DNA 抽提试剂盒提取DNA，完成大黄䗪虫丸DNA的提取。

上述技术方案中，两轮PCR扩增中，第一轮PCR扩增的引物为LC01490和LC02198，第二轮扩增的引物为COI924F和COI924R；引物对扩增结果有决定影响，本发明创造性的设计第二轮扩增的引物，可以成功鉴别出宽体金线蛭、菲牛蛭、石蛭、棒纹牛蛭和日本医蛭5种水蛭，可用于“大黄䗪虫丸”中水蛭的正伪品的鉴定；结合第一轮PCR扩增的引物，首次公开了可以检测十四种大黄䗪虫丸样品，最后结合测序技术对扩增产物的分析，实现了对中成药“大黄䗪虫丸”中动物药材水蛭的2种正品和3种最常见伪品的鉴定，解决了现有技术没有针对中药材尤其是DNA片段碎片化“大黄䗪虫丸”中成药水蛭鉴定方法的缺陷。

上述技术方案中，第一轮PCR扩增为25 μL反应体系，优选的，模板1μL，浓度为10-50 ng/μL；第二轮PCR扩增为25 μL反应体系，优选的，第一轮PCR反应液为1μL。

上述技术方案中，第一轮PCR扩增的程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min。

上述技术方案中，第二轮PCR扩增的程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min。

本发明所述方法涉及的引物序列如下：LC01490为GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；LC02198为TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA；COI924 F为GCTAAAACTGGTAATGATAA；COI924R为TAATTGGTGGGTTTGGTAA

本发明公开的大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒可以有效的扩增出大黄䗪虫丸中成药中水蛭DNA序列，且操作简便，快速，灵敏。同时联合Sanger测序技术对扩增产物测序，将测序结果通过NCBI数据库中BLAST比对，可以有效鉴定出大黄䗪虫丸中成药中水蛭真伪。

附图说明

图1为大黄䗪虫丸基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果；

图2为本发明PCR对14份大黄䗪虫丸扩增结果；

图3为本发明PCR对9份干药材扩增结果；

图4为对比例PCR对7份水蛭干药材扩增结果。

实施方式

本发明公开的大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒进行大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定的方法如下：提取大黄䗪虫丸的DNA作为模板，然后进行两轮PCR扩增，然后将PCR反应液测序；再将测序峰图进行序列拼接后在NCBI数据库中进行比对，完成大黄䗪虫丸中水蛭的检测及正伪品鉴定。

上述步骤中首先使用无菌去离子水将大黄䗪虫丸成药于1.5ml离心管中泡软，后采用组织粉碎仪将成药打碎。取成药溶液（离心后沉淀大约在1.5ml离心管0.1ml位置处）离心，再用无菌去离子水洗后，采用生工柱式深加工产品基因组 DNA 抽提试剂盒（B518264-0050）提取DNA，消化酶消化2h。

上述步骤中PCR扩增首先是使用LC01490和LC02198对大黄䗪虫丸成药的DNA进行第一轮PCR。扩增反应在（杭州朗基A300）PCR仪上进行，反应体系25 μL包括：2×Taq masterMix 12.5 μL，COI基因通用引物上下游引物10 μM各1 μL，大黄䗪虫丸成药DNA模板（10-50ng/μL）1 μL，无菌去离子水补至25 μL。扩增反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min。实验中同时设置不加模板的阴性对照。

随后采用自行设计的能够鉴别宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭、石蛭的引物即COI924对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR，反应体系25 μL包括：2×Taq masterMix 12.5 μL，COI924上下游引物10 μM各1 μL，第一轮PCR反应液1 μL，无菌去离子水补至25 μL。扩增反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min。实验中同时设置不加模板的阴性对照。PCR产物经用2%琼脂糖凝胶电泳分析，在120v、200mA 条件下进行凝胶电泳30min。然后将凝胶在凝胶成像系统300nm光源下，通过调节变焦、对焦、光圈进行扫描并分析。产物大小在400bp左右。上述步骤中PCR反应测序是将第二轮PCR扩增产物送去金维智测序，采用正反向引物正反向测序后，测序峰图采用seqman软件进行序列拼接，后在NCBI数据库中进行比对，同时与相似性搜索分值较高的水蛭品种进行单独COI序列的比对，判断水蛭品种，为常规技术。

实验所用9份水蛭干药材均来自苏州市药品检验检测中心，中成药大黄䗪虫丸14份也均由苏州市药品检验检测中心收集提供，涉及的试剂为现有产品，除了引物；扩增反应在（杭州朗基A300）PCR仪上进行。

本发明大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒包括2×Taq master Mix、无菌去离子水、引物LC01490和LC02198、引物COI924F和COI924R；引物序列如下：

实施例一大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒对大黄䗪虫丸成药中水蛭的检测与鉴定

1. 首先使用无菌去离子水分别将14份大黄䗪虫丸成药于1.5ml离心管中泡软，后采用组织粉碎仪将成药打碎，取成药溶液离心，离心后沉淀大约在1.5ml离心管0.1ml位置处有沉淀物，将沉淀物再用无菌去离子水洗两遍后，采用生工柱式深加工产品基因组 DNA抽提试剂盒（苏州普瑞德生物科技有限公司，B518264-0050）提取DNA，其中消化酶消化2h，得到大黄䗪虫丸DNA。由于中成药经过多种工艺加工，其组成成分的DNA碎片化，大黄䗪虫丸提取的DNA片段集中在450bp以下，见图1，泳道1-6为其中6份大黄䗪虫丸（YP0295、YP0163、YP0253、YP0284、YP0226、YP0194）基因组DNA电泳结果，泳道M为1000bp的marker。

2. 分别以上述提取的大黄䗪虫丸DNA为模板，以引物LC01490和LC02198对大黄䗪虫丸成药DNA进行第一轮PCR，反应体系25 μL包括：2×Taq master Mix 12.5 μL，COI基因通用引物上下游引物10 μM各1 μL，大黄䗪虫丸成药DNA模板（稀释成50 ng/μL）1 μL，无菌去离子水补至25 μL。扩增反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1min，循环40次；最后72℃延伸5 min，得到第一轮PCR产物，实验中同时设置不加模板的阴性对照，PCR产物经用2%琼脂糖凝胶电泳分析，在120v，200mA 条件下进行凝胶电泳30min；然后将凝胶在凝胶成像系统300nm光源下，通过调节变焦、对焦、光圈进行扫描并分析，具体为常规技术。对中药制剂大黄䗪虫丸中水蛭成分的鉴定无法通过采用COI通用引物对其DNA扩增测序实现。

吸取1 μL第一轮PCR产物（14份）分别作为模板，以COI924F和COI924R为上下游引物进行第二轮扩增。第二轮PCR体系25 μL为：2×Taq master Mix 12.5 μL，COI924引物上下游引物10 μM各1 μL，第一轮PCR产物1 μL，无菌去离子水补至25 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min。PCR产物经用2%琼脂糖凝胶电泳分析，在120v，200mA 条件下进行凝胶电泳30min；然后将凝胶在凝胶成像系统300nm光源下，通过调节变焦、对焦、光圈进行扫描并分析，具体为常规技术，产物大小在400bp左右，检测结果琼脂糖凝胶电泳出现明显的扩增条带，见图2，泳道1-14分别对应14份大黄䗪虫丸PCR扩增结果，顺序见表1；泳道N为不加模板的阴性对照；泳道M为100bp的marker。

3. 第二轮PCR产物经苏州金维智公司正反向测序后，峰图采用seqman软件进行序列拼接。将拼接后的DNA序列在NCBI数据库中用BLAST相似性搜索，同时与相似性搜索分值较高的品种进行单独COI序列的比对。测序结果如说明书核苷酸和氨基酸序列表中显示：

序列5~10 分别是YP0295、YP0163、YP0252、YP0193、YP0253、YP0239；

序列11~16 分别是YP0284、YP0279、YP0142、YP0226、YP0049、YP0194；

序列17 YP0157、序列18 YP0202。

测序比对结果见表1，14份大黄䗪虫丸成药中共有5份被检出含有伪品水蛭包括菲牛蛭和石蛭。

表1 大黄䗪虫丸成药水蛭PCR鉴定结果

实施例二大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒对水蛭干药材的检测与鉴定

1. 使用天根组织破碎仪分别将9份水蛭干药材（B、C、I、O、U、W、X、VYZ2、VYZ1）打碎成粉末，各取0.1 g左右，分别采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（苏州普瑞德生物科技有限公司）提取水蛭干药材总DNA，其中消化酶消化2h，得到水蛭干药材DNA，9份。

2. 分别以上述提取的水蛭干药材总DNA为模板，以引物LC01490和LC02198进行第一轮PCR，反应体系25 μL包括：2×Taq master Mix 12.5 μL，COI基因通用引物上下游引物10 μM各1 μL，水蛭干药材DNA模板（稀释成50 ng/μL）1 μL，无菌去离子水补至25 μL。扩增反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min 30s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min，得到第一轮PCR产物；

吸取1 μL第一轮PCR产物（9份）分别作为模板，以COI924F和COI924R为上下游引物进行第二轮扩增。第二轮PCR体系25 μL为：2×Taq master Mix 12.5 μL，COI924引物上下游引物10 μM各1 μL，第一轮PCR产物1 μL，无菌去离子水补至25 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min。PCR产物经用2%琼脂糖凝胶电泳分析，在120v，200mA 条件下进行凝胶电泳30min；然后将凝胶在凝胶成像系统300nm光源下，通过调节变焦、对焦、光圈进行扫描并分析，具体为常规技术，产物大小在400bp左右，检测结果琼脂糖凝胶电泳出现明显的扩增条带，见图3（泳道1-9分别对用干药材C, I, O, U, VYZ2, W, X, VYZ1, B）,测序比对结果过见表2。

表2 COI通用引物与PCR对水蛭干药材鉴定结果比对

上述实验中所采用的9种水蛭干药材经药检所专业人员进行了性状鉴定，并通过COI通用引物（引物LC01490和LC02198）PCR扩增、测序验证，包含宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、石蛭和棒纹牛蛭这五种水蛭。采用本发明设计的COI924水蛭特异性通用引物，通过PCR对9种干药材扩增、测序后，与传统的基于线粒体COI序列的DNA条形码技术对水蛭的鉴定结果相比，两种方法的鉴定结果一致（表2），可以成功鉴别出宽体金线蛭、菲牛蛭、石蛭、棒纹牛蛭和日本医蛭5种水蛭。因此，本发明的COI924水蛭特异性通用引物可用于“大黄䗪虫丸”中水蛭的正伪品的鉴定。

COI通用引物扩增序列结果如说明书核苷酸和氨基酸序列表中显示：

序列19~27 分别是宽体金线蛭1 B、菲牛蛭2 W、3 X、石蛭4 C、5 U、6 O、7 I、棒纹牛蛭8 VYZ2、日本医蛭9 VYZ1。

本发明PCR方法对水蛭干药材扩增测序结果如说明书核苷酸和氨基酸序列表中显示：

序列28~36 分别是：宽体金线蛭1 B、菲牛蛭2 W、3 X、石蛭4 C、5 U、6 O、7 I、棒纹牛蛭8 VYZ2、日本医蛭9 VYZ1。

对比例一

1. 使用天根组织破碎仪分别将7份水蛭干药材（B、C、I、U、W、X、VYZ2，表2）打碎成粉末，各取0.1 g左右，分别采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（苏州普瑞德生物科技有限公司）提取水蛭干药材总DNA，其中消化酶消化2h，得到水蛭干药材DNA，7份。

2. 分别以上述提取的水蛭干药材总DNA为模板，以引物LC01490和LC02198进行第一轮PCR，反应体系25 μL包括：2×Taq master Mix 12.5 μL，COI基因通用引物上下游引物10 μM各1 μL，水蛭干药材DNA模板（稀释成50 ng/μL）1 μL，无菌去离子水补至25 μL。扩增反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min 30s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min，得到第一轮PCR产物，产物大小在650bp左右；

3. 吸取1 μL第一轮PCR产物（7份）分别作为模板，以COIAF（AGATGAGGCACCAGCTATATGT）和COIAR（ACGTGATCAGCTATGTTAGGCT）为上下游引物进行第二轮扩增。扩增反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min，完成第二轮PCR。

PCR产物经用2%琼脂糖凝胶电泳分析，在120v，200mA 条件下进行凝胶电泳30min；然后将凝胶在凝胶成像系统300nm光源下，通过调节变焦、对焦、光圈进行扫描并分析，具体为常规技术，检测结果琼脂糖凝胶电泳见图4（泳道1-7对应的水蛭干药材依次为B、C、I、U、W、X、VYZ2），测序结果如说明书核苷酸和氨基酸序列表中显示：

序列39~42 分别是：C（实际为石蛭，COIA引物PCR测序结果为宽体金线蛭）、I（实际为石蛭，COIA引物PCR测序结果为宽体金线蛭）、U（实际为石蛭，COIA引物PCR测序结果为菲牛蛭）、W（实际为菲牛蛭，COIA引物PCR测序结果为宽体金线蛭）。

PCR二轮使用引物为COIA引物时，虽然水蛭干药材均能扩增出目的条带（400bp左右），但是部分扩增产物测序结果与实际样品品种结果不一致。如C和I实际为石蛭，COIA引物PCR测序结果错误的鉴定为宽体金线蛭；U实际为石蛭，COIA引物PCR测序结果错误的鉴定为菲牛蛭；W实际为菲牛蛭，COIA引物PCR测序结果错误的鉴定为宽体金线蛭。因此，二轮引物对检测结果具有决定的影响。

对比例二

1. 首先使用无菌去离子水分别将14份大黄䗪虫丸成药（实施例一）于1.5ml离心管中泡软，后采用组织粉碎仪将成药打碎，取成药溶液离心，离心后沉淀大约在1.5ml离心管0.1ml位置处有沉淀物，将沉淀物再用无菌去离子水洗两遍后，采用生工柱式深加工产品基因组 DNA 抽提试剂盒（苏州普瑞德生物科技有限公司，B518264-0050）提取DNA，其中消化酶消化2h，得到大黄䗪虫丸DNA。

2. 分别以上述提取的大黄䗪虫丸DNA为模板，以引物LC01490和LC02198对大黄䗪虫丸成药DNA进行第一轮PCR，反应体系25 μL包括：2×Taq master Mix 12.5 μL，COI基因通用引物上下游引物10 μM各1 μL，大黄䗪虫丸成药DNA模板（稀释成50 ng/μL）1 μL，无菌去离子水补至25 μL。扩增反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1min，循环40次；最后72℃延伸5 min，得到第一轮PCR产物；吸取第一轮PCR产物1 μL，COI基因通用引物上下游引物10 μM各1 μL，2×Taq master Mix 12.5 μL，用无菌去离子水补齐至25 μL，进行二轮PCR，扩增反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1min，循环40次；最后72℃延伸5 min，得到第二轮PCR产物；实验中同时设置不加模板的阴性对照，PCR产物经用2%琼脂糖凝胶电泳分析，在120v，200mA 条件下进行凝胶电泳30min；然后将凝胶在凝胶成像系统300nm光源下，通过调节变焦、对焦、光圈进行扫描并分析，具体为常规技术，琼脂糖凝胶电泳上显现为弥散性条带，无特异性条带。

本发明PCR方法对水蛭品种的鉴定通过扩增产物的Sanger测序，将测序结果在NCBI数据库中比对确定水蛭品种，为了确保鉴定准确性，本发明通过9种干药材COI通用引物PCR扩增和测序结果，建立5了五种水蛭COI数据库，用于本研究的中成药鉴定结果的序列比对。

此外，中国药典中规定的水蛭抗凝血酶活性测定来鉴定水蛭真伪的方法，对于水蛭干药材的鉴定可能尚能适用，但是对于已加工的这14份中成药，结果显示，正品宽体金线蛭的凝血酶活性在2.8-39.1/U，而伪品菲牛蛭和石蛭凝血酶活性在2.9-27.8/U，因此，该药典方法无法实现中成药中水蛭正伪品的鉴定。这也是本发明具有重要意义的所在，本发明首次公开了可以有效鉴定中成药中水蛭正伪品的方法，填补了现有技术这该领域的空白。

因此，本发明建立了新的PCR方法，旨在提高PCR检测的敏感性和特异性。PCR的第一轮PCR引物为COI通用引物，该引物至少可扩增出土鳖虫、水蛭、虻虫、蛴螬这四种动物药相应的COI序列，而且扩增片段大小基本一致；为针对性的鉴定“大黄䗪虫丸”中水蛭种属的正伪品，本发明创造性的设计第二轮PCR扩增所使用的引物，在COI引物的扩增产物内，可以对“大黄䗪虫丸”中的水蛭成分进行扩增，能够检测十四种大黄䗪虫丸样品，最后结合测序技术对扩增产物的分析，实现了对中成药“大黄䗪虫丸”中动物药材水蛭的2种正品和3种最常见伪品的鉴定。

序列表

<110> 苏州普瑞姆生物科技有限公司

<120> 大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctaaaactg gtaatgataa 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taattggtgg gtttggtaa 19

<210> 5

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaattggtg gggtttggta attgactttt accattaata attggtgccc cagatatagc 60

ttttcctcga ttaaataatt ttaggttttg attacttcca ccatcattaa ctatattggt 120

aagatcatca atagttgaaa atggtgttgg tacaggatga actatttatc cgccattagc 180

tgatagcatt tctcattcag ggccatgtgt agatatagct attttttcat tacatatagc 240

tggtgcatct tctattttag gttctttaaa ttttatttct actattgtta atatacgaac 300

taagggaata ggaaatgaac gagttccatt atttgtttga tctgtagtaa ttactactat 360

tttattatta ttatcattac crgttttagc a 391

<210> 6

<211> 380

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taattggtgg ggtttggtaa ttgactccta ccattaatgg taggggccgt agatatatcg 60

tttcctcgtc tgaataactt aagattttgg ttactacccc cttcaataat catattgctt 120

aggtcatcct taattgaggg tggtgtaggt gcagggtgaa ccctttatcc tccactatca 180

gactccgtat ctcattcagg cccatccgtt gacatagcca tcttttcatt acatatagct 240

ggtgcctcat ctattttagg gtcattaaat tttatttcga ctattataaa tatacgaact 300

aaaggaataa caactgaacg agtaccatta tttgtttggt cagttgttat tactactatt 360

ttattattgt tatcattacc 380

<210> 7

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttaattggtg gggtttggta attgactcct accattaatg gtaggggccg tagatatatc 60

gtttcctcgt ctgaataact taagattttg gttactaccc ccttcaataa tcatattgct 120

taggtcatcc ttaattgagg gtggtgtagg tgcagggtga accctttatc ctccactatc 180

agactccgta tctcattcag gcccatccgt tgacatagcc atcttttcat tacatatagc 240

tggtgcctca tctattttag ggtcattaaa ttttatttcg actattataa atatacgaac 300

taaaggaata acaactgaac gagtaccatt atttgtttgg tcagttgtta ttactactat 360

tttattattg ttatcattac agttttagca 390

<210> 8

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttaattggtg ggtttggtaa ttgactccta ccattaatgg taggggccst agatatatcg 60

tttctcgatc tgaataactt aagattttga gttactaccc ccttcaataa tcatattgct 120

taggtcatcc ttaattgagg gtggtgtagg tgcagggtga accctttatc ctccactatc 180

agactccgta tctcattcag gcccatccgt tgacatagcy atcttttcat tacatatagc 240

tggtgcctca tctattttag ggtcattaaa ttttatttck actattataa atatacgaac 300

taaaggaata acaactgaac gagtaccatt atttgtttgg tcagttgtta ttactactat 360

tttattattg ttatcattac aggttttagc a 391

<210> 9

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaattggtg gggtttggta attgactcyt accattaatg gtaggggccg tagatatatc 60

gtttcctcgt atgaataact taagattttg gttactaccc ccttcaataa tcatattggt 120

taggtcatcc ttaattgaaa awggtgtagg ggcagggtga aaccytttat cctccmwtat 180

cagactccrt atctcattca ggcccatscg ttgacatagc yatcttttca ttacatatag 240

ctggtgcctc atctatttta gggtcattaa attttatttc kactattrta aatatacgaa 300

ctaaaggaat aacaamtgaa cgagtaccat tatttgtttg rtcagttgtt attactacta 360

ttttattatt gttatcatta cagttttagc a 391

<210> 10

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaattggtg ggtttggtaa ttgactttta ccattaataa ttggtgcccc agatatagct 60

tttcctcgat taaataattt taggttttga ttacttccac catcattaac tatattggta 120

agatcatcaa tagttgaaaa tggtgttggt acaggatgaa ctatttatcc gccattagct 180

gatagcattt ctcattcagg gccatgtgta gatatagcta ttttttcatt acatatagct 240

ggtgcatctt ctattttagg ttctttaaat tttatttcta ctattgttaa tatacgaact 300

aagggaatag gaaatgaacg agttccatta tttgtttgat ctgtagtaat tactactatt 360

ttattattat tatcattacc agttttagca 390

<210> 11

<211> 389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taattggtgg gtttggtaat tgactcctac cattaatggt aggggccgta gatatatcgt 60

ttcctcgtct gaataactta agattttggt tactaccccc ttcaataatc atattgctta 120

ggtcatcctt aattgagggt ggtgtaggtg cagggtgaac cctttatcct ccactatcag 180

actccgtatc tcattcaggc ccatccgttg acatagccat cttttcatta catatagctg 240

gtgcctcatc tattttaggg tcattaaatt ttatttckac tattataaat atacgaacta 300

aaggaataac aactgaacga gtaccattat ttgtttggtc agttgttatt actactattt 360

tattattgtt atcattacca gttttagca 389

<210> 12

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttaattggtg ggtttggtaa ttgactccta ccattaatgg taggggccgt agatatatcg 60

tttcctcgtc tgaataactt aagattttgg ttactacccc cttcaataat catattgctt 120

aggtcatcct taattgaggg tggtgtaggt gcagggtgaa ccctttatcc tccactatca 180

gactccgtat ctcattcagg cccatccgtt gacatagcca tcttttcatt acatatagct 240

ggtgcctcat ctattttagg gtcattaaat tttatttcga ctattataaa tatacgaact 300

aaaggaataa caactgaacg agtaccatta tttgtttggt cagttgttat tactactatt 360

ttattattgt tatcatta 378

<210> 13

<211> 392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttaattggtg ggtttggtaa ttgactcctg ccattaatgg taggagccgt agatatatca 60

tttcctcgat ctgaataatt taagattttg gttactaccc ccttcaataa tcatattgct 120

takgtcatct ttaattgagg gtggtgtagg tgcagggtga accctttatc ccccactatc 180

akactccgta tctcattcag gmccatccgt tgacatagcc atcttctcat tacatatagc 240

tggtgcctca tctattttag ggtcattaaa ttttatttck actattataa atatacgaac 300

taaagggata acaactgaca cgartaccat tatttgtttg gtcagttgtt attactacta 360

ttttattatt attatcatta ccggttttag ca 392

<210> 14

<211> 389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttaattggtg ggtttggtaa ttgactttta ccattaataa ttggtgcccc agatatagmt 60

tttcctcgat taaataattt taggttttga ttacttcccc atcattaact atattggtaa 120

gatcatcaat agttgaaaat ggtgtwggta caggatgaac tatttatccg ccattagctg 180

atagcatttc tcattcaggr ccatgtgtag atatagctat yttttcatta catatagctg 240

gtgcatcttc tattttaggt tcwttaaatt ttatttctac tattgtwaat atacgaacta 300

arggaatarg aaatgaacga gttccattat ttgtttgatc tgtagtaatt actactattt 360

tattattatt atcattaccg gttttagca 389

<210> 15

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttaattggtg ggtttggtaa ttgattaatt cctttaataa ttggtgcacc agatatagca 60

ttycctcgac ttaataacct aagattttga ttaytacccc catcaataat tatrttagtt 120

ttttctgcat ttgtagaaaa tggtgtaggr actggatgaa cagtataccc tccattagca 180

tataatattg cccattcygg accatcrgta gatatrgcta tyttctcgtt acatttagca 240

ggagcgtcat ctattttagg ctcrttaaac tttatctcya ctgtagcaaa tatacgatga 300

aaaggtataa cattagaccg ratyccttta tttatttgat cagtagttat tactaccgta 360

ctacttctat tatcattacc gttttagcan 390

<210> 16

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttaattggtg gggtttggta attgattaat tccattaata attggwgcac cagatatagc 60

attyyctcgw cttrataacy tragattttg attactaccc ccatcaataa ttatattagt 120

tttttcwgca ttwgtwgaaa rtggtgtagg gacwggatga acagtatayc ctccattakc 180

akataatatt kcycattcmg gaccatcsgt agatatagct atcttctcrt tacatwtagc 240

aggagcvtca tctattttag gsgtcattaa actttatctc tactrtarca aatatacgat 300

gaaaaggtat aacattagac cgaatccctt tatttatttg atcagtagtt attactaccg 360

tactacttct attatcatta ccagttttag c 391

<210> 17

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttaattggtg gggtttggta attgactcct accattaatg gtaggggccg tagatatatc 60

gtttcctcgt ctgaataact taagattttg gttactaccc ccttcaataa tcatattgct 120

taggtcatcc ttaattgagg gtggtgtagg tgcagggtga accctttatc ctccactatc 180

agactccgta tctcattcag gcccatccgt tgacatagcc atcttttcat tacatatagc 240

tggtgcctca tctattttag ggtcattaaa ttttatttcg actattataa atatacgaac 300

taaaggaata acaactgaac gagtaccatt atttgtttgg tcagttgtta ttactactat 360

tttattattg ttatcatta 379

<210> 18

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

taattggtgg gtttggtaat tgactcatta ccattaatgg taggagccgt agatatatcg 60

tttcctcgat ctgaataatt taagattttg gttactaccc ccttcaataa tcatattgst 120

takgtcatcm ttaattgagg gkggtgtagg tgcagggtga accctttatc ctccaytatc 180

agactcygta tctcattcag gmccatccgt tgacatagcc atcttttcat tacatatagc 240

atggtgcstc atctatttta ggatcattaa attttatttc kactattata aatatacgaa 300

ctaaaggaat aacaamtgaa cgartaccat tatttgtttg gtcagttgtt attactacta 360

ttttattatt gttatcatta ccagttttag c 391

<210> 19

<211> 682

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aaagatattg gtactttata ctttatttta ggaacgtgat cagctatgtt aggctcttct 60

ataagatcaa ttattcgaat tgaattagca cagccaggaa gattccttgg agacgaccaa 120

ttgtataatt cactagtaac ggctcatggg ttggttataa tcttctttat agttatacca 180

attctaattg gtgggtttgg taattgactc ctgccattaa tggtaggagc cgtagatata 240

tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt tggttactac ccccttcaat aatcatattg 300

cttaggtcat ctttaattga gggtggtgta ggtgcagggt gaacccttta tcccccacta 360

tcagactccg tatctcattc aggcccatcc gttgacatag ccatcttctc attacatata 420

gctggtgcct catctatttt agggtcatta aattttattt cgactattat aaatatacga 480

actaaaggga taacaactga acgagtacca ttatttgttt ggtcagttgt tattactact 540

attttattat tattatcatt accagtttta gcagcagcta ttacaatatt acttacagat 600

cgaaatttaa atactacttt ctttgaccct ataggagggg gggatcctat tttgtttcaa 660

catttatttt gattttttgg tc 682

<210> 20

<211> 694

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaccaaaaaa tcaaaataag tgctgaaaca atactggatc tccaccacct atagggtcaa 60

agaatgaagt atttaaatta cggtcagtta ataatattgt aatagctgct gctaatactg 120

gtaatgataa taataataaa atagtagtaa ttactacaga tcaaacaaat aatggaactc 180

gttcatttcc tattccctta gttcgtatat taacaatagt agaaataaaa tttaaagaac 240

ctaaaataga agatgcacca gctatatgta atgaaaaaat agctatatct acacatggcc 300

ctgaatgaga aatgctatca gctaatggcg gataaatagt tcatcctgta ccaacaccat 360

tttcaactat tgatgatctt accaatatag ttaatgatgg tggaagtaat caaaacctaa 420

aattatttaa tcgaggaaaa gctatatctg gggcaccaat tattaatggt aaaagtcaat 480

taccaaaacc tccaattaga ataggtatta ccataaagaa aattataata agtccatgtg 540

cagtaattaa ggaattataa agttgatcat ctccaagaaa acttcctggc tgagataatt 600

caacccgaat aatagtactt atagaggatc ttaatatagc agctcaagca cctaagatta 660

aatataaagt cccaatatct ttatgatttg ttga 694

<210> 21

<211> 685

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaccaaaaaa tcagaataag tgctgaaata aaactggatc tccaccacct atagaggtca 60

aagaatgaag tattcaaaat tacgatcagt tagtaatatt gtaatagctg ctgctaatac 120

tggtaacgaa agtaataata aaatagtagt aattactaca gatcaaacaa ataatggaac 180

tcgttcattt cctattccct tagttcgtat attaacaata gtagaaataa aatttaaaga 240

acctaaaata gaagatgcac cagctatatg taatgaaaaa atagctatat caacacatgg 300

tcctgaatga gacatactat cagataatgg tggataaata gttcatcctg taccaacacc 360

attttcaacy attgatgatc ttaccaatat agttaacgat ggtggaagta atcaaaacct 420

aaaattattt aatcgaggaa aagctatatc tggcgcacca attattaatg gtaaaagtca 480

attaccaaaa cctccaatta aaataggtat caccataaaa aaaattataa taagcccatg 540

tgcagtaatc aaggaattat aaagttgatc atctccaaga aaactacctg gctgagataa 600

ttcaatccga ataatagtac ttatagagga tcctaatata gcagctcaag cacctaaaat 660

taaatataaa gttccaatat cttta 685

<210> 22

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtcaacaaat cataaagata ttggaacatt atattttatt ctaggagctt gatcagctat 60

agctgggaca ggaataagag tattaattcg aattgaatta gctcaacctg gtacgtttct 120

aggtaatgat caaatttata atactattgt aactgcacat ggcttagtaa taattttctt 180

tatagtaata cctattttaa ttgggggttt tggtaattgg ttaatccctt taataattgg 240

tgcaccagat atagcatttc cccgacttaa taacctaaga ttttgattat tacccccatc 300

aataattatg ttagttttct ctgcatttgt agaaaatggt gtaggaactg gatgaacagt 360

ataccctcca ttagcatata atattgccca ctctggacca tcagtagata tggctatttt 420

ctcgttacat ttagcaggag cgtcatctat tttaggctca ttaaacttta tctccactgt 480

agcaaatata cgatggaaag gtataacatt agaccgaatc cctttattta tttgatcagt 540

agttattact accgtactac ttctattatc attaccagta ctagcagcag ctattacaga 600

tattacttac agatcgwaat ttaaatacct cattctttga tcctgctgga ggaggggacc 660

ctattctatt tcaacacttg ttttgatttt ttggtcaccc tggaagttta a 711

<210> 23

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttaaacttcc cagggtgacc aaaaaatcaa aacaaatgtt gaaatagaat aggatctcct 60

cctccagcag gatcaaagaa tgatgtgttt aaatttcgat ctgtaagtaa tattgtaatg 120

gctgccgcta atactggcaa tgataataga agtagtacgg tagtaataac tactgatcaa 180

ataaataaag ggattcggtc taatgttata ccttttcatc gtatatttgc tacagtagag 240

ataaagttta atgagcctaa aatagatgat gctcctgcta aatgtaacga gaagatagct 300

atatctaccg atggtccgga atgggcaata ttatatgcta atggagggta tactgttcat 360

ccagtcccta caccattttc tacaaatgca gaaaaaacta atataattat tgatgggggt 420

agtaatcaaa atctcaggtt attaagtcga gggaatgcta tatctggtgc accaattatt 480

aagggaatta atcagttacc aaacccccca attagaatag gtattactat aaagaaaatt 540

attactaaac cgtgtgcagt tacaatagta ttataaattt gatcattacc tagaaacgta 600

ccaggttgag ctaattcaat tcgaattaat actcttatcc ctgttccagc tatagctgat 660

caggccccta gaataaaata taatgttcca atatctttat ga 702

<210> 24

<211> 683

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgaccaaaaa atcaaaacaa atgttgaaat agaataggat ctcctcctcc agcaggatca 60

aagaatgatg tgtttaaatt tcgatctgta agtaatattg taatggctgc cgctagtact 120

ggtaatgata atagaagtag tacggtagta ataactactg atcaaataaa taaaggaatc 180

cggtctaatg ttataccttt tcatcgtata tttgctacag tagagataaa gtttaacgag 240

cctaaaatag atgacgctcc tgctaaatgt aacgagaaga tagctatatc taccgatggt 300

ccggaatggg caatattata tgctaatgga gggtatactg ttcatccagt ccctacacca 360

ttttctacaa atgcagaaaa aactaatata attattgatg ggggtagtaa tcaaaatctt 420

aggttattaa gtcgagggaa tgctatatct ggtgcaccaa ttattaaggg aattaatcag 480

ttaccaaaac ctccaattaa aataggtatt actataaaga aaattattac taaaccatgt 540

gcagttacaa tagtattata aatttgatca ttacctagaa acgtgccagg ttgagctaac 600

tcaattcgaa ttaatactct tatccctgtt ccagctatag ctgatcaggc ccctagaata 660

aaatataatg ttccaatatc ttt 683

<210> 25

<211> 713

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttaaacttcc agggtgacca aaaaatcaaa acaaatgttg aaatagaata ggatctcctc 60

ctccagcagg atcaaagaat gatgtgttta aatttcgatc tgtaagtaat attgtaatgg 120

ctgccgctag tactggtaat gataatagaa gtagtacggt agtaataact actgatcaaa 180

taaataaagg aatccggtct aatgttatac cttttcatcg tatatttgct acagtagaga 240

taaagtttaa tgagcctaaa atagatgacg ctcctgctaa atgtaacgag aagatagcta 300

tatctaccga tggtccggaa tgggcaatat tatatgctaa tggagggtat actgttcatc 360

cagtccctac accattttct acaaatgcag aaaaaactaa tataattatt gatgggggta 420

gtaatcaaaa tctcaggtta ttaagtcgag ggaatgctat atctggtgca ccaattatta 480

agggaattaa tcagttacca aaacctccaa ttaaaatagg tattactata aagaaaatta 540

ttactaaacc atgtgcagtt acaatagtat tataaatttg atcattacct agaaacgtgc 600

caggttgagc taactcaatt cgaattaata ctcttatccc tgttccagct atagctgatc 660

aggcccctag aataaaatat aatgttccaa tatctttatg attttgttga cca 713

<210> 26

<211> 713

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttaaactttc agggtgacca aaaaatcaaa ataagtgttg aaataatact ggatctccac 60

cacccattgg atcaaaaaat gaagtattta aattacgatc arttaataac attgtaatag 120

ctgctgctaa tacaggtaat gaaagtaata ataagatagt agtaattaca acagatcaaa 180

caaataatgg aactcgttca ttacttatac cattagttcg catattaata atagtagaaa 240

taaaatttaa agaacctaaa atagatgatg caccagctat atgcaatgaa aagatagcta 300

tatctacaca aggtcctgag tgagaaactc tatcagctaa tggtggataa atagtccatc 360

ctgtaccaac accggattca attattgatg atcttactaa tatagttaat gaaggtggta 420

ataatcaaaa cctaaaatta tttaatcgtg gaaaagccat atctggggca ccaattatta 480

acggtaaaag tcaattacca aacccaccga ttaaaatagg tattactata aaaaaaatta 540

taataagtcc atgtgcagta attaaagaat tataaagttg atcatcccca agaaacctac 600

ctggttgaga taactcaatt cgaataatag ttcttataga ggagcctaat atagctgccc 660

aagcccctag aatcaaatat agagttccaa tatctttatg attttgttga cca 713

<210> 27

<211> 698

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ttaaacttcc agggtgacca aaaaatcaaa ataagtgttg aaacaaaatt gggtctcccc 60

ctcctatagg atcaaaaaaa gaggtattta gatttcgatc trttaataat atagtaattg 120

ctgcagctaa aacaggtaat gataaaagta gaagaatagt agtaataatt actgaccata 180

caaataatgg aatacgttca gctcttattc cattagttcg tatattaata attgtagaaa 240

taaagtttaa agatcccaaa atagatgatg ccccggctat atgtaatgaa aaaattgcta 300

tgtctactga cggaccagaa tgtgatattg aatctgataa tggcggatat aatgttcatc 360

cagctcctac accaccttca attattgagg aacttagtag tataattata gatggtggta 420

ataatcaaaa gcttagatta ttaagacgtg gaaatgatat atcaactgct ccaactatta 480

atggcaataa tcaatttcca aacccaccaa tcaaaatagg tattactata aaaaaaatta 540

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aagcacccaa aataaaatat aatgttccaa tatcttta 698

<210> 28

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttaattggtg ggtttggtaa ttgactccta ccattaatgg taggggccst agatatatcg 60

tttctcgatc tgaataactt aagattttga gttactaccc ccttcaataa tcatattgct 120

taggtcatcc ttaattgagg gtggtgtagg tgcagggtga accctttatc ctccactatc 180

agactccgta tctcattcag gcccatccgt tgacatagcy atcttttcat tacatatagc 240

tggtgcctca tctattttag ggtcattaaa ttttatttck actattataa atatacgaac 300

taaaggaata acaactgaac gagtaccatt atttgtttgg tcagttgtta ttactactat 360

tttattattg ttatcattac aggttttagc a 391

<210> 29

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttaattggtg ggtttggtaa ttgactttta ccattaataa ttggtgcccc agatatagct 60

tttcctcgat taaataattt taggttttga ttacttccac catcattaac tatattggta 120

agatcatcaa tagttgaaaa tggtgttggt acaggatgaa ctatttatcc gccattagct 180

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<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttaattggtg gggtttggta attgactttt accattaata attggtgcgc cagatatagc 60

ttttcctcga ttaaataatt ttaggttttg attacttcca ccatcgttaa ctatattggt 120

aagatcatca atrgttgaaa atggtgttgg tacaggatga actatttatc caccattatc 180

tgatagtatg tctcattcag gaccatgtgt tgatatagct attttttcat tacatatagc 240

tggtgcatct tctattttag gttctttaaa ttttatttct actattgtta atatacgaac 300

taagggaata ggaaatgaac gagttccatt atttgtttga tctgtagtaa ttactactat 360

tttattatta ttatcattac cgttttagca n 391

<210> 31

<211> 383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

nnttcttaat tggtgggttt ggtaattggt taatcccttt aataattggt gcaccagata 60

tagcatttcc ccgacttaat aacctaagat tttgattatt acccccatca ataattatgt 120

tagttttctc tgcatttgta gaaaatggtg taggaactgg atgaacagta taccctccat 180

tagcatataa tattgcccac tctggaccat cagtagatat ggctattttc tcgttacatt 240

tagcaggagc gtcatctatt ttaggctcat taaactttat ctccactgta gcaaatatac 300

gatggaaagg tataacatta gaccgaatcc ctttatttat ttgatcagta gttattacta 360

ccgtactact tctattatca tta 383

<210> 32

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tnnttaattg gtgggtttgg taactgatta attcccttaa taattggtgc accagatata 60

gcattccctc gacttaataa cctgagattt tgattactac ccccatcaat aattatatta 120

gttttttctg catttgtaga aaatggtgta gggactggat gaacagtata ccctccatta 180

gcatataata ttgcccattc cggaccatcg gtagatatag ctatcttctc gttacattta 240

gcaggagcat catctatttt aggctcatta aactttatct ctactgtagc aaatatacga 300

tgaaaaggta taacattaga ccgaatccct ttatttattt gatcagtagt tattactacc 360

gtactacttc tattatcatt a 381

<210> 33

<211> 389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttaattggtg ggtttggtaa ttggttaatc cctttaataa ttggtgcacc agatatagca 60

tttccccgac ttaataacct aagattttga ttattacccc catcaataat tatgttagtt 120

ttctctgcat ttgtagaaaa tggtgtaggg actggatgaa cagtataccc tccattagca 180

tataatattg cccactctgg accatcagta gatatggcta ttttctcgtt acatttagca 240

ggagcgtcat ctattttagg ctcattaaac tttatctcca ctgtagcaaa tatacgatgg 300

aaaggtataa cattagaccg aatcccttta tttatttgat cagtagttat tactaccgta 360

ctacttctat tatcattacc agttttagc 389

<210> 34

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gtttggtaac tgattaattc ccttaataat tggtgcacca gatatagcat tccctcgact 60

taataaccta agattttgat tactaccccc atcaataatt atattagttt tttctgcatt 120

tgtagaaaat ggtgtaggga ctggatgaac agtataccct ccattagcat ataatattgc 180

ccattccgga ccatcggtag atatagctat cttctcgtta catttagcag gagcgtcatc 240

tattttaggc tcgttaaact ttatctctac tgtagcaaat atacgatgaa aaggtataac 300

attagaccgg attcctttat ttatttgatc agtagttatt actaccgtac tacttctatt 360

atcatta 367

<210> 35

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tggagnnnna tatggcnnnn ncncgatnaa ataatttnag gttttgatta ttaccacctt 60

ctttaattat attaatattc tcatcaacaa ttgaatccgg agctggtaca ggatgaacan 120

tntatccacc attatctgan atagtttctc antcaggacc ttggntanat atagctatct 180

tttcattgcc ttagctggtg catcatctat tttangttct tgaattttat ttcnactatt 240

aataatatgc aaactaatgg tttaattaat gaacaatttc tataattgga ttaaccggta 300

gtaataccta ctatctaata ataatattca taaccatttt aaca 344

<210> 36

<211> 395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tttttttaat tggtgggttt ggtaattgat tattgccatt aatagttgga gcagttgata 60

tatcatttcc acgtcttaat aatctaagct tttgattatt accaccatct ataattatac 120

tactaagttc ctcaataatt gaaggtggtg taggagctgg atgaacatta tatccgccat 180

tatcagattc aatatcacat tctggtccgt cagtagacat agcaattttt tcattacata 240

tagccggggc atcatctatt ttgggatctt taaactttat ttctacaatt attaatatac 300

gaactaatgg aataagagct gaacgtattc cattatttgt atggtcagta attattacta 360

ctattcttct acttttatca ttaccagttt tagca 395

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

agatgaggca ccagctatat gt 22

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

acgtgatcag ctatgttagg ct 22

<210> 39

<211> 395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tatntacgtg atccagctat gttaggctct tctataagat caattattcg aattgaatta 60

gcacagccag gaagattcct tggagacgac caattgtata attcactagt aacggctcat 120

gggttggtta taatcttctt tatagttata ccaattctaa ttggtgggtt tggtaattga 180

ctcctgccat taatggtagg agccgtagat atatcatttc ctcgtctgaa taatttaaga 240

ttttggttac tacccccttc aataatcata ttgcttaggt catctttaat tgagggtggt 300

gtaggtgcag ggtgaaccct ttatccccca ctatcagact ccgtatctca tcaggcccat 360

ccgttgacat agccatcttc tcattacata tagct 395

<210> 40

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tatgttaggc tcttctataa gatcaattat tcgaattgaa ttagcacagc caggaagatt 60

ccttggagac gaccaattgt ataattcact agtaacggct catgggttgg ttataatctt 120

ctttatagtt ataccaattc taattggtgg gtttggtaat tgactcctac cattaatggc 180

aggagccgta gatatatcat ttcctcgtct gaataattta agattttggt tactaccccc 240

ttcaataatc atattgctta ggtcatcttt aattgagggt ggtgtaggtg cagggtgaac 300

cctctatccc ccactatcag actccgtatc tcattcaggc ccatccgttg acatagccat 360

cttctcatta catatagc 378

<210> 41

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tkttacgtga tccagctatg ttaggctcct ctataagtac tattattcgg attgaattat 60

ctcagccagg tagttttctt ggagatgatc aactttataa ttccttgatt actgcacatg 120

gacttattat aatttttttt atggtgatac ctattttaat tggaggtttt ggtaattgac 180

ttttaccatt aataattggt gcgccagata tagcttttcc tcgattaaat aattttaggt 240

tttgattact tccaccatcg ttaactatat tggtaagatc atcaatagtt gaaaatggtg 300

ttggtacagg atgaactatt tatccaccat tatctgatag ctatgtctca ttcaggacca 360

tgtgttgata tagctatttt ttcattacat atagctggtg cctcatct 408

<210> 42

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tntacgtgat ccagctatgt taggctcttc tataagatca attattcgaa ttgaattagc 60

acagccagga agattccttg gagacgacca attgtataat tcactagtaa cggctcatgg 120

gttggttata atcttcttta tagttatacc aattctaatt ggtgggtttg gtaattgact 180

cctaccatta atggtaggrg ccgtagatat atcrtttcct cgtctgaata atttaagatt 240

ttggttacta cccccttcaa taatcatatt gcttaggtca tccttaattg agggtggtgt 300

aggtgcaggg tgaacccttt atcctccact atcagactcc gtatctcatc aggcccatcc 360

gttgacatag ccatcttttc attacatata gctggg 396

Claims

1.大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒，包括第一轮PCR扩增引物LC01490和LC02198、第二轮PCR扩增引物COI924F和COI924R，可鉴定的水蛭为宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、石蛭、棒纹牛蛭，其特征在于，LC01490为GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；LC02198为TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA；COI924 F为GCTAAAACTGGTAATGATAA；COI924R为TAATTGGTGGGTTTGGTAA；所述试剂盒用于大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定时，采用两轮PCR反应，第一轮PCR扩增为25 μL反应体系；第二轮PCR扩增为25 μL反应体系；第一轮PCR扩增时，模板浓度为10-50 ng/μL；第二轮PCR扩增时，第一轮PCR反应液为1μL。

2.根据权利要求1所述大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒，其特征在于，所述大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒还包括2×Taq master Mix、无菌去离子水。

3.根据权利要求1所述大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒，其特征在于，第一轮PCR扩增的程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1 min 30 s，72℃延伸1min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min；第二轮PCR扩增的程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，45℃退火1min 30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，循环40次；最后72℃延伸5 min。

4.大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用引物，包括第一轮PCR扩增引物LC01490和LC02198、第二轮扩增引物COI924F和COI924R；LC01490为GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；LC02198为TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA；COI924 F为GCTAAAACTGGTAATGATAA；COI924R为TAATTGGTGGGTTTGGTAA；所述水蛭为宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、石蛭、棒纹牛蛭。

5. 权利要求1所述大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用试剂盒或者权利要求4所述大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定用引物在大黄䗪虫丸中水蛭检测及正伪品鉴定中的应用；采用两轮PCR反应，第一轮PCR扩增为25 μL反应体系；第二轮PCR扩增为25 μL反应体系；第一轮PCR扩增时，模板浓度为10-50 ng/μL；第二轮PCR扩增时，第一轮PCR反应液为1μL。