CN107354226B - 一种瓦氏雅罗鱼dna条形码标准检测序列及其应用 - Google Patents

Abstract

一种瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列及其应用，涉及一种瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列及其应用。本发明的目的在于提供一段瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列及其在物种鉴定中的应用。该序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。本发明所提供的瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列有利于实现瓦氏雅罗鱼的分子鉴定，能有效缩短鉴定时间。本发明瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列用于鉴定瓦氏雅罗鱼。

Description

一种瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列及其应用

技术领域

本发明涉及瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列及其应用。

背景技术

瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)又名东北雅罗鱼，俗称华子鱼、滑鱼、白鱼，隶属于鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科的雅罗鱼属，是一种体型较小的冷水性经济鱼类。瓦氏雅罗鱼体长，呈纺锤形，侧扁，腹部圆，无皮棱；口端位，口列倾斜，上颌倾斜，较下颌长；唇薄，无须，无角质边缘；吻钝，稍隆起，吻长略大于眼径；眼中等大，鳃耙短小，鳞中等大，侧线完全，微向腹面弯下，向后延至尾柄正中轴；背鳍无硬刺；体背部及提上侧灰黑色，腹部银白，偶鳍和臀鳍为黄色，其余各鳍灰白色。

瓦氏雅罗鱼是一种普生种类，广泛分布于欧洲、西伯利亚、高加索、黑龙江流域的清冷水域。在中国分布于黑龙江、乌苏里江、嫩江、松花江、牡丹江以及其支流、湖泊、水库，也产于图们江、鸭绿江、辽河等水域。在黄河流域的河南、山西、陕西、甘肃、青海等省区也有分布。在内蒙古自治区除额济纳河水系以外，各大水系均有分布，达里湖数量最多。目前，对瓦氏雅罗鱼的物种识别仅局限于形态学鉴定，而能够鉴定的专业人员很少，这使得很多地区无法对瓦氏雅罗鱼进行准确的鉴定。因此，开发出瓦氏雅罗鱼有效的鉴定方法就显得尤为重要。

DNA条形码(DNA barcoding)是利用生物体DNA中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术，能够快速、准确的进行物种鉴定。目前，在动物中最常见的分子标记是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome coxidase I，COI)基因的部分序列。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种的鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码不同于以往的传统鉴别方法，其操作简单，容易掌握，对研究人员的专业技能无较高要求。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无意将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用DNA条形码技术，可以很好的对瓦氏雅罗鱼进行快速、有效的鉴定。

物种鉴定一直是分类学研究上至关重要的基础步骤。能够对物种进行准确的鉴定，特别是稀有经济物种和保护意义重大的种类，分类鉴定工作就显得尤为重要。自2003年，加拿大科学家Hebert提出以COI基因作为DNA条形码以来，越来越多的研究证明了DNA条形码在物种分类上具有高效的可行性。大量的研究结果证明了COI基因作为标记的DNA条形码能够准确的对各类动物进行物种鉴定，可以选用COI基因作为动物条形码数据库的标准条形码。

DNA条形码鉴定方法与传统的分类学方法相辅相成，不仅可以解决鉴定中标本残缺导致的无法辨识的问题，而且有利于快速鉴定。目前已有专门的鱼类数据库，包含了多种鱼类条形码数据。但是我国许多鱼类因其特有性，没有足够的相关数据。也没有瓦氏雅罗鱼的相关基因序列。

发明内容

本发明的目的在于提供一段瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列及其在物种鉴定中的应用。本发明所提供的瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列有利于实现瓦氏雅罗鱼的分子鉴定，能有效缩短鉴定时间。

本发明瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列为COI基因，如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供用于检测上述瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列的引物，包括正向引物5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'和反向引物5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'。

上述瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列在鉴定瓦氏雅罗鱼中的应用。

具体的鉴定方法为：

一、从待测组织样本中分离提取DNA；

二、以步骤一得到的DNA为模板，采用正向引物和反向引物，进行PCR扩增，

三、将步骤二得到的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，根据扩增产物大小判定结果，如果与如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的同源性在93％以上，即可判定待测样本为瓦氏雅罗鱼。

步骤二所述正向引物为5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'，反向引物为5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'。

进一步的，步骤二所述的PCR扩增反应的条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃再延伸7min。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种用于鉴定瓦氏雅罗鱼的DNA条形码标准检测序列，实现了快速、准确的鉴定瓦氏雅罗鱼，克服了现有技术以下的不足：对残缺不全的个体基本不能鉴定，对完整的个体鉴定需要对瓦氏雅罗鱼十分熟悉的专业人员。与传统的形态学鉴定相比，有效的缩短了鉴定时间，鉴定方法准确。

本发明方法检测准确，能够将瓦氏雅罗鱼与同属的其他鱼种加以区别。

本发明提供的鉴定方法中，PCR反应体系及反应条件的重复性高，稳定性好。

附图说明

图1为实施例1中PCR扩增产物的电泳图；

图2为实施例1的序列比对结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列如序列表中SEQID NO：1所示。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列为COI基因。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：用于检测瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列的引物，包括正向引物5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'和反向引物5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列在鉴定瓦氏雅罗鱼中的应用。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：具体的鉴定方法为：

一、从待测组织样本中分离提取DNA；

二、以步骤一得到的DNA为模板，采用正向引物和反向引物，进行PCR扩增，

三、将步骤二得到的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，根据扩增产物大小判定结果，如果与如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的同源性在93％以上，即可判定待测样本为瓦氏雅罗鱼。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤二所述的PCR扩增反应的条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃再延伸7min。其它与具体实施方式四相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

1)检测样本DNA提取：

取待测样本的任意组织至于1.5ml离心管中依次加入600μl裂解液和10μl蛋白酶K，混匀后将离心管至于55℃水浴锅中过夜消化；消化后加入10μl RNA酶混匀后置于37℃水浴锅中水浴1h；然后加入600μl苯酚与氯仿混合液，混匀后常温下12000r/min离心10min；取离心上层清液置于一个新离心管中，再加入1ml无水酒精混匀，常温下12000r/min离心10min；离心后旋转倒出究竟再加入70％的乙醇500μl，常温下12000r/min离心5min；用移液器吸出乙醇，白色沉淀再经12000r/min离心1min，离心后移液器吸出管内残留乙醇后室温下倒置干燥10min，最后加入30-50μl的1×TE溶液-40℃下保存备用，即完成待测样本的DNA提取；

2)PCR扩增：

PCR反应体系为25μl，由18μl自制混合buffer，10.0mmol/L的上、下游COI通用引物各1μl，酶活为1U的Taq DNA聚合酶0.6μl，去离子水2.4μl，DNA模版2μl组成；PCR的反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s,57℃退火30s,72℃延伸30s,共进行30个循环,最后72℃再延伸7min。

3)PCR产物的检测

PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增产物大小判定结果，如果能特异性扩增出700±10bp的条带(电泳图如图1所示)，可初步判定待测样本可能是瓦氏雅罗鱼。

4)检测样本的序列测定

选取效果较好的PCR产物送至生物公司测序，得到十个测序样本序列S1(如SEQ IDNO：4所示)、S2(如SEQ ID NO：5所示)、S3(如SEQ ID NO：6所示)、S4(如SEQ ID NO：7所示)、S5(如SEQ ID NO：8所示)、S6(如SEQ ID NO：9所示)、S7(如SEQ ID NO：10所示)、S8(如SEQID NO：11所示)、S9(如SEQ ID NO：12所示)和S10(如SEQ ID NO：13所示)。其中S1和S2为达里湖的瓦氏雅罗鱼；S3和S4为岗更湖的瓦氏雅罗鱼；S5和S6为黑龙江的瓦氏雅罗鱼；S7和S8为额尔齐斯河的高体雅罗鱼；S9和S10为额尔齐斯河的贝加尔雅罗鱼；其中，高体雅罗鱼和贝加尔雅罗鱼与瓦氏雅罗鱼同为雅罗鱼属鱼类，亲缘性比较近。

5)基因序列的比对

使用生物学软件BioEdit对瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准序列(如序列表中SEQ IDNO：1所示)与十个测序样本序列(S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9和S10)进行两两比对，结果显示瓦氏雅罗鱼标准序列与来自三个不同流域的六个瓦氏雅罗鱼测序序列S1、S2、S3、S4、S5、S6比对后同源性分别为93.51％、93.25％、96.63％、96.77％、93.38％、93.39％均在93％以上，而与同为雅罗鱼属的高体雅罗鱼和贝加尔雅罗鱼的四个样品测序序列S7、S8、S9、S10的同源性分别为88.15％、88.14％、87.43％、89.31％。可判定S1、S2、S3、S4、S5、S6这六个测序序列均为瓦氏雅罗鱼，六个待测组织也可以认定为瓦氏雅罗鱼的组织。对比结果如图2所示，图2中lw为瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准序列(SEQ ID NO:1)；CE1为测序序列1(S1)；CE 2为测序序列2(S2)；CE 3为测序序列3(S3)；CE4为测序序列4(S4)；CE 5为测序序列5(S5)；CE 6为测序序列6(S6)；CE7为测序序列7(S7)；CE8为测序序列8(S8)；CE 9为测序序列9(S9)；CE 10为测序序列10(S10)。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

<120> 一种瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列及其应用

<141> 2017-09-04

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 664

<212> DNA

<213> 瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)

<400> 1

cttgtatttg gtgcctgagc cggaatagtg gggactgccc taagcctcct tattcgggcc 60

gaactaagcc aacccgggtc acttttaggc gatgaccaaa tttataacgt tatcgttacc 120

gcccacgcct tcgtaataat tttctttata gtaatgccaa ttcttattgg agggttcgga 180

aactgactcg tcccactaat gattggtgca cctgatatgg cattcccacg aataaataac 240

ataagcttct gacttctgcc cccatccttc ctcctgctat tagcttcttc tggcgttgaa 300

gccggagccg gaacaggatg aacagtgtat cccccactcg caggcaatct cgcccacgca 360

ggagcatcag tagacttaac aatcttctca cttcacctag caggtgtatc atcaatttta 420

ggtgcagtca acttcatcac cacaattatt aacatgaaac ccccagccat ctcccaatat 480

caaacaccgc tctttgtatg ggccgtactg gtaacagccg tccttctcct cctgtctcta 540

ccagtcttgg ccgccgggat tacaatactt cttacagatc gtaatcttaa caccacattc 600

tttgacccgg cagggggagg tgacccaatc ttataccaac acctattctg attctttggc 660

cacc 664

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaaccaacc acaaagacat tggcac 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagacttctg ggtggccaaa gaatca 26

<210> 4

<211> 709

<212> DNA

<213> 瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)

<400> 4

ttcaaccaac cacaaagaca ttggcaccct ttatcttgta tttggtgcct gagccggaat 60

agtggggact gccctaagcc tccttattcg ggccgaacta agccaacccg ggtcactttt 120

aggcgatgac caaatttata acgttatcgt taccgcccac gccttcgtaa taattttctt 180

tatagtaatg ccaattctta ttggagggtt cggaaactga ctcgtcccac taatgattgg 240

tgcacctgat atggcattcc cacgaataaa taacataagc ttctgacttc tgcccccatc 300

cttcctcctg ctattagctt cttctggcgt tgaagccgga gccggaacag gatgaacagt 360

gtatccccca ctcgcaggca atctcgccca cgcaggagca tcagtagact taacaatctt 420

ctcacttcac ctagcaggtg tatcatcaat tttaggtgca gtcaacttca tcaccacaat 480

tatcaacatg aaacccccag ccatctccca atatcaaaca ccgctctttg tatgggccgt 540

actggtaaca gccgtccttc tcctcctgtc tctaccagtc ttggccgccg ggattacaat 600

acttcttaca gatcgtaatc ttaacaccac attctttgac ccggcagggg gaggtgaccc 660

aatcttatac caacacctat tctgattctt tggccaccag aaagtctaa 709

<210> 5

<211> 711

<212> DNA

<213> 瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)

<400> 5

ttcaaccaaa ccacaaagac attggcaccc tttatcttgt atttggtgcc tgagccggaa 60

tagtggggac tgccctaagc ctccttattc gggccgaact aagccaaccc gggtcacttt 120

taggcgatga ccaaatttat aacgttatcg ttaccgccca cgccttcgta ataattttct 180

ttatagtaat gccaattctt attggagggt tcggaaactg actcgtccca ctaatgattg 240

gtgcacctga tatggcattc ccacgaataa ataacataag cttctgactt ctgcccccat 300

ccttcctcct gctattagct tcttctggcg ttgaagccgg agccggaaca ggatgaacag 360

tgtatccccc actcgcaggc aatctcgccc acgcaggagc atcagtagac ttaacaatct 420

tctcacttca cctagcaggt gtatcatcaa ttttaggtgc agtcaacttc atcaccacaa 480

ttatcaacat gaaaccccca gccatctccc aatatcaaac accgctcttt gtatgggccg 540

tactggtaac agccgtcctt ctcctcctgt ctctaccagt cttggccgcc gggattacaa 600

tacttcttac agatcgtaat cttaacacca cattctttga cccggcaggg ggaggtgacc 660

caatcttata ccaacaccta ttctgattct ttggccaccc agaaagtcta a 711

<210> 6

<211> 680

<212> DNA

<213> 瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)

<400> 6

ccgatactgt atttggtgct gagccggata gtggggactg ccctaagcct ccttattcgg 60

gccgaactaa gccaacccgg gtcactttta ggcgatgacc aaatttataa cgttatcgtt 120

accgcccacg ccttcgtaat aattttcttt atagtaatgc caattcttat tggagggttc 180

ggaaactgac tcgtcccact aatgattggt gcacctgata tggcattccc acgaataaat 240

aacataagct tctgacttct gcccccatcc ttcctcctgc tattagcttc ttctggcgtt 300

gaagccggag ccggaacagg atgaacagtg tatcccccac tcgcaggcaa tctcgcccac 360

gcaggagcat cagtagactt aacaatcttc tcacttcacc tagcaggtgt atcatcaatt 420

ttaggtgcag tcaacttcat caccacaatt atcaacatga aacccccagc catctcccaa 480

tatcaaacac cgctctttgt atgggccgta ctggtaacag ccgtccttct cctcctgtct 540

ctaccagtct tggccgccgg gattacaata cttcttacag atcgtaatct taacaccaca 600

ttctttgacc cggcaggggg aggtgaccca atcttatacc aacacctatt ctgattcttt 660

ggccaccaat aaagtctaaa 680

<210> 7

<211> 679

<212> DNA

<213> 瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)

<400> 7

cagttactgt atttggtgct gagccggata gtggggactg ccctaagcct ccttattcgg 60

gccgaactaa gccaacccgg gtcactttta ggcgatgacc aaatttataa cgttatcgtt 120

accgcccacg ccttcgtaat aattttcttt atagtaatgc caattcttat tggagggttc 180

ggaaactgac tcgtcccact aatgattggt gcacctgata tggcattccc acgaataaat 240

aacataagct tctgacttct gcccccatcc ttcctcctgc tattagcttc ttctggcgtt 300

gaagccggag ccggaacagg atgaacagtg tatcccccac tcgcaggcaa tctcgcccac 360

gcaggagcat cagtagactt aacaatcttc tcacttcacc tagcaggtgt atcatcaatt 420

ttaggtgcag tcaacttcat caccacaatt atcaacatga aacccccagc catctcccaa 480

tatcaaacac cgctctttgt atgggccgta ctggtaacag ccgtccttct cctcctgtct 540

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ttctttgacc cggcaggggg aggtgaccca atcttatacc aacacctatt ctgattcttt 660

ggccaccaga aagtctaaa 679

<210> 8

<211> 710

<212> DNA

<213> 瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)

<400> 8

ttcaaccaaa ccacaaagac attggcaccc tttatcttgt atttggtgcc tgagccggaa 60

tagtggggac tgccctaagc ctccttattc gggccgaact aagccaaccc gggtcacttt 120

taggcgatga ccaaatttat aacgttatcg ttaccgccca cgccttcgta ataattttct 180

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caatcttata ccaacaccta ttctgattct ttggccacca gaaagtctaa 710

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<212> DNA

<213> 瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)

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ttcaaccaaa ccacaaagac attggcaccc tttatcttgt atttggtgcc tgagccggaa 60

tagtggggac tgccctaagc ctccttattc gggccgaact aagccaaccc gggtcacttt 120

taggcgatga ccaaatttat aacgttatcg ttaccgccca cgccttcgta ataattttct 180

ttatagtaat gccaattctt attggagggt tcggaaactg actcgtccca ctaatgattg 240

gtgcacctga tatggcattc ccacgaataa ataacataag cttctgactt ctgcccccat 300

ccttcctcct gctattagct tcttctggcg ttgaagccgg agccggaaca ggatgaacag 360

tgtatccccc actcgcaggc aatctcgccc acgcaggagc atcagtagac ttaacaatct 420

tctcacttca cctagcaggt gtatcatcaa ttttaggtgc agtcaacttc atcaccacaa 480

ttatcaacat gaaaccccca gccatctccc aatatcaaac accgctcttt gtatgggccg 540

tactggtaac agccgtcctt ctcctcctgt ctctaccagt cttggccgcc gggattacaa 600

tacttcttac agatcgtaat cttaacacca cattctttga cccggcaggg ggaggtgacc 660

caatcttata ccaacaccta ttctgattct ttggccacca gaagtctaaa 710

<210> 10

<211> 709

<212> DNA

<213> 高体雅罗鱼(Leuciscus baicalensis)

<400> 10

tcaaccaaac ccaaagacat tggcaccctt tatcttgtat ttggtgcctg agccggaatg 60

gtggggactg ccctaagcct ccttattcgg gccgaactaa gccaacccgg gtcactttta 120

ggcgatgacc aaatttacaa tgttatcgtt accgcccacg ccttcgtaat aattttcttt 180

atagtaatgc caattcttat tggcgggttc ggaaattgac tcgtcccact aatgattggc 240

gcacctgaca tggcattccc gcgaatgaat aatataagct tctgacttct acccccatca 300

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tatcccccac ttgcaggcaa tctcgcccac gcaggagcat cagtagactt aacaatcttc 420

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attaacatga aacccccagc catctcccag tatcaaacac cgctctttgt atgggccgtg 540

ctggtaacag ccgtccttct ccttctatca ttaccagtct tagctgccgg aattacaata 600

cttcttacag atcgtaatct taataccacg ttcttcgatc cggcaggggg aggtgacccg 660

atcctgtacc aacacttatt ctgattcttt ggccaccaga aagtctaaa 709

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<211> 709

<212> DNA

<213> 高体雅罗鱼(Leuciscus baicalensis)

<400> 11

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ggtggggact gccctaagcc tccttattcg ggccgaacta agccaacccg ggtcactttt 120

aggcgatgac caaatttaca atgttatcgt taccgcccac gccttcgtaa taattttctt 180

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attcctactg ctattagctt cttctggtgt tgaagccgga gctgggacag gatgaacagt 360

gtatccccca cttgcaggca atctcgccca cgcaggagca tcagtagact taacaatctt 420

ctcgctccac ctagcaggtg tatcatcaat tttaggcgcg gtcaacttca tcactacaat 480

tattaacatg aaacccccag ccatctccca gtatcaaaca ccgctctttg tatgggccgt 540

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acttcttaca gatcgtaatc ttaataccac gttcttcgat ccggcagggg gaggtgaccc 660

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<211> 682

<212> DNA

<213> 贝加尔雅罗鱼(Leuciscus leuciscus baicalensis)

<400> 12

cccttaaact tgtttttggt gctgggccgg atagtgggga ctgccctaag cctccttatt 60

cgggccgaac taagccaacc tgggtcactt ttaggcgatg accaaattta taatgtcatc 120

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tttggccacc aaaaaagtct aa 682

<210> 13

<211> 657

<212> DNA

<213> 贝加尔雅罗鱼(Leuciscus leuciscus baicalensis)

<400> 13

gtttggtgct gggccggaat agtggggact gccctaagcc tccttattcg ggccgaacta 60

agccaacctg ggtcactttt aggcgatgac caaatttata atgtcatcgt taccgcccac 120

gccttcgtaa taattttctt tatagtaatg ccaattctta ttggtggatt cggcaactga 180

ctcgtcccac taataattgg tgcacctgac atagcattcc cacgaataaa taatatgagc 240

ttctgacttc tacccccatc attcctgtta ttgttagcct cttctggtgt tgaggccggt 300

gccggaacag gatgaacagt atacccgcct cttgcaggca acctcgctca cgcaggggca 360

tcagtagact taacaatctt ctcacttcac ctggcaggtg tgtcatcaat tttaggggca 420

gtcaatttca ttactacaat tattaatatg aaacccccag ccatctccca gtatcaaaca 480

cctctctttg tatgagccgt actagtaacg gccgtccttc tccttctatc attaccagtg 540

ctggctgccg gaattacaat gcttcttaca gatcgtaatc ttaatactac attcttcgac 600

ccagcgggag gaggggaccc aatcctatat cagcacttat tctgattctt tggccac 657

Claims (3)

1.一种瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列，其特征在于该序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。

2.如权利要求1所述的瓦氏雅罗鱼DNA条形码标准检测序列在鉴定瓦氏雅罗鱼中的应用，其特征在于具体的鉴定方法为：

一、从待测组织样本中分离提取DNA；

二、以步骤一得到的DNA为模板，采用正向引物和反向引物，进行PCR扩增，

三、将步骤二得到的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，如果PCR扩增产物与如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的同源性在93%以上，即判定待测样本为瓦氏雅罗鱼；

其中步骤二正向引物为5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'，反向引物为5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤二所述的PCR扩增反应的条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃再延伸7min。

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