KR101169196B1

KR101169196B1 - 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물 및 어류 바이러스 백신

Info

Publication number: KR101169196B1
Application number: KR1020120021057A
Authority: KR
Inventors: 정성주; 비나이; 박창수
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2012-07-26

Abstract

본 발명은 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 제조를 위해 가장 적합한 면역보조제를 선택하고 선택된 면역보조제의 가장 적합한 조성물 농도 성분을 제공한다. 서로다른 성분으로 제조된 조성물들에 대해 백신효능연구를 위한 백신접종, 공격실험에 의한 효능 검증의 단계의 실험을 실시한 결과 최적조성의 면역보호제는 100ml의 기준양으로 5ml의 스쿠알렌(Squalene), 20ml의 글리세롤, 0.5ml의 계면활성제(Tween 80)을 넣고 배지성분인 MEM을 넣어 50ml로 맞춘 후 5분간 와류발생(voltex)시켜, 동량(50ml)의 불활화 VHSV를 넣고 얼음 위에서 10분간 균질기(homogenizer)로 교반하여 제조한 조성물에 수산화 알루미늄 5mg/ml를 더 첨가한 조성물이 가장효과가 좋았다. 최적 조성의 면역보조제 조성물이 바이러스성 출혈성패혈증에 대해 효과적으로 면역을 증진시키는 뛰어난 효과를 나타냄으로서 국산 백신의 경쟁력을 강화시키고 양식산업 전반에 예방법 활성화로 항생제와 화학약품의 사용이 상당수 감소하여 안전한 먹거리를 공급하여 국민 보건을 증진시키며, 생태계 보전에도 이바지할 것으로 기대된다.

Description

어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물 및 어류 바이러스 백신{Composition of adjuvant supplements and virus vaccine for fish}

어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물 및 어류 바이러스 백신에 관한 것이다. 보다 상세하게는 바이러스성 출혈성 패혈증 (viral haemorrhagic septicemia)의 불활화 백신에 대한 적합한 면역보조제 조성물 및 상기 조성물을 이용한 어류 바이러스 백신을 도출하기 위해, 다양한 면역보조제 후보군을 선택하여 농도별로 어류에 접종하여 스크리닝한 후, 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증에 안전하고 효과가 뛰어난 최적의 효과를 갖는 면역보조제 조성물 및 이를 이용한 어류 바이러스 백신을 제공한다.

어류의 바이러스성 질병 중의 하나인 바이러스성 출혈성 패혈증은 우리나라의 대표적 양식어류인 넙치에서 수온이 낮은 겨울에서 봄에 걸쳐 발병한다. 치어부터 성어 모두 감염하며 감염개체는 먹이섭취가 불량해지며, 체색이 검어지고 이상유영을 하며 외부 증상으로 복수축적에 의한 복부팽만, 안구돌출, 빈혈 및 출혈(안구, 피부, 아가미, 지느러미 기부)을 일으켜 상품으로서 가치를 손상함은 물론 누적 폐사율이 70% 이상인 경우도 있는 위험 질병이다.

또한, 어류질병의 치료목적으로 사용되는 포르말린 등의 약제와 약품의 인체에의 안전성과 환경에의 부하가 문제시되면서 어류 스스로의 면역체계를 이용한 백신의 개발과 사용에 대한 관심과 필요성이 대두되고 있다.

현재 전 세계적으로 많은 종류의 어류용 백신이 시판/사용되고 있고 특히 노르웨이의 경우 백신 사용으로 항생제 사용이 줄어들고 양식생산량은 증가하였다. 국내시판 어류용 백신은 사균(불활화) 백신으로 안전성은 높지만 면역보조제가 첨가되어 있지 않아 면역원성이 매우 낮아 우수한 면역보조제의 첨가로 면역 증강효과의 극대화가 필요하다.

특히, 바이러스성 질병에 대한 백신은 어류에서 가장 개발이 절실한 것으로 높은 바이러스배양비용으로 개발이 어려운 실정이나 면역보조제를 이용하면 비교적 적은 양의 항원으로도 면역을 유도할 수 있을 것으로 기대된다.

병원체는 생체에 침입, 증식하면서 병을 일으키는 메카니즘이 병원체의 종에 따라 확연히 차이 나므로, 병원체의 종류에 따라 사용되는 면역보조제의 종류에도 차이가 있다. 따라서 백신을 개발할 때는 목적 병원체에 적합한 최적의 면역보조제의 선택을 위한 연구가 따로 수행되어야하며, 생물종에 따라 사용하는 면역보조제에 의한 부작용(독성)에서도 차이가 날 수 있다.

따라서 본 발명의 목적은 실험대상인 넙치에게 적합한 면역보조제를 찾기 위해, 어류에 적합한 면역보조제 후보군을 선별하고 어류의 바이러스성 출혈성패혈증바이러스(viral haemorrhagic septicemia virus; 이하 VHSV 라 한다)에 가장 적합한 조성의 면역보조제 조성물을 개발하고자 하였다.

국내 등록공보 제10-05217690호에는 과립구 콜로니 자극인자 약 0.05 내지 10.5 중량%, 계면활성제 약 0.5 내지 90 중량%, 결착제 약 0.1 내지 98 중량% 등을 구성요소로 하는 어류의 경구투여용 면역증강제 조성물, 이를 포함하는 어류용 사료, 면역증강제를 어류에 경구투여하여 어류의 면역활성을 증가시키는 방법 및 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서 목적으로 하는 어류의 바이러스성 출혈성패혈증바이러스에 가장 적합한 조성의 면역보조제 조성물과는 차이가 있다. 국내공개특허공보 제10-2009-0083448호에는 스쿠알렌을 함유하는 수중유 에멀젼에 대한 품질 관리 방법에 관한 것으로 수중유 에멀젼에서 스쿠알렌 함량을 측정함으로서 제조과정에서 나타나는 품질 문제를 확인하기 위한 방법을 개시하고 있으나, 본 발명에서 스쿠알렌을 면역보조제의 구성성분으로 사용하는 내용과는 상이한 차이를 갖는다. 또한 본 발명자에 의해 출원공개된 국내 공개특허공보 제10-2009-0077303호에는 약물처리나 DNA 백신 처리 등을 하지 않고도 양식 온도의 조절을 통해 넙치의 출혈성 패혈 바이러스(VHSV)에 대한 감염을 예방하는 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방방법 및 예방 시스템을 개시하고 있으나, 본 발명의 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 백신용 면역보조제 조성물과는 상이한 구성을 갖는다. 이와 같은 선행문헌들은 본 발명에서와 같이 어류의 VHSV에 스쿠알렌과 수산화알루미늄등을 구성 조성물로 하는 어류의 백신용 면역보조제에 대한 선행기술과는 상이한 것으로, 본 발명의 기술 특징과 유사한 선행기술은 발견할 수 없었다.

본 발명은 어류의 바이러스 백신 제조를 위해 가장 적합한 면역보조제를 선택하고 선택된 면역보조제의 가장 적합한 조성물 농도 성분을 결정, 제공한다.

상기 과제를 달성하기 위해, 스쿠알렌을 유효구성 성분으로 포함하는 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 백신용 면역보조제 조성물을 제공한다. 더욱 상세하게는 유효구성 성분으로 스쿠알렌에 글리세롤, 계면활성제를 포함하며, 상기 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 백신용 면역보조제 조성물에 수산화알루미늄을 부가적으로 첨가하는 것을 특징으로 한다.

상기 백신용 면역보조제 조성물의 비율구성은 스쿠알렌 2-20 %, 글리세롤 10-45 % 및 계면활성제 0.5-2 %를 유효성분으로 구성하고, 상기 유효성분 구성에 배지성분인 MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen Corp, Cat. No., 12100-046)을 넣어 100 %로 맞추어 이루어지는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 백신용 면역보조제 조성물 100 %에 수산화알루미늄 0.4-4 %를 부가적으로 더 첨가하는 것으로 구성될 수 있다.

면역보조제를 포함하는 백신 제조는 먼저, VHSV를 0.3% 포르말린과 혼합하여 4℃에서 12시간 동안 교반시킴으로써 불활화시킨 VHSV를 제조하였다.

조성물의 구성성분으로 포함되는 기준 비는 100ml의 백신(50ml 면역보조제와 50ml 불활화 백신혼합액)을 기준으로 1-10ml의 스쿠알렌(Squalene; 혼합액 중의 1-10%), 20ml의 글리세롤(glycerol; 혼합액 중의 20%), 0.5ml의 계면활성제(Tween 80; 혼합액 중의 0.5%)을 넣고 배지성분인 MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen Corp, Cat. No., 12100-046)을 넣어 50ml로 맞춘 후 5분간 와류발생(voltex)시켜, 50ml의 불활화 VHSV를 넣고 얼음 위에서 10분간 균질기(homogenizer)로 교반하는 과정으로 제조되는 구성성분의 비를 갖는다.

상기 50ml 면역보조제와 50ml 불활화 백신혼합액의 구성을 갖는 혼합액에 사포닌(Saponin)을 부가적으로 10mg 더 첨가된 조성물, 사포닌 10mg과 수산화 알루미늄 500mg(0.5g)을 더 첨가한 조성물 및 수산화 알루미늄 500mg(0.5g)을 더 첨가한 조성물을 제조하였다.

또한 10mg의 사포닌을 동물영양 배지성분인 MEM 50ml에 넣고 5분간 와류발생(voltex)시킨 후, VHSV를 0.3 % 포르말린과 혼합하여 4℃에서 12시간 동안 교반시켜 불활화시킨 50ml의 불활화 VHSV를 혼합하여 5분간 와류발생(voltex)시킨 물기반의 면역보조제 조성물을 제조하였다.

상기 제조된 조성물들에 대해 면역보조제의 백신효능 연구를 위한 조건설정, 백신효능연구를 위한 백신접종, 공격실험에 의한 효능 검증의 단계의 실험을 실시하여 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 제조를 위해 가장 적합한 면역보조제의 조성(혼합) 농도를 도출한다.

세계적으로 친환경 양식산업 환경이 조성되고 있는 가운데 백신수요는 점차 늘어날 것으로 예상되며, 이에 따라 본 발명에서 밝혀진 최적 조성의 면역보조제 조성물이 바이러스성 출혈성 패혈증에 대해 효과적으로 면역을 증진시키는 뛰어난 효과를 나타냄으로서 국산 백신의 경쟁력을 강화시키고 양식산업 전반에 예방법 활성화로 항생제와 화학약품의 사용이 상당수 감소하여 안전한 먹거리를 공급하여 국민 보건을 증진시키며, 생태계 보전에도 이바지할 것으로 기대된다.

도 1은 다양한 면역보조제를 첨가한 백신처리 12주후 VHSV 접종한 실험어의 생존율을 나타낸 그래프이다
도 2는 다양한 면역보조제를 첨가한 백신처리 3주 후 VHSV 접종한 실험어의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 다양한 면역보조제를 첨가한 백신처리 6주 후 VHSV 접종한 실험어의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 다양한 스쿠알렌 농도기반 백신처리 4주 후 VHSV 접종한 실험어의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 다양한 스쿠알렌 농도기반 백신처리 10주 후 VHSV 접종한 실험어의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6는 현장적용 백신처리 3주 후 VHSV 접종한 실험어의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 현장적용 백신처리 6주 후 VHSV 접종한 실험어의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 현장적용 백신처리 12주 후 VHSV 접종한 실험어의 생존율을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 발명의 목적을 달성하기 위하여, 어류의 백신용 면역보조제 조성물은 스쿠알렌을 유효구성 성분으로 구성하며, 여기에 일정량의 글리세롤, 계면활성제를 포함하고 상기 3종류의 조성물의 합에 배지성분인 MEM 을 넣어 100 %로 맞추어 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 어류의 백신용 면역보조제 조성물 100 %에 일정량의 수산화알루미늄을 부가적으로 첨가되는 것을 특징으로 한다.

어류의 백신용 면역보조제 조성물의 상세한 비율구성은 스쿠알렌 2-20 %, 글리세롤 10-45 % 및 계면활성제 0.5-2 %를 유효성분으로 구성한 후, 배지성분인 MEM을 넣어 100 %로 맞추어 이루어지는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 백신용 면역보조제 조성물 100 %에 부가적으로 첨가되는 수산화알루미늄은 0.4-4 %를 더 첨가하는 것으로 구성될 수 있다.

어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물을 이용한 백신은 100 ml를 기준으로, 스쿠알렌 1-10 ml, 글리세롤 20 ml, 계면활성제 0.5 ml, 배지성분인 MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen Corp, Cat. No., 12100-046) 19.5 - 28.5 ml와 VHSV를 0.3 % 포르말린과 혼합하여 4℃에서 12시간 동안 교반시켜 불활화시킨 VHSV 50ml의 구성으로 이루어진 수중유적 조성물을 기본구성으로 한다.

또한 상기 기본구성을 갖는 조성물에 수산화알루미늄이 5 mg/ml의 기준량으로 부가적으로 첨가되는 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물을 이용한 백신이 제공되며, 상기 기본 구성을 갖는 조성물에 수산화알루미늄이 5 mg/ml, 사포닌이 1 mg/ml의 기준량으로 부가적으로 첨가되는 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물을 이용한 백신이 제공된다.

또한 10 mg의 Saponin을 동물영양 배지성분인 MEM 50ml에 넣고 5분간 와류발생(voltex)시킨후, VHSV를 0.3 % 포르말린과 혼합하여 4℃에서 12시간 동안 교반시켜 불활화시킨 50ml의 불활화 VHSV를 혼합하여 5분간 와류발생(voltex)시킨 물기반의 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물을 이용한 백신이 제공된다.

본 발명은 발명의 목적을 달성하기 위한 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물 제조방법으로는

A) VHSV를 0.3%의 포르말린과 혼합하여 4℃에서 12시간 동안 교반하여 불활화시키는 단계;

B) 스쿠알렌 1-10ml, 글리세롤 20ml, 계면활성제 0.5ml를 넣고 배지성분을 넣어 50ml로 맞추어 5분간 와류발생(voltex)시키는 단계;

C) A)단계에서 제조된 불활화 VHSV 50ml를 B)단계의 조성물과 혼합하여 얼음 위에서 10분간 균질기(homogenizer)로 교반하는 단계로 이루어진 어류의 바이러스백신용 면역보조제 조성물 제조방법이 제공된다.

또한, 상기 C)단계 이후에 500mg의 수산화 알루미늄을 더 첨가하여 교반하는 단계를 포함하는 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물 제조방법과, 상기 C)단계 이후에 500mg의 수산화 알루미늄과 10mg의 사포닌을 더 첨가하여 교반하는 단계를 포함하는 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물 제조방법이 제공된다.

이하 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 전체적인 구성을 실시 예와 함께 자세히 설명하면 다음과 같다.

실시예 1. 불활화 백신과 백신 조합물의 제조

다음과 같이 불활화 VHSV를 제조하고 여기에 다양한 성분의 보조제를 혼합하여 각기 다른 성분의 면역보조제 조성물을 제조하여, 3개월 이후 공격실험함으로서 장기간 면역을 지속시키는 효능을 기대할 수 있는 VHSV백신에 적합한 면역보조제를 선별하였다.

1) 불활화 VHSV (이하 "IV"라 한다): 10^8.8TCID₅₀/ml의 VHSV를 0.3% 포르말린과 혼합하여 4℃에서 12시간 동안 교반시킴으로써 불활화시켰다.

2) FCA (Fruends' complete adjuvant)와 FIA (Fruends' incomplete adjuvant): 주로 연구목적으로 사용되는 강력한 면역보조제로 어류에 사용하면 육아종이 형성되는 부작용이 있어 실제로 어류에 사용하기는 부적절하나 본 발명에 사용된 면역보조제들과의 효능을 비교하기 위한 양성대조로 사용하였다. FCA와 FIA는 동량의 불활화 VHSV와 섞어 에멀젼(emulsion)으로 만들었다.

3) 스쿠알렌 5%: 100ml의 백신을 만들기 위하여 5ml(5%)의 스쿠알렌, 20ml(20%)의 글리세롤, 0.5ml(0.5%)의 계면활성제(Tween 80)를 넣고 동물세포배양용 배지인 MEM을 넣어 50ml로 맞춘 후 5분간 와류발생(voltex)시켰다. 그 후 50ml의 불활화 VHSV를 넣고 얼음위에서 10분간 균질기(homogenizer)로 교반하였다.

4) 스쿠알렌 + 사포닌(Saponin): 상기 3)의 조성물에 10mg(0.01%)의 사포닌을 부가적으로 더 첨가하여 교반한다.

5) 스쿠알렌 + 사포닌 + 수산화알루미늄: 상기 3)의 조성물에 10mg(0.01%)의 사포닌과 500mg(0.5%)의 수산화알루미늄을 부가적으로 더 첨가하여 교반한다.

6) 스쿠알렌 + 수산화알루미늄: 상기 3)의 조성물에 500mg(0.5%)의 수산화알루미늄을 부가적으로 더 첨가하여 교반한다.

7) 사포닌: 10mg의 사포닌을 MEM 50ml에 넣어 5분간 voltex하고 그 후 50ml의 불활화 VHSV를 넣고 5분간 voltex하여 물기반의 사포닌 조성물을 제조한다.

이상의 내용을 요약하여 표 1에 정리하였다.

백신에 사용한 면역보조제의 조성

Type	Adjuvants	Concentration	Antigen	Dose
Antigen only	-	-	불활화 VHSV
유중수적 (Water in oil; Mineral oil)	FCA	1:1(불활화바이러스;FCA)	불활화 VHSV	100㎕/fish
유중수적 (Water in oil; Mineral oil)	FIA	1:1(불활화바이러스;FIA)	불활화 VHSV
수중유적 (Oil in water; Squalene oil)	스쿠알렌	스쿠알렌 5%	불활화 VHSV
	스쿠알렌+사포닌	스쿠알렌 5%, 사포닌 0.01%(100㎍/ml)
	스쿠알렌+사포닌+ 수산화알루미늄	스쿠알렌 5%, 사포닌 0.01%(100㎍/ml), 수산화알루미늄 0.5%(5mg/ml)
	스쿠알렌 + 수산화알루미늄	스쿠알렌 5%, 수산화알루미늄 0.5%(5mg/ml)
물 기반(Water based)	사포닌	사포닌 0.01%	불활화 VHSV
대조구(Control)	MEM	MEM 2% FBS	-
대조구(Control)	Naive	-	-

1.1. 면역시험

250L의 순환수조에 에어레이션을 설치하고, 각 그룹에 넙치(어체중 23.99±4.30g) 40마리씩 분배하였다. 백신 접종에 앞서 1주일간 환경에 순치시켰고 실험개시 시점의 수온은 18℃였고 12주 후 종료시점의 수온은 13℃였다. 다양한 면역보조제를 첨가한 백신을 접종하였고, 한 그룹은 바이러스가 포함되지 않은 배지 성분인 MEM만을 동량 복강에 주사하였다. 실험어는 일반사료를 매일 어체중의 2% 급이 하였다.

1.2. 공격시험

백신접종 12주 후에 실험어를 항온실(15℃)로 옮겨서 VHSV를 접종하였다. 각 실험어에 VHSV 배양액을 500㎕씩(10^6.5TCID₅₀/fish)을, 대조구(control)에는 MEM을 500㎕접종했다. 각 실험구는 2주간 폐사를 관찰하였고 접종한 실험어의 상대생존률(RPS)을 아래와 같이 계산하여 백신의 효능을 평가하였다.

RPS = [1-(% mortality of vaccinated group/ % mortality in control)] X 100

표 2에는 다양한 면역보조제를 첨가한 백신을 접종하고 12주 후 공격 감염한 넙치의 누적폐사율과 상대생존율을 나타낸다.

다양한 면역보조제를 첨가한 백신을 접종하고 12주 후 공격 감염한 넙치의 누적폐사율과 상대생존율

Vaccine group	No. of fish Challenged	Cumulative mortality (%)	RPS
Naive	10	0	100
MEM	10	80	-
IV(inactivated virus)	10	70	17
FIA	10	70	17
IV+Saponin	8	62.5	22
IV+Squalene	6	50	38
IV+Squalene+Saponin	10	30	63
IV+Squalene+Alum	10	40	50
IV+Squalene+Saponin+Alum	10	60	25

1.3. 면역보조제 첨가 백신의 효능

백신을 접종하지 않고 VHSV로 공격감염시킨 구(MEM구)는 80%가 폐사하였고, 면역보조제를 첨가하지 않고 불활화시킨 바이러스만으로 면역한 구는 70%가 폐사하였다. 강력한 면역보조제로 생각되는 FIA를 면역보조제로 사용한 구는 70%가, 면역보조제로 사포닌을 첨가한 구는 (IV+Saponin)는 62.5%가 폐사하였다.

스쿠알렌이 포함된 4구 모두 다른 구들 보다는 폐사가 적게 발생하였는데, 그 중에서도 스쿠알렌과 사포닌이 포함된 구 (IV + Squalene + Saponin)가 30%, 스쿠알렌과 수산화알루미늄이 포한된 구 (IV + Squalene+Alum)가 40%로 폐사가 적게 발생하였다. 그러나 스쿠알렌, 사포닌과 수산화알루미늄 모두를 첨가한 구(IV + Squalene + Saponin + Alum)는 60%가 폐사하였다.

상기의 다양한 면역보조제를 사용함으로써 12주 후까지 VHSV에 대한 방어력을 유지할 수 있었으며, 실험에 사용한 면역보조제 중에서는 스쿠알렌에 사포닌이나 수산화알루미늄을 첨가한 것이 효능이 가장 좋았다. 강력한 면역보조제인 FIA와 몇몇 연구에서 면역보조제로 효능이 뛰어난 것으로 알려진 사포닌 자체만으로는 넙치에 대한 VHSV백신의 면역보조제로서는 효능이 없었다(도 1).

실시예 2: 백신 조성물들의 면역 반응 평가

상기 실시예 1의 실험에서 12주째까지 면역보조제로 효능이 있었던 구들을 중심으로 면역을 하고, 3주와 6주째에 공격시험을 실시하여 이전의 실시예 결과와 동일한 효능이 있는지 확증하기 위하여 실험을 행하였다.

2.1. 면역시험

50L 수조에 에어레이션을 설치하고 매일 75% 환수 실시하였으며 각 그룹에 넙치(어체중 20±2g) 40마리씩을 넣었다. 백신처리 전에 일주일간 순치시켰다. 아래 표 3과 같이 다양한 면역보조제를 첨가한 백신을 접종하였고, 한 그룹은 바이러스가 포함되지 않은 배지인 MEM만을 동량 복강에 주사하였다.

이전의 실험에서 효능이 없었던 스쿠알렌, 사포닌과 수산화알루미늄 모두를 첨가한 구는 이번 실험에서는 제외시켰다. 어체중의 2%의 일반사료를 급이했고, 실험기간 동안 수온은 20~23℃였다.

2.2. 공격시험

백신접종 3주차와 6주차의 실험어를 15℃ 항온실로 옮겨서 FHM 주화세포로 배양한 VHSV를 접종하였다. 각 실험어는 200㎕(10^8.1TCID₅₀/fish)의 VHSV를 접종하였고, naive구는 동량의 MEM을 접종하였다.

2.3. 면역보조제 첨가 백신의 효능 (백신접종 3주째):

백신을 접종하지 않고 VHSV로 공격감염시킨 구(MEM구)는 70.5%가 폐사하였고, 면역보조제를 첨가하지 않고 불활화시킨 바이러스만으로 면역한 구(IV)는 47%가 폐사하였다. 그러나 불활화시킨 바이러스 백신에 면역보조제로 FCA와 사포닌을 첨가한 구는 각각 94.1%와 88.3%가 폐사하였다. 백신에 스쿠알렌을 첨가한 구 (IV+ Squalene)는 35.8%가 폐사, 백신에 스쿠알렌과 수산화알루미늄을 첨가한 구(IV+ Squalene+Alum)는 17.6%가 폐사하였고, RPS는 각각 51%와 76%였다(도 2, 표 3).

스크리닝한 면역보조제를 첨가한 백신을 접종하고 3주 후 공격 감염한 넙치의 누적폐사율과 상대생존율

Vaccine group	No. of fish Challenged	Cumulative mortality (%)	RPS
Naive	17	0	100
MEM	17	70.5	-
IV(inactivated virus)	17	47	37
FCA	17	94.1	0 (-33)
IV+Saponin	17	88.3	0 (-25)
IV+Squalene	17	35.2	51
IV+Squalene+Alum	17	17.6	76

2.4. 면역보조제 첨가 백신의 효능 (백신접종 6주째):

백신을 접종하지 않고 VHSV로 공격감염시킨 구(MEM구)는 94.4%가 폐사하였고, 면역보조제를 첨가하지 않고 불활화시킨 바이러스백신만으로 면역한 구(IV)는 100%가 폐사하였다. 그러나 백신에 면역보조제로 사포닌을 첨가한 구는 88.2%가 폐사하였다. 백신에 스쿠알렌을 첨가한 구 (IV+Squalene)는 42.8%가 폐사, 백신에 스쿠알렌과 수산화알루미늄를 첨가한 구(IV+Squalene+Alum)는 44.4%가 폐사하였고, RPS는 각각 55%와 53%였다(도 3, 표 4).

스크리닝한 면역보조제를 첨가한 백신을 접종하고 6주후 공격감염한 넙치의 누적폐사율과 상대생존율

Vaccine group	No. of fish Challenged	Cumulative mortality (%)	RPS
Naive	18	0	100
MEM	18	94.4	-
IV	12	100	0 (-4)
IV+Saponin	17	88.2	7
IV+Squalene	14	42.8	55
IV+Squalene+Alum	18	44.4	53

상기 결과에 따라 실시예 1의 면역 12주째에 바이러스로 공격한 실험과 실시예 2의 면역 3주째와 6주째 모두에서 백신에 면역보조제로 스쿠알렌 단독, 혹은 스쿠알렌에 수산화알루미늄을 첨가한 것이 백신을 단독으로 투여하는 것보다 훨씬 효능이 좋았다. 면역보조제를 사용하지 않고 백신단독 접종으로는 6주와 12주까지 면역이 지속되지 않았다. 실시예 1과 실시예 2 모두에서 Fruends' adjuvant와 물기반의 사포닌은 넙치의 VHSV에 대한 면역보조제로 적합하지 않았다.

실시예 3: 면역보조제 스쿠알렌의 농도 조성 차이에 따른 백신효능 평가

[실시예 1]과 [실시예2]에서 스쿠알렌을 포함하는 면역보조제가 효능이 있었으므로, 가장 적합한 스쿠알렌의 농도의 찾기 위하여 실험을 실시하였다. 또한 수산화알루미늄을 단독 사용한 경우와 스쿠알렌에 수산화알루미늄을 혼합사용할 때의 효능의 차이를 알아보고자 하였다.

3.1. 면역

250L 순환수조에 에어레이션을 설치하고 각 그룹 45마리의 실험어(평균체중 15.24g)를 넣은 12개 그룹을 준비하였다. 매일 어체중 2%의 일반사료를 급이했다. 백신처리를 위해 1주간 순치시켰다.

백신은 불활화 VHSV(IV)단독, 불활화 VHSV(IV)에 각각 1%, 5%, 10% 의 스쿠알렌에 0.5%의 수산화알루미늄을 넣은 것과 넣지 않은 것 6가지로 구분하여 면역보조제들을 혼합한 것, 불활화 VHSV(IV)에 FIA를 넣은 것과 0.5% 수산화알루미늄, 5% 스쿠알렌 에멀젼을 항원 없이 넣은 구, naive구와 MEM 접종구이다. VHSV 접종 전에 마리당 100㎕의 제제를 각자의 그룹별 마다 처리하여 4주 동안 유지하였다. 수온은 4주간 평균 15.52℃(434.8 degree days)였다. 10주차 까지의 평균수온은 10.15℃(710.2 degree days)였다.

상기 1%, 5%, 10% 의 스쿠알렌은 실시예 1의 3)에서 상술한 바와 같이 100ml의 백신을 만들기 위하여 각각 1, 5, 10ml의 스쿠알렌, 20ml의 글리세롤, 0.5ml의 계면활성제(Tween 80)를 넣고 동물세포배양용 배지인 MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen Corp, Cat. No., 12100-046)을 넣어 50ml로 맞춘 후 5분간 와류발생(voltex)시켰다. 그 후 50ml의 불활화 VHSV를 넣고 얼음 위에서 10분간 균질기(homogenizer)로 교반한 3종류의 조성물을 의미한다.

3.2. 공격시험

백신접종 4주차에 백신처리 한 실험어 절반을 15℃ 항온실로 옮겨서 VHSV접종하였다. 각 실험어는 200㎕(10^7.1TCID₅₀/fish)의 VHSV를, naive구는 MEM을 접종하였다. RPS와 폐사율은 표 5와 도 4에 나타내었다. 또한 10주차 공격실험한 결과는 표 6과 도 5에 나타내었다.

백신처리 4주 후 VHSV 접종한 실험어의 폐사율과 상대생존율 도표.

Vaccine group	No. of fish Challenged	Cumulative mortality (%)	RPS
Naive	20	0	100
MEM	50 (25/tank, 2 tanks)	82	-
IV(inactivated virus)	21	52.3	37
IV+FIA	21	80.9	3
IV+Squalene 1%+Alum	21	66.6	19
IV+Squalene 1%	20	65	21
IV+Squalene 5%+Alum	20	35	58
IV+Squalene 5%	21	57.1	31
IV+Squalene 10%+Alum	20	55	33
IV+Squalene 10%	20	45	46
IV+Alum	21	66.6	19
Squalene 5%+Alum	21	80.9	3

백신처리 10주 후 VHSV 접종한 실험어의 폐사율과 상대생존율 도표.

Vaccine group	No. of fish Challenged	Cumulative mortality (%)	RPS
Naive	20	0	100
MEM	40 (20/tank, 2 tanks)	85	-
IV(inactivated virus)	20	45	48
IV+FIA	20	25	71
IV+Squalene 1%+Alum	20	25	71
IV+Squalene 1%	20	40	53
IV+Squalene 5%+Alum	20	15	83
IV+Squalene 5%	20	30	65
IV+Squalene 10%+Alum	20	10	90
IV+Squalene 10%	20	20	77
IV+Alum	20	40	53
Squalene 5%+Alum	20	80	6

3.3. 스쿠알렌 농도 조성의 차이에 따른 백신의 효능

3.3.1 백신 4주 후

백신을 접종하지 않고 VHSV로 공격감염시킨 구(MEM구)는 82%가 폐사하였고, 면역보조제를 첨가하지 않고 불활화시킨 바이러스백신만으로 면역한 구(IV)는 52.3%가 폐사하였고, 면역보조제로 FIA을 첨가한 구는 80.9%가 폐사하였다.

면역보조제로 스쿠알렌을 1%, 5%, 10% 첨가한 구는 폐사율이 각각 65%, 57.1%, 45% (RPS는 21%, 31%, 46%)였다. 스쿠알렌 1%, 5%, 10%에 수산화 알루미늄을 0.5% 첨가한 구는 폐사율이 각각 66.6%, 35%, 55% (RPS는 19%, 58%, 46%)이었다. 수산화 알루미늄만을 0.5% 첨가한 구는 폐사율이 66.6% (RPS 19%)였다. 모든 실험구 중에서 가장 백신의 효능이 뛰어난 것은 불활화한 VHSV(IV)에 스쿠알렌 5%에 수산화 알루미늄를 0.5%첨가한 그룹이었다(표 5, 도 4).

백신성분 없이 면역보조제인 스쿠알렌 5%에 수산화 알루미늄를 0.5% 첨가한 것으로 면역한 실험구는 80.9%가 폐사하여 면역하지 않은 MEM구와 비슷한 폐사를 보여 접종한 백신특이적인 방어가 형성되어 있음을 알 수 있었다.

3.3.2 백신 10주 후

10주차에 백신을 접종하지 않고 VHSV로 공격감염시킨 구(MEM구)는 85%가 폐사하였고, 면역보조제를 첨가하지 않고 불활화시킨 바이러스백신만으로 면역한 구(IV)는 45%가 폐사하였고, 면역보조제로 FIA을 첨가한 구는 25%가 폐사하였다.

면역보조제로 스쿠알렌을 1%, 5%, 10% 첨가한 구는 폐사율이 각각 40%, 30%, 20% (RPS는 53%, 65%, 77%)였다. 스쿠알렌 1%, 5%, 10%에 수산화 알루미늄을 0.5% 첨가한 구는 폐사율이 각각 25%, 15%, 10% (RPS는 71%, 83%, 90%)이었다. 수산화 알루미늄만을 0.5% 첨가한 구는 폐사율이 40% (RPS 53%)였다. 이번에는 모든 실험구 중에서 가장 백신의 효능이 뛰어난 것은 불활화한 VHSV(IV)에 스쿠알렌 10%에 수산화 알루미늄을 0.5%첨가한 그룹이었다(도 5, 표 6). 지난 실험에서 가장 효능이 뛰어났던 스쿠알렌 5%에 수산화 알루미늄을 0.5% 첨가한 그룹은 그 다음으로 높은 효능을 나타내었다.

불활화바이러스 성분 없이 면역보조제인 스쿠알렌 5%에 수산화알루미늄 0.5%를 첨가한 실험구는 80%가 폐사하여 면역하지 않은 MEM구의 85%폐사율과 비슷하여 바이러스 특이면역이 형성됨을 알 수 있었다.

결론적으로 VHSV의 불활화백신에 면역보조제로 스쿠알렌을 5%, 10%만을 첨가한 것, 스쿠알렌 1%, 5%, 10% 각각에 수산화 알루미늄을 0.5% 첨가한 것이 백신으로 효능이 뛰어난 것을 알 수 있었다. 또한, 수산화 알루미늄의 첨가가 백신의 효능을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

백신에 면역보조제로 스쿠알렌 10%를 첨가한 그룹에서 10주차가 4주차보다 효과가 좋았던 것은 높은 오일(oil) 함량으로 말미암아 항원 방출이 늦어져 면역이 생성되기까지 오랜시간이 소요되었기 때문으로 판단된다.

실시예 4: 최적의 면역보조제가 혼합된 VHSV백신의 방어지속기간의 평가

최적의 면역보조제가 혼합된 VHSV백신의 방어지속기간을 알아보고자 실제 넙치사육 양식장에서 대량의 넙치에 면역을 실시하여, 최적의 면역보조제가 혼합된 VHSV백신의 방어지속기간을 알아보았다. 5%의 스쿠알렌에 0.5% 수산화알루미늄이 포함된 것, 10% 스쿠알렌에 0.5% 수산화 알루미늄이 부가적으로 포함된 것의 2가지가 가장 높은 효능을 보였으나, 면역형성에 상대적으로 짧은 시간이 소요되는 5% 스쿠알렌에 0.5% 수산화 알루미늄을 부가적으로 포함하는 것이 현장적용에 더 적합한 것으로 판단하였다.

4.1 면역

넙치(평균체중 15.24g)는 무작위로 골라서 1000마리씩 두 개의 그룹으로 나누어 직경 6m 양식 원형 수조에 넣었다. 백신처리 전에 1주일간 하루 2%의 일반사료를 주면서 순치시켰다.

4.2. 백신과 백신처리

불활화 VHSV에 5% 스쿠알렌과 0.5% 수산화알루미늄을 혼합하였다. 바이러스는 FHM 주화세포로 얻은 바이러스를 사용했다. 불활화 VHSV와 동량의 5% 스쿠알렌을 혼합하였고 0.5% 수산화알루미늄을 부가적으로 첨가했다. 100㎕의 백신혼합물을 연속주사기를 통해서 주사하였고, 동량의 MEM을 대조구에 주사하였다.

4.3. 감염 실험

백신 처리 후, 3주, 6주, 12주째에 백신처리된 실험어를 15℃ 항온실로 옮겨서 VHSV 접종했다. 수온은 3주간 평균 18.1℃(380.2 degree days), 6주간 평균 16.35℃(687.1 degree days), 12주간 평균 약 13℃(1090.4 degree days)의 수온을 나타냈다. 각 실험어는 200㎕(10^7.1TCID₅₀/fish)의 VHSV를 접종했고, naive는 MEM을 접종하였다. 백신처리 3주 후, 6주 후 및 12주 후의 RPS와 폐사율은 표 7 내지 9 및 도 6 내지 8에 나타내었다.

백신처리 3주 후 VHSV 공격감염 한 실험어의 누적폐사율과 상대생존율 도표

Vaccine group	No. of fish Challenged	Cumulative mortality (%)	RPS
Naive	30	0	100
IV+Squalene 5%+Alum	25	32	60
MEM	25	80	-

백신처리 6주 후 VHSV 공격감염한 실험어의 누적폐사율과 상대생존율 도표

Vaccine group	No. of fish Challenged	Cumulative mortality (%)	RPS
Naive	25	0	100
IV+Squalene 5%+Alum	50(25/tank, 2 tanks)	30	64
MEM	50(25/tank, 2 tanks)	82	-

백신처리 12주 후 VHSV 공격감염한 실험어의 누적폐사율과 상대생존율

Vaccine group	No. of fish Challenged	Cumulative mortality (%)	RPS
Naive	20	0	100
Squalene 5%+Alum	40(20/tank, 2 tanks)	25	71
MEM	40(20/tank, 2 tanks)	85	-

이상의 결과에 의하면 백신 처리 후, 3주, 6주, 12주째에 VHSV 접종을 한 결과 각각 60, 64, 71%의 상대생존율을 보여 최적의 면역보조제가 혼합된 VHSV백신의 방어지속기간은 백신 처리 후 최소 12주까지 지속 되는 것으로 확인되었다.

통상 어류의 바이러스성 출혈성패혈증이 발병되면 수 일 이내에 폐사하는 것을 감안하면 백신과 면역보조제를 함께 투여함으로서 치유기간을 확보하여 생존율을 높일 수 있는 것으로 판단된다.

어류의 바이러스성 출혈성패혈증에 대해 효과적으로 면역을 증진시키는 뛰어난 조성물의 성분비를 밝힘으로서 국산 백신의 경쟁력을 강화시키고 양식산업 전반에 예방법 활성화로 항생제와 화학약품의 사용이 상당수 감소하여 안전한 먹거리를 공급하여 국민 보건을 증진시키며, 생태계 보전에도 이바지할 것으로 기대된다.

Claims

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A) 바이러스성 출혈성 패혈증 불활화 백신(viral haemorrhagic septicemia virus vaccine; VHSV)를 0.3%(V/V)의 포르말린과 혼합하여 4℃에서 12시간 동안 교반하여 불활화시키는 단계;
B) 스쿠알렌 1-10 %(V/V), 글리세롤 20 %(V/V), 계면활성제 0.5 %(V/V)를 넣고 배지성분 MEM을 넣어 50 %(V/V)로 맞추어 5분간 와류발생(voltex)시키는 단계;
C) A)단계에서 제조된 불활화 VHSV 50 %(V/V)를 B)단계의 조성물과 혼합하여 얼음위에서 10분간 균질기(homogenizer)로 교반하는 단계로 이루어진 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물을 포함하는 어류의 바이러스 백신 제조방법.
제6항에 있어서 C)단계 이후에 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물 100 %(V/V)의 중량 대비 0.5 중량%의 수산화알루미늄을 부가적으로 더 첨가하여 교반하는 단계를 포함하는 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물을 포함하는 어류의 바이러스 백신제조방법.
제6항에 있어서 C)단계 이후에 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물 100 %(V/V)의 중량 대비 0.5 중량%의 수산화 알루미늄과 0.01 중량%의 사포닌을 더 첨가하여 교반하는 단계를 포함하는 어류의 바이러스 백신용 면역보조제 조성물을 포함하는 어류의 바이러스 백신제조방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 백신