KR20200120791A

KR20200120791A - 고병원성 에어로모나스 살모니시다 RTDH(Aeromonas salmonicida RTDH) 균주 및 이를 이용한 백신 조성물

Info

Publication number: KR20200120791A
Application number: KR1020190042554A
Authority: KR
Inventors: 홍수희; 임종원; 이상민
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2020-10-22
Also published as: KR102199932B1

Abstract

본 발명은 무지개송어에서 분리된 에어로모나스 살모니시다 RTDH(Aeromonas salmonicida RTDH) 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 에어로모나스 살모니시다 RTDH는 어류의 에어로모나스 살모니시다 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

고병원성 에어로모나스 살모니시다 RTDH(Aeromonas salmonicida RTDH) 균주 및 이를 이용한 백신 조성물{High-pathogenic Aeromonas salmonicida RTDH and vaccine composition using the same}

본 발명은 고병원성 에어로모나스 살모니시다 RTDH(Aeromonas salmonicida RTDH) 균주 및 이를 이용한 백신에 관한 것이다.

연어과 어류인 무지개송어는 국내 내수면 양식 어업에서 뱀장어, 메기 다음으로 주요 품종이다. 최근 전국 각지에서 행해지는 송어, 산천어 축제 및 연어과 어류에 대한 선호도 증가로 인해 수요가 급증하고 있다. 무지개송어를 비롯한 연어과 어류는 냉수성 어종으로 여름철 고수온기에 에로모나스속의 세균감염에 의한 감염성 질병으로 양식 산업에서 매우 큰 경제적 손실이 발생하고 있다.

연어과 어류에서 가장 문제가 되는 세균성 질병인 절창병은 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)가 원인균이다. 특히 수온이 상승하거나 하강하는 시점에서 주로 발생하며 일반적으로 고령어에서 많이 보고되고 있으나, 당년생에서도 발병하게 된다. Aeromonas salmonicida의 어원은 salmo가 salmon, cida는 cut 또는 kill로 연어를 죽인다는 의미로 지어진 이름으로 절창병에 걸린 병어는 외부에서 보기에 체표에 1개 또는 수개소의 팽융된 환부가 형성되고, 궤양은 외부손상에 의한 것이 아니며, 모세 혈관 내에서 병원균이 증식해서 혈관 벽과 근육을 붕괴시켜 피와 농이 나오고 조직이 괴사된다. 또한 사람에도 패혈증, 뇌수막염 및 폐렴과 같은 질병을 일으킬 수 있다. 1896년 Lehmann과 Neumann에 의해 처음 알려진 에어로모나스 살모니시다는 다섯 가지의 아종 중, subsp. salmonicida의 정형(typical type)이, 주로 연어류에서 절창병을 일으키며, 다른 네 가지 아종 subsp. achromogenes, subsp. masoucida, subsp. smithia, subsp. pectinolytica의 비정형(atypical type)은 50여종이 넘는 어류에서 질병을 일으킨다고 보고되었다.

이러한 연어과 어류의 절창병을 치료 및 예방하기 위하여서는 항생제 및 백신이 사용될 수 있으나 국내에서는 절창병에 대한 백신이 아직 개발되지 않은 바, 항생제를 이용한 치료가 주로 실시되고 있다. 그러나 항생제의 사용은 약제 내성균을 발생시킬 수 있으며 어체 내 잔존 약제에 대한 수산물 안정성의 문제로 어체 내 항생제 잔류량이 일정 제거될 때까지 출하할 수 없다.

전 세계적으로 연어과 어류에 대한 많은 백신들이 개발 및 상용화되어 있고, 특히 연어 주요 생산국인 노르웨이같은 경우 절창병 예방 백신 등과 같은 백신 접종으로 인한 연어의 질병 예방이 이루어져 항생제 사용의 감소와 양식연어의 생산성을 크게 증가시켰다. 국내에서는 어병예방을 위하여 사용이 승인된 수산용 백신이 20종이며 이중 19종이 넙치의 질병에 대한 백신들이며 연어과 어류 질병에 대한 국내백신은 전혀 없는 실정이다. 최근 연어과 어류에 대한 비브리오 백신을 유럽으로부터 수입하여 사용한 적이 있으나 그 효능은 입증되지 않았는데, 이는 같은 종의 균이라고 하더라도 유럽과 한국의 지리적인 거리에 따라 다른 항원성을 가지기 때문일 수 있을 것이다. 따라서 국내에서 발생하는 어병 균주에 대한 백신을 개발하여야 국내질병에 대한 효율적인 예방이 가능할 것이다. 또한 병원성의 차이를 나타내는 균주의 특성을 고려하여 고병원성 균주에 대한 백신의 개발이 어류에서 발생하는 질병을 예방하기 위하여 필수적이라 할 수 있다. 이러한 균주의 병원성 차이는 균주마다 병원성 유전자의 보유여부 혹은 발현의 차이에서 기인하고 있으며 이는 분자생물학적인 방법으로 확인가능하다.

이에 본 발명자들은 정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida supsb. salmonicida)에 대한 연어과 어류 백신 개발을 연구하였고, 2017년 8월 강원도 내 위치한 양식장에서 무지개송어의 대량 폐사가 확인되어 근육 출혈을 나타내는 어체의 신장으로부터 고병원성 균주를 분리하여 분석을 실시하였다. 분리된 고병원성 균주가 불활화 백신으로서 절창병 예방에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Bergh P. V., Burr S. E., Benedicenti O., von Siebenthal B., Frey J., Wahli T.: Antigens of the type-three secretion system of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida prevent protective immunity in rainbow trout. Vaccine. 31(45):5256-61, 2013.

본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC13827BP의 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이로부터 유래한 단백질을 항원으로 포함하는 어류의 에어로모나스 살모니시다 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 어류에 투여함으로써 어류의 에어로모나스 살모니시다 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 포함하는 어류의 에어로모나스 살모니시다 감염의 예방 또는 치료를 위한 사료 조성물을 제공하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 어류에서 에어로모나스 살모니시다에 감염성을 가지는 균주를 분리하였고, 이 균주 중 고병원성을 나타내는 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 에어로모나스 속 균주인 에어로모나스 살모니시다 RTDH KCTC13827BP를 무지개송어에서 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따른 에어로모나스 살모니시다 RTDH KCTC13827BP는 어류 유래의 에어로모나스 살모니시다 신규 균주이다.

본 발명의 실시예를 통해 분리된 절창병에 대해 고병원성을 나타내는 에어로모나스 살모니시다 RTDH의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 분석 결과, 상기 균주를 보다 정확히 동정하기 위하여 하우스키핑유전자인 rpoD(RNA polymerase sigma factor) 프라이머를 이용하여 rpoD(RNA polymerase sigma factor) 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 2의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명의 실시예를 통해 병원성 유전자를 분석한 결과, 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주에서 T3SS(Type three secretion system)가 병원성에 크게 관여하는 것으로 나타났다.

하기 실시예에서 인위감염 테스트를 통해 연어과 어류에 대한 병원성 시험을 실시하여 누적 폐사율을 조사한 결과, 에어로모나스 살모니시다 RTDH가 고병원성 갖는 것을 확인했다.

따라서, 연어과 어류에 대해 에어로모나스 살모니시다 백신을 사전 투여할 경우 재감염 정도를 낮출 수 있어, 에어로모나스 살모니시다가 유발하는 질병에 대해 유용하게 사용될 수 있다.

그러므로 본 발명은 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주 또는 이로부터 유래한 단백질을 항원으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적인 제제(製劑)로서, 감염증의 예방을 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원(免疫原)을 말한다. 생체내 면역은 병원균의 감염 후에 생체내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.

본 발명의 백신 조성물에 있어서, 상기 항원으로 사용될 수 있는 것은, 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주 그 자체 또는 그로부터 유래된 단백질일 수 있다. 여기에서 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주는 불활화 균체, 약독화된 균체 또는 사균체로써 사용될 수 있다. 또한, 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주 유래의 단백질이 사용될 수 있는데, 상기 단백질은 RTDH 균주로부터의 통상적인 단백질 정제 또는 유전 공학적 재조합을 통해 항원을 만들어 사용할 수 있다.

상기 균주 유래의 단백질은 포린(porin), 리파아제(lipase), 세린 프로테아제(serine protease), 에어로라이신(aerolysin), 헤모라이신(haemolysin), 아연 메탈로프로테아제(zinc metalloprotease), 콜라게나아제(collagenase), 엘라스타아제(elastase), 엔테로톡신(enterotoxin), T3SS 구조 단백질 및/또는 T3SS 이펙터 단백질 등이 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 에어로모나스 살모니시다 RTDH KCTC13827BP (Aeromonas salmonicida RTDH KCTC13827BP)를 포함하는 에어로모나스 살모니시다 감염에 대한 백신은 생물학적 제제로써 사용되어 어류의 양식 산업 등에 적용시킬 수 있다.

상기 에어로모나스 살모니시다 감염은 연어과 어류에 대한 질병을 유발하며, 상기 질병은 절창병(furunculosis), 세균성 패혈증(septicemia), 전신 감염(systemic infection), 안구돌출증(exophthalmia), 점상출혈(petechiae), 복수(ascites), 빈혈증(anaemia), 출혈성 병변(haemorrhagic lesions), 검은피부색(darkened skin), 흑색종(melanomas), 식욕감퇴(loss of appetite) 또는 무기력증(lethargy)일 수 있으며, 바람직하게는 절창병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 연어과 어류는, 연어(Oncorhynchus keta), 곱사연어(Oncorhynchus gor-buscha), 산천어(Oncorhynchus masou), 무지개송어(Oncorhynchus mykiss), 은연어(Oncorhynchus kisutch) 및 열목어(Brachymystax lenok)일 수 있으며, 바람직하게는 무지개송어일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 약학적으로 허용되는 어쥬번트(adjuvant) 및 담체를 추가로 포함하는 것인 백신 조성물을 제공한다.

상기 어쥬번트는, 비이온성 계면활성제, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 스쿠알렌 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 백신 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 어류에 투여함으로써 어류의 에어로모나스 살모니시다 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 복강내 투여, 근육내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 또는 침지 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 백신은 단독으로 10⁸ 내지 10¹⁰CFU/fish로 투여한 백신이 효과적일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 백신은 사균체로 투여시 어체당 10mg/dose 농도로 투여될 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서 상기 백신 조성물을 포함하는 어류의 에어로모나스 살모니시다 감염의 예방 또는 치료를 위한 사료 조성물을 제공한다.

상기 백신 조성물은 어분, 육분, 대두박, 면실박, 지렁이, 개구리, 새우 및 이들의 혼합물을 포함하는 사료 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 사료 조성물의 형태는 건사료와 같은 고형사료, 습사료, 또는 생사료 등 일반적인 사료 형태일 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함되는 에어로모나스 살모니시다 RTDH 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 0.001 내지 10%(w/w)일 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명에 따른 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 포함하는 어류의 에어로모나스 살모니시다 감염 예방용 백신은 상기 감염을 효과적으로 면역을 증진시키는 효과를 나타냄으로써 이를 효과적으로 예방할 수 있어, 어류의 양식 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 TSA배지에 20℃에서 48시간 배양한 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주의 사진이다.
도 2는 16S rDNA 유전자의 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR(polymerase chain reaction) 산물의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 rpoD 유전자의 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 전기영동 결과 및 염기서열을 나타낸 사진이다.
도 4는 TSB 배지에 20℃에서 200rpm, 48시간 배양 시 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5는 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주의 gDNA 분리 후 12개 병원성 유전자의 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 균주로부터 RNA 추출 후 cDNA(complementary DNA)를 합성하여 T3SS 구성 유전자의 발현을 PCR로서 확인한 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주와 다른 에어로모나스 살모니시다 균주를 농도별로 무지개송어 복강내 주사한 후 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 공격실험에서 에어로모나스 살모니시다 RTDH에 감염된 무지개 송어 모습으로 C와 D같이 피부 괴사 및 출혈들이 발생하고, B처럼 간이 붉게 변하거나 점상 출혈이 발생하여 정형적인 에어로모나스 살모니시다 감염 증상을 나타낸 사진이다.
도 9는 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주가 다른 연어과에서도 병원성을 보이는지 확인하기 위해 은연어에 농도별로 복강내 주사한 후 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 백신 단독 및 보조제 혼합액을 주사한 후 8주 뒤에 보호효과를 보이는지 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 무지개송어에 복강내 주사한 후 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida) 균주 분리 및 동정

2017년 1월에서 2018년 2월 사이에 22개 연어과어류 양식장으로부터 세균성 질병을 모니터링한 결과, 에로모나스속 균주가 가장 많이 분포되어 있는 것으로 나타났다. 이 중 가장 많이 분리된 에어로모나스 살모니시다와 에로모나스 소브리아 균에 대한 인위감염을 실시한, 결과 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주에서 가장 높은 병원성이 나타났고. 하기와 같이 분석하였다.

에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주는 2017년 8월 강원도 내 위치한 양식장에서 대량 폐사가 진행중이던 무지개송어(Oncorhynchus mykiss)에서 분리되었으며, 당시 절창병의 전형적인 특징인 근육 출혈을 나타내는 어체를 샘플링한 후, 병어의 외부 및 내부 증상을 관찰하고 전신, 비장, 간 및 아가미로부터 TSA배지를 이용하여 25℃에서 24시간 배양 후 세균을 분리 배양하였다. 분리균주는 그람 음성 간균으로 확인됐고, 티로신이 첨가된 배지에서 갈색색소를 보이며, 동그랗고 딱딱한 콜로니를 형성하였다(도 1).

상기 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 동정하기 위하여 배양된 균주의 콜로니를 주형으로 16S rDNA 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 10분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초간 결합, 72℃에서 1분간 신장을 35회 반복하였다. 그 후, 72℃에서 7분간 최종 신장 단계를 거쳤다. 상기 증폭된 PCR산물은 염기서열 분석을 하고, NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 blast search (Megablast)을 통해 에로모나스속 임을 확인하였다.

결과로, 에어로모나스 살모니시다 RTDH의 16S rDNA 염기서열 정보를 얻었으나, 이 단계에서 정확한 종 동정을 할 수 없었다.

균주의 동정을 위해 16S rDNA gene 프라이머 세트를 사용하였다;

<SEQ ID NO: 3> EUB-F: 5`-ACGCTGGCGGCAGGCCTAACAC-3`

<SEQ ID NO: 4> EUB-R: 5`-ATTACTAGCGATTCCGTCTTC-3`

도 2는 16S rDNA 유전자를 기반으로 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 결과 약 1300bp의 유전자 단편이다.

<SEQ ID NO: 1> Aeromonas salmonicida RTDH의 16S rDNA (1086bp)

GGGCCGACGGCGCGGGAAGTTAGCTTTGCTTCCTTTCTGCCGGCGAAGCGGCGGACGGGTTGAGTAATGCCTGGGGATCTGCCCAGTCCGAGGGGGATAACAGTTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGAGGGGACCTTCGGGCCTTTCGCGATTGGATGAACCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAAGGTTGGCGCCTAATACGTGTCAACTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTGGATAAGTTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTAAAACTGTCCAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAAATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGCTGTGTCCTTGAGACGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCTGGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGAAATCAGAACACGAGTGCTGCGTGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATATTGGGGTAAGGTCCCGCAAAGGGGGGAAACCCCGTGCCTTTGTTGCCAGCAGT

상기 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 보다 정확히 동정하기 위해 하우스키핑 유전자인 rpoD 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. 이하 과정은 상기 사용된 방법으로 동일하게 진행하여 에어로모나스 살모니시다 임을 확인하였고 에어로모나스 살모니시다 RTDH의 rpoD 염기서열 정보를 얻었다.

rpoD 프라이머 세트의 염기서열은 아래와 같다.

<SEQ ID NO: 5> rpoD-F2: 5`-GAAGGCGAAATCGACATCGC-3`

<SEQ ID NO: 6> rpoD-R1: 5`-CTCTGCGTTGAGCAGGCCAA-3`

도 3은 rpoD 유전자를 기반으로 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 결과 약 500bp의 유전자 단편이다.

<SEQ ID NO: 2> Aeromonas salmonicida RTDH의 rpoD (593bp)

AAACTAAAACGTATCACCAGGTACAAGCTCCGTTGCCGAGTACCCAGAAGCGATTACCTATCTGCTTGAGCAGTATGATAAATACGAAGCCGAACAGCTGGGTCTGTCCGATATCATCTCAGGTTTTATCGATCCCAACGAGGCCGATGATGTAGCACCGACTGCTACCCATATCGGTTCCGAACTCGGCGAAGACGATCTGGCCGACGAAGACGAAGATGAAGACGACGATGGTGACAGCTCGGATGACGAAGGTGACGGTGGTCCTGATCCGGAAGTTGCTCGCGAGAAGTTTGGTGATCTGCGTGCCCAGTATGAGGTAACTCGCCTCTCCATTCAGAAGAATGGCCGTGCTCACGAAGATACCCAGGCTGCGATTGCCCAGCTGGCCGATGTGTTCCGTCAATTCCGCCTGATGCCCAAGCAGTTCGATCGCTTGGTCAACAACATGCGCGAAATGATGGAGCGCGTCCGCGTGCAAGAACGCATCATCATGAAGCTCTGCGTTGAGCAGGCCCAAAAAAAAAAAGGAGGAGGCGGGTGGGGGGGGAGGGGGAGAGAGAGGGGGGGCAGGAGCCGAGGGGGGGGCGTCG

실시예 2: Aeromonas salmonicida RTDH 균주의 특성 조사

상기 실시예 1에서 동정된 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주의 특성을 조사하기 위하여, 생화학적, 분리균주의 생장 분석, 병원성 유전자를 분석하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

2-1. 생화학적 특성 조사

생화학적 특성 규명을 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.

보다 구체적으로 제조사의 지침서에 따라 API 20NE TEST(BioMe´France)을 이용하여 실시예 1에서 동정된 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 25±2℃에서 48시간 배양하여 하기와 같이 Nitrate reduction, Esculinhydrolysis, Gelatinase에서만 양성 반응 결과를 나타냈다(표 1).

[표 1]

2-2. 분리균주의 생장 분석

분리균주의 생장 특성분석을 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.

보다 구체적으로 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 TSB 배지에 넣고 20℃에서 200rpm, 48시간 배양하였다. 탁도는 PowerWave X 340(BIO-TEK, USA)으로 600nm의 파장에서 분광광도계로 0시간부터 4시간까지는 1시간 마다, 4시간 이후부터는 2시간 마다 판독되었다. 그 결과 에어로모나스 살모니시다 RTDH는 0시간부터 4시간까지는 유도기, 4시간부터 16시간까지는 대수증식기에 들어갔다(도 4).

2-3. 병원성 유전자 조사

상기 실시예 1에서 동정된 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주에 대한 병원성 유전자를 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주에 대한 12개의 병원성 유전자들을 대상으로 분석하였다.

에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주는 Tissue SV mini kit(GeneALL, Korea)를 사용하여 의 gDNA를 추출하여 주형으로 12개의 병원성 유전자 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초간 결합, 72℃에서 30초간 신장을 35회 반복하였다. 그 후, 72℃에서 5분간 최종 신장 단계를 거쳤다.

T3SS 분비 장치에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 7> ascV_F: 5`-ATGGACGGCGCCATGAAGTT-3`

<SEQ ID NO: 8> ascV_R: 5`-TATTCGCCTTCACCCATCCC-3`

<SEQ ID NO: 9> ascC_F: 5`-GCATTGGAGCAACAGTCCCA-3`

<SEQ ID NO: 10> ascC_R: 5`-CCTTCAATCCCCTTGCGAT-3`

A-layer에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 11> vapA_F: 5`-TCGTTACTACCTCCCTCGCA-3`

<SEQ ID NO: 12> vapA_R: 5`-CACCCAAGACAGCTGTAGCA-3`

Cytotoxic enterotoxin에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 13> Act_F: 5`-AGAAGGTGACCACCAAGAACA-3`

<SEQ ID NO: 14> Act_R: 5`-AACTGACATCGGCCTTGAACTC-3`

Cytotonic enterotoxin에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 15> Ast_F: 5`-TCTCCATGCTTCCCTTCCACT-3`

<SEQ ID NO: 16> Ast_R: 5`-GTGTAGGGATTGAAGAAGCCG-3`

<SEQ ID NO: 17> Alt_F: 5`-TGACCCAGTCCTGGCACGGC-3`

<SEQ ID NO: 18> Alt_R: 5`-GGTGATCGATCACCACCAGC-3`

Lipase에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 19> Lip_F: 5`-ATCTTCTCCGACTGGTTCGG-3`

<SEQ ID NO: 20> Lip_R: 5`-CCGTGCCAGGACTGGGTCTT-3`

Elastase에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 21> Ela_F: 5`-ACACGGTCAAGGAGATCAAC-3`

<SEQ ID NO: 22> Ela_R: 5`-CGCTGGTGTTGGCCAGCAGG-3`

Flagellin에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 23> Fla_F: 5`-TCCAACCGTYTGACCTC-3`

<SEQ ID NO: 24> Fla_R: 5`-GMYTGGTTGCGRATGGT-3`

Haemolysin에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 25> hlyA_F: 5`-GGCCGGTGGCCCGAAGATACGGG-3`

<SEQ ID NO: 26> hlyA_R: 5`-GGCGGCGCCGGACGAGACGGG-3`

Aerolysin에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 27> aerA_F: 5`-GCWGARCCCRTCTATCCWG-3`

<SEQ ID NO: 28> aerA_R: 5`-TTTCTCCGGTAACAGGATTG-3`

Lateral flagella에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 29> laf_F: 5`-GGTCTGCGCATCCAACTC-3`

<SEQ ID NO: 30> laf_R: 5`-GCTCCAGACGGTTGATG-3`

수득한 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 통해 12개의 병원성 유전자의 존재를 확인하였다(도 5).

상기 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주에서 병원성에 크게 관여하는 것으로 알려진 T3SS와 vapA(A-layer) 유전자의 발현유무를 확인하였다. 또한 이 해당 유전자들은 다양한 배양 환경에서 손실되거나 변이로 인해 실제로 발현되지 않는 것으로 알려져 있으므로, 본 연구에서는 20℃와 25℃에서 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주와 대조군으로 다른 에어로모나스 살모니시다 OD170508-5균주(대조균)를 각 온도에서 24시간 배양한 후 RNA를 추출하여 유전자의 발현 유무를 확인했다.

보다 구체적으로, 20℃와 25℃에서 24시간에 각각 배양된 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주와 대조균의 RNA를 Qiazol을 이용한 guanidine-phenol extraction 법으로 추출하고, M-MULV 역전사효소를 포함하는 cDNA Synthesis kit(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 상기 사용된 방법과 동일하다.

균주의 mRNA 발현을 확인하기 위해 3종의 프라이머 세트를 사용하였다.

T3SS 분비 장치(secretion apparatus)에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 31> ascV_F2: 5`-TTTGCGCTGTCGGCCATCGT-3`

<SEQ ID NO: 32> ascV_R2: 5`-GCTGCCCGGTTTTGGCTTGC-3`

<SEQ ID NO: 33> ascC_F2: 5`-TATGTGGCAGAAGGGGAGAG-3`

<SEQ ID NO: 34> ascC_R2: 5`-TGCTCCAGATTGATGAGACG-3`

A-layer에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다.

<SEQ ID NO: 35> vapA_F2: 5`-TGGCTGCTTTTGGTACACTG-3`

<SEQ ID NO: 36> vapA_R2: 5`-CACGAATGTGGATGAGGTTG-3`

수득한 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 통해 병원성 유전자의 발현을 확인한 결과, 20℃와 25℃ 배양온도에 의한 차이는 나타나지 않았다. 그러나 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주는 T3SS 분비 장치 관련 유전자인 ascC와 ascV 유전자가 발현되는 것으로 나타났고, 반면 에어로모나스 살모니시다 OD170508-5균주(대조군)에서는 발현되지 않았다. 그 외 외막단백질 중 하나인 vapA(A-layer) 유전자는 두 균주 간에 차이가 나타나지 않았다.

도 6과 같이 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주와 대조군간의 T3SS 분비 장치 관련 유전자인 ascC와 ascV 유전자의 발현차이가 확인되었다.

2-4. 연어과 어류에 대한 병원성 시험

2-4-1. 무지개송어에 인위감염 테스트

상기 실시예 1에서 동정된 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주와 다른 에어로모나스 살모니시다 균주의 무지개송어에 대한 병원성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.

보다 구체적으로, 각기 다른 양식장의 무지개송어와 대서양연어에서 분리된 에어로모나스 살모니시다 균주들과 함께 하기 표 2와 같이 인위감염 후 3주간 폐사율을 조사하였다.

[표 2]

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주는 5.3×10⁵, 5.3×10⁴, 5.3×10³CFU/fish를 복강내 주사하여 인위감염결과 누적 폐사율이 각 100%, 61%, 46%로 나타났고, 높은 병원성을 나타내었다(도 7).

또한, 감염어들의 증상으로 일반적으로 주사된 피부에서 괴사나 출혈이 발생하였고, 복강과 항문에서도 출혈이 나타났다. 또한 간이 붉어지거나 울혈 등이 관찰되었다(도 8).

2-4-2. 은연어에 인위감염 테스트

상기 실시예 1에서 동정된 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주의 은연어에 대한 병원성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.

보다 구체적으로, 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 하기 표 3과 같이 인위 감염 후 3주간 폐사율을 조사하였다.

[표 3]

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주는 1.07×10⁶, 1.07×10⁵, 1.07×10⁴CFU/fish를 복강내 주사하여 인위감염 결과 누적 폐사율이 각 100%, 100%, 87%로 나타났고, 높은 병원성을 나타내었다(도 9).

실시예 3: 불활화 백신 제조 및 접종

상기 실시예 1에서 동정된 에어로모나스 살모니시다 RTDH를 이용한 백신 제조를 위하여, 하기와 같이 수행하였다.

보다 구체적으로, 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 TSB배지에 20℃, 48시간, 200rpm으로 배양하였다. 이후 배양액에 포르말린(v/v) 2%을 넣고 3시간 동안 동일한 조건으로 불활화하고, TSA배지에 배양하여 불활화를 확인하였다. 최종 배양물은 7000g × 25min 원심 분리하여 Pellet을 제외하고 상층액을 완전히 제거하였다. 불순물을 제거하기 위해 다시 30ml의 멸균 생리식염수로 세척하고, 이러한 과정을 동일하게 3회 더 실시하여 불순물을 완전히 제거하였다. 불순물이 제거된 pellet은 생리식염수를 첨가하고 100mg/ml로 재현탁하여 4℃에 보관하였다.

제조된 백신은 하기 표 4에서 보는 바와 같이 백신 접종구 및 대조구를 설정하였다. 시험어로는 에어로모나스 살모니시다에 대한 병원체에 대한 감염 경험이 없는 무지개송어로 2-페녹시에탄올(2-phenoxyethanol)을 이용하여 마취한 후 시험 백신을 어체 당 100㎕씩 복강 주사하였다. 대조구(PBS)는 멸균 생리 식염수를 동량으로 복강 주사하였다.

[표 4]

실시예 4: 불활화 백신의 복강 접종에 따른 백신 효과 확인 시험

상기 실시예 3에서 제조한 불활화 백신의 복강 접종에 따른 백신효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 3의 방법으로 백신 단독을 100㎕을 복강 접종하였고, 백신 접종 후 8주 후 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주를 1.5×10⁵CFU/ml농도로 공격 접종하였다. 이후 3주 동안 백신 접종구와 대조구에서의 누적 폐사율을 조사하였고, 상대생존율을 하기와 같이 수학식 1로 산출하였다. 그 결과를 하기 표 5 및 도 10에 나타내었다.

[표 5]

[수학식 1]

상기 표 5 및 도 10에서 나타낸 바와 같이 에로모나스 살모니시다 RTDH에 대한 백신 접종구의 상대 생존율은 10⁸CFU/fish 백신처리된 A 실험구 에서 81.8%로 다른 접종구보다 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 그 외 10⁶, 10⁷CFU/fish 백신 처리된 실험구의 상대생존율은 45.5%, 54.5% 수준으로 효과적인 방어 효능이 확인이 되지 않았다. 따라서 무지개송어 에어로모나스 살모니시다 감염 예방에 있어서 불활화 백신을 복강 접종시, 10⁸CFU/fish 농도로 투여한 백신이 가장 효과적인 것으로 확인되었다.

한국생명공학연구원

KCTC13827BP

20190313

<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> High-pathogenic Aeromonas salmonicida RTDH and vaccine composition using the same <130> P19U12C0170 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1086 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Aeromonas salmonicida RTDH <220> <221> gene <222> (1)..(1086) <223> Aeromonas salmonicida RTDH <400> 1 gggccgacgg cgcgggaagt tagctttgct tcctttctgc cggcgaagcg gcggacgggt 60 tgagtaatgc ctggggatct gcccagtccg agggggataa cagtttggaa acgactgcta 120 ataccgcata cgccctacgg gggaaaggag gggaccttcg ggcctttcgc gattggatga 180 acccaggtgg gattagctag ttggtggggt aatggctcac caaggcgacg atccctagct 240 ggtctgagag gatgatcagc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg 300 cagcagtggg gaatattgca caatggggga aaccctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga 360 agaaggcctt cgggttgtaa agcactttca gcgaggagga aaggttggcg cctaatacgt 420 gtcaactgtg acgttactcg cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt 480 aatacggagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcacg caggcggttg 540 gataagttag atgtgaaagc cccgggctca acctgggaat tgcatttaaa actgtccagc 600 tagagtcttg tagagggggg tagaattcca ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg 660 aggaataccg gtggcgaagg cggccccctg gacaaagact gacgctcagg tgcgaaagcg 720 tggggagcaa acaggattaa ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg tcgatttgga 780 ggctgtgtcc ttgagacgtg gcttccggag ctaacgcgtt aaatcgaccg cctggggagt 840 acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900 tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctggcct tgacatgtct ggaatcctgt 960 agagatacgg gagtgccttc ggaaatcaga acacgagtgc tgcgtggctg tcgtcagctc 1020 gtgtcgtgag atattggggt aaggtcccgc aaagggggga aaccccgtgc ctttgttgcc 1080 agcagt 1086 <210> 2 <211> 593 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Aeromonas salmonicida RTDH <220> <221> gene <222> (1)..(593) <223> Aeromonas salmonicida RTDH <400> 2 aaactaaaac gtatcaccag gtacaagctc cgttgccgag tacccagaag cgattaccta 60 tctgcttgag cagtatgata aatacgaagc cgaacagctg ggtctgtccg atatcatctc 120 aggttttatc gatcccaacg aggccgatga tgtagcaccg actgctaccc atatcggttc 180 cgaactcggc gaagacgatc tggccgacga agacgaagat gaagacgacg atggtgacag 240 ctcggatgac gaaggtgacg gtggtcctga tccggaagtt gctcgcgaga agtttggtga 300 tctgcgtgcc cagtatgagg taactcgcct ctccattcag aagaatggcc gtgctcacga 360 agatacccag gctgcgattg cccagctggc cgatgtgttc cgtcaattcc gcctgatgcc 420 caagcagttc gatcgcttgg tcaacaacat gcgcgaaatg atggagcgcg tccgcgtgca 480 agaacgcatc atcatgaagc tctgcgttga gcaggcccaa aaaaaaaaag gaggaggcgg 540 gtgggggggg agggggagag agaggggggg caggagccga ggggggggcg tcg 593 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EUB <220> <221> gene <222> (1)..(22) <223> Forward primer <400> 3 acgctggcgg caggcctaac ac 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EUB <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> Reverse primer <400> 4 attactagcg attccgtctt c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoD <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 5 attactagcg attccgtctt c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoD <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 6 ctctgcgttg agcaggccaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ascV <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 7 atggacggcg ccatgaagtt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ascV <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 8 tattcgcctt cacccatccc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ascC <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 9 gcattggagc aacagtccca 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ascC <220> <221> gene <222> (1)..(19) <223> Reverse primer <400> 10 ccttcaatcc ccttgcgat 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vapA <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 11 tcgttactac ctccctcgca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vapA <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 12 cacccaagac agctgtagca 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Act <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> Forward primer <400> 13 agaaggtgac caccaagaac a 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Act <220> <221> gene <222> (1)..(22) <223> Reverse primer <400> 14 aactgacatc ggccttgaac tc 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ast <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> Forward primer <400> 15 tctccatgct tcccttccac t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ast <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> Reverse primer <400> 16 gtgtagggat tgaagaagcc g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Alt <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 17 tgacccagtc ctggcacggc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Alt <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 18 ggtgatcgat caccaccagc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 19 atcttctccg actggttcgg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 20 ccgtgccagg actgggtctt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ela <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 21 acacggtcaa ggagatcaac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ela <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 22 cgctggtgtt ggccagcagg 20 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fla <220> <221> gene <222> (1)..(17) <223> Forward primer <400> 23 tccaaccgty tgacctc 17 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fla <220> <221> gene <222> (1)..(17) <223> Reverse primer <400> 24 gmytggttgc gratggt 17 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hlyA <220> <221> gene <222> (1)..(23) <223> Forward primer <400> 25 ggccggtggc ccgaagatac ggg 23 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hlyA <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> Reverse primer <400> 26 ggcggcgccg gacgagacgg g 21 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aerA <220> <221> gene <222> (1)..(19) <223> Forward primer <400> 27 gcwgarcccr tctatccwg 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aerA <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 28 tttctccggt aacaggattg 20 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> laf <220> <221> gene <222> (1)..(18) <223> Forward primer <400> 29 ggtctgcgca tccaactc 18 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> laf <220> <221> gene <222> (1)..(17) <223> Reverse primer <400> 30 gctccagacg gttgatg 17 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ascV <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 31 tttgcgctgt cggccatcgt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ascV <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 32 gctgcccggt tttggcttgc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ascC <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 33 tatgtggcag aaggggagag 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ascC <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 34 tgctccagat tgatgagacg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vapA <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Forward primer <400> 35 tggctgcttt tggtacactg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vapA <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> Reverse primer <400> 36 cacgaatgtg gatgaggttg 20

Claims

수탁번호 KCTC13827BP의 에어로모나스 살모니시다 RTDH{Aeromonas salmonicida RTDH} 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 SEQ ID NO: 1의 16S rDNA 염기서열을 가지는 것인 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 SEQ ID NO: 2의 rpoD 염기서열을 가지는 것인 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 병원성 유전자 T3SS(Type three secretion system)를 발현하는 것인 균주.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 에어로모나스 살모니시다 RTDH 균주 또는 이로부터 유래한 단백질을 항원으로 포함하는 어류의 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida) 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 에어로모나스 살모니시다 RTDH의 불활화 균체, 약독화된 균체 또는 사균체를 포함하는 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 에어로모나스 살모니시다 RTDH 유래의 단백질로써 포린(porin), 리파아제(lipase), 세린 프로테아제(serine protease), 에어로라이신(aerolysin), 헤모라이신(haemolysin), 아연 메탈로프로테아제(zinc metalloprotease), 콜라게나아제(collagenase), 엘라스타아제(elastase), 엔테로톡신(enterotoxin), T3SS 구조 단백질 및 T3SS 이펙터 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 어류는 연어과 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신 조성물.
제8항에 있어서,
상기 연어과 어류는, 연어(Oncorhynchus keta), 곱사연어(Oncorhynchus gor-buscha), 산천어(Oncorhynchus masou), 무지개송어(Oncorhynchus mykiss), 은연어(Oncorhynchus kisutch) 및 열목어(Brachymystax lenok)로 이루어진 군에서 선택된 것인 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 어쥬번트 및 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제5항에 따른 백신 조성물을 어류에 투여하는 것을 포함하는 어류의 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida) 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 투여는 복강내 투여, 근육내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 또는 침지 투여인 예방 또는 치료하는 방법.
제5항에 따른 백신 조성물을 포함하는 어류의 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida) 감염의 예방 또는 치료를 위한 사료 조성물.
제13항에 있어서,
상기 사료 조성물에 포함되는 에어로모나스 살모니시다 RTDH의 함량은 사료 조성물 중량에 대하여 0.001 내지 10%(w/w)인 것인 사료 조성물.