KR20230004016A - 어류의 감염성 박테리아에 대하여 사멸능을 가지는 박테리오파지와 이를 섭취한 플랑크톤 및 이의 용도 - Google Patents
어류의 감염성 박테리아에 대하여 사멸능을 가지는 박테리오파지와 이를 섭취한 플랑크톤 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230004016A KR20230004016A KR1020210085770A KR20210085770A KR20230004016A KR 20230004016 A KR20230004016 A KR 20230004016A KR 1020210085770 A KR1020210085770 A KR 1020210085770A KR 20210085770 A KR20210085770 A KR 20210085770A KR 20230004016 A KR20230004016 A KR 20230004016A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- fish
- bacteriophage
- etp
- plankton
- phage
- Prior art date
Links
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 237
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 title claims abstract description 223
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title abstract description 28
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title abstract description 14
- 241000607471 Edwardsiella tarda Species 0.000 claims abstract description 58
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241001247197 Cephalocarida Species 0.000 claims description 96
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 9
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 5
- 241000607473 Edwardsiella <enterobacteria> Species 0.000 claims description 5
- 241000239366 Euphausiacea Species 0.000 claims description 5
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 claims description 5
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 241000700686 Chaetognatha Species 0.000 claims description 2
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 claims description 2
- 241000239250 Copepoda Species 0.000 claims description 2
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 claims description 2
- 241000238576 Daphnia pulex Species 0.000 claims description 2
- 241001147665 Foraminifera Species 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 241000700141 Rotifera Species 0.000 claims description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 213
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 48
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 46
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 11
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 10
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 208000010824 fish disease Diseases 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 6
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 5
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 5
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 4
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 3
- 241000269980 Pleuronectidae Species 0.000 description 3
- 241000702072 Podoviridae Species 0.000 description 3
- 241000194056 Streptococcus iniae Species 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000723298 Dicentrarchus labrax Species 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194040 Lactococcus garvieae Species 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 241001282110 Pagrus major Species 0.000 description 2
- 241001600434 Plectroglyphidodon lacrymatus Species 0.000 description 2
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 2
- 241000194055 Streptococcus parauberis Species 0.000 description 2
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 2
- 241000269838 Thunnus thynnus Species 0.000 description 2
- 241000276707 Tilapia Species 0.000 description 2
- 241001504592 Trachurus trachurus Species 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 241001233037 catfish Species 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060954 Abdominal Hernia Diseases 0.000 description 1
- 241000607525 Aeromonas salmonicida Species 0.000 description 1
- 241000122170 Aliivibrio salmonicida Species 0.000 description 1
- 241001206546 Ampullaviridae Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241001340646 Bicaudaviridae Species 0.000 description 1
- 241000252229 Carassius auratus Species 0.000 description 1
- 241000721191 Clarias gariepinus Species 0.000 description 1
- 241000351651 Clavaviridae Species 0.000 description 1
- 241000701520 Corticoviridae Species 0.000 description 1
- 241000702221 Cystoviridae Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- 241000276423 Fundulus heteroclitus Species 0.000 description 1
- 241000701367 Fuselloviridae Species 0.000 description 1
- 241001136687 Globuloviridae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000617639 Hyporthodus septemfasciatus Species 0.000 description 1
- 241000702394 Inoviridae Species 0.000 description 1
- 241000714210 Leviviridae Species 0.000 description 1
- 241000701365 Lipothrixviridae Species 0.000 description 1
- 241000123826 Lutjanus campechanus Species 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000702318 Microviridae Species 0.000 description 1
- 241001502129 Mullus Species 0.000 description 1
- 241000701553 Myoviridae Species 0.000 description 1
- 241000277329 Oncorhynchus keta Species 0.000 description 1
- 241000277269 Oncorhynchus masou Species 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276569 Oryzias latipes Species 0.000 description 1
- 241000269979 Paralichthys olivaceus Species 0.000 description 1
- 241000229231 Phage E Species 0.000 description 1
- 241000701369 Plasmaviridae Species 0.000 description 1
- 241000269978 Pleuronectiformes Species 0.000 description 1
- 241000778495 Pseudocaranx dentex Species 0.000 description 1
- 241000040592 Rudiviridae Species 0.000 description 1
- 241000277289 Salmo salar Species 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- 241000132119 Seriola dumerili Species 0.000 description 1
- 241000893636 Seriola lalandi Species 0.000 description 1
- 241000269796 Seriola quinqueradiata Species 0.000 description 1
- 241001417495 Serranidae Species 0.000 description 1
- 241001417871 Silurus asotus Species 0.000 description 1
- 241000702202 Siphoviridae Species 0.000 description 1
- 241000500840 Spondyliosoma cantharus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241001441723 Takifugu Species 0.000 description 1
- 241001441722 Takifugu rubripes Species 0.000 description 1
- 241000701521 Tectiviridae Species 0.000 description 1
- 241001542930 Tenacibaculum maritimum Species 0.000 description 1
- 241001648776 Trachurus japonicus Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000207194 Vagococcus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 241001135139 Vibrio ordalii Species 0.000 description 1
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 108010027322 single cell proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- -1 zooplankton Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/195—Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Birds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 출원은 어류의 감염성 박테리아에 대하여 사멸능을 가지는 박테리오파지와 이를 섭취한 플랑크톤의 용도에 관한 것으로서, 어류용 항생 조성물 및 어류의 박테리아 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법 등을 제공한다.
Description
어류의 감염성 박테리아에 대하여 사멸능을 가지는 박테리오파지와 이를 섭취한 플랑크톤 및 이의 용도에 관한 것이다.
에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda, E. tarda)는 다양한 해수 및 담수 어종에서 에드워드 감염증 (Edwardsiellosis)을 유발하는 주요한 어류 병원성 세균이며 특히 넙치 등 우리나라 주요 양식 어종에서 발생하는 심각한 질병의 원인균이기도 하다. E. tarda는 해산 어류인 대서양 연어, 넙치, 농어, 숭어, 방어, 참돔 및 감성돔 등과 담수어인 잉어, 금붕어, 무지개송어, 틸라피아, 메기, 뱀장어 등에서 검출되었다. E. tarda가 감염된 넙치의 에드워드 감염증은 복부팽만 탈장 등의 증상을 나타내고 간장이나 신장 등에 농창이 형성되어 있으며 때로는 등지느러미 쪽의 근육 내 농이 관찰되기도 한다.
그 외에도, 어류는 Vibrio anguillarum, V. salmonicida, V. ordalii, V. alginoriticus 등이 원인이 되는 비브리오증, Streptococcus iniae, S. parauberis, S. difficilis, S. shiloi, Lactococcus garvieae, L. piscicum, Vagococcus salmoninarum 등이 원인이 되는 연쇄구균증, Tenacibaculum maritimum 등이 원인이 되는 활주세균증과 같은, 다양한 감염성 박테리아에 의해 발생되는 다양한 세균성 질병에 취약하고, 감염 후에는 쉽게 치유되지 않으므로, 어류 산업에 있어서 박테리아 감염성 질병으로 인한 피해는 상당한 실정이다.
이에, 상기와 같은 질병 예방 및 치료의 문제점에 대한 대책으로 항생제를 사용하고 있으나, 기존의 항생제에 대하여 내성을 가지는 강한 균주의 발생 및 기존 항생제의 부작용 등으로 인하여 새로운 항생제의 개발이 요구된다.
한편, 박테리오파지는 박테리아 감염에 대한 다양한 치료제로 제안되어 왔다. 대한민국 등록특허 제 2003773 호에서는 어류에 적용할 수 있는 비브리오균에 특이적인 박테리오파지에 대하여 개시하고 있다. 다만, 박테리오파지는 이의 천연 환경, 즉, 수중에서 비교적 짧게 생존하며, 어류에 의해 섭취되더라도, 위산에 의해 파괴될 수 있다는 점 때문에, 어류의 세균성 질병을 치료하는데 여전히 한계가 있다.
이런 배경 하에서, 본 발명자들은 감염성 박테리아에 대하여 사멸능을 가지는 박테리오파지와 이를 섭취한 플랑크톤을 이용하는 경우, 상기 박테리오파지의 한계를 극복하고 어류의 E. tarda 등의 병원성 박테리아 감염에 대한 예방 또는 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.
일 양상은 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)에 대하여 특이적인 사멸능을 가지는 박테리오파지 ETP-1 (기탁번호: KCTC18896P) 및 이를 유효성분으로 포함하는 어류용 항생 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 어류에 상기 박테리오파지 ETP-1을 급이하는 단계를 포함하는 어류의 박테리아 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)에 대하여 특이적인 사멸능을 가지는 박테리오파지를 제공한다.
상기 에드워드시엘라 타르다 균은 장내세균과에 속하는 그람 음성균으로, 주로 어류에서 소화관의 장애를 일으키는 원인균으로 알려져 있으며, 특히, 에드워드 병의 원인균으로 알려져 있다.
상기 에드워드 병은 고수온기에 2년어 이상의 대형어류에서 자주 발생하며, 외관증상으로는 두부의 궤양, 복부의 팽만 또는 발적, 안구의 백탁 또는 돌출 등이 있고, 내부증상으로는 복수가 차 있거나 생식소 특히 난소의 발적과 경화가 특징 등이 있으며, 이병에 의한 누적 폐사율은 약 20 내지 30%에 달한다.
용어 "박테리오파지 (bacteriophage)"는 박테리아를 숙주세포로 하는 바이러스의 일군을 의미한다. 상기 박테리오파지는 박테리아에 감염 (Infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 가질 수 있다.
상기 박테리오파지는, 일반적으로, 박테리오파지를 수득가능하고, 박테리오파지의 숙주 또는 타겟 박테리아를 배양할 수 있고, 박테리오파지가 이의 숙주 또는 타겟 박테리아를 감염시킬 수 있는 한, 일반적인 박테리오파지이며, 제한되는 것은 아니다. 상기 박테리오파지는 ssRNA, dsRNA, ssDNA, 또는 dsDNA 박테리오파지일 수 있으며, 유전 물질이 환형이거나 선형일 수 있다.
바람직한 박테리오파지를 분리하는 방법에 대한 예들은 단지 일 예로서, Gill JJ and Hyman P, "Phage choice, isolation, and preparation for phage therapy", Curr Pharm Biotechnol., Jan. 2010, Volume 11, Issue 1, pp 2-14; 및 "Bacteriophage Therapy" minireview by Sulakvelidze et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Mar. 2001, pp 649-659 등의 문헌들에 널리 기술되어 있다.
상기 박테리오파지는 미오비리대 (Myoviridae), 시포비리대 (Siphoviridae), 포도비리대 (Podoviridae), 리포뜨릭스비리대 (Lipothrixviridae), 루디비리대 (Rudiviridae), 앰풀라비리대 (Ampullaviridae), 비카우다비리대 (Bicaudaviridae), 클라바비리대 (Clavaviridae), 코티코비리대 (Corticoviridae), 시스토비리대 (Cystoviridae), 푸셀로비리대 (Fuselloviridae), 글로불로비리대 (Globuloviridae), 구타비루스 (Guttavirus), 이노비리대 (Inoviridae), 레비비리대 (Leviviridae), 미크로비리대 (Microviridae), 플라스마비리대 (Plasmaviridae), 및 텍티비리대 (Tectiviridae) 과 (Family)에 속하는 박테리오파지들 중 하나 또는 그 이상의 박테리오파지일 수 있다. 예컨대, 상기 박테리오파지는 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae) 박테리오파지, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus) 박테리오파지, 스트렙토코커스 이니에 (Streptococcus iniae) 박테리오파지, 스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis) 박테리오파지, 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda) 박테리오파지, 및 에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida) 박테리오파지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리오파지일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC18896P인 박테리오파지 ETP-1일 수 있다. 상기 박테리오파지 ETP-1은 용균성 박테리오파지일 수 있다. 상기 박테리오파지 ETP-1은 서열번호 1로 표시되는 유전체를 포함하는 박테리오파지일 수 있다. 상기 박테리오파지 ETP-1은 도 2의 유전체 지도의 유전체를 포함하는 박테리오파지일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 박테리오파지 ETP-1은 약 10 내지 30 면체 머리와 짧은 꼬리로 구성된 구조를 가지는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 박테리오파지 ETP-1의 머리의 직경은 약 30 내지 70 또는 40 내지 60 nm일 수 있다. 상기 박테리오파지 ETP-1의 꼬리의 길이 또는 너비는 약 10 내지 40 또는 20 내지 30 nm일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 박테리오파지 ETP-1은 포도비리대 (Podoviridae) 과 (family)에 속하는 박테리오파지일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 박테리오파지 ETP-1은 에드워드시엘라 타르다에 대하여 특이적인 사멸능을 나타내는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 박테리오파지 ETP-1은 에드워드시엘라 타르다에 대하여 생장 억제 효과, 사멸 효과, 항균 효과, 또는 용균 효과를 나타내는 것일 수 있다.
따라서, 일 구체예에 따르면, 상기 박테리오파지 ETP-1은 에드워드 병과 같은 박테리아-감염성 어류 질환에 대하여 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 박테리오파지 ETP-1은 어류의 내부에서 (구체적으로는, 어류의 조직 내에서), 상기 에드워드시엘라 타르다와 같은 감염성 또는 병원성 박테리아의 생장을 억제시키거나, 사멸시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다.
상기 박테리오파지 ETP-1은 기존 항생제에 비하여 에드워드시엘라 타르다에 대한 특이성이 매우 높으므로, 유익균은 죽이지 않고, 특정 병원균만 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성 및 저항성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명 (life cycling)이 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다.
다른 양상은 상기 에드워드시엘라 타르다에 대하여 특이적인 사멸능을 가지는 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 어류용 항생 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC18896P인 박테리오파지 ETP-1일 수 있다.
상기 어류용 항생 조성물은 에드워드시엘라 타르다에 대한 항균 효과를 나타내는 것일 수 있다. 상기 항균 효과는 박테리아 생장 억제 효과, 박테리아 사멸 효과, 또는 용균 효과를 의미할 수 있다.
상기 어류용 항생 조성물에 포함된 박테리오파지 (구체적으로, 박테리오파지 ETP-1)는 플랑크톤 (plankton)에 섭취된 형태일 수 있다.
용어 "플랑크톤 (plankton)"은 담수나 해수에서 물의 움직임에 따라 수동적으로 수중에 떠 있거나 표류하는 생물을 총칭한다.
상기 플랑크톤은 수중에 서식하는 박테리아, 단세포 원생생물, 파래 모자반 같은 다세포 해조류, 어류의 알, 크릴새우류, 대형 해파리 등 다양한 크기의 수서 동, 식물을 포함할 수 있다. 상기 플랑크톤은 박테리아플랑크톤 (bacterio plankton), 식물성 플랑크톤 (phytoplankton), 동물성 플랑크톤 (zooplankton) 등을 포함할 수 있다. 상기 박테리아플랑크톤은 수층에 부유하는 원핵생물 (부유박테리아)을 의미하고, 상기 식물성 플랑크톤은 수층에 부유하는 식물성 부유조류를 의미하며, 상기 동물성 플랑크톤은 수층에 부유하는 단세포 원생동물 (protozoa)부터 다세포 어류의 난과 자, 치어까지 다양한 동물성인 부유동물을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 플랑크톤은 단세포 편모충류, 섬모충류, 방산충류, 유공충류, 해파리, 화살벌레, 요각류, 갑각류, 곤쟁이류, 옆새우류, 난바다곤쟁이류, 크릴새우류, 및 크릴류의 동물성 플랑크톤으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 플랑크톤은 알테미아 (artemia), 로티퍼 (rotifer), 및 물벼룩 (daphnia pulex)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 알테미아일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 어류의 먹이로 사용될 수 있는 플랑크톤이면, 어느 것이나 제한 없이 허용될 수 있다.
상기 박테리오파지가 플랑크톤에 섭취된 형태는, 플랑크톤이 먹이로서 공급된 박테리오파지를 직접 섭취하거나, 박테리오파지를 플랑크톤에 감염시키거나, 박테리오파지가 플랑크톤에 흡수되는 등의 방식에 의하여 박테리오파지가 플랑크톤의 세포 내 또는 내부 (예컨대, 비장, 내장, 신장, 간 등의 조직 내)에 위치한 형태를 모두 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 박테리오파지 ETP-1을 동물성 플랑크톤의 배양액에 투여하여 혼합 배양함으로써, 상기 동물성 플랑크톤이 상기 박테리오파지 ETP-1을 섭취하게 할 수 있다.
상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤은 어류의 먹이로서 제공될 수 있다. 따라서, 상기 어류는 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 섭취함으로써, 박테리오파지를 제공받을 수 있고, 그로 인해, 상기 어류는 박테리오파지를 섭취하거나, 박테리오파지에 감염될 수 있다. 이와 같이, 어류에게 플랑크톤에 섭취된 형태로 박테리오파지를 제공하는 경우, 상기 박테리오파지는 수중 환경에서 더 오래 생존할 수 있고, 어류 내로 섭취된 박테리오파지의 위산에 의한 파괴가 감소될 수 있다. 이로 인해, 박테리오파지의 어류에 대한 감염율 또는 흡수율, 또는 어류 내부에서의 (구체적으로는, 어류의 조직 내에서의) 박테리오파지의 생존율이 현저히 증가될 수 있다.
따라서, 어류에 플랑크톤에 섭취된 형태로 박테리오파지를 제공하는 경우, 상기 어류 내에서 (구체적으로는, 어류의 조직 내에서) 상기 박테리오파지에 의한 감염성 또는 병원성 박테리아에 대한 항균 효과가 현저히 개선될 수 있고, 이로 인해, 박테리아-감염성 어류 질환에 대한 예방 또는 치료 효과가 현저히 개선될 수 있다.
일 구체예에서, 어류가 박테리오파지 ETP-1에 직접적으로 노출되는 경우와 비교하여, 상기 동물성 플랑크톤에 섭취된 형태로 박테리오파지 ETP-1을 어류에 제공하는 경우, 상기 어류 내에서 (구체적으로는, 어류의 조직 내에서) 상기 박테리오파지 ETP-1의 생존율이 현저히 증가될 수 있다. 이로 인해, 상기 어류 내에서 (구체적으로는, 어류의 조직 내에서) 상기 박테리오파지 ETP-1의 에드워드시엘라 타르다에 대한 특이적인 항균 효과가 현저히 개선될 수 있고, 에드워드시엘라 타르다-감염성 어류 질환에 대한 예방 또는 치료 효과가 현저히 개선될 수 있다.
용어 "유효성분 (effective ingredient)"은 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 유효량의 성분을 의미한다. 구체적으로는, 유효량의 제제, 활성제, 또는 박테리오파지를 의미할 수 있다.
상기 유효량은 개체에 한번 또는 그 이상 투여될 수 있고, 개체에 대하여 질병을 예방하거나, 질병 상태를 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 또는 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로)을 위한 적절한 양일 수 있다. 상기 유효량은 개체의 종류, 개체의 상태, 개체의 양, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 관련 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 에드워드시엘라 타르다에 대하여 특이적인 사멸능을 가지는 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 어류용 항생 조성물은 어류에 대하여 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
용어 "어류용 항생 조성물"은 어류에게 제공되어 균을 억제시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제, 항생제, 및 항균제를 총칭하는 것이다. 구체적으로, 상기 어류용 항생 조성물은 어류에게 제공되어 균의 생장을 억제시키거나 균을 사멸시키는 등의 항균 효과를 나타낼 수 있는 제제를 의미할 수 있다.
상기 어류용 항생 조성물은 어류에 사용되는 것으로서, 사료, 사료 첨가제, 항생용 약제, 박테리아 감염성 질병 예방 또는 치료용 약제, 또는 면역 증진용 약제인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 어류용 항생 조성물은 어류에 사용되는 것으로서, 에드워드시엘라 타르다 감염성 질병 예방 또는 치료용 약제인 것일 수 있다.
상기 어류용 항생 조성물은 추가로 수의학적으로 허용 가능한 담체를 1 종이상 포함할 수 있다. 수의학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화할 수 있다.
상기 어류용 항생 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 달라질 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
상기 어류용 항생 조성물이 사료 또는 사료 첨가제로서 사용되는 경우에는, 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 더 포함될 수 있고, 효용 증대를 위하여 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 어류용 항생 조성물이 사료 또는 사료 첨가제로서 사용되는 경우에는, 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류, 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질, 동물성플랑크톤류, 어분 등의 사료 또는 사료첨가제와 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 어류는 수중에서 사는 척추동물을 광범위하게 포함할 수 있고, 그 종류에 있어서 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 어류는 에드워드시엘라 타르다 감염에 대한 예방이 필요한 정상 어류이거나, 이미 에드워드시엘라 타르다에 감염되어 치료가 필요한 감염 어류일 수 있다. 또한, 상기 어류는 에드워드시엘라 타르다에 감염될 수 있는 모든 어류를 제한없이 통칭할 수 있다. 구체적으로, 상기 어류는 넙치 (Paralichthys olivaceus), 방어 (Seriola quinqueradiata), 참돔 (Pagrus major), 자주복 (Takifugurubripes), 부시리 (Seriola aureovittata), 송어 (Oncorhynchus masou), 무지개 송어 (Oncorhynchusmykiss), 잿방어 (Seriola dumerili), 전갱이 (Trachurus japonicus), 흑점줄전갱이(Pseudocaranx dentex), 능성어 (Epinephelus septemfasciatus), 참다랑어 (Thunnus thynnus), 잉어 (Cyprinus carpio), 제브라피쉬 (Danio rerio), 메기 (Silurus asotus), 클라리아스 가리에피누스 (Clarias gariepinus), 틸라피아 (Oreochronis niloticus), 연어 (Oncorhynchus keta), 대서양 연어 (Salmo salar), 및 송사리 (Oryziaslatipes)를 포함할 수 있고, 바람직하게는 양식 어류일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 박테리오파지에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 박테리오파지에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 박테리오파지를 급이하는 단계를 포함하는 어류의 박테리아 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 박테리오파지는 에드워드시엘라 타르다에 대하여 특이적인 사멸능을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC18896P인 박테리오파지 ETP-1일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 급이는 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 급이하는 형태로 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 방법은 플랑크톤 배양액에 박테리오파지를 투여하여 혼합 배양하는 단계; 및 상기 혼합 배양 단계에서 수득된 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 급이하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 상기 방법에 의하여 박테리아-감염성 어류 질환을 예방 또는 치료하기 위한, 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템이 구현될 수 있다. 또한, 일 구체예에서는, 상기 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 효과를 증가시키기 위한 조건을 제공한다.
상기 플랑크톤 배양액에 박테리오파지를 투여하여 혼합 배양하는 단계에서, 상기 플랑크톤이 투여된 박테리오파지를 직접 섭취하거나, 투여된 박테리오파지에 감염되거나, 투여된 박테리오파지가 상기 플랑크톤에 흡수되는 등의 방식에 의하여 박테리오파지가 플랑크톤의 세포 내 또는 내부 (예컨대, 비장, 내장, 신장, 간 등의 조직 내)에 위치하게 되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 플랑크톤 배양액에 박테리오파지를 투여하여 혼합 배양하는 단계에서, 상기 플랑크톤은 부화 후 약 20 내지 40 또는 30 내지 40 시간된 알테미아일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 플랑크톤 배양액에 박테리오파지를 투여하여 혼합 배양하는 단계에서, 상기 박테리오파지는 플랑크톤 1 개체 당 약 105 내지 1010 PFU의 양으로 플랑크톤 배양액에 투여되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 플랑크톤 배양액에 박테리오파지를 투여하여 혼합 배양하는 단계에서, 상기 박테리오파지는 플랑크톤 1 개체 당 약 105 내지 109, 105 내지 108, 105 내지 107, 105 내지 106, 106 내지 1010, 106 내지 109, 106 내지 108, 106 내지 107, 107 내지 1010, 107 내지 109, 107 내지 108, 108 내지 1010, 108 내지 109, 또는 109 내지 1010 PFU의 양으로 플랑크톤 배양액에 투여되는 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 박테리오파지는 플랑크톤 1 개체 당 약 106 내지 108 PFU의 양으로 플랑크톤 배양액에 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 박테리오파지는 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤의 활성도 또는 생존율이 안정적으로 유지되면서, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 먹이로 제공받은 어류의 각 조직 내에서 상기 박테리오파지의 생존율이 높은 수준으로 유지되기 위한 적합한 양으로 플랑크톤 배양액에 투여되는 것일 수 있다.
다만, 상기 플랑크톤 배양액에 박테리오파지를 투여하여 혼합 배양하는 단계에서, 상기 박테리오파지를 플랑크톤 1 개체 당 약 105 PFU 미만의 양으로 플랑크톤 배양액에 투여하는 경우, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 먹이로 제공받은 어류의 각 조직 내에서 상기 박테리오파지의 생존율이 현저히 감소할 수 있고, 상기 박테리오파지를 플랑크톤 1 개체 당 약 1010 PFU 초과의 양으로 플랑크톤 배양액에 투여하는 경우, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤의 활성도 또는 생존율이 현저히 감소할 수 있다.
따라서, 상기 플랑크톤 배양액에 박테리오파지를 투여하여 혼합 배양하는 단계에서, 상기 박테리오파지를 플랑크톤 1 개체 당 약 105 내지 1010 PFU의 양으로 플랑크톤 배양액에 투여함으로써, 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤의 활성도 또는 생존율을 안정적으로 유지하면서, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 먹이로 제공받은 어류의 각 조직 내에서 상기 박테리오파지의 생존율이 높은 수준으로 유지될 수 있다. 이로 인해, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 제공하는 경우, 박테리아-감염성 어류 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 현저히 개선시킬 수 있다.
일 구체예에서, 상기 플랑크톤 배양액에 박테리오파지를 투여하여 혼합 배양하는 단계에서, 상기 플랑크톤과 박테리오파지의 혼합 배양은 약 1 시간 내지 약 8 시간 동안 혼합 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 플랑크톤 배양액에 박테리오파지를 투여하여 혼합 배양하는 단계에서, 상기 플랑크톤과 박테리오파지의 혼합 배양은 약 1 시간 내지 약 8 시간 동안, 약 2 시간 내지 약 7 시간 동안, 또는 약 3 시간 내지 약 5 시간 동안 혼합 배양하는 것일 수 있다.
상기 플랑크톤과 박테리오파지의 혼합 배양 시간이 약 1 시간 미만인 경우에는, 상기 플랑크톤이 박테리오파지를 충분히 섭취하기 어려워, 플랑크톤 내에 농축된 박테리오파지의 양이 감소할 수 있고, 이로 인해, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 먹이로 제공받은 어류의 각 조직 내에서 상기 박테리오파지의 생존율이 현저히 감소할 수 있다. 또한, 상기 플랑크톤과 박테리오파지의 혼합 배양 시간이 약 8 시간을 초과하는 경우에는, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤의 활성도 또는 생존율이 현저히 감소할 수 있다.
따라서, 상기 플랑크톤과 박테리오파지의 혼합 배양 시간이 약 1 시간 내지 약 8 시간, 바람직하게는 약 3 시간 내지 약 5 시간이 되도록 함으로써, 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤의 활성도 또는 생존율을 안정적으로 유지하면서, 플랑크톤 내에 박테리오파지가 충분히 농축될 수 있다. 이로 인해, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 제공하는 경우, 어류의 각 조직 내에서 상기 박테리오파지의 생존율이 높은 수준으로 유지될 수 있어, 박테리아-감염성 어류 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 현저히 개선시킬 수 있다.
상기 방법은 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 급이하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 급이하는 단계에서, 상기 어류는 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 섭취함으로써, 박테리오파지를 제공받을 수 있고, 그로 인해, 상기 어류는 박테리오파지를 섭취하거나, 박테리오파지에 감염될 수 있다. 이를 통해, 상기 박테리오파지가 어류의 세포 내 또는 내부 (예컨대, 비장, 내장, 신장, 간 등의 조직 내)에 위치할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 급이하는 단계는, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 최초 급이하는 단계; 및 상기 최초 급이 후, 약 10 내지 80, 10 내지 70, 10 내지 60, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20 시간, 또는 24 시간 간격으로 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 재급이하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 재급이하는 단계에서, 상기 최초 급이 후, 약 10 시간 미만 간격으로 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 재급이하는 경우, 단기간에 어류 내로 과도한 양의 박테리오파지가 흡수되어, 어류의 면역 반응 또는 병리적 상태에 부정적인 영향을 미칠 수 있고, 약 80 시간을 초과하는 간격으로 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 재급이하는 경우, 어류의 각 조직 내에서 상기 박테리오파지의 생존율이 현저히 감소할 수 있다.
따라서, 상기 최초 급이 후, 약 10 내지 80 시간 간격으로 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 재급이함으로써, 어류의 면역 반응 또는 병리적 상태가 정상적으로 유지되면서, 어류의 각 조직 내에서 상기 박테리오파지의 생존율이 높은 수준으로 유지될 수 있어, 박테리아-감염성 어류 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 현저히 개선시킬 수 있다.
일 구체예에서, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 급이하는 단계는 약 3 일 내지 약 12 일 동안 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 매일 연속적으로 급이하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 급이하는 단계는, 약 4 일 내지 약 12 일 동안, 약 6 일 내지 약 12 일 동안, 약 8 일 내지 약 12 일 동안, 약 9 일 내지 약 11 일 동안, 또는 약 10 일 내지 약 12 일 동안 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 매일 연속적으로 급이하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는, 약 9 일 내지 약 11 일 동안 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 매일 연속적으로 급이하는 것일 수 있다.
상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 약 3 일 미만의 기간 또는 약 12 일을 초과하는 기간 동안 매일 연속적으로 어류에 급이하는 경우, 상기 플랑크톤을 섭취한 어류의 각 조직 내에서의 박테리오파지의 생존율이 일정하게 유지되지 않고, 현저히 감소할 수 있다.
따라서, 약 3 일 내지 약 12 일 동안, 바람직하게는 약 9 일 내지 약 11 일 동안 상기 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 매일 연속적으로 급이함으로써, 상기 플랑크톤을 섭취한 어류의 각 조직 내에서의 박테리오파지의 생존율이 높은 수준으로 일정하게 유지될 수 있다. 이로 인해, 박테리아-감염성 어류 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 현저히 개선시킬 수 있다.
상기 방법은 어류의 박테리아 감염성 질병을 예방 또는 치료할 수 있다. 구체적으로, 상기 어류의 박테리아 감염성 질병은 에드워드시엘라 타르다 감염성 질병 또는 에드워드 병일 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 박테리오파지 또는 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 박테리오파지 또는 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 박테리오파지는 감염성 박테리아인 E. tarda (Edwardsiella tarda)에 대하여 현저히 우수한 항균 효과를 나타낸다.
또한, 일 양상에 따른 조성물 또는 방법에 의해, 어류에게 박테리오파지를 제공하는 경우, 박테리오파지는 수중 환경에서 더 오래 생존할 수 있고, 상기 어류에 의해 섭취된 박테리오파지의 위산에 의한 파괴를 감소시킬 수 있다. 이로 인해, 상기 어류에 대한 박테리오파지의 감염율 또는 흡수율, 또는 어류 내부에서의 (구체적으로는, 어류의 조직 내에서의) 박테리오파지의 생존율이 현저히 증가될 수 있다.
또한, 일 양상에 따른 박테리오파지, 조성물, 또는 방법에 따르면, 어류가 박테리오파지에 감염되더라도, 어류에 있어서 비정상적인 면역 반응 또는 병리적 상태 등이 나타나지 않으므로, 어류에 안전하게 적용될 수 있다.
따라서, 일 양상에 따른 박테리오파지, 조성물, 또는 방법에 의해, 어류 내부에서의 박테리오파지의 감염성 박테리아에 대한 억제능 또는 사멸능이 현저히 증가될 수 있고, 결과적으로, 어류의 병원성 박테리아 감염에 대한 예방 또는 치료 효과가 현저히 개선될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 분리된 ETP-1 phage의 존재를 확인하기 위한 이중층 한천 오버레이 (double-layer agar overlay) 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 일 실시예에 따른 ETP-1 phage의 원형 유전체 지도 (Circular genomic map)를 나타내는 도면이다.
도 3은 일 실시예에 따른 ETP-1 phage의 형태학적 특성을 확인하기 위한 투과전자현미경 (Transmission electron microscope: TEM) 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 일 실시예에 따른 ETP-1 phage의 E. tarda (Edwardsiella tarda)에 대한 항균 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 일 실시예에 따른 ETP-1 phage의 어류의 E. tarda 감염에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따른 알테미아 (artemia)를 이용한 ETP-1 phage-전달 시스템의 원리를 나타내는 모식도이다.
도 7은 일 실시예에 따른 알테미아를 이용한 ETP-1 phage-전달 시스템의 각 단계를 요약하여 나타내는 모식도이다.
도 8은 일 실시예에 따른 알테미아와 ETP-1 phage의 혼합 배양 시간에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아의 활성 정도를 나타내는 도면이다.
도 9는 일 실시예에 따른 알테미아와 ETP-1 phage의 혼합 배양 시간에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 10은 일 실시예에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 먹이로 제공받은 어류의 각 조직에서의, feeding 기간에 따른 ETP-1 phage의 생존 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 일 실시예에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 먹이로 제공받은 어류에서의 면역 반응 유발-시토킨의 발현량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12는 일 실시예에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 먹이로 제공받은 어류를 부검하여 얻어진 조직의 병리적 상태를 나타내는 도면이다.
도 2는 일 실시예에 따른 ETP-1 phage의 원형 유전체 지도 (Circular genomic map)를 나타내는 도면이다.
도 3은 일 실시예에 따른 ETP-1 phage의 형태학적 특성을 확인하기 위한 투과전자현미경 (Transmission electron microscope: TEM) 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 일 실시예에 따른 ETP-1 phage의 E. tarda (Edwardsiella tarda)에 대한 항균 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 일 실시예에 따른 ETP-1 phage의 어류의 E. tarda 감염에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따른 알테미아 (artemia)를 이용한 ETP-1 phage-전달 시스템의 원리를 나타내는 모식도이다.
도 7은 일 실시예에 따른 알테미아를 이용한 ETP-1 phage-전달 시스템의 각 단계를 요약하여 나타내는 모식도이다.
도 8은 일 실시예에 따른 알테미아와 ETP-1 phage의 혼합 배양 시간에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아의 활성 정도를 나타내는 도면이다.
도 9는 일 실시예에 따른 알테미아와 ETP-1 phage의 혼합 배양 시간에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 10은 일 실시예에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 먹이로 제공받은 어류의 각 조직에서의, feeding 기간에 따른 ETP-1 phage의 생존 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 일 실시예에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 먹이로 제공받은 어류에서의 면역 반응 유발-시토킨의 발현량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12는 일 실시예에 따른 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 먹이로 제공받은 어류를 부검하여 얻어진 조직의 병리적 상태를 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서 특별한 정의가 없으면, 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다.
실시예 1.
감염성 박테리아를 사멸시키는 박테리오파지의 제조
감염성 박테리아를 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 제조하였다.
구체적으로, 감염성 박테리아에 속하는 E. tarda (Edwardsiella tarda)에 특이적으로 반응하여 E. tarda를 사멸시킬 수 있는 박테리오파지인, ETP-1 phage를 제조하였다.
구체적으로, 해수 샘플 (약 12.5 mL)을 BHI + 약 1 % NaCl 액체 배지 (약 12.5 mL) 및 오버나잇 배양한 E. tarda 배양액 (OD 595 nm: 약 0.5 = 약 2.8 x 109 CFU/mL)과 혼합하고 용균성 ETP-1 phage의 증폭을 허용하기 위해 약 25℃에서 약 24 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후 배양액을 약 7000 x g에서 약 20 분 동안 약 4℃에서 원심분리하고 상층액을 약 0.2 μm 멤브레인 필터 (Minisart 시린지 필터, 독일)를 사용하여 여과하였다. 그 후, 수정된 표준 이중층 한천 오버레이 (double-layer agar overlay) 방법을 사용하여 상기 여과액에 단일 유형의 용균성 파지가 존재함을 확인하였다. 구체적으로, 상기 여과액 약 100 μL와 log-phase E. tarda 배양액 약 200 μL의 혼합물을 소프트 한천 (BHI 액체 배지, 약 0.4% 한천, 약 0.15 g/L CaCl2, 약 0.2 g/L MgSO4, 및 약 5 g/L NaCl)에 첨가하여 혼합하였다. 이어서 상기 혼합물을 사전 응고된 BHI + 약 1% NaCl 한천 플레이트에 붓고 약 25℃에서 인큐베이션하여 플라크 형성을 허용하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 약 1 mm의 지름을 가지는 투명한 원형의 플라크를 확인할 수 있었다. 이로 인해, E. tarda를 사멸시킬 수 있는 ETP-1 phage를 수득하였음을 확인하였고, 상기 ETP-1 phage는 용균성 박테리오파지임을 확인하였다.
그 후, 형성된 단일 플라크를 골라서 약 750 μL의 SM 완충액 (약 50 mM Tris HCl, 약 0.1 M NaCl, 및 약 8 mM MgSO4)에 첨가하고, 약 4℃에서 약 12 시간 동안 로커에서 배양한 다음, 원심분리하여 ETP-1 phage를 분리하였다. 또한, 분리된 ETP-1 phage의 유전체를 분석하였다.
그 결과, 상기 ETP-1 phage는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 포함하는 박테리오파지임을 확인하였고, 상기 ETP-1 phage의 원형 유전체 지도 (Circular genomic map)를 도 2에 나타내었다.
실시예 2. ETP-1 박테리오파지의 형태학적 특성
분리된 ETP-1 phage에 대해 투과전자현미경 (Transmission electron microscope: TEM) 분석을 수행하여 형태학적인 특성을 확인하였다.
구체적으로, 분리된 ETP-1 phage에 대해 약 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)를 이용해 네거티브 염색 (negative staining)을 수행한 후, 투과전자현미경을 이용하여 형태학적인 특성을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, ETP-1 phage는 약 20 면체 머리와 짧은 꼬리로 구성된 구조를 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, ETP-1 phage의 헤드 구조의 직경은 약 55.27 nm이고 꼬리 길이 x 기본 너비는 약 23.05 x 26.3 nm임을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, ETP-1 phage는 포도비리대 (Podoviridae) 과 (family)에 속하는 것으로 확인할 수 있었다.
실시예 3. ETP-1 박테리오파지의
E. tarda
에 대한 항균 효과의 확인
E. tarda의 성장 및 생존에 대한 ETP-1 phage 감염의 효과를 확인하였다.
구체적으로, early log-phase E. tarda 배양액에 ETP-1 phage를 약 10, 1, 0.1, 또는 0.01의 MOI (박테리아 수에 대한 박테리오파지 수의 비율)로 첨가한 후 배양하였다. 배양 시간이 증가함에 따라, 배양액의 흡광도 (OD: 595 nm)를 측정함으로써, 박테리아의 성장을 분석하였다. 대조군으로는 ETP-1 phage를 첨가하지 않은 멸균된 SM 완충액에 E. tarda를 접종하여 배양한 배양액을 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, ETP-1 phage 감염에 의해 E. tarda의 성장 및 생존이 현저히 억제됨을 확인하였다. 특히 ETP-1 phage를 약 10 내지 0.01의 MOI, 구체적으로는 약 10 내지 1의 MOI로 첨가한 경우, E. tarda에 대한 성장 및 생존 억제 효과가 더욱 우수함을 확인하였다.
실시예 4. 어류의
E. tarda
감염에 대한 ETP-1 박테리오파지의 효과 확인
어류의 E. tarda 감염에 대한 ETP-1 박테리오파지의 효과를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 박테리오파지인 ETP-1 phage를 약 12 일 동안 연속적으로 어류 (zebra fish) 배양액에 약 9.85 x 108 PFU/ml의 농도로 투여하여 상기 어류가 상기 ETP-1 phage에 직접적으로 노출되어 감염되도록 하였다. 그 후, 상기 ETP-1 phage에 감염된 어류의 배양액에 E. tarda 배양액을 투여하여 (투여된 E. tarda의 양: 약 1.08 x 105 CFU/fish), 상기 어류가 E. tarda에 감염되도록 한 후, 약 96 시간 동안 상기 어류의 생존율을 평가하였다. E. tarda 배양액을 투여하지 않은 어류 배양액을 양성 대조군으로 사용하였고, ETP-1 phage에 노출된 적 없는 상태에서 E. tarda 배양액을 투여한 어류 배양액을 음성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, ETP-1 phage에 노출된 적 없는 상태에서 E. tarda 배양액을 투여한 어류 배양액의 어류는 E. tarda 감염에 의하여 대부분의 어류가 죽고, 약 18%의 어류만이 생존함을 확인하였다. 반면, ETP-1 phage에 직접적으로 노출되어 감염된 어류의 경우, 그 후, E. tarda 배양액을 투여하여 E. tarda 감염을 유도하였음에도, 약 68%의 어류가 생존함을 확인하였다.
본 실시예를 통해, ETP-1 phage는 E. tarda 감염으로부터 어류를 보호하여, 어류의 E. tarda 감염에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 5. 플랑크톤 (plankton)을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 개발
어류의 박테리아 감염을 예방 또는 치료하기 위하여, 플랑크톤 (Zooplankton)을 이용한 박테리오파지-전달 시스템을 개발하였다.
구체적으로, 도 6에 나타낸 바와 같이, 어류의 먹이로 사용되는 플랑크톤 (예컨대, 알테미아 (artemia) 등)에게, 상기 실시예 1에서 제조된 박테리오파지인 ETP-1 phage를 먹이로 제공하였다. 그 후, ETP-1 phage를 섭취한 플랑크톤을 어류에게 먹이로 제공하였다. 즉, 어류는 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 섭취함으로써, 박테리오파지를 제공받게 된다.
이와 같이, 어류가 플랑크톤을 통해 박테리오파지를 제공받는 경우, 상기 박테리오파지는 수중 환경에서 더 오래 생존할 수 있고, 어류에 의해 섭취된 박테리오파지의 위산에 의한 파괴를 감소시킬 수 있다. 이로 인해, 상기 어류에 대한 박테리오파지의 감염율 또는 흡수율, 또는 어류 내부에서의 (구체적으로는, 어류의 조직 내에서의) 박테리오파지의 생존율이 현저히 증가될 수 있다.
따라서, 상기 어류 내부에서의 박테리오파지의 감염성 박테리아에 대한 항균능 (구체적으로, 생장 억제능 또는 사멸능)이 현저히 증가될 수 있고, 결과적으로, 어류의 병원성 박테리아 감염에 대한 예방 또는 치료 효과가 현저히 개선될 수 있다.
실시예 6. 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 개발: 박테리오파지 투여량의 결정
플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템을 개발하기 위하여, 플랑크톤에게 먹이로서 제공되는 박테리오파지인, ETP-1 phage의 투여량을 결정하였다.
구체적으로, 도 7에 나타낸 바와 같이, 다양한 농도의 실시예 1에서 제조된 ETP-1 phage 각각을 플랑크톤인 알테미아와 혼합 배양하여 알테미아가 ETP-1 phage를 섭취하도록 하였다. 이때, 상기 알테미아는 부화 후 약 36 시간된 알테미아로서, 고농도의 알테미아 배양액 (약 25,000 개체/ml)을 상기 ETP-1 phage와 혼합하였다. 즉, 도 7에 나타낸 바와 같이, 약 50,000 개체를 포함하는 알테미아 배양액에 약 16 x 1011, 16 x 108, 또는 16 x 105 PFU의 ETP-1 phage (즉, 약 3.2 x 107, 3.2 x 104, 또는 3.2 x 101 PFU/artemia)를 혼합하여 배양하면서, 알테미아가 ETP-1 phage를 섭취하도록 하였다. 혼합 후, 약 25℃에서 최소 4 시간 동안 배양하여, 알테미아가 ETP-1 phage를 충분히 섭취하여, 알테미아의 내부에 ETP-1 phage가 충분히 농축되도록 하였다. 대조군으로는 알테미아 배양액에 ETP-1 phage를 첨가하지 않고, SM 완충액을 첨가하여 배양한 실험군을 사용하였다. 인큐베이션 완료 후, 과잉 파지 용액을 배수하고 증류수로 세척하여 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 수득하였다. 수득된 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 어류 (zebrafish)에게 먹이로 제공하였다. 이때, 상기 알테미아를 섭취한 어류 내에서의 ETP-1 phage의 생존율을 비교 분석하여 (구체적인 실험 방법은 하기 실시예 8에 기재하였음), ETP-1 phage의 최적의 투여량을 결정하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 약 50,000 개체를 포함하는 알테미아 배양액에 약 16 x 1011 PFU의 ETP-1 phage (즉, 약 3.2 x 107 PFU/artemia)를 투여하여 수득된, ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 어류에 먹이로 제공하는 경우, 상기 알테미아를 섭취한 어류 내에서의 ETP-1 phage의 생존율이 가장 높음을 확인하였다.
실시예 7. 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 개발: 박테리오파지와 플랑크톤의 혼합 배양 시간 (섭취 시간)의 결정
플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템을 개발하기 위하여, 박테리오파지와 플랑크톤의 혼합 배양 시간 (섭취 시간)을 결정하였다.
구체적으로, 플랑크톤인 알테미아 배양액 (부화 후 약 36 시간된 알테미아로서, 고농도의 알테미아 배양액 (약 50,000 개체)에 실시예 1에서 제조된 박테리오파지인 ETP-1 phage (약 3.2 x 107 PFU/artemia)를 투여한 후, 약 25℃에서 약 16 시간 동안 배양하여, 알테미아가 ETP-1 phage를 충분히 섭취하여, 알테미아의 내부에 ETP-1 phage가 충분히 농축되도록 하였다. 이때, 혼합 배양 시간 즉, 알테미아의 ETP-1 phage 섭취 시간의 경과에 따른 알테미아의 생존율을 비교 분석하였다. 또한, ETP-1 phage가 미포함된 NaCl 용액 또는 SM 완충액에서 배양된 알테미아를 대조군으로 사용하였다. 알테미아의 상태 이미지는 현미경에 연결된 Moticam Pro 205A 현미경 카메라 (Motic Deutschland GmbH, 독일)로 촬영되었다. 혼합 배양 기간 즉, 알테미아의 ETP-1 phage 섭취 기간 동안 artemia의 생존을 정량화하기 위해 그들의 움직임을 생존 (활성), 중간 활성, 및 죽은 알테미아로 분류하여 임의의 지수를 도입하였다. 알테미아의 백분율 (%)은 하기와 같이 계산되었다:
artemia (%) = (특정 지수에 해당하는 알테미아의 수 (Ai) / 총 알테미아의 수 (At))*100 (Ai는 생존 (활성), 중간 활성, 또는 죽은 알테미아를 의미하고, At는 총 알테미아를 의미함).
그 결과, 도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 알테미아 배양액에 실시예 1에서 제조된 박테리오파지인 ETP-1 phage를 투여한 후, 약 8 시간 동안 혼합 배양하였을 때, ETP-1 phage를 섭취한 알테미아의 활동성이 대조군과 유사한 수준으로 유지되어, 약 80% 이상의 알테미아가 생존하였음을 확인하였고, 약 4 시간 동안 혼합 배양하였을 때, ETP-1 phage를 섭취한 알테미아의 활동성이 대조군과 차이가 없었으며, 약 100%의 알테미아가 생존하였음을 확인하였다. 반면, 약 12 시간 이상 동안 혼합 배양하였을 때, ETP-1 phage를 섭취한 알테미아의 활동성이 대조군과 비교하여 현저히 감소하였으며, 알테미아의 생존율이 현저히 낮아짐을 확인하였다.
본 실시예를 통해, 플랑크톤과 박테리오파지의 혼합 배양 시간을 약 8 시간 이내, 가장 바람직하게는 약 4 시간 이내로 조절함으로써, 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤의 생존율을 높일 수 있음을 확인하였다. 이로 인해, 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 어류에 대한 박테리오파지 전달율 및 어류의 박테리아 감염성 질병에 대한 예방 또는 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 8. 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 개발: 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 먹이로 제공받은 어류 내에서의 박테리오파지의 분포 위치 및 생존 가능 시간의 확인
플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템을 개발하기 위하여, 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 먹이로 제공받은 어류 내에서의 박테리오파지의 분포 위치 및 생존 가능 시간을 확인하였다.
구체적으로, 도 7에 나타낸 바와 같이, 다양한 농도의 실시예 1에서 제조된 ETP-1 phage 각각을 플랑크톤인 알테미아와 혼합 배양하여 알테미아가 ETP-1 phage를 섭취하도록 하였다. 이때, 상기 알테미아는 부화 후 약 36 시간된 알테미아로서, 고농도의 알테미아 배양액 (약 25,000 개체/ml)을 상기 ETP-1 phage와 혼합하였다. 즉, 도 7에 나타낸 바와 같이, 약 50,000 개체를 포함하는 알테미아 배양액에 약 16 x 1011, 16 x 108, 또는 16 x 105 PFU의 ETP-1 phage (즉, 약 3.2 x 107, 3.2 x 104, 또는 3.2 x 101 PFU/artemia)를 혼합하여 배양하면서, 알테미아가 ETP-1 phage를 섭취하도록 하였다. 혼합 후, 약 25℃에서 최소 4 시간 동안 배양하여, 알테미아가 ETP-1 phage를 충분히 섭취하여, 알테미아의 내부에 ETP-1 phage가 충분히 농축되도록 하였다. 인큐베이션 완료 후, 과잉 파지 용액을 배수하고 증류수로 세척하여 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 수득하였다. 수득된 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 어류 (zebrafish)에게 먹이로 제공하였다.
구체적으로, 어류를 3 그룹으로 나누고, 상기 각 그룹의 어류에게 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 제공하기 전에, 3 일 동안 정상적인 알테미아를 먹이로 제공하면서 약 25℃에서 배양하였다. 그 후, 상술한 바와 같이, ETP-1 phage를 상이한 농도 (즉, 약 3.2 x 107, 3.2 x 104, 또는 3.2 x 101 PFU/artemia)로 투여하여 알테미아와 함께 배양하여 수득된, ETP-1 phage를 섭취한 알테미아 각각을 상기 각 그룹의 어류에게 3 일 동안 매일 하루에 3회 먹이로 제공하면서 약 25℃에서 배양하였다. 1회 급이 시, 상기 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 어류 총 무게의 약 4%에 해당하는 양만큼 상기 어류에게 먹이로 제공하였다. 그 후, ETP-1 phage를 섭취한 알테미아의 공급을 중단하고, 이어지는 7 일 동안 정상적인 알테미아를 먹이로 제공하면서 약 25℃에서 배양하였다. 상기 어류의 조직을 수집하기 약 12 시간 전에 정상적인 알테미아의 공급이 중단되었다. 다시 말해, 어류에 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 약 3 일 동안 급이한 후 12 시간, 3 일, 및 7 일에 어류를 채취하여 조직을 분리하였다. 구체적으로, 채취된 어류를 마취한 후, 어류로부터 조직 (장, 신장, 비장, 및 간)을 분리하였다. 분리된 조직을 약 450 μL의 SM 완충액과 약 5 μL의 클로로포름을 포함하는 튜브에 넣어 보관하였다. 채취된 총 어류의 무게와 분리된 총 조직의 무게를 별도로 기록하였다. 상기 분리된 각 조직에 약 20 kHz의 초음파를 인가하여 약 1 분 동안 균질화하고 볼텍싱하여 조직 샘플을 수득하였다. 수득된 샘플을 약 4℃에서 약 5 분 동안 약 12,000 rpm에서 원심분리한 후, 상층액을 약 200 μm 필터를 사용하여 여과한 후, 여과액을 약 4℃에서 보관하였다. 조직에서 ETP-1 phage의 존재 여부를 검사하기 위해 스팟 테스트를 수행하였다. 구체적으로, 약 1 % NaCl를 포함하는 BHI 한천 배지 위에 E. tarda 지표 균주를 배양하여 E. tarda 지표 균주 층을 포함하는 플레이트를 준비하였다. 상기 여과된 조직 샘플을 희석한 후, 각 조직 샘플의 약 5 μL를 E. tarda 지표 균주 층을 포함하는 플레이트에 접종하였다. 이어서 상기 플레이트를 인큐베이터에서 약 25℃에서 오버나잇 인큐베이션하였다. 다음날, 상기 플레이트에서 조직 샘플이 접종된 부위에 전체 용해 또는 단일 플라크 중 하나 이상이 발견되면, 해당 조직에 ETP-1 phage가 생존하는 것으로 결정하였다. 또한, 조직 샘플에서의 체중 특이적 ETP-1 phage의 풍부도는 상술한 바와 같이, 스팟 테스트 분석을 사용하여 분석하였다. 계수 가능한 플라크 수는 정성 분석을 위해 스팟 테스트 분석을 실시한 플레이트에서 직접 계수했으며, ETP-1 phage의 정량 분석을 위해서는, 조직 샘플의 연속 희석 및 스팟 테스트를 반복하여 분석하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 먹이로 제공받은 어류의 경우, 상기 알테미아를 섭취한 후 약 3 일까지, 상기 어류 내에서 ETP-1 phage가 생존할 수 있음을 확인하였다. 특히, 상기 알테미아를 섭취한 후 약 12 시간까지는 상기 어류 내에서 (특히, 내장 및 신장에서) ETP-1 phage가 현저히 높은 비율로 생존할 수 있음을 확인하였다.
본 실시예를 통해, 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 최초로 급이한 이후, 약 12 시간 내지 3 일 간격으로 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 어류에 재급이함으로써, 상기 플랑크톤을 섭취한 어류 내에서의 박테리오파지의 생존율을 높일 수 있음을 확인하였다. 이로 인해, 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 어류에 대한 박테리오파지 전달율 및 어류의 박테리아 감염성 질병에 대한 예방 또는 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
| 샘플 채취 시간 (ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 어류에 급이한 후 기간) |
어류 내 조직 | 알테미아 배양액에 투여된 ETP-1 phage의 양 (PFU/artemia) |
||
| 약 3.2 x 101 |
약 3.2 x 104 |
약 3.2 x 107 |
||
| 급이 후 12 시간 | 비장 | - | ++ | ++ |
| 내장 | ++++++++ | ++++++++++ | +++++++++++ | |
| 신장 | ++++++++ | +++++++++ | +++++++++++ | |
| 간 | ++ | ++++ | +++++ | |
| 급이 후 3 일 | 비장 | - | - | + |
| 내장 | - | ++ | ++ | |
| 신장 | - | - | ++ | |
| 간 | - | - | - | |
| 급이 후 7 일 | 비장 | - | - | - |
| 내장 | - | - | + | |
| 신장 | - | - | + | |
| 간 | - | - | - | |
('+'는 어류 조직 내의 ETP-1 phage의 생존을 의미 함)
실시예 9. 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 개발: 어류에게 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 먹이로 제공하는 feeding 기간의 결정
플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템을 개발하기 위하여, 어류에게 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 먹이로 제공하는 feeding 기간을 결정하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 박테리오파지인 ETP-1 phage를 플랑크톤인 알테미아 배양액에 약 3.2 x 107 PFU/artemia의 농도로 투여하여 수득된, ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 약 10 일 동안 연속적으로 어류 (zebra fish)에게 먹이로 제공하였다. 즉, 상기 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 어류에게 약 10 일 동안 매일 하루에 3회 먹이로 제공하였다. 1회 급이 시, 상기 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 어류 총 무게의 약 4%에 해당하는 양만큼 상기 어류에게 먹이로 제공하였다. 이러한 feeding 기간 중 1 일째, 4 일째, 7 일째, 및 10 일째에 각각 상기 알테미아를 섭취한 어류를 채취하여 어류 내에서의 박테리오파지의 분포 위치 및 생존율을 확인하였다. 구체적인 분석 방법은 실시예 8에서 기재한 바와 같다.
그 결과, 표 2 및 도 10에 나타낸 바와 같이, ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 약 4 일 이상 동안 연속적으로 어류에게 먹이로 제공하였을 때 상기 알테미아를 섭취한 어류 내의 각 조직에서 ETP-1 phage의 생존율이 일정 수준으로 유지됨을 확인하였다. 특히, ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 약 10 일 동안 연속적으로 어류에게 먹이로 제공하였을 때, 상기 알테미아를 섭취한 어류 내의 각 조직에서 ETP-1 phage의 생존율이 현저히 높은 수준으로 일정하게 유지됨을 확인하였다.
본 실시예를 통해, 박테리오파지를 섭취한 플랑크톤을 약 10 일 동안 연속적으로 어류에게 먹이로 제공함으로써, 상기 플랑크톤을 섭취한 어류 내 다양한 조직에서 박테리오파지의 생존율을 높일 수 있음을 확인하였다. 이로 인해, 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 어류에 대한 박테리오파지 전달율 및 어류의 박테리아 감염성 질병에 대한 예방 또는 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
| 샘플 채취 시간 | 어류 내 각 조직에서의 ETP-1 phage의 생존율 | |||
| 비장 | 내장 | 신장 | 간 | |
| Feeding 1 일째 | ++ | +++++++++ | ++++++++ | ++ |
| Feeding 4 일째 | ++++ | ++++++ | +++++ | ++++ |
| Feeding 7 일째 | +++ | +++++++ | +++++ | ++++++ |
| Feeding 10 일째 | +++++ | ++++++ | +++++ | ++++++ |
실시예 10. 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템과 박테리오파지 직접 투여 시스템간의 어류 내에서의 박테리오파지의 생존 수준 비교
플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템과 박테리오파지 직접 투여 시스템간의 어류 내에서의 박테리오파지의 생존 수준을 비교하기 위하여, 박테리오파지를 어류에 직접 노출시킨 후, 어류 내에서의 박테리오파지의 생존 수준을 분석하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 박테리오파지인 ETP-1 phage를 약 12 일 동안 연속적으로 어류 (zebra fish) 배양액에 약 4 x 107 PFU/ml의 농도로 투여하여 상기 어류가 상기 ETP-1 phage에 직접적으로 노출되어 감염되도록 하였다. 이러한 ETP-1 phage 투여 기간 중 1 일째, 7 일째, 10 일째, 및 12 일째에 각각 상기 ETP-1 phage에 직접적으로 노출된 어류를 채취하여 어류 내에서의 박테리오파지의 분포 위치 및 생존 수준을 확인하였다. 구체적인 분석 방법은 실시예 8에서 기재한 바와 같다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, ETP-1 phage를 약 10 일 이상의 긴 시간 동안 연속적으로 어류 배양액에 투여하여야, 어류 내의 각 조직에서 ETP-1 phage의 생존 수준이 일정 수준으로 유지될 수 있음을 확인하였다. 또한, 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템과 비교하여, 어류 내의 각 조직에서 ETP-1 phage의 생존 수준이 더 낮음을 확인하였다 (도 10 참고).
본 실시예를 통해, 박테리오파지는 수중 환경 또는 어류의 위산 등에 직접 노출되는 경우 파괴되거나, 불활성화될 수 있으며, 이로 인해, 어류에 대한 박테리오파지의 감염율 또는 흡수율, 또는 어류 내부에서의 (구체적으로는, 어류의 조직 내에서의) 박테리오파지의 생존율이 현저히 감소할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템을 사용하여 어류에 박테리오파지를 제공하는 경우, 박테리오파지의 파괴 또는 불활성화를 막을 수 있고, 이로 인해, 어류 내부에서의 박테리오파지의 생존율이 더욱 증가될 수 있음을 알 수 있었다.
| 샘플 채취 시간 | 어류 내 각 조직에서의 ETP-1 phage의 생존 수준 (PFU/mg) | |||
| 비장 | 내장 | 신장 | 간 | |
| ETP-1 phage 투여 1 일째 | 약 1.20 x 101 ± 6.80 x 100 |
약 3.45 x 102 ± 1.99 x 102 |
약 1.00 x 101 ± 5.60 x 100 |
약 1.70 x 101 ± 9.7 x 100 |
| ETP-1 phage 투여 7 일째 | 약 1.05 x 104 ± 2.50 x 103 |
약 8.31 x 103 ± 8.20 x 102 |
약 9.70 x 101 ± 3.50 x 101 |
약 2.57 x 104 ± 1.02 x 103 |
| ETP-1 phage 투여 10 일째 | 약 2.32 x 103 ± 1.23 x 103 |
약 8.93 x 103 ± 4.85 x 102 |
약 1.57 x 103 ± 3.34 x 102 |
약 2.45 x 103 ± 1.21 x 102 |
| ETP-1 phage 투여 12 일째 | 약 1.48 x 104 ± 9.33 x 102 |
약 1.20 x 104 ± 8.21 x 102 |
약 2.04 x 103 ± 3.33 x 102 |
약 1.07 x 104 ± 4.30 x 103 |
실시예 11. 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 안전성 확인: 면역 반응 확인 (
in vivo
)
플랑크톤을 이용한 ETP-1 phage-전달 시스템을 어류에 적용하였을 때의 안전성을 분석하기 위해, 어류의 면역 반응 변화를 분석하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 ETP-1 phage를 섭취한 플랑크톤인 알테미아를 어류 (zebra fish)에게 먹이로 제공하였다. 급이 7일 후, 상기 알테미아를 섭취한 어류에서의 면역 반응 유발-시토킨 (cytokine)의 발현량 변화를 측정하였다. 상기 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아 대신에 ETP-1 phage가 미포함된 SM buffer에서 배양된 알테미아를 먹이로 제공받은 어류를 대조군으로서 사용하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 먹이로 제공받음으로써 상기 ETP-1 phage에 감염된 어류에서 면역 반응 유발-시토킨의 발현량은 대조군과 비교하여 큰 차이가 없음을 확인하였다.
본 실시예를 통해, ETP-1 phage 또는 플랑크톤을 이용한 ETP-1 phage-전달 시스템은 어류에 있어서, 비정상적인 면역 반응을 유발시키지 않기 때문에, 어류에 안전하게 적용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 12. 플랑크톤을 이용한 박테리오파지-전달 시스템의 안전성 확인: 부검을 통한 조직의 병리적 상태 비교 평가 (
in vivo
)
플랑크톤을 이용한 ETP-1 phage-전달 시스템을 어류에 적용하였을 때의 안전성을 분석하기 위해, 부검을 통한 조직의 병리적 상태 비교 평가를 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 ETP-1 phage를 섭취한 플랑크톤인 알테미아를 어류 (zebra fish)에게 먹이로 제공하였다. 그 후, 상기 알테미아를 섭취한 어류에 대하여 부검을 실시하였고, 그로 인해 얻어진 내장 조직 샘플의 병리적 상태를 관찰하였다. 상기 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아 대신에 ETP-1 phage가 미포함된 SM buffer에서 배양된 알테미아를 먹이로 제공받은 어류를 대조군으로서 사용하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 ETP-1 phage를 섭취한 알테미아를 먹이로 제공받음으로써 상기 ETP-1 phage에 감염된 어류의 병리적 상태가 술잔 세포 밀도, 융모 높이 등의 측면에서 대조군과 비교하여 큰 차이가 없음을 확인하였다.
본 실시예를 통해, ETP-1 phage 또는 플랑크톤을 이용한 ETP-1 phage-전달 시스템은 어류에 있어서 비정상적인 병리적 상태 또는 병리적 부작용 등을 유발시키지 않기 때문에, 어류에 안전하게 적용할 수 있음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC)
<120> Bacteriophage capable of killing infectious bacteria in fish, and
plankton ingested thereof, and uses thereof
<130> PN132970KR
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 41785
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Edwardsiella phage ETP-1
<400> 1
gcctagggtc ccctaatagc tatcagagta gtaatgagac gagtaataat gcagccaggt 60
actatcgcac agcgtaacta ttagcaggca ggtgctatcg cgtagtgata ttagcgcgta 120
gctaatagtg tatgagcgag cgcaaataag cgcaaaggcc gtgtacaagc cggctaatat 180
gtagtattcg cgcgtgcgca cgcctaataa tagaagtaag aggtaatctg cttattagtt 240
gaataaagta gtgtacaaac gacaggaggc gccacataat atattcatac tgagttgacg 300
cacaaactaa ttgagctgta cgacacacgc attaatgtgg taggttagtt tgatacgtat 360
gtttattcac aaaggagtaa ctagtatgga cttgtttatc ttaaagggcg tctcagacga 420
attagttgaa gtgcttgttg ccaggtatgg tacgatacta gcggagtatg gcactgtagt 480
attgcctgta ggtgttgcga cttacaaaga gcttaaagac ttaggtttgg acgttacagt 540
gcgtacggta taatccttat atgtagtgca ctttatctaa tgagtgcact ataataagac 600
ttatccacaa aggagtaact aatcatgact atcgttaaga agcagtttgc cgacatcttc 660
gctatcttag aagctaacca aagccgtaag gtctcaacta tcatgccgca attgttagag 720
ctgatgcaag ctaagggtgg ttgtagcagt gacacgggcc gcacattcct taaagacgac 780
gaaggtaata cctatgcagt attttgttac taccacaagc gctgggagct aactaatact 840
gctgagtatg gagccaaagg gagtactgca acgggcctca acactatgtg caaagaaggt 900
gctaatgcgt gggctaaaca gcagcgtgta tataagaagc tgcagcagga cctgcttacg 960
cttattgcgg gtggacagct aactgttgag gagatgcaag ctcaactggc agacgctgag 1020
gaagctcgta gagctatcgt tccgcgtgct gacggccatg gctttgaggc tgttgatgaa 1080
gtgactaagt aaggttgcgg attgagggta ctaactaaaa aattagccag ttcgtgccct 1140
cttcacttac cttaatactg tcattatatt atttaaatat ataataccta taatactaaa 1200
attaaataag tgaaactcaa ttttagcata tatcgttctt gtagattttt ggtattatag 1260
gtattatatt ttcattttta ttgtgacgca ttttaagttg tactattaac ggtctatact 1320
tggtttatcc gagttgctta tcggtattat attgtgacgc attttaagtt gtactattaa 1380
cggtctataa ttggtttatc cgagttgctt atcggtatta tattgtgacg cattttaagt 1440
tgtactatta acggtctata cttggtttat ccgagttact tataggagtc tatacagtga 1500
accattatac tgatgctaac ggcattgtcc aagctatctt ttgcacttac cacaagaagt 1560
gggagtgccc tcaacaagtt gaattcagcg cgcttaaggc gagcaagacg ggcctggctt 1620
atgcctgtaa ggaaggcgct agcaaggctg tgcaagagtg gaagcgggct aaacaaaata 1680
agcacgcgct tggcgagctg gacgctactg gtctacctaa gcctgtcccg cgtgctgatg 1740
gtcatggtag tgagtcactc gatgacctgc ttgctaccct cgacttgcat aggcctacta 1800
cgcttacgct tacaccgcag cagcttcggc aggtgcttgc agcgttcgac gtgcctggca 1860
agcacgctat tgtgcgtgca ctaatgtatg ttgctcgcgg ctcttcagtc gctgatgcac 1920
acatcgcggc gtgcaatgac gaattaaatt gttaatctaa aaagagtatt attggtatta 1980
tataatttat aacgaacaat aggatgcact tatgaagtta ttaaccgcac ttactaacct 2040
gcaggcaatg cttgaccgcg gagagcaccc tgactacgct ggtatctgcg agtacatcgt 2100
taatgaaata gacacgccta ctattgacta tgcaaaacta cttatgacta agtggcctgg 2160
cagaagcgac tctgatgaat tcatagtgcc tgcaacagca ttaaataaag acacgttgtg 2220
tgctatgagg tcatatatta aaggccacac tgtgcctgca ttatcttggc ttggtactga 2280
gtatgcagca caacgtcgta cactactgga ctggatggta gaggagctta agaatgccta 2340
aggtagtact gttaatcgcg ctcactgaca tcgagcaaac cctggcgcgt ggcgcattac 2400
ctactgaagg tgggaatgcc actggattgt gcaaggcagt gctagaccgt cacggctcgc 2460
cacgcctgtt aactaccatg atgatggact ggcctaagta cagtggtaac cctgcttatc 2520
ctatccctag ctgccgtggt aagtcagcac gcgaggagta ccagcaggca accgagcgcg 2580
gcatgtggtt cggcactaag tatgcggagc ttcgccgcga actattagct tacctgataa 2640
aggagcttca aaatgctatc taagttagtt gttatattag ccgtgcttgc tcttgtaggt 2700
taccttgact atgaggacca ggcgctaagc aagcgagtgt actgtgctaa cgtgcagcta 2760
tggtcctcgt cgcatcagca agccgggcac cctgcttaca acccaagcat tgtatgtgag 2820
gtgaagccat gatggcctgg gtactagtaa tactgctgag ctctggcgag acacttgagc 2880
taccagccgg gcctagcatt acagactgcc agagcctgca agctcacatg atgcacaata 2940
cgcgctatgt gacaggctac aactcgcaat gtctgtataa gtgggttaat aattttagtg 3000
tacaacccta attatccaag ctataataaa aacaattgag gagacaatac tatgactaag 3060
aaatatgagt tgttggaaag cgacctaact actcctagcg gagctacgct gtatcgcgtc 3120
aaagcgctaa aggactttgg tgatgtgaag gcgggctaca ttgaaggcga gcacaaccta 3180
gaccatgcgg gtacttgctg ggtgtccggt gaggcgtggg tgtccggtgg ggcgcgggtg 3240
tcctaatagg cagaggttac tataagtatt aatggaggct catatgccta agaaatacga 3300
gttgttagaa agcgatctga ctactcctag tggagctaag ctgtatcgca tcaaagcgct 3360
caaggacttt ggcaatgtga aggcgggcga cattggcggc tacattggag gtgagcacaa 3420
cttaagccac aatggcagct gctgggtatc agatgaggca tgggtgtccg gagaggcgtg 3480
ggtatcagac aatgcctggg tgtccggcga ggcgtgggtg tccggcgagg cgtgggtatc 3540
agacgacgcc cgagtgtccg gtaatgcccg agtgttcggt gatgcatggg tgtccgatga 3600
cgccgagtgt cttagcagcg tagttgatgg aggtagacat gcttaataag ttactagaaa 3660
tccgcgatcg cctgaatgcc cgtgatgtgc tcactgaacg cactatctgc actgaactgc 3720
gtcgcacata cggcgttgaa ccgaaggacc ttgaagttat tcatagcatt gctatgacct 3780
ggcctaagtg cgccgaccgc ttatacattg tgcctgctag ccctgaagca gtgttagttc 3840
aaagcagcat ttcacgcatg ctattagctc gtgacgctta tagtgaagac aactgccata 3900
acgcctggta taacaatgga cgagctgacc tccgccgaga gttgctggac tacctaattg 3960
aggagcttag cgatgattaa ctgcgccgca ctgctgctga ctcttgcgct gtacgtgata 4020
actaagatta acccgtatcc ttcgcccgcc caagcgctac tatggtgggt tggcgtaatt 4080
actaacatta tattactgtg cattatcatt gcctaagggt tcactatgat tacatatccg 4140
attagtccta actacgtagc agactgggga attaacgaag ccgttcgcga actaattcag 4200
aacgctattg acagcgacga gcacttcact gttgaactga ccgagaacgg cctatatatc 4260
gagagtgagg gcgtgtttga cacgtctgct ctactattag gcaactcaaa taaagctgaa 4320
ggctccattg gttgtcacgg cgaaggcatg aagttagcga tgcttgtgct cgctcgctct 4380
ggtattaatc acgtaattcg cactaacggc ttctgtataa caggcaacat tgcagacacc 4440
gattttggcc ctgcgctgcg agttacacta actgaatgcg agcaaagtag ccgcaccagt 4500
gtgtgggtcg acgaaacaag gctaaactta gctgaagtgt ttattcgtaa cctacctaac 4560
ggtttactac aatacactaa aggtctgtgg gtggctggtt taaaagtgtg tgacctgcct 4620
ggcttcaagt acggctacaa tatgccgttg ggcactatta agttagatag agaccgtaat 4680
tccgcggaca tagccgtagt gcgcgactat gccgctgcgc ggctattaga taaggccgac 4740
tatgcactaa tcgcttcact actgtttgaa caagctcaag acgtagcaga cttgtactat 4800
agaacttcgc agcgccagga cgaagagatt ggcgcagagt gcgcaaaact cgccagtaag 4860
caaaacttgg gcataactac tattggcaaa gttggttatc acttccacaa ctacttgtgc 4920
aactccggtt atcagcaacg cgagcgatct aaggctggca aacagcttga cgcatttatt 4980
accaagcatc gtaagcatat gcgagcagac gcctatcgcg cattaaagag gattgttaaa 5040
gatgtctaaa gtctttgtat ggattaccaa atataacgag tacaaattgc ctcgcgacat 5100
gacaacaacg catttgtact actcattacg tactatttgg aactatttta tgcctgaaga 5160
gttgctacta ggaggtggca tagtgtataa ttatgagagc aaatcaacag agtatttagt 5220
agacgctatc aaagcattat acaaagagct gcaaacacgc caagatttgc cttggcactt 5280
gcatgacgag ttaagctata ttcaaccaac cagtcttgaa aagaccattg tagcgcaacg 5340
taagaagcct gagctggcca tgatggatag gtttagactt atgcttaaca aaactagggc 5400
aaagccattt gactttagaa agcactacag cgttagccat atgtgtaaag aagacaagga 5460
cagagctaaa gagctactcg cgcaagacct ctatttcttg ccggataaca cgtgggactg 5520
gctagaatac aactctataa gcatacgcgt agccttacta gtgcggaggt cgcgtaaaga 5580
gcatgattaa actacactat atcattgatg gtcgtaaggt tccagtgcta ctacgcaaag 5640
caaacgtaca ctgcgttatc tggaggccaa gcggctgctt agtcggcata aacggtgagc 5700
aagagcctat gcacttcgtc gagtcatttg agcaagtaga ggagctaatg actgcgcata 5760
aaactaactg tgcatgagcc tgttgacgat atgctggagg ccgtaaaaaa cttaaaataa 5820
ttgtgtacaa ggcctgggtt taacgatatt attatttcat caagtcaata ctaatcttca 5880
acaaagagag aaccgttatg tctaccatca aaaaagcgta ccaagcaatt gtagaagtcc 5940
tgcagaacaa cgctagtgcc gtcgtctctg acgtgctgcc acaggttatc gaactggcct 6000
ctgccaaaac tgcagctggc ggtggtaagc ctaccacctt ccatcgtgac gacgccggta 6060
atgtcgtagc catcaagtgc tactaccacg gcctgtggat ggacccgcgt gtagctgagt 6120
tcggcgagaa gaaaacctct gcaagcggct tcaactccat gagcaaagat ggctcttcta 6180
agtggactaa gcagaacgct gctgctaaga aagctaaaga agaactgctg acccgcgtac 6240
agtctggtga agttgcgccg gaagctatcg cctctgaaat ggctgcaatc gacgccgctc 6300
gccaggccgt cgttgcccgt gaagatggct acggcttcga agccctggaa gagtgcctgg 6360
cagactctgc tgcccgcggc ctgtaattaa gactgcccgc taatgcgggc tttcttttca 6420
agtcaactgt cacaacacga ggttcaagat gtctgtgttg attgaagcat ggcgctcagg 6480
gttcttcaca gaggacgaag tatgcaaagg cttcggcgtt acgcataagg agttccgtag 6540
cacactgcta tcctatggct taccacttcc ggcagcagag cagtctgcag gtctgtgggc 6600
tgaagtgtat aacaacaagc ctgagaacgt catgcgtgct acagctgaat atggtgtacg 6660
gcttaaccta atggtaaagt tctgcactga gaagccgggt gatgtgctga cacgtgaagc 6720
cgtattagct atgcgaggtg aaggcctcac tgttgcgcaa atcgccaagc attatagcgt 6780
tactcaatac tacgtgcgca agcttctgcc taaatgcaat aggctagtaa tagataaaga 6840
agctattact gctgacatta tggaaggcaa gttatcttta ttagacatag ctgtaaagca 6900
cgaagtgtca ccgtcgctcg tgtcaaagct gaaccctaat aagattaaga aaactcgtgg 6960
tgaaggtctt gacgatgcca cacttgctaa tatgcgagct gacctacaga ggtttaatgt 7020
ttcagaagtt gctagacttt atggggtatc aaggggatac gtatatgctc accgcaaagc 7080
cacattacaa gaagctgact agcgagcagc ttaatgctat aaaacagcac gtgccatcta 7140
gtaccaactt tactcctacg ggctcggtag agttgaaccg cacgattaac ttagctaagc 7200
tctacgcgca agcatctatc aactacatta atggagcctg gtacgaagtt acctggaaag 7260
cataatgcgt gacatacaac cattcatcga tgctggttgg cacactgtac ctctacgtgg 7320
cgaactaaag cgtacagagt ctggcgataa gactgtacca gtgttcgagt ctaactggcg 7380
gcataagtat caagaagaac gcaatgacac agcgacgaaa cttggtggca ctataacagg 7440
cgaagtgtca ggcattatcg caatcgactg tgacaatagc gcaacatttg ctatcttcac 7500
tgctatggac ccagactata cctttctatt cttgtctaaa ggtaagttag ataagaatgg 7560
agtagagaag caatgcggaa cctttatcta caagtatgac gccgaactag ctgagtcatt 7620
tagtatcaac gatggtagca tggctttaga cttctattct gaccgtggct tcgtgtatct 7680
acctacagca gctaacgaga ctaaagtagc tctacaagag ctacctgaac taaagtcagc 7740
gcctccggct acaaaggtcc tattgcagca gttagtgaag acacggcctg aagctaagca 7800
agcatcgcca atggctagta acatcatgac tgcaaactgc ttggctcctt tagtttgcca 7860
gtacaacact aaccctggca aggtgatgcc gggcttattc cgcatcatta cgcctcgcga 7920
ctttcgtgat acgcctgagt acgtctctca aggctatctg cggcctgacc aggttcctga 7980
agggcgtggt agtgagtacc taagtaaggt gtctgctata ctaggcgctg atgtgtctat 8040
tgacgctgca ttgtataacg agacaatgca caacattaac aatctgtatg atgttcctat 8100
gggcaaggac cgtcttgaca agacaattct tgaccctatg ataagcggac gggctaatat 8160
aagtggtaaa gctatttggc aatatgatga ggcgtgggag cagtatcgtc ttgtgctgtc 8220
tagtaagcgt cagtctagcc ttgagctgtg ttttgacgac cgccgtaatg cttactacgt 8280
tgttgatgca gctaacgagc actataaagt gttctctcgt gactcggaac tagtagcgta 8340
cgtctctgct actgctagta accctccgaa gaaaatagat atgctgcgta gtctgcctat 8400
cgtcaacgtt aaatcacaac ctaataagcc attcgggttt aatgagggtg atgaccctac 8460
agcacgtacg ttgaacacgt ttattcagac accagagtta gctataatgt ccaaccctga 8520
tagttatgcg gcgttatata aacggcctac tacaacgcta aagttcttgg agacactagt 8580
cccagaagag gagatgcgtg acttcttact aggctttact aaacgcaagc tactcacttt 8640
cgagtacagt cctgtaatcc tgtacttctt aggcgtgcac ggttcaggta aagacaccta 8700
tgtgcgtatc ctagagacca tcgtaggcaa tgtagctcgc ccaacaacta aggagttttt 8760
ggagatgttc aacggttggc tgctagacgc gtactttgta cagctcgatg agtacggtaa 8820
ccagatgacg cgcattagcg agcgcgaaga agcattaggt aaactaaaag cctacacggg 8880
taagcagaac gtgcagattc gcgctatgcg tacagatggc ttcacatacc atcataacgc 8940
cacattcatc atgacagcta acaagaaccc gttgatgctg gaagacggtg accgccgcgt 9000
tgccttacta ccaactccta atgtgttagc tgagcaagac tgggttattg atgctggagg 9060
tgttacagta gtacacgagc gcatcatgaa cgaagttaaa gacttcgcgt actaccttgc 9120
tgttgaggtg cctatgctaa gccctaacca atacatgaag ccaccggagt ctgtagctaa 9180
gcgcaagcta gtagccgaca gcatgtacgc tgcacaacgc ttagcttatt gctttaagca 9240
tagcatgaaa gactacttgt tggacctggc agaagacttc agtgccacca agttcgctga 9300
agcggttaaa cgcggtcgtg tatatacaga agacattgaa ccactgtatg acgccatgac 9360
agacatgcaa ggcgatattc gtgctgtaac taaggctttc cgccttctta atgtacctac 9420
aacaaccact actcgcaatg gctctaagac acaatgcgtg acaatcgggg agcatgttga 9480
agaagagaag tgggacgacg taactaaagg agaacctcaa ctatgaacgt gctagacacc 9540
tttattgatt tcctagcgga caaagaagct tgggatatgt acattactgg agcggcaggt 9600
acaggcaaga ctacgcagct aagccaagaa gtacaatact gcatagacaa tggcatctcc 9660
tatattgtat gcgcatacac acataaagct tgtggcatac tgcgcgacaa actaccagaa 9720
ggcgcgctgg ttactacgct gcactcattc cttaagaagc ggcctactat aaaccagcat 9780
gcaacagaca agaagtatct acaagttaac acacaaagcg gcgcacctaa gcagcctgta 9840
gtgatgttcc ttgatgagta ctccatggta ggcgagaaag acggcctaga catcctcgca 9900
ttacaagacc ctgactacga gggcgcacca agcttgaagg tggtgtggct tggcgataag 9960
aaccagctag acgcaatagg tgatatacct tacgttgttc ctactggtaa gtacaatgtg 10020
aagctaacaa ctatctaccg tcaggcagga gataatccac tgctagagcc ccttagcatg 10080
ctggtggaca tgattgaagg caaacgcgac gtatgcgcgc tacctgctaa tagctcgttt 10140
attcgtggcc aggacatcgt aaaggcgtat aaacctggtg aagactgcgt gctactcgcc 10200
tacactaatc agcgtgttga agaactaaat gctgcgattc aaaaacgcaa agagccgaaa 10260
gtgggagatt ggctatttag tcctacgaca aaacgccggt atgagttcct gggctgggtt 10320
aaaaagccag agtatataga cacaccgttc aatggagaat tacacctggg ctcaaaatac 10380
gagaccctag agtacttgac aaaaactaaa aactgccagt tcgccgaggc gcgagcagaa 10440
gatgacgaag ttttaactat cgcagtagtc tttggccact accagtacaa gttaaagaca 10500
gaggagctga agtcagccgc agctaactct aaccgcgaga tagaaaccac acaccgtggc 10560
tacaaagctg cagcttgggc taaggcgaat cctaagaaca agttagctag agcacgtgca 10620
aaggcctggc gagactttct tagcttcgat gagtgcgtaa tttgcgtaga ctttgtacac 10680
gcaatgactg tgcataagag ccagggctct acgtacggta ctgtctatgt agacacagat 10740
gacttgtatc gctgcgcgtc tatcaacttg aagcaatacc ttaagctaat gtacgtggct 10800
ctatcacgcg catcaggcaa agtaatcact aactaacata gcatgagtga ctagaaaaat 10860
attttagccc ggctatgtac aagaccagag tcttttaata taatatattc acagtcaagc 10920
aatgatgttt gtctgtgaat tcaactgagg aataatgaaa tggcaaaagc aatcaatgta 10980
cgcactcctg ttggccaact taactgggta aatatcactg gcgaaggcaa agagaacatg 11040
tcgggcaagc tgaagtatct ggctgacctg gtgctgcctg ccacgtctga cgcgtgtaaa 11100
gcgctgatgg cggaaatcga tgcttactgg ctggctaact tgccgactgg ttggaatcct 11160
aaacgcgcgc ctaaatctcg cggatatcga gaagaaactg tcgctgtcaa ggatgataac 11220
ggtgatgatg tatacggaga agacggtaag aaagtaaaac aacccaccgg caatatggtg 11280
tttactttct ccaccgacac tacttacccc tctggcgatg ctaaggttat tagcgtgtac 11340
aacgccaaag gcaacaaggt agcgcttggt gatactcgta tcggtaatgg ttctacaggg 11400
caggttggtg gcgctatggg cacctacgct attaaggggc ctaaaggcga ccttactgat 11460
gcaggcgtta cgctgtatct gaacagcgtc cgcatcatca agctggtaga gttctccggc 11520
gaagagacgt gggatgacgc tggtgacgac gacggttgga ccggtgaaga taacagctgg 11580
accggcgagc ctgagtcagg cactcctgca actccgcgct tgtaagtagt actaagtagg 11640
gctacggccc tgcttttaga aacgcactga gtagtgcttt tctcaaagct aatcacaact 11700
gaggataata gaatgttcaa catgaagaat gtagtagccg ctgtaatgcc taacctcgta 11760
gccgttgaag taacctttgg tgacggccgt gctcagtgct acacctatct cgctccagca 11820
agcatgggcg tatgtaaagg cgataaagta gtagtatgta ctccggctag cggacttaaa 11880
gtagtgtctg tggtacgagt gagtgaagac tttgacctgg atgttaactt cgagtataga 11940
tacgtcgcag cacggctgga cttcagcgag tacgaaaaac taatgcgcgg caaggcgcag 12000
gtagaagcag cctacgtcgc cagccagcgc gctgccgcac gcaagcagtt ggctgatgtg 12060
ttgaccgcaa gcttgagtga cgacgttaaa gaactattag ctaacctggg agctaaagat 12120
acgaagtaaa ctggcattaa tgctattcac taccctttct taccttacct gcgtgctcca 12180
agggttaagc gtgtacgtaa aactaagtca gttgcgcaga tgaagctaag aaacgcaaca 12240
acattcgcaa acacaagtaa acaataggcg gccttcgggt caccttgccg ctggaggcag 12300
aaatgaaagt accataccgt aaaacgtccc tatctgaagt atcttccctt attgacacta 12360
cgaaagacct agcgcttgac accgagacgc aaggcttcta ccagcgcatt cgcctcgccc 12420
aattctacca gcgtgactgg cctgaagtac tattagttga gtacccaaac caatacgaat 12480
tagctactgt cgttgacact gtccacattg tggcgcacaa cgtgcactat gaaataacaa 12540
ctatacagca gcagaccggc acgcgctgga tgcctaagtc ttttgatgac acttttctac 12600
tggcacggct tcactttcct cagaaagagt ctttctcact agacgacgtc actgcttacg 12660
tgttaggtta tgacctgtat actaagctag ggttggagaa gaaaaagctg caaggcagtg 12720
attggtctgt accagtattg tctgacgcgc aactgctata tgctgcggca gacgtgtaca 12780
aactgctgga cgtgtatgac gaagtaaagc agcagcgtgt agcttttagc tacaagttag 12840
acaagctaac tttaggatac tgcgcagact tccaatggaa tggtatgcct gtagacaaag 12900
ctcgtatgtt cgaggagttc gacagtatca ctgagaagct taatgctatc gtgctacctg 12960
taaatgccaa ctcacctaag caagtgaaag agtggctcgg tgttgacagc actggcgaca 13020
ttgagttggc gtgtctagag ctcgacccta cacaaacaga gctgtgttac ttcggtgtgg 13080
ctaagcctat gccgcgcaat gaagcagctg gtctggtgcg caagacgcgc aagctaaaga 13140
aacaactcag ctttatcaaa aagtttgaag agacaatgct cagcgaacta ggcattctag 13200
gtaagttcaa gccgtcagct cgttctggtc gattaacgtc tgacgaccaa aacctacagc 13260
agctaccgcg ctctctaaag tgctgtttcg gtactaagcc tggtagtgaa gtactaatct 13320
atgctgacta tgcacagatt gagctacgcc atatatgcgc cattacagaa tgtaagacga 13380
tggagaagct gttccgcgaa ggccgcgacc tacactcata cactacagat atgatattcg 13440
agacctatga aaacatcttc gaccgcatgc tacaaagtgc tcttgataca gcggagactc 13500
gccgtggcaa cgtagtctca gaagaggact accagcgtat cagagcaggc gtagaaagtg 13560
aagctaagaa attgtacaaa cgctaccgtc agattagtaa gacatgtaac tttagcctgc 13620
tttacggcgg tggcattgct atgtttatta gcatcctaat caagacagcg tctatcctac 13680
ttaccgaggt agaagctaac aagattcgcc agaagtggcg caacctatgg cgcgagattt 13740
atgcttggca agagcgtggc attgcgatgt ggcgtaaagg taaattaggc tctactccac 13800
tgggccgcca ctactcagct aagatgatga ctgatcagct aaacatcgag aaccagggcg 13860
gtgcagctga cgttaacaag ttagctatgc attacctagc gcctcgcctt gccgcctaca 13920
acgagcaaca tggcaccaat tattgtatcg ccaataacat acacgatagc tatatcttgc 13980
gaggtgaaga caacgcagag cattataaag ctgtggcagt tattttagct gaatgcatgc 14040
agctcgcctg gtttgagtgc tcaaaagcac tgaaagtaaa agatatccca atgcctgtta 14100
acgttaaggt cggctataac tggggggaca tcgaagacga cgatgtgcca gacctataca 14160
gctttgactt ggaaccttat gtaatgttgg agaaagcaca atgaagtttg aacacgacta 14220
cgcagcttta gtatctaaga ttttacgtac tggcgagatg cgtaatacgc gcaatgctgt 14280
aactaaaagc atttttggcg agacgcttgt tatcgattgc ggcgcaaagt tcgcaccatt 14340
actagttggc cgccagatgt tctataaagg catctttgga gagctagcag ctgtgctacg 14400
ccagcctaag catattgatg actttaagcg ctggggctgc aactactggg gacagtgggc 14460
taactctgat gggactataa acgtagacta tggcaatgct tggttccgtg gtggccagat 14520
tgaacgactc aaggacaagt tagctaatga ccctacagac cgtcgcatga ttattgctgg 14580
ttgggagcct aaaaacttgg acaagctaaa ccttccttgt tgccaccata cctatcagtt 14640
ttatgtgcga gctggtaagt tcttagacat gagctggagc cagcgcagtg ttgatactat 14700
gattggccta ccttcagaca tcgtgtttgc ttgggcatgg ctagtaatgg tagctaatga 14760
gttcggtttc acccctggcc gcattactat gttccttggt gattgccaca tttatgagga 14820
gcacattgag aacgcccagc gctatctgta tcgagttcat tctggcaaac taccttcacc 14880
accaacattt gaggtaaagg cggaagagaa aaaagatttt actttgtttg aaccagacga 14940
tataatgatt tcatcttatg agcacaaagg caaactggag tttaaacttt atgaataata 15000
tctatcaacg tgttgttact tggaacgaag cccgctacga gcgtgagttt aaccttaacc 15060
tggcagttgc tctgctgcgt gaagagtaca atgagtggct tacggcgaag actaaagtag 15120
gcaagctgga tggcctgtgc gacatcgcct tcgtagcctt aggcgttatc tggaaaaaca 15180
acacgccgga cttttggcta gacgacgctt tccaacgtgc gtacgacaat caactagctc 15240
atagcgtata cgaaccaatc tattacactg ctgctttact tgacgtactt gagcacactg 15300
acgtctcaca agagcaagta ttagacatta tggcagaact aatcgtgcag tgccaagctc 15360
aagcattgta catgggctta agcaataaac agtggctacg cgctatgaat gttgtatgcg 15420
actctaatgc cagcaagagc attaagaaag tcgcgtcaga cgttaaggct aatgctggcg 15480
ataaagggcc tttctacttc ccgcctacct cagggctagc taaaattctg agagaggtta 15540
agatcaatga ctaagcacga gttggtagca tatgtaatgg gcgtagcagc taagtctaat 15600
attgaaaagc gccgcgtagg ctgtgtaatc gttgacagta agggcagggt gcttggtgaa 15660
ggctataaca cctctgaagt gcacgcagaa atagctgcat tgaagtctat gctaaaccgt 15720
gtaagcaatg ccgacccagt taaggcgaac gaaacgcgta ctgtctatgt tacgcaccag 15780
ccttgtccgg cctgtgccag gcagttagca gttgtactcg gtacagacac taagattgaa 15840
gtagttgagg catttctaaa gttcgacggt gacaagctac gcatggacct gattccgccg 15900
tcagcaacta aagctttagc tgaagtgcta acctttggtg cgcgtaagta caagccgaac 15960
aactggaaga atgtagaaga ggcagaccgt tacgtagcag cacttatgcg tcatgttgaa 16020
gcgtatcgcg aaggcgagct aatagacccg gagtcaggcc tgcatcattt agctcatgca 16080
atgacaaaca tagcattctt aattgaactg gaccataagc cgcaaacctg gctacgaaac 16140
ggatccaagg cctaatttaa atccaaggcc tggctaaacg gctaggccaa atttccggct 16200
cgaccacggg ccattctgga gaccgtataa tgtctattaa aattaataat atgtctattc 16260
gcattcgtcc ttccgcggta gactcttttt acggctgtgc ttatcagtgg ggcaagacct 16320
tcttagaagg catcagctct atccctaact cacgtgcggc catcggtaca gctattcatg 16380
ctggaattga agcttcttgg cgtgacgcta tggcgcacgg caaagctaat cacaacttgt 16440
ctgcaatgtc agacgcagca gttagttcgt ttaaagaaga gacagctaat ggttgcagct 16500
ttggcaacga tgagacggtt aacacatgtc acgtagaaat tattggtggc attaaggctt 16560
gggtagaaga cattgcgcca tttgtccctg tcccagaagc tgtagagacc tttcttaaag 16620
tagatatcca aaaccaccct tttgtctctg aagttggcgg cacactggac tacttaggcc 16680
atggagtaat tgacgacgtt aagacgtcca agcgtaaagt aactggctcc agttatgaca 16740
cacagcaagc tatctataag tacttagcag aagctaacgg gcaccaagtg ctacattctc 16800
gcctgcagaa cgtcgtgctt actaagtcgc cagcaggaca gattctaact attgagccca 16860
atgtaggtaa agcaaagagc ctagtaaacg gcatgctaga cgtgcttgag ctggtagcta 16920
aagacatcgt acctatcgaa ttattgttgc gtggtaatcc taagtatact ttctgctcag 16980
acaagtattg tgctcattat gacaactgtc cttgggtgcg tggtaaagtg gctgagcctc 17040
gtaaagcaga catcgcagct attaagctgt aaccctctga cgagggcttc ggccctctac 17100
tggagaacgg tatgaaagta acacattttg tagacctaac gcctggtaaa gcaggcacgt 17160
acggcatcgc agagcagcct ggcagcagta ctcgaggaag acctggcgga gcacgtgaag 17220
ttcgcgtaaa cgagcctgca gacattatgc ttgatgcagg ttatgacctg cgctggctgc 17280
cacaaatagg cgtagtagag cgtaagggta cacggtacta ccggaatggt aagttacacg 17340
cttacactgg tgaactgccc gctgccacca gcacccaaat tctaagcagc gcgtactgga 17400
gggagctgta caatgacgcc ttacacgcat cagcttgagc taagcgatgt agccttggcc 17460
atactgcgag aaaatggctt ggcgtatctt gcgaatgaag aacgtacagg caagacattg 17520
acagctatct tagtatccga gaagtcctct gccgagcgca tattagtagt cacgaagaaa 17580
aaagccttaa caggttggga agaaactcta gctgcgttca aacatgcaaa gcagtacgtc 17640
gtaactaact accatcaagc tcacaagcaa ggctccaact ttgacctggt tatactggac 17700
gaagcacata actatattag ctcgttccct aagcctggta agatacacaa agagctaatg 17760
ccaatctgca aaggtaagcc tatactgtat atcagtgcca cgccatatgc acaagggccg 17820
cagatgttgt tcaaccagtt taagctgagt tcgtattcac cttggtataa gcactctaat 17880
ttctactcat ggtttcgtgt atacggaaag ccgtacacaa aggagataaa cggtatcaac 17940
ataccgcagt acgaccgctg caatacagag atggtgttgg actgcgttaa gcacttgttc 18000
ataactaaga caagagcgga cttgggcttt gaacacgagc cagaggacaa gcttcacttt 18060
atcgagctgg ctaccaacac aaaagctgtg tacaatgctc tgcttaagga caagctcgtg 18120
caactcagtg taggtaaagt agtatgtgac agcgcggcca aacttcgcac aacgttgcac 18180
cagctcgagg gtggtacggt aaagatcgat aacaagagcc atgtattagc taataacgaa 18240
aaaatcgact acataaagga gcacttcggc gacacaggca agctggcaat aatgtacaac 18300
tttattggtg aaggcgtgaa gcttaaccag gcattcaagc atgctgcaat attgcaagca 18360
acgtcctttg cggaaggcgt agacctgcat aagtatgatg agcttgtaat ttactcgcaa 18420
gactactcta ctgctcgcca cacacaacgc cgtgcacggc agtgcaacca aaagcgagac 18480
aagccgatag tcgtacactt cctactggta gctaatgcga ttagctcaca ggtgtacaaa 18540
acagtgtcgg ttaataaacg caactatgta gacagcgtat ttgagaggac aatgctatga 18600
acaaagtgat gctatcttgc aacaccatac ctaacgtgca taccgacatc gcctaccctg 18660
tgctggcctc aggcaagatc gacggaataa ggatgtgtgt gcaagaaggg caagcagtat 18720
cccgctcgct taagccgatg gctaatcata tgctgcgcac aaagcatagt accaagttgt 18780
tagacgggct ggatggcgag ttaactgtgg cgaatagtga ctggaatagc ttcaacgtta 18840
actcctctgc cattatgacg caaggcacaa atcctagcgt gctgtaccat gtgttcgacg 18900
acatgcttaa ccctgcgcaa gcgtctacgc gtaagtctca aacacacgac cgcgttaagc 18960
agctgcagga tgctgggtgg gagcacctgc gcttttgtga gcaacacctg gcgcacaatg 19020
ctatggaact gttagagtta tatgatagct atcgtgcgag aggttacgaa ggcttgattg 19080
taatgaagcc ctcgggccac tacaagaatg ggcgcagcac tttattgcag cagctctcct 19140
tgaagctaaa accgcaagct gacgctgaag cagtagttgt gggctttgaa gagctaatgc 19200
acaacttaga cgccggcaac tcaaaatgcg ctgagcacct cgtgcctggt aataaactgg 19260
gagcgctgat tgtagaattc aacggccaga cttttaacat tggcacaggc tttgacgact 19320
acatgcgtaa tgaagtttgg attaacaagc acaagtatat agggcaatta gttaccttta 19380
aatacatgga gctgtatccg tctggtgttc cacgcgggcc agtgtttaaa ggttttagga 19440
gcaaactaga tgtctgagca ggcgctacaa actaagatta tggactggct aaaagctcac 19500
ggcttttacg cagtaaagat aatagcgtgc agtaaagctg gtacagcaga tatactggca 19560
tgttcaccta aagggcggtt tgttgctata gaagttaagt acggacgcaa tacgccgtct 19620
gaactgcaga aagacttcat taatgaagta gagcgcagag atggtctggc gttcgttaca 19680
tgggatctgc agacagttat cttccaccta cagggagaga ttgtaccgct gaaggcagag 19740
gttagaccaa cagacttctt gttgtaaaat taagccctct ttcgagggct tattattact 19800
tgaataaacc ccgcagcttc tctccaacag acgagccgaa acgatagttc attacttgtt 19860
gtcgttcttg gtagagctga ttcaaacagc ctccaatgat ggcagacaca gtagctaagg 19920
tgccctcagt cataccagat gtagttaccc acactaacag cgtaatacta ccgccaataa 19980
gcgggatgtt accaaacatg atcagataag ctaatttgct tgtagtagca tcgtcacgca 20040
atgtctcacg ggcatgctga atatcattta cctgcatctg tagcacgtca gcgactttgg 20100
acatcaactc taactgcagc tgaggattct gctcaagcac gtccttatag cctgcaagag 20160
cctgctgaga gtctgcacag cctgtagtag ctttagctgt atcgataaca atagtagcta 20220
cttctgctgc cttgtcactc ccaaaggccg acttaaacaa gtctggcacg tacttggagg 20280
ccagacccag cgctaacgga ataagcggcc ccattagttg tcctccgctg cataaagcag 20340
gttgtctgaa atgcgccgag cccagccttt accgtaacta ttccaagtgc tagtctccgt 20400
cataaagcgt agtcgcttac ctaagaaccg caggcacacg tcattagggt ccatagcttg 20460
tacggctgca atagtcttag gtccaacaat accgtcgtca ttaactcgcg cagcccactg 20520
cagccatttg atagctcggc cgcaaccact atttacagct gcgtcgaata cctggaagtc 20580
tagcacgtca ggccagctag tcatattaag cttatcccag aagtctcgct tatagattgc 20640
cttcgcttgc tcccaggtta aacctttaat gtcaagatta gggtacgaca tagccgagat 20700
gccatactta gtacctttga gctggcctac accacactta ccgctagtcc aattgccgcg 20760
atctttaggg tcagcagtgt agttgccttc gtggctaagt acgcgaccaa taactttatc 20820
atacatatac agtgtcctta agtaaggcct caactaagag gccgcaagtt taaatcagtt 20880
cgatagttaa gtagctggca cgatctgcac ctgcaccagc gacgttagtg cctgcgatgc 20940
cgttcccata gaaatgcaag aactgacctc cattcagttt gcccgtataa tcgacataca 21000
cggtctgttt ctctgtagaa cgacctggtt ggttaagcgt tagcagtgta cccgtgccag 21060
aagcggccgc tgcctgccta acatctagcg ttgcaccatc tgacaagcta taagtgccaa 21120
cattaacacg cacacgatag ttgccagtca ttggcacgcg gaaatacaca ccacgcccac 21180
cgataccgaa cttatcgtct tctacaacgg caaactcaaa gttgtctcca gggctggtat 21240
tacgagctag tttgtacgca gagaatttaa taggtgtacg agagctggta atacggttca 21300
tgccagtagg caccggctgg ttcttaatgc tatcaataca tttagttagg tcagcgtttc 21360
gcaggtcaaa ctgactagtg tcaaaagcgc cgccaaagtt aaggtagtag ccaggtgcgt 21420
tggtcctata cgacccacca tctacagtaa tagaactcgc gccaccttta gagttaaaga 21480
tcttagcacc aacatcgcta gccgtgccga acacgccaga gcccacatca gggtcagtga 21540
caactacgga gctcggcgct gtagtagagt ctacaactaa aaatgagcca tacagaccat 21600
ccgctacagg gctctctaac cggacagcgt cacagttgat gacattaaat gcaacagggt 21660
ggtcagctgc ggttacaggc ccaatagtgt taacattctt agcaatacaa ctagagaacg 21720
agacagaccc gtgtacgtgc atcagataac tagttttata gccgtcgact agcacgccgc 21780
taaacttgtt acccgtgccg gagcgtagac ttgcaggatc atttagctcg atgcctgcca 21840
tttcactgta cgtatctgcg ctagtgtagt aatacttaaa gcgcaggtca gtaaaagtgt 21900
tatagctagc gttgtagcaa cgaatgccac gacggaagcc tgtaaatgaa cagttagtaa 21960
acttgcagtt attaaccaca ggggcgaaaa taccgaactc actcttgtcc ttagtcaaga 22020
agttaacacc gtctacctca acatctactg caaagcctgt gtccgggtgc actacgatga 22080
taccagcgtc cacgttaaaa cttgtctgag actgcggagg acggtcaggt tgttggtgcg 22140
taggtaagtt aggcatagtg ccaggacgct tagtcagagt aaaattgcct agtgacatta 22200
cgcgatcccc tgtgtacaat accaggtagt cgtaatcggc attcatgtct acaatcatag 22260
caacgccttt agcctgcgca gcagccatgg cagctgtaac ggggtcctgg ctatctttgt 22320
atgagctaag cagaacgcca tacgtacctt ttacagccgc gagctcttgc tgcactgtct 22380
tgcctgagtc agcaccaatc atgctagcgc cagagttaga cgcaagctgt tcgcgtagtg 22440
aataacctac agctaattta aaaccactag ccgggtcttc tgggttaatg ccaggcacaa 22500
ctacgtgcgg aactgcgcca gtccactcgt atgctttgcc gttaactaag cttacgacaa 22560
cagtcttgtc agtggtaact gtgcagccgg cctcgcagtt acctgcgtac tcaggcccaa 22620
cagactcgat ccatagctgc atgaagctct tggtaaagcc attaacattc actgcagcgc 22680
cgccgcgcat ctgctggacg acctctgggt taagcagcat atcctgctgc gctgccaggc 22740
tcttcttgat aactttagtt tgcataatgt accctcagtt gaaaaaggtc tgacacgtat 22800
aacccaacta gcaatacaac aagcaagtag tactttagat tactcataag aacttactca 22860
gtagtttctc caaccctagg cgctcagcta agaagcccaa tcctagcccc attccaatat 22920
gccagaagcg caggacattc ttagacaatt cgccaagctt actgtcctgc tcttcctgct 22980
tagtctcaac cccatctagt tgagacttaa gccgctctaa ctctctctct gtttctttat 23040
ccattattta aggactctga ttctatctgt gccttgctgt actgcagcgt aaccgttgga 23100
cttcagcatt gtatcaactg ctgtcttatc agctaagtta ataccagaag actcggccag 23160
tgtagtaagc accttcgtag acgcaatacg atgcacggga atcgtatgag cttgcccagt 23220
ccctttaaga ccaagcaccg agccagaacc gtagagcttg acgcgcggca tagtggtgtc 23280
tttaccggct gctgcagctc gcgcagtctg ctgctgcagg ttaagcacct ctctgcttac 23340
atctactttg tcaccagctg cctccattag ttctcttaca gaacgagcat taagtgggtt 23400
ctcaagcagc tttgcagtct tacgcacgag ggcaagctcg gcagttttct tgctaggcag 23460
cagagacttt acgtaattaa acataccaga agctatctcg tactttgcgc gcgcgactgg 23520
gtcagtggtt aaatagctct ggaacttagg aatctgaata ttgccagtga tgcgcgacaa 23580
cggcacgtca ttgcggaata cctcagccaa cgcacttaca gcctcacgag cctgacgagc 23640
ctgaggtgta gacagtgtta ccttcttaag ctcatcagac agcataggga agttaacagc 23700
ctgcaagcca tcgccaacgc cagcggtata tttattagct aatgtgtcaa ctacagaatt 23760
ctctacacgt gagcgcatct caactggcaa ctttatcata acgtcgttaa acgtgccatc 23820
catagccgta atgtaacgag ctaaattgcg cgtcacgtca gcctcgttag ctccaggctt 23880
attaagcgcc ttatacataa cgttcttctc aagctgcttc atcttagcgt agccaagacg 23940
tgcctcacca taagacttaa gccactccgc aggtttgtct acagcaacct gcgcgccttt 24000
ataaatctca tcgtcgatag acttgagaat gccgttaagc gcctcaaagt ctttagcttt 24060
agaaatacgc gtgttaaact tgaactcatt aacaacttgg cgcaggtcta acaggtcagc 24120
aaaggttctg ccgtctgaca tatcacgaat gcgggaggct tgcagctgga acttttccag 24180
tactgcagga tccataatat tgcgttgcag cgtagctagc accgggtcga tggctaactt 24240
gtcatagtcg aagcggaagt tactagcctt agtagactgt gcggcttgcg caatcacgct 24300
atggtaattc tgcttaacat ctgctacgta gttgcctaag tcctctcgca gcactttacc 24360
taggctctca ccggacatct cgcctgttgt gcgcagaagg tccttggccc tgtcatctat 24420
gccctttgct acagctcggc ttgcttgagc atccagacca gcagcagctt gtacaagacc 24480
ctcagcacca gggcgagtaa tagcagttgc agcaatcgct tgctctgcga agttcttatc 24540
ggtagccatg ttagtagaca tacgacccag ctgcgtgaca atctgcgcag cttggtcatc 24600
cgacataaac tccatttgtt taagcgcttc atacgcgccc ttagtattgc catctacaac 24660
aaagtctttg acacgtttta cgccacgcca caaaccctta gccccttttg ctacgccgag 24720
accaagcgca tctgctacca cgcttacttc agcagctgtt aatgccttat gtgccataac 24780
gtctgcttca atgtcctctt gtagcttcac agcttggtat aaataatcga gctgtgtacc 24840
tgtagcagag cctgcagcag cacctaagat agacccaaca acagtaccag cagctacacc 24900
ccaagggccc ccaacagtac cagctgcagc gcctaaccgg ccaccaacaa tagctccact 24960
aacgccacca gccaactcgc ctttctgcgt ccagaagcta tcccagaaac cttcttcaat 25020
aggctgcggg cctgtttcag tctgtgtcac gaatgagcct aactcatcat tccactctag 25080
ctgcagacca cgcttagccg ccatgtcaat gatacgcgtg cgactagcga gcgcgccagc 25140
ctcagcctta gtagctgctt cttggttacc aaagaagcct gatacacggg tggtcatgga 25200
ggccatgtta ggtgccagca cctgcatact agctaacaag tcttctgcgt ccatctcgtc 25260
gccagacgtt agcttgtcat acgccgactg cttaggctta gaagcgaaca atgatgacac 25320
ccattgctcg atgtcaccag acgtaacagg cttcgtttct acgttagcaa cttgcggttt 25380
actaccttta ataaacccgt cgatctcagc gtcatcgtag ccggcttcac gcgcttgcgc 25440
aatctgctgc gattgagtag tcagctctag aatctgctca tcatcgtagc ctttgccttt 25500
taaatacccg gctacttctt tatcggaata acccttagct aaagcatcgg ccatcttaaa 25560
agaatcacca agtgagtcga atgaggcggt agcaccaggt tttagcacag cgttaccctc 25620
cacctcttca taccctgcgc cagttgcttt tgcgactgac cgcaactctt tagactgcgc 25680
ttcatcggct acagggacta ctaactgctg cctaccaccg gcctctaaat cgcccatagt 25740
tgcttgtacg gcttttgcaa tgtagcttgg agcatctacc atagcgtctt caggcaagtt 25800
catagtaaca ttgctaagca cacgactagg cacaccgttg aactctgtgt cttcagaacg 25860
catagtcatt gtagcatcgg tgttggcaaa gctaacagct ttgtctgcgg cagtagggtt 25920
agggccgtca gtgcgtgaaa tagtccagct cattaatact ctccttcagg aagctttaaa 25980
ctctcgcttt gcggttgacc tgcgaaacct tgttgtacgc ccatattagc ttgagccaag 26040
gctgcgttct gctgctggtt accttgtaac atttgagcag tctgttcaag cacttcagag 26100
atattaggtg cgtagcgcgt tttcatagtc ttaacactca gactagccat cttaaagaaa 26160
cctgcagggt ttgcctgcat aaccatctgg ccaatcgccc cagacatcac cgtctctaac 26220
agtaactggc ctttctcatc gtcatcatta taggcagacg agtcgatgcg tacctggaat 26280
tttgtaaagc taaagtccgt gccttcttca ttaacaggcc caaagataat gttgccagca 26340
tcgtcctcaa gaaactcccc attagctggg tcagtctctg gcagcaatat agcctgcgtc 26400
tctggttcgc ctgtcatagg gtcaatgcgg ccagtaaact cttgcatagg cttattaact 26460
tcaatccaac gctcgccaac gatctcatca gttagctgga taacttggtg tgctgagtag 26520
tattgctgag ctaacttagc aacatcgtaa gctaacaact catagaatga ctcaatacgc 26580
gctgtaatat agcgcagcga catgatagta gcgttctgct gcagcttaac cttgcggcca 26640
gagtctgacg cgaaggccat gccaaggaaa ctatcattga tgccgagcac tttttgaata 26700
cgtgcaagag cattatcgac aataagatac tgctgctgca cgtcaccggc catggtagag 26760
atcttaatac cattcaagtt aagaaccgga atgataccgg taaccctgtt gtaggctgtt 26820
tcaaagtccg ccatgttatc cacggctttc tcttcgacaa acgccttgtt agagttaacc 26880
atgagctgaa tctttagcac agcttggttg attgcatgct gggactggat aacctcgtga 26940
aagatgccgt agtactctgc tttatccgag ctttgcacgc gctctacacg ataaggccag 27000
cgcacttcct tatacgtgat ttcctctttc tcaagcatca cgtcttgaca ccaaaagcat 27060
gaccagcgct tgccgtcttc gtcttcgata acagagtgca caataagata gttatccatt 27120
accttgtact tgccgacgaa gcgctggcca tatagataat caaagtctgc ttctttgatg 27180
ttaaggtggt taaagtaggc gtcaagctct tgcattttag ctttgccaaa cagcttaatc 27240
actcgctctt tagacatcca cttaaagcgg tgcaaataca tagcatcact gtagtcatca 27300
gcgcggctca tggggtcaag tacaacctca gagtctggta cgtggctcat aacaatgcgg 27360
ttaataggcc ggccaaattc atctgtctcg tcagtaggta ctacatcgat aaagctaaca 27420
agcaagcctg acaccatggc gctaagctta atcttgtcac cctcgattgt atcgaagcgg 27480
ttatcttcaa acgtgtagtt aactacgtca ttaagcacag ccgctgcatc gatatcacgg 27540
tagtgcctag ggctaataac tgcagtatta acaactgtag agtagtagcc cactagcatg 27600
cgcgcaaaca tcttgataac gttgaacgtc tctgcaggct gacccctatt ctcaagcaca 27660
gctaactgtc ggtcagagaa gtgacgatta tggaacaagt tccatacttc gtctgcttcc 27720
ttgcgagact tctcaaatac ctcataacct acgcggaagg tgtcctgcag gtcttcaata 27780
atagctttca ttagttagct cctcggttaa agatttcatc cagtgaaggg cgagaccctg 27840
gagcttgaga aggtgctgtg ctagacggta cggggttaac cttaatgccg ctttcagtac 27900
gtgcaccacc actagctgtt ttgttaatga ggcggatgcg tgcatcgatg gcgttaattg 27960
tcttatccat atcctcaagt gaacggccat aacgtgcttt agctacgtac tggtcaccta 28020
agtctgctgc agcctgcata tcgtcgcgaa cagtttccag cgtgttctta agcgaagcta 28080
atacagggcc ggtcttctga cccaagttag caacaagctt attagtagca gcatagtctg 28140
agttagacac ctgagagccg aacaaggcgt ttcgcgtcaa tgcacgaact tgctccattg 28200
cgatagacgc ttctttgtgc tcaacgttgt cgctgatata ggccatggta gagttaagtg 28260
ttgagtcaag caggcctgtc tgctcatcag tcagcttgcc tgctttgcta ccggctgaaa 28320
ctaacttacg cacagcacga gcgttgcgct tctcctctgg acttagttct aacccgccaa 28380
cctgttcgat acggtttacg tatttgttaa gctcacgggt ctgcgtagga tcaagactag 28440
ctaagtttgc accaaggaag tcacctccga acgcgtcgtc tagcgctacc tgggcctcct 28500
cggcatactc agtgttctta atagcagacg tacgttcatc cttaccagcc ttgcggtacg 28560
cggacagcgc gtcttcacgt gtagcttccg gattccgctg catatagtcg gcgatgaaac 28620
ggccttcgtt ggttttacca ccactgcttc caccactaat aagacccata gcttgctcta 28680
gtgaggtacg atagtccatg tcagggtcgt ctttacgcag ctgtgaggct acacgttcta 28740
aggcagaacc tgcgcctcca ccagagcctc ctacagcctt aggtgcttca tgcagcattc 28800
tgtacgcctc atctcgagac ataccagtta gctcagcggc ctttgataca agcatatcgt 28860
cgcgcttaat ctgctgcatg ttaccaccgg cacgaatctg ctgaagcagc gcagagttct 28920
tcatgatgga cttcatctgc tcgtcagtgg catactgcgt ataacctgtc atagcgtaaa 28980
tcttgttcat atcaacaagc tgctgagagc catcgttgcc tgttgttaca actaaagaac 29040
tagctaattt ggggtcacta aagaagccgt cgatgtcttt cacaccactc tgttgcagca 29100
tgcgctcaac ttcaggtgtg cgagacacgc ggtcgaagcg cgatatgccg tccatcaggc 29160
ctgatgcaac agggttgcct ctagcgttct gaacccattg gttcaggtgc ttgggatcca 29220
tatcttgctg gtaacgctga aaggcatcaa acgactgctg cttagctaac tgcgcgtttg 29280
cagtatatgc agcctggcgc aactgggcca tttcggcatc ttggcgctgc tccacaagcg 29340
gcgcttcctg tttcatgcgc tgcagctgaa tctcactagc ttcggcacgg ctacgcgcct 29400
ctttaactcg tgcactgcgc atctcaatat ctgcagcacc ggccgcaata cctgcaccaa 29460
tatacgcgtt attcatttgc tgcctccaat actgtagttc ttgtcaagat aacttgacag 29520
ccctgagcca atagtgctaa cagccgagcc aaacgcctga ccagccgcca tactggcttg 29580
ctgagctcgc ccttgcgctg ccatagcaga ctgttggcca aaggacgaac gttgagctag 29640
ggcagagcta acagacggag cagggtccgc acgcatgcca agtgacaaga agtcctgttg 29700
ctcttgacgc gcttgtacag gtgcctgtcg acgaatttgt gcgcgctgag tggcagactg 29760
catagccata tcagagcgca gtgaagccga caagccacta tctgtaacgc ctcgctgagc 29820
taaggtttcg tcgagccgcg acatagcatt ggtacgttcc agctcaaagg cttctagacc 29880
catggcttca tagtactctg gagacagatt ctggtagtag ttaccaaggt tttcctggat 29940
agggccgtaa atagccttcc agtctgcgta acgttctttt tcaaattcaa gctgctcccg 30000
ctgcatctgc aacgaagctt cattagcttg ttctgcttgg ctagaagcct tatcagacga 30060
cttcttgctc attagcgacc cagcaacaga ggctgcgcct gcaatgattg caccccacat 30120
attagctcct tagggaacgg agtaacccgg cctagtagtc aagctgttat acgtggcagg 30180
aggattagca gtactagctc ctgccacaac tcacattatt tcttttctaa cgcagcttta 30240
agctcgttaa gctgttgcaa aaggctttgc aagaagcgcc gtagcgctac ttggtcagtc 30300
aaatcaacag gcacttgttg gttatgctcc gacgacatat tcaagctccg atacttcgcc 30360
agtaccttca acctcaaact gcaggttgaa ccctcgttgc agctcttgag gtacttgaat 30420
gtcgaatgag tcttcgccac taagtaccct ttcaaccaca atagtcccgt taattaatat 30480
tcttattata atatgacccg ctgaatatgt aaatattttt ttgtagactt tattcagtgt 30540
aaaggagcct tccgtcatca gcgcagactt gaagcgcatg acagcagggt cagtactcgc 30600
gaacaactcc cacagggtgc cattgttata accatatagc ttatcgttag caacagctaa 30660
tgagctaatg tcaaatctga agtgcttcac agtgccattg ttgatgcagt agataagccc 30720
ggagtcagtc ataacatagt attggccatc atatacagca gagtctaccg gccgaatatc 30780
gagcttacct aacagctctc gtgtgataac gtttatctgc gcgccggacg agacacagat 30840
accatcagaa gatacccaca gtgcttctgc accaacaaac tggatagatt cattactgat 30900
acagccttgg tcaccgctaa gcagatatgt agatagcacg ctaggcccgt tacctgttac 30960
gatgtgcgta cggtactctg tgaatacgag aataccgtta gctacgggtg cgatccctgt 31020
aatgtctgcg tcgtactgca gaaagaaggt ctcgggccac tcgttaggcc ggcctacggg 31080
cgtgaatcta agcttagagc cttctgccgc gaacagcatt gcgtaagcct cacgcatata 31140
ctttagaccc gctggcgccg acgcagcatt ctgcgtagtt agcagcgtac caggcagtga 31200
ggcgtcagat gtagcatccg tgtagtctaa cgtggcaatg ggtagctctt taactaatgt 31260
aaactcacca aggttgccgc ctacacggta cagccgcatc ttgtctactt gtcggtcttc 31320
tgactgcgga aagccataag catagattga gccaccgcct tttaagtcta gctcctctga 31380
caaagcagat ggagcagact cagcaccgtc attgctattc acgaaagttg ttacatactg 31440
gtacacacct tgtaacgctc caaacttagt aaagtccagc tcaaggttag tgccaatatc 31500
atacacagta tccgccacag tagcagtgcc attagtgata gtaccgacaa gcctaaactt 31560
gttgttgtac tgcctataca cctgcactcc acctgagcca atggttacac cttttacttg 31620
accaattgac acctgatact tagtcgtaga agtatcacta ttgatcttgg gttgaattat 31680
gggcttaggt gtagactccg ctatagtgtt gacagtgcct ttagtgtcta cagtcagctg 31740
caacgcgtta gagaaagcat cgccgtctac gttgacaata acgtaaacat gcagctcact 31800
aggcaagcca gaaccagctg cctctgtacg cttgacctcc acgtcagata caacgccagg 31860
attatcgaca gccctgaacg acgccttagt gctaggcgca gcaagcccta aattggtctg 31920
tgcccctctc atgttcagct tttgtggcag gcctatgccg tcgcaccagt acaaagtctt 31980
ctggaactca acgtaatagc gttgaatgtt agaactaacc cacttattac ccgcgacgta 32040
gaacgtgtgg taaggcagca cagcctgacc agagtcctta ggtagcatta caggtgcgag 32100
gctacctgcc tcttggttaa tattctcata tacaacgccc tggctcaagt caatgaactg 32160
cgggcgaggg cgggcatgca acccgccatt aaactgttga agtttcatat tacccctttg 32220
ttgtgcagta aaaacctact attacaccag ctgaactcgg cgcgttgcct tgcgctggta 32280
tgctaactat gcctatctgt ttagcggagg cgtcagtaac gtgacgaagc ctaaaatatg 32340
tgcctggagc tacttgtata ggaagagtaa agtctacaac cctgtactca ttagcctctt 32400
gggaagcaag tgagactcta cgagctgacc caggcacagc agtccaagta gtattatcgc 32460
tagacgcttc tatgaacata gcccaattag ctaagccact gcctccagtc ttgcgcacta 32520
cttgtgccga tacagtaagt aagcctacag cagtatctac aaagctaaac acaccagtag 32580
cagcgtcaac tagtatactt ggagacgaca tagctatagt gttatagctt attgtcatcg 32640
gcgggttgtc cgccactagc aactgggtag cttctgaacc gcccgcaaca aaactaacgc 32700
gtgcaccttt gccggtgaca agctcgctac taggcagtgt aacagttgcc tcctgtgtta 32760
acttaactgt taatagaggc ctgctactac tatcgctctg taagaaggca cagtcagggt 32820
tattaccttg aacggtcagt gcaagtttgt ctccggcttt agcatctatt ctaaacgtgc 32880
gtagcgcgct ctctctgccc aacatagact gccagggagc ggtaacacgt ccgtgcggga 32940
gtcctctatc ggcaccagag taccattagg ctgtacgttg ttccataaaa actgcgccga 33000
agccggtacg ccctgctcgt tgtacatgcg cacagtagaa gctactgtag taataccatc 33060
actacctagt ataatagcgc cctcaccacc tctcgcggta ctccctgcta ttgtgttaac 33120
agaggcgtct aagtcggtct ttagcttgcc agatacctgt acaccacaag gcataggctg 33180
gttaggcgtg tcgttgatcg tgtaacgcag cgctttatag ccttggttat cttgaaccag 33240
tgtagcagac agtggtgaca acattaagtg ctgctcagca gtaatgctag gcaaacctac 33300
ataccaacca gtgaaaggtg atggcacatc tacgcgcaga ctgtgcagct gtaagttatt 33360
tggcgactgc atctctatcg tagcgactac aatagcgtag ttattggagg tctgcggaac 33420
tgtaaatgtt aggtcaatag gcgtcatttg cccagttatc atttcaggaa tgaactggtc 33480
tgttataaca tgccagtctg ggtcaaactc tatattactg ttgctatagc cagttatgat 33540
gggcatagtc acatctggtg tgcctgtcca gtacatagcg tagacccgca cagcattcac 33600
agtactgcac acagagcctg tcacgtgcac aagcttgttc tgcagcagcc ttgtttcttc 33660
agagtcgaac gttactgttg gtgcgaatgc tacaatgtcg ccgctatcac tcaagttcaa 33720
tatgccgctg ctcacactag cgcgtgcgcc attacctagt atctgtgtac tgaagccgtc 33780
cggcaacacc acagtggacg tagcggcggt gtctggcata ttgtgttgta ggatgaagct 33840
agtgtcaaac ctgccgagac ctaagtagcg tttggacaag ctaagttgca cacctgtgtc 33900
tagctcaaac tgctggcgcg cgtccccagt agccgagtta gccgccagac cttgaataag 33960
caagccagta gggaatgcgg taggatccaa acaagcgacg ccgttctcaa aggtagtctc 34020
ggcgaaaaat tttacgtatt ctatggctgt gaagtcgcaa acagccgcag ctactagagg 34080
tgaactgggg tcatgtagaa cttcacctgc cttataggat cgctctaccc caactatatg 34140
accgttggtg tcgtataagt acccagcggg cctacctaat tggtctaacc tagctgcata 34200
gatgcggatt ctaccgtctg tctcagcttc acctctaaat cctgcgaata tacatactaa 34260
tgcgtcatct ccgcctgtta cattagggtc taggccgtcc cattcctgga aaccgtaggc 34320
ttttaggtta ggggctgcga gtataaactc atcgtcagat acctgctttt ggtctgggaa 34380
gaacgcgcct gtatggtcga atgtgtcgct aggctttcct acaagataag tgccaggcgc 34440
tgcgtaaact aacaagccag gagctttctt ttgttcatac gcgtcgtgct tcacgtctaa 34500
agtgagctta gcgcctgcct tgtgcagctg caacggaggt aggacggtta catcaccagt 34560
gagaggcgta gtgctgtctg cgttgtacca ggcaacgcta ggcgttatac ttaatacgcc 34620
tgcaccaaga tctttaacct cgcagtttac aaagtccagc gtagcgatac cagtatacac 34680
atcgctgcct gcactaacag ctatcgtaga actctttaca ccaaccttaa gtgagccaga 34740
cggatcttgc gtcacatcaa acacgctgct atcaaaagcc caagagtcta ccttcagccc 34800
gttaacgctg tgtcgtttgt cagggtagat agtaaggata ttgccgttat ccctaggtga 34860
cactactgcg ccagggaact ctaaagtagg agctttgtag aaggcagaac ccagcacttg 34920
ccctgtgcta acacctacag acggttcaac gtttaacgta acactttggc cttgctgatc 34980
ctctagcctg ccgcctttaa tatgcaagtc tgtgatatca tcaaaggcat tattgtgctc 35040
gtcttctacg tgaatacctg cgatcttctg ggttaagctg ctctccacag cctgcacagc 35100
cgtagataga ctgtctaaac gcttagctaa ggtctgcaga tcttctgttt gcagcttagt 35160
ccagcctgac gcttctttat accagaaggc tttcgagata atggcaaggc tattaacagg 35220
tgctgtaggc tcagcaactt ctaggtcttg cacggtgtca tacacaccca aatacgtagg 35280
gtggaaagcc cctacaggcg cgagctctac ccacgcgccg cctacgctat gaaagtactt 35340
ctcgcttggc gttagcacaa tcgcctgtag atttccagta ggccgcttta tgccgtcttg 35400
caactctgct agatcattat atatacctac gaagtgcagg ccaagtgtag gagcgtacgg 35460
agtgacgcca gtctgcacag gcacgtacgc agagccattg tagcgaaaga actctgcgcc 35520
gtcttgtgcg actttaagta caaaaggaaa ccgcgaaccg tctagcccag ttagctccgc 35580
gtctgaccta atgaggtaca acagctttat gcgtgtgact tcaatgggtt ggccgttacg 35640
aacttgctgc gccttgcctt cgccgaacag caagtcttcc ataccgccga gttctttatg 35700
cactaaatta gtcatcaaaa gcacccctgt agctggatcg gttgtacttc gtagtagctg 35760
acgcatcata ctcgcgcgtc tgctcgccaa tattagtcag ctctctagcg tacatagaaa 35820
gagccctatc actcttctgt tgatactgcg tgtctaagtc gtcgctaaaa gcatgcccaa 35880
taacgtagta gactagtgcc ttgtcaaata ccctaggcac tccaagctcg ccatctaagc 35940
taaggacgtc atccgggtct tttatatatt ggattgtaac agcgccagta acatctgcca 36000
cgtctgtagc tacaccaaac agcgaatcaa acgtcgcaat agtgtcagac tctacgatat 36060
ctgagagcac gccaaataca ggttcaggta caagcccatc aaactctgtg acaaccccga 36120
agtaaggcgc agtattacgc actgctagcg tgttacgcat taggtctgca gtcacgccat 36180
atacagagtt gaaagaggct agttcgtcta gactagccag cacaccgtta actttatcaa 36240
taggcgcatc ggcgtatacg ccgtaagccg tatccatagt gcctacaagc acgccttctc 36300
cctcgaatac gtagacatct ttgtctatat catcgtcagg ggtaggccat acgcgaatgg 36360
tgtctacatt gcgcaagtcg tagaccaagt tttctactcg gttgcctgtg cgagcaaacc 36420
acgcagcatc tgcgctatcc atagcatcgt acgacagcag agggatacgc accaagttaa 36480
acgcagctcg ggtaataagc cataggtctt ccggcagttt atacatagct tggccagggc 36540
ttaaggctag cgaggtctct gctttaagca gtttaagctc tctagctaag tctttctggc 36600
cttgactaag caaacgaaga agccgctcat cggtccaacg ttcgccttta gggtcagcta 36660
gtgaatatct agcatcagcg ataatttgac gtacacgact cattagtttg ctccgtaaat 36720
gaagaaaggc ccttctacag tgaagggcct gtgtttctta gaactgggtg tattcgccag 36780
tggatttctc tacttcgtcg taagtaatta cgacagcata gtcaccccac ttgccagcgc 36840
caggaccagt cgcaccaact ttgatgaaca ccggcaggcc tgtgccggtg aacactttgc 36900
ctaccagcga gcctacgaac ccgcccgcag cagttgcttt gacgtcagca gcagcgataa 36960
gctgtgctcc gccttcagcc gtgcctacgt ctacggtcaa cgtagcagtg gtcggctgtt 37020
tgcgcaccag cacataagcg tcagtaacaa cgcagtttgc cggcagattg gccatcaagt 37080
agttaccagc cgcgatagca ccgcctgcct cgactaccag cgcctcatta agcggcataa 37140
ctagtacgct agccgccttc ttttgcgcaa tagtgcctgc gcgggtcatg cttgtaaaag 37200
ccatcagcta tctccttatg cagagacctt gacgtccagc gctacaacgc cgaagtccag 37260
gttagcgatt tttgcttgtt tgtaatcagc gttctctgcc ttaagagcag tcttacgcat 37320
ctcacaccaa acctccaggc aagactcgga cttaatgccg aagtcttcag actcctgcac 37380
tttatagtcc ggctgcatgc caaatgccat ctgcagaccg ccggcgccaa gaatcaggca 37440
gcgtgagtac agagagttag agccatagga gaaaccttct tggccagtcc atgcaccatt 37500
ggttttatcc cactgacgca gaccagagat ctctacagag ctatcgttga gaccgaagcc 37560
agtagctgca gtaccagcag tgtcaccaaa gaactggtta gctacgataa cgagcagcgc 37620
acctacgcgt ttgatctcac cggtcagcac gcggttacca ttgcctcgcg ggtcggcaga 37680
agtaatgata gagttccaac gttggtcttt acgcagctta gctgcaacag acgcgtcgat 37740
tactaccagc cacaccgggt cttgctcgtt caggttccac ggaacaagcg ggcgacgaat 37800
accgccagtg gtatagcctt gcgaggtacg cagtgtagtc tcgatatcga tcagcgtgtc 37860
gaaagtgaag gtatcagcgc taatgatatg cgatgggccc tgtttaccgt cgttgagcgt 37920
gaccaggtta ccctgcgcag catcaaacaa gccttggtct ttccaacgaa caaacaggtc 37980
agctagttta gcgcggctat ctgcatgctc tgccagtgac aaatcgccaa tgtcaacggc 38040
gtcgaactta tcaccgttgt ctacaaccaa acggtagcgc tctaccataa ttttgtcgga 38100
gaacttacgc ttttgttcac ctttaccgaa agcagtatct ttgcctttta cggccttgcc 38160
tgacaggttg ccgtcaaagt caaacacaac agtgtgtcca gcttttgcag tttcgttgtt 38220
tacctggtaa acaacgccct tggtgttcat ggcggtcata ccgttccaga acgacttact 38280
tgctgcctgt accagccctt cacgcaccca ttgcttacgc ttaaggtctg agccagggcg 38340
cactacgcct gtagccataa tagcttcctc gttgatttaa gttatgtgta atatgcggca 38400
gggattccag ggctggagtc tgacgttaag gcatgtgggt attcgagatg aagccacaaa 38460
gcctgcatat tattaattat ggcgcaaaat tcgcgccatg taaatttaat aaatctgtta 38520
aaaaatctcg tctttatact gacgagctgc tgcatggctt acctttgtag gatcagggaa 38580
gtcactaccg cctgtggccg agaggttttt gactcccgct ggcacgtcta ctacaggctt 38640
aaccactttg cccttagtca ggaagctctt gcactcctcg agaaactgcc caaagctaat 38700
ctcaccgttt tccaacttgc gtgtaatgcg cggcgggata tcgttctgca caacgtcgtt 38760
atcgatttgc acagtaggat tagcttcaga gaactcttgc agtgcacgtt ggcggtactc 38820
cagttctgtc tcgcctttag ctttagtagc aatttcttgc cgcttgctgc caaactcccc 38880
acgccgctga acttctaact cgttcagcct gttacgccag gcatcagggt ctgtagcttt 38940
cagctcttca agttccgcct gcgtatcgat tggcaactca cgtgcaaact ggtcttccca 39000
acctttagct agcaggtcgt tctcagtctg cagtcgctta gcctcttgct gcgctcgcgt 39060
gtatgcacct tgagtgtcgc gccggcgctt ttccagcgtt gccgcgtata ctacttcttc 39120
tggcaggcct tccggcagta ccaaattgcc tttatcatcc gtagtagcag aagcaactgc 39180
ttcatttacg cggtctgcaa aggatggctg agcggcattg tcaggattat ccatcttagg 39240
ttcctcttat gttaaacata aatttattat atgtcgaata tgtacaattg taaacatacg 39300
acgtataata tttttaataa gactaaagga gcttaaaatg gcagtctata cattctcagc 39360
taaagagaaa aaaccagaag atgtggagac cgtagaggct gtcaaggcct actgcgaacg 39420
ctttaactta aactttagcg gcgttgtagt agaattgctc aaaaagtata aagcagaggt 39480
ggttgatgag cgtacgcgat gaggtgtatt ataaagtgct aagtcgtatt gacaacggcg 39540
aagagccaaa gatgctcgcc gcggagtttg agcttagcga aagtacagtg ctgcgctgga 39600
agcgcgagtt tgaagctgct aagctaaacg ggacgcttag caaggtgtat aatatcgaca 39660
gtcttgtgct agctaaggta ggagaagagc tgtcggcgcc gaaggccgta gtagagaatg 39720
gcatagtaaa tgtcactaaa ggcttagaag gcttagctaa gcttgacgta gacttgcaac 39780
gttctgctgc gttgcttatc cagcgcgtaa atagcctaat tatcagcgca gagcgcagcg 39840
agcttgagac ttatgtgtcg tgcgtgtgca agctgcgcga cgctttcttt aatagcaagt 39900
caacgcaggt caacgtacag aacaactaca gctctggcca gccgccttac tcggattttc 39960
tcggagacaa gcctaatggt tgagtatgga ttaacgatta atgagcagga attcaacgaa 40020
atctaccctg atctagtggg gcattacgca ttctttaacg agccgcctcc gtcctacata 40080
tctacgcaag acttcgagcg ccaatactta gctaataagt tatggcggct caaccatatc 40140
tacaccattg ttaataagtc tggcgctgct gtgcagttca aaatgaacaa gtcacagcac 40200
cgtgtatacg gggccagccg caagcacaaa cgtgttatta tcctaaagtc ccggcagcaa 40260
ggcatatcaa ctttctggct tgttagctac tttgacgatg gagtattctg caagctgctc 40320
aacataggca tgatggcaca aggtgttgat gaagccgcgt cgcttcttga gcgctcaaag 40380
tttatctggg accacctatc gccagacatt aagcgctttg ctaatatagg cttagacaaa 40440
gacaacctga aggagttctc ctttaccaac ggctctaaga tattcatccg cgtgtcattc 40500
cgctctacta ctctacagcg tttgcatatc tcagagatgg gcaaaatagc taatcagaca 40560
ccacagcgag ctaaagaagt aaaaaccggt acgctgcagg cgctttatga aggcaatacg 40620
ggcgtcatag aaagcaccgc tgaaggcatg aacatgttta aagagatgtg ggaccaggca 40680
gaactggctc tacactctgg cgccatgacc tggaaggact tctaccctgt attcttgtcg 40740
tggttagagg acccggactg cgccatggat gtagaccagg agtcggacag tgaggctata 40800
aagtactttg ctgagttaga agacaaagtg acaaagttcc gccgcgcgat ggaggttaca 40860
gcacccgcgt ttaagctaac caggcagcag aaaaactttt ggctcgcgca gcgtcgtgag 40920
cttggtggcg acatcttcca ggagtacccg gcgacgcctg aagaggcctt taccgcaagc 40980
cgcgatggca catactgggg caggcagttc agagagacgg tggtacgtaa taagcgagcg 41040
gctgtagcta acttgcacga cccaaacctt cctacagacg tgttcatcga tataggcgtt 41100
gaagactatg gcgtgcttgt gttcaggcaa tggtaccgcg gagagtaccg tatcatagat 41160
gagtacttta accagaacta cgacatggcg cactacatgg atgaagccat gagtagaggg 41220
tacaatatca caactatagt gttccctcac gatattaaag tacgtgagta cagcggcggt 41280
aacagtggcg caggtggcga agcccgcaca cgtttagaca ttgcggagga gaaggtccgc 41340
ctagaaggct gggatgtgcg tatcgacata gcgcctaagc taagtattgc cgatggcatt 41400
gaagctgtgc gccgcattat acctaagcta ataattgacg cccgttgcaa gtacctaact 41460
aagtgtttcc aacgttacac taaggagtgg gatgagaaac tgcaagcgtg gaagaagacc 41520
gaggtccata atgagtggtc acatggcgcg gcggcgctac gctatatggc tacgtataca 41580
tcggagagag gcctagtagc gccgcgcaaa atgcgggtga agagagggga atactgcgta 41640
taaataagcc gtatagcgca ctcgtgtagt gcgctaataa atttattaat acactagtta 41700
ggtaagttaa taaatttatt acagtcactt ttggataaaa tttcacaacc tcccaagctg 41760
caaaaagaca gggtggcggt ccggt 41785
Claims (11)
- 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)에 대하여 특이적인 사멸능을 가지는 기탁번호 KCTC18896P인 박테리오파지 ETP-1.
- 청구항 1의 박테리오파지 ETP-1을 유효성분으로 포함하는 어류용 항생 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 에드워드시엘라 타르다에 대한 항균 효과를 나타내는 것인, 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 사료, 사료 첨가제, 항생용 약제, 박테리아 감염성 질병 예방 또는 치료용 약제, 또는 면역 증진용 약제인 것인, 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 에드워드시엘라 타르다 감염성 질병 예방 또는 치료용 약제인 것인, 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 박테리오파지 ETP-1은 플랑크톤 (plankton)에 섭취된 형태로 제공되는 것인, 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 플랑크톤은 단세포 편모충류, 섬모충류, 방산충류, 유공충류, 해파리, 화살벌레, 요각류, 갑각류, 곤쟁이류, 옆새우류, 난바다곤쟁이류, 크릴새우류, 및 크릴류의 동물성 플랑크톤으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 플랑크톤은 알테미아 (artemia), 로티퍼 (rotifer), 및 물벼룩 (daphnia pulex)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
- 어류에 청구항 1의 박테리오파지 ETP-1을 급이하는 단계를 포함하는 어류의 박테리아 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 급이하는 단계는 상기 박테리오파지 ETP-1을 섭취한 플랑크톤을 어류에 급이하는 것인, 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 박테리아 감염성 질병은 에드워드시엘라 타르다 감염성 질병인 것인, 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210085770A KR20230004016A (ko) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 어류의 감염성 박테리아에 대하여 사멸능을 가지는 박테리오파지와 이를 섭취한 플랑크톤 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210085770A KR20230004016A (ko) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 어류의 감염성 박테리아에 대하여 사멸능을 가지는 박테리오파지와 이를 섭취한 플랑크톤 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230004016A true KR20230004016A (ko) | 2023-01-06 |
Family
ID=84924024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210085770A KR20230004016A (ko) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 어류의 감염성 박테리아에 대하여 사멸능을 가지는 박테리오파지와 이를 섭취한 플랑크톤 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230004016A (ko) |
-
2021
- 2021-06-30 KR KR1020210085770A patent/KR20230004016A/ko not_active Application Discontinuation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11785948B2 (en) | Bacteriophage and composition comprising same | |
| US9950018B2 (en) | Bacteriophage and composition comprising same | |
| US9956256B2 (en) | Bacteriophage and composition comprising same | |
| KR101536901B1 (ko) | 바실러스 서브틸러스 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 어류용 프로바이오틱스 조성물 | |
| US10822590B2 (en) | Bacteriophage and composition comprising same | |
| KR101381796B1 (ko) | 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
| KR101381793B1 (ko) | 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
| Nurhafizah et al. | Virulence properties and pathogenicity of multidrug-resistant Vibrio harveyi associated with luminescent vibriosis in Pacific white shrimp, Penaeus vannamei | |
| NO342578B1 (en) | Probiotic bacteria for fish | |
| Xu et al. | Enhanced mortality in Nile tilapia Oreochromis niloticus following coinfections with ichthyophthiriasis and streptococcosis | |
| Gui et al. | Disease prevention and control | |
| Yan et al. | Pathogenicity of fish pathogen Pseudomonas plecoglossicida and preparation of its inactivated vaccine | |
| Farto et al. | Bacteria-affecting cephalopods | |
| US10925909B2 (en) | Bacteriophage and composition comprising same | |
| El-Sharaby et al. | Molecular studies on Aeromonas species isolated from freshwater fishes collected from Delta region, Egypt | |
| JP2007084492A (ja) | バクテリオファージを含む、細菌性感染症治療用の薬剤 | |
| KR20230004016A (ko) | 어류의 감염성 박테리아에 대하여 사멸능을 가지는 박테리오파지와 이를 섭취한 플랑크톤 및 이의 용도 | |
| Du et al. | A case of Aeromonas veronii infection in golden Taiwanese loach (Paramisgurnus dabryanus) at low water temperature | |
| KR20170001379A (ko) | 조피볼락의 비정형 에어로모나스 살모니시다의 불활화 백신 조성물 | |
| GALAL SAAD EL-DEEN | SUSCEPTIBILITY RATE OF NILE TILAPIA,(OREOCHROMIS NILOTICUS) AND RED SWAMP CRAYFISH,(Procambarus clarkii) to PROTEUS VULGARIS INFECTION | |
| Hadfield | Bacterial diseases | |
| ISLAM | Impact of quorum sensing on the virulence of Vibrio crassostreae and Vibrio tasmaniensis in vitro and in vivo in blue mussel larvae | |
| Nielsen | Identification and assessment of potential probiotics for the use in rotifers (Brachionus plicatilis) and Artemia used as feed for marine fish larvae | |
| Dong | Disease Resistance of Different Genetic Types of Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Female× Blue Catfish, I. furcatus, Male Hybrid Catfish | |
| Sumon et al. | Growth performance, digestive enzyme activity and |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal |