CN107523523A - 一株耳炎假单胞菌及其降解羽毛产寡肽的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域。目的是提供一株发酵产物中寡肽产率高的耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)H11，以及该菌株在降解羽毛生产羽毛寡肽粉的应用。耳炎假单胞菌H11的保藏编号为：CGMCC No.14262。本发明采用的技术方案是：对耳炎假单胞菌H11进行活化培养，得到一级种子液，然后将一级种子液接种在牛肉膏蛋白胨培养基中培养得到二级种子液；将二级种子液接种在发酵培养基中培养，得到的发酵产物可用于制备羽毛寡肽粉或寡肽溶液。本发明能够将完整羽毛几乎完全降解，降解产物中羽毛寡肽产率高，可用于生产易消化、高附加值的羽毛寡肽粉。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耳炎假单胞菌及其降解 羽毛产寡肽的应用。
背景技术
近年来，随着我国禽畜养殖规模不断扩大，产生了大量的畜禽废弃 物，如羽毛、毛发、角、蹄等，其中废弃羽毛年产量达数十万吨，造成 严重的环境负担。分析结果表明，羽毛等的主要成分是角蛋白，其粗蛋 白含量可达到80％以上，且含有多种氨基酸，还含有较多常量元素、微 量元素以及一些未知生长因子，是一种潜在价值很高的饲料蛋白源。然 而，由于羽毛角蛋白分子间存在大量的二硫键、氢键和疏水基相互作用， 分子结构紧密而复杂，使其难以被动物来源的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋 白酶降解。
国内外对羽毛降解产蛋白饲料做了大量的研究，目前主要有物理 法、化学法、酶法和微生物发酵法，与前三种方法相比，微生物发酵法 不仅工艺简单，避免了大量动力和能量的消耗，而且菌体本身就是蛋白 源、营养成分更加平衡，适口性也更好，因此受到国内外研究人员的高 度重视，具有广泛的用途和广阔的开发应用前景。但实际上，由于发酵 产品中大分子蛋白含量高，消化率低，在动物饲料中可添加量不足10％， 造成大量的资源浪费。
羽毛角蛋白降解产物除了可溶性蛋白，还有小分子肽类、氨基酸等。 肽是氨基酸脱水聚合的产物，通常把由10～100个氨基酸分子脱水缩合 而成的化合物叫多肽，把由2～10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子 肽)。根据现代消化理论，寡肽可不经消化直接被动物体吸收，具有吸 收速度快，耗能低，不易饱和等特点，而且不与氨基酸的吸收相竞争， 能够大大提高蛋白的吸收利用率。此外，很多研究已经证实，给动物饲 喂低水平蛋白质并补充合成氨基酸日粮并不能获得最佳的生产性能和 饲料效率，而要达到这两个目的，日粮必须要有一定数量的原蛋白质和 寡肽。
现有技术中，对羽毛角蛋白降解的研究大都集中在提高其降解效 率、提高角蛋白酶含量和活性的研究上，例如，申请号为2011102816561 的专利提供一种单胞菌，该菌在优选的发酵条件下培养24h，角蛋白酶 活力可达150U/mL，优于国内外报道的大多数菌株。而对于羽毛角蛋白 降解发酵产物中的寡肽的产率，尤其是在生产动物饲料中的应用方面，尚未得到较多关注，这就导致了高效降解发酵得到的大量再生资源，难 以被充分利用和快速消耗，造成再生资源的积压，不利于实现畜禽废弃 物再生利用的工业生产。
发明内容
本发明的首要目的是提供一株降解羽毛高产寡肽的耳炎假单胞 菌(Pseudomonasotitidis)H11，于2017年6月22日保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为： CGMCC No.14262，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明提供的耳炎假单胞菌H11从养鸡场长期堆放羽毛废弃物的土 壤中筛选得到，其形态特征为：细胞形态为杆状，长1.09～1.93μm， 宽0.365～0.415μm，无鞭毛，无芽孢，革兰氏染色为阴性；其菌落特 征为：在牛肉膏蛋白胨平板上培养48h后，菌落呈红褐色，形状不规则， 表面湿润光滑，有光泽、不透明；其生长pH值范围为5.0～12.0，最适 生长pH值为6，生长温度范围为7～45℃，最适生长温度为28℃，在牛 肉膏蛋白胨培养基中生长迅速，10h后进入稳定期，稳定期长达48h。
本发明的另一个目的是提供耳炎假单胞菌H11在降解羽毛生产羽毛 寡肽粉和寡肽溶液的应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：包括以下步骤：
1)、制备二级种子液：挑取斜面保存的耳炎假单胞菌H11一环，接 种到牛肉膏蛋白胨试管培养基中28℃活化12h得到一级种子液，再将一 级种子液按照2％接种量接种至30ml牛肉膏蛋白胨培养基中28℃培养 12h，即得二级种子液。
所述牛肉膏蛋白胨培养基包括：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯 化钠5g/L，pH值为6.0，在121℃灭菌20min。
2)、发酵降解羽毛：将耳炎假单胞菌H11的二级种子液按2％的接种 量接入发酵培养基中，在温度20～45℃、pH值为6～11条件下发酵24h， 收集发酵产物。
优选的：对所述的发酵产物进行干燥、粉碎制备得到羽毛寡肽粉。
优选的：对发酵产物进行固液分离，超滤后得到寡肽溶液，进一步 将寡肽溶液烘干、研磨得到寡肽粉。
优选的：所述的发酵培养基包括：羽毛10g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.7g、 KH2PO40.35g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。所述的耳炎假单胞菌 H11降解羽毛产寡肽的发酵可以为液体发酵，也可以为固态发酵。
优选的：所述的发酵温度为40℃。
优选的：所述的发酵条件pH值为11。
本发明具有以下有益效果：能够将完整羽毛几乎完全降解，降解产 物中羽毛寡肽含量高，可用于生产易消化、高附加值的羽毛寡肽粉。具 体来说，本发明提供的耳炎假单胞菌H11对羽毛角蛋白废弃物有很强的 降解能力，能够将其降解为动物易吸收的寡肽，其降解产物用于生产动 物饲料时可以大大提高蛋白的吸收利用率，有利于获得最佳的生产性能 和饲料效率。这样解决了羽毛角蛋白降解产物中大分子蛋白含量高、消 化率低的问题，显著提高了降解产物在动物饲料中的可添加量，实现了 资源的充分循环利用。本发明提供的菌株在降解羽毛角蛋白生产羽毛寡 肽粉和寡肽溶液方面具有广阔的开发应用前景。
附图说明
图1为耳炎假单胞菌H11在培养基上的菌落照片
图2为耳炎假单胞菌H11的扫描电镜图；
图3为耳炎假单胞菌H11的革兰氏染色图；
图4为耳炎假单胞菌H11在牛肉膏蛋白胨培养基中的生长曲线图；
图5为耳炎假单胞菌H11产寡肽的发酵温度优化柱形图；
图6为耳炎假单胞菌H11产寡肽的发酵pH优化柱形图；
图7为耳炎假单胞菌H11产寡肽的发酵时间优化柱形图；
图8为发酵培养基发酵前后的对比照片。
图9为羽毛寡肽粉、寡肽溶液及寡肽粉的制备过程。
具体实施方式
下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明 的技术方案和效果。
实施例1：菌株的筛选
1、富集和驯化：取长期堆积羽毛的土壤、发酵池沼渣和下水沟淤 泥的混合样品，与水按照1:5的质量比混合均匀。从中取10ml分装到 盛有80ml一号富集培养基的250ml三角瓶中，在37℃、pH值为7、 150r/min的条件下摇床培养至羽毛基本腐烂；然后取瓶中富集液按5％ 的接种量接种至二号富集培养基中，在与上述相同的条件下培养至羽毛 基本腐烂，传代两次。
所述的一号富集培养基的成分为：NH4Cl 0.5g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.7g、KH2PO40.35g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母膏0.1g、葡萄糖1g，pH 值7.0，加入羽毛5g，115℃灭菌30min。
所述的二号富集培养基的成分为：NaCl 0.5g、K2HPO4 0.7g、KH2PO4 0.35g、MgSO4·7H2O 0.2g、pH值7.0，加入羽毛5g，121℃灭菌20min。
2、初筛和复筛：取步骤1中得到的富集液1ml，10倍梯度稀释后 涂布于初筛培养基上，重复三次以上至纯化；挑取有透明圈的菌落接种 至牛肉膏蛋白胨培养基上过夜培养，然后将其按20％的接种量接种于含 有5ml复筛培养基的试管中进行复筛，记录各菌株降解羽毛的快慢，筛 选出的菌株保存于4℃的冰箱中。
所述的初筛培养基的成分为：NH4Cl 0.5g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.7g、 KH2PO40.35g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母膏0.1g、酪蛋白7g，pH值7.0， 121℃灭菌20min。
所述的复筛培养基的成分为：NaCl 0.5g、K2HPO4 0.7g、KH2PO4 0.35g、 MgSO4·7H2O 0.2g、pH值7.0，羽毛6g，121℃灭菌30min。
所述牛肉膏蛋白胨的成分为：蛋白胨10g、牛肉膏5g，氯化钠5g， pH值7.0，121℃灭菌20min。
3、二次复筛：将步骤2中保存的菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中活 化24h，然后按2％的接种量接入装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶 中，在37℃、pH值为7、150r/min的条件下培养48h，根据各菌株对羽 毛的降解情况、多肽和寡肽产率的高低进行二次复筛。
所述的发酵培养基的成分为：羽毛10g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.7g、 KH2PO4 0.35g，蒸馏水1000mL、pH值7，121℃灭菌20min。
实施例2：菌株鉴定
1、菌落及菌体的形态观察：将纯化分离的耳炎假单胞菌H11在牛 肉膏蛋白胨平板培养基上进行划线培养，在37℃恒温培养48h，肉眼观 察菌落呈红褐色，形状不规则，表面湿润光滑，有光泽、不透明，如图 1所示。扫描电子显微镜下观察，如图2所示，菌体呈杆状，长1.09～ 1.93μm，宽0.365～0.415μm，无鞭毛，革兰氏鉴定为阴性(如图3所 示)。
2、培养特征观察：将耳炎假单胞菌H11按相同的接种量分别接种 于牛肉膏蛋白胨培养基中，置于不同温度下摇床培养18h，在7～45℃ 环境中的菌株能够生长，其中最适生长温度值为28℃；置于不同初始 pH值环境下摇床培养18h，在pH值范围为5～12的环境中菌株能够生 长，其中最适生长pH值为6.0。采用全自动生长曲线分析仪绘制该菌株 的生长曲线，绘制结果如图4所示：该菌株几乎无延滞期，在培养10h 后进入稳定期，稳定期达48h。
3、分子生物学鉴定：采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯 菌株的全基因组，通过选用细菌16SrDNA通用引物27F和1492R进行PCR， 然后测序分析。测序结果经BLAST比对，鉴定该菌株为本发明的保藏菌 株耳炎假单胞菌CGMCC NO.14262，本发明菌株的遗传序列如序列表所示。
实施例3：产寡肽发酵条件优化
1)、制备二级种子液：挑取斜面保存的耳炎假单胞菌H11一环，接 种到牛肉膏蛋白胨试管培养基中28℃活化12h得到一级种子液，再将一 级种子液按照2％接种量接种至30ml牛肉膏蛋白胨培养基中28℃培养 12h，即得二级种子液。
所述牛肉膏蛋白胨培养基包括：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯 化钠5g/L，pH值为6.0，在121℃灭菌20min。
2)、发酵降解羽毛：将耳炎假单胞菌H11的二级种子液按2％的接种 量接入发酵培养基中，采用单因素实验考察不同发酵pH、发酵温度和发 酵周期对羽毛降解率以及寡肽产率的影响，摇瓶初始发酵条件为：2％接 种量，pH值为7，在37℃、180r/min条件下摇床培养48h。
发酵温度优选实验：其它发酵条件为初始发酵条件，分别于20℃、 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下摇床培养48h后测定寡肽产率。 测定结果如图5所示，发酵温度为40℃时，寡肽产率最高，为51.71％， 故选择发酵温度为40℃。
发酵pH值的优选实验：其它发酵条件为初始发酵条件，调整初始 pH值分别为6、7、8、9、10、11，摇床培养48h后测定产率含量。测 定结果如图6所示，初始pH值为11时，寡肽产率最高，为57.98％，故 选择初始pH值为11。
发酵周期的优选实验：其它发酵条件为初始发酵条件，每隔24h取 样测定寡肽产率，确定菌株发酵的最优周期。测定结果如图7所示，发 酵24h，寡肽产率最高，达55.84％，故选择发酵周期为24h。
实施例4：降解羽毛产寡肽
1)、制备二级种子液：挑取斜面保存的耳炎假单胞菌H11一环，接 种到牛肉膏蛋白胨试管培养基中28℃活化12h得到一级种子液，再将一 级种子液按照2％接种量接种至30ml牛肉膏蛋白胨培养基中28℃培养 12h，即得二级种子液。
2)、发酵降解羽毛：将耳炎假单胞菌H11的二级种子液按2％的接种 量接入发酵培养基中，在温度40℃、pH值为11的条件下发酵24h，观 察发酵过程中羽毛降解现象。随着发酵时间增加，羽小枝脱落，培养基 逐渐浑浊，待发酵结束时，完整羽毛几乎被完全降解，如图8所示，发 酵液呈淡黄色。收集发酵产物，测得羽毛的降解率达90.56％，总肽产率 达82.12％，寡肽产率达66.21％。
实施例5：不同处理对羽毛降解产寡肽的影响
设置3组对照实验，实验条件分别设置为：1)自然PH，培养基不 灭菌，不接种；2)PH调整为11，121℃灭菌20min；不接种；3)PH调 整为11，121℃灭菌20min，按照2％接种量接种耳炎假单胞菌H11；其 他条件同实施例3，研究不同处理对羽毛降解产寡肽的影响，结果如下 表所示：
表1不同处理下的羽毛降解产寡肽率
实施例6：羽毛寡肽粉制备
在实施例4的基础上，将收集的发酵产物进行烘干、研磨处理得 到羽毛寡肽粉。
实施例7：寡肽溶液制备
在实施例4的基础上，对发酵产物进行固液分离，超滤后得到寡 肽溶液，进一步将寡肽溶液烘干、研磨得到寡肽粉。
由表1可见，本发明提供的菌株和发酵方法大大提高了降解产物中 寡肽的含量，使羽毛等畜禽废弃物快速降解，并产生能够在动物饲料中 大量添加的羽毛寡肽粉，进而利用该羽毛寡肽粉生产最佳生产性能和饲 料效率的日粮。这样就显著提高了畜禽废弃物再生资源的利用率，避免 了高效生产出的再生资源的积压，为羽毛寡肽粉的工业生产奠定了基 础。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。 显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通 技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认 为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一株耳炎假单胞菌及其降解羽毛产寡肽的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> 耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)
<400> 1
tgaaacgatc tcgtggtacc gtcctccttg cggttagact agctacttct ggagcaaccc 60
actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtgacattc 120
tgattcacga ttactagcga ttccgacttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgga 180
ctacgatcgg ttttatggga ttagctccac ctcgcggctt ggcaaccctt tgtaccgacc 240
attgtagcac gtgtgtagcc ctggccgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc 300
ttcctccggt ttgtcaccgg cagtctcctt agagtgccca cccgaggtgc tggtaactaa 360
ggacaagggt tgcgctcgtt acgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 420
agccatgcag cacctgtgtc agagttcccg aaggcaccaa tccatctctg gaaagttctc 480
tgcatgtcaa ggccaggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc 540
gcttgtgcgg gcccccgtca attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc 600
ggtcgactta tcgcgttagc tgcgccacta agatctcaag gatcccaacg gctagtcgac 660
atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac 720
ctcagtgtca gtatcagtcc aggtggtcgc cttcgccact ggtgttcctt cctatatcta 780
cgcatttcac cgctacacag gaaattccac caccctctac cgtactctag ctcagtagtt 840
ttggatgcaa ttcccaggtt gagcccgggg ctttcacatc caacttgctg aaccacctac 900
gcgcgcttta cgcccagtaa ttccgattaa cgcttgcacc cttcgtatta ccgcggctgc 960
tggcacgaag ttagccggtg cttattctgt tggtaacgtc aaaacagcaa ggtattaact 1020
tactgccctt cctcccaact taaagtgctt tacaatccga agaccttctt cacacacgcg 1080
gcatggctgg atcaggcttt cgcccattgt ccaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg 1140
agtctggacc gtgtctcagt tccagtgtga ctgatcatcc tctcagacca gttacggatc 1200
gtagccttgg tgggccatta ccccaccaac tagctaatcc gacctaggct catctgatag 1260
cgtgaggtcc gaagatcccc cactttctcc cgtaggacgt atgcggtatt agcgttcctt 1320
tcgaaacgtt atcccccact accaggcaga ttcctaggca ttactcaccc gtccgccgct 1380
gaatcatgga gcaagctcca ctcatccgct cgacttgcat gtgtagctgc gcatgctc 1438
Claims (10)
1.一株耳炎假单胞菌H11，其特征在于：该菌株的分类名称为耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)，于2017年6月22日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.14262。
2.根据权利要求1所述的耳炎假单胞菌H11，其特征在于：所述菌株是从养鸡场长期堆放羽毛废弃物的土壤中筛选得到。
3.根据权利要求1所述的耳炎假单胞菌H11，其特征在于：所述菌株的形态特征为：细胞形态为杆状，长1.09～1.93μm，宽0.365～0.415μm，无鞭毛，无芽孢，革兰氏染色为阴性；在牛肉膏蛋白胨平板上培养48h后，菌落呈红褐色，形状不规则，表面湿润光滑，有光泽、不透明。
4.根据权利要求1所述的耳炎假单胞菌H11在降解羽毛生产羽毛寡肽粉和寡肽溶液的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
1)、制备二级种子液：挑取斜面保存的耳炎假单胞菌H11一环，接种到牛肉膏蛋白胨试管培养基中28℃活化12h得到一级种子液，再将一级种子液按照2％接种量接种至30ml牛肉膏蛋白胨培养基中28℃培养12h，即得二级种子液；
所述牛肉膏蛋白胨培养基包括：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，pH值为7.0，在121℃灭菌20min；
2)、发酵降解羽毛：将耳炎假单胞菌H11的二级种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，在温度20～45℃、pH值为6～11的条件下发酵24h，收集发酵产物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将所述的发酵产物进行干燥、粉碎制备得到羽毛寡肽粉。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：对发酵产物进行固液分离，超滤后得到寡肽溶液，进一步将寡肽溶液烘干、研磨得到寡肽粉。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的发酵培养基包括：羽毛10g、NaCl0.5g、K2HPO4 0.7g、KH2PO4 0.35g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的发酵温度为40℃。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的发酵条件pH值为11。
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