CN105018365A - 一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母及其应用，属于基因工程领域。本发明以毕赤酵母SMD1168为宿主，以pPIC9k为载体，表达了角蛋白酶。本发明所构建的重组菌经发酵培养，168h时细胞干重达到174.1g/L，胞外角蛋白酶酶活达到1156U/mL，更适合工业化生产角蛋白酶。

Description

一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明涉及一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

我国每年在养殖业、畜牧业和纺织工业的生产过程中都产生数十万吨的羽毛、羊毛和动物角质等废物，这些废物的主要成分是角蛋白，由于其结构致密，因此很难被充分利用，大多数成为垃圾，不仅对环境造成污染，而且也是一种资源的浪费。

角蛋白酶能够特异性的降解角蛋白，且降解产物中含有动物生长所需要的必需氨基酸，所以可以利用角蛋白来降解羽毛、羊毛和动物角质等角蛋白废物，来生产动物饲料及有机肥料。然而，角蛋白酶来源的原始菌株通常对角蛋白酶的表达量很低，不能用于工业化生产，所以利用生物技术的方法构建一株高产角蛋白酶至关重要。

针对野生菌产酶效率低的问题，通常是将目的基因克隆到常用的表达载体中，然后利用已知的高效表达系统异源表达目的产物。但由于宿主菌的自身修饰，表达的产物酶活降低，且角蛋白酶对宿主菌本身有强烈的毒害作用，因此，产量一直很低，不能用于产业化生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题首先是提供一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母，是以毕赤酵母SMD1168为宿主，以pPIC9k为载体，表达了角蛋白酶。

所述角蛋白酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明要解决的第二个技术问题是应用所述重组毕赤酵母发酵生产角蛋白酶，是将重组菌的种子培养液，按接种量12-13％接种到装液量25-30％的3L全自动发酵罐中，以50％氨水和磷酸溶液控制pH 5.5，温度30℃，调节搅拌转速为500rpm，通气量维持在2vvm；当甘油耗尽，开始以指数流加方式流加350mL的含12mL/L PTM1的50g/L的甘油，维持比生长速率在0.18h^-1左右，并逐渐将搅拌转速调节到1000rpm，通气量调节到4vvm；待甘油再次耗尽，继续保持体系中基质匮乏状态约1h且DO>60％后，开始流加100％甲醇诱导培养基诱导产酶，以反馈流加的方式维持培养基中的甲醇浓度在1.8％(v/v)。

在本发明的一种实施方式红，种子液的获得是将重组菌株转接到YPD平板上，挑取单菌落接种到含有100mL的YPD培养基的1L摇瓶中，置于摇床中30℃，220rpm培养24h作为种子液。

在本发明的一种实施方式红，发酵培养基为BSM培养基：5％磷酸26.7ml/L，K₂SO₄18.2g/L，CaSO₄0.93g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM14.35mL/L。

本发明所构建的重组菌经发酵培养，168h时细胞干重达到174.1g/L，胞外角蛋白酶酶活达到1156U/mL，更适合工业化生产角蛋白酶。

附图说明

图1：重组质粒pPIC9k-kerD的结构图。

图2：重组菌株在3L发酵罐条件下，产角蛋白酶能力和生物量随时间的变化趋势。

具体实施方式

目的产物对角蛋白的降解活力的测定方法：取两只1.5mL的EP管，分为样品组和对照组，都分别加入150μL pH 9.0的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液、50μL的发酵上清液，对照组再马上加入200μL的4％的三氯乙酸溶液混匀，然后都分别再加入100μL的2.5％的角蛋白溶液，马上置于50℃金属浴中，准确反应20min后再向样品组中加入200μL的4％的三氯乙酸溶液混匀。然后10000rpm下离心5分钟。分别取200μL上清液与新的1.5mL的EP管中，再分别加入1mL的4M的NaCO₃溶液、200uL的福林酚溶液，50℃金属浴中准确反应10min，冷却至室温后，利用分光光度计测定660nm处吸光值，以三氯乙酸使酶失活的对照组作对照。(根据酪氨酸标准曲线换算酶活)酶活的定义：在50℃，pH 9.0条件下，角蛋白酶催化角蛋白反应过程中，1min生成1μg的酪氨酸所需的酶量为一个角蛋白酶酶活力单位，以U/mL表示。

实施例1重组菌株的构建

从Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1克隆得到编码角蛋白酶的基因，优化后得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码角蛋白酶的基因，然后将其克隆到表达质粒pPIC9k上，获得重组质粒pPIC9k-kerD。之后将重组质粒线性化整合到毕赤酵母SMD1168感受态细胞中。

具体如下：

根据kerD的基因序列，设计如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的引物EcoRI-F、NotI-R，通过PCR分别在基因两端添加EcoRI和NotI酶切位点。将PCR产物和载体pPIC9k分别用EcoRI和NotI双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌GM109感受态细胞，利用含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pPIC9k-kerD(重组质粒结构如图1所示)。然后从重组GM109中提取重组质粒，将质粒用SacI线性化后，电转化毕赤酵母SMD1168感受态细胞，MD平板筛选His⁺型(组氨酸缺陷回复突变型)重组菌株，再将得到的阳性克隆转接到MM平板上筛选Mut⁺型(甲醇利用快速型)的重组菌株。将筛选到的Mut⁺型的重组菌株分别转接到含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml浓度的G418的YPD平板上，筛选到含有不同拷贝数的目的基因的重组菌株，最后进行菌落PCR验证，筛选得到P.pastoris SMD1168-pPIC9k-kerD。

电转化条件为：15μl质粒(500ng/ml)加入到85μl的SMD1168感受态细胞中，混合后移入预冷的2mm的电转杯中，冰上放置10分钟。电压1500v，电容25μF，电阻200Ω。电击后加1ml预冷的1M的山梨醇溶液至电转杯，混匀后将溶液转移至1.5ml的EP管中，3000rpm离心2min，去上清。加入100μl预冷的1M的山梨醇溶液，涂布MD平板。

表1引物

实施例2keratinase的诱导表达及检测

将重组菌株用250ml摇瓶进行甲醇诱导，同时检测不同时间发酵液上清的角蛋白酶活性，并对发酵液上清进行SDS-PAGE分析。

重组菌株的诱导表达具体如下：

1)将重组菌株转接到YPD平板上，然后挑选单菌落接种到装有25mL BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30℃/250-300rpm培养至OD₆₀₀＝2-6(16-18h)；

2)室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用50mL的BMMY培养基重悬菌体，使OD₆₀₀＝1.0左右；

3)将步骤2所得的(约100-200mL)菌液置于500mL的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃/250-300rpm的摇床上继续生长；

4)每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0％；

5)按时间点分别取菌液样品，取样量为1mL，置于1.5mLEP管中，最大转速离心2～3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h。

结果表明重组菌株的产酶效果较好，而通过SDS-PAGE分析，重组菌株发酵液上清中的蛋白跟转了空载的对照菌株和未用甲醇诱导的出发菌株相比，均多出了一条大小约40kD的条带。之后对蛋白条带进行MALDI-TOF-MS/MS分析，结果表明，该条带的蛋白即为目的蛋白。

实施例3重组菌株在3L发酵罐上的产酶性能的上的验证

将重组菌株转接到YPD平板上，挑取单菌落接种到含有100mL的YPD培养基的1L摇瓶中，置于摇床中30℃，220rpm培养24h作为种子液。然后将其接种到含有800mL的BSM培养基的3L全自动发酵罐(LiFlus GM BioTRON，Korea)中。以50％氨水和磷酸溶液控制pH5.5，温度30℃，调节搅拌转速为500rpm，通气量维持在2vvm；当甘油耗尽(DO迅速上升，且DO>60％时)，开始以指数流加方式流加350mL的50％(W/V)甘油(含12mL/L PTM1)，维持比生长速率在0.18h^-1左右，并逐渐将搅拌转速调节到1000rpm，通气量调节到4vvm。待甘油再次耗尽，继续保持体系中基质匮乏状态约1h且DO>60％后，开始流加100％甲醇，以反馈流加的方式维持培养基中的甲醇浓度在1.8％(v/v)。从发酵开始每隔12h取一次样，7000rpm下离心1.5min，分别取上清和菌体，测定菌体干重和上清酶活。

重组菌株在3L灌上产酶效果如图所示，结果表明，重组菌株在3L灌上发酵168h时干重达到174.1g/L，酶活达到1156U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一株表达角蛋白酶的重组毕赤酵母，其特征在于，是以毕赤酵母SMD1168为宿主，以pPIC9k为载体，表达了角蛋白酶；编码所述角蛋白酶的基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述重组毕赤酵母在生产角蛋白酶中的应用。

3.一种应用权利要求1所述重组毕赤酵母发酵生产角蛋白酶的方法，其特征在于，是将重组菌的种子培养液，按接种量12-13％接种到装液量25-30％的3L全自动发酵罐中，以50％氨水和磷酸溶液控制pH 5.5，温度30℃，调节搅拌转速为500rpm，通气量维持在2vvm；当甘油耗尽，开始以指数流加方式流加350mL的含12mL/L PTM1的50g/L的甘油，维持比生长速率在0.18h^-1左右，并逐渐将搅拌转速调节到1000rpm，通气量调节到4vvm；待甘油再次耗尽，继续保持体系中基质匮乏状态约1h且DO>60％后，开始流加100％甲醇诱导产酶，以反馈流加的方式维持培养基中的甲醇的体积浓度在1.8％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，种子培养液的获得是将重组菌株转接到YPD平板上，挑取单菌落接种到含有100mL的YPD培养基的1L摇瓶中，置于摇床中30℃，220rpm培养24h作为种子液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵培养基为BSM培养基：5％磷酸26.7ml/L，K₂SO₄ 18.2g/L，CaSO₄ 0.93g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1 4.35mL/L。