CN107723263A - 一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系 - Google Patents

一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系 Download PDF

Info

Publication number
CN107723263A
CN107723263A CN201711003402.7A CN201711003402A CN107723263A CN 107723263 A CN107723263 A CN 107723263A CN 201711003402 A CN201711003402 A CN 201711003402A CN 107723263 A CN107723263 A CN 107723263A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microbial strains
screening system
feather meal
keratin degrading
feather
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711003402.7A
Other languages
English (en)
Inventor
曹张军
郝亚楠
张卫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Donghua University
National Dong Hwa University
Original Assignee
Donghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Donghua University filed Critical Donghua University
Priority to CN201711003402.7A priority Critical patent/CN107723263A/zh
Publication of CN107723263A publication Critical patent/CN107723263A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，由羽毛粉平板和转化子二代菌液组成。本发明提供的筛选体系，具有步骤简单、周期短、重复性强的优点，能够快速准确筛选出角蛋白降解能力减弱或丧失的突变体，为深入研究细菌降解羽毛的机理，寻找降解角蛋白相关基因并构建新一代高效菌株奠定了基础。

Description

一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系
技术领域
本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，特别涉及一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系。
背景技术
我国的羽毛资源极其丰富，但是没被充分利用，有的甚至造成环境污染。据测定，羽毛的粗蛋白含量约在80％以上(傅红梅.羽毛粉水解制取可溶性蛋白的工艺研究[J].四川联合大学学报(工程科学版),1997,6(1):65-71.)，氨基酸含量在70％以上，还含有常量元素、微量元素、维生素以及一些未知生长因子。角蛋白具有不溶于水和抗分解的性质，是一种抗性很强的硬性蛋白，其结构通过分子间二硫键、氢键、盐键和其他交键作用形成高度交联的三维稳定结构，角蛋白不能被一般的蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶)水解(Marshall R.C.,Orwin D.F.G.,Gillespie J.M.Structure and biochemistry ofmammalian hard keratin[J].Electron Microsc.Rev,1991,4:47～83.)。
从动物羽毛中提取蛋白质与复合氨基酸的方法有很多，现在主流的方法有高温酸碱水解法、酶解法和微生物发酵法。与常规的羽毛处理方法相比，微生物法有突出的优点，减少了蛋白质变性与氨基酸的损失，二是提高了羽毛粉中氨基酸的消化率，增加了可消化氨基酸，改善了必需氨基酸的平衡性，并降低了氮排除量，减少了氮污染。目前已发现30多种产角蛋白酶分解羽毛的微生物，分属于真菌、放线菌和细菌等(Muhsinand Hadi,2002；Ignatova et al.,1999；Chitte et al.,1999)。
微生物降解羽毛等硬性角蛋白是一个复杂的过程，目前的研究表明微生物降解羽毛的过程不仅仅是角蛋白酶的作用，还需要其他分子甚至微生物的直接参与，但这一过程如何由微生物主导并完成一直没有定论。
可降解羽毛角蛋白的细菌发现比较晚，1990年Williams等(Williams C.M.,RichterC.S.,MackenzieJ.M.Jr.Isolation,identification,and characterization ofa feather-degrading bacterium.Applied Environ.Microbio1,1990,(56):1509-1515)从家禽养殖废物的高温厌氧消化系统中获得了能够降解羽毛的地衣芽抱杆菌(Baccilluslincheniformis PDW-1)，构建细菌突变体是发现新基因、分析基因功能、了解某些生物机理的重要途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，本发明利用细菌能够降解羽毛，能够在羽毛粉平板上生长，而不同菌株角蛋白降解能力不同，从而在羽毛粉平板上表现出不同的生长状况的特性，构建了一种适用于不同菌株角蛋白降解能力的筛选体系。为探究降解羽毛的机理，寻找降解角蛋白相关基因并构建新一代高效菌株奠定了基础。
本发明的一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，由羽毛粉平板和转化子二代菌液组成。
所述羽毛粉平板采用如下配方(100mL)：羽毛粉0.5～1g，葡萄糖1g，氯化钾0.04g，氯化钠0.03g，吐温80 0.4g，琼脂1～2g，磷酸氢二钠0.4g，磷酸二氢钾0.03g，pH＝7～8制得。
所述羽毛粉平板的优选配方为(100mL)：羽毛粉1g，葡萄糖1g，氯化钾0.04g，氯化钠0.03g，吐温80 0.4g，磷酸氢二钠0.4g，磷酸二氢钾0.03g，琼脂2g，pH＝7.5。
所述羽毛粉是通过将鸡毛用洗涤剂清洗洁净后于80℃下烘干48h，剪碎后用粉碎机粉碎制得。
所述转化子二代菌液是通过将微生物菌种接种在羽毛粉平板上，挑取所要鉴定微生物单菌落，接种于5mL牛肉膏蛋白胨培养基进行培养，得到转化子菌液500μL，以1％的接种比例接种于50mL牛肉膏蛋白胨培养基中继续培养至OD600＝0.6～1.0制得。
所述微生物菌种为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)。
所述培养的工艺参数为：35℃，160rpm下培养12～16h。
所述继续培养的工艺参数为：35℃，160rpm下培养。
筛选不同角蛋白降解能力的微生物菌株是通过观察菌株生长状况选择细菌生长缓慢，菌落数量少的菌株进行标记，在羽毛粉平板上保种，继续观察生长状况，与初次筛选的结果比对，若一致，则认为初次筛选得到的微生物菌株角蛋白降解能力可靠。
有益效果
(1)本发明利用微生物能够降解羽毛，能够在羽毛粉平板上生长，而不同菌株角蛋白降解能力不同，从而在羽毛粉平板上表现出不同的生长状况的特性，通过观察、记录细菌生长状况，选择细菌生长缓慢，菌落生长数量少的微生物菌株，筛选出了角蛋白降解能力减弱或丧失的突变体，构建了一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系。
(2)本发明提供了一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，为深入研究细菌降解羽毛的机理，寻找降解角蛋白相关基因并构建新一代高效菌株奠定了基础。本发明具有步骤简单、周期短、重复性强的优点。
(3)本发明解决了现有技术中缺乏筛选不同角蛋白降解能力微生物菌株的初筛体系，达到了快速准确筛选出角蛋白降解能力减弱或丧失的微生物菌株突变体的技术效果。
附图说明
图1为本发明的用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系的操作流程图。
图2为本发明实施例1中滴加1μL不同浓度的Stenotrophomonas maltophiliaDHHJ和Escherichia coli在羽毛粉平板的试验效果对比图，其中平板上半部分是Stenotrophomonas maltophilia DHHJ，下半部分是Escherichia coli；1、2、3、4、5、6分别对应的菌液浓度为：10-3、10-5、10-7、10-9、10-11、10-13。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1实施材料
微生物菌种：嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)，一种能够降解羽毛的细菌；
羽毛粉：用洗涤剂清洗鸡毛，清洗洁净后于80℃烘干48h，剪碎后用粉碎机粉碎。
2实施方法
2.1选择合适的羽毛粉平板
制备不同羽毛粉浓度，琼脂浓度的羽毛粉平板，如表1所示：
表1最初始羽毛粉平板成分(100mL)
经高温高压灭菌后，羽毛粉在培养基中分布不均匀、易结块，滴加菌液经培养后，细菌与平板对比度低，不易观察细菌生长状况，为解决上述问题，改进羽毛粉平板配方，如图2所示。
表2改进后羽毛粉平板成分(100mL)
羽毛粉在培养基中分布均匀、不结块，滴加菌液经培养后，细菌与平板对比度的高，能够清楚地观察细菌生长状况，并且在羽毛粉量为1g、琼脂量为2g的羽毛粉平板上，细菌生长的最快，且生长良好。根据羽毛粉在水中均匀分布情况、细菌与平板对比度的高低，最终选择的羽毛粉平板最佳配方：羽毛粉1g，葡萄糖1g，氯化钾0.04g，氯化钠0.03g，吐温800.4g，磷酸氢二钠0.4g，磷酸二氢钾0.03g，琼脂2g，pH＝7.5。
2.2选择合适的菌液滴加浓度和体积
从上述羽毛粉平板上挑取Stenotrophomonas maltophilia DHHJ单菌落，接种于含5mL牛肉膏蛋白胨培养基的试管中，置于35℃，160rpm培养12～16h。
从上述试管中按照1％的接种比例，接种500μL菌液于含50mL牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，置于35℃，160rpm培养至OD600＝0.6。
将菌液稀释成不同的浓度梯度，包括两组：
第一组：10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7
第二组：10-3、10-5、10-7、10-9、10-11、10-13
分别滴加1μL菌液与5μL菌液在羽毛粉平板上，以大肠杆菌(Escherichia coli)做对照，观察细菌的生长状况。
滴加1μL菌液在羽毛粉平板上的试验效果如图2所示，其中平板上半部分是Stenotrophomonas maltophilia DHHJ，下半部分是Escherichia coli；1、2、3、4、5、6分别对应的菌液浓度为：10-3、10-5、10-7、10-9、10-11、10-13。
通过对细菌的生长状况的观察对比，确定最佳的菌液滴加浓度梯度为：10-3、10-5、10-7、10-9、10-11、10-13，最佳菌液滴加体积为1μL。
实施例2
(1)羽毛粉平板的制备：取实施例1得到的羽毛粉1g，葡萄糖1g，氯化钾0.04g，氯化钠0.03g，吐温80 0.4g，琼脂2g，磷酸氢二钠0.4g，磷酸二氢钾0.03g，pH＝7.5制得羽毛粉平板。
(2)转化子二代菌液的培养：将Stenotrophomonas maltophilia DHHJ接种在羽毛粉平板上，挑取所要鉴定微生物单菌落，接种于含5mL牛肉膏蛋白胨培养基的试管中，置于35℃，160rpm培养12～16h，得到转化子菌液，从上述试管中按照1％的接种比例，接种500μL菌液于含50mL牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，置于35℃，160rpm培养至OD600＝0.6，得到转化子二代菌液。
(3)不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选：将步骤(2)得到转化子二代菌液稀释成不同浓度梯度10-3、10-5、10-7、10-9、10-11、10-13，然后吸取1μL分别滴加在羽毛粉平板上，获得Stenotrophomonas maltophilia DHHJ不同角蛋白降解能力菌株，观察细菌生长状况，选择细菌生长缓慢，菌落数量少的菌株进行标记，将标记的菌株按编号在羽毛粉平板上保种；将保种的角蛋白降解能力减弱或丧失的菌株置于新鲜的羽毛粉平板上，观察生长状况；并与初次筛选的结果比对，若一致，则认为初次筛选得到的微生物菌株角蛋白降解能力可靠。

Claims (6)

1.一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，其特征在于：由羽毛粉平板和转化子二代菌液组成。
2.根据权利要求1所述的一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，其特征在于：所述羽毛粉平板采用如下配方：羽毛粉0.5～1g，葡萄糖1g，氯化钾0.04g，氯化钠0.03g，吐温80 0.4g，琼脂1～2g，磷酸氢二钠0.4g，磷酸二氢钾0.03g，pH＝7～8制得。
3.根据权利要求2所述的一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，其特征在于：所述羽毛粉是通过将鸡毛用洗涤剂清洗洁净后于80℃下烘干48h，剪碎后用粉碎机粉碎制得。
4.根据权利要求1所述的一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，其特征在于：所述转化子二代菌液是通过将微生物菌种接种在羽毛粉平板上，挑取所要鉴定微生物单菌落，接种于5mL牛肉膏蛋白胨培养基进行培养，得到转化子菌液500μL，以1％的接种比例接种于50mL牛肉膏蛋白胨培养基中继续培养至OD600＝0.6～1.0制得。
5.根据权利要求4所述的一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，其特征在于：所述微生物菌种为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)。
6.根据权利要求1所述的一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系，其特征在于：筛选不同角蛋白降解能力的微生物菌株是通过观察菌株生长状况选择细菌生长缓慢，菌落数量少的菌株进行标记，在羽毛粉平板上保种，继续观察生长状况，与初次筛选的结果比对，若一致，则认为初次筛选得到的微生物菌株角蛋白降解能力可靠。
CN201711003402.7A 2017-10-24 2017-10-24 一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系 Pending CN107723263A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711003402.7A CN107723263A (zh) 2017-10-24 2017-10-24 一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711003402.7A CN107723263A (zh) 2017-10-24 2017-10-24 一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107723263A true CN107723263A (zh) 2018-02-23

Family

ID=61213723

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711003402.7A Pending CN107723263A (zh) 2017-10-24 2017-10-24 一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107723263A (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101265470A (zh) * 2008-05-09 2008-09-17 东华大学 一种s.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法
WO2009000057A2 (en) * 2007-06-28 2008-12-31 Universidade Federal Do Rio De Janeiro-Ufrj Keratin hydrolysates, process for their production
CN101580807A (zh) * 2007-12-07 2009-11-18 东华大学 一种产角蛋白酶的菌株及其应用
CN102154144A (zh) * 2010-12-06 2011-08-17 天津科技大学 高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法
US8507254B1 (en) * 2012-07-05 2013-08-13 Khaled Ali Abuhasel Process of growing and harvesting algae in seawater with feather additive
CN104693299A (zh) * 2015-03-06 2015-06-10 东华大学 一种利用羽毛降解制备角蛋白单体的方法
CN104694440A (zh) * 2015-03-24 2015-06-10 东华大学 一种羽毛降解细菌及其应用
CN105802892A (zh) * 2016-04-27 2016-07-27 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用
CN106434404A (zh) * 2015-08-13 2017-02-22 上海杰隆生物制品股份有限公司 产高活性角蛋白水解酶的菌株及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009000057A2 (en) * 2007-06-28 2008-12-31 Universidade Federal Do Rio De Janeiro-Ufrj Keratin hydrolysates, process for their production
CN101580807A (zh) * 2007-12-07 2009-11-18 东华大学 一种产角蛋白酶的菌株及其应用
CN101265470A (zh) * 2008-05-09 2008-09-17 东华大学 一种s.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法
CN102154144A (zh) * 2010-12-06 2011-08-17 天津科技大学 高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法
US8507254B1 (en) * 2012-07-05 2013-08-13 Khaled Ali Abuhasel Process of growing and harvesting algae in seawater with feather additive
CN104693299A (zh) * 2015-03-06 2015-06-10 东华大学 一种利用羽毛降解制备角蛋白单体的方法
CN104694440A (zh) * 2015-03-24 2015-06-10 东华大学 一种羽毛降解细菌及其应用
CN106434404A (zh) * 2015-08-13 2017-02-22 上海杰隆生物制品股份有限公司 产高活性角蛋白水解酶的菌株及其应用
CN105802892A (zh) * 2016-04-27 2016-07-27 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种产角蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘瑞芳等: "《生命科学与工程实验》", 30 June 2016, 中国矿业大学出版社 *
叶明: "《微生物学实验技术》", 30 September 2009, 合肥工业大学出版社 *
梁田等: "嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ固态发酵羽毛工艺的研究", 《环境工程学报》 *
郝亚楠 等: "角蛋白降解能力差异菌株筛选体系的建立", 《工业微生物》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen Modern solid state fermentation
CN102864091B (zh) 一种一菌多酶菌株及其筛选方法和应用
CN106480149B (zh) 一种从酒糟中提取多肽的方法
CN1724481A (zh) 利用废弃菇渣生产微生物活性有机肥方法
US20220009852A1 (en) Bacillus subtilis bs40-4 strain and method for composting organic wastes by using the same
Jayasree et al. Optimization of production protocol of alkaline protease by Streptomyces pulvereceus
US20200113208A1 (en) Method for concentrating protein in grain powder
CN103820352A (zh) 一种蜡样芽孢杆菌ysq08及其应用
CN107653200A (zh) 一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂及应用
CN110317748A (zh) 一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用
CN106399155A (zh) 一种地衣芽孢杆菌发酵培养基
CN103725738B (zh) 用大黄鱼下脚料制备胶原多肽的方法
CN103074243B (zh) 一株伯克霍尔德氏菌qz7及其产生生物表面活性剂的应用
CN104450571A (zh) 一种高效降解蝇蛆蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株
CN107723263A (zh) 一种用于不同角蛋白降解能力微生物菌株的筛选体系
CN102084931B (zh) 一种有机锌酶制剂的制备方法
CN103525715A (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其筛选培养方法和用于豆粕的处理方法
CN106561999A (zh) 利用酶解金枪鱼暗色肉制备饲用肽的方法
Du et al. Sphingobacterium mucilaginosum sp. nov., isolated from rhizosphere soil of a rose
KR101236309B1 (ko) 바실러스의 고농도 배양을 위한 배지 조성물 및 이의 용도
KR20110076337A (ko) 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 리체니포르미스 ｃｓ48 및 그의 배양액
KR101137401B1 (ko) 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ｃｓ47 및 그의 배양액
Petlamul et al. Medium optimization for production of Beauveriabassiana BNBCRC spores from biohydrogen effluent of palm oil mill using taguchi design
Bogatyrenko et al. Potential probiotics of the Far Eastern trepang Apostychopus japonicus producing digestive enzymes
CN110002925A (zh) 一种促进土壤有益微生物生长的固态有机肥及其生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180223

RJ01 Rejection of invention patent application after publication