CN110452853A - 一株喜热噬油地芽孢杆菌g1201及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株喜热噬油地芽孢杆菌（Geobacillus thermoleovorans）G1201及应用，涉及到微生物领域，菌种保藏编号为CGMCC No.17647。所述喜热噬油地芽孢杆菌G1201可应用于羽毛和羽毛粉的降解、畜禽粪污处理以及有机肥生产。该发明所述发酵剂能够降解羽毛或羽毛粉，且发酵后巯基含量是发酵前的2~4倍，其降解产物可作为良好的饲料蛋白原料。该发酵剂应用于发酵鸡粪，能够明显去除其臭味，发酵后鸡粪的浸提液用于种子发芽试验，其发芽率是对照组的2倍，能有效提高有机肥腐熟度。

Description

一株喜热噬油地芽孢杆菌G1201及其应用

技术领域

本发明涉及一株喜热噬油地芽孢杆菌G1201及其应用，特别涉及菌株、发酵剂在降解羽毛和/或羽毛粉、饲料蛋白原料的制备和畜禽粪污处理等领域中的应用。

背景技术

蛋白酶占工业酶制剂种类的75％左右，近年来销售额则占整个酶制剂市场的65％以上。此外，蛋白酶应用领域也比较广泛，在食品、制革、饲料、洗涤、纺织和医药等多个领域均发挥很重要的作用。蛋白酶以最适作用温度可分为低温蛋白酶、中温蛋白酶和高温蛋白酶，其中高温蛋白酶的最适作用温度在60～80℃，甚至更高。由于在很多生产过程中如饲料制粒和烘焙均涉及到高温过程，另外发酵畜禽粪污在高温过程发酵能有效杀死病原菌、加快腐熟程度，因此高温蛋白酶有着极大的市场需求。

饲料蛋白原料一般为豆粕和鱼粉，价格比较贵，且供给日趋紧张。我国饲料蛋白资源缺口达几千万吨。羽毛是家禽屠宰后的副产物，粗蛋白含量在80％以上，其中有90％左右的角蛋白，含有丰富的氨基酸和一些生长因子，但不易被降解利用。物理法和化学法虽然能达到一定的水解效果，但会破坏一些有营养价值的氨基酸，还会出现质量不均一、适口性不佳和环境污染等问题。利用生物法对其进行处理，不仅有着作用条件温和、不会破坏营养价值的优点，对环境也较为友好。

随着全球畜牧业的发展，我国畜禽养殖模式已经逐渐从散户养殖转向规模化、集约化养殖，畜禽类粪便大量产生，成为农村和养殖场周边的主要污染源。一般来说对于粪污处理有发酵饲料、沼气发酵和发酵产生有机肥等途径。其中在发酵生产有机肥过程自然发酵法存在周期太长、臭味严重和缺少专门腐熟菌株等问题。所以筛选应用于除臭、粪污处理的产耐高温蛋白酶的菌株迫在眉睫。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一株同时具有嗜热、产高温蛋白酶特性的喜热噬油地芽孢杆菌G1201及其在降解羽毛和羽毛粉、制备饲料原料和畜禽粪污处理中的应用。

本发明的技术方案如下：

一、一株喜热噬油地芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)G1201，该菌株于2019年4月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17647。

二、一种喜热噬油地芽孢杆菌G1201的液体发酵剂的制备：喜热噬油地芽孢杆菌G1201在LB液体培养基中，50～70℃、180～200rpm条件下培养6h以上，或在液体深层发酵容器中，50～70℃通气条件下培养6h以上，菌体密度大于等于10⁶CFU/mL。

三、一种喜热噬油地芽孢杆菌G1201的固体发酵剂的制备：喜热噬油地芽孢杆菌G1201在LB液体培养基中，50～70℃、180～200rpm条件下培养6h以上，加入占培养基总质量8％～10％的保护剂后喷干，获得喜热噬油地芽孢杆菌G1201的菌粉及代谢产物，菌体密度大于等于10⁷CFU/g。

四、喜热噬油地芽孢杆菌G1201在降解羽毛和羽毛粉制备饲料原料以及在畜禽粪污处理中的用途。

1、饲料蛋白原料的制备

所述饲料蛋白原料是按照如下方法制备的：称取占发酵培养基总质量1％～2％的干燥的羽毛和/或羽毛粉加入到发酵培养基中，121℃灭菌30min，称取占发酵培养基总质量1％～2％的发酵剂接种于发酵培养基，置于50～70℃、发酵6h以上。

2、畜禽粪污发酵制备有机肥

所述的有机肥是按照下述步骤制备的：向畜禽粪污中加入占畜禽粪污总质量2％～5％的喜热噬油地芽孢杆菌G1201发酵剂，补充占畜禽粪污总质量5％～10％的水分，使粪污含水量达到45～55％，50～70℃发酵6h以上。

本发明的优点和有益效果：通过上述技术方案，本发明提供了一株喜热噬油地芽孢杆菌G1201，该菌株在50～70℃具有良好的生长状态，生长速度快，产高温蛋白酶；该菌株发酵剂应用于羽毛和/或羽毛粉降解，可以制备饲料蛋白原料，且发酵后巯基含量是发酵前的2～4倍；在发酵畜禽粪污过程中能有效减少臭味、增加腐熟度，提高种子发芽率。本发明在降解羽毛和/或羽毛粉、饲料蛋白原料的制备及畜禽粪污制备有机肥等方面有着广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明所述喜热噬油地芽孢杆菌G1201在蛋白酶平板上特征；

图2示本发明所述喜热噬油地芽孢杆菌G1201在LB平板上菌落形态；

图3示本发明所述喜热噬油地芽孢杆菌G1201在透射电镜下的菌体形态；

图4示本发明所述羽毛降解效果图。

具体实施方案

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。

本发明所述的菌株G1201是从土壤中筛选获得，经过形态学、生理生化和分子生物学等方法，鉴定该菌株为喜热噬油地芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)，该菌株已于2019年4月29日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.17647。

实施例1、喜热噬油地芽孢杆菌G1201的鉴定

1、形态学鉴定

参照《Bergey’sOF Systematic Bacteriology Second Edition》VolumeThree对G1201进行形态学鉴定，并对其进行透射电镜观察其形态。该菌株在LB固体培养基上呈微黄色，半透明，直径约3～4mm，不规则，边缘有缺刻(图1)。透射电镜下细胞呈杆状，宽0.8～1.2μm，长3.0～3.5μm，端生孢子，有鞭毛(图2)。

2、16S rRNA基因的扩增与序列分析

1)细菌基因组提取参照试剂盒操作说明进行；2)以上步提取的基因组为模板，利用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，SEQ ID No：2)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，SEQ ID No：3)进行PCR扩增。扩增程序为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。PCR产物送上海生工进行测序，结果在NCBI基因库中进行序列比对。16S rRNA如SEQ ID No：1所示。用MEGA7软件进行系统发育进化树的构建，G1201与Geobacillus thermoleovorans同源性最高，结合生理生化实验进一步确定该菌株为喜热噬油地芽孢杆菌。

实施例2、喜热噬油地芽孢杆菌G1201产蛋白酶特性

将喜热噬油地芽孢杆菌G1201接种于脱脂奶粉固体培养基平板上，65℃培养48h，通过透明圈大小观察其产蛋白酶活性(图3)。利用GB/T23527-2009福林酚法测蛋白酶活力。

表1菌株G1201平板产酶结果

实施例3、喜热噬油地芽孢杆菌G1201液体发酵菌剂的制备

取保藏的喜热噬油地芽孢杆菌G1201于LB液体培养基中活化，50～70℃，180～200rpm条件下摇床培养12～18h，以占培养基总质量2％的接种量接种于30L发酵罐，通气条件下培养18h，作为种子液，然后以占培养基总质量1％的接种量接种于1000L发酵罐中，培养6h以上，菌体密度大于等于10⁶CFU/mL。

表2不同培养条件下的菌体密度

实施例4、喜热噬油地芽孢杆菌G1201固体发酵菌剂的制备

取保藏的喜热噬油地芽孢杆菌G1201于LB液体培养基中活化，50～70℃，180～200rpm条件下摇床培养12～18h，以占培养基总质量2％的接种量接种于30L发酵罐，通气条件下培养18h，作为种子液，然后按以占培养基总质量1％的接种量接种于1000L发酵罐中，培养6h以上，加入以占培养基总质量8％～10％的硅藻土或沸石粉后喷干，获得喜热噬油地芽孢杆菌G1201的菌粉及代谢产物，菌体密度大于等于10⁷CFU/g。

实施例5、喜热噬油地芽孢杆菌G1201发酵羽毛及羽毛粉

发酵羽毛和/或羽毛粉是按照下述步骤制备的：称取1重量份的干燥的羽毛或羽毛粉加入到发酵培养基中，称取占培养基总质量1％的发酵剂接种于发酵培养基，以不添加发酵剂作为对照，于60℃、180rpm发酵24～72h，每24h对羽毛进行观察并记录其完整性来判断发酵情况(图4)。采用Ellma法对发酵后上清液进行巯基含量的测定。

上述发酵培养基是按以下配方配制：磷酸二氢钾0.50g，磷酸氢二钾1.20g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.10g，氯化钙0.20g，加水定容至1000mL，pH为7。

表3羽毛发酵巯基含量测定

实施例6、喜热噬油地芽孢杆菌G1201发酵羽毛及羽毛粉

发酵羽毛和/或羽毛粉是按照下述步骤制备的：称取占培养基总质量2％的干燥的羽毛或羽毛粉加入到发酵培养基中，称取占培养基总质量1％的发酵剂接种于发酵培养基，以不添加发酵剂作为对照，于65℃、180rpm发酵72h，每24h对羽毛进行观察并记录其完整性来判断发酵情况。采用Ellma法对发酵后上清液进行巯基含量的测定。

表4羽毛粉发酵巯基含量测定

实施例7、喜热噬油地芽孢杆菌G1201发酵鸡粪

取1kg鸡粪分别加入占鸡粪总质量2％、5％的发酵剂，补充水分到含水量占鸡粪总质量的50％，对照组以蒸馏水替代发酵剂。充分拌匀，60℃发酵7d。期间每24h闻鸡粪气味。

以种子发芽率作为检测指标。具体做法如下：取发酵后的鸡粪放入锥形瓶中，加入100mL蒸馏水混匀，30℃水浴18～24h后过滤，获得浸提液。100颗白菜种子均匀置于四层纱布上，实验组加20mL浸提液，对照组1不加浸提液，对照组2以蒸馏水代替浸提液，置于30℃培养箱内培养3d。观察记录白菜种子的生长情况。

表5 2％发酵剂添加量发芽率

添加占鸡粪总质量2％的发酵剂的实验组在发酵7d后基本无臭味，对照组仍然有刺鼻臭味。添加占鸡粪总质量5％的发酵剂的实验组在发酵5d后基本无臭味，对照组仍有刺鼻臭味。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 青岛海洋生物医药研究院

青岛百奥安泰生物科技有限公司

<120> 一株喜热噬油地芽孢杆菌G1201及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> 喜热噬油地芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)

<400> 1

ctggggggtg ctatacatgc agtcgagcgg accaaatccg gagcttgctc tggtttggtc 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggca acctgcccgc aagaccggga taactccggg 120

aaaccggagc taataccgga taacaccgaa gaccgcatgg tctttggttg aaaggcggcc 180

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accaaggcga cgatgcgtag ccggcctgag agggtgaccg gccacactgg gactgaaaca 300

cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatgggc gaaagcctga 360

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cgtaaagcgc gcgcaggcgg tcccttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600

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cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggcctgca 720

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gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag gggtcacacc ctttagtgct gcagctaacg 840

cgataagcac tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cccctgacaa cccaagagat tgggcgttcc cccttcgggg ggacagggtg 1020

acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080

gagcgcaacc ctcgcctcta gttgccagca cgaaggtggg cactctagag ggactgccgg 1140

cgacaagtcg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200

acacacgtgc tacaatgggc ggtacaaagg gctgcgaacc cgcgaggggg agcgaatccc 1260

aaaaagccgc tctcagttcg gattgcaggc tgcaactcgc ctgcatgaag ccggaatcgc 1320

tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccac gagagcttgc aacacccgaa gtcggtgagg ctaacccgca agggagccag 1440

ccccgccag 1449

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 喜热噬油地芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 喜热噬油地芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株具有嗜热特性、且产高温蛋白酶的喜热噬油地芽孢杆菌（Geobacillus thermoleovorans）G1201，已于2019年4月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 17647。

2.权利要求1所述具有嗜热特性、且产高温蛋白酶的喜热噬油地芽孢杆菌G1201作为发酵菌株在降解羽毛和/或羽毛粉、制备饲料原料和畜禽粪污处理中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是指喜热噬油地芽孢杆菌G1201作为发酵菌在降解羽毛和/或羽毛粉制备饲料蛋白原料的发酵剂、在发酵畜禽粪污生产有机肥的发酵剂方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵剂包含由喜热噬油地芽孢杆菌G1201制成的菌粉、菌液及其代谢产物中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌液及其代谢产物按如下方法制备而成，喜热噬油地芽孢杆菌G1201在液体培养基中，50~70℃、180~200rpm条件下培养6h以上，或在液体深层发酵容器中，50~70℃通气条件下培养6h以上，菌体密度大于等于10⁶CFU/mL。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌粉及其代谢产物按如下方法制备而成，喜热噬油地芽孢杆菌G1201在液体培养基中，50~70℃、180~200rpm条件下培养6h以上，加入保护剂后喷干，获得喜热噬油地芽孢杆菌G1201的菌粉及代谢产物，菌体密度大于等于10⁷CFU/g。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述饲料蛋白原料按照如下方法制备：称取占培养基总质量的1%~2%的干燥羽毛和/或羽毛粉加入到发酵培养基中，121℃灭菌30min，称取占培养基总质量的1%~2%的发酵剂接种于发酵培养基，置于50~70℃、发酵6h以上。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵畜禽粪污生产有机肥的方法如下：向畜禽粪污中加入占畜禽粪污总质量2%~5%的发酵剂，补充占畜禽粪污总质量5%~10%份的水分，使粪污含水量达到45~55%，50~70℃发酵6h以上。

9.根据权利要求3或8所述的应用，其特征在于，所述有机肥在提高种子发芽率的应用。

10.根据权利要求3或8所述的应用，其特征在于，所述喜热噬油地芽孢杆菌G1201发酵畜禽粪污生产有机肥时能够去除臭味、增加腐熟度。