DK168050B1 - Fremgangsmaade til fremstilling af en stabil vandig oploesning af varmestabil alfa-amylase fra bacillus licheniformis - Google Patents

Description

DK 168050 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en stabil vandig opløsning af varmestabil a-amylase fra Bacillus licheniformis ud fra en fermenteringsvæske indeholdende enzymet og faste spildprodukter fra fermenteringen.

5 Enzymer er biokatalysatorer, der regulerer mange af de biokemiske reaktioner, som forekommer naturligt i levende organismer. Enzymer anvendes på mange områder, f.eks. i garveri-, detergent-, næringsmiddel- og farmaceutisk industri. Ved den traditionelle metode til fremstilling af en-10 zymer opløses en enzymfældning i vand. Opløsninger af enzym i vand med høj styrke (koncentrerede opløsninger med høj enzymaktivitet) kan imidlerttid være opbevarings-in-stabile. Enzymet udfældes fra opløsningen og/eller er var-mefølsomt. I US patentskrift nr. 3.242.056 beskrives anven-15 delsen af vandige polyolopløsninger til hjælp ved hindring af termisk instabilitet af lysozym. I US patentskrift nr. 4.497.897 beskrives der en stabil, flydende proteinase fra Subtilisin Carlsberg indeholdende propylenglycol, calciumion og carboxylatsalt. I US patentskrift nr. 4.519.034 beskrives 20 der en stabil, flydende a-amylase fra Bacillus licheniformis, dispergeret i propylenglycol.

Et flydende enzymprodukt indeholdende varmestabil a-amylase fra Bacillus licheniformis i vandig opløsning er ønskelig, eftersom det kan anvendes direkte industrielt, 25 f.eks. i flydende detergenter, uden besværet med først at genopløseliggøre en tør enzymfældning i vand og/eller uden at tage hensyn til opløsningsmiddelforenelighed, f.eks. forenelighed med propylenglycol. Desuden undgås enzymstøv fra et tørt produkt. Forskere har således længe søgt efter 30 metoder til at holde dette enzym i vandig opløsning, navnlig opløsninger med høj aktivitet (højkoncentrerede opløsninger). Omend den kendte teknik, der er nævnt i det foregående afsnit, angiver anvendelsen af forskellige opløsningsmidler, f.eks. propylenglycol, er der aldrig blevet opnået et vandigt 35 enzymprodukt med høj enzymaktivitet, hvor dette enzym forbliver i opløsning.

2 DK 168050 B1 a-Amylase kan eksempelvis fås ved dyrkning af forskellige mikroorganismer, f.eks. Bacillus subtilis eller Bacillus licheniformis, i· et egnet næringsmedium. Bacillus subtilis producerer α-amylase, der er fysisk stabil, 5 dvs. at enzymet ikke i kendeligt omfang vil udfældes fra en vandig opløsning, selv når aktiviteten er 3 millioner MWU/ml (Modified Wohlgemuth Units pr. ml) eller mere. Disse α-amylase-opløsninger er imidlertid varmefølsomme, og maltodextrin tilsættes til forøgelse af termostabiliteten.

10 Ligeledes beskriver Klesov et al. i "Substrate Thermostabilization of Soluble and Immobilized Glucoamylase", Department of Chemistry, Moscow State University, Biokhimiya,

Vol. 44 (6), side 1084-1092 (1979), termostabilisering af en opløsning af glucoamylase fra Aspergillus niger med 15 maltodextrin. På den anden side er α-amylase opnået fra Bacillus licheniformis varmestabil, jfr. f.eks. Volesky et al., Microbial Enzymes: Production, Purification and Isolation, Vol. 2, nr. 2, side 120, 1985, men den er ikke specielt fysisk stabil i en vandig opløsning ved høje kon-20 centrationer.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i det foregående nærmere angivne art, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man til fermenteringsvæsken sætter maltodextrin i en mængde på fra ca. 0,1 til ca. 50% 25 (vægt/rumfang) af maltodextrin til opløsningen til inhibering af enzym-enzym-agglomerering, hvorved opløseligheden af α-amylasen i den vandige opløsning forøges.

Intetsteds i litteraturen foreslås eller angives den foreliggende, nye erkendelse, ifølge hvilken man kan anvende 30 maltodextrin til fremstilling af et stabilt vandigt produkt med høj enzymaktivitet, hvori enzymet er varmestabil a-amy-lase fra Bacillus licheniformis, og man har således nu undersøgt virkningen af tilsætningen af maltodextrin på stabiliseringen af vandige α-amylase-opløsninger med aktiviteter 35 op til ca. l million MWU/ml.

3 DK 168050 B1

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes et i det væsentlige opløsningsstabilt α-amylasepræparat, hvor α-amylasen er opnået fra Bacillus licheniformis. Ved udtrykket "i det væsentlige opløsningsstabil" menes der, at den 5 tilstand, hvor enzymet forbliver i opløsning, favoriseres, i modsætning til, at enzymet udfældes fra opløsningen, når denne opløsning er kraftig, dvs. har en høj enzymkoncentration, hvor aktiviteten er mindst 350.000 MWU/ml. Ved tilpasning af mængden af maltodextrin kan der fås særdeles kon-10 centrerede opløsninger med en aktivitet på 1 million MWU/ml eller endog mere, og som er i det væsentlige opløsningsstabile.

I US patentskrift nr. 3.272.717 er der beskrevet et termisk stabilt α-amylasepræparat, som fremstilles ud fra 15 amylaseholdige væsker ved tilsætning af et overfladeaktivt middel til koagulering eller fældning af urenheder, som fjernes ved filtrering. I patentskriftet omtales der tilsætning af stivelse til det α-amylaseholdige filtrat og omrøring, og der beskrives endvidere en fremgangsmåde til til-20 vejebringelse af granulær α-amylase, ved hvilken der anvendes stivelse til at forøge fældningen af α-amylaseholdige partikler. I modsætning hertil har det ifølge den foreliggende opfindelse vist sig, at en bestemt stivelse, nemlig maltodextrin, forøger opløseligheden af α-amylase (medens andre 25 stivelser er uopløselige og vil forøge enzymfældningen) . I dette patentskrift er der således intet antydet om, at man kan sætte maltodextrin til en vandig opløsning af a-amylase til inhibering af enzym-enzym-agglomerering til forøgelse af opløseligheden af a-amylasen.

30 I US patentskrift nr. 3.661.786 er der beskrevet stabilisering af α-amylase med almindelige granulære stivelser eller modificerede stivelser, herunder dextrin. Der beskrives et granulært præparat indeholdende et enzym og et detergent, hvilket præparat er stabiliseret med stivelse, 35 især mod udsættelse for temperaturer ved eller over omgivelsernes temperatur og/eller høj fugtighedsgrad og/eller per- 4 DK 168050 B1 borat-blegemidler, der har tendens til at destruere eller nedsætte aktiviteten af a-amylase. Stivelses/enzym-granulerne fremstilles ved en spraytørringsproces, og der findes i patentskriftet ingen antydning om, at stivelsen forøger 5 opløseligheden af a-amylasen i den opløsning, ud fra hvilken de spraytørrede granuler fremstilles, eller om, at maltodex-trin er den stivelse, der er specielt egnet til opnåelse af den omtalte virkning.

Det her fremstillede flydende præparat kan yderligere 10 indeholde en amylase, der er forskellig fra varmestabil a-amylase fra Bacillus licheniformis og/eller en protease. Forskellige mikroorganismer, som producerer amylaser og/eller proteaser, omfatter, men er ikke begrænset til Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus 15 og Bacillus amyloliquefaciens. De her omhandlede præparater er også fortrinsvis tiltænkt til anvendelse i et detergent og kan således indeholde fra ca. 0 til ca. 80% af et detergent-overfladeaktivt middel udvalgt fra gruppen af amphotere, anioniske, kationiske, ikke-ioniske, zwitter-20 -ioniske eller semipolære-ikke-ioniske overfladeaktive midler eller blandinger deraf. Sådanne detergenter er velkendte, og eksempler på nogle detergenter, der kan anvendes i forbindelse med de her omhandlede, flydende enzympræparater, er de, der er beskrevet i US patentskrift nr. 4.318.818 og 25 US patentskrift nr. 4.111.855.

Den følgende oversigt viser en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen sammenholdt med en konventionel behandling. Denne oversigt tjener kun til illustrerende formål og skal ikke betragtes som en an-30 givelse af, hvorledes den foreliggende opfindelse skal udøves i praksis.

35 DK 168050 Bl 5

Oversigt (A) Fermentering (biomasseadskillelse) (B) Kulturfiltrat (PM-2-membran) 5 (C) UF-koncentrat (D) (i) eller (D) (U) Fældnings- Vakuumind- metode til dampnings- opnåelse metode til af kage opnåelse af ^•0 koncentrat (E*) (i) eller (E') (ii) (E) (i) eller (E) (ii)

Ekstraktion Fortsat Ekstraktion Stabilisering af enzym fra inddamp- ·" af enzym ved tilsætning kage i vand (ind— ning fra kage i af maltodextrin stilling på vand inde- pH 6,5 pH 8, opbe- holdende varing ved maltodex- 10°C i 18- trin -24 timer) (filtre ring) 20 (pi) Enzymkageprodukt (F) Flydende slutprodukt (G) Ekstraktion af enzym fra kage i vand indeholdende maltodextrin pH 6,5 25 _

En simpel fremgangsmåde til fremstilling af et i det væsentlige stabilt, højvirksomt, vandigt a-amylasepræparat 30 er angivet i den ovenstående oversigt. Fremgangsmåden omfatter (A) udførelse af en fermentering, (B) adskillelse af biomassen fra fermenteringsvæsken indeholdende enzymet ved filtrering, (C) ultrafiltrering (UF) til opnåelse af et enzymkoncentrat, (D) enten (i) udfældning af en kage inde- 35 holdende enzymet eller (ii) udførelse af yderligere koncentrering ved vakuuminddampning eller yderligere ultrafil- DK 168050 B1 6 trering, og derefter (E) enten (i) ekstraktion af det udfældede enzym fra kagen over i en vandig opløsning ved genopslæmning af kagen i opløsningen, eller ved cirkulering af opløsningen gennem kagen, hvor den ekstraherende opløsning 5 indeholder maltodextrin, eller maltodextrin sættes til ekstrakten, eller (ii) tilsætning af maltodextrin direkte til koncentratet til opnåelse (F) af et vandigt, maltodextrin-holdigt slutprodukt. Ved konventionel behandling består trinet (E1) i stedet af (i) opslæmning af kagen i vand til 10 ekstraktion af enzymet derfra, eller består (ii) af en fortsat inddampning. Der genudfældes dernæst en enzymholdig kage, og overskud af moderlud fraskilles ved filtrering, hvorved der efterlades et tørt enzymprodukt (F1). Alternativt kan den foreliggende opfindelse bringes i anvendelse efter 15 trinene (E1) og (F') ved ekstraktion af enzymet fra denne udfældede kage over i en vandig opløsning indeholdende maltodextrin (G).

Efter enzymproduktion kan de faste stoffer (biomasse fra fermentering) fjernes fra den hele fermenterings væske 20 til tilvejebringelse af en enzymholdig opløsning ved anvendelse af enhver standardteknik, f.eks. filtrering og/eller centrifugering. Dernæst koncentreres den cellefri, enzym-holdige opløsning fortrinsvis mellem ca. 1 og ca. 10 gange ved hjælp af vilkårlig koncentrationsmetode, f.eks. ultra-25 filtrering og/eller inddampning. Maltodextrin eller en vandig opløsning indeholdende maltodextrin sættes til opløsningen eller koncentratet i en mængde på fra ca. 0,1 til ca. 50% efter vægt pr. rumfang, fortrinsvis fra ca. 3 til ca. 15% efter vægt pr. rumfang, af maltodextrin til den enzymholdige 30 opløsning eller koncentratet.

Ifølge en foretrukken udførelsesform kan der forud for tilsætningen af maltodextrinen sættes et fældningsmiddel til den cellefri, enzymholdige opløsning (eller koncentratet) , hvorved en kage indeholdende enzymet udfældes. Vel-35 kendte fældningsmidler er de lavmolekylære organiske opløsningsmidler såsom methanol, ethanol, isopropanol, 1-propanol, 7 DK 168050 B1 n-butanol, tert.butanol eller en blanding deraf eller salte såsom natriumsulfat, ammoniumsulfat eller blandinger deraf. Det er her hensigten, at udtrykket "kage" skal omfatte udtrykket "opslæmning" til inkludering af de tilfælde, hvor 5 kagen er så fugtig, at den vil blive betragtet som en opslæmning. Såfremt der forefindes et overskud af moderlud, kan dette fjernes fra opslæmningen eller kagen ved anvendelse af enhver af en række metoder, f.eks. almindelig filtrering, sugefiltrering, gravitetssedimentering eller centrifugering. 10 Dernæst kan der fremstilles en vandig opløsning indeholdende fra ca. 0,1 til ca. 50% efter vægt pr. rumfangsenhed, fortrinsvis fra ca. 3 til ca. 15% efter vægt pr. rumfangsenhed af maltodextrin i vand, som anvendes til opløsning eller ekstraktion af enzymet fra kagen. Ekstraktionen af enzymet 15 fra kagen kan også udføres ved hjælp af vand, og maltodex-trinen sættes dernæst i en mængde på fra ca. 0,1 til ca.

50% efter vægt pr. rumfangsenhed til ekstrakten.

Ifølge en anden udførelsesform adskilles de faste spildprodukter (dvs. biomasse fra fermentering) ikke fra 20 fermenteringsvæsken efter enzymproduktionen. I stedet sættes maltodextrinen eller en vandig opløsning af denne direkte til den hele fermenteringsvæske. Dette hjælper med til at holde enzymet i opløsning, således, at når de faste spildprodukter fjernes, tabes der mindre enzym i de faste stoffer. 25 Maltodextrinen tilsættes i en mængde på fra ca. 0,1 til ca. 50% efter vægt pr. rumfangsenhed til den hele fermenterings-væske.

Maltodextrinen kan være et substrat for enzymet. I almindelighed indvirker enzymer, der udviser deres maksimale 30 aktivitet ved en forhøjet temperatur, dvs. f.eks. 60°c, ikke kendeligt på et substrat, med mindre der foretages nogen opvarmning. Nærmere betegnet begynder a-amylase fra Bacillus licheniformis i det væsentlige ikke at hydrolysere et maltodextrinsubstrat, førend temperaturen er ca. 40°C, 35 idet en væsentlig hydrolyse ikke finder sted, førend temperaturen når ca. 60°C. Substratet vil således ikke blive 8 DK 168050 B1 væsentligt nedbrudt under typiske opbevaringsbetingelser ved omgivelsernes temperatur. En kilde til maltodextrin er Maltrin®, et hydrolyseret majsprodukt (faste stoffer fra kornsorten), der leveres i forskellige dextroseækvivalenter, 5 f.eks. af Grain Processing Corporation, Muscatine, Iowa.

Maltrin® er et mildt, hvidt carbonhydrat af næringsmiddelkvalitet med meget ønskelige bulk-karakteristika. Det har en lav sødhedsgrad, er letopløseligt i vand og er modstandsdygtigt mod klumpdannelse.

10 Eksempelvis er en typisk analyse for Maltrin-100 som følger:

Typiske kemiske og fysiske data

Dextroseækvivalent 9,0-12,0 15 Fugtighed, % maksimum 6,0 pH, 20%1 s opløsning 4,0-4,7

Form Hvidt pulver

Typisk carbonhydrat-profil (tør basis) 20 Monosaccharider 1%

Disaccharider 4%

Trisaccharider 6%

Tetrasaccharider 5%

Pentasaccharider og højere saccharider 84% 25

Det har vist sig, at en koncentration på fra ca. 3 til ca. 15% efter vægt pr. rumfangsenhed af maltodextrin er mest fordelagtig til at holde enzymet i opløsning.

Det har endvidere overraskende vist sig, at der ek-30 sisterer en omvendt korrelation mellem dextroseækvivalentet (DE) for maltodextrinet og opretholdelsen af enzymets solu-bilisering. Med andre ord er forholdet det, at jo lavere DE for maltodextrinet er, desto mere har enzymet tendens til at forblive i opløsning. Fortrinsvis er værdien for DE 35 9 DK 168050 B1 ca. 35 eller mindre, navnlig fortrinsvis mindre end ca. 25. Denne erkendelse er illustreret i det følgende eksempel 4.

Den nøjagtige mekanisme kendes ikke, men det antages, at maltodextrin kan anvendes på grund af dannelsen af et 5 stabilt enzym-substrat-kompleks.

I den foretrukne udførelsesform, enten efter eller før tilsætningen af maltodextrinen, indstilles pH-værdien for den enzymholdige opløsning på et niveau ved eller over enzymets isoelektriske punkt. pH-værdien bør ligge i et om-10 råde fra ca. 4,0 pH-enheder over det isoelektriske punkt og ned til omkring det isoelektriske punkt. Fortrinsvis er pH--værdien ikke mere end ca. 3,0 enheder over det isoelektriske punkt. Det isoelektriske punkt for α-amylase varierer mellem 4,8 og 5,5, og ved en sådan sur pH-værdi vil enzy-15 met forblive i opløsning. Imidlertid er det at holde pH- -værdien så lavt ikke et alternativ til opbevaring af a-amy-lase-opløsningen, fordi aciditeten vil bevirke denaturering af enzymet. Ifølge den mest foretrukne udførelsesform, hvor enzymet er Taka-Therm® (leveret af Miles Laboratories, Inc., 20 Elkhart, Indiana), en varmestabil α-amylase, der fås ved fermentering af en mutantstamme af Bacilis licheniformis, bør pH-værdien ligge mellem ca. 5,5 og ca. 9,0, fortrinsvis mellem ca. 6,0 og ca. 8,2. Det har vist sig, at den optimale pH-værdi i den foretrukne udførelsesform ved anvendelse 25 af Taka-Therm ® ligger mellem ca. 6,5 og ca. 8,0. De foretrukne midler til indstilling af pH-værdien er velkendte inden for enzymkemien, og eksempler er baser såsom NaOH og Κ0Η samt syrer såsom saltsyre og eddikesyre.

a-Amylase-aktivitet måles i eksemplerne ved bestem-30 melse af hydrolysen af opløselig stivelse under anvendelse af blåværdi-reduktion af stivelse-iod-kompleks som beskrevet i Manual of Liquefying Alpha-Amylase Assay, der er en modifikation af den metode, der er beskrevet af Wohlgemuth i Biochem., 29, 1 (1908). Ved et typisk forsøg inkuberes 35 5 ml 2%*s opløselig stivelse, der er pufret ved en pH-værdi på 5,4, og 4 ml vand med 1 ml passende fortyndet enzym i et DK 168050 B1 10 vandbad, der holdes ved 40°C. Ved tidsbestemte intervaller (5-30 minutter fra tilsætningen af enzym) udtages ali-quoter på 1 ml og indsprøjtes i et rør indeholdende 5 ml fortyndet iodopløsning, og der sammenblandes ved inversion.

5 Den udviklede farve sammenlignes derpå i en komparator til overvågning af fremkomsten af reaktionens slutpunkt. Enzymaktiviteten beregnes som Modified Wohlgemuth Units per milliliter (MWU/ml).

En Modified Wohlgemith Unit (MWU) er den aktivitet, 10 som dextriniserer 1 ml opløselig stivelse til en defineret blåværdi i løbet af 30 minutter under analysebetingelserne. Til beregningsformål antages det, at massefylden svarer til massefylden for vand, og aktiviteten pr. ml antages at være ækvivalent med aktiviteten pr. g. Beregningen er følgende: 15 „TTTT / 1 / _ 100 x 30 _ 3000

MWU/ml MWU/g T x W T x W

hvor 100 = mg stivelse i hver inkubationsblanding 30 = defineret dextriniseringstid i minutter T = tid i minutter til at nå slutproduktet W = vægt i g af enzym tilsat inkubationsblandingen i 1 ml aliquot af enzymfortynding.

En skematisk afbildning af teorien for stabilisering af α-amylase ved høje koncentrationer under anvendelse af 25 maltodextriner som stivelsessubstratet er som følger. Det har uventet vist sig, at faktorer, der nedsætter koncentrationen af det frie enzym i opløsning, også hindrer aggregeringen af enzymet ved høj' enzymaktivitet. Fjernelse af vand fra en fortyndet enzymopløsning har tendens til at favorisere 30 enzym-enzym-interaktioner i stedet for enzym-vand-inter aktioner. De forøgede enzym-enzym-interaktioner forårsager således, at enzymet associeres gennem ikke-kovalent tiltrækning, hvilket resulterer i fældningen af enzymet.

35 11 DK 168050 B1 n(E) —> (E)n Aggregering —p> Fældning V i'

Vand Vand 5

Det har vist sig, at tilsætningen af xnaltodextrin (M) enten til ekstrakten af enzym eller under koncentrering af enzymet fører til undgåelse af uopløseliggørelsen af enzymet ved høje koncentrationer, hvilket fremgår af det 10 følgende reaktionsskema: n(E) + m (M) -> (EM) x + M (n-m) + En_x, hvis n > m

Under ligevægtsforhold indeholder opløsningen i al-15 mindelighed x mol enzym/maltodextrinkompleks (EM), maltodex-trin (Mn_m) og frit enzym (En_x).

De eksperimentelle data viser, at i fraværelse af maltodextrin forekommer der fældning af enzymet, når koncentrationen af det fri enzym (En_x) er mere end 350.000 20 MWU/ml aktivitet, beregnet på vægten af enzymet i opløsningen.

De udførelsesformer, der er illustreret i de følgende eksempler, angår alle anvendelsen af Taka-Therm®, der er en varmestabil a-amylase fra Bacillus licheniformis.

25 30 35 0 DK 168050 B1 12

Farmentering af Bacillus licheniformis til produktion af varmestabil α-amylase (Taka-Therm ^ )_

Et fermenteringsmedium, der er egnet til dyrkning af en stamme af Bacillus 'licheniformis til produktion af 5 varmestabil α-amylase, kan fremstilles på følgende måde til en 1000 liter gæringsbeholder:

Calciumchlorid-dihydrat (flager) 0,2-1,0 kg

Mono- og dikaliumphosphat 15-24 kg

Ammoniumsulfat 2-7 kg 10 Egnet carbonkilde 100-200 kg

Bomuldsfrømel 25-40 kg

Sojamedium (sojamel) 30-50 kg

Mazu DF 6000x 8-13 liter

Vand tilsat til 1000 liter totalrumfang 15 _ x et organisk antiskummiddel leveret af Mazu Company, hvor hovedbestanddelene er poly-propylenglycol og silicone.

20 Mediet podes med levedygtige celler af en stamme af

Bacillus licheniformis og får lov at fermentere i 70-90 timer ved 40-50°C, idet pH-værdien holdes praktisk taget neutral. Efter denne fermentering kan mediet flocculeres ved hjælp af et egnet flocculeringsmiddel til hjælp ved fjernel-25 se af biomassen. Biomassen kan fjernes f.eks. ved centrifugering eller filtrering, og væsken passerer gennem et tromlefilter til polering og dermed til tilvejebringelse af en cellefri opløsning (primært kulturfiltrat eller ovenstående væske). Typisk for-overtrækkes tromlefilteret med et 30 filterhjælpemiddel såsom Superaid ®til polering (dvs. klaring) af det primære kulturfiltrat eller den ovenstående væske.

Ifølge en foretrukken udførelsesform kan det primære kulturfiltrat koncentreres ved ultrafiltrering, f.eks.

35 med en PM-10-membran (molekylvægtsgrænse 10.000) og/eller 0 13 DK 168050 B1 ved hjælp af vakuum. Dernæst kan enzymet udfældes kvantitativt (pH = 6-8) fra det koncentrerede kulturfiltrat i form af en enzymholdig kage, fortrinsvis ved tilsætning af 2o% natriumsulfat efter vægt/rumfang, 28% ammoniumsulfat efter 5 vægt/rumfang eller 80% ethanol efter rumfang/rumfangsenhed, hvorefter der følger en ekstraktion af enzymet fra kagen med vand, og der sættes dernæst maltodextrin til ekstrakten.

10 Eksempel 1

Et primært kulturfiltrat af a-amylase som ovenfor beskrevet, der er blevet klaret ved at blive ført gennem et tromlefilter overtrukket med Superaid ® , koncentreres 7 gange ved ultrafiltrering under anvendelse af et 15 Romicon ®20HF-4-filterapparat med en membran med en molekylvægtsgrænse på 10.000 ved 10°C, og filtratet opdeles i en række aliquoter. pH-værdien for hver aliquot indstilles på 7,6 med 20% vandig kaliumhydroxidopløsning. Der tilsættes Maltrin-20 til en række prøver i varierende procentmæng-20 der efter vægt/rumfangsenhed,og prøverne omrøres grundigt til opnåelse af ensartet sammenblanding. Nogle få prøver beholdes som kontroller (0% Maltrin-20 efter vægt/rumfangs-enhed). Dernæst koncentreres hver prøve yderligere ved hjælp af vakuum ved 35°C med en roterende inddamper (Brink-25 man-Buchi Rotovapor ®) til den ønskede amylaseaktivitet og Maltrin-koncentration for den bestemte prøve, der er tale om. Alle prøverne beskyttes mod mikrobiel forurening ved tilsætning af 0,5% kaliumsorbat efter vægt/rumfangs-enhed, efterfulgt af opbevaring i 1 måned ved 25°C. Efter 30 det angivne tidsrum centrifugeres prøverne. Mængden af enzym (hvad' 'enten der er tale om den oprindelige mængde, der forbliver i den ovenstående væske, eller den udfældede mængde) kan bestemmes ved måling af aktiviteten i MWU/ml som ovenfor beskrevet. Mængden af enzym i den ovenstående 35 væske bestemmes således og subtraheres fra den oprindelige 14 0 DK 168050 B1 mængde enzym, hvorved man får den mængde enzym, der er tabt i udfældningen, og denne mængde omdannes til procentmængden af fældet enzym ved anvendelse af formlen 100 x (fældet enzym/oprindeligt· enzym). Resultaterne er samlet 5 i den følgende tabel I.

10 15 20 25 30 35 15 DK 168050 B1

-P

Q)

rH

K

IH IT) in 03 ID OD <ί VD 'J O CM o 00 00 O

K s »· K I h, W s ^ *· ** ^ *· k ^ g ro oo r~- m l oo σ co t-·- m cm in r-H oo ιο m

>1 σ CM 00 CM 00 Γ' r-H r-H CM CM OO CM ID Η H CM

Q) N

tfl β

ttJ H

H

>i o\o g β β

IH

(tf 'd d

Cn O) β β β β Η ο(ΰ ih β g g π3 β ι—1 ι-Η β a) \ ΙΗ -Η -Ρ

dO

Η U fB CM

βΟ > ι lo β ΙΜ {tø !Κ Η β CM ο\° ·Η Ο Η Ο ^ Ο Ο ο Μ ·ί m Ο «1 (ϋ ^ Ρ Ο Η Γ'· co *3* Ο'-ο^Ο^^ο OooLncMcon i—ITJid .p ·»*.··. «· «.v**.*.». * *>*·*·*· *

(Didcu β Η O CM CO ID Γ" O CM LO σ i—1 CO O CM -=31 CO CO H

j2 P > 0 β HrH >H

β d BS

Eh d -P

ο<ϋ β β d-H β β -Ρ Ο β β

CM > (D

I (L) U

β X! β Ή (ί Ο β 0 & •Ρ Γ—I β β Φ a tj β 4Η β nj d co co Ο to co iH^cmcmoO 00 CM in in r- •H r^r^Or^r'' cm θ'- cm cm r- r~ h cm σ oo co cm tn HH if ϋ1 O tr ^ ^ r" m oo co r" β (Ug..... ...... ......

-Η Αχ tn ο Ο ο Ο m οι m in in m id cm σ id ιο cm β fj h Μ1 Μ1 U) "5Γ co Γ- 00 ^ σι ^ ^ rH Γ- Γ- 00 00 Γ- Μ -Η^ΟΟσΟιΗ γ- Γ- οο οο οο οο Γ'ΟοσΓ^Γ^οο β β S · · •Η d γΗ γ—1 Η Η > Ο β β ....... ...... ......

> Η es m ^ ιη ιοΓ'ΟοσΟΗ cMcn^mioo

Ό. γΗγΗγΗι—Ιι—! ι—I ι—I ι—I

β (β 16 DK 168050 B1 -μ

<D

'd

iH

« m σ\ H oo o ^ H oocncncmco^ O O r- m O σι V. V. V *·. *. *>. K. fc. V < fc. ·«. W *- W V.

g O H cn -¾1 in ^ oo in "ί ί in id (N <τ η H

(O Is fO lO ri ri til IO ^t1 ri i—I H Li") H (—1 r—I r-1 i—I

O) N

in β

td H

iH

>1 0\° g td a

IH

td ^ t5 tn t n d) β β β id

^ -Η ο(ΰ IH

£ C Ε g S Ti β

® ri Η H

fæ \

£ M-i -H -P

O tnO

‘h m u ffl oj ^ (do >l LO C 5h tK is ΗΠ<Μο\ο·Ηθ ro O O O in (D ^S-iOcNOjr-OO O Η cm ro ^ (Μ O (N lo u rH *·.*►*»***»*► «w k ^ >k < k κ >. v. >«. ·«. (j) <D cd (D ÆHOcn^loooO O ^ ^ ^ co H Ocm^^dcoO h rQ Η ϊ> O itf rH rH i—1 1—i

(d tn -H S O

H tn -Η H

°td β td -P

a-H Η β

Η -P O

0 (d β ,¾ cm > 0)

1 O) O M

β Λ β Ο) •na ο MOW ο -Ρ η Η Η td tu t n SO Ο β iH β -31 td θ' 1 Ο ^ η ro σι ο οοΟΟοοΟ^ο Η m Ο cn γί η cn •Η Ο di Ή ri μ ω to pi co μ σ> on m oo m m tn HH O r-· m m η H in co oo in co r-' n o t' m oi ^ - β 0) g...... co

•Η Ό\ΟΗοοοονοοο O N n O n m οί H vo O O m H

β βρ^ιηΓ^Γ^Ηΐη t" m in r~- m co ιο cm o oo oo σι ,¾ rig to m in in m m n^^nrom - Μ M S cm •na η > ο ιο ν

I—I

(D

• β Μ Η

β CD

> (D...... "& > oo οη ο Η cm on ·ί in co ν ra m ο Η cm on ·3* in η S Η Η Μ Dl ΟΙ Dl Ν Dl Dl ΟΙ Dl W 0Π ΓΠ 00 00 0Q ΓΟ ft Μ a κ } DK 168050 Bl 0 17

Resultaterne i tabel I viser, at maltrin inhiberer fældningen af enzymet i et koncentreret kulturfiltrat. Enzymet opretholdes imidlertid ikke i en højaktiv opløsning lige så godt som ifølge den foretrukne udførelsesform, der 5 er beskrevet i det følgende eksempel 3.

Eksempel 2

Fremgangsmåden fra eksempel 1 følges, idet der dog anvendes en anden størrelsesorden for koncentrationen, en 10 anden pH-regulering og en anden Maltrin-tilsætning. Det samlede kulturfiltrat koncentreres 7 gange ved ultrafiltrering og inddampes derpå til en koncentration på ca.

700.000 MWU/ml. Koncentratets pH-værdi indstilles derpå til 7,6, og koncentratet opdeles i 4 portioner. Der sæt-15 tes Maltrin-20 til hver portion i forskellige koncentrationer. Prøverne omrøres moderat ved 25°C i 40 timer og centrifugeres dernæst. Den procentmængde enzym, der går tabt i fældningen, beregnes på samme måde som i eksempel 1. Resultaterne er samlet i følgende tabel II.

20

Tabel II

Virkning af Maltrin-20 ved 700.000 MWU/ml % Vægt/rumfang % Enzym

Maltrin-20 fældet 25 0,00 8 4 2.0 74 4.0 48 8.0 6,2 30 Det fremgår af tabellen, at forskellige mængder af Maltrin-20 op til 8,0% efter vægt/rumfang giver anledning til en drastisk formindskelse af tabet af enzym på grund af udfældning. Aktiviteten opretholdes imidlertid ikke i en højaktiv opløsning lige gå godt som tilfæl-35 det er ved anvendelse af den foretrukne udførelsesform, 0 DK 168050 B1 18 der er beskrevet i det følgende eksempel 3.

Eksempel 3

En α-amylaseopløsning koncentreret ved ultrafiltre-5 ring 4 gange med en PM-10-membran, efterfulgt af Na2S0^~ -fældning (20% vægt/rumfangsenhed) som ovenfor beskrevet anvendes i dette eksempel.

Eftersom natriumsulfat anvendes som fældningsmiddel, udføres der en opvarmning til over stuetemperatur, dvs. til 10 ca. 30°C, til undgåelse eller formindskelse af klumpdannelse af natriumsulfatet. Der tilsættes Filteraid FW-6 (1% efter vægt/rumfangsenhed), og der opsamles en enzymholdig kage ved vakuumfiltrering. Den enzymholdige kage fjernes fra filtreringsapparatet og genopslæmmes i en minimal mæng-15 de vand til opløsning af enzymet derfra. Opløsningen filtreres til dannelse af en koncentreret enzymopløsning og indstilles derpå med vand til en høj udgangsenzymkoncentration som bestemt ved en målt aktivitet på 1 million MWU/ml, og opløsningen opdeles yderligere i 7 aliguoter.

20 Pulveriseret Maltrin-250 sættes til 6 af disse aliquoter i en mængde på 1%, 2%, 3%, 4%, 5% og 10% efter vægt/rumfangsenhed, og 1 aliquot beholdes som kontrol (0% Maltrin--250). Efter tilsætningen omrøres prøverne grundigt til ensartet sammenblanding, og pH-værdien indstilles på 8,0 25 med Κ0Η. Den oprindelige aktivitet korrigeres for fortyndingen på grund af tilsætningen af Maltrin, dvs. at passende blindprøver indeholdende de respektive mængder af Maltrin-250 også fremstilles til eliminering af enhver fejl, der skyldes virkningen af Maltrin på analysen. Alle 30 prøver opbevares ved 10°C i 24 timer. Efter det angivne tidsrum filtreres prøverne. Som ovenfor nævnt bestemmes mængden af enzym ved måling af aktiviteten. Mængden af enzym i filtratet måles således og subtraheres fra den korrigerede oprindelige enzymmængde for at give den mæng-35 de enzym, der er tabt i fældningen, som omdannes til pro- 0 DK 168050 B1 19 cent fældet enzym under anvendelse af udtrykket 100 x (fældet enzym/korrigeret oprindeligt enzym). Resultaterne er sammenfattet i den følgende tabel III.

5 Tabel III

Virkning af Maltrin-250-koncentration på den vandige stabilisering af α-amylase ved en høj indledende enzymkoncentration på 1.000.000 MWU/ml, pH = 8,0, og med opbevaring ved 10°C _i 24 timer_ 10 Koncentration, Procent fældet

Prøve nr. Maltrin-250 (% vægt/rumfang) enzym_ 1. kontrol 0 80 2. 1 45 3. 2 18 15 4* 3 0 5.4 0 6. 5 0 7. 10 0 20 Den vandige enzymopløsning er meget renere end det koncentrerede kulturfiltrat som beskrevet i det ovenstående eksempel 1, eftersom fældningen med Na2S04 bevirker fjernelse af urenheder. Der kræves således ikke mere end 3% mal-trin efter vægt/rumfangsenhed til at holde praktisk taget 25 hele enzymaktiviteten i opløsning. Som det ses, fældes der intet enzym, når koncentrationen af Maltrin-250 er 3% efter vægt/rumfangsenhed eller mere, og 100% af amylasen som målt ved dennes aktivitet forbliver således i filtratet.

30 Eksempel 4

Eksempel 3 gentages, men i dette tilfælde holdes den mængde maltrin, der tilsættes, konstant, og dets dextrose-ækvivalent varieres. Der undersøges således virkningen af graden af polymerisation (DP) af maltodextriner på stabili-35 seringen af α-amylase ved høj aktivitet. Maltodextriner med 0 DK 168050 B1 20 varierende dextroseækvivalenter (DE) tilsættes i en mængde på 1% efter vægt/rumfangsenhed til 8 vandige, koncentrerede a-amylase-aliquoter indeholdende 1 million MWU/ml begyndelsesaktivitet. pH-værdien for hver prøve indstilles på 8,0 5 med KOH, og aktiviteten korrigeres for tilsætningen af mal-trin. Prøven opbevares ved 10°C i 24 timer. Efter det angivne tidsrum filtreres de opbevarede prøver. Filtratet analyseres for α-amylase-aktivitet, og procentmængden af fældet enzym beregnes på samme måde som i eksempel 3. Resulta-10 terne er sammenfattet i den følgende tabel.

Tabel IV

Virkning af DE på stabiliseringen af a-amylase ved høj indledende enzymkoncentration på 1 mil-lion MWU/ml med opbevaring ved 10°C i 24 timer 15

Stivelse Målt % Enzym

Prøve nr. substrat DE fældet 1. Maltrin-040 5,2 40,0 2. Maltrin-100 11/4 41,5 3. Maltrin-150 16,1 41,5 20 4. Maltrin-200 22,5 45,5 5. Maltrin-250 23,6 45,5 6. Maltrin-365 35,7 51,0 7. Maltose 68,0 82,0 8. Glucose 100,0 85,0 ?5 9. kontrol Intet — 80,6

Resultaterne i tabel III viser, at stabiliseringen af enzymet forøges med DE for maltodextrin. Tilsætningen 30 af maltose eller glucose påvirker ikke nogen formindskelse af den fældede enzymmængde sammenlignet med kontrolforsøget, men bevirker snarere en svag stigning.

Sammenligningseksempel A (intet maltrin) 35 En koncentreret α-amylase-opløsning, der er fremstil- DK 168050 B1 21 0 let ved ultrafiltrering og ^280^-fældningsmetoden (20% efter vægt/rumfang) som beskrevet i eksempel 2 anvendes i dette eksempel.

pH-værdien for den' koncentrerede enzymopløsning 5 indstilles på 8,0 med KOH, hvorpå opløsningen yderligere opdeles i 3 prøver. Dernæst indstilles begyndelseskoncentrationen af enzym for hver af prøverne med vand på en aktivitet på 1 million MWU/ml, 700.000 MWU/ml og 350.000 MWU/ml. Hver af de tre prøver opdeles dernæst i 4 dele og 10 opbevares ved 5°C, 10°C, 24°C og 37°C i 18 timer. Efter den angivne tid filtreres prøverne under anvendelse af Whatman nr. 3-filtrerpapir, og mængden af enzym i filtratet bestemmes ved måling af aktiviteten, og procentmængden af fældet enzym beregnes under anvendelse af formlen 15 100 x (oprindelig mængde enzym minus filtrat-enzym/oprin- delig mængde enzym). Resultaterne er angivet i den følgende tabel A.

20 25 30 35 0 DK 168050 B1 22

Tabel A

Virkning af temperatur og indledende enzymkoncentration på enzymfældningen ved pH = 8,0 med opbevaring ved forskellige tempera-_i 18 timer_ 5

Oprindelig enzymaktivitet Inkubations- % enzym fældet efter MWU/ml temp., °C 18 timer ved pH = 8,0 1. 1.000.000 5 81,3 10 10 80,0 25 80,7 37 75,0 2. 700.000 5 44,3 15 10 45,6 25 41,4 37 23,8 3. 350.000 5 4,8 20 10 7,3 25 7,3 37 0,0

Resultaterne i den ovenstående tabel viser klart 25 relationen mellem oprindelig enzymkoncentration og graden af enzymfældning i fraværelse af Haltrin. Opbevaring af vandig enzymopløsning indeholdende 1 million MWU/ml høj begyndelsesaktivitet ved en pH-værdi på 8,0 i 18 timer resulterer i en fældning af fra 75 til 81,3% enzym, medens 30 en lav begyndelsesaktivitet på 350.000 MWU/ml kun resulterer i et tab på 7,3% eller mindre af enzym i fældningen.

Det forholder sig med andre ord således, at når styrken af enzymopløsningen forøges, dvs. når opløsningen har en højere koncentration af a-amylase, er der en tendens til, at 35 enzymet fældes fremfor at forblive i opløsning.

i 0 DK 168050 B1 23

Sammenligningseksempel B (intet Maltrin)

Eksempel A gentages, men i dette tilfælde holdes aktiviteten konstant, og pH-værdien varieres.

En aliquot som i eksempel A af den koncentrerede op-5 løsning, der er blevet indstillet med vand på en høj begyndelsesaktivitet på 1 million MWU/ml, opdeles i 6 aliquoter. Hver aliquot indstilles med KOH på en pH-værdi på 5,5, 6,5, 7,5, 8,5, 9,5 og 10,5, og opbevares ved 5°c i 18 timer. Efter opbevaring filtreres prøverne gennem Whatman nr. 3-pa-10 pir, og det tilbageblivende enzym i filtratet bestemmes, og derpå beregnes procentmængden af fældet enzym på samme måde som i eksempel A. Resultaterne er sammenfattet i den følgende tabel B.

15 Tabel B

Virkning af pH på α-amylase-enzymet fældet ved høj begyndelsesaktivitet med opbevaring _ved 5°C i 18 timer_

Prøve nr. pH Procent fældet a-amylase 20 1. 5,5 0 2. 6,5 9,0 3. 7,5 65,0 4. 8,5 80,0 5. 9,5 76,5 ος 6. 10,5 52,0

Graden af enzym, som fældes fra opløsningen, forøges, når pH-værdien forøges fra 6,5 til 8,5,og når et maksimum 30 ved en pH-værdi på 8,5. Ved en pH-værdi over 8,5 iagttages der en formindskelse af den mængde enzym, der går tabt i fældningen, hvilket kan skyldes genopløseliggørelse af det fældede enzym ved en høj alkalisk pH-værdi. Det er interessant at bemærke, at den maksimale opløselighed af enzymet 35 ved en høj begyndelseskoncentration finder sted ved en pH- 24 0 DK 168050 B1 -værdi på 5,5, hvilket er nær ved enzymets isoelektriske punkt. Ikke desto mindre vil en sådan sur pH-værdi som ovenfor nævnt denaturere enzymet under lange opbevarings-perioder.

5

Sammenligningseksempel C (intet Maltrin)

Virkning af temperaturen på hastigheden af fældning af a- -amylase ved en pH-værdi på 8,0_

En aliquot af koncentreret, vandig enzymopløsning 10 indeholdende 1 million MWU/ml begyndelsesaktivitet som i eksempel B separeres i to forskellige kolber (150 ml for hver prøve), men med den undtagelse, at pH-værdien i hver indstilles på 8,0 under anvendelse af natriumhydroxidopløsning. De to prøver opbevares dernæst ved 10°C og 37°C.

15 En aliquot på 10 ml udtages fra hver kolbe ved forskellige tidspunkter, dvs. efter 2,5 timer, 4 timer, 7 timer, 10 timer, 12 timer og 20 timer. Umiddelbart efter udtagelsen filtreres hver aliquot gennem Whatman nr. 3-papir, og filtratet analyseres for a-amylase. Dernæst beregnes pro-20 centmængden af fældet enzym på samme måde som i eksempel A. Resultaterne er sammenfattet i den følgende tabel C.

Tabel C

Virkning af temperaturen på hastigheden af fældning af α-amylase ved pH = 8,0 25 Tid (timer) Procent fældet enzym

10°C 37°C

2,5 4 - 7 36 - 30 10 61 19 12 75 40 20 80 65 35 25 0 DK 168050 B1

Resultaterne i tabel C viser, at den lave temperatur favoriserer fældningen af enzymet, medens temperaturen på 37°C favoriserer enzymets opløseliggørelse.

Sammenfattende kari det med hensyn til tabellerne 5 A, B og C siges, at resultaterne tydeligt viser relationen mellem oprindeliat enzym i opløsningen og graden af tabt enzym i fældningen ved forskellige pH-værdier og temperaturer. Fjernelse af vand fra enzymopløsningen, dvs. fremstilling af en koncentreret opløsning med høj aktivitet, forår-10 sager forøget protein-protein-interaktion, der har tendens til at favorisere aggregeringen af det enzym, der fremkommer ved fældningen. En sammenligning med eksemplerne 1, 2, 3 og 4 viser klart, at tilsætningen af Maltrin til koncentrerede opløsninger med høj aktivitet inhiberer protein-pro-15 tein-interaktion og favoriserer opløseligheden af enzymet.

20 25 30 35

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en stabil vandig opløsning af varmestabil a-amylase fra Bacillus licheniformis 5 ud fra en fermenteringsvæske indeholdende enzymet og faste spildprodukter fra fermenteringen, kendetegnet ved, at man til fermenteringsvæsken sætter maltodextrin i en mængde på fra ca. 0,1 til ca. 50% (vægt/rumfang) af maltodextrin til opløsningen til inhibering af enzym-enzym-agglo- 10 merering, hvorved opløseligheden af a-amylasen i den vandige opløsning forøges.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fermenteringsvæsken behandles til fjernelse 15 af de faste spildprodukter inden tilsætningen af maltodextrin til tilvejebringelse af en cellefri, enzymholdig opløsning, hvortil maltodextrinen sættes, hvorved der fås et vandigt, i det væsentlige opløsningsstabilt a-amylaseprodukt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kendeteg net ved, at man blander maltodextrinen i den enzymholdige opløsning, hvori maltodextrinen tilsættes direkte, eller maltodextrinen opløses først i H2O, og den resulterende vandige opløsning tilsættes. 25

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den enzymholdige opløsning koncentreres mellem ca. 1 og ca. 10 gange, og at maltodextrinen tilsættes under eller efter koncentreringen. 30

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at pH-værdien, før eller efter tilsætningen af maltodextrinen, indstilles til et punkt i området fra omkring enzymets isoelektriske punkt og op til 35 ca. 4,0 pH-enheder over det isoelektriske punkt. > DK 168050 B1

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at aktiviteten af det vandige produkt er 350.000 MWU/ml.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at maltodextrinen er et substrat for a-amylasen.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-7, 10 kendetegnet ved, at substratet for a-amylasen er majssirup eller maltodextrin.

9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-8, kendetegnet ved, at der anvendes maltodextrin 15 med et dextroseækvivalent under ca. 35.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der efter fjernelsen af de faste spildprodukter til tilvejebringelse af den cellefri enzymholdige opløs- 20 ning og inden tilsætningen af maltodextrinen sættes et fældningsmiddel udvalgt fra gruppen bestående af salte og lavmolekylære organiske opløsningsmidler til den enzymholdige opløsning til at bevirke, at der fældes en kage indeholdende enzymet, hvorpå enzymet ekstraheres fra den enzymholdige 25 kage i (i) vand, efterfulgt af tilsætning til ekstrakten af maltodextrin i en mængde på fra ca. 0,1 til ca. 50% efter vægt/rumfangsenhed af stivelse til vand, eller ekstraheres i (ii) vand indeholdende maltodextrin i en mængde på fra ca. 0,1 til ca. 50% efter vægt/rumfangsenhed af stivelse 30 til vand. 35