DE69117956T2 - Reinigung von erwinia-l-asparaginase - Google Patents
Reinigung von erwinia-l-asparaginaseInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von L-Asparaginase.
- Wie berichtet, kommt L-Asparaginase im Bereich von Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Säugetieren vor, und ihr Vorhandensein in gramnegativen Bakterien ist eingehend dokumentiert (Wriston J.C. & Yellin T.O. (1973). Adv. Enzymol. 39: 185 - 248; Wriston J.C. (1985). Methods Enzymol. 133: 608 - 618). L-Asparaginasen sind von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung, weil einige dieser Enzyme, vor allem die aus Escherichia coli (Asparaginase II) und Erwinia chrysanthemi gegen akute lymphoblastische Leukämie wirksam sind (Wriston 1985, siehe oben). Die Enzyme von Erwinia und E. coli zeigen keine immunologische Kreuzreaktivität und können deshalb eine alternative Therapie für Patienten darstellen, die gegen eines dieser Enzyme überempfindlich geworden sind. (Cammack K.A., Marlborough D.I. & Miller D.S. (1972). Biochem. J. 126: 361 - 379). Das Enzym von Erwinia ist ein Tetramer der relativen Molekülmasse 140.000 mit vier identischen Untereinheiten und hat einen ungewöhnlich hohen isoelektrischen Punkt mit einem pH von 8,6.
- Bisher wurde L-Asparaginase im großen Maßstab durch eine Kombination von Chargen- und Kolonnenionenaustausch- Chromatographie hergestellt. Um die notwendige Reinheit zu erlangen, sind zahlreichen Stufen erforderlich, wobei die Chargenionenaustausch-Chromatographie besonders arbeitsintensiv ist. Die derzeit übliche Praxis beeinhaltet die Züchtung einer Zellkultur und dann eine Extraktion des Rohproteins unter Verwendung von alkalischer Sprengung und Säureausfällung. Der resultierende Extrakt wird dann einer Adsorption auf sowie einer Elution von CM-Cellulose unterzogen. Anschließend folgen ein weiterer Säureusfällungsschritt und mehrere Chromatographieschritte unter Verwendung von CM- und DEAE-Cellulosemedien. Eines der Hauptprobleme des Systems ist seine Komplexität. Daher läßt es sich nur schwer automatisieren und kann nicht ohne weiteres für den kontinuierlichen Betrieb adaptiert werden.
- Wir haben jetzt ein neues Verfahren für die Reinigung von L-Asparaginase entwickelt. Dadurch erhält man durch ein einfaches Verfahren, das darüber hinaus noch leichter automatisiert werden kann, ein Produkt von erstaunlicher Qualität.
- Erf indungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung aufgereinigter L-Asparaginase zur Verfügung gestellt, bei dem man (a) einen Rohextrakt der L-Asparaginase mit einem festen Medium mit Kationenaustauschergruppen in Kontakt bringt, um die L-Asparaginase auf dem Träger zu adsorbieren, und (b) die adsorbierte L-Asparaginase vom Träger eluiert, dadurch gekennzeichnet, daß die Kationenaustauschergruppen Sulfonatgruppen enthalten und der Schritt (b) bei einem höheren pH Wert als Schritt (a) durchgeführt wird, wobei dieser pH Wert unter 8, liegen sollte.
- Die Kationensulfonatgruppen (-SO&sub3;&supmin;) können beispielsweise durch Gruppen der Formel -(CH&sub2;)NSO&sub3;&supmin;, in der n 1 bis 3 ist, zur Verfügung gestellt werden.
- Welcher Art die Matrix des festen Mediums ist, ist nicht besonders kritisch, doch um eine hohe Strömungsgeschwindigkeit in einem kontinuierlichen Verfahren zu erreichen, wird ein Träger mit einem hohen Porositätsgrad bevorzugt. Andere wünschenswerte Eigenschaften umfassen Steifheit, eine geringe, nicht spezifische Bindung von Protein und allgemeine chemische Stabilität.
- Wir haben festgestellt, daß Agarose oder ein Agarosederivat diese Eigenschaften aufweist.
- Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird verdünnter Rohextrakt von L-Asparaginase bevorzugt auf das feste Medium mit einem pH von 4,0 bis 5,5 aufgebracht. Anschließend wird mit einem pH von 6,0 gewaschen. Dann kann die adsorbierte L-Asparaginase mit einer geeigneten Pufferlösung mit einem pH im Bereich von 6,0 bis 7,5 eluiert werden. Bevorzugt liegt dieser Bereich zwischen 6,5 und 7,0.
- Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich vorteilhaft auf die Reinigung der L-Asparaginase von E. chrysanthemi anwenden. Wie erwähnt, sind L-Asparaginasen in Prokaryonten praktisch allgegenwärtig, wobei die von E. chrysanthemi wegen ihres therapeutischen Nutzens bevorzugt verwendet wird. Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu verwendet werden, aus Kulturen von E. chrysanthemi extrahierte L-Asparaginasen oder L-Asparaginase aus anderen Quellen zu reinigen. Beispiele sind L-Asparaginase mit Aminosäuresequenzen, die denen des Erwinia-Enzyms verwandt sind. Um eine angemessen hohe spezifische Aktivität zu erhalten, ist es wünschenswert, eine enge Sequenzhomologie (z.B. > 90 %, noch bevorzugter > 95 %) mit dem wilden Typ aufrechtzuerhalten. Die Aminosäuresequenz des Proteins vom wilden Typ ist in Fig. 1 dargestellt.
- Das Verfahren kann auch für die Reinigung von L-Asparaginase aus Organismen verwendet werden, die einer Transformation oder anderen Klontechniken unterzogen wurden, wodurch das E. chrysanthemi-L-Asparaginase-Gen mit Systemen verbunden wird, die die Superexpression beschleunigen.
- Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gehen aus folgenden Beispielen hervor
- Eine 12 h Impfkultur von E. chrysanthemi wird bei 37ºC gezüchtet und bis zu einem Gesamtvolumen von 400 l einem Hefeextrakt und Natriumglutamat enthaltenden Medium in einem gerührten tiefen Kulturgefäß zugesetzt, im wesentlichen wie in GB-A-1 314 530 beschrieben. Die Kultur wird durch Zentrifugieren geerntet.
- Zellpaste aus 2,5 Kulturen wird kombiniert und mit einer Konzentration von 1,5 g Trockengewicht/100 ml 6 mM EDTA suspendiert. Die Suspension von 300 bis 400 1 wird bei 16ºC gerührt und der pH mit 0,5 M NaOH auf 11,3 bis 11,5 eingestellt. Die Mischung wird 30 Minuten gerührt und der pH mit 12,5%iger Essigsäure auf 6,3 bis 6,7 eingestellt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit mit 25%iger Essigsäure auf einen pH von 4,8 eingestellt. Dann wird sie zentrifugiert, um die Ablagerung zu entfernen.
- Protein, das durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren aus E. chrysanthemi extrahiert wurde, wird wie folgt gereinigt:
- Natriumacetatpuffer wird durch Zusatz von 25%iger Essigsäure zu 40 mM Natriumacetat auf einen pH von 4,8 hergestellt. Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, wird durch Zugabe von 2 M NaOH zu NaH&sub2;PO&sub4; hergestellt. Die Absorbanz von Protein wird bei 280 nm und von Cytochrom b&sub5;&sub6;&sub2; zusätzlich bei 405 nm überwacht. Der verdünnte Extrakt mit einem pH von 4,8 wird auf eine Kolonne mit S-Sepharose Fast Flow, die mit 40 mM Natriumacetatpuffer ins Gleichgewicht gebracht wurde, pH 4,8, mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 300 cm/h aufgebracht. Ungebundenes Protein wird mit der gleichen linearen Fließgeschwindigkeit aus der Kolonne mit dem Gleichgewichtspuffer gespült. Gebundenes Protein ohne Asparaginase, aber mit Cytochrom b&sub5;&sub6;&sub2; wird mit etwa 20 Kolonnenvolumen 40 mM Natriumphosphat, pH 6,0 bis 6,2, mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 300 cm/h eluiert.
- Diese umfangreiche Spülung ist erforderlich, um das gesamte Cytochrom b&sub5;&sub6;&sub2; zu eluieren. L-Asparaginase wird mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 100 cm/h mit 40 mM Natriumphosphat, pH 6,5 - 7,0, aus der Kolonne eluiert. Aufeinanderfolgende Fraktionen wurden auf L-Asparaginase-Aktivität analysiert; die beigefügte Fig. 2 zeigt die Ergebnisse. Fraktionen, die L-Asparaginase enthalten, wurden in 20 mM Natriumphosphat, pH 6,0, diafiltriert, die Leitfähigkeit auf weniger als 1,5 mS/cm verringert und die Lösung konzentriert und filtersterilisiert. In einem alternativen (und bevorzugten Verfahren) wurde der pH schrittweise angehoben. Man stellt fest, daß das Enzym als schmaler Peak eluiert wurde, sobald ein Puffer mit einem pH von 6,8 zugegeben wurde (siehe Fig. 3).
- Die folgende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 1 Stufe Gesamtenzym (Megaeinheiten) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein) Ausbeute (%) Zellen (60 kg) Alkalischer Extrakt Säureausfällung S-Sepharose Fast Flow Ultrafiltration/Konzentration
- Protein, das mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren aus E. chrysanthemi extrahiert wurde, wird mit Verfahren des Standes der Technik wie folgt gereinigt:
- Die überstehende Flüssigkeit (Leitfähigkeit < 6,5 mS/ cm) wird mit entmineralisiertem Wasser auf eine Leitfähigkeit von etwa 2,5 mS/cm verdünnt und bei 14ºC gerührt, bis das gesamte Enzym auf 15 kg CM-Cellulose adsorbiert war, die zuvor mit 40 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,8, ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Flüssigkeit wird durch Durchflußzentrifugieren aus der Suspension entfernt. Die CM-Cellulose wird in der Zentrifuge mit entmineralisiertem Wasser gewaschen und das überschüssige Wasser durch Zentrifugieren entfernt. Die Cellulose wird in einen Plastikbehälter umgefüllt und das Enzym mit 18 l 1 mM EDTA enthaltendem 40 mM NaOH, pH 10,3, aus der CM-Cellulose eluiert. Die CM-Celluloseaufschlämmung wird in eine kleinere Durchflußzentrifuge eingebracht, das Eluat gesammelt und zurückbehalten. Die CM-Cellulose wird zurückgewonnen, mit 18 1 Elutionspuffer versetzt und der pH mit 2M NaOH auf 10,3 eingestellt. Die Aufschlämmung wird wieder in die Zentrifuge gegeben und das Eluat gesammelt und mit dem ersten Eluat kombiniert.
- Der pH der kombinierten Eluate wird mit 20%iger Orthophosphorsäure auf 6,0 eingestellt und nach weiteren 45 Minuten noch einmal überprüft.
- Die Lösung wird durch eine Durchflußzentrifuge geleitet, auf 80 l verdünnt und dann auf 30 l konzentriert. 45 bis 85 l entmineralisiertes Wasser werden zugesetzt, um die Leitfähigkeit auf unter 1 mS/cm zu senken, und die Lösung auf 3 l konzentriert. Das Konzentrationssystem wird mit 7 l entmineralisiertem Wasser gespült. Das Konzentrat wird durch eine 0,5 µm Filtrationsmembran geleitet und das Filtrationssystem mit 2 l filtriertem entmineralisiertem Wasser gespült. Die Lösung wird auf einem kleineren System auf 2 l konzentriert. Wenn die Leitfähigkeit größer als 1,3 mS/cm ist, wird entmineralisiertes Wasser zugesetzt und die Lösung erneut auf 2 l konzentriert. Das Konzentratorsystem wird mit bis zu 1,5 l entmineralisiertem Wasser gespült. Der pH der Lösung wird mit 20%iger Orthosphosphorsäure auf 5,0 eingestellt; die Lösung wird bei Bedarf verdünnt, um die Leitfähigkeit auf unter 1,3 mS/ cm zu senken. Ablagerungen werden durch Zentrifugieren aus der Lösung entfernt. Die Lösung wird sterilfiltriert und mit 1 ml/l mit Toluol versetzt.
- Der vorstehende Teil des Verfahrens wird wiederholt, um ausreichend Enzym (etwa 600 Megaeinheiten) für den Rest des Verfahrens zur Verfügung zu stellen, der unter aseptischen Bedingungen durchgeführt wird. Alle verbleibenden Schritte werden, wenn nicht anders angegeben, bei 3 bis 6ºC durchgeführt.
- Nicht verbrauchte CM 52-Cellulose wird mit 60%igem wäßrigem Ethanol behandelt, mit filtriertem entmineralisiertem Wasser gründlich gewaschen und gegen Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, ins Gleichgewicht gebracht. Die Cellulose wird in eine Kolonne von 25,2 x 60 cm gepackt, mit mindestens einem Bettvolumen abgekühltem Gleichgewichtspuffer gewaschen, und der Extrakt von 18 l mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 4 l/h auf die Kolonne aufgebracht. Die Kolonne wird mit mindestens einem Bettvolumen des Puffers gewaschen. Das Enzym wird mit 60 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, aus der Kolonne eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, durch eine Filtermembran von 0,2 µm filtriert und kombiniert. Die kombinierte Proteinlösung wird unter Verwendung eines Hohlfasersystems auf 40 bis 60 mg/ml konzentriert und dann mit 1 M Natriumhydroxid auf einen pH von 8,5 eingestellt.
- Die folgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 2 Stufe Gesamtenzym (Megaeinheiten) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein) Ausbeute (%) Zellen (60 kg) Alkalischer Extrakt Säureausfällung CM-Celluloseadsorption Ultrafiltration/Konzentration Kombinierte Extrakte CM-Cellulosechromatographie
- Enzym, das auf die in Beispiel 2 oder 3 beschriebene Weise gereinigt wurde, kann folgenden Schritten zur Fertigstellung unterzogen werden:
- Ammoniumsulfat wird der Proteinlösung auf eine Endkonzentration von 40 % zugesetzt und die Suspension 1 bis 3 Stunden bei 18 bis 25ºC gerührt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen (5986 g, 30 min.), in sterilem destilliertem Wasser aufgelöst und gegen steriles destilliertes Wasser unter Einsatz eines Hohlfasersystems filtriert, bis die Leitfähigkeit der Lösung im Bereich von 0,9 bis 1,15 mS/cm liegt. Die Lösung wird konzentriert, so daß sich die Enzymaktivität im Bereich von 65.000 bis 85.000 U/ml bewegt. Der pH wird mit 1 M Natriumhydroxid auf einen pH von 8,7 und die Leitfähigkeit mit 0,25 M Natriumboratpuffer, pH 8,7, auf eine Leitfähigkeit von 1,2 bis 1,6 mS eingestellt.
- CM-52 Cellulose wird mit 60%igem wäßrigem Ethanol behandelt, dann mit 20 mM Natriumboratpuffer, pH 8,7, ins Gleichgewicht gebracht, und in eine 25,2 x 45 cm Kolonne gepackt. Das Enzym wird mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 5 l/h auf die Kolonne aufgebracht. Das Enzym bindet nicht, sondern fließt durch die Kolonne. Die aktiven Fraktionen werden filtriert und kombiniert.
- DEAE 52 Cellulose wird mit Natriumboratpuffer, pH 8,7, ins Gleichgewicht gebracht und in eine 25,2 x 60 cm Kolonne gepackt. Die Enzymlösung wird mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 6 l/h auf die Kolonne aufgebracht. Dann sammelt, filtriert und kombiniert man die Fraktionen.
- Die Konzentration der Enzymlösung wird durch Verdünnen mit 20 mM Natriumboratpuffer, pH 8,7, auf einen Wert zwischen 25.000 und 35.000 U/ml eingestellt. Dann gibt man 0,66 Volumen Ethanol zu. Die Lösung wird mit 1 M Essigsäure auf einen pH von 8,5 eingestellt und die Suspension noch eine Stunde bei 18 bis 25ºC gerührt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (5968 g über 45 Minuten) entfernt; dann gibt man 0,09 Volumen Ethanol zu. Die Lösung wird bei -2ºC 24 Stunden gelagert, ehe die Kristalle wieder suspendiert werden. Dann werden weitere 0,1 Volumen Ethanol zugesetzt und die Lösung mindestens 48 Stunden lang wieder bei -2ºC gelagert. Die überstehende Flüssigkeit wird von den Kristallen abdekantiert; die Kristalle werden zentrifugiert (5986 g über 20 Minuten). Die abgesetzten Kristalle werden in einem minimalen Volumen sterilem destilliertem Wasser aufgelöst und bei 2 bis 4ºC ausgiebig gegen steriles destilliertes Wasser dialysiert. Die kombinierte dialysierte Enzymlösung wird dann in bezug auf Natriumchlorid auf 10 mM gebracht und die resultierende großvolumige Enzymlösung bis zur Weiterverarbeitung bei -20ºC eingefroren.
- Eine ausreichende Menge der Enzymlösung wird aufgetaut und kombiniert, um genug Substanz für eine Charge von 10.000 Phiolen zur Verfügung zu stellen, die auf je 1 ml gefüllt werden. Die Proteinkonzentration wird mit sterilem destilliertem Wasser auf 30 bis 50 mg/ml eingestellt, in Chargen von entsprechender Größe geteilt, mit 1,0 M Essigsäure auf einen pH von 6,0 eingestellt und bei 18 bis 25ºC mit 0,5 Volumen Alhydrogel behandelt. Nach 30 Minuten Rühren werden die Lösungen zentrifugiert (3986 g über 45 min.), um das Aluminiumoxid und die überstehenden Flüssigkeiten zusammen zu entfernen. Die Lösung wird mit 1,0 M Natriumhydroxid auf einen pH von 7,4 eingestellt und mit sterilem destilliertem Wasser auf 14.000 U/ml verdünnt. Steriles Natriumchlorid und Glukosemonohydrat werden auf eine Endkonzentration von 10 mM bzw. 0,5 Gew.-% zugesetzt. Die Lösung wird schließlich mit sterilem Wasser verdünnt, um eine Enzymaktivität von 10.500 U/ml zu ergeben und durch einen positiv geladenen 0,2 µm Membranfilter in ein steriles Sammelgefäß filtriert. Das sterile Produkt wird in 3 ml Glasphiolen gefüllt, gefriergetrocknet, verschlossen und unter 0,5 Atmosphären Stickstoff gekräuse lt.
- Die folgende Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 4 Stufe Gesamtenzym (Megaeinheiten) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein) Ausbeute (%) Ammoniumsulfatausfällung CM-Cellulosedurchtritt DE-Cellulosedurchtritt Kristallisation Ungeteiltes Enzym Depyrogenierung
- Aus Tabelle 1 (Beispiel 2) geht hervor, daß man mit dem erf indungsgemäßen Verfahren einen Reinheitsgrad erreichen kann, der nach nur drei Reinigungsschritten (alkalischer Extrakt, Säureausfällung, Adsorption/Elution) eine spezifische Aktivität von mehr als 600 Einheiten/ mg bei einer Ausbeute von 60 bis 70 % ergibt. Einen ähnlichen Reinheitsgrad (spezifische Aktivität > 600 Einheiten/mg) erreicht man mit dem Verfahren des Standes der Technik (siehe Tabelle 2, Vergleichsbeispiel 3) erst nach sechs Reinigungsschritten (alkalischer Extrakt, Säureausfällung, CM-Celluloseadsorption, Säureausfällung, Ultrafiltration 1 Konzentration, CM-Celluloseadsorption). Außerdem sank beim Verfahren des Standes der Technik die Ausbeute auf 40 %, wenn man die vorstehende spezifische Aktivität erreichte.
Claims (14)
1. Verfahren zur Herstellung aufgereinigter L-Asparaginase, bei dem man (a) einen
Rohextrakt der L-Asparaginase mit einem festen Medium mit
Kationaustauschergruppen in Kontakt bringt, um die L-Asparaginase auf dem Träger zu adsorbieren,
und (13) die adsorbierte L-Asparaginase vom Träger eluiert, dadurch gekennzeichnet,
daß die Kationenaustauschergruppen Sulfonatgruppen enthalten und das Eluieren (1,)
bei einem höheren pH-Wert als in Schritt (a) erfolgt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem Schritt (b) bei einem pH unterhalb 8,
ausgeführt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Sulfonatgruppen einen Bestandteil der
Gruppen der Formel -(CH&sub2;)nSO&sub3;θ darstellen, wobei n = 1 - 3 ist.
4. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Träger von
Agarose abgeleitet ist.
5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Msprüche, bei dem das
In-Kontakt-Bringen des Rohextrakts mit dem festen Medium in Schritt (a) bei einem pH von 4,0 bis
5,5 erfolgt.
6. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Eluieren der
adsorbierten L-Asparaginase in Schritt (b) bei einem pH von 6,0 bis 7,5 erfolgt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem der pH in Schritt (b) im Bereich von 6,6 bis
7,0 liegt.
8. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem man
(i) die L-Asparaginase bei einem pH von 11,3-11,5 aus aufgebrochenen Zellen
extraliiert,
(ii) den pH auf einen Wert im Bereich von 6,3 bis 6,7 einstellt,
(iii) den Überstand von ausgefäliten Verunreinigungen abtrennt,
(iv) den Überstand aus Schritt (iii) der Adsorbtion auf dem festen Medium mit
Kationenaustauschergruppen unterwirft, und
(v) die adsorbierte L-Asparaginase eluiert.
9. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die der Aufreinigung
unterworfene L-Asparaginase im wesentlichen die Aminosäuresequenz der
L-Asparaginase aus E. chrysanthemi hat.
10. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die der Aufreinigung
unterworfene L-Asparaginase eine Sequenzhomologie von mindestens 90 % zu der
in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, bei dem die der Aufreinigung unterworfene
L-Asparaginase eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu der in Fig. 1
dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei welchem die der Aufreingung unterworfene
L-Asparaginase eine Sequenzhomologie von mindestens 99 % zu der in Fig. 1
dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
13. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Rohextrakt
dadurch hergestellt wird, daß man einen transformierten Mikroorganismus kultiviert,
der ein rekombinantes Plasmid mit einem für die L-Asparaginase codierenden DNA-
Insert enthält.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 - 9, bei dem der Rohextrakt durch die
Kultivierung von E. chrysanthemi erhalten wird.
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