CN100425991C - 一种用于检测sars抗体的免疫微球及其制备方法和用途 - Google Patents

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CN100425991C CNB2004100701474A CN200410070147A CN100425991C CN 100425991 C CN100425991 C CN 100425991C CN B2004100701474 A CNB2004100701474 A CN B2004100701474A CN 200410070147 A CN200410070147 A CN 200410070147A CN 100425991 C CN100425991 C CN 100425991C
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Abstract

本发明涉及一种用于检测SARS抗体的免疫微球，及其制备方法和用途。该免疫微球是以表面有羧基修饰的聚苯乙烯微球为内核，其表面的羧基通过多聚赖氨酸化学偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白。该免疫微球可以作为检测试剂检测抗SARS抗体。本发明提供的用于检测SARS抗体的免疫微球与现有技术相比，其敏感性和特异性好，准确性高，避免了PCR诊断试剂盒的假阳性的缺点；整个检测过程快速；检测不需要任何仪器设备，经济实用，适合广大基层卫生防疫单位使用。

Description

一种用于检测SARS抗体的免疫微球及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种用于检测SARS抗体的免疫微球，及其制备方法和用途。
技术背景
SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒是一种新发现的冠状病毒，其引起的这种新型疾病发病快，传播速度快，若不及时诊断治疗，病死率非常高。
目前在科研和临床上常用的检测方法是酶联免疫法(ELISA)。使用酶联免疫法(ELISA)检测抗体，即将抗原包被酶标板上，加小牛血清或脱脂奶封闭，再加待测血清后温育1小时，经反复冲洗后加酶标第二抗体，温育，再冲洗多次后加显色的底物。此法虽然敏感性和特异性很好，但是要完成全部试验需要2小时以上。
而使用免疫微球法检测抗体是一种简便、快速的方法，只需1分钟就可得到结果。该方法是将抗原偶联或交联到有机聚合物制备的微球上，制成免疫微球试剂来检测抗体。但是现有的免疫微球试剂的制备方法，无论是物理或是化学方法，得到的免疫微球均不是通过共价键结合的，因此免疫微球本身很不稳定，受温度和盐浓度影响很大，容易造成假阳性的实验误差。
发明内容
本发明的目的在于克服现有酶联免疫法不够简便、快速；而免疫微球法的免疫微球本身很不稳定，容易造成假阳性实验误差的缺陷，从而提供一种既可以快速、简便的检测，又很稳定的用于检测SARS抗体的免疫微球。
本发明的另一目的在于提供一种所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的用途。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
本发明提供的用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)抗体的免疫微球，其为以聚苯乙烯微球为内核，其表面的羧基通过多聚赖氨酸偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白，所述的聚苯乙烯微球为表面直径为200～900纳米，其表面有羧基修饰。
本发明提供一种所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的制备方法，是采用化学偶联法将SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白作为抗原偶联到微球，包括如下的步骤：
1)将聚苯乙烯微球15～20mg/ml，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸缓冲液，然后加入2～4mg/ml的碳二亚胺，于室温反应完全后，离心，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤，重悬于0.01～0.05M的pH 7.5～8.5的碳酸盐缓冲液；所述的聚苯乙烯微球直径为200～900纳米，其表面有羧基修饰；
2)向步骤1)得到的混合液中加入0.2～2.4mg/ml的多聚赖氨酸，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸缓冲液，然后加入2～4mg/ml的碳二亚胺，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤，重悬于0.01～0.05M的pH 7.5～8.5的碳酸盐缓冲液；
3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白0.2～2.4mg/ml，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液；加入50～200微升0.25M乙酰胺，于室温反应完全后，离心分出固体；
4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.01～0.05M的pH 7.5～8.5的碳酸盐缓冲液，于室温反应完全后，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的免疫微球。
所述的SARS冠状病毒S蛋白的氨基酸序列为：
MetPheIlePheLeu    LeuPheLeuThrLeu     ThrSerGlySerAsp     LeuAspArgCysThr
ThrPheAspAspVal    GlnAlaProAsnTyr     ThrGlnHisThrSer     SerMetArgGlyVal
TyrTyrProAspGlu    IlePheArgSerAsp     ThrLeuTyrLeuThr     GlnAspLeuPheLeu
ProPheTyrSerAsn    ValThrGlyPheHis     ThrIleAsnHisThr     PheAspAsnProVal
IleProPheLysAsp    GlyIleTyrPheAla     AlaThrGluLysSer     AsnValValArgGly
TrpValPheGlySer    ThrMetAsnAsnLys     SerGlnSerValIle     IleIleAsnAsnSer
ThrAsnValValIle    ArgAlaCysAsnPhe     GluLeuCysAspAsn     ProPhePheAlaVal
SerLysProMetGly    ThrGlnThrHisThr     MetIlePheAspAsn     AlaPheAsnCysThr
PheGluTyrIleSer    AspAlaPheSerLeu    AspValSerGluLys    SerGlyAsnPheLys
HisLeuArgGluPhe    ValPheLysAsnLys    AspGlyPheLeuTyr    ValTyrLysGlyTyr
GlnProIleAspVal    ValArgAspLeuPro    SerGlyPheAsnThr    LeuLysProIlePhe
LysLeuProLeuGly    IleAsnIleThrAsn    PheArgAlaIleLeu    ThrAlaPheSerPro
AlaGlnAspThrTrp    GlyThrSerAlaAla    AlaTyrPheValGly    TyrLeuLysProThr
ThrPheMetLeuLys    TyrAspGluAsnGly    ThrIleThrAspAla    ValAspCysSerGln
AsnProLeuAlaGlu    LeuLysCysSerVal    LysSerPheGluIle    AspLysGlyIleTyr
GlnThrSerAsnPhe    ArgValValProSer    GlyAspValValArg    PheProAsnIleThr
AsnLeuCysProPhe    GlyGluValPheAsn    AlaThrLysPhePro    SerValTyrAlaTrp
GluArgLysLysIle    SerAsnCysValAla    AspTyrSerValLeu    TyrAsnSerThrPhe
PheSerThrPheLys    CysTyrGlyValSer    AlaThrLysLeuAsn    AspLeuCysPheSer
AsnValTyrAlaAsp    SerPheValValLys    GlyAspAspValArg    GlnIleAlaProGly
GlnThrGlyValIle    AlaAspTyrAsnTyr    LysLeuProAspAsp    PheMetGlyCysVal
LeuAlaTrpAsnThr    ArgAsnIleAspAla    ThrSerThrGlyAsn    TyrAsnTyrLysTyr
ArgTyrLeuArgHis    GlyLysLeuArgPro    PheGluArgAspIle    SerAsnValProPhe
SerProAspGlyLys    ProCysThrProPro    AlaLeuAsnCysTyr    TrpProLeuAsnAsp
TyrGlyPheTyrThr    ThrThrGlyIleGly    TyrGlnProTyrArg    ValValValLeuSer
PheGluLeuLeuAsn    AlaProAlaThrVal    CysGlyProLysLeu    SerThrAspLeuIle
LysAsnGlnCysVal    AsnPheAsnPheAsn    GlyLeuThrGlyThr    GlyValLeuThrPro
SerSerLysArgPhe    GlnProPheGlnGln    PheGlyArgAspVal    SerAspPheThrAsp
SerValArgAspPro    LysThrSerGluIle    LeuAspIleSerPro    CysSerPheGlyGly
ValSerValIleThr    ProGlyThrAsnAla    SerSerGluValAla    ValLeuTyrGlnAsp
ValAsnCysThrAsp    ValSerThrAlaIle    HisAlaAspGlnLeu    ThrProAlaTrpArg
IleTyrSerThrGly    AsnAsnValPheGln    ThrGlnAlaGlyCys    LeuIleGlyAlaGlu
HisValAspThrSer    TyrGluCysAspIle    ProIleGlyAlaGly    IleCysAlaSerTyr
HisThrValSerLeu    LeuArgSerThrSer    GlnLysSerIleVal    AlaTyrThrMetSer
LeuGlyAlaAspSer    SerIleAlaTyrSer    AsnAsnThrIleAla    IleProThrAsnPhe
SerIleSerIleThr    ThrGluValMetPro    ValSerMetAlaLys    ThrSerValAspCys
AsnMetTyrIleCys    GlyAspSerThrGlu    CysAlaAsnLeuLeu    LeuGlnTyrGlySer
PheCysThrGlnLeu    AsnArgAlaLeuSer    GlyIleAlaAlaGlu    GlnAspArgAsnThr
ArgGluValPheAla    GlnValLysGlnMet    TyrLysThrProThr    LeuLysTyrPheGly
GlyPheAsnPheSer    GlnIleLeuProAsp    ProLeuLysProThr    LysArgSerPheIle
GluAspLeuLeuPhe    AsnLysValThrLeu    AlaAspAlaGlyPhe    MetLysGlnTyrGly
GluCysLeuGlyAsp    IleAsnAlaArgAsp    LeuIleCysAlaGln    LysPheAsnGlyLeu
ThrValLeuProPro    LeuLeuThrAspAsp    MetIleAlaAlaTyr    ThrAlaAlaLeuVal
SerGlyThrAlaThr    AlaGlyTrpThrPhe    GlyAlaGlyAlaAla    LeuGlnIleProPhe
AlaMetGlnMetAla    TyrArgPheAsnGly    IleGlyValThrGln    AsnValLeuTyrGlu
AsnGlnLysGlnIle    AlaAsnGlnPheAsn    LysAlaIleSerGln    IleGlnGluSerLeu
ThrThrThrSerThr    AlaLeuGlyLysLeu    GlnAspValValAsn    GlnAsnAlaGlnAla
LeuAsnThrLeuVal    LysGlnLeuSerSer    AsnPheGlyAlaIle    SerSerValLeuAsn
AspIleLeuSerArg    LeuAspLysValGlu    AlaGluValGlnIle    AspArgLeuIleThr
GlyArgLeuGlnSer    LeuGlnThrTyrVal    ThrGlnGlnLeuIle    ArgAlaAlaGluIle
ArgAlaSerAlaAsn    LeuAlaAlaThrLys    MetSerGluCysVal    LeuGlyGlnSerLys
ArgValAspPheCys    GlyLysGlyTyrHis    LeuMetSerPhePro    GlnAlaAlaProHis
GlyValValPheLeu    HisValThrTyrVal    ProSerGlnGluArg    AsnPheThrThrAla
ProAlaIleCysHis    GluGlyLysAlaTyr    PheProArgGluGly    ValPheValPheAsn
GlyThrSerTrpPhe    IleThrGlnArgAsn    PhePheSerProGln    IleIleThrThrAsp
AsnThrPheValSer    GlyAsnCysAspVal    ValIleGlyIleIle    AsnAsnThrValTyr
AspProLeuGlnPro    GluLeuAspSerPhe    LysGluGluLeuAsp    LysTyrPheLysAsn
HisThrSerProAsp    ValAspLeuGlyAsp    IleSerGlyIleAsn    AlaSerValValAsn
IleGlnLysGluIle    AspArgLeuAsnGlu    ValAlaLysAsnLeu    AsnGluSerLeuIle
AspLeuGlnGluLeu    GlyLysTyrGluGln    TyrIleLysTrpPro    TrpTyrValTrpLeu
GlyPheIleAlaGly    LeuIleAlaIleVal    MetValThrIleLeu    LeuCysCysMetThr
SerCysCysSerCys    LeuLysGlyAlaCys    SerCysGlySerCys    CysLysPheAspGlu
AspAspSerGluPro ValLeuLysGly ValLysLeuHisTyr Thr
所述的SARS冠状病毒N蛋白的氨基酸序列为：
MetSerAspAsnGly    ProGlnSerAsnGln    ArgSerAlaProArg    IleThrPheGlyGly
ProThrAspSerThr    AspAsnAsnGlnAsn    GlyGlyArgAsnGly    AlaArgProLysGln
ArgArgProGlnGly    LeuProAsnAsnThr    AlaSerTrpPheThr    AlaLeuThrGlnHis
GlyLysGluGluLeu    ArgPheProArgGly    GlnGlyValProIle    AsnThrAsnSerGly
ProAspAspGlnIle    GlyTyrTyrArgArg    AlaThrArgArgVal    ArgGlyGlyAspGly
LysMetLysGluLeu    SerProArgTrpTyr    PheTyrTyrLeuGly    ThrGlyProGluAla
SerLeuProTyrGly    AlaAsnLysGluGly    IleValTrpValAla    ThrGluGlyAlaLeu
AsnThrProLysAsp    HisIleGlyThrArgAsn ProAsnAsnAsnAla    AlaThrValLeuGln
LeuProGlnGlyThr    ThrLeuProLysGly    PheTyrAlaGluGly    SerArgGlyGlySer
GlnAlaSerSerArg    SerSerSerArgSer    ArgGlyAsnSerArg    AsnSerThrProGly
SerSerArgGlyAsn    SerProAlaArgMet    AlaSerGlyGlyGly    GluThrAlaLeuAla
LeuLeuLeuLeuAsp    ArgLeuAsnGlnLeu    GluSerLysValSer    GlyLysGlyGlnGln
GlnGlnGlyGlnThr    ValThrLysLysSer    AlaAlaGluAlaSer    LysLysProArgGln
LysArgThrAlaThr    LysGlnTyrAsnVal    ThrGlnAlaPheGly    ArgArgGlyProGlu
GlnThrGlnGlyAsn    PheGlyAspGlnAsp    LeuIleArgGlnGly    ThrAspTyrLysHis
TrpProGlnIleAla    GlnPheAlaProSer    AlaSerAlaPhePhe    GlyMetSerArgIle
GlyMetGluValThr    ProSerGlyThrTrp    LeuThrTyrHisGly    AlaIleLysLeuAsp
AspLysAspProGln    PheLysAspAsnVal    IleLeuLeuAsnLys    HisIleAspAlaTyr
LysThrPheProPro    ThrGluProLysLys    AspLysLysLysLys    ThrAspGluAlaGln
ProLeuProGlnArg    GlnLysLysGlnPro    ThrValThrLeuLeu    ProAlaAlaAspMet
AspAspPheSerArg GlnLeuGlnAsnSer MetSerGlyAlaSer AlaAspSerThrGln Ala
所述的SARS冠状病毒M蛋白的氨基酸序列为：
MetAlaAspAsnGly    ThrIleThrValGlu    GluLeuLysGlnLeu    LeuGluGlnTrpAsn
LeuValIleGlyPhe    LeuPheLeuAlaTrp    IleMetLeuLeuGln    PheAlaTyrSerAsn
ArgAsnArgPheLeu    TyrIleIleLysLeu    ValPheLeuTrpLeu    LeuTrpProValThr
LeuAlaCysPheVal    LeuAlaAlaValTyr    ArgIleAsnTrpVal    ThrGlyGlyIleAla
IleAlaMetAlaCys    IleValGlyLeuMet    TrpLeuSerTyrPhe    ValAlaSerPheArg
LeuPheAlaArgThr    ArgSerMetTrpSer    PheAsnProGluThr    AsnIleLeuLeuAsn
ValProLeuArgGly    ThrIleValThrArg    ProLeuMetGluSer    GluLeuValIleGly
AlaValIleIleArg    GlyHisLeuArgMet    AlaGlyHisSerLeu    GlyArgCysAspIle
LysAspLeuProLys    GluIleThrValAla    ThrSerArgThrLeu    SerTyrTyrLysLeu
GlyAlaSerGlnArg    ValGlyThrAspSer    GlyPheAlaAlaTyr    AsnArgTyrArgIle
GlyAsnTyrLysLeu AsnThrAspHisAla GlySerAsnAspAsn IleAlaLeuLeuVal Gln
所述的SARS冠状病毒E蛋白的氨基酸序列为：
MetTyrSerPheVal    SerGluGluThrGly     ThrLeuIleValAsn    SerValLeuLeuPhe
LeuAlaPheValVal    PheLeuLeuValThr     LeuAlaIleLeuThr    AlaLeuArgLeuCys
AlaTyrCysCysAsn    IleValAsnValSer     LeuValLysProThr    ValTyrValTyrSer
ArgValLysAsnLeu AsnSerSerGluGly ValProAspLeuLeu Val
将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
本发明提供一种所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的用途。该免疫微球可以作为检测试剂检测抗(SARS)抗体，其检测方法如下：
将被测血清样品滴在洁净的玻片或透明塑料片上，加入本发明提供的用于检测SARS抗体的免疫微球，其中，偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白的免疫微球各占1/4，用竹签、牙签、塑料棒或其他物体搅拌，将待测样品和免疫微球混匀并呈圆斑状。
在黑色背景下，用肉眼或在显微镜下直接观察凝集反应，并用下列符号记录结果：
(-)无肉眼可见凝集颗粒；
(+)肉眼可见细的凝集颗粒，背景混浊；
(++)肉眼可见大的凝集颗粒，背景稍混浊；
(+++)肉眼可见大而清晰凝集颗粒，背景清楚；
(++++)肉眼可见大而清晰的凝集块，背景清楚。
也可进行半定量测定抗体滴度，将被测血清倍比稀释，按上法测定，以稀释度为抗体滴度。
SARS病是一种严重的传染性极强的烈性传染病，需要快速、准确地进行诊断。本发明提供的用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)抗体的免疫微球是将基因重组的SARS冠状病毒S，N，M，E蛋白通过化学方法偶联到(乳胶)聚苯乙烯微球上。该免疫微球与现有技术相比，其有益效果为：
第一，准确性高。因为使用的基因工程重组抗原，其纯度达到99％，为此，避免了PCR诊断试剂盒的假阳性的缺点；
第二，快速。整个检测过程仅需要数分钟，避免了酶联免疫诊断试剂盒需要数小时的费时的缺点；
第三，经济实用。检测不需要任何仪器设备，适合广大基层卫生防疫单位使用。
总之，该免疫微球能够快速检测血清抗SARS抗体，且敏感性和特异性均好。
附图说明
图1为免疫微球检测SARS抗体：左(阴性)，右(阳性)；
图2为免疫前、后兔血清与SARS CoV的基因重组蛋白免疫微球反应(40X)；其中：A.免疫前兔血清；B.免疫后兔血清；
图3为正常人和病人血清与SARS CoV基因重组蛋白免疫微球反应；其中：A.正常人血清(10X)；B.SARS病人血清(强反应(10X)；C.SARS病人血清(强反应40X)；D.SARS病人血清(1∶200稀释40X)。
具体实施方式
实施例1、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S蛋白的免疫微球的制备
SARS冠状病毒S蛋白抗原的制备及鉴定：
制备——用基因重组技术克隆、表达和纯化SARS冠状病毒S蛋白作为抗原：用RT-PCR方法扩增SARS冠状病毒S的基因片段，将该基因片段经测序证实基因序列正确无误后，再将其克隆到表达载体如原核表达载体pQE30，或酵母表达载体pPICZαA，然后进行表达和蛋白纯化。
鉴定——抗原纯化后，通过以下试验进行鉴定：
1)抗原蛋白含量测定：取抗原1毫升用分光光度计测其蛋白含量，在其260nm和280nm处分别测OD值后，用公式280nm Odx1.45-260nmODx0.74即可计算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；
2)抗原蛋白纯度测定：取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白电泳即SDS-PAGE电泳，结果显示为一条带。
3)酶联免疫试验(ELISA)：以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶标微孔板，置4℃20小时后，弃去抗原包被液，加入5％小牛血清以封闭未被抗原包被的部分，置37℃1小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后，加阳性病人血清，置37℃2小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后加入最适工作浓度HRP标记的羊抗人IgG 200微升，置室温2小时后，分别用PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤各3次，加入反应底物200微升，再495nm测定吸光度。
4)对照实验：用免疫微球10微升加入10微升抗体阳性血清和阴性血清，混匀后，阳性血清有凝集颗粒，阴性血清则无凝集。
免疫微球的制备：
1)将直径为200纳米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时，以12000转/分离心10分钟，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液；
2)向步骤1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚赖氨酸，置室温上下摇动12小时，用0.5M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时；用0.5M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液；
3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒S蛋白0.2mg/ml，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液；加入50微升0.25M乙酰胺封闭多聚赖氨酸上未被抗原结合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室温上下摇动30分，以13000转/分离心10分钟，分出固体；
4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液，置室温上下摇动30分，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S蛋白的免疫微球。
将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
实施例2、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒N蛋白的免疫微球的制备
SARS冠状病毒N蛋白抗原的制备及鉴定：
制备——用基因重组技术克隆、表达和纯化SARS冠状病毒N蛋白作为抗原：用RT-PCR方法扩增SARS冠状病毒N的基因片段，将该基因片段经测序证实基因序列正确无误后，再将其克隆到表达载体如原核表达载体pQE30，或酵母表达载体pPICZαA，然后进行表达和蛋白纯化。
鉴定——抗原纯化后，通过以下试验进行鉴定：
1)抗原蛋白含量测定：取抗原1毫升用分光光度计测其蛋白含量，在其260nm和280nm处分别测OD值后，用公式280nm Odx1.45-260nmODx0.74即可计算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；
2)抗原蛋白纯度测定：取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白电泳即SDS-PAGE电泳，结果显示为一条带。
3)酶联免疫试验(ELISA)：以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶标微孔板，置4℃20小时后，弃去抗原包被液，加入5％小牛血清以封闭未被抗原包被的部分，置37℃1小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后，加阳性病人血清，置37℃2小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后加入最适工作浓度HRP标记的羊抗人IgG 200微升，置室温2小时后，分别用PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤各3次，加入反应底物200微升，再495nm测定吸光度。
4)对照实验：用免疫微球10微升加入10微升抗体阳性血清和阴性血清，混匀后，阳性血清有凝集颗粒，阴性血清则无凝集。
免疫微球的制备：
1)将直径为200纳米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时，以12000转/分离心10分钟，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液；
2)向步骤1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚赖氨酸，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时；用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液；
3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒N蛋白0.2mg/ml，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液；加入50微升0.25M乙酰胺封闭多聚赖氨酸上未被抗原结合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室温上下摇动30分，以13000转/分离心10分钟，分出固体；
4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液，置室温上下摇动30分，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒N蛋白的免疫微球。
将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
实施例3、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒M蛋白的免疫微球的制备
SARS冠状病毒M蛋白抗原的制备及鉴定：
制备——用基因重组技术克隆、表达和纯化SARS冠状病毒M蛋白作为抗原：用RT-PCR方法扩增SARS冠状病毒M的基因片段，将该基因片段经测序证实基因序列正确无误后，再将其克隆到表达载体如原核表达载体pQE30，或酵母表达载体pPICZαA，然后进行表达和蛋白纯化。
鉴定——抗原纯化后，通过以下试验进行鉴定：
1)抗原蛋白含量测定：取抗原1毫升用分光光度计测其蛋白含量，在其260nm和280nm处分别测OD值后，用公式280nm Odx1.45-260nmODx0.74即可计算抗原的蛋白含量1mg/ml左右：
2)抗原蛋白纯度测定：取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白电泳即SDS-PAGE电泳，结果显示为一条带。
3)酶联免疫试验(ELISA)：以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶标微孔板，置4℃20小时后，弃去抗原包被液，加入5％小牛血清以封闭未被抗原包被的部分，置37℃1小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后，加阳性病人血清，置37℃2小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后加入最适工作浓度HRP标记的羊抗人IgG 200微升，置室温2小时后，分别用PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤各3次，加入反应底物200微升，再495nm测定吸光度。
4)对照实验：用免疫微球10微升加入10微升抗体阳性血清和阴性血清，混匀后，阳性血清有凝集颗粒，阴性血清则无凝集。
免疫微球的制备：
1)将直径为200纳米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时，以12000转/分离心10分钟，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液；
2)向步骤1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚赖氨酸，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时；用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液；
3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒M蛋白0.2mg/ml，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液；加入50微升0.25M乙酰胺封闭多聚赖氨酸上未被抗原结合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室温上下摇动30分，以13000转/分离心10分钟，分出固体；
4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液，置室温上下摇动30分，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒M蛋白的免疫微球。
将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
实施例4、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒E蛋白的免疫微球的制备
SARS冠状病毒E蛋白抗原的制备及鉴定：
制备——用基因重组技术克隆、表达和纯化SARS冠状病毒E蛋白作为抗原：用RT-PCR方法扩增SARS冠状病毒E的基因片段，将该基因片段经测序证实基因序列正确无误后，再将其克隆到表达载体如原核表达载体pQE30，或酵母表达载体pPICZαA，然后进行表达和蛋白纯化。
鉴定——抗原纯化后，通过以下试验进行鉴定：
1)抗原蛋白含量测定：取抗原1毫升用分光光度计测其蛋白含量，在其260nm和280nm处分别测OD值后，用公式280nm Odx1.45-260nmODx0.74即可计算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；
2)抗原蛋白纯度测定：取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白电泳即SDS-PAGE电泳，结果显示为一条带。
3)酶联免疫试验(ELISA)：以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶标微孔板，置4℃20小时后，弃去抗原包被液，加入5％小牛血清以封闭未被抗原包被的部分，置37℃1小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后，加阳性病人血清，置37℃2小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后加入最适工作浓度HRP标记的羊抗人IgG 200微升，置室温2小时后，分别用PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤各3次，加入反应底物200微升，再495nm测定吸光度。
4)对照实验：用免疫微球10微升加入10微升抗体阳性血清和阴性血清，混匀后，阳性血清有凝集颗粒，阴性血清则无凝集。
免疫微球的制备：
1)将直径为200纳米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时，以12000转/分离心10分钟，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液；
2)向步骤1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚赖氨酸，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时；用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液；
3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒E蛋白0.2mg/ml，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液；加入50微升0.25M乙酰胺封闭多聚赖氨酸上未被抗原结合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室温上下摇动30分，以13000转/分离心10分钟，分出固体；
4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH 7.5的碳酸盐缓冲液，置室温上下摇动30分，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒E蛋白的免疫微球。
将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
实施例5、用本发明提供的免疫微球检测试剂检测抗(SARS)抗体
实验方法：
将被测血清样品10微升滴在洁净的玻片或透明塑料片上，加入5微升本发明提供的用于检测SARS抗体的免疫微球，其中，实施例1～4制备的偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白的免疫微球各占1/4，用竹签、牙签、塑料棒或其他物体搅拌，将待测样品和免疫微球混匀并呈直径1厘米的圆斑状。
在黑色背景下，用肉眼或在显微镜下直接观察凝集反应，并用下列符号记录结果：
(-)无肉眼可见凝集颗粒；
(+)肉眼可见细的凝集颗粒，背景混浊；
(++)肉眼可见大的凝集颗粒，背景稍混浊；
(+++)肉眼可见大而清晰凝集颗粒，背景清楚；
(++++)肉眼可见大而清晰的凝集块，背景清楚。
实验样品：
1)正常兔血清和分别免疫SARS病毒的S、N、M、E蛋白兔血清；
2)正常人血清和SARS患者血清；
实验结果：
如图2所示，在40倍显微镜下观察，正常的兔血清与免疫微球呈阴性反应，可见均匀的微球颗粒；感染了SARS病毒的兔血清与免疫微球呈阳性反应，可见微球颗粒凝集呈块。
如图3所示，在10倍显微镜下观察，正常人的血清与免疫微球(SARS CoV基因重组蛋白免疫微球是偶联了SARS-S蛋白)呈阴性反应，可见均匀的微球颗粒；SARS病人的血清与免疫微球呈阳性反应，可见微球颗粒凝集呈块。
对SARS患者样品进行半定量测定抗体滴度，将被测血清倍比稀释，按上法测定，以稀释度为抗体滴度。观察结果见图3，其中，稀释度为200倍时，仍为阳性(如图1右图)，稀释度为1∶200时，呈阳性(如图1左图)，因此，该1∶200样品的抗体滴度(即稀释度)为1∶20。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院动物研究所
<120>一种用于检测SARS抗体的免疫微球及其制备方法和用途
<130>FPI04040
<150>CN 200410003420.1
<151>2004-02-25
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1255
<212>PRT
<213>corona virus
<400>1
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
            20                  25                  30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
        35                  40                  45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
    50                  55                  60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val
65                  70                  75                  80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
                85                  90                  95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
            100                 105                 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
        115                 120                 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
    130                 135                 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145                 150                 155                 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
                165                 170                 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
            180                 185                 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
        195                 200                 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
    210                 215                 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225                 230                 235                 240
Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
                245                 250                 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
            260                 265                 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
        275                 280                 285
Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
    290                 295                 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305                 310                 315                 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
                325                 330                 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
            340                 345                 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
        355                 360                 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
    370                 375                 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385                 390                 395                 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
                405                 410                 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
            420                 425                 430
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
        435                 440                 445
Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
    450                 455                 460
Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
                485                 490                 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
            500                 505                 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn
        515                 520                 525
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg
    530                 535                 540
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp
545                 550                 555                 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
                565                 570                 575
Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser
            580                 585                 590
Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr
        595                 600                 605
Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr
    610                 615                 620
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
625                 630                 635                 640
His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
                645                 650                 655
Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
            660                 665                 670
Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala
        675                 680                 685
Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile
    690                 695                 700
Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
705                 710                 715                 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu
                725                 730                 735
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
            740                 745                 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
        755                 760                 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
    770                 775                 780
Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile
785                 790                 795                 800
Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
                805                 810                 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
            820                 825                 830
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
        835                 840                 845
Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
    850                 855                 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
865                 870                 875                 880
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
                885                 890                 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
            900                 905                 910
Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
        915                 920                 925
Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
    930                 935                 940
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
945                 950                 955                 960
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
                965                 970                 975
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
            980                 985                 990
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
        995                 1000                1005
Thr Lys  Met Ser Glu Cys Val  Leu Gly Gln Ser Lys  Arg Val Asp
    1010                 1015                 1020
Phe Cys  Gly Lys Gly Tyr His  Leu Met Ser Phe Pro  Gln Ala Ala
    1025                 1030                 1035
Pro His  Gly Val Val Phe Leu  His Val Thr Tyr Val  Pro Ser Gln
    1040                 1045                 1050
Glu Arg  Asn Phe Thr Thr Ala  Pro Ala Ile Cys His  Glu Gly Lys
    1055                 1060                 1065
Ala Tyr  Phe Pro Arg Glu Gly  Val Phe Val Phe Asn  Gly Thr Ser
    1070                 1075                 1080
Trp Phe  Ile Thr Gln Arg Asn  Phe Phe Ser Pro Gln  Ile Ile Thr
    1085                 1090                 1095
Thr Asp  Asn Thr Phe Val Ser  Gly Asn Cys Asp Val  Val Ile Gly
    1100                 1105                 1110
Ile Ile  Asn Asn Thr Val Tyr  Asp Pro Leu Gln Pro  Glu Leu Asp
    1115                 1120                 1125
Ser Phe  Lys Glu Glu Leu Asp  Lys Tyr Phe Lys Asn  His Thr Ser
    1130                 1135                 1140
Pro Asp  Val Asp Leu Gly Asp  Ile Ser Gly Ile Asn  Ala Ser Val
    1145                 1150                 1155
Val Asn  Ile Gln Lys Glu Ile  Asp Arg Leu Asn Glu  Val Ala Lys
    1160                 1165                 1170
Asn Leu  Asn Glu Ser Leu Ile  Asp Leu Gln Glu Leu  Gly Lys Tyr
    1175                 1180                 1185
Glu Gln  Tyr Ile Lys Trp Pro  Trp Tyr Val Trp Leu  Gly Phe Ile
    1190                 1195                 1200
Ala Gly  Leu Ile Ala Ile Val  Met Val Thr Ile Leu  Leu Cys Cys
    1205                 1210                 1215
Met Thr  Ser Cys Cys Ser Cys  Leu Lys Gly Ala Cys  Ser Cys Gly
    1220                 1225                 1230
Ser Cys  Cys Lys Phe Asp Glu  Asp Asp Ser Glu Pro  Val Leu Lys
    1235                 1240                 1245
Gly Val  Lys Leu His Tyr Thr
    1250                 1255
<210>2
<211>422
<212>PRT
<213>corona virus
<400>2
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile
1               5                   10                  15
Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly
            20                  25                  30
Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn
        35                  40                  45
Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu
    50                  55                  60
Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly
65                  70                  75                  80
Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg
                85                  90                  95
Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr
            100                 105                 110
Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys
        115                 120                 125
Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys
    130                 135                 140
Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu
145                 150                 155                 160
Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly
                165                 170                 175
Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg
            180                 185                 190
Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro
        195                 200                 205
Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
    210                 215                 220
Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln
225                 230                 235                 240
Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser
                245                 250                 255
Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr
            260                 265                 270
Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly
        275                 280                 285
Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln
    290                 295                 300
lle Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg
305                 310                 315                 320
Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly
                325                 330                 335
Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile
            340                 345                 350
Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu
        355                 360                 365
Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro
    370                 375                 380
Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp
385                 390                 395                 400
Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser
                405                 410                 415
Ala Asp Ser Thr Gln Ala
            420
<210>3
<211>221
<212>PRT
<213>corona virus
<400>3
Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp Ile Met
            20                  25                  30
Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile
        35                  40                  45
Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe
    50                  55                  60
Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Ala Met Ala Cys Ile Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Val
                85                  90                  95
Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn
            100                 105                 110
Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg Gly Thr Ile Val
        115                 120                 125
Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Ile
    130                 135                 140
Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Ser Leu Gly Arg Cys Asp Ile
145                 150                 155                 160
Lys Asp Leu Pro Lys Glu I le Thr ValAla Thr Ser Arg Thr Leu Ser
                165                 170                 175
Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe
            180                 185                 190
Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp
        195                 200                 205
His Ala Gly Ser Asn Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
    210                 215                 220
<210>4
<211>76
<212>PRT
<213>corona virus
<400>4
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
1               5                   10                  15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
            20                  25                  30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
        35                  40                  45
Val Ser Leu Val Lys Pro Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
    50                  55                  60
Leu Asn Ser Ser Glu Gly Val Pro Asp Leu Leu Val
65                  70                  75

Claims (2)

1、 一种用于检测SARS抗体的免疫微球，其为以聚苯乙烯微球为内核，其表面的羧基通过多聚赖氨酸偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白，所述的聚苯乙烯微球为表面直径为200～900纳米，其表面有羧基修饰；
所述的SARS冠状病毒S蛋白的氨基酸序列为：
MetPheIlePheLeu    LeuPheLeuThrLeu    ThrSerGlySerAsp    LeuAspArgCysThr
ThrPheAspAspVal    GlnAlaProAsnTyr    ThrGlnHisThrSer    SerMetArgGlyVal
TyrTyrProAspGlu    IlePheArgSerAsp    ThrLeuTyrLeuThr    GlnAspLeuPheLeu
ProPheTyrSerAsn    ValThrGlyPheHis    ThrIleAsnHisThr    PheAspAsnProVal
IleProPheLysAsp    GlyIleTyrPheAla    AlaThrGluLysSer    AsnValValArgGly
TrpValPheGlySer    ThrMetAsnAsnLys    SerGlnSerValIle    IleIleAsnAsnSer
ThrAsnValValIle    ArgAlaCysAsnPhe    GluLeuCysAspAsn    ProPhePheAlaVal
SerLysProMetGly    ThrGlnThrHisThr    MetIlePheAspAsn    AlaPheAsnCysThr
PheGluTyrIleSer    AspAlaPheSerLeu    AspValSerGluLys    SerGlyAsnPheLys
HisLeuArgGluPhe    ValPheLysAsnLys    AspGlyPheLeuTyr    ValTyrLysGlyTyr
GlnProI leAspVal   ValArgAspLeuPro    SerGlyPheAsnThr    LeuLysProIlePhe
LysLeuProLeuGly    IleAsnIleThrAsn    PheArgAlaIleLeu    ThrAlaPheSerPro
AlaGlnAspThrTrp    GlyThrSerAlaAla    AlaTyrPheValGly    TyrLeuLysProThr
ThrPheMetLeuLys    TyrAspGluAsnGly    ThrIleThrAspAla    ValAspCysSerGln
AsnProLeuAlaGlu    LeuLysCysSerVal    LysSerPheGluIle    AspLysGlyIleTyr
GlnThrSerAsnPhe    ArgValValProSer    GlyAspValValArg    PheProAsnIleThr
AsnLeuCysProPhe    GlyGluValPheAsn    AlaThrLysPhePro    SerValTyrAlaTrp
GluArgLysLysIle    SerAsnCysValAla    AspTyrSerValLeu    TyrAsnSerThrPhe
PheSerThrPheLys    CysTyrGlyValSer    AlaThrLysLeuAsn    AspLeuCysPheSer
AsnValTyrAlaAsp    SerPheValValLys    GlyAspAspValArg    GlnIleAlaProGly
GlnThrGlyValIle    AlaAspTyrAsnTyr    LysLeuProAspAsp    PheMetGlyCysVal
LeuAlaTrpAsnThr    ArgAsnIleAspAla    ThrSerThrGlyAsn    TyrAsnTyrLysTyr
ArgTyrLeuArgHis    GlyLysLeuArgPro    PheGluArgAspIle    SerAsnValProPhe
SerProAspGlyLys    ProCysThrProPro    AlaLeuAsnCysTyr    TrpProLeuAsnAsp
TyrGlyPheTyrThr    ThrThrGlyIleGly    TyrGlnProTyrArg    ValValValLeuSer
PheGluLeuLeuAsn    AlaProAlaThrVal    CysGlyProLysLeu    SerThrAspLeuIle
LysAsnGlnCysVal    AsnPheAsnPheAsn    GlyLeuThrGlyThr    GlyValLeuThrPro
SerSerLysArgPhe    GlnProPheGlnGln    PheGlyArgAspVal    SerAspPheThrAsp
SerValArgAspPro    LysThrSerGluIle    LeuAspIleSerPro    CysSerPheGlyGly
ValSerValIleThr    ProGlyThrAsnAla    SerSerGluValAla    ValLeuTyrGlnAsp
ValAsnCysThrAsp    ValSerThrAlaIle    HisAlaAspGlnLeu    ThrProAlaTrpArg
IleTyrSerThrGly    AsnAsnValPheGln    ThrGlnAlaGlyCys    LeuIleGlyAlaGlu
HisValAspThrSer    TyrGluCysAspIle    ProIleGlyAlaGly    IleCysAlaSerTyr
HisThrValSerLeu    LeuArgSerThrSer    GlnLysSerIleVal    AlaTyrThrMetSer
LeuGlyAlaAspSer    SerIleAlaTyrSer    AsnAsnThrIleAla    IleProThrAsnPhe
SerIleSerIleThr    ThrGluValMetPro    ValSerMetAlaLys    ThrSerValAspCys
AsnMetTyrIleCys    GlyAspSerThrGlu    CysAlaAsnLeuLeu    LeuGlnTyrGlySer
PheCysThrGlnLeu    AsnArgAlaLeuSer    GlyIleAlaAlaGlu    GlnAspArgAsnThr
ArgGluValPheAla    GlnValLysGlnMet    TyrLysThrProThr    LeuLysTyrPheGly
GlyPheAsnPheSer    GlnIleLeuProAsp    ProLeuLysProThr    LysArgSerPheIle
GluAspLeuLeuPhe    AsnLysValThrLeu    AlaAspAlaGlyPhe    MetLysGlnTyrGly
GluCysLeuGlyAsp    IleAsnAlaArgAsp    LeuIleCysAlaGln    LysPheAsnGlyLeu
ThrValLeuProPro    LeuLeuThrAspAsp    MetIleAlaAlaTyr    ThrAlaAlaLeuVal
SerGlyThrAlaThr    AlaGlyTrpThrPhe    GlyAlaGlyAlaAla    LeuGlnIleProPhe
AlaMetGlnMetAla    TyrArgPheAsnGly    IleGlyValThrGln    AsnValLeuTyrGlu
AsnGlnLysGlnIle    AlaAsnGlnPheAsn    LysAlaIleSerGln    IleGlnGluSerLeu
ThrThrThrSerThr    AlaLeuGlyLysLeu    GlnAspValValAsn    GlnAsnAlaGlnAla
LeuAsnThrLeuVal    LysGlnLeuSerSer    AsnPheGlyAlaIle    SerSerValLeuAsn
AspIleLeuSerArg    LeuAspLysValGlu    AlaGluValGlnIle    AspArgLeuIleThr
GlyArgLeuGlnSer    LeuGlnThrTyrVal    ThrGlnGlnLeuIle    ArgAlaAlaGluIle
ArgAlaSerAlaAsn    LeuAlaAlaThrLys    MetSerGluCysVal    LeuGlyGlnSerLys
ArgValAspPheCys    GlyLysGlyTyrHis    LeuMetSerPhePro    GlnAlaAlaProHis
GlyValValPheLeu    HisValThrTyrVal    ProSerGlnGluArg    AsnPheThrThrAla
ProAlaIleCysHis    GluGlyLysAlaTyr    PheProArgGluGly    ValPheValPheAsn
GlyThrSerTrpPhe    IleThrGlnArgAsn    PhePheSerProGln    IleIleThrThrAsp
AsnThrPheValSer    GlyAsnCysAspVal    ValIleGlyIleIle    AsnAsnThrValTyr
AspProLeuGlnPro    GluLeuAspSerPhe    LysGluGluLeuAsp    LysTyrPheLysAsn
HisThrSerProAsp    ValAspLeuGlyAsp    IleSerGlyIleAsn    AlaSerValValAsn
IleGlnLysGluIle    AspArgLeuAsnGlu    ValAlaLysAsnLeu    AsnGluSerLeuIle
AspLeuGlnGluLeu    GlyLysTyrGluGln    TyrIleLysTrpPro    TrpTyrValTrpLeu
GlyPheIleAlaGly    LeuIleAlaIleVal    MetValThrIleLeu    LeuCysCysMetThr
SerCysCysSerCys    LeuLysGlyAlaCys    SerCysGlySerCys    CysLysPheAspGlu
AspAspSerGluPro ValLeuLysGly ValLysLeuHisTyr Thr
所述的SARS冠状病毒N蛋白的氨基酸序列为：
MetSerAspAsnGly    ProGlnSerAsnGln    ArgSerAlaProArg    IleThrPheGlyGly
ProThrAspSerThr    AspAsnAsnGlnAsn    GlyGlyArgAsnGly    AlaArgProLysGln
ArgArgProGlnGly    LeuProAsnAsnThr    AlaSerTrpPheThr    AlaLeuThrGlnHis
GlyLysGluGluLeu    ArgPheProArgGly    GlnGlyValProIle    AsnThrAsnSerGly
ProAspAspGlnIle    GlyTyrTyrArgArg    AlaThrArgArgVal    ArgGlyGlyAspGly
LysMetLysGluLeu    SerProArgTrpTyr    PheTyrTyrLeuGly    ThrGlyProGluAla
SerLeuProTyrGly    AlaAsnLysGluGly    IleValTrpValAla    ThrGluGlyAlaLeu
AsnThrProLysAsp    HisIleGlyThrArgAsn ProAsnAsnAsnAla    AlaThrValLeuGln
LeuProGlnGlyThr    ThrLeuProLysGly    PheTyrAlaGluGly    SerArgGlyGlySer
GlnAlaSerSerArg    SerSerSerArgSer    ArgGlyAsnSerArg    AsnSerThrProGly
SerSerArgGlyAsn    SerProAlaArgMet    AlaSerGlyGlyGly    GluThrAlaLeuAla
LeuLeuLeuLeuAsp    ArgLeuAsnGlnLeu    GluSerLysValSer    GlyLysGlyGlnGln
GlnGlnGlyGlnThr    ValThrLysLysSer    AlaAlaGluAlaSer    LysLysProArgGln
LysArgThrAlaThr    LysGlnTyrAsnVal    ThrGlnAlaPheGly    ArgArgGlyProGlu
GlnThrGlnGlyAsn    PheGlyAspGlnAsp    LeuIleArgGlnGly    ThrAspTyrLysHis
TrpProGlnIleAla    GlnPheAlaProSer    AlaSerAlaPhePhe    GlyMetSerArgIle
GlyMetGluValThr    ProSerGlyThrTrp    LeuThrTyrHisGly    AlaIleLysLeuAsp
AspLysAspProGln    PheLysAspAsnVal    IleLeuLeuAsnLys    HisIleAspAlaTyr
LysThrPheProPro    ThrGluProLysLys    AspLysLysLysLys    ThrAspGluAlaGln
ProLeuProGlnArg    GlnLysLysGlnPro    ThrValThrLeuLeu    ProAlaAlaAspMet
AspAspPheSerArg GlnLeuGlnAsnSer MetSerGlyAlaSer AlaAspSerThrGln Ala
所述的SARS冠状病毒M蛋白的氨基酸序列为：
MetAlaAspAsnGly    ThrIleThrValGlu    GluLeuLysGlnLeu    LeuGluGlnTrpAsn
LeuValIleGlyPhe    LeuPheLeuAlaTrp    IleMetLeuLeuGln    PheAlaTyrSerAsn
ArgAsnArgPheLeu    TyrIleIleLysLeu    ValPheLeuTrpLeu    LeuTrpProValThr
LeuAlaCysPheVal    LeuAlaAlaValTyr    ArgIleAsnTrpVal    ThrGlyGlyIleAla
IleAlaMetAlaCys    IleValGlyLeuMet    TrpLeuSerTyrPhe    ValAlaSerPheArg
LeuPheAlaArgThr    ArgSerMetTrpSer    PheAsnProGluThr    AsnIleLeuLeuAsn
ValProLeuArgGly    ThrIleValThrArg    ProLeuMetGluSer    GluLeuValIleGly
AlaValIleIleArg    GlyHisLeuArgMet    AlaGlyHisSerLeu    GlyArgCysAspIle
LysAspLeuProLys    GluIleThrValAla    ThrSerArgThrLeu    SerTyrTyrLysLeu
GlyAlaSerGlnArg    ValGlyThrAspSer    GlyPheAlaAlaTyr    AsnArgTyrArgIle
GlyAsnTyrLysLeu AsnThrAspHisAla GlySerAsnAspAsn IleAlaLeuLeuVal Gln
所述的SARS冠状病毒E蛋白的氨基酸序列为：
MetTyrSerPheVal    SerGluGluThrGly    ThrLeuIleValAsn    SerValLeuLeuPhe
LeuAlaPheValVal    PheLeuLeuValThr    LeuAlaIleLeuThr    AlaLeuArgLeuCys
AlaTyrCysCysAsn    IleValAsnValSer    LeuValLysProThr    ValTyrValTyrSer
ArgValLysAsnLeu AsnSerSerGluGly ValProAspLeuLeu Val。
2、 一种权利要求1所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的制备方法，是采用化学偶联法将SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白作为抗原偶联到微球，包括如下的步骤：
1)将聚苯乙烯微球15～20mg/ml，用0.1～0.5M的pH8，8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸缓冲液，然后加入2～4mg/ml的碳二亚胺，于室温反应完全后，离心，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤，重悬于0.01～0.05M的pH 7.5～8.5的碳酸盐缓冲液；所述的聚苯乙烯微球直径为200～900纳米，其表面有羧基修饰；
2)向步骤1)得到的混合液中加入0.2～2.4mg/ml的多聚赖氨酸，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸缓冲液，然后加入2～4mg/ml的碳二亚胺，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤，重悬于0.01～0.05M的pH 7.5～8.5的碳酸盐缓冲液；
3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白0.2～2.4mg/ml，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液；加入50～200微升0.25M乙酰胺，于室温反应完全后，离心分出固体；
4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.01～0.05M的pH 7.5～8.5的碳酸盐缓冲液，于室温反应完全后，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的免疫微球。
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