CN115698045A - 肽标签和结合配偶体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够通过自发形成异肽键而相互作用的肽标签和结合配偶体，还涉及相关的肽配对物和设计具有改进性质的肽标签、结合配偶体和肽配对物的方法。

Description

肽标签和结合配偶体
技术领域
本发明涉及能够通过自发形成异肽键而相互作用的肽标签(peptide tag)和结合配偶体(binding partner)，还涉及相关的肽配对物(peptide pair)和设计具有改进性质的肽标签、结合配偶体和肽配对物的方法。
发明背景
使用肽和肽样分子作为标签以连接蛋白和其他实体是分子生物学中的一个重要工具。此类肽标签可以允许检测、纯化和分析特定蛋白或实体，或者可以用于被标记的蛋白或实体的特异性靶向。它们还可用于产生纳米颗粒或病毒样颗粒，如例如WO 2016/112921中所述。
肽标签通常具有与结合配偶体结合的能力，可以使用重组DNA方法(例如，通过将编码肽标签的核苷酸序列与编码目标蛋白并表达蛋白产物的基因有效连接)将其连接至目标蛋白。如果结合配偶体是可检测的，例如是抗体或与可检测的实体缀合，则这种结合可以允许检测目标蛋白，或者如果结合配偶体是例如固定在固体支持物上，则这种结合可以允许纯化目标蛋白。或者，肽标签及其结合配偶体可用于在病毒样颗粒(VLP)或纳米颗粒表面展示目标分子，例如抗原。
因此，使用能够与结合配偶体结合的肽标签具有广泛的应用，并且可以提供用于操纵或分析靶蛋白或实体、用于产生可用于癌症免疫治疗的双特异性分子、用于CAR T细胞治疗或用于产生例如基于VLP的疫苗的手段。
已经描述了多种肽标签/结合配偶体系统，其提供了高亲和力或不可逆结合，并可用于上述应用。
特别可用的是其中的肽标签和结合配偶体通过异肽键相互作用的系统。此类配对物通过肽标签与其结合配偶体之间自发形成异肽键而具有稳定或不可逆的相互作用。
异肽键是在羧基/羧酰胺和氨基之间形成的酰胺键，其中羧基或氨基至少一个在蛋白主链(蛋白的骨架)之外。此类键在生物条件下是化学不可逆的，并且对大多数蛋白酶具有抗性。
发明内容
本发明如权利要求书所定义。
因此，本发明使用能够或易于形成自发的异肽键的蛋白以开发改进的肽标签/结合配偶体的配对物，它们彼此共价结合，从而产生改进的不可逆的相互作用。
在这个方面，能够自发形成异肽键的蛋白可以表达为单独的片段，以提供肽标签和肽标签的结合配偶体，其中所述两个片段能够通过形成异肽键而共价重构所述蛋白。这种通过异肽键而产生的共价反应使肽-蛋白相互作用在非共价相互作用会迅速解离的条件下变得稳定。
如下文详细讨论的，肽标签优选包含原始蛋白中参与异肽键的其中一个残基，结合配偶体优选包含原始蛋白中参与异肽键的另一个残基。因此，蛋白的编码序列可以被切割，以形成编码肽配对的标签和结合配偶体的片段。
本文提供了一种生产修饰的结合配偶体的方法，所述修饰的结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内包含的一个反应性残基和肽标签内包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而与所述肽标签结合，
所述方法包括以下步骤：
i)至少选择由第一肽标签与第一结合配偶体组成的第一肽配对物和由第二肽标签与第二结合配偶体组成的第二肽配对物，其中对于每个肽配对物，肽标签和结合配偶体都能够或怀疑能够通过自发形成异肽键而彼此结合；
ii)鉴定第一肽配对物和/或第二肽配对物的异肽键的位置，从而鉴定第一结合配偶体的第一反应性片段和/或第二结合配偶体的第二反应性片段，以及第一结合配偶体的第一残留片段和/或第二结合配偶体的第二残留片段；其中第一和/或第二反应性片段包含参与异肽键的反应性残基；
iii)设计修饰的结合配偶体，其中修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：i)第一反应性片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，以及第二残留片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，其中第一反应性片段优选位于所述第二残留片段的上游，其中修饰的结合配偶体不同时包含参与形成所述异肽键的两个反应性残基；
iv)生产修饰的结合配偶体。
本文还提供了可通过本文公开的方法获得的修饰的结合配偶体。
本文还提供了一种修饰的结合配偶体，其能够通过在所述修饰的结合配偶体中包含的一个反应性残基和肽标签中包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而与所述肽标签结合，其中修饰的结合配偶体不同时包含参与形成所述异肽键的两个反应性残基，并且其中修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：含有一个反应性残基的第一结合配偶体的第一反应性片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，所述第一结合配偶体能够与包含另一反应性残基的第一肽标签通过在反应性残基之间形成异肽键而相互作用，以及第二结合配偶体的第二残留片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，其中所述第二结合配偶体能够与包含另一反应性残基的第二肽标签通过在反应性残基之间形成异肽键而相互作用，其中第二残留片段不包含反应性残基，优选其中第一反应性片段位于第二残留片段的上游。
本文还提供了一种生产肽标签的方法，所述肽标签能够通过在所述肽标签内包含的一个反应性残基和结合配偶体内包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而与所述结合配偶体结合，优选其中所述结合配偶体是本文公开的修饰的结合配偶体，
所述方法包括以下步骤：
a)鉴定与参考肽标签具有至少60％相似性的候选肽标签，其中参考肽标签能够自发地与至少一个参考结合配偶体形成异肽键，优选其中参考肽标签包含参考结合基序；
b)从a)中鉴定的候选肽标签中选择肽标签，其中选择的肽标签包含至少一个可能参与异肽键形成的反应性残基；
c)从选择的肽标签中设计和生产肽标签，其中每个肽标签都包含以下或由以下组成：选择的肽标签的片段，其跨越可能参与形成异肽键的反应性残基的上游4至24个氨基酸至下游2至22个氨基酸，或与其具有至少70％同源性的其同源物，条件是该同源物包含反应性残基。
本文还提供了一种肽标签，其包含含有参与在所述肽标签和结合配偶体之间形成异肽键的至少一个反应性残基的蛋白的片段或由其组成，其中肽标签包含以下或由以下组成：所述蛋白的片段，其跨越反应性残基的上游4至24个氨基酸至下游2至22个氨基酸，或与其具有至少70％同源性的其同源物，条件是该同源物包含反应性残基，优选其中反应性残基是天冬酰胺或天冬氨酸。
本文还提供了一种生产肽配对物的方法，所述肽配对物包含修饰的结合配偶体和肽标签或由其组成，其中修饰的结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内包含的一个反应性残基和肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与所述肽标签结合，
所述方法包括以下步骤：
i)通过本文公开的方法生产修饰的结合配偶体；和/或
ii)通过本文公开的方法生产肽标签。
本文还提供了一种肽配对物，其包含前述项中任一项所定义的肽标签和本文所定义的修饰的结合配偶体或由其组成。
本文还提供了一种修饰的结合配偶体，其与参考结合配偶体相比具有一种或多种改进的性质，其中所述一种或多种改进的性质独立地选自以下一种或多种：
a)相对于参考结合配偶体与肽标签的结合，修饰的结合配偶体与所述肽标签的结合效力增加，其中所述修饰的结合配偶体和任选的所述参考结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内或所述参考结合配偶体内包含的一个反应性残基与所述肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与所述肽标签结合，其中增加的结合效力是总结合和结合速率中的至少一项；
b)当与参考结合配偶体在类似条件下形成颗粒的能力相比时，形成展示目标肽的颗粒的能力增强，例如展示目标肽的病毒样颗粒，例如病毒样颗粒，其中所述颗粒展示目标肽，其中所述颗粒包括与修饰的结合配偶体融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与修饰的结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在修饰的结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成；
c)当与参考结合配偶体在类似条件下展示目标肽的能力相比时，在颗粒如病毒样颗粒上展示目标肽的能力增强，其中所述颗粒包括与修饰的结合配偶体融合的颗粒形成蛋白如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与修饰的结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在修饰的结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
本文还提供了一种肽标签，其与参考肽标签相比具有一种或多种改进的性质，其中所述一种或多种改进的性质独立地选自一种或多种以下：
a)相对于参考肽标签与参考结合配偶体的结合，肽标签与所述参考结合配偶体的结合效力增加，其中所述肽标签和所述参考肽标签能够通过在所述肽标签内或所述参考肽标签内包含的一个反应性残基与所述参考结合配偶体内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与所述参考结合配偶体结合，其中如果总结合和结合速率中的至少一项增加，则结合效力增加；
b)当与参考肽标签在类似条件下形成颗粒的能力相比时，形成颗粒如病毒样颗粒的能力增强，其中所述颗粒展示目标肽，其中所述颗粒包括与参考结合配偶体融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与参考结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在参考结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成；
c)当与参考肽标签在类似条件下展示目标化合物的能力相比时，在颗粒如病毒样颗粒上展示目标化合物例如肽的能力增强，其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与结合配偶体融合的目标化合物，或者其中所述颗粒包括与结合配偶体融合的颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标化合物，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
本文还提供了一种肽配对物，其包含肽标签和结合配偶体或由肽标签和结合配偶体组成，其中与包含参考肽标签和参考结合配偶体的参考肽配对物相比，所述肽配对物具有一种或多种改进的性质，
其中结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内包含的一个反应性残基和所述肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与肽标签结合；
其中参考结合配偶体能够通过在所述参考结合配偶体内包含的一个反应性残基和所述参考肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与参考肽标签结合；
其中所述一种或多种改进的性质独立地选自以下一种或多种：
a)相对于参考结合配偶体与参考肽标签的结合，结合配偶体与肽标签的结合效力增加，其中如果总结合和结合速率中的至少一项增加，则结合效力增加；
b)当与参考肽配对物在类似条件下形成颗粒的能力相比时，形成展示目标肽的颗粒的能力增强，例如展示目标肽的病毒样颗粒，其中所述颗粒包括与结合配偶体融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标化合物，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的病毒样颗粒形成蛋白和与结合配偶体融合的目标化合物，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成；和/或
c)当与参考肽配对物在类似条件下展示目标肽的能力相比时，在颗粒如病毒样颗粒上展示目标化合物的能力增强，其中所述颗粒包括与结合配偶体融合的颗粒形成蛋白如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标化合物，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与结合配偶体融合的目标化合物，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
本文还公开了编码本文公开的修饰的结合配偶体和/或肽标签的多核苷酸。
还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。
还提供了表达本文公开的修饰的结合配偶体和/或本文公开的肽标签的宿主细胞。
还提供了一种组合物，其包含：
i)与本文所述的修饰的结合配偶体融合的蛋白，和与本文所述的肽标签融合的目标化合物，例如肽，如抗原；或
ii)与本文所述的肽标签融合的蛋白，和与本文所述的修饰的结合配偶体融合的目标化合物，例如肽，如抗原，
其中修饰的结合配偶体和肽标签能够通过自发形成异肽键而相互作用，并且
其中所述目标化合物和所述蛋白通过修饰的结合配偶体和肽标签之间的异肽键相连接。
还提供了一种制备本文公开的药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)获得第一多肽，所述第一多肽包含与蛋白融合的本文公开的修饰的结合配偶体或由其组成；和获得第二多肽，所述第二多肽包含与目标化合物融合的本文公开的肽标签或由其组成；或
获得第一多肽，所述第一多肽包含与蛋白融合的本文公开的肽标签或由其组成；和获得第二多肽，所述第二多肽包含与目标化合物融合的本文公开的修饰的结合配偶体或由其组成；
使第一多肽和第二多肽接触，从而允许在肽标签和修饰的结合配偶体之间形成异肽键；和产生如本文所公开的药物组合物。
附图说明
图1：将单独的捕手(catcher)结构域(即SdyCatcher(SdyC)、SpyCatcher(SpyC)、Mooncake和KatI)与单独的带标签的VLP(即SdyT-Ap205、SpyT-Ap205、RumTrunkTag-Ap205和RumTruckD9NTag-Ap205)混合，以获得对于每个结合配偶体5μM的终浓度。然后将这些混合样品的每一个在37℃下孵育1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟、1小时、1小时30分钟或3小时。孵育后，在含有DTT的SDS凝胶上运行单独的样品。基于密度测量法计算重构百分比。
图2A：将含有10μM单独的可溶性捕手结构域(Mooncake，KatI)或捕手-VLP(Mooncake-AP205、KaTI-AP205、SpyC-AP205)的溶液(PBS)以1:1的比例与含有10μM可溶性标签(RumtrunkD9NTag)的溶液混合(每个标签/捕手结合配偶体的终浓度＝5μM)。将这些混合样品在37℃下孵育1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟、1小时、1小时30分钟或3小时。孵育后，在含有DTT的SDS凝胶上运行样品。基于密度测量法计算重构百分比。
图3：该图显示了一个可能的实施方案，其利用自发的异肽键在颗粒例如病毒样颗粒表面展示目标化合物。能够形成颗粒的颗粒形成蛋白(黑线)与肽标签(黑圈)融合。目标化合物例如肽(深灰色滴状物)与结合配偶体(浅灰色，半圆形)融合。接触后，在肽标签和结合配偶体之间自发形成异肽键，这导致目标化合物被展示在颗粒表面上。
图4：对各小鼠组(n＝6)分别用等剂量(6mcg)的MoonCake-HER2病毒样颗粒(VLP)(LCG)、SpyCatcher-HER2 VLP(SPY)或PBS(对于PBS组，n＝5)进行初免-加强免疫。在每次免疫后两周获得血清，并通过ELISA测定抗原特异性IgM和IgG(亚类1、2a、2b和3)的水平。与SpyCatcher-HER2 VLP相比，用MoonCake-HER2 VLP免疫诱导了显著更高的抗原特异性的总Ig。
图5：对各小鼠组分别用等剂量(6mcg)的MoonCake-HER2 VLP或SpyCatcher-HER2VLP进行初免-加强免疫。在每次免疫后两周获得血清，并通过ELISA测定抗原特异性IgM和IgG(亚类1、2a、2b和3)的水平。与SpyCatcher-HER2 VLP相比，用MoonCake-HER2 VLP免疫诱导的IgM以及IgG2a和IgG2b显著更高。
发明详述
定义
本文中使用的术语“异肽键”是指羧基和氨基之间的酰胺键，其中羧基和氨基中至少一个不是来源于蛋白主链，或者被认为不是蛋白骨架的一部分。异肽键可以在单个蛋白内形成，也可以发生在两个肽之间或肽和蛋白之间。因此，异肽可以在分子内形成(单个蛋白内)，或在分子间形成，即在两个肽/蛋白分子之间形成。通常，异肽键可以在分子内在两个反应性氨基酸：赖氨酸和天冬酰胺或天冬氨酸之间发生。为了发生该过程，两个反应性氨基酸需要在疏水环境中非常靠近，通常包括芳香族残基。最后，催化性天冬氨酸或谷氨酸残基可以促进自催化过程，其本身不参与异肽键。
在分子间异肽键的情况下，该键通常在蛋白或肽链的赖氨酸残基和天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸残基或末端羧基之间发生，也可以在蛋白或肽链的α-氨基末端和天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸之间发生。参与异肽键的残基对中的每个残基在本文中称为反应性残基。因此，异肽键可在赖氨酸残基和天冬酰胺残基之间或赖氨酸残基和天冬氨酸残基之间形成。特别地，异肽键可以在赖氨酸的侧链胺和天冬酰胺的甲酰胺基团之间发生。
本文所讨论的肽标签和结合配偶体的配对物是指结合配偶体(肽/蛋白)和通过异肽键(优选自发的异肽键)与其结合的肽标签。肽标签和结合配偶体的配对物将通过异肽键彼此共价结合，因此优选地，肽标签包含参与一个用于设计结合配偶体的异肽键的反应性残基中的一个，并且结合配偶体包含参与该异肽键的另一反应性残基。这些术语常用于本领域中；有时用“捕手(catcher)”一词代替“结合配偶体”。
本文中使用的术语“自发的”是指可以在蛋白中或在肽或蛋白之间(例如在2个肽或肽与蛋白之间)形成的键，特别是异肽键，而不存在任何其他试剂(例如酶催化剂)和/或不存在蛋白或肽的化学修饰，例如不存在天然化学连接或化学偶联。因此，在不存在酶或其他外源物质或不存在化学修饰的情况下，自发的异肽键可以自行形成。然而，特别地，自发的异肽或共价键可需要在参与键的蛋白中或肽/蛋白之一中存在谷氨酸或天冬氨酸残基，以允许键的形成。
本文中的术语“结合性质”是指肽对另一肽的结合性质，例如本文定义的结合配偶体对肽标签的结合性质或反之亦然。在本公开的上下文中最相关的结合性质是总结合和结合速率。
术语“总结合(total binding)”(本文中与术语“重构率(reconstitution rate)”互换使用)是指与给定肽标签随时间形成异肽键的给定结合配偶体分子的百分比。可以如本领域已知的那样确定总结合，例如以等摩尔量混合结合配偶体和肽标签，然后如本领域中已知的那样测定由异肽键形成而产生的结合配偶体和肽标签复合物的量，例如在给定的时间点，并且相对于结合配偶体的起始量而表示。
术语“结合速率(binding rate)”是指给定结合配偶体和给定肽标签之间形成异肽键的速度或速率，随时间而变化。
术语“结合效力(binding efficacy)”是一个涵盖结合速率和总结合两者的通用术语。
本文中使用的术语“变体”是指母体分子的功能变体，例如蛋白如结合配偶体或肽标签的变体，其保留了与母体分子相同的功能。变体结合配偶体因此保留了与肽标签自发形成异肽键的能力；肽标签的变体因此保留了与结合配偶体自发形成异肽键的能力。根据本公开内容，应当理解的是，与给定序列具有至少70％同源性或同一性的变体可以与所述序列，例如结合配偶体或肽标签具有至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性或同一性。
本发明人已经开发了一种用于改善结合配偶体对肽标签且反之亦然的性质，特别是结合性质的方法。简言之，发明人已经发现，与起始结合配偶体和/或肽标签相比，此类修饰的结合配偶体和/或此类修饰的肽标签的一种或多种性质得到了改善。在例如实施例1中描述了如何设计此类修饰的结合配偶体的一般原理。
具有改进的性质的修饰的结合配偶体
生产修饰的结合配偶体的方法
本公开提供了一种生产修饰的结合配偶体的方法，所述修饰的结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内包含的一个反应性残基和肽标签内包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而与所述肽标签结合，所述方法包括以下步骤：
i)至少选择由第一肽标签与第一结合配偶体组成的第一肽配对物和由第二肽标签与第二结合配偶体组成的第二肽配对物，其中对于每个肽配对物，肽标签和结合配偶体能够或怀疑能够通过自发形成异肽键而彼此结合；
ii)鉴定第一肽配对物和/或第二肽配对物的异肽键的位置，从而鉴定第一结合配偶体的第一反应性片段和/或第二结合配偶体的第二反应性片段，以及第一结合配偶体的第一残留片段和/或第二结合配偶体的第二残留片段；其中第一和/或第二反应性片段包含参与异肽键的反应性残基；
iii)设计修饰的结合配偶体，其中修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：第一反应性片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，以及第二残留片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，其中第一反应性片段位于第二残留片段的上游，其中第二反应性片段位于第一残留片段的上游；并且其中修饰的结合配偶体不同时包含参与形成异肽键的两个反应性残基；
iv)生产修饰的结合配偶体。
在第一步中，选择两个肽配对物：由第一肽标签和第一结合配偶体组成的第一肽配对物，和由第二肽标签和第二结合配偶体组成的第二肽配对物。给定肽配对物的肽标签和结合配偶体能够(或怀疑能够)通过在肽标签和结合配偶体之间自发形成异肽键而相互结合。此类肽配对物是本领域已知的，并在下文中进一步描述。所述方法可应用于怀疑能够通过形成自发的异肽键而相互结合的肽或多肽。
对于每个肽配对物，在每个配对物内确定异肽键的位置(或假定的异肽键位置)。结合配偶体和肽标签中的每一个都包含参与异肽键的一个反应性残基。对于许多肽配对物，异肽键的位置是已知的，可以从文献中得出。在其他情况下，可以如本领域已知的那样确定可能参与形成异肽键的候选位置，例如通过序列挖掘、针对已知基序查询肽标签和/或结合配偶体的序列等。
鉴定异肽键的位置相当于鉴定参与异肽键的两个残基的位置。这两个残基中的其中一个存在于结合配偶体中，另一个存在于肽标签中。一旦在结合配偶体中确定了参与异肽键的残基的位置，就鉴定出包含该残基的片段；该片段在本文中也称为反应性片段。结合配偶体的剩余部分称为残留片段(residual fragment)。
因此，鉴定了第一结合配偶体的第一反应性片段，其包含一个参与第一异肽键的残基，而第一肽标签包含另一个残基；第一结合配偶体的剩余部分是第一残留片段。因此，鉴定了第二结合配偶体的第二反应性片段，其包含一个参与第二异肽键的残基，而第二肽标签包含另一个残基；第二结合配偶体的剩余部分是第二残留片段。第一异肽键是指第一结合配偶体和第一肽标签之间的异肽键；第二异肽键是指第二结合配偶体和第二肽标签之间的异肽键。
在所述方法的后续步骤中，设计了修饰的结合配偶体。该修饰的结合配偶体在一些实施方案中包括以下或由以下组成：
i)第一结合配偶体的第一反应性片段，或与其具有至少70％同源性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，以及
ii)第二结合配偶体的第二残留片段，或与其具有至少70％同源性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，
优选地，其中第一反应性片段位于第二残留片段的上游。
在最后一步中，产生修饰的结合配偶体。这例如如本领域已知的那样进行。
优选使用与修饰的结合配偶体具有最高同源性或同一性的结合配偶体作为参考，以确定修饰的结合配偶体是否具有改进的性质，如下文所述。在一些实施方案中，与第二结合配偶体相比，修饰的结合配偶体与第一结合配偶体具有更高的同源性、同一性或相似性，并且使用第一结合配偶体作为参考。在其他实施方案中，与第一结合配偶体相比，修饰的结合配偶体与第二结合配偶体具有更高的同源性，并且使用第二结合配偶体作为参考。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:1或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:3或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:9或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:13或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:15或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:17具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:17或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:19或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:23具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:23或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:25具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:25或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:27具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:27或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:29或与SEQ ID NO:29具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:29或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:30或与SEQ ID NO:30具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:30或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:31或与SEQ ID NO:31具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:31或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:37或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:39或与SEQ ID NO:39具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:39或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:41或与SEQ ID NO:41具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体为SEQ IDNO:41或所述其同源物。
结合性质
一旦通过本文描述的任何方法获得了修饰的结合配偶体，就可以确定其结合性质。因此，在一些实施方案中，所述方法还包括确定修饰的结合配偶体的一种或多种结合性质的步骤，其中所述一种或多种性质优选选自修饰的结合配偶体与第一肽标签、第二肽标签或第三肽标签中的一个或多个的i)总结合和ii)结合速率。确定第一结合配偶体和/或第二结合配偶体与第一肽标签、第二肽标签或第三肽标签中的一个或多个的对应的一种或多种结合性质，允许将修饰的结合配偶体和第一和/或第二结合配偶体与第一、第二或第三肽标签中的一个或多个的结合性质进行比较。总结合和结合速率中至少一项的增加表明结合效力增加或结合性质改进。
为了确定本公开的修饰的结合配偶体的结合性质，可能需要修饰的结合配偶体与其结合或预期与其结合的肽标签。该肽标签可以是第一肽配对物的第一肽标签，或第二肽配对物的第二肽标签，或者它可以是第三肽标签，如下文进一步描述的。
测定修饰的结合配偶体与第一、第二和第三肽标签中至少一个的结合速率相比于第一或第二结合配偶体中的至少一个与相同肽标签的结合速率增加则表明，修饰的结合配偶体具有增加的结合效力。优选地，测量修饰的结合配偶体与肽标签的结合速率，并将其与第一结合配偶体与相同肽标签的结合速率进行比较；在一些实施方案中，结合速率是修饰的结合配偶体或第一结合配偶体与第一肽标签的结合速率。
优选地，所述结合速率的增加是和第一和/或第二结合配偶体与相同肽标签的结合速率相比至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
在一些实施方案中，测量修饰的结合配偶体与第一肽标签的结合速率，并将其与第一结合配偶体与第一肽标签的结合速率进行比较。在其他实施方案中，测量修饰的结合配偶体与第二肽标签的结合速率。在其他实施方案中，测量修饰的结合配偶体与第三肽标签的结合速率。所述方法还可以包括测量修饰的配偶体与第一、第二或第三肽标签中的两个或全部的结合速率。优选地，至少测量修饰的结合配偶体与第一肽标签的结合速率，并将其与第一结合配偶体与第一肽标签的结合速率进行比较。
结合配偶体
可以用作本方法起始点的特定的结合配偶体，即，其可以是第一和/或第二结合配偶体，包括已知或怀疑能够与肽标签形成异肽键的结合配偶体。本文公开的特定的修饰的结合配偶体也可以用作起始点。
因此，第一和/或第二结合配偶体可以独立地选自SEQ ID NO:1(SpyCatcher)、SEQID NO:3(SdyCatcher)、SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
在一些实施方案中，第一结合配偶体，即使用本发明方法进行修饰或改进的结合配偶体是SEQ ID NO:1(SpyCatcher)、SEQ ID NO:3(SdyCatcher)、SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:33，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
在一些实施方案中，第二结合配偶体是SEQ ID NO:1(SpyCatcher)、SEQ ID NO:3(SdyCatcher)、SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
修饰的结合配偶体优选包括参与或怀疑参与与给定肽标签形成异肽键的一个反应性残基；所述肽标签包括另一活性残基。这表示修饰的结合配偶体优选包含第一结合配偶体的反应性残基——如果使用第一结合配偶体的同源物，它们优选仍包含该反应性残基。
优选地，存在于修饰的结合配偶体中且源自第一结合配偶体的反应性残基通常是赖氨酸残基，尽管在某些情况下它可以是天冬酰胺残基。优选地，肽标签中存在的反应性残基是天冬酰胺或天冬氨酸残基。这些残基共同形成异肽键。
不受理论的束缚，第三残基可参与异肽键的形成。虽然不直接参与键，但该第三残基可以介导键的形成。通常，第三残基是谷氨酸残基。修饰的结合配偶体优选包含该第三残基。换言之，第一结合配偶体的第一反应性片段优选包含该第三残基，其也存在于修饰的结合配偶体中。
通常，结合配偶体大于其相应的肽标签；至少当衍生自天然形成异肽键的蛋白时，结合配偶体相比于肽标签包含该蛋白的较大片段或部分或由该蛋白的较片段或部分组成。结合配偶体可以包含蛋白的与设计用以构成肽标签的片段重叠的片段，或可以包含蛋白的与肽标签的片段相比离散或分离的片段。
在一些实施方案中，结合配偶体(即第一结合配偶体、第二结合配偶体和/或修饰的结合配偶体)的长度为至少20个氨基酸。优选地，结合配偶体的长度为5个氨基酸或更长，例如10个氨基酸或更长，例如15个氨基酸或更长，例如20个氨基酸或更长，例如25个氨基酸，例如30个氨基酸，例如35个氨基酸，例如40个氨基酸，例如45个氨基酸，例如50个氨基酸，例如60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350个氨基酸或更长。在优选的实施方案中，修饰的结合配偶体的长度为至少20个氨基酸。优选地，结合配偶体的长度为5个氨基酸或更长，例如10个氨基酸或更长，例如15个氨基酸或更长，例如20个氨基酸或更长，例如25个氨基酸，例如30个氨基酸，例如35个氨基酸，例如40个氨基酸，例如45个氨基酸，例如50个氨基酸，例如60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350个氨基酸或更长。
本方法还可用于修饰怀疑参与与肽标签形成异肽键的肽。WO2011/098772详细描述了如何能够鉴定此类潜在的结合配偶体和肽标签，其中描述的方法可用于选择具有相应的第一和/或第二结合配偶体和肽标签的第一和第二肽配对物。
肽标签
本文中使用的术语“肽标签”通常是指可以直接设计自或衍生自天然形成分子内异肽键的蛋白的小肽片段。肽标签也可以通过使用已知的结合配偶体例如衍生自天然形成分子内异肽键的蛋白来筛选肽文库，而进行鉴定。
在一些实施方案中，用于在本发明方法中确定修饰的结合配偶体的结合性质的第一肽标签、第二肽标签和/或第三肽标签独立地选自SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:69(SnoopTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:50(PhoTag)、SEQ ID NO:52(EntTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
肽标签的长度可以为5-50个氨基酸之间，例如长度为10、20、30、40至50个氨基酸，并且可以通过异肽键与本文定义的结合配偶体共价结合。因此，如上文所述，肽标签可以包含用于设计结合配偶体的异肽蛋白中参与异肽键的一个反应性残基(并且结合配偶体可以包含参与该键的另一个反应性残基)。
可以改变肽标签，例如可以在第一、第二或第三肽标签中的任何一个、任何两个或任何三个中引入突变或改变。
如果使用天然形成分子内异肽键的蛋白直接设计肽标签，则肽标签可以(i)包含以下或由以下组成：长度为至少5个氨基酸的所述蛋白的片段，或与所述片段具有至少50％同一性，例如具有至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性的序列，并且(ii)长度小于50个氨基酸。肽标签可以包含以下或由以下组成：异肽蛋白的片段，该片段的长度为至少5个氨基酸，例如长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸。
如上所述，肽标签可以由少于50个氨基酸残基组成，例如由少于50、40、30、20或10个氨基酸残基组成。
特别地，肽标签可以由3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸残基组成。
如前所述，肽标签，即第一、第二或第三肽标签，应当能够通过异肽键自发地与相应的结合配偶体共价结合。在这个方面，肽标签优选包含异肽蛋白中参与形成异肽键的一个反应性氨基酸残基。因此，肽标签仅包含来自异肽键的一个反应性残基，而不同时包含所涉及的两个反应性残基。此外，如果肽标签被修饰或突变，则该片段中的反应性残基优选保持不变。这意味着当使用肽标签的同源物时，该同源物优选仍含有最初存在于肽标签中的反应性残基。
优选地，存在于肽标签中的反应性残基是天冬酰胺或天冬氨酸残基，其可与结合配偶体或修饰的结合配偶体的反应性残基形成异肽键，如上所述。
不受理论的束缚，第三残基可参与异肽键的形成。虽然不直接参与键，但该第三残基可以介导键的形成。通常，第三残基是谷氨酸残基。修饰的结合配偶体优选包含该第三残基。换言之，肽标签，即第一、第二或第三肽标签中的任何一个，优选不包含该第三残基，而是该第三残基存在于修饰的结合配偶体中。
在所述方法的一些实施方案中，所述方法包括确定修饰的结合配偶体对肽标签的一种或多种结合性质和将其与第一和/或第二结合配偶体对相同肽标签的结合性质进行比较，肽标签是(第一结合配对物的)第一肽标签或(第二结合配对物的)第二肽标签或不同于第一和第二肽标签的第三肽标签。
第三肽标签可以是已知的肽标签。它也可以是用计算机设计的肽标签。它也可以是肽文库中存在的肽，然后可以对其筛选出新的结合配对物——本发明的方法确实可以鉴定具有改进的结合性质的修饰的结合配偶体和候选肽标签。第三肽标签也可以根据下文“生产肽标签的方法”一节中描述的方法进行设计。
结合配对物
本文所述的方法尤其可用于鉴定具有改进的性质，特别是针对给定肽标签具有改进的结合性质的修饰的结合配偶体。优选地，本发明的方法用于改进结合配偶体(即第一结合配偶体)与其肽标签(即第一肽标签)的结合，从而获得改进的肽配对物。这里的术语“改进的性质”是指任何期望的性质，例如本文详述的结合速率或总结合，但也指对给定肽标签的修饰的特异性——在某些情况下，可能需要降低对一个肽标签的特异性，而对另一肽标签的特异性不变或增加。
可在本方法中用作待改进的起始肽配对物的合适肽配对物是例如：
a)SEQ ID NO:1(SpyCatcher)的结合配偶体和SEQ ID NO:5(SpyTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
b)SEQ ID NO:3(SdyCatcher)的结合配偶体和SEQ ID NO:7(SdyTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
c)SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)的结合配偶体和SEQ ID NO:69(SnoopTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
d)SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体和SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
e)SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体和SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
f)SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体和SEQ ID NO:46(RumTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
g)SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体和SEQ ID NO:46(RumTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
h)SEQ ID NO:29(PsCsCatcher)的结合配偶体和SEQ ID NO:75(PsCsTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
其中与结合配偶体或肽标签具有至少70％同源性或同一性的所述结合配偶体或肽标签的变体分别保持着与相应肽标签或结合配偶体形成异肽键的能力，并且与所述结合配偶体或肽标签具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性或同一性。
修饰的结合配偶体
本文还提供了可通过本文公开的方法获得的修饰的结合配偶体，和/或具有改进的性质的修饰的结合配偶体。
本文还提供了一种修饰的结合配偶体，其能够通过在所述修饰的结合配偶体中包含的一个反应性残基与肽标签中包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而与所述肽标签结合，其中修饰的结合配偶体不同时包含参与形成异肽键的两个反应性残基，并且其中修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：第一结合配偶体的第一反应性片段或与其具有例如至少70％同源性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，所述第一反应性片段包含一个反应性残基，所述反应性残基能够与包含另一反应性残基的第一肽标签通过在反应性残基之间形成异肽键而相互作用；以及第二结合配偶体的第二残留片段或与其具有例如至少70％同源性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，其中所述第二结合配偶体能够与包含另一反应性残基的第二肽标签通过在反应性残基之间形成异肽键而相互作用，其中第二残留片段不包含反应性残基，其中第一反应性片段优选位于第二残留片段的上游。
第一结合配偶体和第二结合配偶体可以如上文“结合配偶体”一节中所述。修饰的结合配偶体可以如本文中，尤其是“结合配偶体”一节中所述。
因此，在一些实施方案中，第一和/或第二结合配偶体，优选至少第一结合配偶体，可以独立地选自SEQ ID NO:1(SpyCatcher)、SEQ ID NO:3(SdyCatcher)、SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
其他相关的结合配偶体已描述在例如Kang等人，2007中。
修饰的结合配偶体优选包含参与或怀疑参与与给定肽标签形成异肽键的一个反应性残基；所述肽标签包含另一活性残基。这表示修饰的结合配偶体优选包含第一结合配偶体的反应性残基——如果使用第一结合配偶体的同源物，它们优选仍包含该反应性残基。
优选地，存在于修饰的结合配偶体中且源自第一结合配偶体的反应性残基通常是赖氨酸残基，尽管它在某些情况下可以是天冬酰胺残基。优选地，存在于肽标签中的反应性残基是天冬酰胺或天冬氨酸残基。这些残基共同形成了异肽键。
第一肽标签和第二肽标签可以如上文“肽标签”一节中所述。
在一些实施方案中，肽标签，即第一肽标签和/或第二肽标签，优选至少第一肽标签，独立地选自SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:69(SnoopTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:50(PhoTag)、SEQ IDNO:52(EntTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
如前文所述，肽标签优选包含异肽蛋白中参与形成异肽键的一个反应性氨基酸残基。因此，肽标签仅包含一个来自异肽键的反应性残基，而不同时包含所涉及的两个反应性残基。此外，如果肽标签被修饰或突变，则该片段中的反应性残基优选保持不变。这表示当使用肽标签的同源物时，该同源物优选仍含有最初存在于肽标签中的反应性残基。
使用上述方法，本发明人设计、生产并测试了数种具有改进的性质的修饰的结合配偶体，如下文实施例中所述。
这些标签可以通过突变或合理设计进一步改进。例如，标签可以通过突变反应性残基来进一步改进；例如，在反应性残基为D的肽标签中，将该残基突变为N可改进肽标签的性质，这可进一步改进肽标签的性质。这可导致对修饰的结合配偶体的特异性增加，有时还伴随着对第一或第二结合配偶体的特异性降低。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:37(QueenCatcher)、SEQ ID NO:39(MoonCake)或SEQ ID NO:41(KatI)，其片段或与其具有至少60％同源性或同一性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性或同一性的其同源物。
在一个实施方案中，修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:37或其片段或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:37中残基31(其为活性残基)的残基是未修饰的。
在一个实施方案中，修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:39或其片段或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:39中残基31(其为活性残基)的残基是未修饰的。
在一个实施方案中，修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:41或其片段或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:41中残基31(其为活性残基)的残基是未修饰的。
在一个实施方案中，修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29或其片段或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:29中残基8(其为活性残基)的残基是未修饰的。
在一个实施方案中，修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:9或其片段或与其具有至少60％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:9中残基117(其为活性残基)的残基是未修饰的。
如SEQ ID NO:37所示的修饰的结合配偶体从SEQ ID NO:3开始获得。SEQ ID NO:3中的反应性残基位于SEQ ID NO:3的位置31，并保留在修饰的结合配偶体中，所述修饰的结合配偶体包含SEQ ID NO:37或与其具有至少70％同一性或同源性的其同源物或由SEQ IDNO:37或与其具有至少70％同一性或同源性的其同源物组成。来自SEQ ID NO:3的第一反应性片段跨越SEQ ID NO:3的位置1至93。SEQ ID NO:37的修饰的结合配偶体进一步包含跨越SEQ ID NO:1的位置97至116的片段(残留片段)。SEQ ID NO:37中的反应性残基位于位置31。
如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41所示的修饰的结合配偶体均从SEQ ID NO:37开始获得。如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41所示的修饰的结合配偶体是通过计算机结构建模和合理设计进行设计的，在SEQ ID NO:37中引入了突变。SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41中的反应性残基位于这些序列的位置31。
在一个实施方案中，修饰的结合配偶体包含SEQ ID NO:29或其片段或同源物或由SEQ ID NO:29或其片段或同源物组成，条件是对应于SEQ ID NO:29中残基8(其为活性残基)的残基是未修饰的。
改进的性质
本文公开了如上文所述的用于修饰结合配偶体的方法以及修饰的结合配偶体。如果与参考结合配偶体相比，此类修饰的配偶体展现出改进的性质，那么它们就特别令人感兴趣。改进的性质可以是改进的结合性质，如下文详细描述的，或者它们可以是其他性质，例如对给定配偶体的改进的特异性，如上文详细描述的。例如，本文描述的或用本文描述的方法获得的修饰的结合配偶体可尤其适用于其他应用，例如与在颗粒上进行肽展示有关的应用，或可具有增加的稳定性。
因此，本公开还提供了一种与参考结合配偶体相比具有一种或多种改进的性质的修饰的结合配偶体，其中所述一种或多种改进的性质独立地选自以下一种或多种：
a)相对于参考结合配偶体与肽标签的结合，修饰的结合配偶体与所述肽标签的结合效力增加，其中所述修饰的结合配偶体和任选的所述参考结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内或所述参考结合配偶体内包含的一个反应性残基与所述肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与所述肽标签结合，其中增加的结合效力是总结合和结合速率中的至少一项；
b)当与参考结合配偶体在类似条件下形成颗粒的能力相比时，形成展示目标肽的颗粒例如展示目标肽的病毒样颗粒的能力增强，其中所述颗粒包括与修饰的结合配偶体融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与修饰的结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在修饰的结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成；
c)当与参考结合配偶体在类似条件下展示目标肽的能力相比时，在颗粒如病毒样颗粒上展示目标肽的能力增强，其中所述颗粒包括与修饰的结合配偶体融合的颗粒形成蛋白如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与修饰的结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在修饰的结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
术语“在类似条件下”在本文中指的是展示相同的目标肽的相同颗粒的形成，但其中展示是通过参考结合配偶体的融合而不是通过修饰的结合配偶体的融合获得的。
通常，修饰的结合配偶体的结合性质将至少在与第一结合配偶体(即含有一个反应性残基且该残基仍存在于修饰的结合配偶体中的结合配偶体)的结合性质相比得到改善。将修饰的结合配偶体的性质和与其具有最高同源性、相似性或同一性的结合配偶体(第一或第二)的性质进行比较也可能是有意义的。换言之，在整个本公开中，参考结合配偶体优选是第一或第二结合配偶体中与修饰的结合配偶体具有最大同源性、相似性或同一性的那个。因此，在优选的实施方案中，相较于与第二结合配偶体，修饰的结合配偶体与第一结合配偶体具有更高的同源性、相似性或同一性，则参考结合配偶体是第一结合配偶体；或者相较于与第一结合配偶体，修饰的结合配偶体与第二结合配偶体具有更高的同源性、相似性或同一性，则参考结合配偶体是第二结合配偶体。
然而，应当理解，如上文所述，与第三结合配偶体的结合性质相比，修饰的结合配偶体的结合性质也可以或可选地得到改善。
修饰的结合配偶体的结合性质可以根据与第一肽标签、第二肽标签或第三肽标签中的一个或多个的结合来确定，所述第一肽标签是能够通过异肽键的形成与第一结合配偶体相互作用的肽标签，所述第二肽标签是能够通过异肽键的形成与第二结合配偶体相互作用的肽标签，如上文“肽标签”一节中所述。
上文已经描述了改进的结合性质，并且通常是指与参考结合配偶体对参考肽标签的结合效力相比，修饰的结合配偶体对相同肽标签的结合效力增加，其中参考肽标签是第一肽标签、第二肽标签或第三肽标签，其中所述参考结合配偶体是第一或第二结合配偶体或能够与第三肽标签相互作用的结合配偶体。
因此，当参考结合配偶体与给定肽标签的结合相比时，本文公开的修饰的结合配偶体优选对相同肽标签具有增加的结合效力；增加的结合效力可以是修饰的结合配偶体对肽标签的增加的结合速率和/或增加的总结合。
在一些实施方案中，与参考结合配偶体相比，修饰的肽配偶体的结合速率增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。优选地，参考结合配偶体是修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的一个结合配偶体(第一或第二)，并且结合速率是根据结合配偶体与第一肽标签的结合来确定的。
在一些实施方案中，与参考结合配偶体相比，修饰的肽配偶体的总结合增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。优选地，参考结合配偶体是修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的一个结合配偶体(第一或第二)，并且总结合是根据结合配偶体与第一肽标签的结合来确定的。
在一些实施方案中，与参考结合配偶体相比，修饰的肽配偶体的结合速率增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多，并且与参考结合配偶体相比，修饰的肽配偶体的总结合增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。优选地，参考结合配偶体是修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的一个结合配偶体(第一或第二)，并且总结合是根据结合配偶体与第一肽标签的结合来确定的。
与参考结合配偶体相比可改进的修饰的结合配偶体的另一性质是形成展示目标肽的颗粒的能力。此类颗粒可以通过颗粒形成蛋白形成，如本领域已知的，例如但不仅是病毒样颗粒形成蛋白。通过将肽配对物的一个成员与这样的蛋白融合并将肽配对物的另一个成员与待被展示在颗粒上的肽融合，可以获得展示肽的颗粒；图3显示了一个这样的实施方案的一般原理。例如，颗粒形成蛋白与肽标签融合，并且待被展示的肽与相应的结合配偶体融合。肽标签与其结合配偶体之间自发形成异肽键能够使肽被展示在颗粒表面上。如WO2016/112921中详细描述的，该技术已用于产生展示抗原肽(例如与异常生理反应(如疾病)相关的肽)的病毒样颗粒(VLP)。衣壳蛋白是可用于产生此类VLP的合适颗粒形成蛋白的实例。例如，可以使用AP205、Qβ、MS2、HBc和噬菌体fr、P22、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)、噬菌体λ人腺病毒(AdV)、Vault颗粒(PDB:4V60)。本领域已知其他合适的蛋白，例如可以使用列于Lieknina等人，2019的表1中的蛋白。
在一些实施方案中，与从参考结合配偶体获得的免疫应答相比，当通过本方法获得的结合配偶体用于展示目标化合物如抗原时，例如在病毒样颗粒中或在如下所述的颗粒中时，则在施用于有此需要的受试者时能够导致增加的免疫应答。参考结合配偶体可以如本文别处所述。在一些实施方案中，参考结合配偶体是SpyCatcher(SEQ ID NO:1)。
因此，本文还公开了一种用于在有此需要的受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向受试者施用包含本文所述的或通过本文所述方法获得的结合配偶体的颗粒，例如病毒样颗粒，其中优选地，与施用包含参考结合配偶体但其他方面相同的颗粒如病毒样颗粒后获得的免疫应答相比，所述免疫应答增加，所述参考结合配偶体例如是本文所述的任何参考结合配偶体，特别是SpyCatcher(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，增加的免疫应答是增加的IgM应答和/或增加的IgG2应答，例如增加的IgG2a和/或IgG2b。在一些实施方案中，增加的免疫应答是增加的IgG1应答。在一些实施方案中，增加的免疫应答是增加的IgG3应答。优选地，IgM、IgG2a或IgG2b应答中的至少一种是增加的。
然而，所述方法通常适用于产生不是病毒样颗粒的颗粒，以展示目标化合物，例如肽。颗粒形成蛋白的其他此类实例包括：小热休克蛋白(HSP)(PDB:1SHS)、脱铁铁蛋白(PDB:1DAT)、丙酮酸脱氢酶多酶复合物(PDB:1EAA)、热聚体(Thermosome，THS)和i301(从来自超嗜热细菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的Entner–Doudoroff途径的2-酮-3-脱氧磷酸葡糖酸(KDPG)醛缩酶设计得到)。
根据本发明的方法，可以通过肽标签融合对可自组装成纳米颗粒的蛋白进行遗传修饰。然后，组装的纳米颗粒(即，展示反应性肽标签)可以与通过基因融合至结合配偶体的肽偶联，所述结合配偶体在与肽标签接触时能够通过异肽键与肽标签相互作用。
使用通过本文公开的方法获得或可获得的修饰的结合配偶体而获得的颗粒可以具有改进的性质，例如肽展示密度(即，有多少肽分子展示在颗粒表面上)、展示均匀性(即，肽在颗粒表面上的规则且均匀的间隔)以及展示抗原肽时的免疫原性。
在其他实施方案中，如果修饰的结合配偶体是可检测的，则修饰的结合配偶体可以用于检测目标化合物，尤其是目标蛋白，或者如果结合配偶体是例如被固定在固体支持物上，则可以允许纯化目标蛋白。
肽标签
生产肽标签的方法
本公开还提供了一种生产肽标签的方法，所述肽标签能够通过在所述肽标签内包含的一个反应性残基和结合配偶体内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与所述结合配偶体结合，所述方法包括以下步骤：
a)鉴定与参考肽标签具有至少60％相似性的候选肽标签，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性，其中参考肽标签能够自发地与至少一个参考结合配偶体形成异肽键；
b)从a)中鉴定的候选肽标签中选择肽标签，其中选择的肽标签包含至少一个可能参与异肽键形成的反应性残基；
c)从选择的肽标签设计和生产肽标签，其中每个肽标签包含以下或由以下组成：选择的肽标签的片段，其跨越参与形成异肽键的反应性残基的上游4至24个氨基酸至下游2至22个氨基酸，或与其具有至少70％同源性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，条件是该同源物包含反应性残基。
优选地，候选肽标签是肽配对物的一部分，并且候选物的发现是基于将肽配对物(其可以是由两个结构域即为肽标签和结合配偶体组成的单个蛋白，它们通过异肽键分子内相互作用或怀疑分子内相互作用)与已知肽配对物进行的比对。在一些实施方案中，肽标签与参考肽标签不具有至少60％相似性但却包含3、4、5、6、7、8个或更多氨基酸的部分，或除了与参考肽标签具有至少60％相似性以外还包含3、4、5、6、7、8个或更多氨基酸的部分，该部分包含反应性残基并与参考肽标签的一段氨基酸(例如3、4、5、6、7、8个氨基酸)具有至少60％的同源性、相似性或同一性。
在优选的实施方案中，结合配偶体是本文所述的修饰的结合配偶体，因此所述方法允许设计能够与本文所述的修饰的结合配偶体形成异肽键的肽标签。
在第一步中，鉴定候选肽标签。这可以通过鉴定怀疑是异肽蛋白的蛋白来完成，所述异肽蛋白即为其中两个结构域通过形成分子内异肽键而相互作用的蛋白。此类蛋白例如具有片段或结构域，通常是C末端片段或结构域，其与已知通过自发形成异肽键与至少一种参考结合配偶体相互作用的参考肽标签具有至少60％的相似性、同源性或同一性。因此，从已知的肽标签开始，可以鉴定候选蛋白，从候选蛋白可以鉴定候选肽标签。在整个本公开中，候选蛋白已知或至少怀疑包含可形成分子内或分子间异肽键的反应性残基。因此，候选肽标签和候选结合配偶体优选限于前文定义的候选蛋白的结构域。
候选肽标签可以来自可用于筛选候选肽标签的文库，例如肽文库。
然后选择包含至少一个参与或可能参与形成异肽键的反应性残基的候选肽标签。然后从所选肽标签设计肽标签。
在最后一步中设计的肽标签包含所选肽标签的片段或由所选肽标签的片段组成，该片段跨越从反应性残基的上游位置至反应性残基的下游位置。所述上游位置位于反应性残基的上游4至24个残基或氨基酸，所述下游位置位于反应性残基的下游2至22个氨基酸。
在一些实施方案中，上游位置位于反应性残基的上游4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个残基，下游位置位于反应性残基的下游2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个残基。
因此，在一些实施方案中，肽标签的长度可以是7至47个氨基酸，例如8至46个氨基酸、例如9至45个氨基酸、例如10至44个氨基酸、例如11至43个氨基酸、例如12至42个氨基酸、例如13至41个氨基酸、例如14至40个氨基酸、例如15至39个氨基酸、例如16至38个氨基酸、例如17至37个氨基酸、例如18至36个氨基酸、例如19至35个氨基酸、例如20至34个氨基酸、例如21至33个氨基酸、例如22至32个氨基酸、例如23至31个氨基酸、例如24至30个氨基酸、例如25至29个氨基酸、例如26至28个氨基酸、例如27个氨基酸的长度。在一些实施方案中，肽标签的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46个氨基酸。
如此设计并与其具有至少70％同源性的肽标签的同源物或片段也可以是有用的，条件是包含反应性残基。
一些已知的肽标签包含结合基序，本文称为参考结合基序或参考序列基序，其可用于鉴定候选肽标签。候选肽标签可以是肽标签(或蛋白)，其在其C末端区域内，例如在其C末端的50个氨基酸以内包含序列基序，例如参考序列基序。如果肽标签是“自由”肽即独立肽的形式，则术语“C末端”是指该肽的C末端。然而，如上文详述，肽标签可以是蛋白的一部分，在这种情况下，术语“C末端”是指所述蛋白中与肽标签相对应的结构域的C末端部分——因此，(肽标签的)所述C末端可以位于蛋白内部。
序列基序可以是已知作为或怀疑作为能够与结合配偶体形成异肽键的肽标签的特征的基序。例如，序列基序可以包含以下或由以下组成：如SEQ ID NO:73所示的GX1X2X3IVMX4DX5；如SEQ ID NO:74所示的GX1X2X3YVMX4DX5；如SEQ ID NO:43所示的GX1X2X3FVMX4DX5；或如SEQ ID NO:44所示的GX1X2X3WVMX4DX5；X1、X2、X3、X4和X5独立地选自任何氨基酸。
序列基序可以存在于候选肽标签中，或者它可以存在于蛋白中，例如具有分子内异肽键的异肽蛋白，然后候选肽标签可由此衍生，所述候选肽标签是所述蛋白的包含一个反应性残基的片段，如本文所述。因此，序列基序可以存在于所述蛋白或候选肽标签C末端的50个氨基酸以内，例如C末端的45、40、35、30或25个氨基酸以内。
所述方法还可以包括确定候选肽标签(或异肽蛋白)内异肽键的位置(或异肽链的假定位置)的步骤。根据上述方法选择用于设计肽标签的候选肽标签包括参与形成异肽键的两个反应性残基之一；两个反应性残基中的另一个存在于结合配偶体中。
最后，生产设计的肽标签。这例如如本领域已知的那样进行。
在优选的实施方案中，设计的肽标签能够通过自发形成异肽键而与本文所述的修饰的结合配偶体相互作用。
为了确定通过本方法获得的肽标签是否具有改进的性质，对其与参考结合配偶体的相互作用进行了研究。参考结合配偶体优选是已知与参考肽标签相互作用的结合配偶体。换句话说，为了确定通过本方法获得的肽标签是否具有改进的性质，优选将所述肽标签与参考结合配偶体的性质和参考肽标签与参考结合配偶体的的性质进行比较；上文“结合配对物”一节中描述了可适于用作参考的结合配对物。参考结合配偶体可以是本文描述的任何结合配偶体，尤其是关于第一结合配偶体和第二结合配偶体。在一些实施方案中，参考结合配偶体是如本文所述的修饰的结合配偶体。
在一些实施方案中，参考结合配偶体选自SEQ ID NO:1(SpyCatcher)、SEQ ID NO:3(SdyCatcher)、SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:71和SEQID NO:33，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。在一些实施方案中，参考结合配偶体是修饰的结合配偶体与其具有最大同源性、相似性或同一性的结合配偶体。
在一些实施方案中，参考肽标签选自SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:69(SnoopTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:50(PhoTag)、SEQ ID NO:52(EntTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:12(Bac5Tag)，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
可用于在本方法中确定通过上述方法设计和生产的肽标签是否具有改进的性质的参考肽配对物是例如：
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5；
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7；
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:69；
SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:39；
SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:41；
SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:39；
SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:41。
优选地，参考肽配对物选自SpyTag/SpyCatcher(分别为SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:1)和SdyTag/SdyCatcher(分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:3)。
结合性质
在通过本文所述的任何方法获得肽标签后，就可以测定其结合性质。因此，在一些实施方案中，所述方法还包括确定肽标签的一种或多种结合性质的步骤，其中所述一种或多种性质优选选自肽标签对参考结合配偶体，优选对修饰的结合配偶体的i)总结合和ii)结合速率。确定参考肽标签对相同结合配偶体(即参考结合配偶体，优选修饰的结合配偶体)的相应一种或多种结合性质允许比较肽标签对所述结合配偶体的结合性质。总结合和结合速率中的至少一项的增加表明，结合效力增加或结合性质改进。
与参考肽标签对参考结合配偶体的结合速率相比，测量到肽标签对所述参考结合配偶体的结合速率增加表明，肽标签具有增加的结合效力。优选地，测量肽标签对参考结合配偶体的结合速率，并将其与参考肽标签对相同结合配偶体的结合速率进行比较，其中参考肽标签和参考结合配偶体(即参考结合配对物)能够通过自发形成异肽键而相互作用；在一些实施方案中，结合速率是修饰的结合配偶体或第一结合配偶体对第一肽标签的结合速率。在一些实施方案中，参考肽标签是SpyTag(SEQ ID NO:5)或SdyTag(SEQ ID NO:7)，参考结合配偶体是SpyCatcher(SEQ ID NO:1)或SdyCatcher(SEQ ID NO:3)。
优选地，所述结合速率的增加为与对参考结合配对物测量的结合速率相比至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
在一些实施方案中，测量肽标签对参考结合配偶体的结合速率，并将其与参考肽标签对参考结合配偶体的结合速率进行比较。
结合配偶体
可在本方法中用作参考结合配偶体的特异性结合配偶体包括已知或怀疑能够与(参考)肽标签形成异肽键的结合配偶体。本文公开的特定的修饰的结合配偶体也可用作参考结合配偶体。
因此，参考结合配偶体可以选自SEQ ID NO:1(SpyCatcher)、SEQ ID NO:3(SdyCatcher)、SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。优选地，参考结合配偶体是SpyCatcher(SEQ ID NO:1)或SdyCatcher(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，可以测量通过本方法获得的肽标签与之结合的参考结合配偶体是SEQ ID NO:1(SpyCatcher)、SEQ ID NO:3(SdyCatcher)、SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:33，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
参考结合配偶体优选包括参与或怀疑参与与给定参考肽标签形成异肽键的一个反应性残基；通过上述方法产生的参考肽标签或肽标签包含另一个活性残基。反应性残基在上文已有讨论。参考结合配偶体优选是与修饰的结合配偶体具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体之一。因此，在优选的实施方案中，相较于与第二结合配偶体，修饰的结合配偶体与第一结合配偶体具有更高的同源性、相似性或同一性，则参考结合配偶体是第一结合配偶体；或者，相较于与第一结合配偶体，修饰的结合配偶体与第二结合配偶体具有更高的同源性、相似性或同一性，则参考结合配偶体是第二结合配偶体。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:1或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:1或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:3或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:3或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:9或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:9或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:13或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:13或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:15或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:15或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:17或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:17或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:19或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:19或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:23或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:23或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:25或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:25或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:27或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:27或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:29或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:29或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:30或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:30或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:31或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:31或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:37或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:37或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:39或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:39或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:41或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:41或所述其同源物。
在一些实施方案中，修饰的结合配偶体与其具有最高同源性、相似性或同一性的第一或第二结合配偶体是SEQ ID NO:71或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，并且参考结合配偶体是SEQ ID NO:71或所述其同源物。
肽标签
本文中使用的术语“肽标签”通常是指可以直接设计自或衍生自天然形成分子内异肽键的蛋白(此类蛋白在本文中称为“异肽蛋白”)的小肽片段。肽标签的鉴定也可以通过使用已知的结合配偶体，例如衍生自天然形成分子内异肽键的蛋白的结合配偶体筛选肽文库。
在一些实施方案中，用于确定通过本文所述方法设计的肽标签的结合性质的参考肽标签选自SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:69(SnoopTag)、SEQID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:50(PhoTag)、SEQ ID NO:52(EntTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。优选地，参考肽标签是SpyTag(SEQID NO:5)或SdyTag(SEQ ID NO:7)。
肽标签的长度可以为5-50个氨基酸，例如长度为10、20、30、40至50个氨基酸，并且可以通过异肽键与本文定义的结合配偶体共价结合。因此，如上文所述，肽标签可以包含用于设计结合配偶体的异肽蛋白中参与异肽键的一个反应性残基(并且结合配偶体可以包含参与该键的另一个反应性残基)。
如果使用天然形成分子内异肽键的蛋白直接设计肽标签，则肽标签可以(i)包含以下或由以下组成：长度为至少5个氨基酸的所述蛋白的片段，或与所述片段具有至少50％同一性的序列，例如具有至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性的序列，并且(ii)长度小于50个氨基酸。肽标签可以包含以下或由以下组成：异肽蛋白的片段，该片段的长度为至少5个氨基酸，例如长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸。
如上所述，肽标签可以由少于50个氨基酸残基组成，例如由少于50、40、30、20或10个氨基酸残基组成。
特别地，肽标签可以由3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸残基组成。
如前所述，肽标签，即参考肽标签或通过本文所述方法获得的肽标签，应当能够通过异肽键自发地与相应的结合配偶体共价结合。在这个方面，肽标签优选包含异肽蛋白中参与形成异肽键的一个反应性氨基酸残基。因此，肽标签仅包含一个来自异肽键的反应性残基，而不同时包含所涉及的两个反应性残基。此外，如果肽标签被修饰或突变，则该片段中的反应性残基优选保持不变。这意味着当使用肽标签的同源物时，该同源物优选仍含有最初存在于肽标签中的反应性残基。
结合配对物
本文所述的方法特别适用于鉴定具有改进的性质，尤其是对给定结合配偶体的改进结合性质的肽标签。优选地，本方法用于改进肽标签与参考结合配偶体(例如本文所述的修饰的结合配偶体之一)的结合，从而获得改进的肽配对物。
可在本方法中用作待改进的起始肽配对物的合适肽配对物是例如：
a)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5；
b)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7；
c)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:69；
d)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:39；
e)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:41；
f)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:39；
g)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:41；
或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体。
在一些实施方案中，起始肽配对物是：
a)SEQ ID NO:1(SpyCatcher)的结合配偶体和SEQ ID NO:5(SpyTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
b)SEQ ID NO:3(SdyCatcher)的结合配偶体和SEQ ID NO:7(SdyTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
c)SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)的结合配偶体和SEQ ID NO:69(SnoopTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
d)SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体和SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
e)SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体和SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
f)SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体和SEQ ID NO:46(RumTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
g)SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体和SEQ ID NO:46(RumTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
h)SEQ ID NO:29(PsCsPatcher)的结合配偶体和SEQ ID NO:75(PsCsTag)的肽标签，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
其中与结合配偶体或肽标签具有至少70％同源性或同一性的所述结合配偶体或肽标签的变体分别保持着与相应肽标签或结合配偶体形成异肽键的能力，并且与所述结合配偶体或肽标签具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性或同一性。
设计的肽标签
本文还提供了可通过本文公开的方法获得的肽标签和结合配偶体，和/或具有改进的性质的肽标签。
本文还提供了一种肽标签，其能够通过在所述参考结合配偶体中包含的一个反应性残基与所述肽标签中包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而结合参考结合配偶体，优选如本文所述的修饰的结合配偶体，其中参考结合配偶体和肽标签(或参考肽标签)均不同时包含参与异肽键形成的两个反应性残基。参考结合配偶体可以是上文所述的修饰的结合配偶体，特别是在“结合配偶体”和“生产修饰的结合配偶体的方法”一节中。
本文还提供了一种肽标签，其包含蛋白的片段或由蛋白的片段组成，所述蛋白的片段包含至少一个参与在所述肽标签和结合配偶体之间形成异肽键的反应性残基，其中肽标签包含以下或由以下组成：所述蛋白的片段，其跨越反应性残基的上游4至24个氨基酸至下游2至22个氨基酸，或与其具有至少70％同源性的其同源物，条件是该同源物包含反应性残基，优选其中反应性残基是天冬酰胺或天冬氨酸
肽标签可以包括如上文所述的结合基序。序列基序可以是已知作为或怀疑作为能够与结合配偶体形成异肽键的肽标签的特征的基序。例如，序列基序可以包含以下或由以下组成：如SEQ ID NO:73所示的GX1X2X3IVMX4DX5；如SEQ ID NO:74所示的GX1X2X3YVMX4DX5；如SEQ ID NO:43所示的GX1X2X3FVMX4DX5；或如SEQ ID NO:44所示的GX1X2X3WVMX4DX5；X1、X2、X3、X4和X5独立地选自任何氨基酸。
可用的肽标签包括但不限于选自以下的肽标签：SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ IDNO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:69(SnoopTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:75(PsCsTag)、SEQ ID NO:50(PhoTag)、SEQ ID NO:52(EntTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。在优选的实施方案中，肽标签选自：SEQ ID NO:46(RumTag)；SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)；SEQ ID NO:58(Rum2Tag)；SEQ ID NO:56(Rum3Tag)；SEQ ID NO:60(Rum4Tag)；SEQ ID NO:62(Rum5Tag)；SEQ ID NO:64(Rum6Tag)；SEQ ID NO:54(Rum7Tag)；SEQ ID NO:69(SnoopTag)；SEQ ID NO:66(BacTag)；SEQ ID NO:68(Bac2Tag)；SEQ ID NO:35(Bac3Tag)；SEQ ID NO:22(Bac4Tag)；SEQ ID NO:12(Bac5Tag)；和SEQ ID NO:75(PsCsTag)，以及与其具有至少60％同源性的其同源物。在更优选的实施方案中，肽标签选自SEQ ID NO:46(RumTag)和SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)或与其具有至少60％同源性的其同源物。
如前所述，肽标签优选包含异肽蛋白中参与异肽键形成的一个反应性氨基酸残基。因此，肽标签仅包含来自异肽键的一个反应性残基，而不同时包含所涉及的两个反应性残基。此外，如果肽标签被修饰或突变，则该片段中的反应性残基优选保持不变。这意味着当使用肽标签的同源物时，该同源物优选仍含有最初存在于肽标签中的反应性残基。
然而，如下文详述，发明人发现，对反应性残基进行突变可以有利地用于进一步改进设计的肽标签的性质。
使用上述方法，本发明人设计、生产和测试了数种具有改进的性质的肽标签，如以下实施例中所述。
在一些实施方案中，肽标签对结合配偶体或修饰的结合配偶体具有改进的结合性质，所述结合配偶体或修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:37(QueenCatcher)、SEQ ID NO:39(MoonCake)、SEQID NO:29(PsCsCatcher)或SEQ ID NO:41(KatI)，其片段或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。优选地，肽标签对包含以下或由以下组成的结合配偶体具有改进的结合性质：SEQ ID NO:37(QueenCatcher)、SEQ ID NO:39(MoonCake)或SEQ ID NO:41(KatI)或其片段或同源物。
在一个实施方案中，肽标签对包含SEQ ID NO:37(QueenCatcher)或其片段或同源物或由其组成的修饰的结合配偶体具有改进的结合性质，条件是对应于SEQ ID NO:37中残基31(其为活性残基)的残基未被修饰。
在另一个实施方案中，肽标签对包含SEQ ID NO:39(MoonCake)或其片段或同源物或由其组成的修饰的结合配偶体具有改进的结合性质，条件是对应于SEQ ID NO:39中残基31(其为活性残基)的残基未被修饰。该残基对应于SEQ ID NO:79中的残基35，SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:39相比含有源自克隆过程的4个残留的N末端氨基酸。
在另一个实施方案中，肽标签对包含SEQ ID NO:41(KatI)或其片段或同源物或由其组成的修饰的结合配偶体具有改进的结合性质，条件是对应于SEQ ID NO:41中残基31(其为活性残基)的残基未被修饰。该残基对应于SEQ ID NO:80中的残基35，SEQ ID NO:80与SEQ ID NO:41相比含有源自克隆过程的4个残留的N末端氨基酸。
在另一个实施方案中，肽标签对包含SEQ ID NO:29(PsCsCatcher)或其片段或同源物或由其组成的结合配偶体具有改进的结合性质，条件是对应于SEQ ID NO:29中残基8(其为活性残基)的残基未被修饰。
因此，本文还提供了如上文所述的修饰的结合配偶体，特别是如SEQ ID NO:39(MoonCake)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；如SEQ IDNO:41(KatI)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；如SEQ IDNO:37(QueenCatcher)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；如SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；如SEQ ID NO:29(PsCsCatcher)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；或如SEQ ID NO:37(QueenCatcher)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体。优选地，修饰的结合配偶体是如SEQ ID NO:39(MoonCake)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；如SEQ ID NO:41(KatI)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；或如SEQ ID NO:37(QueenCatcher)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体。
从SEQ ID NO:3开始获得如SEQ ID NO:37所示的修饰的结合配偶体。SEQ ID NO:3中的反应性残基位于SEQ ID NO:3的位置31，并保留在包含SEQ ID NO:37或与其具有至少70％同一性或同源性的其同源物或由其组成的修饰的结合配偶体中。来自SEQ ID NO:3的第一反应性片段跨越SEQ ID NO:3的位置1至93。SEQ ID NO:37的修饰的结合配偶体还包含跨越SEQ ID NO:1的位置97至116的片段(残留片段)。SEQ ID NO:37中的反应性残基位于位置31。
如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41所示的修饰的结合配偶体均从SEQ ID NO:37开始获得。如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41所示的修饰的结合配偶体是通过计算机结构建模和合理设计进行设计的，在SEQ ID NO:37中引入了突变。SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41中的反应性残基位于这些序列的位置31。
如SEQ ID NO:39(MoonCake)所示的结合配偶体，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体，可以自发地与选自以下的肽标签形成异肽键：SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体。在一个优选的实施方案中，如SEQ ID NO:39(MoonCake)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体可以自发地与如SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)所示的肽标签或与其具有70％同源性的其变体形成异肽键。在另一个实施方案中，如SEQ ID NO:39(MoonCake)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体可以自发地与如SEQ ID NO:46(RumTag)所示的肽标签或与其具有70％同源性的其变体形成异肽键。
如SEQ ID NO:41(KatI)所示的结合配偶体，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体，可以自发地与选自以下的肽标签形成异肽键：SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体。在一个优选的实施方案中，如SEQ ID NO:41(KatI)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体可以自发地与如SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)所示的肽标签或与其具有70％同源性的其变体形成异肽键。在另一个实施方案中，如SEQ ID NO:41(KatI)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体可以自发地与如SEQ IDNO:46(RumTag)所示的肽标签或与其具有70％同源性的其变体形成异肽键。
如SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)所示的结合配偶体，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体，可以自发地与如SEQ ID NO:69(SnoopTag)所示的肽标签或与其具有至少70％同源性的其变体形成异肽键。
如SEQ ID NO:37(QueenCatcher)所示的结合配偶体，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体，可以自发地与选自以下的肽标签形成异肽键：SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ IDNO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:12(Bac5Tag)和SEQ ID NO:76(Clib9)或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体。在一个优选的实施方案中，如SEQ ID NO:37(QueenCatcher)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体可以自发地与如SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)所示的肽标签或与其具有70％同源性的其变体形成异肽键。在另一个实施方案中，如SEQ ID NO:37(QueenCatcher)所示的结合配偶体或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体可以自发地与如SEQ ID NO:46(RumTag)所示的肽标签或与其具有70％同源性的其变体形成异肽键。
如SEQ ID NO:29(PsCsCatcher)所示的结合配偶体，或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体，可以自发地与如SEQ ID NO:75(PsCsTag)所示的肽标签或与其具有至少70％同源性的其变体形成异肽键。
改进肽标签性质的方法
通过本方法获得的任何标签都可以通过突变或合理设计进一步改进。例如，可以通过将反应性残基D突变为N来进一步改进标签。
因此，本文还提供了一种用于改进肽标签的性质，特别是通过本文公开的方法获得的肽标签的性质的方法。在一些实施方案中，用作起始点的肽标签包含反应性残基，该反应性残基仍存在于通过上述方法获得的肽标签中。突变该反应性残基可进一步改进肽标签的任何性质，如下文详述。在一些实施方案中，本文所述的设计肽标签的方法因此进一步包括突变所设计的肽标签的反应性残基的步骤。在一些实施方案中，反应性残基是D并且被突变为N。
因此，本文还提供了一种通过突变至少一个反应性残基来改进如上文所述的包含反应性残基的肽标签，特别是本文所述的任何肽标签的性质的方法。
改进的性质
如果与参考肽标签相比，本文所述的肽标签显示出改进的性质，或者如果与参考肽标签相比，它们显示出与给定结合配偶体的改进的结合，那么它们是特别令人感兴趣的。改进的性质可以是改进的结合性质，如上文和下文所详述，或者它们可以是其他性质。例如，本文所述的肽标签或用本文所述的方法获得的肽标签可特别适用于其他应用，例如与在颗粒上进行肽展示有关的应用。
因此，本公开还提供了与参考肽标签相比具有一种或多种改进的性质的肽标签，其中所述一种或多种改进的性质独立地选自：
a)相对于参考肽标签与参考结合配偶体的结合，所述肽标签与所述参考结合配偶体，尤其是修饰的结合配偶体的结合效力增加，其中所述肽标签和任选地所述参考肽标签能够通过在所述参考结合配偶体内包含的一个反应性残基与所述肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与所述参考结合配偶体结合，其中结合效力增加是总结合和结合速率中的至少一项；
b)当与参考肽标签在类似条件下形成颗粒的能力相比时，形成展示目标肽的颗粒，例如展示目标肽的病毒样颗粒的能力增强，其中所述颗粒包括与参考结合配偶体融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与参考结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在参考结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成；
c)当与参考肽标签在类似条件下展示目标肽的能力相比时，在颗粒如病毒样颗粒上展示目标肽的能力增强，其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与参考结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在参考结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
肽标签的结合性质可以根据与一个或多个参考结合配偶体的结合来确定。参考肽标签可以如上文所述。在一些实施方案中，肽标签是通过进一步修饰通过本文公开的方法获得的肽标签来获得的，例如通过突变反应性残基，在这种情况下，将其性质与仍包含原始反应性残基的肽标签进行比较可能是有利的。优选使用与修饰的结合配偶体具有最高同源性或同一性的结合配偶体作为参考，以确定修饰的结合配偶体是否具有改进的性质，如下文所述。在一些实施方案中，相较于与第二结合配偶体，修饰的结合配偶体与第一结合配偶体具有更高的同源性、同一性或相似性，并且第一结合配偶体用作参考。在其他实施方案中，相较于与第一结合配偶体，修饰的结合配偶体与第二结合配偶体具有更高的同源性、同一性或相似性，并且第二结合配偶体用作参考。
上文已经描述了改进的结合性质，并且通常是指结合配偶体和肽标签之间的增加的结合效力。
因此，当比较参考肽标签和给定结合配偶体的结合时，本文公开的肽标签优选对相同结合配偶体具有增加的结合效力；增加的结合效力可以是增加的结合速率和/或增加的总结合。
在一些实施方案中，肽标签的结合速率与参考肽标签相比增加了至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
在一些实施方案中，肽标签的总结合与参考肽标签相比增加了至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
在一些实施方案中，结合速率与参考肽标签相比增加了至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多，并且，肽标签的总结合与参考肽标签相比增加了至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
与参考肽标签相比，肽标签可以改进的另一性质是形成显示目标肽的颗粒的能力。如本领域已知的，此类颗粒可以通过颗粒形成蛋白形成，例如但不仅是病毒样颗粒形成蛋白，并且可以利用结合配对物的优势，所述结合配对物包含针对如上文“改进的性质”一节中所述的修饰的结合配偶体的通过本方法获得的肽标签。
在一些实施方案中，与从使用参考肽标签的颗粒获得的免疫应答相比，当通过本方法获得的肽标签用于展示目标化合物例如抗原时，例如在病毒样颗粒中或在如下所述的颗粒中时，在施用于有此需要的受试者时会引起增加的免疫应答。
因此，本文还公开了一种用于在有此需要的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用包含本文所述或通过本文所述方法获得的肽标签的颗粒，例如病毒样颗粒，其中优选地，免疫应答与施用包含参考肽标签(如本文所述的任何参考肽标签)但其他方面相同的颗粒如病毒样颗粒后获得的免疫应答相比是增加的。
在一些实施方案中，增加的免疫应答是增加的IgM应答和/或增加的IgG2应答，例如增加的IgG2a和/或IgG2b。在一些实施方案中，增加的免疫应答是增加的IgG1应答。在一些实施方案中，增加的免疫应答是增加的IgG3应答。优选地，IgM、IgG2a或IgG2b应答中的至少一种是增加的。
在一些实施方案中，参考肽标签是SpyTag(SEQ ID NO:5)或SdyTag(SEQ ID NO:7)，并且改进的结合性质分别与结合相应的结合配偶体，即SpyCatcher(SEQ ID NO:1)或SdyCatcher(SEQ ID NO:3)有关。
使用通过本文公开的方法获得或可获得的肽标签由此获得的颗粒可以具有改进的性质，例如肽展示密度(即，有多少肽分子展示在颗粒表面上)、展示均匀性(即，肽在颗粒表面上的规则且均匀的间隔)以及展示抗原肽时的免疫原性。
肽配对物
本文还提供了一种生产包含修饰的结合配偶体和肽标签或由其组成的肽配对物的方法，其中修饰的结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内包含的一个反应性残基与所述肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与肽标签结合，
所述方法包括以下步骤：
i)通过本文所述的任何方法生产修饰的结合配偶体；和/或
ii)通过本文所述的任何方法生产肽标签。
由此可以获得由结合配偶体和肽标签组成的以下肽配对物，所述结合配偶体和肽标签能够通过自发形成异肽键相互作用：
·已知的结合配偶体，与通过上述任何方法设计和获得的肽标签；
·通过任何上述方法设计并获得的修饰的结合配偶体，与已知的肽标签；
·通过上述任何方法设计和获得的修饰的结合配偶体，与通过上述任何方法设计和获得的肽标签。
结合配偶体和肽标签可以是本文所述的任何结合配偶体和肽标签。
因此，本方法可用于鉴定肽配对物，其优选与已知肽配对物相比具有改进的性质。特别地，与包含相同结合配偶体的肽配对物(在包含已知结合配偶体的配对物的情况下)，或在包含修饰的结合配偶体的配对物的情况下，与包含用作起始点的结合配偶体(第一结合配偶体)和相同肽标签的肽配对物的性质相比，由本方法获得的肽配对物的性质可以得到改进。
因此，本文还提供了一种肽配对物，其包含肽标签和结合配偶体或由肽标签和结合配偶体组成，其中与包含参考肽标签和参考结合配偶体的参考肽配对物相比，所述肽配对物具有一种或多种改进的性质，
其中结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内包含的一个反应性残基和所述肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与肽标签结合；
其中参考结合配偶体能够通过在所述参考结合配偶体内包含的一个反应性残基和所述参考肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与参考肽标签结合；
其中所述一种或多种改进的性质独立地选自以下一种或多种：
a)相对于参考结合配偶体与参考肽标签的结合，结合配偶体与肽标签的结合效力增加，其中如果总结合和结合速率中的至少一项增加，则结合效力增加；
b)当与参考肽配对物在类似条件下形成颗粒的能力相比时，形成展示目标肽的颗粒，例如展示目标肽的病毒样颗粒的能力增强，其中所述颗粒包括与结合配偶体融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的病毒蛋白和与结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成；和
c)当与参考肽配对物在类似条件下展示目标肽的能力相比时，在颗粒如病毒样颗粒上展示目标肽的能力增强，其中所述颗粒包括如与结合配偶体融合的颗粒形成蛋白病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
在一些实施方案中，结合配偶体是如上所述的修饰的结合配偶体。优选使用与修饰的结合配偶体具有最高同源性或同一性的结合配偶体作为参考，以确定修饰的结合配偶体是否具有改进的性质，如下文所述。在一些实施方案中，相较于与第二结合配偶体，修饰的结合配偶体与第一结合配偶体具有更高的同源性、同一性或相似性，并且第一结合配偶体用作参考。在其他实施方案中，相较于与第一结合配偶体，修饰的结合配偶体与第二结合配偶体具有更高的同源性、同一性或相似性，并且第二结合配偶体用作参考。
在一些实施方案中，其中修饰的结合配偶体包括如上文所定义的第一结合配偶体的第一反应性片段和第二结合配偶体的第二残留片段或由其组成，则参考结合配偶体优选是第二结合配偶体。
在一些实施方案中，其中修饰的结合配偶体包括如上文所定义的第二结合配偶体的第二反应性片段和第一结合配偶体的第一残留片段或由其组成，则参考结合配偶体优选是第一结合配偶体。
参考结合配偶体优选是第一或第二结合配偶体中与修饰的结合配偶体具有最高同源性、相似性或同一性的那个。因此，在优选地实施方案中，相较于与第二结合配偶体，修饰的结合配偶体与第一结合配偶体具有更高的同源性、相似性或同一性，并且参考结合配偶体是第一结合配偶体；或者相较于与第一结合配偶体，修饰的结合配偶体与第二结合配偶体具有更高的同源性、相似性或同一性，并且参考结合配偶体是第二结合配偶体。
在一些实施方案中，肽配对物选自：
a)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:69；
b)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:39；
c)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:41；
d)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:39；和
e)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:41。
在一些实施方案中，肽配对物包含以下或由以下组成：
a)SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体和选自SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)的肽标签；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
b)SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体和选自SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)的肽标签；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
c)SEQ ID NO:37(QueenCatcher)的结合配偶体和选自SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:12(Bac5Tag)和SEQ ID NO:76(Clib9)的肽标签；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体，
其中与所述结合配偶体或肽标签具有至少70％同源性或同一性的结合配偶体的变体或肽标签的变体是保持分别与相应肽标签或结合配偶体形成异肽键的能力的功能性变体，并且与所述结合配偶体或肽标签具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性或同一性。
结合效力
本文所述或通过本文所述方法可获得的肽标签、修饰的结合配偶体和结合肽配对物优选地与参考相比具有一种或多种改进的性质。
一个这样的感兴趣的性质是结合效力：如上所述，可通过本方法获得的肽标签和结合配偶体优选具有增加的结合效力。本文所述的肽配对物还可以具有增加的结合效力，即与参考肽配对物相比，肽配对物和肽配对物的结合配偶体的总结合和结合速率中的至少一项增加。参考肽配对物优选包含相同的肽标签或相同的结合配偶体。因此，参考肽配对物是包含与修饰的结合配偶体具有最高同源性的结合配偶体(第一或第二结合配偶体)的配对物。因此，在优选地实施方案中，相较于与第二结合配偶体，修饰的结合配偶体与第一结合配偶体的同源性更高，并且参考结合配偶体是第一结合配偶体；或者相较于与第一结合配偶体，修饰的结合配偶体与第二结合配偶体的同源性更高，并且参考结合配偶体是第二结合配偶体。
在一些实施方案中，肽配对物的结合速率与参考肽配对物相比增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
在一些实施方案中，肽配对物的总结合与肽配对物相比增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
在一些实施方案中，肽配对物的结合速率与参考肽配对物相比增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多，并且修饰的肽配对物的总结合与参考肽配对物相比增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
颗粒形成
可选地或另外，当与参考肽配对物在类似条件下形成颗粒的能力相比时，本文所述的肽配对物还可以具有增强的形成展示目标肽的颗粒，例如展示目标肽的病毒样颗粒的能力，其中所述颗粒包括融合或缀合至结合配偶体的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和融合至肽标签的目标化合物，或者其中所述颗粒包括融合或缀合至肽标签的病毒样颗粒形成蛋白和融合至结合配偶体的目标化合物，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
如本领域已知的，此类颗粒可以通过颗粒形成蛋白而形成，例如但不仅是病毒样颗粒形成蛋白。通过将肽配对物的一个成员与这样的蛋白融合，并将肽配对物中的另一个成员融合至要被展示在颗粒上的化合物(例如肽)，可以获得展示肽的颗粒。例如，颗粒形成蛋白与肽标签融合，待被展示的肽与相应的结合配偶体融合。肽标签与其结合配偶体之间自发形成的异肽键能够使肽被展示在颗粒表面上。如WO 2016/112921中详细描述的，该技术已用于产生展示抗原肽(例如与异常生理反应(如疾病)相关的肽)的病毒样颗粒(VLP)。衣壳蛋白是可用于产生此类VLP的合适颗粒形成蛋白的实例。例如，可以使用AP205、Qβ、MS2、HBc和噬菌体fr、P22、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)、噬菌体λ人腺病毒(AdV)、Vault颗粒(PDB:4V60)。本领域已知其他合适的蛋白，例如可以使用列于Lieknina等人，2019的表1中的蛋白。
然而，所述方法通常可应用于产生不是病毒样颗粒的颗粒。颗粒形成蛋白的其他此类实例包括：小热休克蛋白(HSP)(PDB:1SHS)、脱铁铁蛋白(PDB:1DAT)、丙酮酸脱氢酶多酶复合物(PDB:1EAA)、热聚体(THS)和i301(从来自超嗜热细菌海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的Entner–Doudoroff途径的2-酮-3-脱氧磷酸葡糖酸(KDPG)醛缩酶设计得到)。
根据本发明的方法，可以通过肽标签融合对可自组装成纳米颗粒的蛋白进行遗传修饰。然后，组装的纳米颗粒(即，展示反应性肽标签)可以与通过基因融合至结合配偶体的肽偶联，所述结合配偶体在与肽标签接触时能够通过异肽键与肽标签相互作用。
本文所述的任何肽标签、修饰的结合配偶体和肽配对物均可以有利地用于产生自组装纳米颗粒。
在一些实施方案中，与从使用参考肽配对物的颗粒获得的免疫应答相比，例如与使用SpyCatcher/SpyTag(分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5)获得的免疫应答相比，通过本方法获得的肽配对物，当用于展示目标化合物如抗原时，例如在如下所述的病毒样颗粒中或颗粒中，在施用于有此需要的受试者时可导致免疫应答增加。
在一些实施方案中，肽配对物由以下组成：如本文所述的修饰的结合配偶体，例如SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体、SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体或SEQ ID NO:37(QueenCatcher)的结合配偶体，以及如本文所述的合适的肽标签。在此类实施方案中，参考肽配对物可以由相同的肽标签和本文所述的参考结合配偶体(例如SpyCatcher(SEQ IDNO:1))组成。在一些实施方案中，参考肽配对物可以由SpyCatcher/SpyTag(分别为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:5)组成。
因此，本文还公开了一种用于在有此需要的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用包含本文所述或通过本文所述方法获得的肽配对物的颗粒，例如病毒样颗粒，其中优选地，与施用包含参考肽配对物(例如本文所述的任何参考肽配对物)但在其他方面相同的颗粒例如病毒样颗粒获得的免疫应答相比，所述免疫应答增加。
在一些实施方案中，增加的免疫应答是增加的IgM应答和/或增加的IgG2应答，例如增加的IgG2a和/或IgG2b。在一些实施方案中，增加的免疫应答是增加的IgG1应答。在一些实施方案中，增加的免疫应答是增加的IgG3应答。优选地，IgM、IgG2a或IgG2b应答中的至少一种是增加的。
颗粒上的化合物展示
可选地或另外，当与参考肽配对物在类似条件下展示目标肽的能力相比时，本文所述的肽配对物还可以具有增强的在颗粒如病毒样颗粒上展示目标化合物例如肽的能力，其中所述颗粒包括融合或缀合至结合配偶体的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和融合或缀合至肽标签的目标化合物，或者其中所述颗粒包括融合或缀合至肽标签的颗粒形成蛋白和融合或缀合至结合配偶体的目标化合物，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
本文所述的任何肽标签、修饰的结合配偶体和肽配对物均可以有利地用于产生能够展示目标化合物的自组装纳米颗粒。
颗粒形成蛋白的实例包括衣壳蛋白，例如病毒衣壳蛋白。例如，可以使用AP205、Qβ、MS2、HBc和噬菌体fr、P22、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)、噬菌体λ人腺病毒(AdV)、Vault颗粒(PDB:4V60)。本领域已知其他合适的蛋白，例如可以使用列于Lieknina等人，2019的表1中的蛋白。
颗粒形成蛋白的除病毒衣壳蛋白的其他实例包括：小热休克蛋白(HSP)(PDB:1SHS)、脱铁铁蛋白(PDB:1DAT)、丙酮酸脱氢酶多酶复合物(PDB:1EAA)、热聚体(THS)和i301(从来自超嗜热细菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的Entner–Doudoroff途径的2-酮-3-脱氧磷酸葡糖酸(KDPG)醛缩酶设计得到)。
待被展示在颗粒表面(其可以是内表面或外表面)上的目标化合物的实例包括目标肽，例如抗原肽。在一些实施方案中，抗原肽能够在动物中引发免疫应答，所述动物例如哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、山羊、美洲驼、小鼠、大鼠、猴子，最优选例如人类；或禽类，例如鸡，或鱼，例如鲑鱼。
在一些实施方案中，目标化合物是与异常生理反应相关的抗原，例如疾病或病症，例如疾病是癌症，例如乳腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫浆液癌；心血管疾病，例如血脂异常、动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症；免疫炎性疾病或慢性疾病，例如嗜酸粒细胞哮喘、过敏、鼻息肉病、特应性皮炎、嗜酸粒细胞食管炎、嗜酸粒细胞增多综合征和查格-施特劳斯综合征；神经性疾病，例如阿尔茨海默症；感染性疾病，例如选自由病毒例如冠状病毒如SARS-CoV-2引起的疾病、疟疾、结核病、HIV和流感的感染性疾病；脂质紊乱，例如高脂血症，I型、II型、III型、IV型或V型高脂血症，继发性高甘油三酯血症，高胆固醇血症，家族性高胆固醇血症，黄瘤病，胆固醇乙酰转移酶缺乏症；动脉硬化病症，例如动脉粥样硬化；或冠状动脉疾病。
在一些实施方案中，抗原是蛋白、肽和/或抗原性片段，所述蛋白、肽或抗原性片段来自癌症特异性多肽、与心血管疾病相关的多肽、与哮喘相关的多肽、与鼻息肉病相关的多肽、与特应性皮炎相关的多肽、与嗜酸粒细胞食管炎相关的多肽、与嗜酸粒细胞增多综合征相关的多肽、与查格-施特劳斯综合征相关的多肽和/或与致病生物体相关的多肽。
因此，本发明的组合物可以是具有预防应用的疫苗组合物。因此，本发明的组合物可用于预防或治疗疾病或病症。本发明的组合物还可用于通过向受试者施用至少一次所述组合物来诱导受试者的免疫应答。
多核苷酸
本文还提供了编码可通过本文公开的方法获得的修饰的结合配偶体的多核苷酸。本文还提供了编码可通过本文公开的方法获得的肽标签的多核苷酸。本文中的术语多核苷酸是指编码给定多肽、肽或蛋白的核酸分子，优选DNA分子。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如本文所述的修饰的结合配偶体。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:37所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:38或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ IDNO:37的残基31的残基的密码子是未修饰的，即位置91至93处的密码子编码赖氨酸。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:39所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:38或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ IDNO:38的残基31的残基的密码子是未修饰的，即位置91至93处的密码子编码赖氨酸。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:41所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:42或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ IDNO:42的残基31的残基的密码子是未修饰的，即位置91至93处的密码子编码赖氨酸。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:29所示的修饰的结合配偶体，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ ID NO:29的残基8的残基的密码子是未修饰的，即位置24至26处的密码子编码赖氨酸。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:9所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:10或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ IDNO:10的残基31的残基的密码子是未修饰的，即位置352至354处的密码子编码天冬酰胺。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:31所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:32或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ IDNO:32的残基31的残基的密码子是未修饰的，即位置91至93处的密码子编码天冬氨酸。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:46所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:45或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ ID NO:46的残基12的残基的密码子是未修饰的，即位置37至39处的密码子编码天冬氨酸。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:48所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:47或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ ID NO:48的残基9的残基的密码子是未修饰的，即位置25至27处的密码子编码天冬酰胺。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:50所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:49或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:52所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:51或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:54所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:53或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:56所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:55或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:58所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:57或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:60所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:59或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:62所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:61或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:64所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:63或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:66所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:65或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:68所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:67或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ ID NO:68的残基13的残基的密码子是未修饰的，即位置37至39处的密码子编码天冬氨酸。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:35所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:36或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:22所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:12所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:11或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:71所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:72或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ ID NO:72的残基9的残基的密码子是未修饰的，即SEQ ID NO:72的位置25至27处的密码子编码天冬氨酸。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:69所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:70或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。
在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO:75所示的肽标签，所述多核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:77或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的其同源物。优选地，编码对应于SEQ ID NO:75的残基8的残基的密码子是未修饰的，即SEQ ID NO:77的位置22至24处的密码子编码天冬氨酸。
所述多核苷酸可在载体内提供，即用作媒介物的DNA分子，以人工将外源遗传物质携带到细胞中，从而外源遗传物质可在细胞中复制和/或表达。四种主要类型的载体是质粒、病毒载体、黏粒和人工染色体。载体本身通常是由插入物(转基因)和作为载体“骨架”的较大序列组成的DNA序列。将遗传信息转移到另一个细胞的载体的目的通常是在靶细胞中分离、扩增或表达插入物。表达载体(表达构建体)专门用于在靶细胞中表达转基因，并且通常具有驱动转基因表达的启动子序列。
在一些实施方案中，其中多核苷酸是SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:72或SEQID NO:11的同源物，多核苷酸中编码对应于参与形成异肽键的一个反应性残基的氨基酸的密码子优选未改变，或者多核苷酸的序列使得编码的多肽仍包含反应性残基。
因此，还提供了包含本文所述多核苷酸的载体，例如质粒。如本领域已知的，载体可包含多个多核苷酸。因此，本文提供了多核苷酸系统，例如包含两个多核苷酸的系统：编码本文所述的结合配偶体，尤其是本文所述的修饰的结合配偶体的第一多核苷酸，和编码本文所述的肽标签，尤其是与修饰的结合配偶体结合的肽标签的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述系统由两个载体组成：包含编码本文所述的结合配偶体，尤其是本文所述的修饰的结合配偶体的第一多核苷酸的第一载体，和包含编码本文所述的肽标签，尤其是与修饰的结合配偶体结合的肽标签的第二多核苷酸的第二载体。
在一些实施方案中，本发明的结合配对物(即，由结合配偶体和肽标签组成的结合配对物，其中结合配偶体可以是已知结合配偶体或本文所述的修饰的结合配偶体，并且肽标签是已知肽标签或本文所述的肽标签)用于偶联两种化合物，尤其是两种多肽。例如，结合配偶体与第一多肽融合，肽标签与第二多肽融合——技术人员知晓如何获得此类融合。由于在结合配偶体和肽标签之间形成了异肽键，使所述两种化合物(在我们的实例中是第一和第二多肽)相互靠近。如上详述，通过将能够形成VLP的衣壳蛋白融合至结合配偶体和肽标签中的一者，并将抗原肽融合至结合配偶体和肽标签的另一者，可以利用这一点来产生例如展示抗原肽的VLP。
可以通过设计编码与结合配偶体融合的第一化合物的多核苷酸和编码与肽标签融合的第二化合物的另一多核苷酸，来实现融合。或者，可以通过设计编码与肽标签融合的第一化合物的多核苷酸和编码与结合配偶体融合的第二化合物的另一多核苷酸，来实现融合。间隔子或接头，特别是基于甘氨酸-丝氨酸的间隔子或接头，可以引入到第一化合物和结合配偶体或肽标签之间，和/或第二化合物和结合配偶体或肽标签之间。
目标化合物可以通过N末端融合或C末端融合或通过内部融合(例如在环中)与肽标签或结合配偶体融合。
宿主细胞
本文还提供了表达本文公开的修饰的结合配偶体和/或肽标签的宿主细胞。这可以如本领域已知的那样进行。宿主细胞包含一种或多种本文所述的多核苷酸，其编码本文所述修饰的结合配偶体或肽标签。多核苷酸可以被整合到宿主细胞的基因组中，或者它们可以作为一种或多种载体的一部分提供，所述载体通过本领域已知的方法被引入细胞中。
如本领域已知的，可以对多核苷酸进行密码子优化以改善在宿主细胞中的表达。
宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞可以属于以下一种：大肠杆菌(Escherichia coli)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(sf9)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(BTI-TN-5B1-4)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella thyphimurium)、巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、旋乃德果蝇2(Drosophila Schneider 2)(S2)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS-1、HepG2、HeLA、BHK、人类胚胎肾细胞293、烟草(Nicotiana tabacum)变种Samsun NN和马铃薯(Solanum tuberosum)变种Solara、烟草(Nicotiana)属的细胞、茄(Solanum)属的细胞、羽扇豆(Lupinus)属的细胞、莴苣(Lactuca sativa)、西红柿细胞如番茄(Solanumlycopersicum)、大豆(Glycine max)、CPMV细胞、PVX细胞或MagnICON细胞、或基于假单胞菌(Pseudomonas)的系统。所述细胞可以是转基因细胞。
组合物
本文还提供了组合物，其包含：
i)与本文公开的修饰的结合配偶体融合的蛋白，以及与本文公开的肽标签融合的目标化合物，例如肽，如抗原；
ii)与本文公开的肽标签融合的蛋白，和与本文公开的修饰的结合配偶体融合的目标化合物，例如肽，如抗原，
其中修饰的结合配偶体和肽标签能够通过自发形成异肽键而相互作用，并且
其中目标化合物和蛋白通过修饰的结合配偶体和肽标签之间的异肽键相连接。
一些特定的组合物包含：
a)与本文所述的修饰的结合配偶体融合的颗粒形成蛋白，以及与本文所述的肽标签融合的目标化合物，例如肽，如抗原；或
b)与本文所述的肽标签融合的颗粒形成蛋白，以及与本文所述的修饰的结合配偶体融合的目标化合物，例如肽，如抗原；
其中修饰的结合配偶体和肽标签能够通过自发形成异肽键而相互作用，并且
其中目标化合物和颗粒形成蛋白通过修饰的结合配偶体和肽标签之间的异肽键相连接，并且
其中颗粒形成蛋白和目标化合物形成展示所述目标化合物的颗粒。
颗粒形成蛋白的实例包括衣壳蛋白，例如病毒衣壳蛋白。例如，可以使用AP205、Qβ、MS2、HBc和噬菌体fr、P22、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)、噬菌体λ人腺病毒(AdV)、Vault颗粒(PDB:4V60)。本领域已知其他合适的蛋白，例如可以使用列于Lieknina等人，2019的表1中的蛋白。
颗粒形成蛋白除病毒衣壳蛋白外的其他实例包括：小热休克蛋白(HSP)(PDB:1SHS)、脱铁铁蛋白(PDB:1DAT)、丙酮酸脱氢酶多酶复合物(PDB:1EAA)、热聚体(THS)和i301(从来自超嗜热细菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的Entner–Doudoroff途径的2-酮-3-脱氧磷酸葡糖酸(KDPG)醛缩酶设计得到)。
待被展示在颗粒表面(其可以是内表面或外表面)上的目标化合物的实例包括目标肽，例如抗原肽。在一些实施方案中，抗原肽能够在动物中引发免疫反应，所述动物例如哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、山羊、美洲驼、小鼠、大鼠、猴子，最优选例如人类；或禽类，例如鸡，或鱼，例如鲑鱼。
在一些实施方案中，目标化合物是与异常生理反应相关的抗原，例如疾病或病症，例如疾病是癌症，例如乳腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫浆液癌；心血管疾病，例如血脂异常、动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症；免疫炎性疾病或慢性疾病，例如嗜酸粒细胞哮喘、过敏、鼻息肉病、特应性皮炎、嗜酸粒细胞食管炎、嗜酸粒细胞增多综合征和查格-施特劳斯综合征；神经性疾病，例如阿尔茨海默症；感染性疾病，例如选自由病毒例如冠状病毒如SARS-CoV-2引起的疾病、疟疾、结核病、HIV和流感的感染性疾病；脂质紊乱，例如高脂血症，I型、II型、III型、IV型或V型高脂血症，继发性高甘油三酯血症，高胆固醇血症，家族性高胆固醇血症，黄瘤病，胆固醇乙酰转移酶缺乏症；动脉硬化病症，例如动脉粥样硬化；或冠状动脉疾病。
在一些实施方案中，抗原是蛋白、肽和/或抗原性片段，所述蛋白、肽或抗原性片段来自癌症特异性多肽、与心血管疾病相关的多肽、与哮喘相关的多肽、与鼻息肉病相关的多肽、与特应性皮炎相关的多肽、与嗜酸粒细胞食管炎相关的多肽、与嗜酸粒细胞增多综合征相关的多肽、与查格-施特劳斯综合征相关的多肽和/或与致病生物体相关的多肽。
因此，本发明的组合物可以是具有预防应用的疫苗组合物。因此，本发明的组合物可用于预防或治疗疾病或病症。本发明的组合物还可用于通过向受试者施用至少一次所述组合物来诱导受试者的免疫应答。
本文还提供了一种制备本文所述的药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)获得第一多肽，所述第一多肽包含与蛋白融合的本文所述的修饰的结合配偶体或由其组成；和获得第二多肽，所述第二多肽包含与目标化合物融合的本文定义的肽标签或由其组成；或
获得第一多肽，所述第一多肽包含与蛋白融合的本文所述的肽标签或由其组成，和获得第二多肽，所述第二多肽包含与目标化合物融合的本文所述的修饰的结合配偶体或由其组成；
ii)使第一多肽和第二多肽接触，从而允许在肽标签和修饰的结合配偶体之间形成异肽键；和产生如本文所述的药物组合物。
在具体的实施方案中，制备组合物的方法包括以下步骤：
i)获得第一多肽，所述第一多肽包含与颗粒形成蛋白融合的本文所述的修饰的结合配偶体或由其组成；和获得第二多肽，所述第二多肽包含与目标化合物例如肽融合的本文所述的肽标签或由其组成；或
获得第一多肽，所述第一多肽包含与颗粒形成蛋白融合的本文所述的肽标签或由其组成，和获得第二多肽，所述第二多肽包含与目标化合物融合的本文所述的修饰的结合配偶体或由其组成；
ii)使第一多肽经受能够形成颗粒的条件；
iii)通过在第二多肽和第一多肽的颗粒形成蛋白之间形成异肽键来获得颗粒；和
iv)产生包含所述颗粒的药物组合物，其中所述药物组合物如本文所述，
从而获得药物组合物。
颗粒形成蛋白可以是上文列出的任意颗粒形成蛋白，例如衣壳蛋白。
实施例
实施例1：
从SEQ ID NO:3开始获得如SEQ ID NO:37所示的修饰的结合配偶体。SEQ ID NO:3中的反应性残基位于SEQ ID NO:3的位置31，并保留在修饰的结合配偶体中，所述修饰的结合配偶体包含SEQ ID NO:37或与其具有至少70％同一性或同源性的其同源物或由其组成。来自SEQ ID NO:3的第一反应性片段跨越SEQ ID NO:3的位置1至93。SEQ ID NO:37的修饰的结合配偶体进一步包含跨越SEQ ID NO:1的位置97至116的片段(残留片段)。SEQ ID NO:37中的反应性残基位于位置31。
如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41所示的修饰的结合配偶体均从SEQ ID NO:37开始获得。如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41所示的修饰的结合配偶体是通过计算机建模和合理设计进行设计的，在SEQ ID NO:37中引入了突变。SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41中的反应性残基位于这些序列的位置31。
实施例2：通过可溶性捕手和标签-VLP融合物之间形成异肽键获得的VLP的改进特性
为了确定偶联动力学(随时间偶联的EC50)，将可溶性捕手和VLP-标签(VLP形成蛋白和标签的融合物)在PBS中稀释至10μM，以1:1的比例混合(最终为5μM)，并在37℃下孵育1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟、1小时、1小时30分钟或3小时，然后在SDS凝胶上运行。还测定了重构百分比；它是3小时后的终点结合，在这里测定的是两个实验的平均值。
结果如图1和表1所示。
表1：
Figure BDA0003962860190000701
可以看出，与SdyCatcher+VLP SdyTag相比，Mooncake+VLP-RumTrunkD9NTag的动力学得到改善，而与SpyCatcher+VLP SpyTag相比，KATI+VLP-RumTrunkD9NTag动力学基本不变。与SdyCatcher+VLP SdyTag相比，重构百分比得到改善。
为了确定上述VLP的最大结合，将可溶性捕手和VLP-标签分别在PBS中稀释至20μM和10μM，并以1:1的比例混合(最终为10μM和5μM)，在37℃下孵育24小时，并在SDS凝胶上运行。为了测定VLP产量，在BL21细胞中表达可溶性捕手，并在含有氨苄青霉素的2*YT培养基中生长。将预培养物放置过夜，并转移到400mL含有氨苄青霉素的2*YT培养基中，用0.1μMIPTG诱导我们的蛋白表达。诱导后，将过夜培养物离心并将沉淀物称重(mg蛋白/gr沉淀物)，使用IMAC纯化蛋白并测量蛋白浓度(mg/L)。结果如表2所示。
表2：ND：未测定
Figure BDA0003962860190000702
Figure BDA0003962860190000711
与SdyCatcher+VLP SdyTag相比，最大结合增加。
总之，这些数据表明，本发明的VLP具有改进的性质，特别是与SdyCatcher/SdyTagVLP相比。
实施例3：可溶性捕手和可溶性标签配对物的改进特性
除非另有说明，否则按照实施例1进行实验。使用可溶性标签代替VLP-标签融合物。
为了测定动力学，将可溶性捕手和可溶性标签在PBS中稀释至10μM，以1:1的比例混合(最终为5μM)，并在37℃下孵育1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟、1小时、1小时30分钟或3小时，然后在SDS凝胶上运行。为了测定结合，将可溶性捕手和可溶性标签在PBS中稀释至10μM，以1:1的比例混合(最终为5μM)，并在37℃下孵育50分钟，然后在SDS凝胶上运行。为了测定最大结合，将可溶性捕手和可溶性标签分别在PBS中稀释至20μM和10μM，以1:1的比例混合(最终分别为10μM和5μM)，在37℃下孵育24小时，然后在SDS凝胶上运行。
SdyC+SdyTag、Mooncake+MBP-RumTrunkD9NTag和KATI+MBP-RumTrunkD9NTag的动力学、结合百分比(50分钟后的重构)和最大结合如图2A、2B和表3所示。
表3：ND：未测定
Figure BDA0003962860190000712
Figure BDA0003962860190000721
实施例4：改进的VLP展示
为了测定动力学，将VLP-捕手和可溶性标签在PBS中稀释至10μM，以1:1的比例混合(最终为5μM)，并在37℃下孵育1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟、1小时、1小时30分钟或3小时，然后在SDS凝胶上运行。为了测定重构(在50分钟时，与RumTrunkD9NTag-MBP结合)，将可溶性捕手和VLP-标签在PBS中稀释至10μM，以1:1的比例混合(最终为5μM)，在37℃下孵育3小时，并在SDS凝胶上运行。为了测定最大结合，将VLP-捕手和可溶性标签分别在PBS中稀释至20μM和10μM，并以1:1的比例混合(最终分别为10μM和5μM)，在37℃下孵育24小时，并在SDS凝胶上运行。为了测定VLP产量，在BL21细胞中表达VLP-捕手融合物，并在含有氨苄青霉素的2*YT培养基中生长。将预培养物放置过夜，并转移到400mL含有氨苄青霉素的2*YT培养基中，用0.1μM IPTG诱导我们的蛋白表达。诱导后，将过夜培养物离心并将沉淀物称重(mg蛋白/gr沉淀物)，使用optiprep梯度纯化蛋白并在超速离心机中离心。通过BCA测定法来测定VLP浓度(mg/L)。
结果如表4和表5所示。
表4
Figure BDA0003962860190000722
Figure BDA0003962860190000731
表5：ND：未测定
Figure BDA0003962860190000732
实施例5：免疫应答增强
不同的小鼠组(n＝6)分别用等剂量(6mcg)的MoonCake-HER2 VLP(LCG)、SpyCatcher-HER2 VLP(SPY)或PBS(对于PBS组，n＝5)来免疫。在每次免疫后两周获得血清，并通过ELISA测定抗原特异性IgM和IgG(亚类1、2a、2b和3)的水平。与SpyCatcher-HER2 VLP相比，用MoonCake-HER2 VLP免疫诱导了显著更高的抗原特异性总Ig(图4)。与SpyCatcher-HER2 VLP相比，用MoonCake-HER2 VLP免疫诱导了显著更高的IgM以及IgG2a和IgG2b(图5)。如分别通过SDS-PAGE密度计和动态光散射分析所测量的，两种疫苗具有相当的偶联效率(即，每VLP展示的HER2数量)和单分散性。
序列
Figure BDA0003962860190000741
Figure BDA0003962860190000751
Figure BDA0003962860190000761
Figure BDA0003962860190000771
Figure BDA0003962860190000781
Figure BDA0003962860190000791
Figure BDA0003962860190000801
Figure BDA0003962860190000811
参考文献
Figure BDA0003962860190000812
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项
1.一种生产修饰的结合配偶体的方法，所述修饰的结合配偶体能够与肽标签通过在所述修饰的结合配偶体内包含的一个反应性残基和在所述肽标签内包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而结合，
所述方法包括以下步骤：
i)至少选择由第一肽标签与第一结合配偶体组成的第一肽配对物和由第二肽标签与第二结合配偶体组成的第二肽配对物，其中对于每个肽配对物，肽标签和结合配偶体能够或怀疑能够通过自发形成异肽键而彼此结合；
ii)鉴定第一肽配对物和/或第二肽配对物的异肽键的位置，从而鉴定第一结合配偶体的第一反应性片段和/或第二结合配偶体的第二反应性片段，以及第一结合配偶体的第一残留片段和/或第二结合配偶体的第二残留片段；其中第一和/或第二反应性片段包含参与异肽键的反应性残基；
iii)设计修饰的结合配偶体，其中修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：i)第一反应性片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，以及第二残留片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，其中第一反应性片段优选位于第二残留片段的上游，其中修饰的结合配偶体不同时包含参与形成异肽键的两个反应性残基；
iv)生产修饰的结合配偶体。
2.根据第1项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
v)测定修饰的结合配偶体的一种或多种结合性质，其中所述一种或多种性质优选选自修饰的结合配偶体与第一肽标签、第二肽标签或第三肽标签中的一个或多个的i)总结合和ii)结合速率；
vi)测定第一结合配偶体和/或第二结合配偶体与第一肽标签、第二肽标签或第三肽标签中的一个或多个的对应的一种或多种结合性质；
vii)比较步骤e)和f)中测定的结合性质，其中，修饰的结合配偶体对第一肽标签、第二肽标签或第三肽标签中的一个或多个的结合效力与第一和/或第二结合配偶体对相同标签的结合效力相比增加则表明，修饰的结合配偶体与第一和/或第二结合配偶体相比具有改进的性质，其中如果总结合和结合速率中的至少一项与第一和/或第二结合配偶体的结合效力相比增加，优选与第一结合配偶体的结合效力相比增加，则结合效力是增加的。
3.根据前述项中任一项所述的方法，其中，修饰的结合配偶体对所述第一、第二和第三肽标签的至少一个的结合速率与第一和/或第二结合配偶体中的至少一个对相同肽标签的结合速率相比增加则表明，修饰的结合配偶体与第一和/或第二结合配偶体相比，优选与第一结合配偶体的结合效力相比具有增加的结合效力，优选地，其中所述增加为至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
4.根据前述项中任一项所述的方法，其中，修饰的结合配偶体对所述第一、第二和第三肽标签的至少一个的总结合与第一和/或第二结合配偶体中的至少一个对相同肽标签的总结合相比增加则表明，修饰的结合配偶体与第一和/或第二结合配偶体相比，优选与第一结合配偶体的结合效力相比具有增加的结合效力，优选地，其中所述增加为至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
5.根据前述项中任一项所述的方法，其中修饰的结合配偶体的长度为5个氨基酸或更长，例如10个氨基酸或更长，例如15个氨基酸或更长，例如20个氨基酸或更长，例如25个氨基酸，例如30个氨基酸，例如35个氨基酸，例如40个氨基酸，例如45个氨基酸，例如50个氨基酸，例如60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350个氨基酸或更长。
6.根据前述项中任一项所述的方法，其中第一和/或第二结合配偶体独立地选自SEQ ID NO:1(SpyCatcher)、SEQ ID NO:3(SdyCatcher)、SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)、SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:33，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
7.根据前述项中任一项所述的方法，其中第一肽标签、第二肽标签和/或第三肽标签独立地选自SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:69(SnoopTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:50(PhoTag)、SEQ ID NO:52(EntTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
8.根据前述项中任一项所述的方法，其中第一、第二或第三肽标签中的反应性残基是天冬氨酸或天冬酰胺残基，和/或其中第一、第二和/或修饰的结合配偶体中的反应性残基是赖氨酸或天冬酰胺残基。
9.修饰的结合配偶体，其可通过前述项中任一项所述的方法获得。
10.修饰的结合配偶体，其能够与肽标签通过在所述修饰的结合配偶体中包含的一个反应性残基和在所述肽标签中包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而结合，其中修饰的结合配偶体不同时包含参与形成异肽键的两个反应性残基，并且其中修饰的结合配偶体包含以下或由以下组成：含有一个反应性残基的第一结合配偶体的第一反应性片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，所述第一结合配偶体能够与包含另一反应性残基的第一肽标签通过在反应性残基之间形成异肽键而相互作用，以及第二结合配偶体的第二残留片段或与其具有至少70％同源性的其同源物，其中所述第二结合配偶体能够与包含另一反应性残基的第二肽标签通过在反应性残基之间形成异肽键而相互作用，其中第二残留片段不包含反应性残基，优选地，其中第一反应性片段位于第二残留片段的上游。
11.根据第9至10项中任一项所述的修饰的结合配偶体，其中所述修饰的结合配偶体可通过第1至8项中任一项所述的方法获得。
12.根据第9项至第11项中任一项所述的修饰的结合配偶体，其中第一和第二结合配偶体独立地选自SEQ ID NO:1(SpyCatcher)、SEQ ID NO:3(SdyCatcher)、SEQ ID NO:9(SnoopCatcher)、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:33，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
13.根据第9至12项中任一项所述的修饰的结合配偶体，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:41，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
14.根据第9至13项中任一项所述的修饰的结合配偶体，与参考结合配偶体对参考肽标签的结合效力中的任何一个或多个的结合效力相比，所述结合配偶体对相同参考肽标签具有增加的结合效力，其中参考肽标签是如第1至8项中任一项所定义的第一肽标签、第二肽标签或第三肽标签，并且参考结合配偶体是如第1至8项中任一项所定义的第一结合配偶体或第二结合配偶体，并且其中如果总结合和结合速率中的至少一项与参考结合配偶体的结合效力相比，优选与第一结合配偶体的结合效力相比增加，则结合效力是增加的。
15.根据第9至14项中任一项所述的修饰的结合配偶体，其中修饰的肽配偶体的结合速率与参考结合配偶体相比增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
16.根据第9至15项中任一项所述的修饰的结合配偶体，其中修饰的肽配偶体的总结合与参考结合配偶体相比增加至少5％，例如至少10％、例如至少15％、例如至少20％、例如至少25％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％或更多。
17.根据第9至15项中任一项所述的修饰的结合配偶体，其中第一肽标签、第二肽标签和/或第三肽标签独立地选自SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ IDNO:69(SnoopTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:50(PhoTag)、SEQ ID NO:52(EntTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物，优选地，第一肽标签、第二肽标签和/或第三肽标签独立地选自SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQID NO:5(SpyTag)和SEQ ID NO:7(SdyTag)。
18.一种生产肽标签的方法，所述肽标签能够与结合配偶体通过在所述肽标签内包含的一个反应性残基和在所述结合配偶体内包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而结合，优选地，其中所述结合配偶体是如第9至14项中任一项所述的修饰的结合配偶体，
所述方法包括以下步骤：
a)鉴定与参考肽标签具有至少60％相似性的候选肽标签，其中参考肽标签能够自发地与至少一个参考结合配偶体形成异肽键，优选地，其中参考肽标签包含参考结合基序；
b)从a)中鉴定的候选肽标签中选择肽标签，其中选择的肽标签包含至少一个可能参与异肽键形成的反应性残基；
c)从选择的肽标签中设计和生产肽标签，其中每个肽标签包含以下或由以下组成：选择的肽标签的片段，其跨越可能参与形成异肽键的反应性残基的上游4至24个氨基酸至下游2至22个氨基酸，或与其具有至少70％同源性的其同源物，条件是该同源物包含反应性残基。
19.根据第18项所述的方法，其进一步包括将反应性残基突变的步骤d)，优选其中反应性残基是天冬氨酸，将其突变为天冬酰胺，其中步骤d)在步骤c)之后进行。
20.根据第18至19项中任一项所述的方法，其中候选肽标签包含候选肽标签C末端50个氨基酸以内，例如候选肽标签C末端45、40、35、30或25个氨基酸以内的序列基序。
21.根据第20项所述的方法，其中序列基序包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:73(GX1X2X3IVMX4DX5)、SEQ ID NO:74(GX1X2X3YVMX4DX5)、SEQ ID NO:43(GX1X2X3FVMX4DX5)或SEQID NO:73(GX1X2X3WVMX4DX5)。
22.肽标签，其包含含有至少一个参与在所述肽标签和结合配偶体之间形成异肽键的反应性残基的蛋白的片段，或由其组成，其中所述肽标签包含以下或由以下组成：所述蛋白的片段，其跨越反应性残基的上游4至24个氨基酸至下游2至22个氨基酸，或与其具有至少70％同源性的其同源物，条件是该同源物包含反应性残基，优选其中反应性残基是天冬酰胺或天冬氨酸。
23.根据第22项所述的肽标签，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:50(PhoTag)、SEQ ID NO:52(EntTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
24.根据第22至23项中任一项所述的肽标签，其中肽标签包含序列基序，所述序列基序包含SEQ ID NO:73或由SEQ ID NO:73组成，所述序列基序优选在肽标签C末端的20个氨基酸以内，例如在肽标签C末端的19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸以内。
25.一种生产肽配对物的方法，所述肽配对物包含修饰的结合配偶体和肽标签或由其组成，其中修饰的结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内包含的一个反应性残基与所述肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与肽标签结合，所述方法包括以下步骤：
i)通过第1至8项中任一项所述的方法生产修饰的结合配偶体；和/或
ii)通过第18至21项中任一项所述的方法生产肽标签。
26.肽配对物，其包含如前述项中任一项所定义的肽标签和如前述项中任一项所定义的修饰的结合配偶体，或由以上组成。
27.根据第26项所述的肽配对物，其中所述肽配对物选自：
a)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:69
b)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:39；和
c)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:41；
d)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:39；
e)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:41。
28.修饰的结合配偶体，其与参考结合配偶体相比具有一种或多种改进的性质，其中所述一种或多种改进的性质独立地选自以下一种或多种：
a)相对于参考结合配偶体与肽标签的结合，修饰的结合配偶体与所述肽标签的结合效力增加，其中所述修饰的结合配偶体和任选的所述参考结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内或所述参考结合配偶体内包含的一个反应性残基与在所述肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与所述肽标签结合，其中增加的结合效力是总结合和结合速率中的至少一项；
b)当与参考结合配偶体在类似条件下形成颗粒的能力相比时，形成展示目标肽的颗粒，例如展示目标肽的病毒样颗粒的能力增强，其中所述颗粒包括与修饰的结合配偶体融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与修饰的结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在修饰的结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成；
c)当与参考结合配偶体在类似条件下展示目标肽的能力相比时，在颗粒如病毒样颗粒上展示目标肽的能力增强，其中所述颗粒包括与修饰的结合配偶体融合的颗粒形成蛋白如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与修饰的结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在修饰的结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
29.根据第28项所述的修饰的结合配偶体，其中当施用于有此需要的受试者时，所述颗粒比与参考结合配偶体形成的而其他方面相同的颗粒诱导更大的免疫应答，优选地，其中参考结合配偶体是SpyCatcher(SEQ ID NO:1)，任选地，其中增加的免疫应答是增加的IgM应答和/或增加的IgG2应答，例如增加的IgG2a和/或IgG2b。
30.根据第28至29项中任一项所述的修饰的结合配偶体，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:41，或其片段，或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
31.肽标签，其与参考肽标签相比具有一种或多种改进的性质，其中所述一种或多种改进的性质独立地选自以下一种或多种：
a)相对于参考肽标签与参考结合配偶体的结合，肽标签与所述参考结合配偶体的结合效力增加，其中所述肽标签和所述参考肽标签能够通过在所述肽标签内或所述参考肽标签内包含的一个反应性残基与所述参考结合配偶体内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与所述参考结合配偶体结合，其中如果总结合和结合速率中的至少一项增加，则结合效力是增加的；
b)当与参考肽标签在类似条件下形成颗粒的能力相比时，形成颗粒如病毒样颗粒的能力增强，其中所述颗粒展示目标肽，其中所述颗粒包括与参考结合配偶体融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标肽，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与参考结合配偶体融合的目标肽，并且其中所述颗粒通过在参考结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成；
c)当与参考肽标签在类似条件下展示目标化合物的能力相比时，在颗粒如病毒样颗粒上展示目标化合物例如肽的能力增强，其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与结合配偶体融合的目标化合物，或者其中所述颗粒包括与结合配偶体融合的颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标化合物，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
32.根据第31项所述的肽标签，其中当施用于有此需要的受试者时，所述颗粒比与参考肽标签形成的而其他方面相同的颗粒诱导更大的免疫应答，任选地，其中增加的免疫应答是增加的IgM应答和/或增加的IgG2应答，例如增加的IgG2a和/或IgG2b。
33.根据第31至32项中任一项所述的肽标签，其包含以下或由以下组成：SEQ IDNO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:50(PhoTag)、SEQ ID NO:52(EntTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)，以及与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
34.肽配对物，其包含肽标签和结合配偶体或由肽标签和结合配偶体组成，其中与包含参考肽标签和参考结合配偶体的参考肽配对物相比，所述肽配对物具有一种或多种改进的性质，
其中结合配偶体能够通过在所述修饰的结合配偶体内包含的一个反应性残基和在所述肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与肽标签结合；
其中参考结合配偶体能够通过在所述参考结合配偶体内包含的一个反应性残基和所述参考肽标签内包含的另一反应性残基之间自发形成异肽键而与参考肽标签结合；
其中所述一种或多种改进的性质独立地选自以下一种或多种：
a)相对于参考结合配偶体与参考肽标签的结合，结合配偶体与肽标签的结合效力增加，其中如果总结合和结合速率中的至少一项增加，则结合效力是增加的；
b)当与参考肽配对物在类似条件下形成颗粒的能力相比时，形成展示目标肽的颗粒，例如展示目标肽的病毒样颗粒的能力增强，其中所述颗粒包括与结合配偶体融合的颗粒形成蛋白例如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标化合物，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的病毒样颗粒形成蛋白和与结合配偶体融合的目标化合物，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成；和/或
c)当与参考肽配对物在类似条件下展示目标肽的能力相比时，在颗粒如病毒样颗粒上展示目标化合物例如肽的能力增强，其中所述颗粒包括与结合配偶体融合的颗粒形成蛋白如病毒样颗粒形成蛋白和与肽标签融合的目标化合物，或者其中所述颗粒包括与肽标签融合的颗粒形成蛋白和与结合配偶体融合的目标化合物，并且其中所述颗粒通过在结合配偶体和肽标签之间自发形成异肽键而形成。
35.根据第34项所述的肽配对物，其中当施用于有此需要的受试者时，所述颗粒比与参考肽配对物形成而其他方面相同的颗粒诱导更大的免疫应答，任选地其中增加的免疫应答是增加的IgM应答和/或增加的IgG2应答，例如增加的IgG2a和/或IgG2b，优选其中参考肽配对物包括SpyCatcher(SEQ ID NO:1)。
36.根据第34至35项中任一项所述的肽配对物，其中结合配偶体是如前述项中任一项所定义的修饰的结合配偶体，并且其中：
a)如果修饰的结合配偶体包含如前述项中任一项所定义的第一结合配偶体的第一反应性片段和第二结合配偶体的第二残留片段或由其组成，则参考结合配偶体是第二结合配偶体；
b)如果修饰的结合配偶体包含如前述项中任一项所定义的第二结合配偶体的第二反应性片段和第一结合配偶体的第一残留片段或由组成，则参考结合配偶体是第一结合配偶体。
37.根据第9至17项、第22至24项或第26至35项中任一项所述的修饰的结合配偶体、肽标签或肽配对物，其中所述颗粒是病毒样颗粒。
38.根据第9至17项、第22至24项或第26至35项中任一项所述的修饰的结合配偶体、肽标签或肽配对物，其中所述颗粒是病毒样颗粒，并且所述颗粒形成蛋白是病毒衣壳蛋白。
39.根据第9至17项、第22至24项或第26至35项中任一项所述的修饰的结合配偶体、肽标签或肽配对物，其中所述病毒衣壳蛋白选自：AP205衣壳蛋白、MS2衣壳蛋白、HBc衣壳蛋白和噬菌体fr衣壳蛋白。
40.多核苷酸，其编码第9至17项或第28至29项中任一项所述的修饰的配偶体和/或第22至24项或第31项中任一项所述的肽标签。
41.根据第40项所述的多核苷酸，其编码：
a)如SEQ ID NO:37所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:38或由SEQ ID NO:38组成；
b)如SEQ ID NO:39所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:40或由SEQ ID NO:40组成；或
c)如SEQ ID NO:41所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:42或由SEQ ID NO:42组成；
d)如SEQ ID NO:29所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成；
e)如SEQ ID NO:71所示的修饰的结合配偶体，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:72或由SEQ ID NO:72组成，
或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
42.根据第40至41项中任一项所述的多核苷酸，其编码：
a)如SEQ ID NO:46所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:45或由SEQ IDNO:45组成；
b)如SEQ ID NO:48所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:47或由SEQ IDNO:47组成；
c)如SEQ ID NO:50所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:49或由SEQ IDNO:49组成；
d)如SEQ ID NO:52所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:51或由SEQ IDNO:51组成；
e)如SEQ ID NO:54所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:53或由SEQ IDNO:53组成；
f)如SEQ ID NO:56所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:55或由SEQ IDNO:55组成；
g)如SEQ ID NO:58所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:57或由SEQ IDNO:57组成；
h)如SEQ ID NO:60所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:59或由SEQ IDNO:59组成；
i)如SEQ ID NO:62所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:61或由SEQ IDNO:61组成；
j)如SEQ ID NO:64所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:63或由SEQ IDNO:63组成；
k)如SEQ ID NO:66所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:65或由SEQ IDNO:65组成；
l)如SEQ ID NO:68所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:67或由SEQ IDNO:67组成；
m)如SEQ ID NO:35所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:36或由SEQ IDNO:36组成；
n)如SEQ ID NO:22所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:21或由SEQ IDNO:21组成；
o)如SEQ ID NO:12所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:11或由SEQ IDNO:11组成；
p)如SEQ ID NO:31所示的肽标签，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:32或由SEQ IDNO:32组成，
或与其具有至少60％同源性，例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同源性的其同源物。
43.载体，其包含第40至42项中任一项所述的多核苷酸。
44.宿主细胞，其表达：
i)第9至17项或第28至29项中任一项所述的修饰的结合配偶体，和/或
ii)第22至23项或第31项中任一项所述的肽标签。
45.根据第44项所述的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
46.组合物，其包含：
i)与第9至17项或第28至29项中任一项所述的修饰的结合配偶体融合的蛋白，以及与第22至23项或第31项中任一项所述的肽标签融合的目标化合物，例如肽，如抗原；或
ii)与第22至23项或第31项中任一项所述的肽标签融合的蛋白，以及与第9至17项或第28至29项中任一项所述的修饰的结合配偶体融合的目标化合物，例如肽，如抗原，
其中修饰的结合配偶体和肽标签能够通过自发形成异肽键而相互作用，并且
其中目标化合物和蛋白通过修饰的结合配偶体和肽标签之间的异肽键而彼此连接。
47.根据第46项所述的组合物，其中与修饰的结合配偶体融合的蛋白是颗粒形成蛋白。
48.根据第47项所述的组合物，其中颗粒形成蛋白和目标化合物形成展示所述目标化合物的颗粒。
49.根据第48项所述的组合物，其中所述颗粒是病毒样颗粒，并且所述颗粒形成蛋白是病毒衣壳蛋白。
50.根据第46至47项中任一项所述的组合物，其中所述目标肽是抗原，优选其中所述抗原是肽或其抗原性片段，例如与异常生理反应相关的肽或其抗原性片段。
51.根据第46至50项中任一项所述的组合物，其中所述异常生理反应是疾病，例如心血管疾病、感染性疾病和/或过敏反应/疾病。
52.根据第46至51项中任一项所述的组合物，其中所述疾病是癌症，例如乳腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫浆液癌；心血管疾病，例如血脂异常、动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症；免疫炎性疾病或慢性疾病，例如嗜酸粒细胞哮喘、过敏、鼻息肉病、特应性皮炎、嗜酸粒细胞食管炎、嗜酸粒细胞增多综合征和查格-施特劳斯综合征；神经性疾病，例如阿尔茨海默症；感染性疾病，例如选自由病毒例如冠状病毒如SARS-CoV-2引起的疾病、疟疾、结核病、HIV和流感的感染性疾病；脂质紊乱，例如高脂血症，I型、II型、III型、IV型或V型高脂血症，继发性高甘油三酯血症，高胆固醇血症，家族性高胆固醇血症，黄瘤病，胆固醇乙酰转移酶缺乏症；动脉硬化病症，例如动脉粥样硬化；或冠状动脉疾病。
53.根据第46至52项中任一项所述的组合物，其中所述抗原是蛋白、肽和/或抗原性片段，所述蛋白、肽或抗原性片段来自癌症特异性多肽、与心血管疾病相关的多肽、与哮喘相关的多肽、与鼻息肉病相关的多肽、与特应性皮炎相关的多肽、与嗜酸粒细胞食管炎相关的多肽、与嗜酸粒细胞增多综合征相关的多肽、与查格-施特劳斯综合征相关的多肽和/或与致病生物体相关的多肽。
54.根据第46至53项中任一项所述的组合物、根据第40至42项中任一项所述的多核苷酸或根据第43项所述的载体，用于预防或治疗疾病。
55.根据第53项所述使用的组合物、多核苷酸或载体，其中所述疾病是癌症，例如乳腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫浆液癌；心血管疾病，例如血脂异常、动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症；免疫炎性疾病或慢性疾病，例如嗜酸粒细胞哮喘、过敏、鼻息肉病、特应性皮炎、嗜酸粒细胞食管炎、嗜酸粒细胞增多综合征和查格-施特劳斯综合征；神经性疾病，例如阿尔茨海默症；感染性疾病，例如选自由病毒例如冠状病毒如SARS-CoV-2引起的疾病、疟疾、结核病、HIV和流感的感染性疾病；脂质紊乱，例如高脂血症，I型、II型、III型、IV型或V型高脂血症，继发性高甘油三酯血症，高胆固醇血症，家族性高胆固醇血症，黄瘤病，胆固醇乙酰转移酶缺乏症；动脉硬化病症，例如动脉粥样硬化；或冠状动脉疾病。
56.根据第46至53项中任一项所述的组合物、根据第40至42项中任一项所述的多核苷酸或根据第43项所述的载体，用于在受试者中诱导免疫应答的方法中，所述方法包括向所述受试者施用所述组合物、多核苷酸或载体至少一次的步骤。
57.一种制备第46至56项中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)获得第一多肽，所述第一多肽包含与蛋白融合的第9至17项或第28至29项中任一项所述的修饰的结合配偶体或由其组成；以及获得第二多肽，所述第二多肽包含与目标化合物融合的如第22至24项或第31项中任一项所定义的肽标签或由其组成；或
获得第一多肽，所述第一多肽包含与蛋白融合的第22至24项或第31项中任一项所定义的肽标签或由其组成，以及获得第二多肽，所述第二多肽包含与目标化合物融合的第9至17项或第28至29项中任一项所述的修饰的结合配偶体或由其组成；
ii)使第一多肽和第二多肽接触，从而允许在肽标签和修饰的结合配偶体之间形成异肽键；以及产生第46至56项中任一项所述的药物组合物。
58.根据第57项所述的方法，其中所述蛋白是颗粒形成蛋白。
根据RULE 91 ISA/EP的更正
序列表
<110> 阿戴普瓦克有限公司（AdaptVac ApS）
<120> 肽标签和结合配偶体
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<211> 116
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）
<400> 1
Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln
1 5 10 15
Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe
20 25 30
Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu
35 40 45
Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly
50 55 60
Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu
65 70 75 80
Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr
85 90 95
Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly
100 105 110
Asp Ala His Ile
115
<210> 2
<211> 348
<212> DNA
<213> 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）
<400> 2
ggtgcaatgg ttgataccct gagcggtctg agcagcgaac agggtcagag cggtgatatg 60
accattgaag aagatagcgc aacccacatc aaattcagca aacgtgatga agatggtaaa 120
gaactggcag gcgcaacaat ggaactgcgt gatagcagcg gtaaaaccat tagcacctgg 180
attagtgatg gtcaggtgaa agatttttat ctgtaccctg gcaaatacac ctttgttgaa 240
accgcagcac cggatggtta tgaagttgca accgcaatta cctttaccgt taatgaacag 300
ggccaggtta ccgtgaatgg taaagcaacc aaaggtgatg cacatatt 348
<210> 3
<211> 104
<212> PRT
<213> 停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）
<400> 3
Ile Asp Thr Met Ser Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gly Gln Ser Gly Asn
1 5 10 15
Thr Thr Ile Glu Glu Asp Ser Thr Thr His Val Lys Phe Ser Lys Arg
20 25 30
Asp Ser Asn Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Met Ile Glu Leu Arg Asn
35 40 45
Leu Ser Gly Gln Thr Ile Gln Ser Trp Val Ser Asp Gly Thr Val Lys
50 55 60
Asp Phe Tyr Leu Met Pro Gly Thr Tyr Gln Phe Val Glu Thr Ala Ala
65 70 75 80
Pro Glu Gly Tyr Glu Leu Ala Ala Pro Ile Thr Phe Thr Ile Asp Glu
85 90 95
Lys Gly Gln Ile Trp Val Asp Ser
100
<210> 4
<211> 318
<212> DNA
<213> 停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）
<400> 4
atgggtattg ataccatgag cggtctgagc ggtgaaaccg gtcagagcgg taataccacc 60
attgaagagg atagcaccac acatgtgaaa ttcagcaaac gcgatgcaaa cggcaaagaa 120
ctggcaggcg caatgattga actgcgtaat ctgagtggtc agaccattca gagctgggtt 180
agtgatggca ccgttaaaga tttttatctg atgcctggca cctatcagtt tgttgaaacc 240
gcagcaccgg aaggttatga gctggcagca ccgattacct ttaccattga tgaaaaaggt 300
cagatttggg ttgatagc 318
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）
<400> 5
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）
<400> 6
gctcacatcg tgatggtgga cgcttacaag cccaccaag 39
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）
<400> 7
Asp Pro Ile Val Met Ile Asp Asn Asp Lys Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）
<400> 8
gaccccatcg tgatgatcga caacgacaag cccatcacc 39
<210> 9
<211> 123
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 9
Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Lys Pro Leu Arg Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asn Val Arg Thr Gly Glu
35 40 45
Asp Gly Lys Leu Thr Phe Lys Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg Leu
50 55 60
Phe Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys Pro
65 70 75 80
Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asn Gly Glu Val Arg Asp Val Thr Ser
85 90 95
Ile Val Pro Gln Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asn Gly Lys
100 105 110
His Tyr Ile Thr Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys
115 120
<210> 10
<211> 369
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 10
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atgaagccgc tgcgtggtgc cgtgtttagc 60
ctgcagaaac agcatcccga ctatcccgat atctatggcg cgattgatca gaatgggacc 120
tatcaaaatg tgcgtaccgg cgaagatggt aaactgacct ttaagaatct gagcgatggc 180
aaatatcgcc tgtttgaaaa tagcgaaccc gctggctata aaccggtgca gaataagccg 240
attgtggcgt ttcagattgt gaatggcgaa gtgcgtgatg tgaccagcat tgtgccgcag 300
gatattccgg ctacatatga atttaccaac ggtaaacatt atatcaccaa tgaaccgata 360
ccgccgaaa 369
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 11
gaaaaagtga tgggccagtt cgaaatcatg aaagttgatg ccaacgacaa gaccaaa 57
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 12
Glu Lys Val Met Gly Gln Phe Glu Ile Met Lys Val Asp Ala Asn Asp
1 5 10 15
Lys Thr Lys
<210> 13
<211> 129
<212> PRT
<213> 粘性放线菌（Actinomyces viscosus）
<400> 13
Gly Ser Leu Ser Lys Tyr Gly Lys Val Ile Leu Thr Lys Thr Gly Thr
1 5 10 15
Asp Asp Leu Ala Asp Lys Thr Lys Tyr Asn Gly Ala Gln Phe Gln Val
20 25 30
Tyr Glu Cys Thr Lys Thr Ala Ser Gly Ala Thr Leu Arg Asp Ser Asp
35 40 45
Pro Ser Thr Gln Thr Val Asp Pro Leu Thr Ile Gly Gly Glu Lys Thr
50 55 60
Phe Thr Thr Ala Gly Gln Gly Thr Val Glu Ile Asn Tyr Leu Arg Ala
65 70 75 80
Asn Asp Tyr Val Asn Gly Ala Lys Lys Asp Gln Leu Thr Asp Glu Asp
85 90 95
Tyr Tyr Cys Leu Val Glu Thr Lys Ala Pro Glu Gly Tyr Asn Leu Gln
100 105 110
Ala Asp Pro Leu Pro Phe Arg Val Leu Ala Glu Lys Ala Glu Lys Lys
115 120 125
Ala
<210> 14
<211> 387
<212> DNA
<213> 粘性放线菌（Actinomyces viscosus）
<400> 14
ggtagcctga gcaaatatgg taaagtgatt ctgaccaaaa ccggcaccga tgatctggca 60
gataaaacca aatataacgg tgcacagttt caggtgtatg aatgtaccaa aacagcaagc 120
ggtgcaaccc tgcgtgatag cgatccgagc acacagaccg ttgatccgct gaccattggt 180
ggtgaaaaaa cctttaccac cgcaggtcag ggcaccgttg aaattaatta tctgcgtgcc 240
aatgattatg tgaacggtgc aaaaaaagat cagctgaccg atgaagatta ttactgtctg 300
gttgaaacca aagcaccgga aggttataat ctgcaggcag atccgctgcc gtttcgtgtt 360
ctggccgaaa aagcagaaaa aaaagcc 387
<210> 15
<211> 102
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 15
Gly Ser Thr Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys Val Asp Gln Asp His Asn
1 5 10 15
Arg Leu Glu Gly Val Gly Phe Lys Leu Val Ser Val Ala Arg Asp Val
20 25 30
Ser Ala Ala Ala Val Pro Leu Ile Gly Glu Tyr Arg Tyr Ser Ser Ser
35 40 45
Gly Gln Val Gly Arg Thr Leu Tyr Thr Asp Lys Asn Gly Glu Ile Phe
50 55 60
Val Thr Asn Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Arg Phe Lys Glu Val Glu Pro
65 70 75 80
Leu Ala Gly Tyr Ala Val Thr Thr Leu Asp Thr Asp Val Gln Leu Val
85 90 95
Asp His Gln Leu Val Thr
100
<210> 16
<211> 306
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 16
ggtagcacca ccaaagtgaa actgattaaa gttgatcagg atcacaatcg tctggaaggt 60
gttggtttta aactggttag cgttgcacgt gatgttagcg cagcagcagt tccgctgatt 120
ggtgaatatc gttatagcag cagcggtcag gttggtcgta ccctgtatac cgataaaaat 180
ggcgaaattt tcgttaccaa tctgccgctg ggtaactatc gttttaaaga agttgaaccg 240
ctggcaggtt atgcagttac cacactggat accgatgttc agctggttga tcatcagctg 300
gtgacc 306
<210> 17
<211> 94
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 17
Pro Arg Gly Asn Val Asp Phe Met Lys Val Asp Gly Arg Thr Asn Thr
1 5 10 15
Ser Leu Gln Gly Ala Met Phe Lys Val Met Lys Glu Glu Ser Gly His
20 25 30
Tyr Thr Pro Val Leu Gln Asn Gly Lys Glu Val Val Val Thr Ser Gly
35 40 45
Lys Asp Gly Arg Phe Arg Val Glu Gly Leu Glu Tyr Gly Thr Tyr Tyr
50 55 60
Leu Trp Glu Leu Gln Ala Pro Thr Gly Tyr Val Gln Leu Thr Ser Pro
65 70 75 80
Val Ser Phe Thr Ile Gly Lys Asp Thr Arg Lys Glu Leu Val
85 90
<210> 18
<211> 282
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 18
ccgcgtggta atgttgattt tatgaaagtt gatggtcgca ccaataccag cctgcagggt 60
gcaatgttta aagtgatgaa agaagaaagc ggtcactata caccggtgct gcagaatggt 120
aaagaagttg ttgttaccag cggtaaagat ggtcgttttc gtgttgaagg tctggaatat 180
ggcacctatt atctgtggga actgcaggca ccgaccggtt atgttcagct gaccagtccg 240
gttagtttta ccattggcaa agatacccgt aaagaactgg tg 282
<210> 19
<211> 123
<212> PRT
<213> 白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）
<400> 19
Val Val Thr Tyr His Gly Lys Leu Lys Val Val Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Glu Ala Gly Lys Val Leu Lys Gly Ala Glu Phe Glu Leu Tyr Gln Cys
20 25 30
Thr Ser Ala Ala Val Leu Gly Lys Gly Pro Leu Thr Val Asp Gly Val
35 40 45
Lys Lys Trp Thr Thr Gly Asp Asp Gly Thr Phe Thr Ile Asp Gly Leu
50 55 60
His Val Thr Asp Phe Glu Asp Gly Lys Glu Ala Ala Pro Ala Thr Lys
65 70 75 80
Lys Phe Cys Leu Lys Glu Thr Lys Ala Pro Ala Gly Tyr Ala Leu Pro
85 90 95
Asp Pro Asn Val Thr Glu Ile Glu Phe Thr Arg Ala Lys Ile Ser Glu
100 105 110
Lys Asp Lys Phe Glu Gly Asp Asp Glu Val Thr
115 120
<210> 20
<211> 369
<212> DNA
<213> 白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）
<400> 20
gttgttacct atcatggtaa actgaaagtg gtgaaaaaag acggtaaaga ggcaggcaaa 60
gttctgaaag gtgcagaatt tgaactgtat cagtgtacca gcgcagcagt tttaggtaaa 120
ggtccgctga ccgttgatgg tgtgaaaaaa tggaccaccg gtgatgatgg cacctttacc 180
attgatggtc tgcatgttac cgattttgaa gatggtaaag aagccgcacc ggcaaccaaa 240
aaattctgtc tgaaagaaac caaagcaccg gcaggttatg cactgcctga tccgaatgtg 300
accgaaattg aatttacccg tgcaaaaatc agcgagaaag ataaatttga aggcgacgat 360
gaagtgacc 369
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 21
gttaccggtc agtttgaaat cgttaaagtt gatgccgaag ataagacccg t 51
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 22
Val Thr Gly Gln Phe Glu Ile Val Lys Val Asp Ala Glu Asp Lys Thr
1 5 10 15
Arg
<210> 23
<211> 134
<212> PRT
<213> 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）
<400> 23
Ser Thr Asn Asp Thr Thr Thr Gln Asn Val Val Leu Thr Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Phe Asp Lys Asp Val Thr Ala Ile Asp Arg Ala Thr Asp Gln Ile Trp
20 25 30
Thr Gly Asp Gly Ala Lys Pro Leu Gln Gly Val Asp Phe Thr Ile Tyr
35 40 45
Asn Val Thr Ala Asn Tyr Trp Ala Ser Pro Lys Asp Tyr Lys Gly Ser
50 55 60
Phe Asp Ser Ala Pro Val Ala Ala Thr Gly Thr Thr Asn Asp Lys Gly
65 70 75 80
Gln Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ile Gln Ser Lys Asp Ala Ser Gly Lys
85 90 95
Thr Arg Ala Ala Val Tyr Leu Phe His Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly
100 105 110
Tyr Asn Thr Ser Ala Asp Phe Trp Leu Thr Leu Pro Ala Lys Ala Ala
115 120 125
Ala Asp Gly Asn Val Tyr
130
<210> 24
<211> 402
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）
<400> 24
agcaccaatg ataccaccac acagaatgtt gttctgacca aatatggctt cgataaagat 60
gttaccgcaa ttgatcgtgc aaccgatcag atttggaccg gtgatggtgc aaaaccgctg 120
cagggtgttg attttaccat ttataacgtg accgccaatt attgggcaag cccgaaagat 180
tataaaggca gctttgatag cgcaccggtt gcagccaccg gtacaacaaa tgataaaggc 240
cagctgaccc aggcactgcc gattcagagc aaagatgcaa gcggtaaaac ccgtgcagca 300
gtttacctgt ttcacgaaac caatccgcgt gcaggttata ataccagcgc agatttttgg 360
ctgaccctgc ctgcaaaagc agcagcagat ggtaatgttt at 402
<210> 25
<211> 114
<212> PRT
<213> 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）
<400> 25
Thr Thr Tyr Glu Arg Thr Phe Val Lys Lys Asp Ala Glu Thr Lys Glu
1 5 10 15
Val Leu Glu Gly Ala Gly Phe Lys Ile Ser Asn Ser Asp Gly Lys Phe
20 25 30
Leu Lys Leu Thr Asp Lys Asp Gly Gln Ser Val Ser Ile Gly Glu Gly
35 40 45
Phe Ile Asp Val Leu Ala Asn Asn Tyr Arg Leu Thr Trp Val Ala Glu
50 55 60
Ser Asp Ala Thr Val Phe Thr Ser Asp Lys Ser Gly Lys Phe Gly Leu
65 70 75 80
Asn Gly Phe Ala Asp Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Ala Val Glu Thr Asn
85 90 95
Val Pro Asp Gly Tyr Asp Ala Ala Ala Asn Thr Asp Phe Lys Ala Asp
100 105 110
Asn Ser
<210> 26
<211> 342
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）
<400> 26
accacctatg aacgtacctt tgttaaaaaa gacgccgaaa ccaaagaagt tctggaaggc 60
gcaggcttta aaatcagcaa tagtgatggc aaattcctga aactgaccga taaagatggt 120
cagagcgtta gcattggtga aggttttatt gatgttctgg ccaataacta tcgtctgacc 180
tgggttgcag aaagtgatgc aaccgttttt accagcgata aaagcggcaa atttggtctg 240
aatggttttg cagataatac caccacctat accgcagttg aaaccaatgt tccggatggt 300
tatgatgcag cagcaaacac cgatttcaaa gccgataata gc 342
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）
<400> 27
Gly Gln Ile Thr Ile Lys Lys Ile Asp Gly Ser Thr Lys Ala Ser Leu
1 5 10 15
Gln Gly Ala Ile Phe Val Leu Lys Asn Ala Thr Gly Gln Phe Leu Asn
20 25 30
Phe Asn Asp Thr Asn Asn Val Glu Trp Gly Thr Glu Ala Asn Ala Thr
35 40 45
Glu Tyr Thr Thr Gly Ala Asp Gly Ile Ile Thr Ile Thr Gly Leu Lys
50 55 60
Glu Gly Thr Tyr Tyr Leu Val Glu Lys Lys Ala Pro Leu Gly Tyr Asn
65 70 75 80
Leu Leu Asp Asn Ser Gln Lys Val Ile Leu Gly Asp Gly Ala Thr Asp
85 90 95
Thr Thr Asn Ser Asp Asn Leu Leu Val Asn Pro
100 105
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> 无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）
<400> 28
ggtcagatta ccatcaaaaa aatcgatggt agcaccaaag caagcctgca gggtgcaatt 60
tttgttctga aaaatgcaac cggtcagttc ctgaatttta acgataccaa taatgttgaa 120
tggggcaccg aagcaaatgc caccgaatat accaccggtg cagatggtat tattaccatt 180
accggtctga aagaaggcac ctattacctg gttgaaaaaa aagcaccgct gggttataat 240
ctgctggata attcacagaa agtgatttta ggtgatggtg caaccgatac caccaatagc 300
gataacctgc tggttaatcc g 321
<210> 29
<211> 91
<212> PRT
<213> 中间链球菌（Streptococcus intermedius）
<400> 29
Glu Gln Asp Val Val Phe Ser Lys Val Asn Val Ala Gly Glu Glu Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ala Lys Ile Gln Leu Lys Asp Ala Gln Gly Gln Val Val His
20 25 30
Ser Trp Thr Ser Lys Ala Gly Gln Ser Glu Thr Val Lys Leu Lys Ala
35 40 45
Gly Thr Tyr Thr Phe His Glu Ala Ser Ala Pro Thr Gly Tyr Leu Ala
50 55 60
Val Thr Asp Ile Thr Phe Glu Val Asp Val Gln Gly Lys Val Thr Val
65 70 75 80
Lys Asp Ala Asn Gly Asn Gly Val Lys Ala Asp
85 90
<210> 30
<211> 273
<212> DNA
<213> 中间链球菌（Streptococcus intermedius）
<400> 30
gaacaggatg ttgtgtttag caaagttaat gttgccggtg aagaaattgc gggtgcaaaa 60
atccagctga aagatgcaca gggtcaagtt gttcatagct ggaccagcaa agcaggtcag 120
agcgaaaccg ttaaactgaa agcaggcacc tatacctttc atgaagcaag cgcaccgacc 180
ggttatctgg cagttaccga tattaccttt gaagttgatg ttcagggtaa agtgaccgtt 240
aaagatgcaa atggtaatgg tgtgaaagcc gac 273
<210> 31
<211> 104
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 31
Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys Asn Asp Lys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr
20 25 30
Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asn Val
35 40 45
Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Lys Asn Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gly Tyr Lys Pro Val
65 70 75 80
Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asn Gly Glu Val Arg
85 90 95
Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln
100
<210> 32
<211> 312
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 32
aaactgggtg atattgagtt catcaaagtg aacaaaaacg ataaaaaacc gctgcgtggt 60
gcagttttta gcctgcagaa acagcatccg gattacccgg atatttatgg tgcaattgat 120
cagaatggca cctatcagaa tgttcgtacc ggtgaagatg gtaaactgac ctttaaaaac 180
ctgagcgacg gtaaatatcg cctgtttgaa aatagcgaac cggcaggtta taaaccggtt 240
cagaataaac cgattgtggc ctttcagatt gttaatggtg aagttcgtga tgtgaccagc 300
attgttccgc ag 312
<210> 33
<211> 130
<212> PRT
<213> 白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）
<400> 33
Gly Ser Glu Arg Lys Gly Ser Leu Thr Leu His Lys Lys Lys Gly Ala
1 5 10 15
Glu Ser Glu Lys Arg Ala Thr Gly Lys Glu Met Asp Asp Val Ala Gly
20 25 30
Glu Pro Leu Asn Gly Val Thr Phe Lys Ile Thr Lys Leu Asn Phe Asp
35 40 45
Leu Gln Asn Gly Asp Trp Ala Lys Phe Pro Lys Thr Ala Ala Asp Ala
50 55 60
Lys Gly His Glu Thr Ser Thr Thr Lys Glu Val Glu Thr Ser Gly Asn
65 70 75 80
Gly Thr Ala Val Phe Asp Asn Leu Asp Leu Gly Ile Tyr Leu Val Glu
85 90 95
Glu Thr Lys Ala Pro Asp Gly Ile Val Thr Gly Ala Pro Phe Ile Val
100 105 110
Ser Ile Pro Met Val Asn Glu Ala Ser Asp Ala Trp Asn Tyr Asn Val
115 120 125
Val Ala
130
<210> 34
<211> 390
<212> DNA
<213> 白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）
<400> 34
ggtagcgaac gtaaaggtag tctgaccctg cataaaaaga aaggtgcaga aagcgaaaaa 60
cgtgcaaccg gtaaagaaat ggatgatgtt gccggtgaac cgctgaatgg tgttaccttt 120
aaaatcacca aactgaactt cgatctgcag aatggtgatt gggcaaaatt tccgaaaacc 180
gcagcagatg caaaaggtca tgaaaccagc accaccaaag aagtggaaac cagcggtaat 240
ggcaccgcag tttttgataa tctggatctg ggtatttacc tggtggaaga aaccaaagca 300
ccggatggta ttgttacagg tgcaccgttt attgttagca ttccgatggt taatgaagca 360
agtgatgcct ggaattataa cgttgttgca 390
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 35
Leu Gly Gln Phe Glu Ile Val Lys Val Asp Ser Gln Asp Lys Thr Lys
1 5 10 15
<210> 36
<211> 48
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 36
ctgggccagt ttgaaattgt taaagttgat agccaggata aaaccaaa 48
<210> 37
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(113)
<223> QueenCatcher
<400> 37
Ile Asp Thr Met Ser Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gly Gln Ser Gly Asn
1 5 10 15
Thr Thr Ile Glu Glu Asp Ser Thr Thr His Val Lys Phe Ser Lys Arg
20 25 30
Asp Ser Asn Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Met Ile Glu Leu Arg Asn
35 40 45
Leu Ser Gly Gln Thr Ile Gln Ser Trp Val Ser Asp Gly Thr Val Lys
50 55 60
Asp Phe Tyr Leu Met Pro Gly Thr Tyr Gln Phe Val Glu Thr Ala Ala
65 70 75 80
Pro Glu Gly Tyr Glu Leu Ala Ala Pro Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu
85 90 95
Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His
100 105 110
Ile
<210> 38
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(339)
<223> QueenCatcher
<400> 38
attgatacca tgagcggtct gagcggtgaa accggtcaga gcggtaatac caccattgaa 60
gaggatagca ccacacatgt gaaattcagc aaacgcgata gcaacggcaa agaactggca 120
ggcgcaatga ttgaactgcg taatctgagt ggtcagacca ttcagagctg ggttagtgat 180
ggcaccgtta aagattttta tctgatgcct ggcacctatc agtttgttga aaccgcagca 240
ccggaaggtt atgagctggc agcaccgatt acctttaccg ttaatgaaca gggccaggtt 300
accgtgaatg gtaaagcaac caaaggtgat gcacatatt 339
<210> 39
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(117)
<223> MoonCake
<400> 39
Ile Asp Thr Met Ser Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gly Gln Ser Gly Asn
1 5 10 15
Thr Thr Ile Glu Glu Asp Ser Thr Thr His Val Lys Phe Ser Lys Arg
20 25 30
Asp Ser Asn Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Met Ile Glu Leu Arg Asn
35 40 45
Leu Ser Gly Gln Thr Ile Gln Ser Trp Val Ser Asp Gly Thr Val Lys
50 55 60
Asp Phe Tyr Leu Met Pro Gly Thr Tyr Gln Phe Val Glu Thr Ala Ala
65 70 75 80
Pro Glu Gly Tyr Glu Leu Ala Ala Pro Ile Thr Phe Thr Val Gln Asp
85 90 95
Asn Gly Glu Val Ile Ile Gln Gly Arg Leu Thr Arg Gly Asp Val His
100 105 110
Ile
<210> 40
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 40
attgatacca tgagcggtct gagcggtgaa accggtcaga gcggtaatac caccattgaa 60
gaggatagca ccacacatgt gaaattcagc aaacgcgata gcaacggcaa agaactggca 120
ggcgcaatga ttgaactgcg taatctgagt ggtcagacca ttcagagctg ggttagtgat 180
ggcaccgtta aagattttta tctgatgcct ggcacctatc agtttgttga aaccgcagca 240
ccggaaggtt atgagctggc agcaccgatt acctttaccg ttcaggataa cggcgaagtt 300
attattcagg gccgcctgac acgtggcgat gttcatatt 339
<210> 41
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(117)
<223> Kat I
<400> 41
Ile Asp Thr Met Ser Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gly Gln Ser Gly Asn
1 5 10 15
Thr Thr Ile Glu Glu Asp Ser Thr Thr His Val Lys Phe Ser Lys Arg
20 25 30
Asp Ser Asn Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Met Ile Glu Leu Arg Asn
35 40 45
Leu Ser Gly Gln Thr Ile Gln Ser Trp Val Ser Asp Gly Thr Val Lys
50 55 60
Asp Phe Tyr Leu Met Pro Gly Thr Tyr Gln Phe Val Glu Thr Ala Ala
65 70 75 80
Pro Glu Gly Tyr Glu Leu Ala Ala Pro Ile Thr Phe Thr Val Gln Asp
85 90 95
Asn Gly Glu Val Gln Ile Gln Gly Lys Ala Thr Arg Gly Asp Val Pro
100 105 110
Ile
<210> 42
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 42
attgatacca tgagcggtct gagcggtgaa accggtcaga gcggtaatac caccattgaa 60
gaggatagca ccacacatgt gaaattcagc aaacgcgata gcaacggcaa agaactggca 120
ggcgcaatga ttgaactgcg taatctgagt ggtcagacca ttcagagctg ggttagtgat 180
ggcaccgtta aagattttta tctgatgcct ggcacctatc agtttgttga aaccgcagca 240
ccggaaggtt atgagctggc agcaccgatt acctttaccg ttcaggataa cggcgaagtt 300
cagattcagg gcaaagcaac acgtggcgat gttccgatt 339
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 参考基序；X独立的是任何氨基酸
<400> 43
Gly Xaa Xaa Xaa Phe Val Met Xaa Asp Xaa
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 参考基序；X独立的是任何氨基酸
<400> 44
Gly Xaa Xaa Xaa Trp Val Met Xaa Asp Xaa
1 5 10
<210> 45
<211> 60
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）
<400> 45
agcgaaaacg gcaacccgct gattgtgatg gtggatgata ccaccaaagt gaaaattagc 60
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）
<400> 46
Ser Glu Asn Gly Asn Pro Leu Ile Val Met Val Asp Asp Thr Thr Lys
1 5 10 15
Val Lys Ile Ser
20
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> Rumtrunk D9N
<400> 47
Gly Asn Pro Leu Ile Val Met Val Asn Asp Thr Thr Lys Val Lys
1 5 10 15
<210> 48
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(45)
<223> Rumtrunk D9N标签
<400> 48
ggtaatccgc tgattgtgat ggtgaatgat accaccaaag tgaaa 45
<210> 49
<211> 66
<212> DNA
<213> Streptococcus phocae
<400> 49
ctggttaccg gcaccgcaca tattgttatg gttgataact ataagccgat cgtggaaacc 60
ggtgat 66
<210> 50
<211> 22
<212> PRT
<213> Streptococcus phocae
<400> 50
Leu Val Thr Gly Thr Ala His Ile Val Met Val Asp Asn Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Ile Val Glu Thr Gly Asp
20
<210> 51
<211> 60
<212> DNA
<213> 粪肠球菌（Enterococcus faecalis）
<400> 51
accgaagtta gcggtaatac cattgtgatg gtggataaac tgaaagaagt tccgcctacc 60
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 粪肠球菌（Enterococcus faecalis）
<400> 52
Asn Thr Ile Val Met Val Asp Lys Leu Lys Glu Val Pro Pro Thr
1 5 10 15
<210> 53
<211> 51
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.） AM43-6
<400> 53
ggcaccccgc tgattgtgat ggtggatgat accaccaaag tggaaattag c 51
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.） AM43-6
<400> 54
Gly Thr Pro Leu Ile Val Met Val Asp Asp Thr Thr Lys Val Glu Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 55
<211> 51
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.） Marseille-P6503
<400> 55
ggcaacccgc tgattgtgat gattgatgaa gcggaacaga aagaaattcc g 51
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.） Marseille-P6503
<400> 56
Gly Asn Pro Leu Ile Val Met Ile Asp Glu Ala Glu Gln Lys Glu Ile
1 5 10 15
Pro
<210> 57
<211> 51
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.） AF25-19
<400> 57
ggcaccccga ttgtgattat ggtggatgaa gcgaaaccga gcctgccgga t 51
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.） AF25-19
<400> 58
Gly Thr Pro Ile Val Ile Met Val Asp Glu Ala Lys Pro Ser Leu Pro
1 5 10 15
Asp
<210> 59
<211> 51
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）
<400> 59
gcgggcggca ttattgtgat gaaagataac accaccaaag tgagcattag c 51
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）
<400> 60
Ala Gly Gly Ile Ile Val Met Lys Asp Asn Thr Thr Lys Val Ser Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 61
<211> 48
<212> DNA
<213> 黄化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）
<400> 61
ggcaacccga ttgtgaccat gattgatgat gcgaccctgg tgaaaatt 48
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 黄化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）
<400> 62
Gly Asn Pro Ile Val Thr Met Ile Asp Asp Ala Thr Leu Val Lys Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 63
<211> 51
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）
<400> 63
ggcaacagca ccattaccat ggtggatgat accaccaaag tgcatattac c 51
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）
<400> 64
Gly Asn Ser Thr Ile Thr Met Val Asp Asp Thr Thr Lys Val His Ile
1 5 10 15
Thr
<210> 65
<211> 45
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 65
ggtcagttcg aaattgttaa agttgatgca aacgataaaa ctaaa 45
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 66
Asn Glu Lys Val Thr Gly Gln Phe Glu Ile Val Lys Val Asp Ala Asn
1 5 10 15
Asp Lys Thr Lys
20
<210> 67
<211> 57
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 67
agcaaaagcc tgggccagtt tgaaattgtg aaagtggatg cgcaggataa aaccaaa 57
<210> 68
<211> 19
<212> PRT
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 68
Ser Lys Ser Leu Gly Gln Phe Glu Ile Val Lys Val Asp Ala Gln Asp
1 5 10 15
Lys Thr Lys
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 69
Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys
1 5 10
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<400> 70
aaactgggtg atattgaatt tattaaagtt aataaa 36
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）
<400> 71
Gly Asn Pro Leu Ile Val Met Val Asp Asp Thr Thr Lys Val Lys
1 5 10 15
<210> 72
<211> 45
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）
<400> 72
ggcaacccgc tgattgtgat ggtggatgat accaccaaag tgaaa 45
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 参考结合基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 参考结合基序
<400> 73
Gly Xaa Xaa Xaa Ile Val Met Xaa Asp Xaa
1 5 10
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 参考结合基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 参考结合基序
<400> 74
Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Val Met Xaa Asp Xaa
1 5 10
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> 中间链球菌（Streptococcus intermedius）
<400> 75
Gly Asn Lys Leu Thr Val Thr Asp Gln Ala Ala Pro Ser
1 5 10
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> Clib9
<400> 76
Arg Gly Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys
1 5 10 15
<210> 77
<211> 39
<212> DNA
<213> 中间链球菌（Streptococcus intermedius）
<400> 77
ggtaataaac tgaccgttac cgatcaggca gcaccgagc 39
<210> 78
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<223> Clib9
<400> 78
cgtggtgttc cgaccattgt tatggttgat tgttataaac gttataaa 48
<210> 79
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(117)
<223> MoonCake克隆序列
<400> 79
Phe Ser Met Gly Ile Asp Thr Met Ser Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gly
1 5 10 15
Gln Ser Gly Asn Thr Thr Ile Glu Glu Asp Ser Thr Thr His Val Lys
20 25 30
Phe Ser Lys Arg Asp Ser Asn Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Met Ile
35 40 45
Glu Leu Arg Asn Leu Ser Gly Gln Thr Ile Gln Ser Trp Val Ser Asp
50 55 60
Gly Thr Val Lys Asp Phe Tyr Leu Met Pro Gly Thr Tyr Gln Phe Val
65 70 75 80
Glu Thr Ala Ala Pro Glu Gly Tyr Glu Leu Ala Ala Pro Ile Thr Phe
85 90 95
Thr Val Gln Asp Asn Gly Glu Val Ile Ile Gln Gly Arg Leu Thr Arg
100 105 110
Gly Asp Val His Ile
115
<210> 80
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(117)
<223> KatI克隆序列
<400> 80
Phe Ser Met Gly Ile Asp Thr Met Ser Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gly
1 5 10 15
Gln Ser Gly Asn Thr Thr Ile Glu Glu Asp Ser Thr Thr His Val Lys
20 25 30
Phe Ser Lys Arg Asp Ser Asn Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Met Ile
35 40 45
Glu Leu Arg Asn Leu Ser Gly Gln Thr Ile Gln Ser Trp Val Ser Asp
50 55 60
Gly Thr Val Lys Asp Phe Tyr Leu Met Pro Gly Thr Tyr Gln Phe Val
65 70 75 80
Glu Thr Ala Ala Pro Glu Gly Tyr Glu Leu Ala Ala Pro Ile Thr Phe
85 90 95
Thr Val Gln Asp Asn Gly Glu Val Gln Ile Gln Gly Lys Ala Thr Arg
100 105 110
Gly Asp Val Pro Ile
115

Claims (33)

1.由肽标签和结合配偶体组成的肽配对物，其中所述肽标签和所述结合配偶体可通过在所述结合配偶体内包含的一个反应性残基和在所述肽标签内包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而彼此结合，其中所述肽配对物选自：
a)SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体，和选自SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)的肽标签；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
b)SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体，和选自SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)的肽标签；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；和
c)SEQ ID NO:37(QueenCatcher)的结合配偶体，和选自SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:12(Bac5Tag)和SEQ ID NO:76(Clib9)的肽标签。
2.根据权利要求1所述的肽配对物，其中所述肽配对物选自：
a)SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体和SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)的肽标签；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
b)SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体和SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)的肽标签；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；
c)SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体和SEQ ID NO:46(RumTag)的肽标签；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体；和
d)SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体和SEQ ID NO:46(RumTag)的肽标签；或与其具有至少70％同源性或同一性的其变体。
3.结合配偶体，其能够与肽标签通过在所述结合配偶体内包含的一个反应性残基和在所述肽标签内包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而结合，其中所述结合配偶体选自：
a)SEQ ID NO:39(MoonCake)；
b)SEQ ID NO:41(KatI)；和
c)SEQ ID NO:37(QueenCatcher)；
其片段或与其具有至少70％同源性或同一性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性或同一性的其同源物，条件是所述片段或同源物包含参与形成所述异肽键的所述反应性残基。
4.根据权利要求2所述的结合配偶体，其中所述结合配偶体是：
a)SEQ ID NO:39或其片段或与SEQ ID NO:39具有至少70％同源性或同一性的SEQ IDNO:39的同源物，条件是对应于SEQ ID NO:39中残基31的残基未被修饰；或
b)SEQ ID NO:37或其片段或与SEQ ID NO:37具有至少70％同源性或同一性的SEQ IDNO:37的同源物，条件是对应于SEQ ID NO:37中残基31的残基未被修饰；或
c)SEQ ID NO:41或其片段或与SEQ ID NO:41具有至少70％同源性或同一性的SEQ IDNO:41的同源物，条件是对应于SEQ ID NO:39中残基31的残基未被修饰。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的结合配偶体，其中：
a)所述结合配偶体是SEQ ID NO:39(MoonCake)或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:39中残基31的残基未被修饰，并且可以通过异肽键与肽标签结合，其中所述肽标签选自SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ IDNO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ IDNO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)；或
b)所述结合配偶体是SEQ ID NO:41(KatI)或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:41中残基31的残基未被修饰，并且可以通过异肽键结合，其中所述肽标签选自SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQ IDNO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)；或
c)所述结合配偶体是SEQ ID NO:37(QueenCatcher)或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:37中残基31的残基未被修饰，并且可以通过异肽键与肽标签结合，其中所述肽标签选自SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ IDNO:71(RumTrunkTag)、SEQ IDNO:66(BacTag)、SEQ ID NO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:12(Bac5Tag)和SEQ ID NO:76(Clib9)。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的结合配偶体，其中：
a)所述结合配偶体是SEQ ID NO:39(MoonCake)或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:39中残基31的残基未被修饰，并且可以通过异肽键与肽标签结合，其中所述肽标签选自SEQ ID NO:46(RumTag)和SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)；或
b)所述结合配偶体是SEQ ID NO:41(KatI)或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:41中残基31的残基未被修饰，并且可以通过异肽键结合，其中所述肽标签选自SEQ ID NO:46(RumTag)和SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)；或
c)所述结合配偶体是SEQ ID NO:37(QueenCatcher)或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:37中残基31的残基未被修饰，并且可以通过异肽键与肽标签结合，其中所述肽标签选自SEQ ID NO:5(SpyTag)、SEQ ID NO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)和SEQ ID NO:75(Clib9)。
7.肽标签，其能够与结合配偶体通过在所述结合配偶体内包含的一个反应性残基和所述肽标签内包含的另一个反应性残基之间自发形成异肽键而结合，其中所述肽标签选自：
a)SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)；
b)SEQ ID NO:46(RumTag)；
c)SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)；
d)SEQ ID NO:58(Rum2Tag)；
e)SEQ ID NO:56(Rum3Tag)；
f)SEQ ID NO:60(Rum4Tag)；
g)SEQ ID NO:62(Rum5Tag)；
h)SEQ ID NO:64(Rum6Tag)；
i)SEQ ID NO:54(Rum7Tag)；
j)SEQ ID NO:66(BacTag)；
k)SEQ ID NO:68(Bac2Tag)；
l)SEQ ID NO:35(Bac3Tag)；
m)SEQ ID NO:22(Bac4Tag)；
n)SEQ ID NO:12(Bac5Tag)；
o)SEQ ID NO:50(PhoTag)；和
p)SEQ ID NO:52(EntTag)；
或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性或同一性的其同源物，条件是所述片段或同源物包含参与形成所述异肽键的所述反应性残基。
8.根据权利要求7所述的肽标签，其中所述肽标签是：
a)SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:47中残基9的残基未被修饰；或
b)SEQ ID NO:46(RumTag)或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:46中残基12的残基未被修饰；
c)SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是对应于SEQ ID NO:71中残基9的残基未被修饰。
9.根据权利要求7至8中任一项所述的肽标签，其中所述肽标签是：
a)SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)或SEQ ID NO:47的片段或与SEQ ID NO:47具有至少70％同源性或同一性的SEQ ID NO:47的同源物，条件是对应于SEQ ID NO:47中残基9的残基未被修饰，其中所述结合配偶体选自SEQ ID NO:37(QueenCatcher)、SEQ ID NO:39(MoonCake)和SEQ ID NO:41(KatI)；或
b)SEQ ID NO:46(RumTag)或SEQ ID NO:46的片段或与SEQ ID NO:46具有至少70％同源性或同一性的SEQ ID NO:46的同源物，条件是对应于SEQ ID NO:46中残基12的残基未被修饰，并且可以通过异肽键与结合配偶体结合，其中所述结合配偶体选自SEQ ID NO:37(QueenCatcher)、SEQ IDNO:39(MoonCake)和SEQ ID NO:41(KatI)；或
c)SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)或SEQ ID NO:71的片段或与SEQ IDNO:71具有至少70％同源性或同一性的SEQ ID NO:71的同源物，条件是对应于SEQ ID NO:71中残基9的残基未被修饰，其中所述结合配偶体选自SEQ ID NO:37(QueenCatcher)、SEQ ID NO:39(MoonCake)和SEQ ID NO:41(KatI)。
10.多核苷酸，其编码权利要求3至6中任一项所述的结合配偶体或权利要求7至9中任一项所述的肽标签。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自以下的结合配偶体：
a)SEQ ID NO:39(MoonCake)；
b)SEQ ID NO:41(KatI)；和
c)SEQ ID NO:37(QueenCatcher)；
或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性或同一性的其同源物，条件是所述片段或同源物包含参与形成所述异肽键的所述反应性残基。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
a)SEQ ID NO:40(MoonCake)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是SEQ ID NO:40的位置91至93处的密码子编码赖氨酸；或
b)SEQ ID NO:42(KatI)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，其中条件是SEQ ID NO:42的位置91至93处的密码子编码赖氨酸；或
c)SEQ ID NO:38(QueenCatcher)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是SEQ ID NO:38的位置91至93处的密码子编码赖氨酸。
13.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自以下的肽标签：
a)SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)；
b)SEQ ID NO:46(RumTag)；
c)SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)；
d)SEQ ID NO:58(Rum2Tag)；
e)SEQ ID NO:56(Rum3Tag)；
f)SEQ ID NO:60(Rum4Tag)；
g)SEQ ID NO:62(Rum5Tag)；
h)SEQ ID NO:64(Rum6Tag)；
i)SEQ ID NO:54(Rum7Tag)；
j)SEQ ID NO:66(BacTag)；
k)SEQ ID NO:68(Bac2Tag)；
l)SEQ ID NO:35(Bac3Tag)；
m)SEQ ID NO:22(Bac4Tag)；和
n)SEQ ID NO:12(Bac5Tag)；
或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性或同一性的其同源物，条件是所述片段或同源物包含参与形成所述异肽键的所述反应性残基。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
a)SEQ ID NO:48(RumTrunkD9NTag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是SEQ ID NO:48的位置25至27处的密码子编码天冬酰胺；
b)SEQ ID NO:45(RumTag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是SEQ ID NO:45的位置37至39处的密码子编码天冬氨酸；
c)SEQ ID NO:72(RumTrunkTag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是SEQ ID NO:72的位置25至27处的密码子编码天冬氨酸；
d)SEQ ID NO:57(Rum2Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；
e)SEQ ID NO:55(Rum3Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；
f)SEQ ID NO:59(Rum4Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；
g)SEQ ID NO:61(Rum5Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；
h)SEQ ID NO:63(Rum6Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；
i)SEQ ID NO:53(Rum7Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；
j)SEQ ID NO:65(BacTag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；
k)SEQ ID NO:67(Bac2Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物，条件是位置37至39处的密码子编码天冬氨酸；
l)SEQ ID NO:36(Bac3Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；
m)SEQ ID NO:21(Bac4Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；和
n)SEQ ID NO:11(Bac5Tag)或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；
或其片段或与其具有至少70％同源性或同一性，例如至少75％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性或同一性的其同源物，条件是所述片段或同源物包含参与形成所述异肽键的所述反应性残基。
15.一种包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的系统，其中所述第一多核苷酸编码肽标签，并且所述第二多核苷酸编码结合配偶体，其中所述肽标签和所述结合配偶体可通过在所述结合配偶体内包含的一个反应性残基和在所述肽标签内包含的另一个反应性残基之间自发形成的异肽键而彼此结合，并且其中：
a)所述第一多核苷酸编码选自SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ IDNO:5(SpyTag)、SEQ IDNO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQIDNO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)的肽标签，并且所述第二多核苷酸编码SEQ ID NO:39(MoonCake)的结合配偶体，或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；或
b)所述第一多核苷酸编码选自SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ IDNO:5(SpyTag)、SEQ IDNO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQIDNO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)和SEQ ID NO:12(Bac5Tag)的肽标签，并且所述第二多核苷酸编码SEQ ID NO:41(KatI)的结合配偶体，或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物；或
c)所述第一多核苷酸编码选自SEQ ID NO:47(RumTrunkD9NTag)、SEQ ID NO:54(Rum7Tag)、SEQ ID NO:56(Rum3Tag)、SEQ ID NO:58(Rum2Tag)、SEQ ID NO:60(Rum4Tag)、SEQ ID NO:62(Rum5Tag)、SEQ ID NO:64(Rum6Tag)、SEQ ID NO:71(RumTrunkTag)、SEQ IDNO:5(SpyTag)、SEQ IDNO:7(SdyTag)、SEQ ID NO:46(RumTag)、SEQ ID NO:66(BacTag)、SEQIDNO:68(Bac2Tag)、SEQ ID NO:35(Bac3Tag)、SEQ ID NO:22(Bac4Tag)、SEQ ID NO:12(Bac5Tag)和SEQ ID NO:76(Clib9)的肽标签，并且所述第二多核苷酸编码SEQ ID NO:37(QueenCatcher)的结合配偶体，或与其具有至少70％同源性或同一性的其同源物。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述肽标签和/或所述结合配偶体如权利要求1至9中任一项所定义。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的系统，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸是如权利要求10至14中任一项所定义的多核苷酸。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的系统，其中所述系统由一个或两个载体例如一个或二个质粒组成。
19.组合物，其包含：
i)与权利要求3至6中任一项所述的结合配偶体融合的蛋白，和与权利要求7至9中任一项所述的肽标签融合的目标化合物，例如肽，例如抗原；或
ii)与权利要求7至9中任一项所述的肽标签融合的蛋白，和与权利要求3至6中任一项所述的结合配偶体融合的目标化合物，例如肽，例如抗原；
其中所述结合配偶体和所述肽标签能够通过异肽键的自发形成而相互作用，并且
其中所述目标化合物和所述蛋白通过所述结合配偶体和所述肽标签之间的异肽键相连接。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述蛋白是颗粒形成蛋白。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述颗粒形成蛋白和所述目标化合物形成展示所述目标化合物的颗粒。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述颗粒是病毒样颗粒，并且所述颗粒形成蛋白是病毒衣壳蛋白。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的组合物，其中目标肽是抗原，优选地，其中所述抗原是肽或其抗原性片段，例如与异常生理反应相关的肽或其抗原性片段，优选地，其中所述异常生理反应是疾病，例如心血管疾病、感染性疾病和/或过敏反应/疾病。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的组合物，其中所述疾病是癌症，例如乳腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫浆液癌；心血管疾病，例如血脂异常、动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症；免疫炎性疾病或慢性疾病，例如嗜酸粒细胞哮喘、过敏、鼻息肉病、特应性皮炎、嗜酸粒细胞食管炎、嗜酸粒细胞增多综合征和查格-施特劳斯综合征；神经性疾病，例如阿尔茨海默症；感染性疾病，例如选自由病毒例如冠状病毒如SARS-CoV-2引起的疾病、疟疾、结核病、HIV和流感的感染性疾病；脂质紊乱，例如高脂血症，I型、II型、III型、IV型或V型高脂血症，继发性高甘油三酯血症，高胆固醇血症，家族性高胆固醇血症，黄瘤病，胆固醇乙酰转移酶缺乏症；动脉硬化病症，例如动脉粥样硬化；或冠状动脉疾病。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的组合物，其中所述抗原是蛋白、肽和/或抗原性片段，所述蛋白、肽或抗原性片段来自癌症特异性多肽、与心血管疾病相关的多肽、与哮喘相关的多肽、与鼻息肉病相关的多肽、与特应性皮炎相关的多肽、与嗜酸粒细胞食管炎相关的多肽、与嗜酸粒细胞增多综合征相关的多肽、与查格-施特劳斯综合征相关的多肽和/或与致病生物体相关的多肽。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的组合物，其中所述抗原是SARS-CoV2抗原。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的组合物、根据权利要求10至14中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求15至18中任一项所述的系统，用于预防或治疗疾病。
28.根据权利要求27所述的组合物、多核苷酸或系统，其中所述疾病是癌症，例如乳腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫浆液癌；心血管疾病，例如血脂异常、动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症；免疫炎性疾病或慢性疾病，例如嗜酸粒细胞哮喘、过敏、鼻息肉病、特应性皮炎、嗜酸粒细胞食管炎、嗜酸粒细胞增多综合征和查格-施特劳斯综合征；神经性疾病，例如阿尔茨海默症；感染性疾病，例如选自由病毒例如冠状病毒如SARS-CoV-2引起的疾病、疟疾、结核病、HIV和流感的感染性疾病；脂质紊乱，例如高脂血症，I型、II型、III型、IV型或V型高脂血症，继发性高甘油三酯血症，高胆固醇血症，家族性高胆固醇血症，黄瘤病，胆固醇乙酰转移酶缺乏症；动脉硬化病症，例如动脉粥样硬化；或冠状动脉疾病。
29.根据权利要求19至26中任一项所述的组合物、根据权利要求10至14中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求15至18中任一项所述的系统，用于在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述组合物、多核苷酸或系统至少一次的步骤。
30.一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用权利要求19至26中任一项所述的组合物、权利要求10至14中任一项所述的多核苷酸的步骤。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病如权利要求24或27至29中任一项所定义。
32.一种制备权利要求19至26中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)获得蛋白和第一多肽的融合物，所述第一多肽包含前述权利要求中任一项所定义的结合配偶体或由其组成；以及获得目标化合物和第二多肽的融合物，所述第二多肽包含前述权利要求中任一项所定义的肽标签或由其组成；或
获得蛋白和第一多肽的融合物，所述第一多肽包含前述权利要求中任一项所定义的肽标签或由其组成；以及获得目标化合物与第二多肽的融合物，所述第二多肽包含权利要求3至6中任一项所述的结合配偶体或由其组成；
ii)使所述第一多肽和所述第二多肽接触，从而允许在所述肽标签和所述结合配偶体之间形成异肽键；以及产生权利要求19至27中任一项所述的药物组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述蛋白是颗粒形成蛋白。
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